Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Фармако-биохимический анализ влияния некоторых производных стероидных гормонов на фибробласты кожи в норме и при псориазе

003474584

На правах рукописи

ЛИГА АРИУНА БОЛДБАТОВНА

ФАРМАКО-БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ НЕКОТОРЫХ ПРОИЗВОДНЫХ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ НА ФИБРОБЛАСТЫ КОЖИ В НОРМЕ И ПРИ ПСОРИАЗЕ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

О 9 «ЮЛ 2000

Москва - 2009

003474584

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Шимановский Николай Львович

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Омельяновский Виталий Владимирович

Доктор биологических наук, профессор Золотов Николай Николаевич

Ведущая организация:

Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН

Защита состоится «_» _2009 года в 14-00 на заседании

диссертационного совета Д 208.072.01 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1

Автореферат разослан «_»_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Джанашия Платон Харитонович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Псориаз, несмотря на появление в последние годы большого количества работ посвященных его изучению, продолжает оставаться актуальной проблемой дерматологии. Это одно из наиболее распространенных хронических кожных заболеваний, которым, согласно данным ВОЗ, страдает до 3% населения мира, а в общей структуре заболеваемости кожи эта патология достигает 12-15% [Бутов Ю.С., 2002; Naldi L. et al., 2005; Puig-Sanz L., 2007; Каг{амбаса А.Д. и др., 2008]. Заболевание не только портит внешний вид и зачастую затрудняет общение больных с другими людьми, но и может приводить к инвалидизации, потере работоспособности и даже летальным исходам.

В настоящее время большинство исследователей определяют псориаз как заболевание мультифакториальной природы, относящееся к наследственно детерминируемым, системным заболеваниям человека и характеризующееся гиперпролиферацией эпидермальных клеток, воспалительной реакцией в дерме, а также патологическими изменениями со стороны различных органов и систем [Скрипкин Ю.К. и др., 1999; Puig-SanzL., 2007].

Особое место в этиопатогенезе заболевания отводится изменениям микроцир-куляторного русла, активности перекисного окисления липидов (ПОЛ) и показателей антиоксидантной системы (АОС) [Молочков В.А. и др., 2007]. Благодаря этим системам в организме на определенном уровне поддерживается ряд физиологических процессов в клетке (клеточная пролиферация, проницаемость мембран и др.) [Альберте Б. и др., 1994], а изменение систем может приводить к нарушению функции клеточных мембран с последующим развитием патологических процессов noun Z. et.al., 1998]. В не меньшей степени, вероятно, на эти физиологические процессы влияют различные антиокисидантные системы кожи, основной из которых является редокс-система глутатиона [Shindo Y. et al., 1993]. Эта система, как во всем организме, так и в коже поддерживается на стационарном уровне, выполняя множество функций (защита от активных кислородных соединений, участие в обмене эй-козаноидов, в процессах пролиферации и др.) [Hirai A. et al., 1997]. Тем не менее, данные литературы о состоянии оксидантно-антиоксидантного равновесия у больных псориазом весьма противоречивы. По мнению одних авторов [Трофимова М.Б. и др., 2004; Костянова Е.Н., 2005] у последних наблюдается повышение ПОЛ с неоднозначным изменением АОС, по мнению других [Шилов В.Н. и др., 2000; Хы-ишктуев Б. С. и др., 2000] - снижение ПОЛ и повышение уровня антиокислительной защиты.

Кроме того, известно, что накопление продуктов ПОЛ является одной из причин повышения проницаемости мембран лизосом. При этом увеличивается выход кислых гидролаз в цитоплазму, что может отрицательно сказаться на течении процессов жизнедеятельности клеток [Rola-Pleszczynski М„ 1985]. Лизосомальный аппарат кожи принимает активное участие в её защитных реакциях и физиологических функциях, участвует в таких специфических процессах как кератинизация, деление клеток, пигментация, рост волос, секреция сала и т.д. [Ухина Т.В. и др., 1993; Цвет-кова Г.М. и др., 2003]. Ряд исследователей отмечают при обострении псориаза уве-

личение активности лизосомальных ферментов в плазме крови [Briganti S. et al, 2003]. Тем не менее, подобные сведения противоречивы и отрывочны.

В последнее время широкое применение в разных областях биологии и медицины находят клеточные культуры, в частности фибробласты [Скрипкин Ю.К. и др., 1994; Barker CL et al., 2004; Озерская O.C., 2004]. Фибробласты являются основными клетками дермы и играют важную роль в ряде физиологических процессов (заживление ран и ожогов, развитие рубцовой ткани и др.) [Келлер Г. и др., 2000; Смирнов C.B. и др., 2003]. Кроме того, существует предположение о том, что пусковые события при развитии псориаза могут быть связаны с воспалением в дерме, тогда как эпидермис вовлекается в процесс вторично [Chrystofers Е. et al, 1987]. Дополнительным свидетельством первичности нарушений в дерме является выявление в ней изменения сосудов до образования псориатических папул [.Braverman S.M., 1991]. Вероятно, исследование фибробластов кожи у больных псориазом позволит выявить некоторые новые механизмы развития патологического процесса, имеющего место при этом дерматозе, и наметить новые пути его лечения.

Применение большого количества лекарственных средств в терапии псориаза часто оказывает лишь временный эффект и приводит к осложнениям [Кацамбаса А.Д. и др., 2008]. В связи с этим, проблема эффективного лечения больных псориазом также остается весьма актуальной. В последнее время показано, что наряду с глюкокортикоидами, наиболее часто применяющимися в терапии псориаза, противовоспалительной активностью обладают новые синтетические соединения с геста-генной активностью [Ухина Т.В., 2004]. В ряде исследований продемонстрирована способность прогестерона к регуляции множества патофизиологических реакций в коже при псориазе, старении, а также при заживлении ран [Gilliver SC et al, 2003]. Вероятно, гестагены могут быть использованы для топической терапии псориаза в концентрациях, действующих на лизосомальные ферменты и редокс-систему глута-тиона.

Учитывая вышесказанное, исследование фибробластов кожи представляет значительный интерес для дальнейшего изучения фармако-биохимических аспектов патогенеза псориаза, а также для проведения скрининга новых лекарственных соединений для терапии этого дерматоза.

Цель исследования:

Изучение и сравнительный анализ влияния ряда стероидных соединений с глюкокортикоидной и гестагенной активностью на интенсивность работы окислительных систем, активность ферментов лизосом и метаболическую активность в фибробластах интактной и патологически измененной кожи при псориазе.

Задачи исследования:

1 ) Оценить влияние гестагенов и глюкокортикоидов на активность лизосомальных ферментов ((З-глюкозидазы, катепсина Д) в фибробластах интактной кожи человека и крыс.

2) Изучить интенсивность процессов ПОЛ в фибробластах нормальной кожи при действии исследуемых стероидов.

3) Исследовать влияние стероидов на состояние антиоксидантной редокс-системы глутатиона в фибробластах кожи здоровых доноров.

4) Выявить влияние стероидных соединений на метаболическую активность фибробластов кожи в норме.

5) Определить активность лизосомальных ферментов, интенсивность ПОЛ и состояние антиоксидантной редокс-системы глутатиона в патологически измененной коже больных псориазом при воздействии исследуемых гормонов.

Научная новизна работы В работе впервые изучено в опытах in vitro влияние нового отечественного гес-тагена АБМП (17а-ацетокси-3р-бутаноилокси-б-метил-прегна-4,6-диен-20-он) на интенсивность работы окислительных систем, активность ферментов лизосом (ка-тепсина Д, р-глюкозидазы) и метаболическую активность культуры фибробластов интактной и патологически измененной кожи больных псориазом. Установлены корреляционные связи между параметрами оксидантно-антикосидантной системы (содержанием ТБК-активных соединений (rs = 0,875, р>0,05), параметров редокс-систем глутатиона (rs = -0,964, р>0,05)) и изменениями активности лизосомальных ферментов в клетках.

Впервые установлено изменение исследуемых биохимических параметров в фибробластах кожи при псориазе и возможность их коррекции с помощью стероидных соединений. Показано, что АБМП, наряду с глюкокортикоидами, обладает выраженным мембраностабилизирующим, антиокислительным и антиметаболическим действием на фибробласты нормальной и патологически измененной кожи человека и может быть рекомендован к соответствующим испытаниям для последующего использования его в качестве компонента комплексной терапии псориаза.

Показано, что фибробласты кожи являются весьма перспективным объектом для изучения биохимических и молекулярных аспектов патогенеза псориаза и для поиска новых лекарственных средств, способных уменьшить проявление этого заболевания.

Теоретическая и практическая значимость результатов исследования

Полученные в работе результаты необходимы для более глубокого понимания механизмов этиопатогенеза псориаза и обосновывают целесообразность клинического изучения гестагенов в качестве противовоспалительных средств в дерматологической практике, в том числе при лечении псориаза. Данные позволяют рекомендовать фибробласты к использованию в качестве экспериментальной модели для дальнейшего изучения фармако-биохимических аспектов патогенеза псориаза, а также для скрининга новых лекарственных соединений, эффективных в терапии этого распространенного хронического дерматоза.

