Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Модуляция ассоциации липопротеидов низкой плотности крови человека

На правах рукописи

003052709

АКСЕНОВ ДЕНИС ВЛАДИМИРОВИЧ

МОДУЛЯЦИЯ АССОЦИАЦИИ ЛИПОПРОТЕИДОВ низком плотности

КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

14.00.16 - Патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2007 г.

Работа выполнена в Лаборатории механизмов атерогенеза Государственного учреждения Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии Российской АМН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук

Орехов Александр Николаевич Паиасенко Олег Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук

доктор медицинских наук, профессор

Клименко Елена Даниловна

Тихазе Алла Карловна

Ведущая организация: Российский Университет Дружбы Народов

Автореферат разослан «_»_2007 г.

Защита диссертации состоится «¿У» уЫСьр I сх^ 2007 года в _часов на заседании

Диссертационного совета при Научно-исследовательского института общей патологии и патофизиологии РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Л. Н.Скуратовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сердечно-сосудистые заболевания - наиболее распространенная причина смертности в развитых странах. Большинство сердечнососудистых заболеваний является следствием атеросклероза магистральных сосудов человека

Одним из ключевых моментов патогенеза атеросклероза является внутриклеточное накопление липидов, в частности эфиров холестерина, в протеогликановом слое интимы артерий [Аничков, 1947; Smith, 1974; Houst, 1978; Mahley, 1979; Fowler et al, 1979] Было показано, что эти липиды ведут свое происхождение от циркулирующих в крови липопротеидов низкой плотности (ЛНП) [Alaupovic, 1971; Cookson, 1971]. Однако нативные ЛНП не вызывают накопления липидов в культуре клеток [Bates et al., 1976, Ross, Harker, 1976; Goldstein et al., 1979] С другой стороны, было продемонстрировано, что различным образом модифицированные m vitro ЛИП (ацетилированные, обработанные малоновым диальдегидом, окисленные, гликозилированные и т.д.) характеризуются атерогенностью -способностью вызывать накопление липидов в культивируемых клетках [Goldstein et al, 1979, Fogelman et al., 1980; Khoo et al., 1990, Lopes-Virella et al., 1988].

Было показано, что модифицированные разными способами ЛНП образуют ассоциаты,

и эти ассоциаты проявляют атерогенные свойства [Tertov et al. 1989] Этот факт был подтвержден многими исследователями, изучающими захват клетками ассоциатов ЛНП, полученных in vitro любыми способами: вортексирование (интенсивное встряхивание) [Buton et al, 1999, Liorente-Cortes et al, 2000, Zhang et al, 2000], окисление медью [Hoffet al, 1992], окисление азо-инициатором [Kawabe et al, 1991; Tertov et al, 1998], обработка гипохлоритом [Hazell et al, 1994, Tertov et al., 1998; Панасенко с соавт, 2004], миелопероксидазой [Панасенко с соавт., 2004], фосфолипазой С [Zhang et al, 2000], сфингомиелиназой [Zhang et al., 2000; Marathe et al, 1999], протеазами [Piha et al, 1995], гликозидазами [Панасенко с соавт., 2006]. После установления факта атерогенности модифицированных m vitro липопротеидов приобрел актуальность вопрос о существовании подобных ЛНП m vivo.

В крови больных ишемической болезнью сердца были обнаружены циркулирующие множественно модифицированные ЛНП (цммЛНП) [Orekhov et al., 1989; Tertov et al., 1990], значительно отличающиеся от нативных по физико-химическим свойствам Так, они имели пониженное содержание сиаловой кислоты, маннозы и других Сахаров. В крови человека были обнаружены также так называемые мелкие, плотные [Shen et al., 1981; La Belle and Krauss, 1990, Avogaro et al., 1991] и электроотрицательные [Avogaro et al., 1988] ЛНП. И мелкие, плотные, и электроотрицательные ЛНП обладают весьма сходными, если не идентичными с цммЛНП свойствами и, по-видимому, представляют собой одну и ту же подфракцию липопротеидных частиц, подвергшихся множественной модификации m vivo [Tertov et al 1995]. Циркулирующие в крови модифицированные ЛНП обладают двумя общими важнейшими свойствами: стимулируют липоидоз на клеточном уровне (являются атерогенными) и проявляют склонность к ассоциации, причем, их атерогенный потенциал напрямую зависит от устойчивости к ассоциации и увеличивается с ее понижением [Orekhov et al., 1990; Tertov et al, 1989,1998]

Было установлено, что' без модификации ЛНП невозможна их ассоциация, без ассоциации ЛНП не проявляют выраженные атерогенные свойства [Tertov et al 1989] В связи с этим, представляет значительный интерес изучение механизмов ассоциации; изменений, которые происходят в частице ЛНП, теряющей устойчивость к ассоциации; а также выявление агентов, способствующих модификации липопротеидов и стимулирующих ассоциацию ЛНП, и, кроме того, ингибиторов ассоциации ЛНП. Учитывая это, цели и задачи настоящей работы были сформулированы следующим образом'

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение стимуляции ассоциации ЛНП ферментами и альдегидами эндогенного происхождения, ведущей к изменению основных структурных компонентов ЛНП, характеристика происходящих под влиянием различных модификаторов изменений главного стабилизирующего компонента частицы ЛНП - апоВ-100, поиск и изучение свойств экзогенных ингибиторов ассоциации ЛНП.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи;

1. Изучение ассоциации ЛНП крови человека, происходящей вследствие их протеолитической, липолитической, окислительной, десиалирующей модификации, а также модификации альдегидами эндогенного происхождения, ведущей к изменению основных структурных компонентов частицы ЛНП белка, липидов, полисахаридов

2. Используя панель моноклональных антител к апоВ-100, сравнить особенности пространственного расположения этого белка в различным образом модифицированных т vitro ЛНП и в цммЛНП.

3 Изучить влияние экзогенных биодоступных амфифильных блок-сополимеров окиси пропилена и окиси этилена (шпороников) на ассоциацию ЛНП.

Научная новизна работы. В работе впервые с использованием широкой панели моноклональных антител как к нативным, так и к модифицированным ЛНП исследованы особенности расположения антигенных детерминант апоВ-100 в циркулирующих модифицированных ЛНП и ЛНП, модифицированных in vitro протеолитическими, липолитическими, окислительными, десиалирующими ферментами, а также альдегидами эндогенного происхождения. Показано, что модификация ЛНП перечисленными выше агентами вызывает ассоциацию ЛНП Выявлено ингибирующее действие плюроников на ассоциацию ЛНП; изучено влияние структуры и свойств плюроника на способность подавлять ассоциацию ЛНП

Теоретическая значимость работы В диссертации показано, что изменение физико-химических свойств частиц ЛНП, которое может происходить в организме под воздействием различных модификаций, снижает их устойчивость к ассоциации Кроме того, показана возможность подавления ассоциации ЛНП при помощи экзогенных биодоступных полимеров - плюроников.

Практическая значимость работы. Работа носит фундаментальный характер, тем не менее, полученные результаты могут иметь практическое значение. Полученные результаты

открывают перспективы разработки принципиально новых подходов и средств, направленных на стабилизацию и повышение устойчивости ЛНП к ассоциации с целью профилактики, замедления или предотвращения агрегации ЛНП, а вместе с ней и торможения процессов отложения липидов в сосудистой стенке, а значит и развития ранних стадий атеросклероза

Положения выносимые на защиту:

1. Модификация любого компонента ЛНП (белка, липида, полисахарида) не зависимо от ее химической природы снижает устойчивость частиц ЛНП, вызывая их ассоциацию

2 Сравнение антигенных профилей цммЛНП и ЛНП, ферментативно модифицированных т vitro, свидетельствует о том, что ни одна из ферментативных модификаций (протеолиз, липолиз, десиалирование, окисление) не воспроизводит полностью изменений пространственного расположения апоВ-100 на поверхности частицы ЛНП, наблюдающихся в случае цммЛНП. Это значит, что формирование структуры цммЛНП является следствием множественной модификации липопротеидной частицы, происходящей in vivo

3 Экзогенные амфифильные блок-сополимеры окиси пропилена и окиси этилена -плюроники подавляют ассоциацию ЛНП. Эта способность зависит от гидрофильно-липофильного баланса и критической концентрации мицеллообразования плюроника, что свидетельствует о важной роли гидрофобных взаимодействий в ассоциации ЛНП

Апиобадия работы Материалы диссертации были представлены на: 13-м Международном симпозиуме по атеросклерозу (Киото, 2003); 75-м Конгрессе европейского атеросклеротического общества (Прага, 2005); 76-м Конгрессе европейского атеросклеротического общества (Рим, 2006), Третьем Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2006)

Публикации По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ в центральных академических, медицинских и международных изданиях.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, четырех глав с результатами экспериментов, обсуждения результатов, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 116 сгр , содержит 14 таблиц, проиллюстрирована 25-ю рисунками и схемами Библиография включает 125 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов

Обзор литературы

В обзоре литературы рассмотрены современные представления о роли модифицированных разными способами ЛНП в развитии атеросклероза, охарактеризованы циркулирующие в крови человека множественно модифицированные ЛНП, показано, что любая модификация

ЛНП in vitro приводит к снижению их устойчивости, увеличивая склонность к ассоциации. Увеличенные в размерах ассоциаты ЛНП вызывают интенсивное накопление холестерина в культуре клеток интимы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Суммарную фракцию ЛНП выделяли из плазмы крови человека методом препаративного ультрацентрифугирования в градиенте плотности NaBr на центрифуге L8-55 (ротор 65Ti; Beckman Instuments, Inc., США), как описано в работе [Tertov et al., 1995] Полученные ЛНП диализовали при 4°С в течение ночи против 4000 объемов изотонического фосфатного буфера (ИФБ, pH 7,4) и после этого стерилизовали фильтрацией (диаметр пор фильтра 0,45 мкм). Концентрацию белка в препаратах липопротеидов определяли по методу Lowryetal [1956].

Общую фракцию ЛНП разделяли на нативные и цммЛНП колоночной хроматографией на агглютинине Ricinus communis (РКА но)., иммобилизованном на CNBr-активированной агарозе [Tertov et al, 1990].

Для получения ЛНП модифицированных протеолитическими ферментами нативные липопротеиды инкубировали в присутствии трипсина или химотрипсина в течение 3,5 часов при 37° в среде содержащей изотонический фосфатный буфер (ИФБ) Модификация ЛНП липолитическими ферментами осуществлялась путем инкубации нативных липопротеидов с соответсвующими концентрациями фосфолипазы Аг или фосфолипазы С в присутствии 5 мкМ СаС12. Для проведения дегликозилирующей модификации нативные ЛНП инкубировали в присутствии фермента нейраминидазы Окислительная модификация ЛНП моделировалась путем обработки нативных липопротеидов миелопероксидазой в присутствии перекиси водорода Модификация ЛНП альдегидами эндогенного происхождения проводилась путем инкубации ЛНП с малоновым диальдегидом, глиоксалем или метилглиоксалем

Анализ модифицированных ЛНП. Экстракция липидов из ЛНП и их анализ. Суммарные липиды ЛНП экстрагировали, как описано в работе [Bligh and Dyer, 1967]. Изменения липидного состава ферментативно модифицированных липротеидов оценивались при помощи тонкослойной хроматографии. Электрофорез в полиакриламидном геле. Анализ фрагментации апоВ-100 ферментативно модифицированных ЛНП проводили при помощи электрофореза в ПААГ, используя буферную систему Laemmly [Laemmly et al., 1970].

Электрофорез в геле агарозы. Суммарный поверхностный заряд частиц ЛНП определяли с помощью электрофореза в геле агарогы [Schalkwijk et al., 1998]

Определение продуктов окисления липидов. Количество окисленных липидов в образцах ЛНП оценивали по содержанию в них карбонильных соединений, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой [Uchiyama et al, 1978].

Определение содержания сиаловой кислоты в ЛНП. Содержание сиаловой кислоты в липопротеидах низкой плотности проводили по Warren (1959) с модификациями. Изучение особенностей структуры модифицированных ЛНП методом твердофазного иммуноферментного анализа. Для определения связывания ЛНП с моноклональными

антителами использовали метод твердофазного иммуноферментного анализа. Моноклональные антитела мыши к апоВ-100 человека, полученные методом гибридизации, и их характеристики были любезно предоставлены лабораторией клеточной инженерии ИЭК РКНПК (зав лаб. Т.Н. Власик) [Яиушевская с соавт., 1999]. Всего в работе было использовано 7 антител, продуцируемых клонами: 2ЕЗ, 2G1, 7С2, ЗС8, 5F8,4С11 и 3G4.

Определение относительного размера ЛНП (метод флуктуации светопропускаиия). Степень ассоциации ЛНП оценивали методом регистрации флуктуации светопропускания луча лазерного света длинной волны 780 им на двухканальном агрегометре (модель LA220, НПФ БИОЛА, Россия) [Tertov et al, 1989, 1992].

Для изучения агрегационной способности ЛНП их, как правило, предварительно освобождали от имеющихся ассоциатов путем фильтрования через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и инкубировали при 37°С в изотоническом фосфатном буфере (ИФБ, GIBCO, Paisley, Великобритания; КС1 0,2 г/л, КН2Р04 0,2 г/л, NaCl 8 г/л, Na2HP04 1,15 г/л, рН 7,2), содержащем 1 мг/мл ЭДТА.

Определение размера ассоциатов ЛНП. Размеры частиц ЛНП и ассоциатов липопротеидов определяли методом квазиупругого лазерного рассеивания на приборе Autosizer 2 (Malvern Instrument, Великобритания).

Основные характеристики использованных в работе плюроников. В работе использованы плюроники Р85, L61 и F68 [BASF, США], любезно предоставленные профессором Ярославовым А. А. (Химический факультет МГУ, Москва, Россия). Основные характеристики плюроников приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Основные характеристики использованных в работе плюроников [Kabanov et al, 2002]

Плюроник Молекулярная масса, Да Критическая концентрация мицеллообразования, % Гидрофильно-липофильный баланс

L61 2000 >0,022 3

Р85 4600 0,005-0,05 16

F68 8400 >0,4 29

Статистическая обработка данных Достоверность отличий значений определяли с помощью двустороннего Ьтеста Стьюдента, отличие считали достоверным при р<0,05

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Ранее в крови больных атеросклерозом была обнаружена подфракция циркулирующих множественно модифицированных ЛНП (цммЛНП). Эта подфракция липопротеидов отличалась измененными физико-химическими свойствами, а также повышенной склонностью к ассоциации и способностью вызывать накопление липидов в культуре клеток. Была показана тесная связь между этими свойствами цммЛНП - только ассоциаты ЛНП вызывали накопление липидов в культуре клеток. Эти свойства цммЛНП обусловлены существенными изменениями структуры и строения модифицированных липопротеидов. Так, было продемонстрировано, что все компоненты цммЛНП существенно изменены по сравнению с нативными липопротеидами - модификации затрагивали как белковую, так и липидную и полисахаридную составляющие частицы ЛНП

В настоящей работе было проведено исследование влияния модификации отдельных компонентов частицы ЛНП на их способность к ассоциации. Предполагалось, что различные эндогенные агенты, моделирующие различные модификации частиц ЛНП m vivo, могут стимулировать ассоциацию ЛНП. Для моделирования протеолитической модификации и деградации основного белка ЛНП - апоВ-100 использовались протеолитические ферменты: химотрипсин и трипсин. Для моделирования липолитического действия и расщепления фосфолипидов ЛНП были использованы фосфолипаза А2 и фосфолипаза С. Десиалирующая модификация вызывалась с помощью фермента нейраминидазы. Альдегиды эндогенного происхождения, такие как глиоксаль, метилглиоксаль, малоновый диальдегид использовались для исследования гликозилирующей модификации ЛНП. Для имитации окислительной модификации был применен фермент миелопероксидаза.

Учитывая важную регуляторную роль апоВ-100 в метаболизме ЛНП и возможные изменения этого белка в процессе модификации частицы липопротеида, было проведено сравнительное исследование расположения этого белка на поверхности частицы цммЛНП и ферментативно-модифицированных липопротеидов Эта часть работы проведена с использованием панели моноклональных антител к апоВ-100. Четыре использованных в работе клона ЗС8, 4С11, 2ЕЗ и 5F8 распознают различные эпитопы апоВ-100 белка не модифицированных ЛНП, три других антитела 2G1, 7С2 и 3G4 специфичны к апоВ-100, модифицированному малоновым диальдегидом.

Было проведено исследование экзогенных агентов, влияющих на ключевое свойство модифицированных ЛНП - способность к ассоциации. Показано, что амфифильные блок-сополимеры окиси пропилена и окиси этилена, так называемые плюроники, способны подавлять ассоциацию липопротеидов.

Сравнение склонности к ассоциации циркулирующих множественно модифицированных и нативных ЛНП. Для исследования склонности к ассоциации циркулирующих множественно модифицированных и нативных ЛНП (нЛНП) был проведен следующий эксперимент. Общую фракцию ЛНП выделяли ультрацентрифугированием, подфракции нативных и циркулирующих множественно модифицированных ЛНП получали методом лектин-хроматографии на Ricinus Communis агглютинин (RCA^o) агарозе. Далее липопротеиды инкубировались в течении 6 часов при 37°С в среде, содержащей изотонический фосфатный буфер Через определенные промежутки времени

регистрировалась флуктуация светопропускания образца ЛНП, которая отражает средний размер частиц в растворе.

На рис. 1 приведены типичные кинетические кривые спонтанной ассоциации нЛНП и цммЛНП. Видно, что цммЛНП сами по себе в процессе инкубации при 37°С хотя и медленно, но ассоциируют в отличие от нЛНП (кривые 1 и 4 на рис. 1). Особенно отчетливо это становится видно в том случае, если инкубацию ЛНП проводили в присутствии индуктора агрегации - полиэтиленгликоля молекулярной массы 6000 (ПЭГ) (кривые 2,3,5 и б на рисунке 1) За 6 ч инкубации в присутствии 2% ПЭГ флуктуация светопропускания эмульсии цммЛНП увеличивалась в 2,5 раза, тогда как для нЛНП она достоверно не изменялась (кривые 2 и 5 , рис. 1). С ростом концентрации ПЭГ (до 6%) увеличивалась и скорость ассоциации ЛНП. Так флуктуация светопропускания за 6 ч инкубации в случае цммЛНП возрастала в 4,5 раза, тогда как в случае нЛНП - лишь в 3,4 раза (кривые 3 и б , рис. 1).

Приведенные результаты свидетельствуют о том, что цммЛНП нестабильны и склонны к спонтанной и индуцированной ассоциации.

Время инкубации, ч

Рис. 1. Кинетические кривые изменения флуктуации светопропускания суспензии нЛНП (7, 2, 3) и цммЛНП (4, 5, б) в отсутствие (1, 4) ив присутствии 2 (2, 5) или 6% ПЭГ (3, 6) Концентрация ЛНП 0,2 мг белка/мл, температура инкубации 37<>С

Влияние различных модификаций частицы нативных ЛНП на устойчивость липопротеидов к ассоциации

Влияние протеолитических ферментов на устойчивость нативных ЛНП к ассоциации.

Методом электрофореза в полиакриламидном геле было показано, что использованные концентрации ферментов вызывают протеолитическую деградацию апоВ-100 в составе ЛНП С другой стороны присутствие в среде инкубации фенилметансульфонилфторида (ФМСФ) -

неспецифического ингибитора протеиназ, предохраняло основной белок ЛНП от протеолиза

Для изучения влияния протеолитических ферментов на ассоциацию ЛНП липопротеиды инкубировались в присутствии трипсина или химотрипсина в течении 6 часов при 37°С в среде содержащей изотонический фосфатный буфер Результаты эксперимента с использованием химотрипсина приведены на рисунках 2 В отсутствие ферментов за 6 часов инкубации флуктуация светопропускания эмульсии нЛНП практически не изменяется, что свидетельствует об отсутствии ассоциации ЛНП (кривая 4 на рис. 2). Добавление к ЛНП трипсина или химотрипсина приводит к увеличению флуктуации светопропускания, что указывает на стимуляцию образования ассоциатов ЛНП. В случае химотрипсина повышение концентрации фермента, как показано на рис. 2, увеличивает флуктуацию светопропускания эмульсии ЛНП, а значит, повышает степень ассоциации частиц ЛНП.