Положения, выносимые на защиту

1. Гестагены оказывают выраженное мембраностабилизирующее действие на лизо-сомальные ферменты фибробластов интактной и патологически измененной кожи, повышая прочность связывания катепсина Д и Р-гшокозидазы с мембранами лизосом и ограничивая тем самым повреждение клеток.

2. АБМП, наряду с глюкокортикоидами, обладает выраженными антиокислительными свойствами, оказывая влияние на параметры оксидантно-антиоксидантного равновесия и способствуя нормализации окислительных процессов в клетках кожи при псориазе.

3. АБМП обладает выраженным антиметаболическим действием в отношении фиб-робластов кожи, концентрация-зависимо подавляя их активность.

4. Псориаз в острой стадии сопровождается выходом катепсина Д и р-глюкозидазы из мембран лизосом, повышением интенсивности процессов перекис-ного окисления липидов и снижением параметров антиоксидантной защиты (редокс-системы глутатиона) в фибробластах кожи.

Внедрение результатов исследования

Результаты работы внедрены и используются в научно-исследовательской работе и теоретическом курсе занятий на кафедре молекулярной фармакологии и радиобиологии МБФ ГОУ ВПО РГМУ Росздрава и на кафедре дерматовенерологии Института повышения квалификации Федерального медико-биологического агентства (ИПК ФМБА).

Апробация работы

Официальная апробация работы состоялась на совместной научно-практической конференции коллектива сотрудников кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии медико-биологического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, ПНИЛ молекулярной фармакологии и кафедры дерматовенерологии Института повышения квалификации Федерального медико-биологического агентства (ИПК ФМБА).

Публикации

Основные положения работы доложены и обсуждены на совместных научно-практических конференциях сотрудников кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии МБФ ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, на XIV и XV Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва 2007, 2008), на III съезде фармакологов «Фармакология - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), на научно-практической конференции МОНИКИ «Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии» (Москва, 2008). По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, включающего 250 источников отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 15 рисунками, 18 таблицами, и 1 схемой.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для экспериментальных исследований служили фибробласты, выделенные из биоптатов интактной кожи новорожденных крыс-самцов линии Wis-tar, а также из биоптатов кожи людей без сопутствующей кожной патологии и больных псориазом, любезно предоставленных сотрудниками Института Псориаза (генеральный директор д.м.н., профессор В.В. Владимиров), кафедры дерматовенерологии ИПК ФМБА (зав. кафедрой д.м.н., профессор В.В. Владимиров) и ГВКГ им.

Н.Н. Бурденко. Биоптаты были получены от 30 здоровых добровольцев и от 30 больных псориазом.

Для исследования использовали стероидные соединения фирмы "Serva" (Австрия): прогестерон, гидрокортизон, дексаметазон и синтетический аналог стероидных гормонов - АБМП, синтезированный В.М. Ржезниковым и сотрудниками в ФГУ Эндокринологическом научном центре (ЭНЦ) РАМН. Все исследуемые стероиды добавляли к гомогенатам клеток в опытах in vitro в конечных концентрациях 10"7, 10"5 и 10"3М (при исследовании метаболической активности клеток - в концентрациях 10"7, 10"6, 10~5М). В качестве контроля использовали гомогенаты клеток без добавления гормонов.

Метод культивирования клеток

Культивирование фибробластов осуществлялось по методу Фрешни Р. (1989) в стерильных условиях с использованием ламинарбокса ЛБ-В (Россия). При пересевах или постановке эксперимента, через 10-14 дней после формирования монослоя клеток, фибробласты снимали с поверхности флаконов смесью версена с трипсином и переводили в суспензию. Методом центрифугирования отделяли супернатант от осадка и гомогенизировали последний в среде выделения для использования в последующих методиках. Количество и жизнеспособность клеток после формирования монослоя оценивали в камере Горяева в присутствии 0,1% раствора трипанового синего.

Методы определения активности лнзосомальных ферментов

В гомогенатах клеток определяли активность лизосомального катепсина Д по методу Баррет А.Дж. и др. (1980) и Р-глюкозидазы по методу Patel и Tappel (1969), основанных на спектрофотометрическом изменении количества продуктов реакции, катализируемых данными ферментами.

Активность ферментов определяли по количеству расщепленных субстратов в гомогенатах клеток (лиофильно высушенного гемоглобина при определении катепсина Д и р-нитрофенильных производных гликозидов при определении р-глюкозидазы). Для определения общей активности ферментов к пробам добавляли неионо-генный детергент тритон Х-100 в конечной концентрации 0,1 %. О функциональной активности лизосом судили по процентному соотношению свободной и общей активностей.

Изучение интенсивности ПОЛ

Изучение интенсивности ПОЛ в клетках определяли по содержанию ТБК-зависимых продуктов по методу Стальной И.Д. (1977), основанному на реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) в кислой среде при 80°С, с образованием окрашенного комплекса с максимумом поглощения при 532 нм.

Методы определения параметров редокс-системы глутатиона

В гомогенатах клеток определяли содержание восстановленного глутатиона (GSH) (по модифицированному методу Sedlak S., 1968), активность глутатионперок-сидазы (GSH-per) (по методу Beutler, 1975) и активность глутатионредуктазы (GSH-red) (по методу Ferrone S. et al., 1970).

МТТ-тест оценки метаболической активности клеток

Влияние исследуемых соединений на метаболическую активность фибробластов определяли по методу Mealey K.L. et al. (2002). Метод основан на способности

ферментов дыхательной цепи митохондрий (сукцинатдегидрогеназ) живых клеток восстанавливать бледно-желтый водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолиум бромид (МТТ) в голубые кристаллы формазана, не растворимые в воде. Количество образовавшегося формазана характеризует интенсивность окислительно-восстановительных процессов, то есть жизнеспособность клеток.

Статистическая обработка результатов Все первичные экспериментальные данные хранились и обрабатывались с использованием программы "Microsoft Excel 2007" и прикладной программы ВЮ-STAT. Статистическая достоверность результатов оценивалась с помощью непараметрических критериев Крускала-Уоллиса, Ньюмена Кейлса и ранговой корреляции Спирмена для уровня значимости 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние стероидных соединений на активность люосомальных ферментов в фибробластах интактной кожи крыс На первом этапе работы мы оценивали влияние стероидов на активность люосомальных ферментов (катепсина Д и (3-глюкозидазы) фибробластов интактной кожи крыс. О функциональной активности лизосом судили по процентному соотношению свободной и общей активностей ферментов (Табл. 1,2.).

Табл.1. Влияние стероидных соединений на активность катепсина Д в фибробла-

Концентрация Активность

свободная общая % СБ ./Общ

Контроль 0,17±0,03 0,30+0,02 57,7±3,5

Гидрокортизон 10"7М о,п±о,оГ 0,24+0,02* 45,2±1,Г

10"5М 0,06±0,03* 0,20+0,01* 28,0±1,0*

10'3М 0,04±0,01* 0,17+0,02* 23,5±0,8*

Дексаметазон 10"7М 0,12±0,01* 0,27±0,01 44,4±1,Г

10"5М 0,07±0,03* 0,19+0,02* 35,8±0,8

10"3М 0,05+0,05* 0,16+0,01* 28,1±1,4*

Прогестерон 10"7М о,п±о,оГ 0,21+0,05* 5б,3±2,3

10'5М о,ю±о,оГ 0,20±0,04* 55,5±3,0

кгм 0,08±0,01* 0,18+0,04* 4б,5±3,0*

АБМП 10"7М 0,14+0,04* 0,29±0,03 43,2±4,1*

10"5М 0,07±0,02* 0,30±0,04 22,1±3,5*

10'3М 0,05+0,03* 0,25±0,04 18,1+3,0*

Примечание: В таблице приведены средние данные из результатов 6-8 опытов; *- различия групп статистически значимы по сравнению с контролем (р < 0,05)

При изучении влияния стероидов на исследуемые параметры было обнаружено их неоднозначное действие. Гидрокортизон, после предварительной инкубации с

суспензией клеток в течение 1 часа, концентрация-зависимо снижал как абсолютные значения свободной и общей активности обоих исследуемых ферментов, так и их соотношение, повышая, таким образом, прочность связывания ферментов с мембранами лизосом. При этом функциональная активность лизосом снижалась в основном за счет снижения значений свободной активности ферментов (в большей степени катепсина Д, в меньшей - р-глюкозидазы). В максимально исследуемой концентрации (10"3М) гормон повышал прочность связывания катепсина Д с мембранами лизосом на 59%, Р-глюкозидазы - на 44%, что свидетельствует о высоком мембрано-стабилизирующем действии гидрокортизона. Аналогичное, но менее выраженное действие на лизосомы оказывал дексаметазон (Табл. 1,2.).

Прогестерон статистически значимо снижал выход исследуемых лизосомаль-ных ферментов из мембран только в концентрации 10"3М (р-глюкозидазы на 40%, катепсина Д - на 20%). При этом снижение доли свободной активности ферментов на 55% в этой концентрации, возможно, являлось следствием стабилизирующего воздействия гормона на липидный бислой лизосомальных мембран [Ухина Т.В., 2004], обнаруженный в ранее проведенных исследованиях (Табл. 1,2.).

Табл. 2. Влияние стероидных соединений на активность Р-глюкозидазы в фиброб-

Концентрация Активность

свободная общая %св./общ

Контроль 0,30±0,03 1,01 ±0,05 39,0±2,0

Гидрокортизон 10"'М 0,23±0,04' 0,65±0,01* 35,4±1,2

10"5М 0,16±0,02* 0,58±0,10* 27,6±1,1*

ю^м о,п±о,оГ 0,50±0,01* 22,0±1,0*

Дексаметазон 10'7М 0,24±0,01* 0,68±0,01* 35,3±1,1

10'5М 0,18±0,01" 0,60±0,01* 30,0±0,7*

10'3М о,п±о,оГ 0,44±0,10* 24,4±0,8*

Прогестерон 10"'М 0,30±0,07 0,8010,07 37,8±2,0

10"3М 0,32±0,06 0,80±0,05 37,2±2,1

10"3М 0,14±0,05* 0,60±0,95 23,4±3,0*

АБМП 10"'М 0,36±0,02 1,10±0,05 38,2±3,3

10"5М 0,52±0,02* 1,15±0,01 45,3±3,0*

10"3М 0,60±0,01* 1,20±0,02 51,0±4,0*

Примечапие: В таблице приведены средние данные из результатов 6-8 опытов; * - различия групп статистически значимы по сравнению с контролем (р < 0,05)

В отличие от прогестерона, АБМП, в концентрации 10~7М через 1 час инкубации с клетками снижал в них свободную активность катепсина Д на 17,6%, практически не изменяя значения общей активности фермента. При этом соединение, наряду с глюкокортикоидами, повышало прочность связывания фермента с мембранами лизосом на 25%. В максимальной исследуемой концентрации (10'3М) АБМП доля свободной активности фермента снижалась на 70,6%, а процентное соотношение

на 68,6%, что в 2,5 раза сильнее действия на клетки прогестерона в той же концентрации (Табл.1.).

При изучении действия АБМП на р-глюкозидазу было выявлено, что в концентрации 10'7М соединение практически не влияло на активность фермента, а в концентрации 10"5М, в отличие от прогестерона, увеличивало его активность. Последнее, предположительно, связано с активацией самого фермента, либо, что более вероятно, с химической структурой и метаболизмом стероидного соединения. Так, при воздействии АБМП в концентрации 10"5М в течение 1 часа свободная активность фермента повышалась приблизительно на 37%, что, вероятно, может быть связано с его мембранотропным действием. Увеличение концентрации гормона до 10"3М вызывало повышение свободной активности фермента вдвое по сравнению с контролем. Активность лизосом при этом характеризовалась повышением высвобождения фермента в связи со снижением прочности его связывания с мембранами лизосом на 30% (Табл.2.).

Таким образом, все исследуемые гормоны концентрация-зависимо изменяли активность лизосомальных ферментов в фибробластах интактной кожи крыс. Глюкокортикоиды и прогестерон оказывали выраженное мембраностабилизирующее действие, выражающееся в способности повышать прочность связывания лизосомальных ферментов с мембранами лизосом, ограничивая тем самым выход из них ферментов и, в результате, повреждение клеток. Действие АБМП зависело как от времени инкубации с клетками, так и от вида фермента. АБМП, в отличие от исследуемых стероидов, начиная с концентрации 10"5М повышал свободную и общую активность р-глюкозидазы, что может быть связано с химической структурой и метаболизмом самого стероидного соединения.

Влияние стероидных соединений на интенсивность ПОЛ в фибробластах интактной кожи крыс

Об уровне ПОЛ в клетках судили по содержанию ТБК-активных соединений -конечных продуктов ПОЛ. Спустя 30 минут инкубации с клетками глюкокортикои-ды (гидрокортизон, дексаметазон) уже в концентрации 10"7М статистически значимо снижали исследуемый параметр в клетках на 15%. По мере увеличения концентрации гормонов до 10~3М значения исследуемого параметра в клетках снижалось почти в 1,5-2 раза по сравнению с контролем. Спустя 1 час после начала инкубации действие глюкокортикоидов усиливалось и вело к еще большему снижению содержания ТБК-активных соединений (на 20% в концентрации 10 7М и на 40% в концентрации 10"5М). В максимально исследуемой концентрации (10"3М) глюкокортикоиды снижали исследуемый параметр в 2 раза по сравнению с нормой.

Гестагены (прогестерон, АБМП), в отличие от глюкокортикоидов, спустя 30 минут инкубации с клетками вызывали статистически значимое снижение определяемого параметра (на 10-12%) только в концентрации 10"3М. По истечении 1 часа инкубации клеток с гормонами влияние гестагенов усиливалось, в концентрации 10" 5М сопровождаясь снижением исследуемого параметра на 37-40% и в концентрации 10'3М - на 60-64%. АБМП снижал содержание ТБК-активных соединений более выражено, чем прогестерон и глюкокортикоиды (Рис.1.).

содержание Т6К-активных соединении, нмоль/мг белка

2,5 2 1.5 1

0,5 О

□ контроль

□ прогестерон ОАБМП

Ш гидрокортизон О дексаметаэон

Рис. 1. Влияние стероидных соединений на содержание ТБК-активных соединений в

фибробластах интактной кожи крыс (¡час инкубации) (М±т: нмоль/мг белка) Примечание: Приведены средние данные из результатов 6-8 опытов; 4- различия групп статистически значимы по сравнению с контролем (р < 0,05)

Таким образом, все исследуемые стероиды снижали интенсивность процессов ПОЛ в фибробластах интактной кожи крыс, в зависимости от концентрации и сроков инкубации с клетками. Наибольшую антиокислительную активность проявляли геетагены в концентрации 1 СГ'М, снижая содержание ТБК-активных соединений в клетках в 2 раза по сравнению с нормой. Эти свойства гестагенов могут способствовать нормализации окислительных процессов в коже при дерматозах с воспалительным компонентом (в том числе псориазе).

Влияние стероидных соединений ни пирометрыредокс-системьIглута-пиита в фибробластах интактной кожи крыс Далее оценивалось влияние исследуемых стероидов на компоненты антиокеи-дантноЙ системы защиты, наибольшее значение из которых Занимает р едоке-система глутатиона. В связи с этим мы изучали содержание восстановленного глутатио-на (0$Н), активность глутатионредуктазы (ОЗН-гес}) и глутатионлероксидазы (й5Н-рег) без воздействия и при воздействии на них гормонов.

Спустя 1 час инкубации гидрокортизона с клетками значения всех исследуемых параметров статистически значимо повышались, начиная с концентрации 10 М. В максимальной исследуемой концентрации (10" М) содержание С5Н увеличивалось на 47%, а активность ферментов (ЗЯН-геё и 05Н-рег редокс-систсмы глутатирна на 40% и 15% соответственно. Аналогичное, но менее выраженное действие на исследуемые параметры оказывал дексаметазон.

Прогестерон, в отличие от гл кжокортикоидов, оказывал менее выраженное действие на параметры редокс-системы глутатиона. При этом, начиная с концентрации Ю'5М, гормон а большей степени повышал активность ферменга СХН-пх! (на 25%) практически не изменяя содержание ОЭН и активность 0$Н-рег. АБМП действовал на ферменты редокс-систсмы глутатиона сравнимо с прогестероном и, наряду с глюкокортикоидами, выражено (в 2-3 раза по сравнению с прогестероном) увеличивал содержание ОЭН (Рис.2,),

Содержание

сэн,

5-&|й|о ль/иг

5 -4,5 -

4 3,5 3

I

I

Л

□ контроль о прогестерон Я АБМП

а гидрокортизон 0 декС&метаэон

10ГМ

105М

10-5М

Активность СБН-гей, шодопь/мин на мг белка

0,06 0,05 0,04 0.03

11111

10'7М

1

£+

4-

+ □ контроль

I

I

□ прогестерон

□ АБМП

(П гидрокортизон И дексаметаэон

10М

Активность йЭН-рег, мкмоль1мин на мг белка

О.Ой 0,05 0,04

или

«НИ

□ контроль

□ прогестерон ВАБМП

Щ гидрокортизон и дексаметаэон

Рис.2. Влияние стероидных соединений на параметры редокс-системм глутатиона в фШробластах интактной кожи крыс (I час инкубации) (М±т; содержание СБН в

имояь/мг белка; активность ферментов в мкмаяь/мин на мг белка) Примечание: Приведены средние данные из результатов 6-8 опытов; различия групп статистически значимы по сравнению с контролем (р < 0,05)

Таким образом, можно полагать, что а н шок целительные свойства исследуемых стероидов могут быть связаны с их непосредственным влиянием на параметры ре-до кс-с и с тс мы глутатиона в фибр областям кожи. Кроме того, полученные данные свидетельствуют о том, что АБМП, наряду с гл го ко к орти кои да м и и в большей степени, чем прогестерон, обладает выраженными антиокислительными свойствами.

Метаболическая активность фибробластов интактной кожи крыс Фибробвасты инкубировали со стероидными соединениями в течение 2 и 5 су-

ток. Максимально действующая концентрация - минимально действующая -

10' М. О метаболической активности клеток судили по изменению количества жизнеспособных клеток в тесте. Оптическую плотность контрольных образцов принимали за 100%-ю выживаемость клеток (РисЗ-4.),

При инкубации фибробластов с гормонами в течение 2-х суток, глюкокортн-коиды (гидрокортизон, дексаметазон) оказывали выраженное действие на клетки, подавляя их метаболическую активность на 30-40% практически равнозначно но всех концентрациях. 13 отличие от глюкокортикоидов, гестагсны (прогестерон, АБМП) в малых концентрациях {10"7, 10"6М) не оказывали статистически значимых эффектов. При увеличении концентрации до 10'3М прогестерон, как и АБМП, вызывал снижение метаболической активности фибробластов на 25% (Рис.3.).