В то же время, если в среду инкубации ферментов с ЛНП добавляли ФМСФ, то рост флуктуации светопропускания эмульсии ЛНП не наблюдался (кривая 3 на рис. 2) Это позволяет предположить, что наблюдаемое увеличение ассоциации частиц ЛНП является следствием протеолиза апоВ-100 и, возможно, изменения его конформации Результаты экспериментов указывают на то, что протеолитические ферменты являются стимуляторами ассоциации ЛНП.

Влиянне линолитических ферментов на устойчивость нативных ЛНП к ассоциации. Липолиз фосфолипидов ЛНП под влиянием использованных фосфолипаз был подтвержден при помощи тонкослойной хроматографии. В случае липопротеидов, обработанных фосфолипазой А2, был повышен уровень лизофосфотидилхолина, а при обработке фософлипазой С повышался уровень диацилглицерола

Также как в случае протеолитических ферментов было показано, что в отсутствие ферментов за 6 часов инкубации флуктуация светопропускания эмульсии нЛНП практически не изменяется, что свидетельствует об отсутствии ассоциации. Добавление к нЛНП фосфолипазы Аг или фосфолипазы С приводит к увеличению флуктуации светопропускания, что указывает на ассоциацию частиц ЛНП. Повышение концентрации фермента увеличивает флуктуацию светопропускания эмульсии ЛНП, следовательно, повышает степень ассоциации частиц ЛНП. Если в среду инкубации ЛНП с ферментом добавляли ЭДТА -ингибитор кальций-зависимых фосфолипаз, то ассоциация частиц ЛНП не наблюдалась

Влияние миелопероксидазы на устойчивость нативных ЛНП к ассоциации.

Инкубация нативных ЛНП при 37°С в течение 6 часов не приводила к увеличению флуктуации светопропускания эмульсии липопротеидов, а значит и не стимулировала ассоциацию частиц. В присутствии же миелопероксидазы наблюдалось заметное увеличение флуктуации светопропускания, что свидетельствует об ассоциации частиц ЛНП Такая потеря устойчивости ЛНП к ассоциации обусловлена активностью миелопероксидазы, поскольку в отсутствие одного из субстратов миелопероксидазы, а именно пероксида водорода, заметных изменений во флуктуации светопропускания, а значит и в размере частиц ЛНП, не наблюдалось.

Рис. 2. Кинетические кривые изменения флуктуации светопропускания суспензии ЛНП в присутствии {1,2,3) и в отсутствие (4) химотрипсина. Концентрация химотрипсина- 1 и 3 -1 Ед/мл, 2 - 0,5 Ед/мл; ЛНП 0,2 мг белка/мл, температура инкубации 37°С. Среда инкубации -ИФБ. Кривая 3 — то же, что и У, но в присутствии 0,5 мМ ФМСФ.

Влияние альдегидов эндогенного происхождения на устойчивость ЛНП к ассоциации.

Степень модификации ЛНП под действием альдегидов оценивали по изменению электрофоретической подвижности частиц. Известно, что обработка ЛНП альдегидами приводит к увеличению отрицательного заряда частиц ЛНП за счет уменьшения количества свободных аминогрупп и, следовательно, к увеличению электрофоретической подвижности. Было показано, что частицы ЛНП, модифицированные малоновым диальдегидом (МДА), метилглиоксалем или глиоксалем, обладают значительной электрофоретической подвижностью по сравнению с нативными ЛНП.

Совместно с лабораторией биохимии свободнорадикальных процессов ИКК РКНПК Росздрава (зав лаб профессор В 3. Ланкин) было изучено влияние МДА, глиоксаля и метилглиоксаля на процесс ассоциации ЛНП. Было продемонстрировано снижение устойчивости ЛНП к ассоциации под воздействием альдегидов эндогенного происхождения. При этом ЛНП, модифицированные МДА, агрегировали в 2 раза медленнее, чем ЛНП, модифицированные глиоксалем или метилглиоксалем

Влияние нейраминидазы на устойчивость нативных ЛНП к ассоциации.

Десиалирующий фермент бактериального происхождения нейраминидаза отщепляет а 2-6 связанную сиаловую кислоту, занимающую терминальное положение в гликопротеине апоВ-100

Резкое снижение содержания сиаловой кислоты в ЛНП, обработанных нейраминидазой, было подтверждено при помощи модифицированного метода Warren

(1959) Так, содержание сиаловой кислоты в ЛНП, инкубированных с 0,02 Ед нейраминидазы в течении 6 часов, снизилось на 73±2% по сравнению с контролем

Было изучено влияние нейраминидазы на ассоциацию частиц ЛНП. Как и в предшествующих экспериментах нативные ЛНП, не обработанные нейраминидазой, сохраняли устойчивость к ассоциации на протяжении 6 часов инкубации. В то же время, флуктуация светопропускания эмульсии ЛНП, обработанных нейраминидазой, неуклонно возрастала, что свидетельствует об ассоциации липопротеидов, модифицированных этим ферментом.

Изучение конформационных изменений апоВ-100 в цммЛНП и ферментативно модифицированных ЛНП. Все типы модификаций, которые мы использовали' протеолитическая, липолитическая, окислительная и десиалирующая — имеют место в циркулирующих модифицированных ЛНП [Tertov et al., 1992, Тертов, 1999] В данном разделе было показано, что любая из этих модификаций приводит к ассоциации ЛНП Остается неясным, какая модификация изменяет частицу липопротеида m vivo, делая ее атерогенной. Для ответа на этот вопрос мы сопоставили изменения в цммЛНП с изменениями, вызываемыми различными модификациями в нативных липопротеидах. Состояние поверхности ЛНП оценивали при помощи моноклональных антител к апоВ-100. Известно, что именно молекула апоВ-100 играет особую роль в стабилизации частицы ЛНП (Hevonoja et al., 2000). Существенные нарушения структуры этого белка неизбежно ведут к ассоциации липопротеидных частиц

Изучение конформационных изменений апоВ-100 в цмЛНП Результаты исследования взаимодействия нативных и цммЛНП с моноклональными антителами различных клонов представлены на рис 3. По различиям в связывании антител с нативными ЛНП и цммЛНП можно судить об изменениях в структуре множественно модифицированных липопротеидов. Так, было обнаружено, что антитело ЗС8 лучше взаимодействует с нативными ЛНП, чем с множественно модифицированными Можно предположить, что соответствующий эпитоп в составе апоВ-100 цммЛНП подвергается маскированию в результате модификаций и перестройки апоВ-100 белка. С другой стороны, цммЛНП эффективнее, чем нЛНП взаимодействуют с антителами клонов 2ЕЗ, 2G1 и 7С2. По-видимому, эпитоп, ответственный за связывание 2ЕЗ антитела (аминокислотные остатки апоВ-100 3728-4306) становится более доступным для взаимодействия с антителом в цммЛНП Повышенная способность цммЛНП связываться с антителами 2G1 и 7С2 может свидетельствовать о некоторой гомологии цммЛНП и МДА-модифицированных липопротеидов, к которым получены эти антитела (см табл. 2).

С другой стороны, в экспериментах с антителом 3G4, также распознающим МДА-модифицированные ЛНП, не было выявлено достоверных различий во взаимодействии нативных и цммЛНП с этим антителом. Следовательно, нельзя говорить о полном совпадении поверхностных структур МДА-модифицированных ЛНП и ЛНП, модифицированных т vivo.

Также не было выявлено изменений в структуре апоВ-100 цммЛНП при использовании антител 5F8 и 4С11. Эти антитела получены к участкам апоВ-100 с 1 по1297 аминокислотный остаток и с 2377 по 2658 аминокислотный остаток соответственно Вероятно, изменения структуры апоВ-100, происходящие в цмЛНП, не затрагивают соответствующие фрагменты N-концевого участка макромолекулы апоВ-100 Таким образом, при использовании четырех моноклональных антител к из семи были обнаружены различия во взаимодействии антител с цммЛНП и нативными липопротеидами

Изучение конформационных изменений апоВ-100 под влиянием протеолитических ферментов. Было обнаружено, что ЛНП, предварительно обработанные химотрипсином, эффективнее, чем нативные ЛНП взаимодействовуют с антителами клонов ЗС8 и 2ЕЗ (рис. 4) С другой стороны, нативные ЛНП лучше, чем ферментативно-модифицированные, связывались с антителами клона 4С11 (рис. 4) Использование других клонов не выявило достоверных различий в их связывании с нативными и обработанными химотрипсином ЛНП. В качестве примера на рис. 4 приведены результаты, полученные для клона 5F8. В табл. 2 приведены результаты исследования антигенных профилей апоВ-100 цммЛНП и протеолитически модифицированных ЛНП Видно, что только антитело 2ЕЗ в обоих случаях предпочтительно распознает модифицированные липопротеиды Возможно, в структуре цммЛНП и модифицированных химотрипсином ЛНП происходят сходные изменения, в результате которых соответствующий участок апоВ-100 (с 3728 по 4306 аминокислотного остатка) становится более доступным для взаимодействия с антителом. Кроме того, антитела 5F8 и 3G4, также как в случае циркулирующих модифицированных ЛНП, одинаково взаимодействовали с нативными и модифицированными липопротеидами Видимо, соответствующие участки апоВ-100 не изменены как в составе цммЛНП, так и в структуре модифицированных химотрипсином ЛНП. Приведенные факты могут говорить об определенном сходстве структур цммЛНП и модифицированных химотрипсином липопротеидов

и-й3 4.Т 7С2

м. «* \1

м • * лЛ 2

*» ы • 1 м 1 ы. '/ т

Концентрация ЛНП мкг/мл

4С11

У

° Концентрация ЛНП мкг/мл

Рис. 3. Кощентрационные зависимости взаимодействия нативных (1) и циркулирующих модифицированных ЛНП (2) с моноклональными антителами к апо-В человека. На графиках показаны данные типичного эксперимента, результаты которого представлены как среднее трех определений ± стандартное математическое отклонение Звездочкой отмечено достоверное отличие от нативых ЛНП, р<0,05.

г

ЛЯП, мкг белка/мл

Рис 4 Концентрационные зависимости взаимодействия нативных (1) и обработанных химотрипсином ЛПНП (2) с моноклональными антителами к ano В-100 человека. На графиках показаны данные типичного эксперимента, результаты которого представлены как среднее трех определений ± стандартное математическое отклонение

Изучение связывания моноклональных к апоВ-100 антител с модифицированными трипсином ЛНП показало, что клоны ЗС8 и 4С11 лучше взаимодействовали с нативными, чем с модифицированными трипсином ЛНП. Клоны 5F8, 2G1, 7С2 и 3G4 не выявили достоверной разницы в связывании с нативными и модифицированными химотрипсином ЛНП. Сопоставляя результаты взаимодействия моноклональных антител с цммЛНП и липопротеидами, модифицированными трипсином, необходимо отметить, что только антитело ЗС8 в обоих случаях сильней связывалось с нативными липопротеидами, чем с модифицированными (табл. 2). Еще два антитела не выявили различий как между нативными и цммЛНП, так и между ферментативно модифицированными и нативными липопротеидами. Как и в случае ЛНП, модифицированных химотрипсином, это антитела 5F8 и 3G4 (табл. 2). Вообще, как видно из табл 2, антигенные профили ЛНП, модифицированных трипсином и химотрипсином, отличаются значительной гомологией -пять из семи использованных антител одинаково реагируют с модифицированными трипсином и химотрипсином ЛНП В то же время, и в случае модификации трипсином, и при обработке химотрипсином только три антитела реагировали с протеолитически модифицированными липопротеидами также как с цммЛНП Итак, сравнивая антигенные профили протеолитически модифицированных липопротеидов и цммЛНП можно сделать вывод о некотором, но далеко неполном сходстве в расположении апоВ-100 на поверхности циркулирующих модифицированных и ферментативно модифицированных ЛНП

Изучение конформационных изменений апоВ-100 под влиянием лнполитических ферментов. С целью исследования влияния гидролиза фосфолипидов на конформацию апоВ-100 изучалось связывание моноклональных антител с нативными ЛНП и ЛИП, модифицированными фосфолипазами С или Аг. Было показано, что клоны 2ЕЗ и 5F8 эффективнее связывались с ЛНП, подвергнутыми липолизу под действием фосфолипазы Аг Клоны 4С11 и ЗС8 напротив лучше взаимодействовали с нативными ЛНП, чем с ЛНП, модифицированными фосфолипазой Аг Клоны 7С2, 2G1 и 3G4 не выявили достоверной разницы в связывании с нативными и модифицированными фосфолипазой Аг ЛНП Из табл. 2 видна гомология антигенных профилей цммЛНП и липопротеидов, модифицированных фосфолипазой Аг. В обоих случаях антитело ЗС8 предпочтительно реагирует с нативными липопротеидами, а антитело 2ЕЗ лучше связывается с модифицированными ЛНП В то же время, антитело 3G4 не выявило различий как между цммЛНП и нативными липопротеидами, так и между нативными ЛНП и липопротеидами, модифицированными фосфолипазой Аг- ЛНП, модифицированные фосфолипазой С, лучше чем нативные связывались с антителами 7С2 и 3G4 Для остальных антител достоверной разницы между взаимодействием с модифицированными фосфолипазой С и нативными ЛНП не обнаружено

Изучение конформационных изменений апоВ-100 под влиянием миелопероксидязы. При сравнении антигенных различий апоВ-100 нативных ЛНП и ЛНП, обработанных миелопероксидазой, было продемонстрировано, что нет достоверных различий во взаимодействии антител клонов 2G1, 5F8, 7С2 с нативными и ферментативно модифицированными ЛНП С другой стороны, антитела клонов 2ЕЗ и ЗС8 достоверно эффективнее связывались с апоВ-100 на поверхности модифицированных миелопероксидазой нативных ЛНП в сравнении с нативными ЛНП, тогда как антитела клонов 3G4 и 4С11, напротив, интенсивнее взаимодействовали с апоВ-100 нативных ЛНП. Результаты экспериментов суммированы в табл 2.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что инкубация нативных ЛНП с миелопероксидазой в присутствии субстратов фермента (Н2О2, С1") приводит к изменению конформации макромолекулы апоВ-100 на поверхности частицы нативных ЛНП. Эти изменения отчасти сходны с теми, которые происходят на поверхности цммЛНП - выявлено два антитела одинаково взаимодействующих с циркулирующими множественно модифицированными липопротеидами и нативными ЛНП. Так, антитело 2ЕЗ предпочтительно взаимодействует с модифицированными миелопероксидазой липопротеидами и цмЛНП, чем с нативными (табл. 2) В то же время, антитело 5F8 одинаково взаимодействовало с нативными, цммЛНП и модифицированными миелопероксидазой липопротеидами. Таким образом, при сравнении антигенных профилей цммЛНП и липопротеидов, модифицированных миелопероксидазой, выявлено только два совпадения.

Таблица 2

Антигенные различия апоВ-100 нативных ЛНП и ЛНП, обработанных различными ферментами М - антитело достоверно лучше связывается с ЛНП, модифицированными ферментом; Н - антитело лучше связывается с нативными ЛНП; 0 - различия в связывании антитела с нативными и модифицированными ферментом ЛНП не достоверны, М, Нд О — совпадения антигенного профиля цммЛНП и ферментативно модифицированных ЛНП

клон цммЛНП химотрнпсни трипсин фосфолнпам A] фосфолипаза С миелопероксидаза нейрамияидаэа

ЗС8 H M H H 0 M M

4С11 0 H H H 0 H 0

2ЕЗ M M 0 M 0 M M

5F8 0 0 0 M 0 0 M

2G1 M 0 0 0 0 0 0

7С2 M 0 0 0 M 0 M

3G4 0 0 0 0 M H 0

Видимо, модификация ЛНП только миелопероксидазой не может привести к появлению цммЛНП

Изучение конформационных изменений апоВ-100 под влиянием нейраминидазы.При сравнении способности моноклональных антител к апоВ-100 белку взаимодействовать с нативными и обработанными нейраминидазой липопротеидами было показано, что антитела ЗС8, 2ЕЗ, 5F8 и 7С2 предпочтительно связывались с ферментативно модифицированными ЛНП. Другие клоны. 4С11, 2G1 и 3G4 одинаково взаимодействовали с нативными и ферментативно модифицированными ЛНП Из четырех клонов, показавших лучшее связывание с цмЛНП по сравнению с нативными ЛНП, два антитела 2ЕЗ и 7С2 также предпочтительно распознавали модифицированные нейраминидазой ЛНП (табл. 2) Другое антитело 4С11 не выявило различий как между нативными и цммЛНП, так и между нативными и модифицированными нейраминидазой липопротеидами. Только три из семи антител одинаково взаимодействовало с цммЛНП и липорпротеидами, модифицированными нейраминидазой Это говорит о незначительном сходстве поверхностных структур цммЛНП и обработанных нейраминидазой липопротеидов

Сопоставление результатов изучения конформационных изменений апоВ-100 цммЛНП и ферментативно модифицированных липопротеидов.Описанные выше результаты изучения взаимодействия моноклональных антител с цммЛНП и ферментативно модифицированными липопротеидами обобщены в табл 2 Из данных этой таблицы можно сделать вывод, что ни одна из использованных ферментативных модификаций не воспроизводит антигенный профиль, свойственный для цммЛНП Для большинства ферментативных модификаций количество антител одинаково распознающих цммЛНП и

ферментативно модифицированные липопротеиды составляет три из семи использованных в работе В случае модификации ЛНП миелопероксидазой выявлено два совпадения с антигенным профилем цммЛНП. Можно также отметить некоторые общие закономерности взаимодействия моноклональных антител к апоВ-100 с модифицированными различным образом липопротеидами Так, антитело 2ЕЗ лучше реагирует с цммЛНП, липопротеидами модифицированными химотрипсином, фосфолипазой Аг, миелопероксидазой, нейраминидазой чем с нативными липопротеидами Вероятно, распознаваемый этим антителом фрагмент апоВ-100 с 3728 по 4306 аминокислотный остаток, становится более доступным для взаимодействия с антителом в результате большинства исследованных модификаций ЛНП. С другой стороны, антитело 5F8 выявило различия между модифицированными и нативными ЛНП; только в случае модификаций фосфолипазой А2 и нейраминидазой. Возможно, соответствующий фрагмент апоВ-100 (1-1297 аминокислотные остатки) устойчив к большинству исследованных модификаций

Экзогенные ингибиторы ассоциации ЛНП. На роль ингибиторов ассоциации могут претендовать так называемые плюроники - амфифильные блок-сополимеры окиси пропилена (ОП) и окиси этилена (ОЭ). Из литературных данных известно, что амфифильные биомолекулы, такие как аполипопротеин A-I, альбумин, способны подавлять ассоциацию ЛНП (Khoo et al, 1990; Liu et al, 1993) Было высказано предположение о том, что экзогенные биодоступные амфифильные полимеры также способны влиять на ассоциацию ЛНП. Для оценки ассоциации ЛНП и влияния плюроников на этот процесс было использовано два метода - метод флуктуации светопропускания и метод квазиупругого лазерного рассеивания. Во всех случаях результаты, полученные при помощи двух методов оценки ассоциации ЛНП, были сходными. Ассоциация ЛНП индуцировалась путем инкубации эмульсии ЛНП при 37°С и постоянном перемешивании. В данных экспериментах использовалась общая фракция ЛНП, выделенная из крови больных сердечно-сосудистыми заболеваниями. Было проведено сравнительное исследование действия плюроников с различными гидрофильно-липофильными свойствами на процесс ассоциации ЛНП. Так, использовались плюроник F68, обладающий высоким значением гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ) 29 и выраженными гидрофильными свойствами, плюроник L61, характеризующийся значительной гидрофобностью (ГЛБ 3), и плюроник Р85 с умеренными гидрофильными и липофильными свойствами (ГЛБ 16) В экспериментах были использованы концентрации плюроников кратные ККМ амфифильных блок-сополимеров. Эта часть работы была проведена в сотрудничестве с кафедрой высокомолекулярных соединений Химического факультета МГУ, (зав лабораторией - профессор А. А Ярославов)

Влияние плюроника P8S на ассоциацию ЛНП.На рис. 5 приведены типичные кинетические кривые изменения размера ассоциатов ЛНП в случае спонтанной ассоциации и в присутствии плюроника Р85. Видно, что при спонтанной ассоциации происходит образование ассоциатов ЛНП и увеличение их размера в зависимости от времени инкубации (рис. 5, кривая 1).

Рисунок 5 Кинетические кривые изменения среднего размера частиц ЛНП под влиянием плюроника Р85 Среда инкубации - ИФБ, рН7Д концентрация ЛНП 2,5 мг белкаЛлл, температура инкубации 37°С, скорость перемешивания 1000 об/мин Кривая (1) - суспензия ЛНП в отсутствие плюроника Р85, кривые (2) и (3) в присутствии, соответственно, 0,1% и 0,01% плюроника Р85

Рисунок 6 Кинетические кривые изменения флуктуации светопропускания суспензии под влиянием плюроника Р85 Среда инкубации-ИФБ, рН7,4, концентрация ЛНП 0,5 мг белка/клп, температура инкубации 37°С, скорость перемешивания 100 об/мин Кривая (1) - суспензия ЛНП 8 отсутствие плюроника Р85, кривые (2),(3) и (4) в присутствии, соответственно, 0,001% 0,1% и 0,01% плюроника Р85

В то же время в случае присутствия в инкубационной среде различных концентраций плюроника Р85 формирование ассоциатов заметно ингибировалось Так, добавление к эмульсии ЛНП до начала инкубации плюроника Р85 в концентрации 0,1% ингибировало процесс ассоциации после 4,5 часов инкубации на 93%, а применение концентрации 0,01% вызывало подавление процесса ассоциации после 4,5 часов инкубации на 79 % (рис. 5, кривые 2 и 5).

Аналогичные данные были получены другим методом. На рис. 6 представлены типичные кривые изменения флуктуации светопропускания эмульсии ЛНП в присутствии

различных концентраций плюроника в инкубационной среде. Как видно из рис. 6, наименьшая концентрация плюроника Р85 - 0.001% не оказывала влияния на процесс ассоциации ЛНП Когда плюроник Р85 добавлялся в эмульсию ЛНП в ходе инкубации, то есть когда процесс ассоциации частиц уже был инициирован, также наблюдалось предотвращение ассоциации липопротеидов. Плюроник Р85 в концентрации 0,1% добавлялся к эмульсии ЛНП после первого и после второго часа инкубации, в обоих случаях не происходило дальнейшего увеличения среднего размера частиц, т.е. ассоциация полностью подавлялась. Необходимо отметить, что добавление плюроника не вызывало уменьшение среднего размера ассоциатов, можно предположить, что под действием плюроника не происходило диссоциации образовавшихся ассоциатов ЛНП.

Влияние плюроника Е68 на ассоциацию ЛНП Было показано, что другой плюроник - Г68, характеризующийся выраженными гидрофильными свойствами и высоким значением ГЛБ, не оказывает влияния на процесс ассоциации частиц ЛНП. Использование большей концентрации плюроника Г68 (4%) также не приводило к угнетению процесса ассоциации ЛНП.

Влияние плюроника 1.61 иа ассоциацию ЛНП Применение обладающего выраженными гидрофобными свойствами и низким значением ГЛБ плюроника Ь61 приводило к подавлению ассоциации ЛНП. Так, в концентрации 0,022% плюроник Ь61 на 78% ингибировал рост флуктуации светопропускания эмульсии ЛНП после 2 часов инкубации. Использование большей концентрации плюроника Ь61 - 0,22% приводило к почти полному подавлению ассоциации ЛНП, а применение меньшей концентрации -0,0022% не влияло на ассоциацию частиц ЛНП Представляется интересным тот факт, что как в случае плюроника Р85, так и в случае плюроника Ь61 подавление процесса ассоциации вызывалось только в концентрациях, превышающих или близких к ККМ. Так, ККМ для Р85 составляет 0,01-0,03% и в концентрациях больших, чем 0,01% наблюдалось значительное угнетение ассоциации, а при уменьшении концентрации плюроника до 0,001% ингибирующее действие не развивалось ККМ плюроника Ь61 равна 0,022%, и использование концентраций больших, чем 0,022% эффективно ингибировало ассоциацию ЛНП, в то время как меньшие концентрации - 0,0022% не оказывали влияние на процесс ассоциации.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что способность амфифильных сополимеров окиси пропилена и окиси этилена ингибировать ассоциацию ЛНП прямо зависит от выраженности гидрофобных свойств плюроника. Плюроники с выраженными и умеренными гидрофобными свойствами способны значительно ингибировать ассоциацию ЛНП. Необходимо отметить, что степень подавления ассоциации прямо зависит от концентрации плюроника. Очевидно, именно мицеллярная форма плюроника способна вызывать ингибирование ассоциации частиц ЛНП, а унимеры плюроников ингибирующими свойствами не обладают.

Заключение. Суммируя полученные в работе данные, можно заключить, что различные модификации вызывают разноплановые изменения в структуре частицы ЛНП. расщепление апоВ-100 в результате протеолитической модификации, изменение липидного состава липопротеидов, обработанных фосфолипазами, накопление ТБК-реактивных продуктов вследствие окисления миелопероксидазой Все эти различные по своей природе изменения различных компонентов частицы ЛНП дестабилизируют частицу ЛНП и приводят к потере устойчивости к ассоциации. Таким образом, повышенная склонность к ассоциации является общим свойством всех исследованных типов модифицированных ЛНП. При любой использованной модификации наблюдалось значительное изменение конформации апоВ-100. Не только протеолитическая модификация способствует изменению структуры апоВ-100, но также липолитическая, дегликозилирирующая, окислительная модификации также приводят к перестройкам этого белка на поверхности частицы ЛНП. Довольно сложно отметить общие закономерности при сравнении профилей антигенных изменений апоВ-100 под действием различных ферментов. Сравнение антигенных профилей цммЛНП и ферментативно модифицированных ЛНП приводит к выводу, что ни одна ферментативная модификация не воспроизводит изменений структуры апоВ-100, происходящих в цммЛНП. В то же время известно, что цммЛНП характеризуются модификацией всех известных компонентов липопротеидной частицы. Полученные данные подтверждают предположение о том, что формирование структуры цммЛНП является следствием множественной модификации липопротеидной частицы и невозможно указать конкретную модификацию, ответственную за появление цммЛНП.

Из результатов исследования потенциальных ингибиторов ассоциации ЛНП можно заключить, что плюроники Р85 и 1,61, характеризующиеся выраженными или умеренными липофильными свойствами, способны значительно ингибировать ассоциацию ЛНП. По-видимому, липофильная часть амфифильной молекулы может взаимодействовать с гидрофобными доменами на поверхности частицы ЛНП, экранировать их и, таким образом, предотвращать процесс ассоциации ЛНП. В то же время гидрофильный плюроник Р68 не оказывал влияния на ассоциацию липопротеидных частиц. Кроме того, плюроники Р85 и Ь61 не вызывают диссоциации уже образовавшихся ассоциатов ЛНП, но предотвращают дальнейшую ассоциацию частиц. Вероятно, это может означать, что амфифильные полимеры способны стабилизировать не только нативные частицы ЛНП, но и образующиеся ассоциаты, однако не способны обратить процесс ассоциации вспять.

Учитывая большое значение ассоциации ЛНП в патогенезе атеросклероза, полученные данные о возможности подавления ассоциации с помощью плюроников могут стимулировать разработку новых подходов к терапии и профилактике атеросклероза С другой стороны, получены новые данные о разносторонней биологической активности плюроников Причины влияния плюроников на ассоциацию ЛНП, закономерности взаимодействия полимеров с частицами липопротеидов заслуживают дальнейшего изучения. Решение этих вопросов позволит окончательно раскрыть механизмы ассоциации ЛНП

выводы

1. Циркулирующие в крови частицы множественно модифицированных ЛНП нестабильны и склонны к ассоциации, что отличает их от нативных ЛНП.

2. Обработка нативных ЛНП протеолитическими, липолитическими, десиалирующими, индуцирующим окисление ферментами, альдегидами эндогенного происхождения приводит к существенным изменениям белковой, липидной и полисахаридной компонентов липопротеидной частицы и стимулирует ассоциацию модифицированных ЛНП.

3 Пространственное расположение ответственного за стабилизацию частиц ЛНП апоВ-100 в цммЛНП и модифицированных т vitro ЛНП отличается от его расположения в нативных ЛНП.

4 Ни одна из модификаций: протеолитическая, липолитическая, десиалирующая, окислительная, модификация эндогенными альдегидами не вызывает изменений пространственного расположения апоВ-100 белка, сходных с изменениями, происходящими в цммЛНП, что свидетельствует о множественном характере модификаций, приводящих к формированию цммЛНП в крови.

5. Амфифильные блок-сополимеры окиси пропилена и окиси этилена, так называемые плюроники, способны подавлять ассоциацию ЛНП, но не вызывают диссоциацию ассоциатов ЛНП

6. Способность ингибировать ассоциацию ЛНП и минимальная ингибирующая концентрация плюроников зависят от их гидрофильно-липофильного баланса и критической концентрации мицеллообразования, что свидетельствует о значительной роли гидрофобных взаимодействий в ассоциации ЛНП.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Аксенов Д.В , Мельниченко A.A., Супрун И.В., Янушевская Е.В., Власик Т.Н., Собенин И.А., Панасенко О М., Орехов А.Н. Гидролиз фосфолипидов фосфолипазами Аг и С нарушает конформацию аполипопротеина В-100 на поверхности липопротеидов низкой плотности, снижая их устойчивость к ассоциации // Бюл эксперим. биологии и медицины. -2005.-Т.140. № 10.-С.418-422.

2. Аксенов Д В, Мельниченко A.A., Собенин И.А., Панасенко О.М., Орехов А Н. Ферментативно модифицированные липопротеиды низкой плотности: протеиназы и фосфолипазы. // Третий российский конгресс по патофизиологии. Тезисы докладов

- М„ 9-12 ноября, 2004, -С.133.

3. Аксенов Д В , Мельниченко А.А, Супрун И.В., Собенин И.А., Панасенко О.М, Орехов А Н Изучение антигенной структуры апо-В 100 циркулирующих модифицированных и ферментативно модифицированных липопротеидов низкой плотности. //XII Российский национальный конгресс « Человек и лекарство», Тезисы докладов. 18-22 апреля 2005. -М. - С. 730-731.

4. Мельниченко A.A., Тертов В,В., Иванова О А., Аксенов Д.В , Собенин И.А., Попов Е В., Каплун В.В., Супрун И В , Панасенко О.М , Орехов А.Н. Десиалирование снижает устойчивость апоВ-содержащих липопротеидов к ассоциации, повышая их

атерогенный потенциал II Бюл. экспергш. биологии и медицины. -2005. -Т. 140 - № 7 -С. 60-64.

5. Панасенко О.М, Мельниченко А.А., Аксенов Д.В., Вахрушева Т.В , Супрун И.В , Янушевская Е.В., Власик Т.Н, Собенин И.А., Орехов А H Миелопероксидаза, модифицируя поверхность и снижая устойчивость к ассоциации липопротеинов низкой плотности крови человека, повышает их атерогенный потенциал // Биол. Мембраны. -2004 -№21.-С.498-505.

6 Панасенко ОМ, Тертов ВВ, Мельниченко АА, Аксенов ДВ, Собенин ИА, Каплун ВВ, Супрун ИВ, Орехов АН Связь размера дегликозилированных различными ферментами апо-В-содержащих липопротеинов с их атерогенный потенциалом // Биологические мембраны. -2006 - №23(7) -С. 43-52

7. Панасенко О.М., Аксенов Д.В , Мельниченко А.А., Супрун И.В , Янушевская Е В , Власик Т.Н, Собенин И. А., Орехов А.Н Протеолиз апопротеида В-100 нарушает его топографию на поверхности ЛПНП, снижая их устойчивость к ассоциации // Бюл экспергш биологии и медицины. -2005 -Т 140. -№11. -С 530-534.

8. Aksenov D., Melnichenko А, Suprun I, Sobenin I, Panasenko О , Orekhov A ApoB-100 antigen structure of naturally occurring modified and enzymatically modified low density lipoprotein И Atherosclerosis. -2005. -V.6. -№ 1. -P.61-62 (75th EAS Congress, 23-26 April, 2005, Prague, Czech Republic).

9. Melnichenko A., Aksenov D., Sobenin I., Panasenko O., Orekhov A. Low density lipoprotein enzymatic modification results in its aggregation and intracellular cholesterol deposition IIAtherosclerosis. -2005 -V 6. -№ 1. -P.71. (75A EAS Congress, 23-26 April, 2005, Prague, Czech Republic).

10. Melnichenko A., Aksenov D., Sobenin I., Panasenko O., Orekhov A. Different types of enzymatic modification cause aggregation of low density lipoprotein and intracellular cholesterol accumulation II Atherosclerosis - 2004 -V.5.- № 1 -V.16-11. (7Ath EAS Congress, 17-20 April. 2004 Seville, Spain)

11. Melnichenko A A, Aksenov D.V., Bukharkov A A., Sobenin I A., Panasenko О M , Yaroslavov A.A., Orekhov A N Pluronics inhibit aggregation of low density lipoprotein // Atherosclerosis 2006 V 7, № 3, -P.500-501 (XIV International Symposium on Atherosclerosis, Rome, Italy, June 18-22,2006).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

апоВ-100 - аполипопротеид В-100

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГЛБ - гидрофильно - липофильный баланс

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФБ - изотонический фосфатный буфер, рН 7,4

ККМ - критическая концентрация мицеллообразования

ЛНП - липопротеиды низкой плотности

ЛВП - липопротеиды высокой плотности

МДА - малоновый диальдегид

МПО- миелопероксидаза

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЭГ - полиэтиленгликоль со средней мол. массой 6000

ТБК - 2-тиобарбитуровая кислота

цммЛНП - циркулирующие множественно модифицированные ЛНП ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Отпечатано в типографии ООО «Документ Сервис ФДС» Объем 1.1 п л Тираж 100 экз Подписано в печать 15 02 2006 г Заказ №215

Ссрдеч ио-сосудистые заболевания наиболее iiiKiipotrpai юнная причина смертности в развитых странах Большинство сердечно-сосудистых заболеваний и ил лете я следствием атеросклероза магисгратышх сосудов человека

О линч из ключевых моментов патогенеза атеросклероза является внутриклеточное накопление днпндов. в частости >фнров холестерина, в иротсоглнкановом сдое интимы артерий [Антш. 1947, Smith, 107-1. Hou&t, 1978. Mahley, 1979, Fowler et al, 1979] Было показано, что чти лип иды ведут свое происхождение от циркрфуюшж в крови дипопротевдов ниткой плотности (ЛНП) [Alaupovic. 1971, Cookson. 197|| Однако натнпные ЛИП не вызывают накопления лннндов в культуре клеток [Bales ct а! . 1976, Ross, Наткет. 1976; Goldstein et al. 1979] С другой стороны, было продемонстрировано, что различным образом модифицированные т у иго ЛНП (ацетил ироваиные, обработанные малиновым диальлегняом. окисленные, глнкознлнрованные и т д ) характеризуются атерогенноетыо - способное! мо вызывать накопление лнпидов в культивируемых клетках [Goldstein et л1 , 1979, Fogelnuin el а!. 1980. Khoo et аЦ [990, Lopes-Virella ct al, 1988]

Было показано, что модифицированные равными способами Л Fill образуют ассоцнаты, и зти ассоцнаты проявляют птерогенные свойства [Tertov el а] 1989] Этот факт был подтвержден многими исследователями. издающими захват клетками ассоциатор ЛНП, полученных w vt/ro любыми способами вортскснрованне (интенсивное встряхивание) |Вцюп ct al. 1999, Licnemc-Cortes el al., 2000. ZJiang ct al 2OO0|. окисление медью [Hoff et al, 1992], окисление азо-ннициатором [Kawabe ct al. 1991. Tertov ct at, 1998], обработка гннохлоритом JHaiell et al . 1994, Tertov ei al 1998; Панасенко с соавт. 2004]. миелоперокеидазой ]Панасенко с соавт , 2004], фосфолнпазои С

Zhang et at, 2000], сфннгомнелинаэой [Zhang et al, 2000. Maraihe cl al. 1999J. протеазами [ftha cl al, 1995], гликозидазами |Нанаееико с соавт , 2006] После установления m vitro факта игерогенмости модифицированных липонротеидо» приобрел актуальность вопрос о существовании ш vivo модифицированных лнп

В кропи больных ншсмнческон 5d,iciiii<k) сердца были обнаружены циркулирующие множественно модифицированные ЛНП (иммЛНН) (Oiekltov ct al. 1989, Tertov et al, 1990], значительно отличающиеся от натииных по физико-химическим свойствам Так. они имели пониженное содержание сиаловой кислоты, маннозы н других Сахаров В кропи человека были обнаружены также так называемые мелкие, пдотщ« |Shen ct al, 1981, La Belle attd Krauis. 1990, Avogaro el al 1991] н мектроотрииательные jAvogaro el al. 1988} ЛНП II мелкие, плотные, и хчекфоотрниательные ЛНП обладают весьма сходными, если не идентичными с цммЛНП свойствами и, по-видимому, предегавляют собой одну и ту же полфракщно лнпопротендных частиц, подвергшихся множественной модификации in vivo [Tetiov el al 1995] Циркулирующие в кропи модифицированные ЛНП обладают двум« общими важнейшими свойствами стимулируют липомдот ил клеточном уровне {являются атсрогеннымн) н проявляют склонность к ассоциации. причем, их атеро генный потенциал напрямую зависит от устойчивости к ассоциации и увеличивается с ее понижением JOrekhov el al. 1990, Tertov el al, 1989,1998}

Было установлено, >1x0: без модификации ЛНП нево.1можна их ассоциация, а без ассоциации ЛНП не проявляют выраженные атерогеииые свойства [Tertov et al 1989] В связи с этим, представляет значительный интерес изучение механизмов ассоциация, изменений, которые происходят в частице ЛНП, склонной к ассоциации, а также поиск агентов, способствующих модификации липопротеилов и стимулирующих ассоциацию ЛНП, и, кроме того. ингибиторов ассоциации ЛНП Учитывая это. цели н задачи настоящей работы были сформулированы следующим образом

Це.н, н ы.ичн иселсдоаанин. Целью настоящей работы явилось »мучение стимуляции ассоциации ЛНП ферментами и альдегидами .шлоплинно происхождения, ведущей к изменению основных структурных компонентов ЛНП, характеристика происходящих под влиянием различных модификаторов изменений главного стабилизирующего компонента частицы ЛНП апоВ-100, поиск и изучение свойств экзогенных ингибиторов ассоциации ЛНП

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи

1 Изучение ассоциации ЛНП крови человека, происходящей вследствие их протеолнтнческой, лицо логической, окислительной, лес позирующей модификации, а "также модификации альдегидами эндогенного происхождения. ведущей к изменению основных структурмых компонентов частицы ЛНП белка, лнпидов. полисахаридов

2 Используя панель моноклинальных антител к агюВ-100. сравнить особенности Пространственного расположения этого белка в различным образом модифицирован) ных т vitro ЛНП н в цмыЛНП

3 Изучить влияние экзогенньсх бнодоступных амфнфнльных блок-сополимеров окиси пропилена н окиси этилена (плюроннков) на ассоциацию ЛНП

Нлучи ашновизна p-iilon,i. [1 работе впервые с использованием широкой панели моноклональных антител как к патнвиым. так и к модифицированным ЛНП исследованы особенности расположения антигенных детерминант апо13-100 в циркулирующих модифицированных ЛНП и ЛНП. модифицированных м Vitro протеолитическими. лииолнтнческими, окиелнгельнымн. десналнрукзшимн ферментами, а также альдегидами эндогенного происхождения Показано» что модификация ЛНП перечисленными выше агентами вызывает ассоциацию ЛНП

Выявлено иигибирующее лсйсшнс плюроннков на ассоциацию ЛИП, изучено «лия мне структуры н свойств плюроника на способность пода ал ять ассоциацию ЛШ

Гсощ'пгич кмч значимость работы D диссертации показа I to. тго изменение фшико-х и м нчес кнх свойств частиц Л НИ которое может

ПРОИСХОДИТЬ В ОрГвНИЭМС ПОД ВОЗДСЙСТВИСМ рЯЗЛНЧНЫХ модификаций. CII ИЖ51СТ их устойчивость к ассоциации Кроме того, показана возможность подавления ассоциации ЛИП при почоиш экзогенных биодоступных полимеров -гшюрокиков

Практическая нтчнмисть paoon.i. Работа носит фундаментальный характер, тем не менее, полученные результаты могут иметь практическое значение Полученные результаты открьпшмт перспективы разработки принципиально новых подходе* и средств, направленных нл стабилизацию и повышение устойчивости ЛНП к ассоциации с целью профилактики, замедлении или предотвращения агрегации ЛИП, а вместе с ней и торможении процессов отложения лнпндов в сосудистой стенке, а значит и развития ранних стадии атеросклероза

Положении выносимые на защиту:

1 Модификация любого компонента ЛНП (бедлка, пилила, полисахарида) не зависимо от ее хнмнчсеской природы снижает устойчивость частиц ЛНП к ассоциации.