жизнеспособность клеток, %

□ прогестерон

□ АБМП

□ гидрокортизон ЕЗдексйштэдш

Рис.3. Влияние стероидных соединений на метаболическую активность (жизнеспособность) фибробластов интактной кожи крыс при 2 сутках инкубации Примечание: + достоверное отличие от контроля при р<0.05. Контроль - жизнеспособность клеток в отсутствии соединений (100±10%)

По истечении 5 суток инкубации стероидов с клетками, гидрокортизон в концентрациях 10т и 10"М вызывал подавление их метаболической активности на 22% и 30% соответственно, а в концентрации 10" М - на 35%. Дексаметазон, начиная с концентрации Ю'^'М, оказывал максимальное антиметаболическое действие среди всех исследуемых гормонов, снижая жизнеспособность фибробластов на 40-50%. Действие прогестерона оставалось примерно на том же уровне. АБМП в концентрациях 10"' и 10 М подавлял метаболическую активность клеток приблизительно на 10-15%, а в концентрации 1 0"5М, подобно глюкокортикоидам, оказывал максимальное действие, выражающееся в подавлении метаболической активности клеток на 38% (Рис.4.).

жизнеспособность клеток, %

-f

□ прогестерон DA БЫЛ

OrvíflpQKOprwjOH а дечсометаэон

Рис.4. Влияние стероидных соединений па метаболическую активность (жизнеспособность) фибробластов интактной кожи крыс при 5 сутках инкубации Примечание^ - достоверное отличие от контроля при р<0,05. Контроль - жизнеспособность клеток и отсутствии соединений (!00±10%)

Анализ данных, представленных на Рис. 3-4., позволил определить ряды но эффективности подавления стероидами метаболической активности фибробластов интактной кожи крыс (Табл.3.).

Табл. 3. Ряды по эффективности подавления гормонами метаболической активности фибробластов интактной кожикрьг;

—инкубации Концентрация ~ 2 суток 5 суток

! 0' 7М ДМ>ГК>АБМП>ПГ ГК>Д М >П П> А Б М П

10"М ДМ>ГК>АБМП>ЛГ ДМ >ГК>ПГ>АБМП

10°М ГК>ЦМ>ПГ>АБМП ДМ>АБМП>ГК>ПГ

Примечание: ПГ- прогестерон, ГК-гидрокортизон. ДМ - дексаметазон, > - достоверное отличие между соединениями (р< 0,001), > - недостоверное отличие

Из таблицы видно, что по истечении 5 суток инкубации клеток со стероидами, геста ген АБМП в концентрации 10""М. наряду с глкжо кортик идами, оказывает выраженное антиметаболическое действие. Возможно, подавление метаболической активности клеток также косвенно указывает на антилролиферативное действие соединения.

Активность лизосомащных ферментов в фибробластах кожи человека

при псориазе

В данной части работы мы оценивали исследуемые параметры в фибробластах, выделенных т биотэтов кожи больных псориазом мужчин и женщин разных возрастов, а затем полученные значения сравнивали со значениями нормы.

Биоптаты были взяты до лечения заболевания под местной анестезией из участков пораженной кожи туловиша 30 больных (16 мужчин (53%) и 14 женщин (47%)) с вульгарной формой заболевания в стадии обострения. Наибольшее число больных приходилось на возраст от 25 до 40 лет; средний возраст составил 35 лет.

Длительность заболевания колебалась от нескольких месяцев до 10 лет и более. В качестве контроля использовали биоптаты интактной кожи, полученные от 30 здоровых добровольцев (13 мужчин (43%) и 17 женщин (57%) в возрасте от 24 до 45 лет).

В результате исследования статистически значимых различий между изучаемыми параметрами в фибробластах кожи мужчин и кожи женщин выявлено не было, однако наблюдалась тенденция к более высоким значениям у женщин по отношению к мужчинам и у молодых людей по отношению к более пожилым. Основные результаты исследования, полученные на фибробластах интактной кожи, подтвердили таковые, полученные на фибробластах кожи крыс.

При анализе изменений активности исследуемых лизосомальных ферментов (катепсина Д и Р-глюкозидазы) было отмечено снижение свободной и общей активности ферментов в фибробластах кожи людей с псориазом (на 35-55%) и повышение выхода ферментов из мембран лизосом на 10-15% по сравнению с фибробластами нормальной кожи {Табл.4-5.).

Глюкокортикоиды (гидрокортизон, дексаметазон) статистически значимо повышали свободную и общую активность катепсина Д (на 15-25%) в фибробластах кожи мужчин и женщин, начиная с концентрации 10"7М. Значения активности фермента в максимальной исследуемой концентрации гормонов (10'3М) приближались к таковым значениям в норме, повышаясь под действием гормонов на 30-37% (Табл.4.).

Гестагены (прогестерон, АБМП), наряду с глюкокортикоидами, приближали значения катепсина Д в фибробластах псориатической кожи к норме, в зависимости от концентрации гормона и вида фермента. Прогестерон, как и АБМП, статистически значимо повышал значения свободной и, в большей степени, общей активности фермента (на 30-50%) в фибробластах, начиная с концентрации 10"5М. Действие гормонов в максимальной исследуемой концентрации (10"ЭМ) снижало выход катепсина Д из лизосом на 10% по сравнению с контролем (псориазом) (Табл.4.).

На второй лизосомальный фермент - Р-глюкозидазу - глюкокортикоиды (гидрокортизон, дексаметазон) оказывали менее выраженное действие, в концентрации 10"7М вызывая статистически значимые эффекты по сравнению с контролем (псориазом) только в фибробластах кожи женщин. В максимальной исследуемой концентрации (10"3М) глюкокортикоиды снижали выход фермента из мембран лизосом на 3-4% по сравнению с контролем (псориазом) (Табл.5.).

Табл. 4. Влияние стероидных соединений на активность катепсина Д в фибробластах кожи человека при псориазе (1 час

инкубации) (М±т; мкмолъ/мин на мг белка)_

Интактная кожа

Контроль (псориаз)

Прогестерон

АБМП

Гидрокортизон

Дексаметазон

10"'М

10"5М

1(Г3М

10"7М

10°М

10_3М

10"7М

1(ГМ

нгм

10"7М

10"5М

игм

женщины

свободная

0,45±0,015

0,30±0,010

0,32±0,010

0,37±0,020

0,41 ±0,015

0,32±0,011

0,40±0,012

0,42±0,016

0,35±0,012

0,39±0,010

0,41±0,010

0,34±0,012

0,37±0,016

0,40±0,015

общая

0,76±0,035

0,43±0,030

0,47±0,020

0,56±0,011

0,65±0,011

0,48±0,015

0,64±0,014

0,70±0,011

0,52±0,010

0,61±0,020

0,68±0,011

0,50±0,002

0,59±0,004

0,65±0,010

%св./общ

59,2±0,4

70,1±0,2

68,1*1,1

бб,2±1,0

61,5±1,3

6б,7±2,0

б2,5±1,6

60,0±1,2

67,3±1,0

63,9±2,0

60,ЗА 1,4

68,0±1,7

62,7±1,0

61,5±1,3

мужчины

свободная

0,30±0,025

0,17±0,020

0,18±0,010

0,20±0,001

0,24=10,002

0,18±0,004

0,23±0,003

0,29±0,002

0,20±0,001

0,21±0,002

0,22±0,001

0,20±0,002

0,21±0,003

0,22±0,001

общая

0,58±0,004

0,27±0,020

0,29±0,002

0,34±0,001

0,43±0,001

0,30±0,002

0,42±0,003

0,5б±0,001

0,34±0,003

0,37±0,001

0,41 ±0,002

0,32±0,001

0,36±0,002

0,40±0,001

%св./общ

51,7±0,2

63,0±0,1

б2,1±1,1

58,8±1,0

54,6±2,0

60,0±1,4

54,8±1,0

51,8±2,0

59,1±1,0

5б,5±1,0

52,6±1,1

60,9±1,2

57,5±1,4

53,4±1,0

Примечание: В таблице приведены средние данные из результатов 6-8 опытов; * - различия групп статистически значимы

по сравнению с контролем (псориазом)(р< 0,05)

Табл. 5. Влияние стероидных соединений на активность Р-глюкозидазы в фибробластах кожи человека при псориазе (I час

женщины мужчины

свободная общая %св./общ свободная общая %св./общ

Иитактная кожа 0,23±0,015* 0,52±0,020* 44,2±0,5* 0,15±0,018* 0,35±0,030* 42,9±0,2*

Контроль (псориаз) 0,19±0,010 0,40±0,020 47,5±0,4 0,10±0,018 0,22±0,030 45,5±0,1

Прогестерон 10"7М 0,20±0,008 0,42±0,010 46,9±1,2 0,11±0,009 0,23±0,009 44,9±1,2

10°М 0,21±0,009 0,44±0,011 44,5±1,0* 0,12±0,005 0,26±0,005 43,0±1,5*

10"3М 0,22±0,010 0,49±0,009* 43,8±1,5* 0,14±0,007* 0,31 ±0,020* 42,3±1,0*

АБМП 10"7М 0,19±0,006 0,41±0,012 46,0±2,0 0,11 ±0,009 0,23±0,005 44,2±1,3

10°М 0,22±0,010 0,49±0,020* 42,3±1,2* 0,14±0,004* 0,28±0,030* 43,8±2,0*

10 3М 0,23±0,007* 0,51±0,015* 41,7±1,1* 0,15±0,005* 0,32±0,010* 42,7±2,1 *

Гидрокортизон 10'7М 0,21±0,010 0,44±0,011 45,1±1,3* 0,12±0,002 0,25±0,010 44,0±1,6

10'5М 0,22±0,011 0,48±0,008* 44,6±2,0* 0,14±0,004* 0,31±0,007* 43,9±1,2

10'3М 0,23±0,008* 0,52±0,015* 44,5±1,8* 0,15±0,001* 0,33±0,005* 42,0±1,3

Дексаметазон 10"7М 0,20±0,008 0,43±0,020 46,6±1,Г 0,12±0,004 0,26±0,010 44,2±1,1

10"5М 0,21±0,009 0,45±0,017* 45,7±1,0* 0,13±0,007 0,29±0,007* 43,5±1,0

10"3М 0,22±0,010* 0,49±0,015* 44,9±0,9* 0,14±0,005* 0,31±0,009* 43,1±2,1

Примечание: В таблице приведены средние данные из результатов 6-8 опытов; * - различия групп статистически значимы

по сравнению с контролем (псориазом) (р < 0,05)

Оценка влияния геетагенов на (З-глюкозидазу показала, что в действии прогестерона имеется тенденция к повышению свободной и общей активности фермента, однако это действие не было статистически значимым. АБМП, более выраженно, чем прогестерон, повышал долю свободной активности фермента на 16%, начиная с концентрации 10~5М. Более выраженное повышение активности фермента (на 40%) при действии соединения наблюдалось в фибробластах кожи мужчин (Табл.5.).

Таким образом, псориаз в острой стадии характеризуется резким снижением свободной и общей активности лизосомальных ферментов в фибробластах кожи и выходом их из мембран лизосом. Все исследуемые гормоны концентрация-зависимо повышают активность обоих ферментов в фибробластах псориатической кожи, приближая значения к значениям нормы. Гестагены, наряду с глюкокортикоидами обладали выраженным мембраностабилизирующим действием, в большей степени действуя на катепсин Д, чем на Р-глюкозидазу.

Содержание ТБК-актиеных соединений в фибробластах кожи человека при

псориазе

На следующем этапе оценивалось содержание ТБК-активных соединений в фибробластах кожи мужчин и женщин при псориазе. Результаты экспериментов показали, что значения исследуемого параметра превышали таковые в фибробластах интактной кожи на 60%. Далее, оценивалось влияние исследуемых гормональных соединений на содержание ТБК-активных продуктов, в зависимости от пола и концентрации гормона (Рис.5.).

Как видно из рисунков, глюкокортикоиды (гидрокортизон, дексаметазон) статистически значимо снижали содержание ТБК-активных соединений на 20-25%, начиная с концентрации 10"5М. По мере увеличения концентрации, увеличивалось и действие гормонов на клетки. В максимальной исследуемой концентрации (10'3М), гормоны статистически значимо снижали исследуемый параметр на 30-35% по сравнению с контролем (псориазом), приближая значения параметра к значениям нормы.

Прогестерон, наряду с глюкокортикоидами, статистически значимо на 10-13% снижал содержание ТБК-активных соединений, начиная с концентрации 10"5М в фибробластах кожи как мужчин, так и женщин. АБМП действовал на исследуемый параметр более выражено, чем глюкокортикоиды и прогестерон, снижая его содержание в той лее концентрации на 17-20%, а в концентрации 10'3М - на 32-34% (Рис.5.). Соединение действовало в равной степени на содержание ТБК-активных соединений в фибробластах кожи мужчин и женщин.

□ интактная кожа О псориаз Ш прогестерон ИАБМП

И гидрокортизон Идехсаметаэон

□ интактная кожа

□ псориаз

В прогестерон ЕАБМП

□ гидрокортизон Идексаметазон

Рис. 5. Влияние стероидов на содержание ТБК-актиеных соединений а фибробла-

стах кожи при псориазе (I час инкубации) (М±т; нмольЫг белка) Примечание: В таблице приведены средние данные из результатов 6-8 опытов; v - различия групп статистически значимы по сравнению с контролем (р < 0,05)

Таким образом, псориаз в острой с тадии характеризуется повышением окислительных процессов в фибробластах кожи в 1,5-2 раза по сравнению с нормой. Все исследуемые гормоны концентрация-зависимо снижали интенсивность процессов ПОЛ (содержание ТБК-акгивных соединений) в фибробластах псориатической кожи. Наибольшую антиокислитель ну ю активность, независимо от пола, проявляли глюкокоргиконды и АБМП в концентрации 10"3М, снижая содержание ТЕК-активных соединений в клетках и приближая значения параметра к норме.

Параметры редокс-системы глутатиона в фибробластах кожи человека

при псориазе

Оценка влияния исследуемых стероидов HS компоненты редокс-системы глутатиона в фибробластах кожи человека при псориазе без воздействия И при воздействии на них гормональных соединений дала следующие результаты (Табл.6-7.). При сравнении полученных данных с данными ранее проведенных исследований на фибробластах ин-тактной кожи было выяснено, что значения отдельных компонентов редокс-системы глутатиона в фибробластах при псориазе в 2,5 раза ниже, чем таковые в норме. Полученные результаты согласуются и дополняют результаты, полученные ранее на нашей кафедре [Ухина Т.В.. 2004).

содержание ТБК-активных соединений, нмопь/мг белка

i

HTM

кгм

содержание ТБК-активных соединений, нмоль/мг белка

женщины

10-М

ю^м

10'TST

Табл. 6. Влияние стероидных соединений на параметры редокс-системы глутатио-на в фибробластах кожи женщин при псориазе (1 час инкубации с препаратами) (Mim; содержание GSHв нмоль/мг белка; активность ферментов в мкмоль/мин на

женщины

Концентрация GSH Активность GSH-red Активность GSH-per

Интактная кожа 3,61±0,20* 0,042±0,003* 0,057±0,0020*

Контроль (псо риаз) 1,41±0,20 0,016±0,0010 0,021±0,0020

Прогестерон 10"'М 1,54±0,20* 0,018±0,0010 0,023±0,0010

10"5М 1,82±0,12* 0,025±0,0013* 0,031±0,0013*

10"3М 2,32±0,14* 0,034±0,0010* 0,039±0,0011*

АБМП 10"7М 1,50±0,11 0,017±0,0010 0,022±0,0012

10"5М 2,45±0,10* 0,032±0,0020* 0,036±0,0010*

10"3М 3,20±0,21* 0,038±0,0013* 0,045±0,0014*

Гидрокортизон 10"7М 1,63±0,13* 0,021±0,0012* 0,027±0,0018*

10"5М 2,05±0,10" 0,033±0,0013* 0,034±0,0010*

10'3М 3,12±0,21* 0,040±0,0010* 0,044±0,001 Г

Дексаметазон 10'7М 1,58±0,12* 0,019±0,0016 0,025±0,0010

10-5М 1,89±0,14* 0,030±0,0010* 0,031±0,0012*

10"3М 2,62±0,09' 0,041±0,0013* 0,039±0,0011*

Примечание: В таблице приведены средние данные из результатов 6-8 опытов; *- различия групп статистически значимы по сравнению с контролем (р < 0,05)

Начиная с концентрации 10"7М, глюкокортикоиды (гидрокортизон, дексамета-зон) оказывали выраженное действие на параметры редокс-системы глутатиона, статистически значимо повышая содержание ОБН и активность ферментов его метаболизма (вБИ-гес! и 08Н-рег) в фибробластах кожи. Сходное с глюкокортикоидами действие оказывал прогестерон. В отличие от прогестерона, АБМП более выражено повышал уровень (йН в фибробластах кожи в концентрации 1(Г5М. При этом, однако, исследуемые параметры повышались в 1,5 раза сильнее, чем при действии прогестерона, приближая значения к значениям нормы. В максимальной концентрации (10"3М) действие гормонов на исследуемые параметры было еще более выраженным (Табл. 6-7.).

Таким образом, псориаз в острой стадии характеризуется снижением параметров редокс-системы глутатиона (содержания С5Н и активности ферментов ОБН-гес! и СБН-рег) в 2,5 раза. Все исследуемые гормоны концентрация-зависимо повышали значения исследуемых параметров, приближая их к значениям нормы. АБМП, наряду с глюкокортикоидами и в большей степени, чем прогестерон, обладал выраженным антиокислительным действием. Вероятно, гормоны могут регулировать анти-перекисную защиту организма за счет их влияния на редокс-систему глутатиона.