2 Сравнение антигенных профилей цмыЛМЛ и ЛНП, модифицированных in vitro свидетельствует о том. '(то ни одна из ферментативных модификаций (лротеалнз, л и пол из, десналированне. окисление) не воспроизводит полностью ичмснений пространственного расположения агюВ»100 белка ни поверхности частицы ЛИП, наблюдающихся в случае имиЛНП Это позволяет предположить, что измененная структура цммЛНП является следствием множественной модификации лнпоггротеидной частицы, происходящей щ vivo.

Экюгснныс амфмфилъные блок-сополимеры окиси пропилена и окиси этилена - плюроинкн подавляют ассоциацию ЛНП Эта способность зависит от гндрофилыю-лнпофня иного баланса н критической концентрации ишнляообриошнк тюроника, «гто свидетельствует о важной роли гидрофобных взаимодействий в ассоциации ЛИП

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В данном обзоре литературы обобщены наиболее важные данные о природе и структуре иативиых ЛИП, модифицированных ЛНП и их свойствах, о значимости ассоциации ЛНП в атерогенезс и о подходах к моду ли им» асоцнаиии ЛНП.

1.1 СГ|Ю«И№ и ф\ нкцин чйспшы ЛНП.

Одним hi наиболее ранних проявлений втеросклсротнчсского поршню амяется внутриклеточное и внеклеточное отложение липндов, преимущественно эфнроа холестерина в интиме сосудов [Аничков 1947. Smith, 1974, Houst, 197». Mahl су, (979. Fowler et at, 1979} Было установлено, что источником лмннлов. накапливающихся ri клетках сосудов, являются ЛНП. циркулирующие в кропи человека (Baies et ¡ti, 1976. Ross. Harker. 1976, Wissler el al., 1976: Chen et al, 1977; Gotdslein et al, 1979] Лнпопротенди ниткой плотности и организме чьюим ответственны за транспорт холестерина к клеткам По классическим представлениям (Estcrbaucr cl al. 1992], частица ЛНП состоит из гидрофобного ядра, которое покрыто оболочкой hï фосфолинилов, холестерина и одной молекулы апоВ-ИЮ Ядро ЛНП состоит из примерно I60Ö молекул пермфминроааимого холестерина, и 170 молекул трнглнцс ридов [Esterbatier et al. 1992J Амфипатныи поверхностный слой построен из 7Û0 молекул фосфолипидоа и одной молекулы anoH-1 CK) белка Молекулы нетгернфипнреваннога (свободного) холестерина присутствуют как и составе ядра частицы, так и поверхностного слоя Фосфолнпнды предстаалены главным образом фосфатидилхолииом (500 молекул) и сфингоммелином (200 молекул) (си. рисунок I) Установлено, что anoEMOQ связывается в основном с молекулами фосфатидилхоли н a [üuid-Katt and Phillips . 1986; Sommer el al ,1992, Murphy et al, 1997], в то время как холестерин в большей степени связывается со ефнигомнелнном | Lund-Rat/ et al ,1988. Matt jus el al, 1996] Eure одна важная компонента ЛИП углеводная, представленная полисахарид ным и цепями связанными как с апоВ. так и с ли пилам h поверхности лнпопротенла В обоих случаях терминальным момосюарядеым остатком выступает еншш кислого (Millar d aí, 20011 (см рисунок 2).

Рисунок! Строение частицы ЛНП [no Kevonoja et al. 2000)

Л Г

ИЗ сфингочнелии " фосфо-гаднлхолнн ! лиэофосфсггндалхолнн холестерина нптерифеншромнн ый олеетернк аполнпопрптенн В-100 I

S Ma* í)1-> «IfitíWí Ч И- - Ar n I

NaáAc oí [Ib» íGfcHAí a 5 »

Put. 2, Последовательность caxupos в углеводной цени ЛИП (Sul сиалоьая кислота. Gal - галактоза Man манноза, GlcNAc Nацстнпглкжозоамнноглихан)

1,2 In vitro шинфнцнркваниыс .11111 склонны к ассоциации. Данная работа посвящена главным образом изучению ассоциации JIH1I Как уже указывалось выше, in vitro модифицированные ЛНП склонны к ассоциации Ассоциация ЛНП ннл>'пируете я разнообразными химическими реагентами (Cu2+, HiOi. суперокснд анион радикал, оксид азота, Ся2+} и изменениями условий среды, содержащей лилопротенлы (повышенная кислотность среды, изменении нежной силы среды) (Navab et ah 1996, Hoffet al 1992; Berliner and Heinecke, 1996; Ricc-Evans and Bruckdörfer. 1992. Wiztusn and Steinberg. 1991] Кроме того, ассоциацию ЛНП стимулируют различные бномолекулы ферменты |Xu and Tabas. 1991. Chao et al. 1992. Hakala et al 1999, Marathe a ai,

1999. Вс1кпс1 с! а1, 1993], компоненты межклеточного матрикса [Маог Ш1с1 Аушип, 1999, Сатс|о. 1982] Также показана стимуляция ассоциации ЛИП пол денем лиси физических процессов - вдртекенроши, интенсивного переме шнвлн и я

В интиме артерий н кровеносном русле существуют протеолнтическнс и лнполнтическне ферменты, способные модифицировать ЛНП и индуцировать ассоциацию липопротенлои Во внеклеточном пространстве интимы былн обнаружены химаза н триптазл. дм; нейтральные протеазы. секретируеыые тучными клетками [Каагнпеп с! а! 199-1], металлопротеинаты, секретируеыые макрофагами и гладкомышечнммн клетками (Оайа е( а) . 1994], шпииин [Сгат^ег а!, 1994], тромбин [Эти!» с( а1., 1996] и лн-юсочадынме гфотеяш |1-о,1<1а е( д1„ 1984, £икЬо\а & а1, 1998] Химаза тучных Клеток крысы может гидролиз о пять белковую часть ЛНП [Коккопеп с! л!. 1986, 1989], лнлосомальныс протеазы макрофагов разрушают апоВ-100 при кислых значениях рН [1еакс С1 а!. 1990]. Плазнин, каллмкреин. тромбин [Рйш е( а! „ 1995] и другие метадопротеинаш также способны модифицировать апибелок ЛНП

Было показано, что протеолнтическая деградация и по В- КМ) приводит к агрегации и слиянию частиц лнпопротекдов. ДпоВ-100 важный компонент поверхности ЛНП [Вашш1агк е1а1, 1990, Кгооп, 1994] Даже частичное удаленно апобелка с поверхности частицы приводит к реорганизации ее структуры и как следствие изменению структуры липндиого ядра По мнению некоторых авторов [Раапопеп апй Котами, 1994], прн нротсоличе апоВ-100 лнннды ядра перемещаются к поверхности частицы ЛНП. увеличивая се гкдрофобность Это может служить причиной слиянии частиц ЛНП Интересно, что при ннжой температуре (15"С). когда эфкры холестерина находятся я относительно упорядоченной состоянии и, вероятно, не способны передвигаться в сторону поверхности, частицы ЛНП с ноиршснкын Силком не ассоциируют

Во внеклеточном матриксе интимы присутствуют фосфолипаза А2 [Mcnschtkowski et al. 1995, Hurt-Carney ei al, 1997, Romano et al „ IWÄ] н сфингомнелинаэа [Sellóse! cl al . 1996. Marathe с» al. 1999] Фосфолипаза A2 гндроякзует фосфотидилхолнн ЛНП [Sanipy et al 1996] Сфингомнелннааа при кислых значениях pH гидролизует молекулы сфннгомнслини. особенно после гидролиза ЛН П в нейтрал иной среде фосфолнпаэоб А2 [Schissel el al . I9981

Сфингомнелинаэа гидролюуст молекулы сфикгомиелнна с образованием водорастворимых молекул фосфохалнна. которые удаляются из частнцы ЛНП, и молекул церамнда, которые остаются в ЛНП Было показано, тго обработка ЛНП сфингомиелниазой приводит к ассоиацнн н слиянию ЛНП (Xu and Tabas, 199 К Pcntikainen et al , 1996. Oörni et ni. 1998] Возможно, это происходит из-за увеличении содержании церамндп в частые [Schisscl el al ,1996J Известна, что церамид, а отличие от не гид рол н зояанного сфннгочислина, образует доиены в частное ЛНП [Huang el al , 1996, Holopaincn el al . 1998) Сф о p мированн ы е домены могут играть роль ненолярпыч плотов Fia поверхности частиц, гидрофобное взанмоде истине которых приведет к ассоиацнн Л Hit При понижении температуры до 15°С увеличивается жесткость лип ИД »ото ядра, вследствие чего замедляется диффузия сфингомиелння в поверхностном монослое ЛНП |Fcnskc el al, 199Ü], что в свою очередь частично замедляет образование микродомснов церамнда Key н Табас [Xu and Tabas. 1991] показали, что полученные лесоциаты вызывают КМртное увеличение уровня эфиров холестерина и макрофагах по сравнению с нагнвными ЛНП При этом скорость внутриклеточной дефадаини ассоинато» ЛНП возрастет лишь в 4 раза

Фосфолшииа А2 ускоряет гкарояиз эфнров жирных кислот п лл-2 положении Если ЛИП подвергаются действию фосфояипады А2 в отсутствие с взывающихся с липидамн белков (таких кок альбумин). гфбдут лнполюл -лизофосфлтидилхолнн и свободные жирные кислоты - накшишш п ЛНП Тем не менте, при физиологических концентрациях альбумина большая •теть жирных кислот н некоторое количество лизофосфатнднлхолнна переносится на альбумин [К1е1птап е! л1. 1988] Липолнэ ЛНП с поношью фосфолнпаэы А2 в присутствии альбумина приводит к конформаннонным изменениям апобелка и реорганизации липидного компонент ЛНП [Юеттап е1 а1. 1988. Оог^кспя е( а!. 1996), что вызывает агрегацию. гю не сятияе частиц ЛНП [ОСитн е\ я] . 1998] При шучении с помощью электронной микроскопии частиц ЛНП. модифицированных фоефолипатой А2, было показано, что они более мелкие чем штнпные лнпопротенды [Обгш е< а1 1998, А^егЬеск с1 а! . .ЧагИру й а1. 1999} В мелких частицах пропорциональное соотношение линидов и поверхностном монослое возрастает [ЬоПт е1 а!. 1996]. что делает поверхность лилопротендов более гидрофобной, увеличивая склонность днпопротеидоя к ассоцацни В то же время, увеличение лилидной составляющей п поверхностном слое делает его более жестким [СолЬкспа с! а1, 1996), -по препятствует слиянию модифицированных частиц

Интересно, что внесение гепарина до. во время или после обработки липопротендов фосфолипазой А2, вызывает их слияние [Н&Ыа е1 а1 , 1999] Так как обработка гепарином до липолизд способствует слиянию ЛНП. можно предположить, что взаимодействие ЛНП с глюноаойинногликанамн приводит к необратим мм изменениям конформапни агюбелка Возможно взаимодействие с гепарином увелнч икает женюииию лизин- и ар гинн н -содер ж а тих сегментов ипоВ-100 |Сл»^о е[ а1. 2000] и делает структуру ЛНП менее стабильной [Сате;о а!. 2000, Мшеи е! а!. 198*1]

Поврежденные фосфолннлзой Al ЛНП более чувствительны к последующей модификации другими форматами Такие ЛНП лроникают неспецнфичеекмч путем в цакрофигапъньк клетки, что приводит к накоплению внутриклеточных липидов К тому же ли^офосфолипиды и свободные жирные кислоты, выделяемые при взаимодействии фосфолипазы с ЛНП. также прояаляют атерогсииые свойства [НиП-Силиуо et al , 20011

Фосфолипаза С гидролнзует фосфолилиды до фосфоходина и диацил глицерина После обработки фосфолипазой С фскфочодин удаляется из ЛНП, а гидрофобный диаинлглииеркн остается как в лнпилном ядре, гак и на поверхности частицы ЛНП Взаимодействие с фосфолипазой С приводит к агрегации и слиянию частиц ЛНП [Suits с» al 1989. Liu el al , I9Í3J По всей верой i нос ím. это обусловлено образованием гидрофобных доменов на поверхности ЛШ1 С другой стороны было показано, ЛНП модифицированные фосфолиллюй С, вызывают накопление тгернфнннрованных стеролов в кульгнвнрчемых макрофагах [Heínecke et al , 1991] Причем модифицированные иссоцнлты ЛНП сначала локализуются в фагасомлх. затем попадают во вторичные лкюсомы. после чего образующийся свободный холестерин снова тарифицируется. формируя лнпидиые капли в цитоплазме В инти ме была обнаружена pH-зависимая nолестсркнзстсразa [Shamir et al. 1996, Li et al. 1998). которая способна гидролнзоьать лнэофосфолнпиды в окисленных ЛНП, а также в присутствии чолата, зфнры холестерина Наконец, микрофаги и пенистые клетки в стенке сосуда синтезируют лнзосомальную кислую липазу [Davis el al . 1985] Активен ли этот фермент во внеклеточном пространстве - неизвестно

В hin и ml- аорты ест* ферменты, способные к окислению липо протеидов 15-лнпокенгеназа [Yla-Heffluata el al. I990J. ниелопероксидаза [Dmgbnty el al, 199.1], гемохеигеназа-! [Wang et al. 1998] Также в интиме находятся NO' сккпзя fLuwnii el ¡il. 1998J и НЛДФ1 {-оксидан [Azumi ci ¡il. 1999], которые продуцируют ВССЬМЯ реакционные СОСДИНСНИЯ. СПОСоиИЫС ОКИСЛЯТЬ ЛНП Области нтеросклеротического поражения содержит также церуло rut аз м и н (Swam ce al, 1995] и ионы металлов переменной валентности [Swaincl al , 1995, Smith et al, 1992, Evans et al. 1995, Lamb cl al. 1995 ], которые способны усугублять окисление ЛНП

Окисленные ЛНП также имеют тенденцию к эссоцпинн шение было изучено при взаимодействии липоиротеидов е различными окислителями, такими как ионы иедн (Hoff et al , 1991], 2.2'амбмс-[2-аыидинол ponan]-гндрохлорил [Hoff et al .1992), гинохдорит [Cynshi ci al, 1994] В результате окисления ионами меди теряется целостность частицы ЛИП что приводи! к агрегации и слиянию лнпопротеидов (Hoffet al., 1991, PentikÜnen et al. 1996. Hoff el al, 1992, Cynsbl tí al, 1994, Vandcryse ct al, 1992. Dobian el al , 1993. Kawabe et al 1994, Mcyeret al, 1996) При окислении с помощью 2,2"-азобис-[2-амиди>юнропан|-гидрохлсц)11Да липопротенлы ассоциируют в той же степени, что и при воздействии с нонами меди [Kawube ci al., 1994] Выло проведено сравнение атерогениости аесоциатов и мономеров лннопротендов. модифицированных 2,2 ' -азобне -( 2-л м ндннопропвн )-гидрохлорцдом I lo кала но. что мономеры модифнннроваиных частно вызывали пиконленнс шпндов в клетках в гораздо меньшей степени, чем ассоцилты

В отличие от других типов модификаций, окисление приводит к изменениям как белковой, гак и лнпидной частей ЛНП Так. образующиеся при перокендаинн лнпилов гндропероксиды разлагаются до альдегидов, которые могут реагировать с апоВ-ЮО. что приводит к окислительной деградации аминокислотных остатков апобелка [Esierbaoer el al, 19921 Изменения, которые происходят в ЛНП ирн окислении, отчасти сходны с таковыми при действии л и политических ферментов Гак, при окислении атакуются непредельные жирнокнслотныс цепи фосфоянпндов на поверхности лнпопротсндов, которые íaTtM могут быть гидролизова нм эндогенной фосфолнлазой А2 Как было сказано ранее, лимфосфолнпнды и свободные жирные кислоты переносятся на альбумин, что влечет ta собой изменении в структуре поверхности ЛНИ, Повышая н\ склонность к ассоциации Г1рн окислении сннжашся подвижности поверхностных фосфолнпндов что препятствует л н пид-б ел к о вому паимодсисгимю и приводит к повышению полярности лнпнлноп част ЛИГ! [Paiiasenko et al, 199]. Eichenbergcr el al, 1982. Barcnghí et al , 1990] Окисление апоВ-100 также способствует ассоциации и слиянию частиц ЛИП Показано, что альдегиды, образующиеся в ходе окисления лннопротеилов, также реагируют с ЛНП, вызывая ассоциацию последних [Hoff and O'N'etl 1991] Хотя обработки гнпохлорнтом приводит к образованию малых количеств продуктов окислительной деградации ЛНП, она все же вызывает их ассоциацию более того, показано, что преимущественно деградируют гидрофобные участки алобелкя jPanasenko el al , 1991]

Итак, в организме человека существует множество факторов стимулиру ющих модификацию и ассоциацию ЛНП

1.3 Мо,шфи luipuiuiM иы? Л III I, tiiipKtlHp) Himiic и крови чс.тонска

А Н Ореховым и В В Тестовым с соавт в кровн пациентов больных ишемнческон болезнью сердца были обнаружены JIHII, отличающиеся от нативиых ЛНП сниженным содержанием сналовой кислоты "Зги лнпопротемлы были выделены с помощью мсктин-хроматографнн на Ricinus communis агглютинин (RCA и,) ara розе и получили название циркулирующие множественно модифицированные ЛНП (иммЛНП) (Orckhcv et at, 1989, Tertov et al . 1990] цммЛНП вызывали накопление лннндов в клетках интимы аорты человека и & макрофага*, то есть являются атеро генными [ОгекЬот е( з1. 1990, ТеПоу с1 а1, 1992] В цммЛНП, выделбнных ил крови больных атеросклерозом, содержание сиаловой кислоты было в среднем в 2-3 рала ниже, чем к нлтивных липопротеилах [ТеПоу с1 • '^92. 1995] Была установлено достоверная обратная корреляция между содержанием сиаловой кислоты и ЛНП и их способностью вызывать накопление лннидов М уиго [ОгвкЬот й а! 1992] Более того, нативпые липопротенды здоровых лиц после удаления сиаловой кислоты бактериальной ненрлминнлазон приобретали атерогенные свойства [Отек Кол с1 а1, 1989, 1991} Кроме измененного содержания сиаловой кислоты цммЛНП обладали целым рядом свойств, отличающих их от натнвных ЛНП [ТеПоч й и1. 1992; Терто в. 1999] Так, диаметр частиц цммЛНП был 14а 10-15% меньше, чем диаметр натнвных липопротемдов Плотность иммЛНГ! была достоверно ниже по сравнению с кативными ЛНП цммЛНП характеризовались более высокой 5лектро<1>орстнческай подвижностью, что говорит о повышенном поверхностном отрицательном заряде липопротендной частицы Дальнейшими исследованиями были продемонстрированы существенные различия в лилидиом составе нативных и цммЛНП [ТеЛде ьЧ а1. 1992. Тертов. 1999] (табл. I)

Так. содержание свободного и тарифицированного холестерина и трмглииерилов в цммЛНП здоровых лнп на 30*40% ниже, чем в нагивных л и попрете идах (для им м ЛНП и н.зтивных ЛНП пациентов с коронарным атеросклерозом на разница была 1,5'2 кратной) Уровень моноглицеридов н свободных жирных кислот цммЛНП здоровых лиц на 20-25% выше по сравнению с натнвными лмнопротеидамн (тэбл I)

В цммЛНП больных с ажиографнчески подтвержденным коронарным атеросклерозом содержание трнглмцерндов в 1,5-2 рам выше, а свободных жирных кислот, моно- и диглиперндов в 3-5 раз выше, чем в натплныч ЛНП

Циркулирующие модифиинроиаимыс ЛИП здоровых дин имеют сниженный уровень фосфатндилходина и фосфатнднлзтэноламина. а также увеличенное содержание лизофосфлтнлидхолнна цммЛНП пациентов с коронарным атеросклерозом содержат и 1,5-2 раза меньше фосфатидилхолнив,

Таблица I.

Содержание основных классов лнлилов в нагнаны* ЛНП и цммЛНП здоровых лиц и пациентов с коронарным атеросклерозом [ТеЛо\ et al, 1992. Тертое, |W9 J

Л и н ил Содержание лииидов в ЛНП, мкг/мг белка

Дорогие гп i v: Пацнщтты

EI^THBIIHIC Наивные лил ЧИкЛВП ЛИП цныЛНП

X'"." - ХОДФСГСрчнп J0ii±m li07±5i 223 5 ft 74 1412*30

ХОЛССТ^РНН 629129 4I1±14 63Si27

Трнглниеркии 1№М 3M±7 301±27 ]9й±12

Днглнцврццн J Sil t5±l l»2 2!il

Моногпииернлы 2Ш ife-l S2i4

Г auüfVLI Ыс жнр>|ые sit: 7St3 !J±2 !M±J

КкН^1(7|Ы

Ф.Ч'{ IT Hin м ГЦШ 90ÜOT 73Z±3b ] 1 )i Л {73437 иJ. ' - .'-i i хопнн tl±3 7Ш 54ЛА L03±4 фоефатнлилэтаноламина н сфингомиелина. а также к 2 рала больше лнюфосфатндилхолнна по сравнению с натиппыми ЛНП Содержание основных оксистеролов (7-ксто-, 5.Ь-лисн-, 7-окен- и 2 5-ОкенхаЛсстСр кнл ) в цммЛНП как здоровых лиц, так и лдциенггоа с коронарным атеросклерозом, в 2-4 раза выше, чем в нативных липопротендах Уровень жирорастворимых витаминок (Л и Е) в цммЛНП здоровых лиц достоверно ниже по сравнению с натнвными ЛНП В иммЛНП пациентов с коронарным атеросклерозом содержание вигамнноп Л и Е соответственно примерно в 1,5 и 1 раза ниже по сравнению с натпвными лннопротендлми Ныла обнаружена повышенная предрасположенность циркулирующих модифицированных ЛИП к окислению т vitro, которая, скорее всего, является следствием частичной потери жнрорастпорнмых витаминов, обладании их выраженными антнокнедительными свойствами [Tertov el al .

1992)

Было выявлено изменение третичной структуры белка ЛНП. а также модификация личнновых аминокислотных остатков, что являлось, по-видимому, причиной снижения связывания иммЛНП с аноВгЕ-рецептором [Тернов. 1999] В отличие от натаяиых ЛИП, иммЛНП способны СМ11ШПС1 со екзвенджер-рсцептором, аеналглнкопротгнд-реиептором н протсоглнканами клеточной стенки [Orckhov е4 at, 1992]. что было подтверждено и другими исследователями (Filipom et al., 1989, Taragucht et al, 1989]

Позже исследованиями в других лабораториях в крови человека были обнаружены ЛНП, характеризуемые повышенным отрицательным зарядом поверхности впоследствии выделенные с гюмошью ионообменной хроматографии [Avogaro et al, 1988] «Элек-тро отрицательные» липопротенды отличались от нативных ЛНП повы шейной способностью к ассоциации, увеличенным содержанием а побелка, модификацией некоторых, аминокислотных остатков, сниженным содержанием эфиров холестерина, фосфолипидов, витамина Е, а также вызывали накопление лнпидов в перитоннальнмх макрофагах мыши т vitro [Avogaro et al . (991, Cazzolllo el al , 1991] Впоследствии mi данные были подтверждены другими исследователями [Vedie et al .1991, Lm ei al , 1995] Также были получены данные о присутствии в крови человека фракции ЛНП. отличающейся от нативных меньшими размерами и более высокой плотностью тик называемые «мелкие плотные»

ЛНП [Shcn et ai, I9&IJ. Такие ЛНП имели пониженное содержание сноповой кислоты [La Belle and Krauss, 1990J и вызывалн накопление линндов макрофагами (Avogaro et al, 1991]

В табл 2 приведены лиеиешп основных физико-химических характеристик цммЛНЛ, -'злектро отрицательных» и «меякИх/плотных» ЛНП по сравнению с нативными ЛНП Можно вндегь целый рид признаков, общих как для циркулирующих модифицированных, тик н для «электроотрицательных» и «мелких/плотных» ЛНП малый размер частиц, высокая плотность, увеличенный поверхностный отрицательный ляряд, измененный лип иди ый состав и низкий уровень жирорастворимых витаминов, модификация аминокислотных остатков в составе апоВ-100. повышенная склонность к окислению, способность индуцировать внутриклеточное накопление липидов (атерогениосгъ) Кроме того, было показано, что в так называемых «олсктроотрииателмшх» лнпопротендах уровень енпловои кислоты значительно ниже, чем В наТИиных ЛНП [Tertov et al. 1995] На основе полученных данных был сделан вывод о том, что все обнаруженные в крови человека модифицированные fn vivo ЛНП « зл ектроотр и цзтел ьны с !►, «мелкие/плотные» н циркулирующие модифицированные ЛНП - представляют собой одну и ту же под фракции» близких но свойствам лнгюпротендных частиц, подвергшихся множественной модификации (Terlov et al, 1995, Те рта в, 1999]

Важно отметить, что циркулирующие модифицированные, «электроотрицательные» и «мелкие/плотные» ЛНП имели повышенную склонность к ассоциации (Tctlov et al . 19951 Таким образом, ключевыми свойствами m vivo модифицированных ЛНП являются пониженная устойчивость к ассоциации и способность вызывать накопление лнпнлов в культуре клеток

Причины появления нммЛНП в крови человека не ясны до енх пор Предположительно, модификация ЛНП может происходить под действием ферментов плазмы Так, было показано присутствие и плазме транс-снал плазм, фермент способного десиалировоть ЛНП крови человека [Tcflov et al 2001] Не исключено участие в in м\о модификации ЛНП и других ферментов плазмы

Таблица 2.

Сравнительная характеристика цммЛНП, «ллектроотрнштель-ных» н « мел кнх/пл ont ых» ЛНП, обнаруженных в крови человека по сравнению с нативными ЛНП [Тертов, 1999]

Параметр цмыЛМП "Э,1CKTJKIOTptlцлтсл*ИЫе Мелкие плотные ЛНП ЛНП

Атсрогенное г! I Т

Размер | 1 1

Плотность ? ?

Отрицательный заряд f Т Î

Сналовая кислота [ 1 i нри холестерина | i ;

Фосфолнпиды 1 i 1

Соотношение i i белок'лнпиды

Окислясмость т г

Антиоксиданты 1 i i

Модификация î ? аминогрупп

Ассоцацня | 1 t

Пришгчании Î - увеличение параметра гю сравнению с нагнвнымм ЛНП, | - уменьшение параметра по сравнению с нативными ЛНП. ? - исследования не проводилось l.-< Роль 4ИЧЧ1Ч11ЛННН ЛНП и якригпге».

Основная роль ЛНП в агерогенезе доставка лнпидов в сосудистую стенку и последующее жстраклет очное и внутриклеточное накоплении линндов в стенке сосуда Ниже будут изложены данные о роли ассоциации ЛНП во внеклеточном и внутриклеточном наконленнн линндов

1.4,1 Роль jii44HiinitiHi ЛШI во виу i рнкметочном накоплении инш ши.

Внутриклеточное накопление лмпидов в стенке сосуда, ведущее к формнрованню пенистых клеток, является ключевым моментом в патогенезе атеросклероза Результаты большинства исследований сводятся к тому, что инкубация нативиыч ЛНП с различными типами клеток не приводит к внутриклеточному накоплению липидов |Brown ei al. 1983, HaberlatwJ ei al , I9B7.198&] Тем не менее, в отдельных работах продемонстрировано накопление липидов в предварительно активированных монощпах-чакрофан'ах в результате инкубации клеток с высокими концентрациямн натняных ЛНП [КпцЬ ei al 2002. Krulh el al 2005]

Натнвиые ЛНП попадают в клетку через специфические ЛНП-рецепгторы. которые обладают механизмом отрицательной обратной связи (Golclslein and Brown. 1977] Это дает возможность клетке регулировать внутриклето'нюе содержание холестерина В то Же время ассоцнаты модифицированных ЛНП вызывают накопление липидов в различных типах клеток

Влияние различных модификаций, стимулирующих ассоциацию ЛНП, н» накопление липидов в культуре клеток достаточно хорошо изучено Например, было выдвинуто предположение, тго ЛНП могут быть гликознлированы in ivvo (зто особенно вероятно при заболевании диабетом) Были полечены гликознлнрованные ЛНП [Lopen-Virclla el al, 1988]. которые вызывали накопление лнпидов я клетках в .1 раза большее, чем нативные ЛНП Показано. что обработка лнпопротсндов ршичныин ферментами, такими как липоксигсната. миелопероксидаза. фосфолиплза А2 и С, ефнигомяеяяназа [Хи. Tabas , 1991. Chao e¡ al, 1992, Mejor, Avirwn. 1999, Hakala et al . 1999] также вызывает у »ел иченне их атерогенноети

Причины внутриклеточного накопления липидов, по-видимому, заключаются в особенностях взаимодействия модифицированных липонротеидов с клетками Так, Браун н Голkiштейн показали, используя культуру клеток мышиных лернтонепльных макрофагов [Goldslcin el ai 1979], что ацетил ированные ЛНП попадают в клетку не через апоВ.Е-, а через екзвенджер-реиепторы, неконтролируемые по принципу обратной связи, что приводит к чрезмерному неконтролируемому накоплению липндон в клетках Однако /п vtvo не существует предпосылок для ацетнлировлння Щ Тем не менее, Браун и Гольлштейн считали, что существуют другие eme не выявленные модификации ЛИП. «осле которых они захватываются скэвенлжер-реиептором к ацетмлнрованным ЛНП (Goldstein el al. 1979) Двумя годами позже Хенриксен с соавт [Hennkscn е< al, 1981] обнаружили, что после инкубации с зцдотелиальиымн клетками ЛНП приобретают способность вызывать накопление лип иное в макрофагах, при зтом захват клетками осуществлялся именно через скзвенлжер-реиспторы к аистилированным ЛИП Окне .тс иные, склонные к ассоциации ЛИП также захватываются человеческими моноцитами-макрофагами при помоши с кэвенджер-рс цегггоро& [Asnas et al 2040] Дальнейшие исследования показали гетерогенность семейства екзвенджер-рецеггторов окисленные, агрегированные ЛНП преимущественно взаимодействуют с сювенджер рецептором A {SRA I. SRA П|. модифицированные липопротеиды, сохранившие устойчивость к ассоциации захватываются при помоши CD36 и екзвенджер рецепторов В [Endcmann ci al 1993, Asmis et al 2005]

Существуют н другие пути поступления л клетку различным образом модифицированных ЛИП Так. было показано, что лнлопротеиды. обработанные малоновым диальдегндом (МДА) [Fogelman el al . 1980], также являются атсрогеинимн. тс способными вызывать накопление внутриклеточных ЛйПНЛО! Причем скорость захвата н jeipajaumi клетками МДА-моднфинированных ЛИП не изменялась при добавлении ацетил провал ныч или нативных ятшопротеидов Это значит, что они проникало! в клетку не через апоВ,Е> или ектенджер рецепторы

При изучении захвата ЛНП. модифицированных гнлохлоритом, обнаружено, что окисленные днпопротенлы вызывают внутриклеточное накопление лннндов, частично проникая « клеш} путем фагоцитоза. чктн адо через CD36 и SR-B1 рецепторы [Marsche et al. 2003]

Вортекснрование (интенсивное встряхивание) может служить моделью поведения лнгюпротендо» п м№№ ветвления сосудов. где возникнет высокое турбодинамнчеекое напряжение ЛНП после воздействия вортексом также вызывают накопление лип клоп в клепях JKhoo cl al, 1990] В промессе вортекенровамия образуются ч истицы более крупные, чем катившие липопрспенды. которые захватываются клетками путем фагоцитоза.

Предположение о значимости фагоцитоза п процессе захвата ассоциатор ЛИП было подтверждено впоследствии [Teriov et al] Было покатано, что мнкрисферы латекса, цитохалазкн В нтнтельно ингнбнроши захват меченых |И1 ассоцнатов ним Л HI I в культуре клеток Н1ГГИМЫ аорты человека Кроме того, была показана тесна» корреляция между степенью ассоциации и размером ассоцнатов цммЛНП и накоплением лииндов в метках

Еще одним возможным путем поступления в клетку ассоциатор ЛНП. является так называемый ЛНП-peueirfop родственный белок (LRP рецептор) Было показано , что этот pencil top участвует в захвате гдалкомышечнымн клетками коронарных артерий человека ассоцнатов ЛНП и лнпонратеидов, модифицированных версиканом [LJorenie~Cones et al 2000, 2002]

Таким образом, ане зависимости от типа модификации и механизма взаимодействия с клетками, асе известные модификации ЛНП. стимулирующие ассоциацию липопротендов индуцировали внутриклеточное накопление дипидов

1.4,2 Pit.il. ассоциации .11111 п жег ракле точном итложекнк лишишь.

Внеклеточное накопление дипндов в артериальной стенке также тесно связано с модификацией и последующей ассоциацией ЛНП Так. было показано, 'по даже внешне непораженная интима аорты содержит внеклеточные лннндные включения и везикулы [Tirau et al 1995] Кроме того, при введении экспериментальным животным - новозеландским белым кроликам ЛНП человека было продемонстрировано появление в сосудистой стенке лнпидных включений, напоминающих ассоцнаты ЛНП [Niovdstein ci al 1991] Кроме того, в ряде работ с использованием животных моделей [Мота et al 1*387, Tammmen cl al 1999, Nievelstcm-Posi et al 1994] было показано, что появление внеклеточных отложений лнпидов стимулирует миграцию моноцитов в стенку сосуда

Внеклеточные отложения дннидов можно рщелип> на четыре категории [Оотш et al 2000]: ЛНП-подобные частицы, частицы подобные липопротсидам очень низкой плотности (ЛОНП), липкдные везикулы, лнпнлные капли ЛНП-подобные частицы отличаются от наги а пых липопротендов низкой плотности увеличенным размером, сниженной гндратированной плотностью» повышенным содержанием лнзофосфолнпилов и сфингомнелнна, пониженным уровнем фосфотндилхолнма, частичной фрагментацией апоВ белка, повышенной >лектрофоретнчсской подвижностью, присутствием маркеров окисления Обшей чертой всех лигмпрогенд-нодобных частиц выделяемы к из сосудистой стснкн является их склонность к ассоциации fКлимов. Ннкульчева 1995] Этот факт и значительный по сравнению с кативными ЛНП размер лнпопротенд - подобных частиц говорит о важной роли ассоциации ЛНП в формировании жстракд сточных лнпцдных включений Липидные капли характеризуются размером 40-200 ни, значительным уровнем эфиром холестерина, низким значением гндратнрованной плотности Липидные везикулы не реагируют с моноклональными антителами к апоВ белку, насыщены ефнигомиелнном и неэтернфицнрованным холестерином, содержат альбумин, что говорит об их внеклеточном происхождении ЛОНП-подобные частицы весьма сходны с лкпопротендамн очень низкой плотности крови, но отличаются пониженным уровнем трмглнисрндов[Осгти el al 2000] По-видимому, все эти липидные включения ведут свое происхождение напрямую от лнгюпротеидов плазмы крови, проникших в стенку сосуда, а не являются результатом взаимодействия липопротенлов с клетками В пользу этого предположения говорит преобладание линолеата холестерина в липндныч включениях - как шиспю в ходе внутриклеточного метаболизма ЛНП происходит переэтерификация свойственного для ЛНП линолеата в олеат холестерина [Guyton ei al 1994. Smith 1974]. Кроме того, размер зкеграклеточкых лнпндных отложений - 30 - 400 им существенно меньше, чем размер внутриклеточных включений (400 - 6000 нм) [Guyton et al 1990. Chao et al 1990] Одной из возможных причин формирования внеклеточных лнпндных включений взаимодействие ЛНП с межклеточным матрнксом сосудистой стенки Так, было показано, что апоВ содержащие липидные капли тесно связаны с протеогликанамн и коллагеновымн волокнами стенки сосуда [Frank and Fogelman 1989 Tamminen M et aî 1999, Ntevebtem et al 1991] В то же время натнвные ЛНП слабо взаимодействуют с протеогликанамн сосудистой стснкн ш vitre при нейтральном pH и физиологических значениях ионной силы и концентрации кальция Лффипость взаимодействия лнпопротендов низкой плотности и межклеточного матрнкса значительно повышается при модификации и последующей ассоциации частиц Л НП [кепщ с! а1 1972. Сатср «I а! 19Н2] Так, модификация ЛНП фосфолипазой Л2. ведущая к ассоциации лмлопротеилных частиц, значительно иокышш способность ЛНП взаимодействовать с гликоааминогликамамн [БагЦру с1 а1 1999] н протсоглнканаыи аорты человека [Ойгги К е1 а1 1998] Обработка ЛНП ефнигомиелмназой. протеолитическнмн ферментами также приводит к ассоциации лнноггротеилов и увеличению связывания с межклеточным мнтрнксом [Оопи К с! а1 (998, Раавапеп Йа1 1994, Раапапеп с( а1 1995] Механизм связывания ЛНП межклеточным веществом, вероятно, заключается во взаимодействии положительно заряженных личина н аргинина апоВ белка н отрицательно заряженных карбоксильных и сульфатных групп гл икозамн нагл н капо в Увеличение количества молекул апоВ в ассоцнэтах и структурные перестройки аполипопротенна. делающие доступными новые места связывания, объясняют усиление взаимодействия ассоциатор ЛНП с межклеточным веществом (Оопн К е1 а1 1998, Раапапсп е£ а1 1995]

1,5 Ингибиторы ассоциации ,'ШП

Нтак. ассоциация ЛНП играет важнейшую роль ни ранних стадиях атерогенсза связанных с внеклеточным и внутриклеточным накоплением лнпилон Отсюда понятен интерес к потенциальным ингибиторам ассоциации ЛНП Однако исследован этот вопрос недостаточно КЬсн и соавторы показали, что ассоциация ЛНП, индуцируемая вортскснрованием или фосфолнпазой С. подавляется альбумином, дигюпротендамн высокой плотности [ЛВГ1] н аполипопротенном А-1 (КНоо е[ я1, 1990] В то же время 2,5 М N>01 не влиял на ассоциацию ЛНП Эти же авторы первыми предположили, что ассоциация ЛНП обусловлена гидрофобными взаимодействиями частиц Исходя hi этого способность ипоА-1 бедка подавлять ассоциацию ЛНП объясняется его амфнпатиымн свойствами, благодаря которым аполипопротоид взаимодействует с гидрофобными доменами на поверхности ЛНП н предотвращает, гаким образом, взаимодействие частиц Впоследствии Liu и соавторы подтвердили вышеизложенные результаты, продемонстрировав, что человеческий апо-\-1 и аиолннофорин насекомых ннгнбнрут ассоциацию ЛНП. вызванную обработкой фосфолипазой С [Liu et al. 1993] Talboi и соавторы показали, что термическая обработка альбумина увеличивала его способность ингиб кровать ассоциацию ЛНП По-вилимому. этч> явление связано с увеличением гидрофобностк денатурированного белка и. следовательно, увеличением способности экранировать гидрофобные дом сны ЛНП Эти же авторы пытались моделировать механическое воздействие тока крови на ассоциацию ЛЕШ В рамках этой модели также было показано ннгнбирующее действие компонентов плазмы на ассоциацию ЛНП (Talboi et al, 2СЮЗ] Таким образом, в ряде работ были описаны эндогенные ингибиторы ассоциаций ЛНП ЛВГ1. аж>А-1 и некоторые другие аполинротеиды, альбумин Все >ти бномолекулы объедини ют выраженные амфифнльные саойсшд