Табл. 7. Влияние стероидных соединений на параметры редокс-системы глутатио-на в фибробластах кожи при псориазе (1 час инкубации с препаратами) (М±т; содержание в нмоль/мг белка; активность ферментов в мкмоль/мин намг белка)

мужчины

Концентрация GSH Активность GSH-red Активность GSH-per

Интактная кожа 3,56±0,10* 0,040±0,0018* 0,055±0,001 Г

Контроль (псориаз) 1,56±0,10 0,020±0,0014 0,024±0,0021

Прогестерон 10'7М 1,59±0,10 0,022±0,0012 0,026±0,0018

10'5М 1,79±0,14* 0,028±0,001* 0,033±0,0012*

10'3М 2,15±0,10* о,озз±о,ооГ 0,038±0,0010*

АБМП 10'7М 1,61±0,10 0,023±0,001 0,025±0,0013

10"5М 2,11±0,12* 0,032±0,001* 0,038±0,0010*

10"3М 3,15±0,25* 0,038±0,002* 0,046±0,0013*

Гидрокортизон 10"'М 1,68±0,10* 0,025±0,002* 0,030±0,0010*

10"5М 2,23±0,12* 0,033±0,00Г 0,042±0,0012*

10"3М 3,03±0,10* 0,038±0,001* 0,051±0,0011*

Дексаметазон 10_7М 1,62±0,20* 0,023±0,002* 0,025±0,0013

10"5М 2,10±0,10* 0,030±0,001* 0,034±0,0010*

10"3М 2,88±0,12* 0,035±0,001* 0,043±0,0013*

Примечание: В таблице приведены средние данные из результатов 6-8 опытов; * - различия групп статистически значимы по сравнению с контролем (р < 0,05)

Метаболическая активность фибробластов кожи человека при псориазе

Конечным этапом нашей работы явилось исследование метаболической активности фибробластов патологически измененной кожи при псориазе (Рис.6.).

В результате исследования сохранялись основные тенденции касательно действия глюкокортикоидов и гестагенов на клетки. По истечении 5 суток инкубации стероидов с клетками, гидрокортизон и, в большей степени, дексаметазон в концентрациях 10' и вызывали подавление их метаболической активности на 3040%, а в концентрации 10'5М - на 50%. Действие прогестерона являлось менее выраженным. АБМП в концентрациях 10 и

10"бМ подавлял метаболическую активность клеток приблизительно на 25-35%, а в концентрации 10*5М, подобно глюко-кортикоидам, оказывал максимальное действие, выражающееся в подавлении метаболической активности клеток на 55%) (Рис.6.).

жизнеспособность к лето к. %

и прогестерон ВЫЕШ В ШДр№ОрП!.!ОН я дексаметазон

ю-7м

10-ГЛ

1С'аМ

Рис. 6. Влияние стероидных соединений на метаболическую активность (жизнеспособность) фибробластов кожи мужчин при псориазе (5 суток инкубации) Примечание: достоверное отличие от контроля при р<0,05. Контроль - жизнеспособность клеток в отсутствии соединений (}00±10%)

Анализ данных, представленных на Рис.6., позволил определить ряды по эффективности подавления стероидами метаболической активности фибробластов кожи человека при псориазе (Табл. 7.).

Табл. 7. Ряды но эффективности подавления гормонами метаболической актив но -

сти ц тбробластов кожи мужчин при псориазе

инкубации Концентрация 5 суток

ГК>Д М>ПГ> А Б МП

ю"м ДМ >ГК>ПГ>АБМП

ДМ>АБМП>ГК>ПГ

Примечание: ПГ - прогестерон, ГК~ гидрокортизон, ДМ- дексаметазон, > - достоверное отличие между соединениями (р<0,001), > - недостоверное отличие.

Из таблицы видно, что через 5 суток инкубации клеток со стероидами, геста ген АБМП в концентрации 10'?М, наряду с гл юхокорти кила м и, оказывает выраженное антиметаболическое действие. Возможно, подавление метаболической активности клеток также косвенно указывает на анти п роли ф ератйвное действие соединения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Суммируя полученные результаты и учитывая данные литературы, можно заключить, что фиброблаеты кожи являются весьма перспективным объектом для изучения биохимических и молекулярных аспектов патогенеза псориаза и для поиска новых лекарственных средств, способных уменьшить проявление этого заболевания. В ходе работы нами было установлено, что лизосомальный аппарат фибробла-стов, интенсивность перекисного окисления липидов и параметры редокс-системы глутатиона в этих клетках подвержены регулирующему влиянию стероидных гормонов. Это воздействие зависит от их концентрации и заключается в снижении активности лизосомальных ферментов, повышении прочности их связывания с мембранами лизосом, а также в снижении интенсивности процессов перекисного окисления липидов и повышении антиокислительной защиты.

Нами впервые было установлено изменение исследуемых биохимических параметров в фибробластах при псориазе и возможность их коррекции с помощью стероидных соединений. При этом эффективность действия гестагенов не уступает глюкокортикоидам.

При анализе результатов исследования, проведенных на фибробластах кожи мужчин и женщин разных возрастов (условно здоровых и больных псориазом), мы выявили, что в патогенезе этого заболевания происходит снижение свободной и общей активности лизосомальных ферментов (в большей степени катепсина Див меньшей - Р-глюкозидазы) на фоне увеличения их высвобождения из мембран лизосом, повышение интенсивности процессов перекисного окисления липидов и снижение антиокислительной системы защиты (параметров редокс-системы глутатиона). Результаты экспериментов на фибробластах интактной кожи человека подтверждают таковые, проведенные на фибробластах интактной кожи крыс.

Кроме того, были установлены корреляционные связи между параметрами ок-сидантно-антикосидантной системы (содержанием ТБК-активных соединений (г5=0,875, р>0,05), параметров редокс-систем глутатиона (г5=-0,964, р>0,05)) и изменениями активности лизосомальных ферментов. При этом статистически значимых отличий между значениями этих параметров в фибробластах мужчин и женщин выявлено не было.

Анализ действия исследуемых гормонов на клетки показал, что влияние глюко-кортикоидов и гестагенов имеет противоположную направленность изменениям, происходящим в фибробластах при псориазе: снижение высвобождения лизосомальных ферментов катепсина Д и р-глюкозидазы из мембран лизосом, снижение интенсивности процессов перекисного окисления липидов и повышение антиокислительной системы защиты (параметров редокс-системы глутатиона). Этот факт подтверждает наше предположение о том, что гестагены обладают противовоспалительной активностью и могут быть рекомендованы к соответствующим испытаниям для последующего использования их в качестве компонентов комплексной терапии псориаза

выводы

1. В фибробластах интактной кожи человека и крыс пшококортикоиды (гидрокортизон, дексаметазои) и прогестерон, начиная с концентрации 10"7М, оказывают выраженное мембраностабилизирующее действие на лизосомы клеток. Действие АБМП зависит как от времени инкубации с клетками, так и от вида фермента, в отличие от исследуемых гормонов в концентрации 10"5М повышая свободную и общую активность Р-глюкозидазы.

2. Все исследуемые стероидные соединения (гидрокортизон, дексаметазон, АБМП, прогестерон) снижают интенсивность процессов перекисного окисления ли-пидов в фибробластах интактной кожи человека и крыс. Наибольшее антиокислительное действие оказывают гестагены, в концентрации 10"3М снижая содержание ТБК-активных соединений в клетках в 2 раза по сравнению с нормой.

3. Все исследуемые стероидные соединения (гидрокортизон, дексаметазон, АБМП, прогестерон) обладают выраженным антиокислительным действием, повышая параметры редокс-системы глутатиона (содержание восстановленного глута-тиона, активность глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы) в интактных фибробластах кожи, начиная с концентрации 10"5М. АБМП, наряду с глюкокортикоида-ми и в 2-3 раза более выражено, чем прогестерон повышает содержание вБИ.

4. Метаболическая активность фибробластов концентрация-зависимо снижается под действием всех исследуемых стероидных соединений. Глюкокортикоиды подавляют её на 30-50% спустя 2 суток инкубации с клетками, а гестагены более выражено проявляют своё действие в концентрации 10'5М только спустя 5 суток инкубации. При этом АБМП оказывает максимальное антиметаболическое действие, подавляя жизнеспособность клеток на 38%.

5. Псориаз в острой стадии сопровождается изменением всех исследуемых параметров: снижением свободной и общей активности лизосомальных ферментов в фибробластах псориатической кожи и выходом их из мембран лизосом, повышением интенсивности процессов перекисного окисления липидов (содержания ТБК-активных соединений) и снижением параметров антиоксидантной защиты (редокс-системы глутатиона). Действие всех исследуемых гормонов на клетки сопровождается повышением прочности связывания лизосомальных ферментов с мембранами лизосом, снижением интенсивности процессов ПОЛ, а также повышением параметров редокс-системы глутатиона, в зависимости от концентрации и срока инкубации с клетками.

Практические рекомендации

Результаты диссертации позволяют рекомендовать новый отечественный геста-ген АБМП для клинического исследования и последующего внедрения в практику в качестве противовоспалительного средства комплексной терапии псориаза и других дерматологических заболеваний с элементами воспаления.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ухина Т.В., Лига А.Б. Изучение антиокислительных свойств синтетического гестагена бутагеста./УСборник материалов XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство» М., 2007.- С. 890-891.

2. Ухина Т.В., Лига А.Б. Сравнительная оценка действия гестагенов на экспериментальные дерматиты в коже крыс.//Сборник материалов III Съезда фармакологов «Фармакология - практическому здравоохранению», Санкт-Петербург 23-27 сентября, 2007. - С. 2-1988.