Вместе с тс.м почти не исследовано ал ил кис экзогенных а.чфифильных агентов на ассоциацию ЛНП Одним и:з гипотетически* модуляторов ассоциации ЛНП могут являться бкодоступиые амфифнльные б лок-е ополи меры оксида пропилена и оксида этилена, т и илюроннкн

1.6 Харяьгтсрнстнстнка и осноиные спонспш плюронккоа. 'Jth полимеры состоят из лмгюфильной - образованной окисью пропилена (ОП), и гидрофильной, построенной окисью этилена (ОЭ). частей и имеют следующую структуру [03]N-[0n]M-[(>3|N Такая структура определяет основные свойства плюроников. в том числе способность к образованию мицелл Важными характеристиками плюроннков являются критическая концентрация мнцеллообразоваии.« (ККМ), при превышении которой происходит сборка отдельных сополимеров в мицеллы, а также гидрофидмю-лнгофнльнмй баланс (ГЛБ). отражающий соотношение гидрофильных и гидрофобных свойств вещества [Kibanov А V et al, 2002] В настоящее время существует большое количество ачюроников. отличающихся количеством мономеров ОЭ н ОП, и соответственно характеризующихся ратными гмрофнльнимн Н Л НПофнЛ 1.НЫ.М И СВОЙСТВаМН. молекулярной массой н К КМ [Batracova et al, 2003] Так, полимеры, характеризующиеся значительным количеством остатков ОП и небольшим ОЭ отличаются высокой липофильностью, относительно низкими ККМ и ГЛБ - плюроникн 1.61, МП Напротив, плюроникн в составе которых ОЭ преобладает гидрофильны и характеризуются высокими значениями ККМ и ГЛБ (например, плюроникн F68 и FI0S) Наконец существует группа плюроннков с промежуточными свойствами - плюроники PÄ5, PI03 Активно исследуется возможность применения плюроннков в качестве переносчиков лекарственных средств, отличающихся низкой биодоступностью Показано, что >тя полимеры стимулируют транспорт ряда веществ через гемато-энцсфалнческин барьер [Batrakova et al. 2001 \

Также известно, что плюроникн тормозят выведение лекарства И1 раковых клеток, устойчивых к химиотерапии, по-видимому, ja счет подавления эффлюнеа лекарственных средств, опосредованных Р-гликонротенном Кроме того, плюроникн проявляют собственную разностороннюю биологическую активность, в том числе и способность в лишь на обмен липидов Так, при пероралыюм приеме плюроник L8I нарушал сборку н секрецию хнломнкроиов, способствовал снижению уровни холестерина ЛНП и лнпопротендов очень низкой плотности (ЛОНП) и предотвращал развитие индуцированных диешй гиперхолестсринемни и атеросклероза у крыс [Manowili NR el al, 19861 Ит вышеизложенного можно заключит!», что ассоциация ЛНГ1 играет важнейшую роль в атсрогенезе н тесно связана с внутриклеточным и внеклеточный накоплением лцпилов Однако возможности модуляции ассоциации ЛНП - кап стимуляции, так н подавления этого пронес« изучены недостаточно В згой работе приведены результаты исследования стимулирующего дейсгвия различных модификаций на ассоциацию ЛНН и изучения потенциальных экзогенных ингибиторов ассоциации ЛНП

1. ЭКС П Е РИМ Е HT АЛЬ нля ч лсть МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2 J Выделение и фрмкшюнвроняниг липопротешов iim?kq«í ninniwm 2.1,1 Доноры,

В работе была использована плазма н сыворотка кропи мужчин н женшнн и возрасте от 30 до 60 лет. больных ишемическои болезнью еерлиа (ИБС), и здоровых лиц (25-55 лет), у которых отсутствовали признаки ИБС в анамнезе и при медицинском обследовании Содержание холестерина н трнглииерндов в плазме крови не превышало 200 мг'дл и 150 мг/дл, соответственно

2 Л .2 Получение плазмы н сыпи ритм) кров».

Для получения плазмы кровь забирали утром натощак в пробирку с цитратом натрия (конечная концентрация - 0,38%) Препараты цситрифугировали 10 мин при вООхв (2500 об'мин) на цетрифупс Т/-6 (Beckman Instruments, Inc , США) Для предотвращения окисления ЛНП в ходе выделении к полученной плазме добавляли 10 мМ нонола

Дм я получения сыворотки кровь забирали из локтевой вены в пластиковую пробирку и инкубировали I час при 37Образовавшийся сгусток отделяли от стенок пробирки, после чего сыворотку центрифугировали в течении 15 мин при 800xg (2500 об/мин)

2,U Выделение суммарной фракции тнпонротен.топ ннзкпн к кщццтк нз плазмы кропи.

К плазме добавляли бромид натрия I Nalir) из расчета 0,5 г соли на I мл. разливали по 5 мл в 16х76-мм полнкарбоновые центрифужные пробирки (Bcckman Instruments, Palo Alto, CA) и наслаивали сверху по 5 мл раствора МаВг с плотностью 1.019 r/ил Пробы центрифугировали в течение 2 часов при 41000 об/мин на центрифуге L8-55 (ротор 65Ti, Beckman Instilments. hic . США) После ультрацентрифугнрованмч отбирали зону, содержащую ЛНП В образны Л HII сном добавляли Naßr из расчета 0,3 г соли на 1 мл пробы, повторно центрифугировали в тех же условиях и отбирали »ну ЛНП Полученные липопротеады днзлизовали при 4*С в течение ночи против 4000 объемов ИФБ (изотонический фосфатный буфер) pH 7.4 и после этого стерилизовали фильтрацией (диаметр пор 0,45 м км)

2.1.4 Определение концентрации бедка в препарата* ЛНП.

Концентрацию белка в препаратах липопротеидов определяли по метолу Lowry ei al 11956] с модификациями К пробе объемом 5-20 чкл добавляли 200 мкл свежеприготовленного 0,2 N раствора NaOH. содержащего 0.01% тзртрата калнн-нлтрня. 0,005% сульфата меди и 0,02% карбоната натрия, |0 мкл 1% раствора додецнлеульфата натрия (Boehnnger Mannheim. ФРГ), затем 20 мкл I N реактива Фолина {Sigma Chemical Company. США), перемешивали и выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут, после чего измерили оптическую платность проб на спектрофотометре "MiiltHcan МОС" При длине волны 690 нм н рассчитывали концентрацию белка я препарате В качестве стандарта использовали раствор БСА

2.1.5 Получение фракций натаяны* н цирку, гнруинпих множественно модифицированных лнпопротендоо шикой плотности,

ЛНП разделали на натнвные и циркулирующие модифицированные методом лектнн'чроматографни на Ricinus communis агглютинин (RCA) 20) агарозе, как описано ранее [Tcrtov ci а], 1990] Для разделения липопротеидов колонки, содержащие I мл RCA-120 -ссфарозы (Sigma-Aldrîch, США), уравновешивали 10 мл ИФБ. pH 7,2 Наносили 0,5-1 мл препарата липопротеидов. содержащего от 0,2 до 2 мг белка Колонку промывали тремя миллилитрами ИФБ При этом на аычодс получали фракцию липопротендов с нормальным содержанием сиадовой кислоты - натнвные лнпопротеиды низкой плотности Для удаления не специфически свивавшихся с сорбентом дипопротсидов колокк\г промывали десятью миллилитрами ИФБ. Фракцию яипопротеидов с низким содержанием еиаловой кислоты циркулирующие множественно модифицированные злюировали тремя миллилитрами 50 чМ галактозы

К полу ченным лнпопротеидам добавляли бромид натрия из расчета 0,3 г lia I мл образца и концентрировали методом ультрацентрнфугировання затем диализовали против 4000 объемен ИФБ. как описано выше

2.2 Получение модифнинрешлиных .1НП. Мсинфнк.шни .111П иротсолмтнческнмн ферчонпчи. Натнвные ЛИП подвергили нротеолизу Дзя зтого их инку бн|к> вали в присутствии трипсина (1 Ел/ил) (Serva, Германия) или хнмотрипеина ( 1 Ед/мл и 0,5 ЕД''мл ) I.Sigma, США) в течение 3.5 часов при ЗТГ в среде, содержащей изотонический фосфатный буфер (ИФБ, GIBCO. Paisley, Великобритания KCl 0J гУл. КН3Р04 0,2 г/я, NaCI 8 г/л, Na2HP04 1.15 г/л, pH 7,2) Концентрации ферментов указаны в подписях к рисункам Далее к ЛИП, подвергнутым лротеолнэу, добавляли бромид натрия из расчета 0,3 г на 1 мл образца и отделяли от фермента рецентрнфугированнсм при 1 i ООО об/мин (ротор Ti 50. Весkman, США) в течение 2 часов Полученные ЛИП днализовалн против ИФБ в течение 12 часов и использовали для иммуноферчентного анализа

2.2.1 Модификации ЛИП мнелоперокендяюн (М ПО),

Натнвные ЛИИ обрабатывали M ПО из нейтрофнлов человека (Piaina GmbH.

Вена, Австрия) Для зтого их инкубировали с ферментом (0,5 мкг/мд) в в присутствии пероксида водорода (40 мкМ) в течение 3.5 часов при 37*С я с реле, содержащей НФБ Далее к ЛНП, модифицированным M ПО, добавляли бромид натрия из расчета 0.3 г на 1 мл образна и отделяли от фермента реиекгрифу! нров.зннем при -I IООО об'мнн {ротор Ti 50. ßcckinari. США) в течение 2 часов Полученные ЛНП днолизовали против НФБ в течение 12 часов и использовали для иммуноферментного анализа

2.2.2 Модификации , Ш П лииолнтпческнмм ферментами.

Нативные ЛНП подвергали липоаилнтической модфикации Для этого 0,2 мг.'мл (по белку ) нативных ЛНП инку бировали с фосфолнпазои А: (líoehnnper Mannheim, Германия > или фосфолкпозой С (Sigma, США) в присутствии 5 мкМ CaClj в течение 3.5 часов при 37Т в среде, содержащей ИФБ В экспериментах использовались следующие концентрации ферментов фосфолнпвзы Л;. 0.125 мг/мл и 0.06 мг.'мл, фосфолипазы С • 1,5 Ед/мл и 0,83 Ед|!мл. Далее к ЛНП, подвергнутым ли по л из v. добавляли бромнл натрия из расчета 0,3 г на t мл образца отделяли от фермента рецентрнфугнрокшнем при 41000 об/чин (ротор Ti 50. ßcckman. США) в течение 2 часов Полученные ЛНП днализовлли против ИФБ в течение 12 часов и использовали для иммуноферментного анализа

2.2.3 Модификации .11111 деглнкошлнр) ннннмн ферчен i.imh -нейрнмнннлвзай.

Деглнкоэнлнрующая модификации« ЛНП осуществлялась путем инкубации нативных ЛНП с ферментом ненрамннндазой в среде, содержащей ИФБ Далее к модифицированным ЛНП добавляли бромид натрия из расчета 0.3 г на I ил образца нотделялн от фермента рс центрифугирован нем при 41000 об'мнн (ротор

Ti 50, Beckman. США) в течение 2 часов Полученные ЛНП диад изовали против ИФБ в течение 12 часов и использовали для нммунофермемпгмого анализа

2.2.4 Модификации ЛИП низкомолекулнрнымн альдегидами эндогенного происхождения.

ЛНП обрабатывали свежепригоговлеииым МДА. который получали из 1,1,3,3-тетр а этокс и про гш на путем кислотного гидролиза (Rcquetu J et al. 1997) Лилопротсидм (100 мы апоВ) инкубировали с I мкмоль МДА в темноте при 37°С нрН 6 5 |Fogelmai) А et а!. 1980]

Другие альдегиды глиоксаль. метнлглиоксаль использовали для модификации ЛНП в количествах, эканмолярных МДА

От избытка альдегидов, после модификации ЛНП. избавлялись ггрн номошн диализа против 2000 объемов НФН. рН=7 2 в течение 18 часов при +4 аС

2.3 \|шн> моднфнпнрованных . IHM. 2JЛ Экстракция лнннлоо н t ЛНП.

Суммарные липндм ЛНП экстрагировали по методу Bligh and Dyer, 1967 Для этого к 25 мкл ЛНП. содержащим 20-35 мкг белка добавляли 450 мкл смеси хлороформ-метанол 1:2 (объеЧ'обтлм), встряхивали и инкубировали при ком шпион температуре 2 часа в закрытых пробирках Далее смесь центрифугировали (4500 об/мин, 15 мин) и супернатант переносили в другую пробирку Осадок рееуспенднровали в 120 мкл дистиллированной воды н повторяли экстракцию хлороформ-метанолом, описанную выше Супернатанзы объединяли и добавляли бООмкл смеси хлороформа и воды в объемном соотношении 1 1, ннетснеивно встряхивали н центрифугировали 10 минут нрн 4500 об/MHH Затем тонкой пастеровской пипеткой отбирали хлороформную фазу, упаривали ce до сухого остатка, который растворили в 50 мкл смеси хлороформ-метанола 2 1 (об1*ем-объсч)

2.3.2 Аналнт лнпилпм .11111 при помощи тонкослойной Хроматш рафнн.

Изменения линидного состава ферментатнвно модифицированных лнпротенлов оцени вались при помощи тонкослойной хроматографии Ил пластины дли тонкослойной хроматографии (Merck. Германия) наносили полученный экстракт лниндоп ЛИП. а также стандарты лнпндов Нейтральные лнпнды отделяли прн помощи хроматографии а системе гексан-ацетон I 3 (объем-объем), Состав фосфолипидов анализировалн прн помощи тонкослойной хроматографии а системе хлороформ-метанол-уксусна* кислота-вода 251542 (объем-объем-объем-объем) Для визуализации пиков фосфолнпидов пластину погружали а раствор C^$04(3%>'H3P04(8%) и затем осуществляли нагревание пластины до 150*С Далее пластины сканировались при помощи денситометра Shimadxu С5-930 (Shirnadiu, Япония) прн длине волны 200 нм

2.3.3 Электрофорез в пол на крнл амид ном геле.

Анализ фрагментации ллоВ белка ферментативно модифицированных

ЛИП проводили прн помощи фореза в полиакрнламидном геле [ГТААГ]. используя буферную систему Laemmly Jl-aemmly et al 1970]. Гели с концентрацией полиакрнламнда 3 и "?% готовили на основе исходного акрнпамида и 0,8% X.N-бис-акриламида Концентрирующий гель 4% нолиакриламид в 0.125 M Трис-HCI. рН 6.8, 0,1% додсинл сульфат натрия Разделяющий 1з;ль - 7% пшжакрнламнд в 0.375 M Трис-HCt, рН 8,8, 0.1 % додецилеульфат натрия

Элскггроферстическнн буфер 0,05 M Трме. 0,384 M глнцнн. pli 8.3. Исследуемые образцы (5" 10 мкг белка) растворяли в 0,0IM Трис-HCl, pH S.O. 0,00| M ЭДТА, 1%додеиил сульфат натрии и нагревали 5 минут при WQf При проведении электрофореза поддерживалось, напряжение 60 вольт после вхождения белкоа л разделяющий гель напряжение поднимали до 120 вольт Использовали прибор для вертикального электрофореза с пластинами размером J 0*10 см. толщина геля I мм Окрашивание геля производили 0.1 25% раствором Coomasie Bine R-250 (Sigma. США). 2.J.4 Электрофорез м arnpowoM геле.

Суммарный поверхностный заряд частиц ЛИП определили с ночошыю электрофореза в агарозном геле [Schalkwijli С et а!. 1998] Лгарознмй гель 1*о агароза в 40 ыМ вероналовом буфере. pH 8,5 [40 нМ 5,5'днэтнбарбнтуроваи кислота. 4 мМ ЭДТА) Буфер для электрофореза 10 мМ Трнс-глипин. pH 8.0 Исследуемые образцы белка (5 мкг) растворяли « № мМ Трис- г л и им жда> м буфере. pH 8.0. содержащем 10% глицерин Электрофорез проводили п течение 45 минут при напри женин 90 В Для анализа ЛИП использовали I % агарозный гель Гель фиксировали 100 % метанолом (30 сек), окрашивали при помощи красителя Fai Red 7В От избытка красителя избавлялись 70 % метанолом Эл е ктроф о ретич ее кую подвижность модифицированных ЛИП сравнивали с наливными ЛНП

2,3,5 Определение шобирбнгурчи лн кислота |îl>k')-|iHnrr«(iHi.i\ продуктов,

К образцу ЛНП концентрацией 0,4 мг/мл rio белку объемом 0,5 мл добавляли 25 мкл 20 м\1 нокола (для предотвращения окисления во время тепа), перемешивали, добавляли 1.5 мл 1.5% HtPOj и 0,5 мл 0,5% ТБК, перемешивали, неплотно прикрывши пробирки пробками, выдерживали при 100СЧГ в течение 45 минут, охлаждали до комнатной температуры, добавляли по 2 мл «■бутанолп, тщательно перемешивали и центрифугировали 20 минут при 3000 об./мин для достижения расслоения фаз Далее отбирали верхнюю бутвнольную фазу и определили спектр ее поглощения п области от 515 им до 550 им относительно б утл иола Рассчитывали оптическую плотность при 532 нч относительно двух базовых длин волн * 515 им и 550 им

Qw«* íto=Dje-0.5 *psl j+DjjJ Содержание ТБК'реактивныч продуктов выражали через эквнвлленгное количеетво M ДА. считая мольный коэффициент экстннкцнн M ДА при 532 ни» равным 1.56* 10s M'см '

NiДА],, икМ»6»41* Dîxî jis ^|*[2000,''[объем образца в мл] ]

МДА], нмольЧи белка [[МДА]. мкМ' [белок, иг/мл] [Uchiyama el al I978|

116 Определение содержания сналовом кислоты в ЛНП.