3. Ухина Т.В., Лига А.Б. Влияние гестагенов на интенсивность процессов свободно-радикального окисления в фибробластах кожи крыс.//Сборник материалов XV Российского национального конгресса «Человек и лекарство» М., 14-18 апреля 2008,- С. 715-716.

4. Лига А.Б., Ухина Т.В., Шимановский Н.Л. Активность лизосомальных ферментов фибробластов кожи крыс при воздействии прогестерона и нового гестагена АБМП.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2008. - т. 145. - №1. -С. 50-52.

5. Владимирова Е.В., Лига А.Б. Ухина Т.В. Патогенетическое обоснование применения новых лекарственных соединений для терапии псориаза.// Материалы научно-практической конференции МОНИКИ «Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии» М., 28-29 мая 2008., С. 106-107.

6. Лига А.Б., Ухина Т.В., Ржезников В.М., Шимановский Н.Л. Исследование пролиферативной активности фибробластов кожи крыс при воздействии глюкокор-тикоидов и гестагенов.//Экспериментальная и клиническая фармакология. 2008. -Том 71. №5. -С. 44-47.

7. Лига А.Б., Ухина Т.В. Исследование метаболической активности фибробластов интактной кожи человека при воздействии глюкокортикоидов и гестагенов.// Материалы научно-практической конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины». М., 28 ноября 2008. - С. 63.

8. Лига А.Б., Ухина Т.В., Владимирова Е.В., Шимановский Н.Л. Некоторые аспекты этиологии и патогенеза псориаза и поиск новых лекарственных соединений для его терапии//Клиническая дерматология и венерология. - 2008. - №6. - С. 15-19.

Заказ № 73/06/09 Подписано в печать 15.06.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 www.cfr.ru; е-таП:т/о@с/г.т

Актуальность исследования

Псориаз, несмотря на появление в последние годы большого количества работ, посвященных как изучению его патогенеза, так и разработке новых методов лечения, до сих пор продолжает оставаться актуальной проблемой дерматологии [10; 106]. Это одно из наиболее распространенных хронических кожных заболеваний, которым, согласно данным ВОЗ, страдает до 3% населения мира, а в общей структуре заболеваемости кожи эта патология достигает 1215% [45; 75; 78; 150; 158; 198; 227]. Заболевание не только портит внешний вид и зачастую затрудняет общение больных с другими людьми, но и может приводить к инвалидизации, потере работоспособности и даже летальным исходам.

В настоящее время большинство исследователей определяют псориаз как заболевание мультифакториальной природы, относящееся к наследственно детерминируемым, системным заболеваниям человека и характеризующееся гиперпролиферацией эпидермальных клеток, воспалительной реакцией в дерме, а также патологическими изменениями со стороны различных органов и систем [73; 75; 106; 227]. Однако, несмотря на многочисленные исследования этого дерматоза, многие вопросы этиологии и патогенеза псориаза остаются неясными.

Особое место в этиопатогенезе заболевания отводится изменениям мик-роциркуляторного русла, активности перекисного окисления липидов (ПОЛ) и показателей антиоксидантной системы (АОС) [73]. Благодаря этим системам в организме на определенном уровне поддерживается ряд физиологических процессов в клетке (клеточная пролиферация, проницаемость мембран и др.) [2; 7], а изменение систем может приводить к нарушению функции клеточных мембран с последующим развитием патологических процессов [230]. В не меньшей степени, вероятно, на эти физиологические процессы влияют и различные ан-тиокисидантные системы кожи, основной из которых является редокс-система глутатиона [234]. По существующим в настоящее время экспериментальным данным эта система, как во всем организме, так и в коже поддерживается на стационарном уровне, выполняя множество функций (защита от активных кислородных соединений, участие в обмене эйкозаноидов, в процессах пролиферации и др.) [182]. Тем не менее, данные литературы о состоянии оксидантно-антиоксидантной системы у больных псориазом весьма противоречивы. По мнению одних авторов [112] у последних наблюдается повышение ПОЛ с неоднозначным изменением АОС, по мнению других [133] - снижение ПОЛ и повышение уровня антиокислительной защиты.

Кроме того, известно, что накопление продуктов ПОЛ является одной из причин повышения проницаемости мембран лизосом. При этом увеличивается выход кислых гидролаз в цитоплазму, что может отрицательно сказаться на течении процессов жизнедеятельности клеток [229]. Лизосомальный аппарат кожи принимает активное участие в её защитных реакциях и физиологических функциях [68], участвует в таких специфических процессах как кератинизация, деление клеток, пигментация, рост волос, секреция сала и т.д [116; 127]. Активность ферментов лизосом играет важную роль во всех системах поддержания гомеостаза. Кроме того, при определенных условиях ферменты лизосом могут участвовать в развитии самых различных патологий [40; 162]. Ряд исследователей отмечают при обострении псориаза увеличение активности лизосомальных ферментов в плазме крови [153]. Тем не менее, подобные сведения противоречивы и отрывочны.

В последнее время широкое применение в разных областях биологии и медицины находят клеточные культуры. Создание живого эквивалента кожи позволяет использовать модельные системы in vitro для изучения фундаментальных процессов происходящих в коже, в частности межклеточных взаимодействий, а также для тестирования новых фармакологических соединений [104]. Особое внимание уделяется культуре клеток фибробластов [84; 104; 145]. Фибробласты являются основными клетками дермы и играют важную роль в ряде физиологических процессов: при заживлении ран и ожогов, развитии рубцовой ткани, образовании соединительнотканной капсулы вокруг инородного тела и др. [46; 107]. Кроме того, существует предположение о том, что пусковые события при развитии псориаза могут быть связаны с воспалением в дерме [159], тогда как эпидермис вовлекается в процесс вторично. Первичность изменений дермы в псориазогенезе согласуется с установленной ролью в межклеточной кооперации фибробластов как активных участников дифференци-ровки и формирования специфичности эпидермиса, одновременно являющимися соматическими и иммунокомпетентными клетками [48; 143]. Дополнительным свидетельством первичности нарушений дермы является факт выявления в ней изменений сосудов до образования псориатических папул [35; 152]. Вероятно, исследование фибробластов кожи у больных псориазом позволит выявить некоторые новые механизмы развития патологического процесса, имеющего место при этом заболевании, и наметить новые пути его лечения.

Применение большого количества лекарственных средств в терапии псориаза часто оказывает лишь временный эффект, а в некоторых случаях приводит к осложнениям. [45; 50; 73; 227]. В связи с этим, проблема эффективного лечения больных псориазом также остается весьма актуальной.

В терапии дерматозов широко используются препараты на основе глюко-кортикостероидов [26]. Установлено, что глюкокортикоиды, усиливая синтез липокортинов, ведут к снижению выработки медиаторов воспаления, фосфоли-пидов, а также мукополисахаридов. Одновременно уменьшается количество ан-тигенпрезентирующих и тучных клеток и снижается активность лизосомальных ферментов, что ведет к уменьшению отека и сосудистой проницаемости [73]. Противовоспалительное действие глюкокортикоидов также в значительной мере связано с их способностью снижать интенсивность процессов ПОЛ. Известно, что гормоны могут дозозависимо регулировать и антиперекисную защиту организма за счет их влияния на редокс-систему глутатиона [100].

Тем не менее, обладая высокой противовоспалительной, гипосенсибили-зирующей и антитоксической активностью, глюкокортикоидные препараты при длительном применении часто могут вызывать различные нежелательные эффекты (атрофия кожи, телеангиэктазии, гипертрихоз и др.) [45; 105]. Учитывая родного тела и др. [46; 107]. Кроме того, существует предположение о том, что пусковые события при развитии псориаза могут быть связаны с воспалением в дерме [159], тогда как эпидермис вовлекается в процесс вторично. Первичность изменений дермы в псориазогенезе согласуется с установленной ролью в межклеточной кооперации фибробластов как активных участников дифференци-ровки и формирования специфичности эпидермиса, одновременно являющимися соматическими и иммунокомпетентными клетками [48; 143]. Дополнительным свидетельством первичности нарушений дермы является факт выявления в ней изменений сосудов до образования псориатических папул [35; 152]. Вероятно, исследование фибробластов кожи у больных псориазом позволит выявить некоторые новые механизмы развития патологического процесса, имеющего место при этом заболевании, и наметить новые пути его лечения.

Применение большого количества лекарственных средств в терапии псориаза часто оказывает лишь временный эффект, а в некоторых случаях приводит к осложнениям. [45; 50; 73; 227]. В связи с этим, проблема эффективного лечения больных псориазом также остается весьма актуальной.

В терапии дерматозов широко используются препараты на основе глюко-кортикостероидов [26]. Установлено, что глюкокортикоиды, усиливая синтез липокортинов, ведут к снижению выработки медиаторов воспаления, фосфоли-пидов, а также мукополисахаридов. Одновременно уменьшается количество ан-тигенпрезентирующих и тучных клеток и снижается активность лизосомальных ферментов, что ведет к уменьшению отека и сосудистой проницаемости [73]. Противовоспалительное действие глюкокортикоидов также в значительной мере связано с их способностью снижать интенсивность процессов ПОЛ. Известно, что гормоны могут дозозависимо регулировать и антиперекисную защиту организма за счет их влияния на редокс-систему глутатиона [100].