Использовались по 4 аликвоты hi каждого препарата (2 - опытные, 2-контрольные для определения поправки на содержание ТВК-рсакгнвиых продуктов) К образцу, содержащему 50-100 мкг ЛНП (по белку), добавляли ргашй объем трмхяоруксусной кислоты, после чего псрсисшимми и инкубировали 20 минут при 4°С Пробы центрифугировали при 4500 об /мни в течение 10 минут, к осадку добавляли 200 мкл 0JI-I HjSOj и перемешивали Образцы гидролнзовалн при 80®С а течение I часа После охлаждения к опытным образцам добавляли 10 мкл 0.2 М HiJOli в 9 М HjPOj, к контрольным 10 мкл 9М HiP04, образцы тщательно перемешивали и инкубировали 20 минут при комнатной температуре Далее к опытным образцам добавляли 100 мкл 10Я» NaAsOj в 0,5М NajSQ* и 0.IN H3SOj, к контрольным 100 мкл 0,5М Na.-SOj., образцы тшатедыю перемешивали до исчезновения желто-коричневого окрашивания Сразу после этого к пробам добавляли 250 мкл раствор тмобарбнтуровой кислоты а 0,5М N"a;SO¿, перемешивали Далее образцы инкубировали на кипящей водяной бакс в течение 15 минут В охлажденные пробы добавляли 4Q0 мкл трет-бутвнояа Образцы интенсивно перемешивали на вортсксе в течение 5 секунд дважды с интервалом 5 минут Пробы центрифугировали при 4500 об., мин в течение 10 mhfs>t для разделения фаз Из органической фазы отбирали 250 мкл и переносили в 96-луночную планшет) и измеряли оптическую плотность при 540 им (Mullí skan Dichromatic (Labsystems OY. Helsinki. Финляндия» Среднее значение, подученное в контрольных пробах, характеризует содержание ТБК-реактианых продуктов Его вычитали из среднею значения, полученного в опытных образцах 13 качестве стандарта использовался раствор водный сиаловой кислоты 1мг. мл

2,3.7 Изучение особенностей структуры мплифнииропяннмх .1IHI методом тверлофи «нн ч иммуноферментно) о яналиш

M о нокл онол ьны с антитела мышн к апоВ-100 человека, полученные методом гибридизации, и их характеристики были любезно предоставлены лабораторией клеточной инженерии И ЭК PK H ПК (зав лвб ТН Власик) [Янушсвская с совет, 1099] Всего к работе было тнлшнию 7 ачитятел, продуцируемых клонами 2ЕЗ, 2GI. 7С2. ЗС8, 5F8, 4СП и íOJ Основные характеристики использованных антител ггрнведены в таблице 3

Для определении связывания ЛИП с моноклональными антителами использовали %-луночную плашку (Nunc, Roskilde, Дания) В лунки вносили 100 мкл поликлональных антител козы к anoß-100 человека (ИМТЕК, Россия) в изотоническом фосфатном буфере (ИФБ; GtBCO. Paisley, Великобритания, KCl 02 г/л, КН:РОд 0,2 г/л. NaCI 8 г/л. Na3HPOj 1.15 rín. pH 7,2) в концентрации I ы к г/мл и инкубировали в течение 24 ч при 4*С После каждой инкубации лункн промывали ИФБ, содержащим 0,2% БСА Далее в лункн вносили |0О мкл ИФБ, содержащего 2% БСА и инкубировали ) ч при комнатой температуре В лунки добавляли ЛНП и инкубировали 2 ч при комнатной температуре Диапазоны концентрации ЛНП были подобраны для каждого моноклонал иного антитела в предварительных экспериментах Затем в лункн добавляли tío 100 мкл монокяошльных антител мыши к апоВ-100 человека н инкубировали I ч при комнатной температуре Оптимальная концентрация монокдопальных антител

ТяОлнш J. Характеристика и спольэо ванны к п работе чоноклокальных антител

Антитело Антиген Эчптопная специфичность антител

5FS Апо-В-ЮО [-1297 аминокислотные остатки япо-В-ÍOO

4€11 Ало-В-100 2377-2658 аминокислотные остатки aïio-B'100

2ЕЗ Апо-В-100 3728-4306 аминокислотные остатки апо-В-ЮО

ЗС8 Ало-В-100

2GI Ano-B-VOO. модифицированный МДА *

7С2 Апо-В-100. модифицированный МДА

3G4 Апо-В-100. модифицированный МДА j была подобрана it предварительных экспериментах н составляла то 10 до 50 икг'.чл. В лунки вносили по 100 мкл меченых №{КЖСНФ№№ полнклональных антител козы к иммуноглобулинам мыши <1 мы мл) н инкубировали I ч при комнатной температуре Последующее проявление проводили добавлением 0,1 M нитратного буфера, pH 4.5, содержащего 0,04% ортофенилсидннммна и 0,003% Hj02 Инкубировали 30 мин при 37"С Реакцию останавливали добавлением 20 мил 50% Н:$Од Оптическую ПЛОТНОСТЬ измерили при длине полны >192 ни ни многоканальном спектрофотометре Mulliskan Bichromatic (Labsystems OY. Helsinki, Финляндия)

Для всех изученных моноклинальных антител проводились предварительные эксперименты с целью исключения возможности н\ неспеннфического связывания с поднклональными антителами козы к человеческому лпоВ«100

2.4 ()n|it№H'K№ cicncHii аееонняннн ЛНП н размера ассчцняюв. 2.-4.1 Определение относительного размера ЛНП (метод флукпацнн снегон ронусканни

Степень ассоциации ЛНП оценивали методом регистрации флуктуации светопропускатшя луча лазерного света длинной волны 7 КО нм на даухканальном агрегометре (модель LA220, НПФ БИОЛА. Росс и«) [Tertov et al, (989, 19921 Метод основан на том, что относительная дисперсия колебании оптической плотности, вызванных случайными изменениями в количестве частиц, попадающих в оптический путь лазерного луча, 01ражает отклонения от их среднего размера, то есть степень их ассоциации Увеличение флуктуации снетопропусканич свидетельствует об увеличении взвешенного среднего оптического радиуса части и Это даст возможность оценить изменения среднего размера частиц ЛНП в условных единицах Данный метод дает качественно схожие результаты с результатами, полученными методом квази-упругого светорассеяния, позволяющего непосредственно определять размер частиц ЛНП [Тст1о\ е1 а!, 1992]

Для изучения агрегационион способности ЛЕШ их, как правило, предварительно освобождали от имеющихся ассоцнзтов путем фильтровании через фильтр с диаметром нор 0,45 мкм и инкубировали при 37"С в изотоническом фосфатном буфере (ИФБ. ОШСО, Ра«1еу, Великобритания, КС! 0,2 г/л, КНаР04 0,2 г/я, N30! 5 г/л, ГЧл.НГО^ 1,15 г/л, рН 7,2). содержащем I иг/мл ЭДТА

2.4.2 Опрело. к'нне размера ассоинатоп ЛИН.

Раз меры частиц ЛНП и ассоцнагов лнпопротендов определяли и методом квазнупругого лазерного рассеивания на приборе АШовьеег 2 (\lalvem [пЫгитеш, Великобритания)

2ч5 Основные характеристики использованных п работе плюроннков.

В работе использованы плюронмки РЯ5. 1.61 и Р68 [ВАБР. США}, любезно предоставленные профессором Ярославовым А А (Химический факультет МГУ, Москва. Россия) Основные характеристики плюроннков приведены в таблице I

ТиСлшш*

Основные характеристики использованных в работе плюроников (Kabanov cl aJ 20021

Moxcsy.uptiui Крнтч-им;|!Ш( 1 .i.:j:iv:¡;>i : >ii> uacci, Да ишце^аиич лиипфшшыын баланс

1 С,Ч,||М1 l1 .il:" : . 11 и « %

LÈI 2000 «,022 3 l>SS 4600 O.OOS-O.OÍ Ib

FS S гим =0.4 29

2.6 Статистическая »^«Гюнл! данных

Достоверность отлнчнй значений определяли с помощью двустороннего t-теегта Стъюдснти; отличие считали достоверным при р<0.05

3, РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Ранее в крови больных атеросклерозом была обнаружена подфракцня циркулирующих множественно модифицированных ЛНЛ (цммЛНП) Эта нолфракинн лило протеидов отличалась измененными физико-химическими свойствами, а также повышенной склонностью к ассоциации и способности вызывать накопление лнлидов в культуре клеток Была показана тесная связь между этими свойствами ими ЛИП - только ассоцнаты ЛИП вызывали накопление лнпндов в культуре клеток Эти свойства цммЛНП обусловлены существенными изменениями структуры и строения модифицированных липплротендов Так. было продемонстрировано, что все компоненты цммЛНП существенно изменены по сравнению с дативнымн лнпопротсидами модификации затрагивали как белковую, так и лип ид кую н поли саха рндиую составляющие частицы ЛНЛ

В настоящей работе было проведено исследование влиянии модификации отдельных компонентов частицы ЛИП на их способность к ассоциации Предполагалось что различные эндогенные агенты, моделирующие различные модификации частнц ЛНП ш vivo, могут стимулировал, ассоциацию ЛНП Для моделировании протеолитнческон модификации и деградации основного белка ЛНП - агюдипопротеина В-100 использовались нротсоднтнчсские ферменты химотрипенн и трипсин Для моделирования аналитического действия и расщепления фосфолипндов ЛНП были использованы фосфолнпаза Л; и фосфолнназа С Дескалнруютач модификации вызывалась с помощью фермента ненраминидяаы Альдегиды эндогенного происхождения, такие как глноксаль. мстнпгдиокеаль, малоновын днальдегид использовались для исследования гдикознлируюшей модификации ЛНП Для имитации окислительной модификации был применен фермент мислонероксидаза

Учитывая важную регуляторную роль нпоВ в метаболизме ЛНП и возможные изменения этого белка в процессе модификации части иы лнполротеида, было проведено сравнительное исследование расположении этого белка на поверхности частицы ими Л НИ и ферментатнвно-моднфнцнроваиных липопротендов Эта часть работы проведена с использованием панели моноклонильных антител к аполипопротенну В Четыре использованных в работе клона ЗС8, 4CII. 2ЕЗ и 5F8 распознают различные 1 питоны алоВ-100 белка немодифицнрованных ЛНП. три других антитела 2G1, 7С2 и 304 специфичны к ало В-100, модифицированному чалоновым диальдсгидом Основные характеристики использованных антител приведены в таблице 3 Использованные антитела и их характеристики былн любезно предоставлены лабораторией клеточной инженерии ИЭК РКНПК {заа лаб Т И Власик)

Было проведено исследование экзогенных агентов, влияющих на ключевое свойство модифицированных ЛНП - способность к ассоциации I (оказано, что амфифильные блок-сополкмеры окиси пропилена и окиси этилена, т и плюрокикн, способны подаалять ассоциацию лило протеидов.

3.1 Сравнение склонности к ассоциации циркулирующих множественно модифицированных н пашшсых ЛНП.

Дм исследования склонности к ассоциации инркулируюшнч множественно модифицированных н нативныч ЛНП был проведен следующий эксперимент Общую фракцию ЛНП выделяли ультраце нтри фугированием, подфракцни нативных н циркулирующих множественно модифицированных липопротендов получали методом лсктнн~хрочлтографнн на Ricinus Communis агглютинин (RCA^,) агарозс Далее лнпопротенлы инкубировались а течении 6 часов при в среде, содержащей изотонический фосфатный буфер Через определенные промежутки времени регистрировалась флуктуация саетопропусканн* образца ЛНП. которая отражает средний размер части а растворе

На рис 3 приведены типичные кинетические кривые спонтанной ассоциации и ЛНП и «мм ЛИП Видно, что цммЛНП сами по себе в процессе инкубации при 37"С хотя и медленно, но ассоциирует л отличие от и ЛНП (кривые / и 4 на рис I ).

Особенно отчетливо это становится видно а том случае, если инкубацию ЛНП проводили в присутствии индуктора агрегации - полнэтнленглнколя молекулярной массы 6000 (ПЭГ) (кривые 2, 3. 5 и 6 на рисунке 3) Известно, что ПЭГ - синтетический водорастворимый полимер, изменяя физико-химические свойства водной фазы на поверхности природных бслок-липидных комплексов, в том числе и ЛНП, способствует их агрегации с возможным последующим слиянием Причем, процесс ассоциации ЛНП в значительной степени определяется состоянием поверхности частиц, модификация которой гн>л действием различных факторов изменяет их агрегацнонную устойчивое« t. Это лавало основание предполагать, что ИММЛНП, физико-химические свойства которых заметно отличаются от таковых у нЛНП, могут обладать отличной от нЛКП устойчивостью к ПЭГ-нндуцированноЙ ассоциации Действнтельно, за 6 ч инкубации в присутствии 2% ПЭГ флуктуация свстопропускання эмульсин цммЛНП увеличивалась в 2,5 раза, тогда как для нЛНП она достоверно не изменялась (кривые 2 и J . рнс 3). С ростом концентрации ПЭГ (до 6%) увеличивалась и скорость ассоциации ЛНП Так флуктуация свстопропускання за 6 ч инкубации в случае цммЛНП возрастала а 4,5 раза, тогда как в случае нЛНП лишь в 3,4 раза (кривые i и й . рис 3),

Приведенные результаты свидетельствуют о том. что цммЛНП нестабильны н склонны к спонтанной и индуцированной ассоциации

3.1 Влияние paiiiviHui MoniiijtuKtntiit чястнш пнтижпыя Л H VI Hit устончипосп. лнпопротендоп к acïoilttiluilit

J.2.1 K-iiiMiiiit' nfinimiimi'ieiiiH\ фсрмсишп на устойчивость ияшнньп ЛИП к accouHHUHii.

В качестве протсолитнческнх фермам тип использовались ссриновые протеинаты трипсин и хнмотрипсин Известно. что трипсин специфически гилролтуст пептидные связи, образованные карбоксильными группами остатков api мнима н дюйма. несущих при физиологических значениях pH положительно заряженную группу Химотрмпеии, напротив специфически гндролизуег пептидные связи, образованные карбоксильными группами гидрофобных ароматических аминокислот феннлаланинл. тирозина и триптофана. а также и лейинна, имеющего сравнимую с ними гндрофобность Таким образом, используя трипсин и химотрнпенн, мы имели возможность гидролнзовать acto В-100 а составе ЛИП преимущественно по ло/юженню гидрофильных и гидрофобных аминокислотных остатков соответстаснно

Методом электрофореза в полнакрнламндном геле было показано, что использованные концентрации ферментов вызывают протсо:титическую деградацию ано В-tOO в составе ЛИП (см рис 4 ) С другой стороны присутствие ц среде инкубации фемидметанеульфонилфторнда (ФМСФ) -неспецифнческого ингибитора протеи маз. предохраняло основной белок ЛНП от протеолнта

Для изучении влияния лротеолитмческих ферментов на ассоциацию ЛИП липопротендм инкубировались в присутствии трипсина или хкмотриненна в течение 6 часок при 37°С в среде содержащей изотонический фосфатный буфер

Рисунок. 4 Электрофорез в паяна криламндном геле (3-7%) апоВ ó елка ЛНП. обработанных протеолнтачеекммк ферментами

1 - натмяные ЛНП

2 - натниные ЛНП + хнмотриленн ( Ел/мл + ЮмМФМСФ

3 - катимые ЛНП + кимотрнпенн I Ед'гмл - 4 часа

4 - «атташе ЛНП + трнпейн I Ед/мв - А часа

5 - маркер молекулярного seca

Время, ч

Рне 6 Кинетические кривые изменения флуктуации светопроттускання суспензии ЛНП в присутствии (,1.2.3) и н отсутствие (<0 хнмотрнпсина Концентрация «иотрнпенна / и 3 - 1 Ед/ыл, 2 - 0,5 Ед/ил, ЛНП 0,2 мг белкй/ыл, температура инкубации 37-С Среда инкубации - ИФБ. Кривая то же. что и i. но в присутствии 0,5 мМ ФМСФ

Тнпнтнме кинетические кривые йНШСПН флуиуаши светопролускання эмульсин ЛНП в присутствии протеолнтмческих ферменто» приведены на рисунках 5 и 6 В отсутствие ферментов за 6 часов инкубации флуктуация снетопропускання эмульсии натнциых ЛНП практически не изменяется, «гго свидетельствует об отсутствии ассоциации ЛНП (кривые 2 и 4 на рис 5 и 6 соответственно) Добавление к ЛНП трипсина или хнмотрипсина приводит к увеличению флуктуации еветопропускания что указывает на стимуляцию образования ассоицзто» ЛНП В случае хнмотрипсина повышение концентрации ферм^гта, как показано на рис 6, увеличивает флуктуацию светопропускания эмульсии ЛНП, а значит, повышает степень ассоциации частиц ЛНП

В то же время, вели в среду инкубации фермент я е ЛНП добавляли ФМСФ. то рост флуктуации снстопрстусканкн эмульсии ЛНП не наблюдался (кривые 3 на рис 5 и 6) Это позволяет предположить, что наблюдаемое увеличение ассоинапин частиц ЛНП является следствием протеолиза алоВ-ЮО и, возможно, изменения его кйнформзини Результаты экспериментов указывают на то. что протеолнтнческне ферменты являются стимуляторами ассоциации ЛНП

3.2.2 Вчините лпполнтнчсских ферментов ни устойчивость нятнвнмл . 11111 к яссиинннпн.

В работе использовались такие лнгюлнтнческие ферменты как фосфоямпаза А; и фосфолнпаза С Известно, что фоефолигнна А;, являясь карбокснл-зстсразой, тндролнзует сложно зфнрную связь в ьи-2 положении фосфолипидой При обработке лнпопротендных частиц ферментом происходит растепление фоефолнпндов (главным образом фосф лтид клходннэ | с образованием лизофосфолипидов и свободных жирных кислот Фосфолнпаза С является фосфогндролазой и к свою очередь гидролизу ет эфирную связь между диглнцеридом и «мешенной фосфорной кислотой а фосфолипидач с образованием дношглнцерндй и фосфохолмш (а случае фосфатмлнл\ ол н н а)

ЛипоЛИЗ фОсфоЛИПНДОВ ЛНП ПОД влиянием кполыопнных фосфояжш был подтвержден при помощи тонкослойной хроматографии (рис 7) ti случае лнпопротеилоа. обработанных фосфолнпазой А2. был попышен уровень лнэофосфо)нднлхолина, а при обработкс фософлнпаяон С повышался уровень днацнлгл и нерола.

Типичные кинетические кривые изменения флуктуации еветопропускания эмульсии ЛНП » присутствии лнполнтнчсскнх фсрмеитоа приведены на рис S и 9 Видно, 'гто в 01еутствме ферментов за Л часов инкубации фяуетуидия светолропускания эмульсии натавных ЛНП практически не изменяется, что свидетельствует об otcjtctb«h ассоциации Л11П (кривые 3 на рис 8 и 9) Добавление к ЛНП фосфопнгипы А; иди фосфолишны С приводит к увеличению флуктуации светолропускания '.то укатывает на ассоциацию частиц ЛНП. Повышение концентрации фермента, как показано на рис S н 9 (кривые I и 2), увеличивает флуктуацию свстолронуекания змульсни ЛНП. следовательно, повышает степень ассоциации частиц ЛНП Если в среду гнкубапик ЛНП с ферментом добавляли ЭДТА - ингибитор работы кальний зависимых фосфолипаз, то ассоциация частиц ЛНП не наблюдалась (кривые 4 на ряс 8 и 9)

3.2.3 В.тниннг мнелонсраксиппы на и юнмшкн п, натннныч ЛНП к ассоинацин.

Как известно. мнелоперокснДйза катали.!ирует образование гиночлорита. используя в качестве субстрата пероксил водорода Гнпохлорнт енльнын г>*игя»тсрь н хлорирующий агенс Он способен реагировать со всеми диацилглнцерол фосфата днлхоли н

Л изофосфотил 11Л ХОЛ1IH

1 2 3 4 5 6 7

Рис 7 Тонкослойная хроматография фосфолниндов ЛНП. обработанных фосфолкпаэой А2 н фосфо&нпаэой С 1-2 - наткан ыс ЛИП 3-1 - нативныс ЛНП + фосфолипаза С I Ед/мл 5-6 - натявнькЛНП + фосфолмлаза А2 7- стандарт фосфогиднлхолина

0 1 2 3 4 5 6 Время, ч

Рис 9 Кинетические кривые изменения флуктуации светолропусканил суспензии ЛИП № присутствии | /,2, -/) и в отсутствие (.?) фосфолипазы С Концентра ПНЯ фосфолипазы С 1 - 1.5 Ед/мл, 2 - 0,83 Ея/иа. ЛИП 0,2 мг белка/ил. температура инкубации 37°С Срсла ннКубании ИФБ, рН 7,2 Кривая 4 - то же. что н /, но в присутствии 15 мМ ЭДТА компонентами ЛН11. но особенно эффективно он окисляет 5Н- и хлорирует N11;-группы белков.

Таблица 5

Содержание ТБК-реактивных продуктов в ЛИП после их инкубации с миелоперокс идазой

Миелоперогсвдаза. икг'ып ТБК-реаьггивные продукты, мдаопь иг 66л кя

0.09 ± 0.02

0.6 ].!2±0.20

0.9 г.я ±0,12

Результаты исследования ассоциации ЛИП под влиянием миелопероксндазы приведены ма рис 10 Видно, что инкубация нативныч ЛИП при ' в течение 6 часов не приводит к увеличению флуктуации с везопропускания эмульсин лнпопротсцдов, а значит и не стимулирует ассоциацию частиц В присутствии же миелоперокс идазы наблюдается заметное увеличение флуктуации светопропускання. что свидетельствует об ассоциации частиц ЛИП Такая потеря устойчивости ЛИЛ к ассоциации обусловлена активностью миелопероксндазы, поскольку, как видно из рис 10 (криаая 3). а отсутствие одного из субстратов миелопероксидазы. а именно псрокснда водорода, эаметныч изменений ао флуктуации светопропускання а значит и в размере частни ЛИП не наблюдается

3.2,4 Влинннс альдегидов эндогенного происхождении ил усгойчниосгь Jlllf I к ассоциации.