Тем не менее, обладая высокой противовоспалительной, гипосенсибили-зирующей и антитоксической активностью, глюкокортикоидные препараты при длительном применении часто могут вызывать различные нежелательные эффекты (атрофия кожи, телеангиэктазии, гипертрихоз и др.) [45; 105]. Учитывая вышесказанное, очевидна необходимость дальнейшей разработки новых эффективных методов лечения, направленных на получение положительного терапевтического результата при минимальных побочных явлениях.

В последнее время показано, что наряду с глюкокортикоидами, противовоспалительной активностью обладают новые синтетические соединения с гес-тагенной активностью [118; 233]. В ряде исследований продемонстрирована способность прогестерона и некоторых других половых стероидных гормонов к регуляции множества патофизиологических реакций в коже при псориазе, старении, а также при заживлении ран [176]. Вероятно, гестагены могут быть использованы для топической терапии псориаза в концентрациях, действующих на лизосомальные ферменты и редокс-систему глутатиона фибробластов.

Учитывая вышесказанное, активности антиокислительной и лизосомаль-ной систем, в сочетании с метаболической активностью клеток кожи должны существенно изменяться при псориазе, что играет не последнюю роль в патогенезе развития последнего. Однако сведений о функционировании этих систем в коже при ее патологии, а также о влиянии на них гестагенов явно недостаточно, для того чтобы судить о субклеточных механизмах их действия на клетки кожи.

Таким образом, исследование фибробластов кожи представляет значительный интерес для дальнейшего изучения фармако-биохимических аспектов патогенеза псориаза, а также для проведения скрининга новых лекарственных соединений для терапии этого дерматоза.

В связи с этим, в данном исследовании были поставлены следующие цель и задачи.

Цель исследования:

Изучение и сравнительный анализ влияния ряда стероидных соединений с глюкокортикоидной и гестагенной активностью на интенсивность работы окислительных систем, активность ферментов лизосом и метаболическую активность в фибробластах интактной и патологически измененной кожи при псориазе.

Задачи исследования:

1) Оценить влияние гестагенов и глюкокортикоидов на активность лизо-сомальных ферментов (Р-глюкозидазы, катепсина Д) в фибробластах интактной кожи человека и крыс.

2) Изучить интенсивность процессов ПОЛ в фибробластах нормальной кожи при действии исследуемых стероидов.

3) Исследовать влияние стероидов на состояние антиоксидантной редокс-системы глутатиона в фибробластах кожи здоровых доноров.

4) Выявить влияние стероидных соединений на метаболическую активность фибробластов кожи в норме.

5) Определить активность лизосомальных ферментов, интенсивность ПОЛ и состояние антиоксидантной редокс-системы глутатиона в патологически измененной коже больных псориазом при воздействии исследуемых гормонов.

Научная новизна работы

В работе впервые изучено в опытах in vitro влияние нового отечественного гестагена АБМП (17а-ацетокси-3 Р-бутаноилокси-6-метил-прегна-4,6-диен-20-он) на интенсивность работы окислительных систем, активность ферментов лизосом (катепсина Д, Р-глюкозидазы) и метаболическую активность культуры фибробластов интактной и патологически измененной кожи больных псориазом. Установлены корреляционные связи между параметрами оксидантно-антикосидантной системы (содержанием ТБК-активных соединений (rs = 0,875, р>0,05), параметров редокс-систем глутатиона (rs = -0,964, р>0,05)) и изменениями активности лизосомальных ферментов в клетках.

Впервые установлено изменение исследуемых биохимических параметров в фибробластах кожи при псориазе и возможность их коррекции с помощью стероидных соединений. Показано, что АБМП, наряду с глюкокортикои-дами, обладает выраженным мембраностабилизирующим, антиокислительным и антиметаболическим действием на фибробласты нормальной и патологически измененной кожи человека и может быть рекомендован к соответствующим испытаниям для последующего использования его в качестве компонента комплексной терапии псориаза.

Показано, что фибробласты кожи являются весьма перспективным объектом для изучения биохимических и молекулярных аспектов патогенеза псориаза и для поиска новых лекарственных средств, способных уменьшить проявление этого заболевания.

Теоретическая и практическая значимость результатов исследования

Полученные в работе результаты необходимы для более глубокого понимания механизмов этиопатогенеза псориаза и обосновывают целесообразность клинического изучения гестагенов в качестве противовоспалительных средств в дерматологической практике, в том числе при лечении псориаза. Данные позволяют рекомендовать фибробласты к использованию в качестве экспериментальной модели для дальнейшего изучения фармако-биохимических аспектов патогенеза псориаза, а также для скрининга новых лекарственных соединений, эффективных в терапии этого распространенного хронического дерматоза.

Положения, выносимые на защиту

1. Гестагены оказывают выраженное мембраностабилизирующее действие на лизосомальные ферменты фибробласгов интактной и патологически измененной кожи, повышая прочность связывания катепсина Д и Р-глюкозидазы с мембранами лизосом и ограничивая тем самым повреждение клеток.

2. АБМП, наряду с глюкокортикоидами, обладает выраженными антиокислительными свойствами, оказывая влияние на параметры оксидантно-антиоксидант-ного равновесия и способствуя нормализации окислительных процессов в клетках кожи при псориазе.

3. АБМП обладает выраженным антиметаболическим действием в отношении фибробласгов кожи, концентрация-зависимо подавляя их активность.

4. Псориаз в острой стадии сопровождается выходом катепсина Д и глюкозидазы из мембран лизосом, повышением интенсивности процессов пе-рекисного окисления липидов и снижением параметров антиоксидантной защиты (редокс-системы глутатиона) в фибробластах кожи.

Внедрение результатов исследования

Результаты работы внедрены и используются в научно-исследовательской работе и теоретическом курсе занятий на кафедре молекулярной фармакологии и радиобиологии МБФ ГОУ ВПО РГМУ Росздрава и на кафедре дерматовенерологии Института повышения квалификации Федерального медико-биологического агентства (ИПК ФМБА).

Апробация работы

Официальная апробация работы состоялась на совместной научно-практической конференции коллектива сотрудников кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии медико-биологического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, ПНИЛ молекулярной фармакологии и кафедры дерматовенерологии Института повышения квалификации Федерального медико-биологического агентства (ИПК ФМБА).

Публикации

Основные положения работы доложены и обсуждены на совместных научно-практических конференциях сотрудников кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии МБФ ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, на XIV и XV Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва 2007, 2008), на III съезде фармакологов «Фармакология — практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), на научно-практической конференции МОНИКИ «Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии» (Москва, 2008). По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, включающего 250 источников отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 15 рисунками, 18 таблицами и 1 схемой.

ВЫВОДЫ

1. В фибробластах интактной кожи человека и крыс глюкокортикоиды (гидрокортизон, дексаметазон) и прогестерон, начиная с концентрации оказывают выраженное мембраностабилизирующее действие на лизосомы клеток. Действие АБМП зависит как от времени инкубации с клетками, так и от вида фермента, в отличие от исследуемых гормонов в концентрации 10"5М повышая свободную и общую активность (3-глюкозидазы.

2. Все исследуемые стероидные соединения (гидрокортизон, дексаметазон, АБМП, прогестерон) снижают интенсивность процессов перекисного окисления липидов в фибробластах интактной кожи человека и крыс. Наибольшее антиокислительное действие оказывают гестагены, в концентрации 10"3М снижая содержание ТБК-активных соединений в клетках в 2 раза по сравнению с нормой.

3. Все исследуемые стероидные соединения (гидрокортизон, дексаметазон, АБМП, прогестерон) обладают выраженным антиокислительным действием, повышая параметры редокс-системы глутатиона (содержание восстановленного глутатиона, активность глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы) в ин-тактных фибробластах кожи, начиная с концентрации 10"5М. АБМП, наряду с глюкокортикоидами и в 2-3 раза более выражено, чем прогестерон повышает содержание ОБН.

4. Метаболическая активность фибробластов концентрация-зависимо снижается под действием всех исследуемых стероидных соединений. Глюкокортикоиды подавляют её на 30-50% спустя 2 суток инкубации с клетками, а гестагены более выражено проявляют своё действие в концентрации 10"5М только спустя 5 суток инкубации. При этом АБМП оказывает максимальное антиметаболическое действие, подавляя жизнеспособность клеток на 38%.

5. Псориаз в острой стадии сопровождается изменением всех исследуемых параметров: снижением свободной и общей активности лизосомальных ферментов в фибробластах псориатической кожи и выходом их из мембран лизосом, повышением интенсивности процессов перекисного окисления липидов (содержания ТБК-активных соединений) и снижением параметров антиокси-дантной защиты (редокс-системы глутатиона). Действие всех исследуемых гормонов на клетки сопровождается повышением активности лизосомальных ферментов и прочности связывания их с мембранами лизосом, снижением интенсивности процессов ПОЛ, а также повышением параметров редокс-системы глутатиона, в зависимости от концентрации и срока инкубации с клетками.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДА]

ТТШ

Результаты диссертации позволяют рекомендовать новый отечественный гестаген АБМП для клинического исследования и последующего внедрения в практику в качестве противовоспалительного средства комплексной терапии псориаза и других дерматологических заболеваний с элементами воспаления.