Альдегидные группы могут вступать в реакцию с £--аы кногрулпян н лкзнновых остатков молекул апоВ с образованием прочны* внутри- и межиолекулярных сшивок, в то« числе н ко валентных связен типа оснований Шмффа Далее, относительно нестабильные связанные с белком основания Шиффа подвергаются перегруппировке по реакции Дмадори с обршяаннем более стабильных производных, которые е свою очередь преобразуются через лнклрбонкльные интермедиа™ о конечные продукты гликозилкронакия Таким образом, альдегиды могут выбывать модификацию ЛИП Известна, что в ходе окислительного и карбонильного стресса, сопровождающее многие патологические процессы в организме человека, могут формироваться эндогенные низкоиолекул ирные альдегиды, такие, например, как глноксаль и метняглиохсаль Кроме того, модифицирующее действие на ЛИЛ способен оказывать .VIДА. образующийся в результате окислительной деструкции лнпнлньгх гидроперокенлов

Степень модификации ЯНП г«« действием альдегидов оценивали по изменению злектрофоретнческой подвижности частиц Известно, что обработка ЛИП альдегидами приводит к увеличению отрицательного заряда частиц ЛИП за счет уменьшения количества свободны* аминогрупп и, силикате дню, к увеличению электрофоретической подвижности Из рис М видно, что частицы ЛИП. модифицированные МДА. метнлглноксадем и глноксалем. обладают значительной злехгрофоретической подвижностью по сравнением, с нвтнвными ЛИЛ

Совместно с лабораторией биохимии свободнораднкальных процессов ИКК PKI1ПК Росзлрава (зав лоб- профессор В1 Ланкин) было изучено влияние

12 3 4

Рис 11 Элсмрофореграмма наш иных ЛНП и ЛНП, модифицированных альдегндамн эндогенного происхождения а I % агарешом геле (1) - ЛНП. модифицированные МДА, (2) ЛНП. модифицированные метилглиоксалсм, (3) - ЛНП, модифицированные гдиоксалем, (4) -i шинные ЛИГ] g •»

Время, ч

Рисунок 12 ЗСянегачкик крзшы.с титаапы ^ятктуацин свгпгарнхускаши ЛНП • ТЦНЛС/ГСНЕа П OTiyiElKM 4»ПДПКЛ (!) НЯЯЕЧЬЖ ЛНП. Û') ЛИП Н5»|ИЦ"РОМИИЫС МДА, ( 3) ЛНП КйдфЕПК овзниыг глквКадас, 14) ЛНП моэафЩфгеаише: ыгпякюплхя*. ( ' • «ялтав «• мя^ш pí 0 05) малоновосо диальдегида (MДА), глноксаля и метилглноксаля на процесс ассоциации ЛИП Результат эксперимента приведены на рис 12 Видно, что инкубация il¡trnиных ЛИП при 37°С в течение 6 часов не вызывает изменении флуктуации светопролуекания эмульсии (рис 12, кривая I), а значит не приводит к изменению и среднего размера частицы В присутствии же альдегидов наблюдается заметное увеличение флуктуации свезопропуекания, что свидетельствует об увеличении среднего размера частиц ЛНП При этом ЛИГ], модифицированные M ДА (рис 12. кривая 2), aipernpyioT а 2 раза медленнее, чем ЛИП, модифицированные глноксалем и метилииоксалем (рис 12 кривая 3 и 4)

3.2,5 Brummt' ненрачннидазм на устойчивость натнвных ЛНП к accoUHAiiMii.

Дссиалирукнций фермент бактериального происхождения нейраминидаза отщепляет а 2-й связанную «валовую кислоту, инишюшую терминальное положение в глнкопротеине апоВ-ТОО

Резкое снижение содержания сналовои кислогы в ЛНП. обработанных нейрамннндазой, было подтверждено при помощи модифицированного метода Воррена Так, содержание сиаловой кислоты h ЛНП. инкубированных с (J,02 Ед кейрамнннддлы в течении 6 чпеоь. снизилось на 73+ -2е® по сравнению t контролем

Влияние ненраминндазы на ассоциацию частиц ЛНП отражено на рисунке 13 Как н а предшествующих экспериментах нативные ЛНП, не обработанные нсирамнниданой. сохраняли устойчивость к ассоциации на протяжении 6 часов инкубации В то же время, флуктуация с вето про пускания эмульсин ЛНП. обработанных нейрамикндазой. неуклонно возрастала, что свидетельствует об ассоциации л um »протеидов

JJ Изучение конфармнииииных шчснсинн ли и И Сел мл ичм.1МП и фер.чщщ шнии модифицированных ЛИП.

Вес типы модификация, которые мы использовали протеолитнческаи, лнггалитнческая, окислител ьная и десналнруюшая - имеют место в циркулирующих модифицированных Л НП [Tenov et at-, 1992. Терто», 1999] В данной работе было показано, что любая из этих модификации приводит к ассоциации ЛИП Остается неясным какая модификация изменяет частицу дипопротеида m vivo, делая ее атврогениой Для отпета на зтот вопрос мы соспоставили изменения в иммЛНПс изменениями, вызываемыми различными модификациями в нативмыч липопротсидах В качестве показателя изменений имеющих принципиальное значение, была выбрана ионерхнасгное расположение а п ол на on ротеидя В, которое оценивали при помощи монокл опальных антител Известно, что именно молекула апоВ uqjaer особую роль в стабилизации частицы ЛНП (Hevonoja с» я1„ 2000) Существенные нарушен!« структуры апобелка В неизбежно ведут к ассоциации липопротендных частиц

3.3.1 Изучение конфпрмацнонныз изменении аноН белка цмч.ПШ

Результаты исследовании взаимодействия нативных и цмиЛНП с монокдональными антителами различных клонов представлены на рис N По различиям а связывании антител е нативными ЛИП и им м ЛНП можно судить об изменениях в структуре множественно модифицированных липопротендов Так. было обнаружено, что антитело ЗС8 лучше взаимодействует с нативнымн ЛНП. чем с множественно модифицированными Можно предположить, что соответствующий зпитон в составе аггоВ цммЛНП подвергается маскированию в результате модификаций и перестройки алоВ белка С другой стороны. I щ

1 ЗС4 1 г " Л * , г

• С В) £ 1 ¡^И о Концентрация ЛНП мкг/мл

Рис I Концентрационные зависимости взаимодействия нативных < I > и циркулирующих модифицированных ЛНП (2) с мсиоклональными антителами к ало-В человека На графиках показаны данные тип^иого эксперимента, результаты которого представлены как среднее трех определений 1 стандартное математическое отклонение Звездочкой отмечено достоверное отгшчие от кативых ЛНП, ]ХО,05 ццнЛКП эффективнее, чем нЛНП втаикодействутот с антителами клонов 2ЕЗ, 2G1 и 7С2. По-видимому, зпнтоп,, ответственный за связывание 2ЕЗ антитела (аминокислотные остатки апоВКЮ 372&-4306) становится более доступным для взаимодействия с антителом в цммЛНП Поьышеииач способность цммЛНП связываться с антителами 2G1 и 7С2 может свидетельствовать о некоторой гомологии цммЛНП и МДА-модифицированных лнпопротеидов. к которым получены ттм антитела (си табл 3) С другой стороны, в экспериментах с антителом 3G4, также распознающим МДА-моднфнцнрованные ЛИП, не было выявлено достоверных различий во взаимодействии натнвныч и цммЛНП с зтим антителом Следовательно, нельзя говорить о полном совпадении поверхностных структур МДА-модифицированных ЛНП и m vivo модифицированных липопротеидов

Также не было выявлено изменений в структуре апоВ иммЛИП при использовании антэттел 5F8 и 4С11Эти антитела получены к участкам эпоВ белка с 1 по 1247 аминокислотный остаток и с 2377 по 2658 аминокислотный остаток соответственно Вероятно, изменения структуры апов происходящие в цммЛНП не затрагивают соответствующие фрагменты N концевого участка макромолекулы апоВ

Таким образом, при использовании четырех моноклональных антител к из семи были обнаружены различил во взаимодействии антител с цммЛНП и натнвны ч и лиггопротекдамн

3.3,2 Изучение конформлпнонных изменений «поВ белки пол влиянием протсолнП1ЧССКИХ ферментов.

Результаты исследования взаимодействия натнвных н молнфиииро ванных протеолитнческнин ферментами ЛНП с моноклональнымн антителами

Таблица 6 Антигенные различия ano В-100 катнвных, цммЛНП и обработанных протеолитнческимн ферментами ЛНП М - антитело достоверно лучше связывается с ЛНП. модифицированными ферментом, Н -антитело лучше связывается с неткаными ЛНП. 0 - различия в связывании антитела с нативнмми И модифицированными ферментом ЛНП не достоверны, jVJj, Hi Л- совпадения антигенного профиля цммЛНП и ферм си гати вно модифицированных ЛНП клон иччЛНИ шыогршким грмвсцц

ЗСЯ II м н

4С11 0 и 1«

2ЕЗ м ¿1 0

SF« 0 и

2<Jt м 0 0

7С2 М 0 0

3G-4 Q 1 в 1

I "1 •»

Ш1

Рис 15 Концентрационные зависимости взаимодействия наганных(/) н обработанных хнмотрипсином ЛПНП (2) с маноклональнымн антителами к апо В-100 человека На графиках показаны данные типичного эксперимента, результаты которого представлены как среднее трех определений ± стандартное математическое отклонение различных кдоно» представлены на рис 15 и 16 Было обнаружено, что ЛИП. предварительно обработанные химотрнпснном. эффективнее, чем напевные ЛНП взанмодейспювуют с антителами клонов ЗС8 и 2£3 (рис 15) С другой стороны, натнвные ЛНП лучше, чем ферментатнвно-моднфнцнрованные. связывались с шгатеяами клоив4СИ (рис. 15) Использование других клонов не вы*вито достоверных различий в их связывании с нвтнвнымн и обработанными хнмотрипсином ЛНП В качестве пр им ера на рис 15 приведены результаты, полученные для клона 5Р8 В таблице 6 приведены результаты исследования антигенных профилен апоВ иммЛНП н протеолнтнческн модифицированных ЛНП Видно, что только знгитела 2ЕЗ в обоих случаях предпочтительно распознает модифицированные лнпопротенды Возможно, в структуре иммЛНП и модифицированных хнмотринсином ЛНП происходят сходные изменения в результате которых соотистствуюшнй участок апоВ, с 3725 по 4306 аминокислотные остатки, становится более доступным для взаимодействия с антителом Кроме того, а»тпгтела 5Р8 и ЗС4, также как в случае циркулирующих модифицированных ЛНП, одинаково взанмолсйстьоаалн с натмвиыми и модифицированными лнгюпротсидамк Видимо, соответствующие участки ало В белка не изменены как в составе ими ЛНП, так и в структуре модифицированных химотри пенном ЛНП Приведенные факты могут говорить об определенном сходстве структур цммЛНП и модифицированных химотрнпенном липопротендов

Изучение связывания ионокланальных к ано В-100 антител с модифицированными трипсином ЛНП показало, что клоны 3С8 и 4С11 лучше взаимодействовали с натнвнымн, чем с модифнцнрованными трипсином ЛНП Клоны ЮТ. 7С2 и ЗС4 не выявили достоверной разницы в связывании с нативнымн и модифицированными химотрнпсином ЛНП. В качестве примера на

ЛИП, мкг белка/мл

Рис 16 Концентрационные зависимости взаимодействия нлтнвных (!) и обработанных трипсином ЛИП (2) с моноклинальными антителами к ало В'100 человека На графиках показаны ланные типичного эксперимента, результаты которого представлены как среднее грех определений ± стандартное математическое отклонение рис 16 приведены результаты, полученные п случае использования клонов 4С11 н 5FS Солоставлия результаты взаимодействия моноклон иль ныл антител с цммЛНП и лнпояротекдами, модифицированными трипсином необходимо отметить, «по только антитело ЗС8 в обоих случаях сильней связывалось с натнвными липопротсидями чем с модифицированными (таблица Etue два антитела не выявили различий как между иатнвными и им м ЛНП. так и между ферментатнвно модифицированными и нативкыми липонротеидачи Как и в случае ЛНП модифицированных хнмотрнпсином это антигена 5F8 и 3G4 (таблица 6) Вообше. как видно из таблицы 6 антигенные профили ЛНП, модифицированных трипсином и химотрипсином отличаются значительной гомологией пять из семи использованных антител одинаково реагируют с модифицированными трипсином и хнмотрнпсином ЛИП В то же время, и в случав моднфниикацин трипсином, и при обработке хнмотрнпсином, только три антитела реагировали с пратеоянтнческн модифицированными липопротендамн также как с ним ЛНП Итак, сравнивая антигенные профили протеодитическн модифицированных липопротендов н ним ЛИП можно сделать вывод о некотором, но далеко неполном сходстве поверите пни» расположении апоВ белка в циркулирующих модифицированных и ферментатнвно модифицированных ЛНП

3.3,3 ¡Пучение кчшфпрмяинонныл шменпшн лпоВ под влившем лшмтгпркшш фер««1то»,

С целью исследования влияния гидролиза фоефолинидов на конформацию ало B-ltMJ изучалось связывание нонокпошяышх антител с нагивными ЛНП н ЛНПГ модифицированными фосфолиназамн С или А2 Было показано, что клоны 1ЕЗ и 5Г8 эффективнее связывались с ЛНП, подвергнутыми

Таблица 7 Антигенные различия ana В*100 натнвных, цммЛНП и обработанных ли политическими ферментами ЛНЛ M - антитело достоверно лучше связывается с ЛНП, модифицированными ферментом, H - антитело лучше связывается с нативными ЛНП, 0 - различия в связывании антитела с натнвньшн и модифицированными ферментом Л МП не достоверны, M, Н, О совпадения антигенного профиля цммЛНП и фрментатнмю модифицированных ЛНП клон шчЛЯП фщф» ПИШИ* Aï

J Ci H 11 0

4CI1 0 11 0

ZE3 M M «

SFÄ 0 M i>

M 0 V

M 0 if

3G4 0 a A t

J а»

5- в *

§ „ эса

JVC1 М!Гв*П*в1»АП

Рис. 17 Кон центрационн ые зависим ости взаи модействня натииных ( / ) и обработанных фосфолипаэой А2 ЛНП (2) с моноклональными антителами к ало В-100 человека На графиках показаны данные типичного эксперимента. результаты которого представлены как среднее трех определений ± стандартное математическое отклонение лнполизу под действием фоефолнпазы А» Клоны 4CII и ЗС8 напротив лучше взаимодействовали с нативными ЛИП, чем с ЛНП, модифицированными фосфолипазой Аг. Клоны 7С2, 2G1 и 3G4 не выявили достоверной разницы в связывании с нативнымн и модифицированными фосфолипазой A; ЛНП На рисунке 17 приведены результаты типичных экспериментов дли клонов 7С2. ЗСК. 5F8 Из таблицы 6 видна гомологии антигенных профилей иимЛНП и липопротеидов модифицированных фосфолипазой А; в обоих случаях антитело ЗС8 предпочтительно реагирует с нативнымн липопротеидами. а антитело 2ЕЗ лучше связывается с модифицированными ЛНП В то же время, антитело 3G4 не выявило различий как между цммЛНП н нативнымн лннопротсидами. так и между нативнымн ЛНП н лигюпрогекдами. модифицированными фосфолипазой А; и ЛНП, модифицированные фосфолипазой С, лучше чем нативные связывались с атителамн 7С2 н 3G4, для остальных антител достоверной разницы между взаимодействием с модифицированными фосфолипазой С и нативнымн ЛНП не обнаружено В качестве примера на рис 1S приведены концентрационные зависимости связывания клонов ЗС4 и 7С2 с нативнымн и обработанными фосфолипазонС ЛНП Необходимо отмстить очевидную разницу между взаимодействием использованных клонов антител с ЛНП. обработанными фосфолнназойС и имм ЛНП Только антитело 7С2 предпочтительно распознавало как имм ЛНП, так н лнпонротеиды, модифицированные фосфолипазой С Кроме того, для антител •1С И и 5FS не было выявлено достоверной разницы в связывании с модифицированными и нативнымн .пнпопротендамн как в случае имчЛПП так н в случае ферме нтатнвно модифицированных лнпопротеидов (см таблицу 7) Таким образом, можно заключит., что лнполитичсская модификации ЛНП фосфолипазой С или фосфолипазой А3 не приводят к формированию антигенной структуры аноВ. M в g I о 0-s 0.7 1 0,6 M w a) 0.2 [1.1

ЛНП, мкг белка/мл

Рис IS Кониснтрациоииые зависимости взаимодействия натнвмык (/) и обработанных ^юсфолилазой С ЛНП (2) с моноклональнымн антителами к ano В-100 человека На графиках показаны данные типичного эксперимента, результаты которого представлены как среднее трех определений ± стандартна математическое отклонение идентичнонтаковон У цымЛНП. При сравнении атшсниш профилей ЛНП. модифицированных двумя разными фосфолипазами ипвлено только одно совпадение - антитело 2G1 в обоих случаях одинаково взаимодействовало с натнвнымн и ферментзтнвно модифицированными ЛНП Интересно. что антитела 2G1, 7С2 и 304 специфичные к ano В-100. модифицированному M ДА не выявили антигенных различий между наги иным и ЛНП н ЛНП, обработанными фоефолипаэой Аз В то же время два антитела (7Г2 и 3G4) лучше связывались с ЛНП, обработанными фосфолипазой С. по сравнению с натнвнымн ЛИП (см таблицу 7). По-видимому, это значит, что фосфолиндза С в отличие от фосфолнпазы А; вызывает коиформапнонные изменения ano В-100 на поверхности ЛНП отчасти аналогичные тем, которые происходят под действием известного продукта перокендацни лнпндов - M ДА

J .3.4 Изучение конформашюннм* тиснении аноВ пол влиянием ми е. нтероксн да ны.

При сравнении антигенных различии апоВ белка натнвиых ЛНП и обработанных миедоперокендазой лнпопротсидов было продемонстрировано что нет достоверных различий во взаимодействии антител клонов 2G1. 5FS. 702 с натнвнымн и ферменпзтнвно модифицированными ЛНП С друзой стороны, антитела клонов 2ЕЗ и ЗС8 достоверно эффективнее связывались с апоВ на поверхности модифицированных миедоперокендазой натнвиых ЛНП л сравнении с нативных ЛНП. тогда как антитела клонов 3G4 и 4CIJ, напротив, интенсивнее взаимодействовали с алой натнвиых ЛНП Результаты экспериментов суммированы в таблице S

На рис приведены 3 типичных примера для случаев, когда антитела обладают более высоким сродством к нативным ЛНП, модифицированным

Таблица 8 Антигенные различия апо 1Ы00 нагнаны*, цчмЛНП н обработанных мнелопероксндазой ЛНП М антитело достоверно лучше связывается е ЛНП, модифицированными ферментом. Н - антитело лучше связывается с пяти иными ЛНП; 0 - различия в связывании антитела с катиными и модифицированными ферментом ЛНП не достоверны, М, Н, О - совпадения антигенного профиля цммЛНП и ферментатнвно модифицированных ЛНП клон имнЛНП tttK.inHrimcH.iai« зев II VI

С11 0 И

2ЕЗ м м

5Кв 0 а хи м 0

7С2 м 0 ми 0 н

ЛЕП ин/ш

Рис 17 Концентрационные зависимости взаимодействия натнвных (/) и обработанных фосфолнпазой АЗ ЛНП (2) с моноклоналышмн антителами к ало В-НЮ человека На графиках показаны данные типичного эксперимента, результаты которого представлены как среднее трех определений ж стандартное математическое отклонение мнслолероксилазой {клон ЗС8). к нативных ЛНП (клонЗС4) или когда достоверные различил в связывании с апоВ на поверхности модифицированных мнелопероксидазой и нативных ЛНП отсутствуют (клон 7С2).

Полученные результаты свидетельствуют о том. Что инкубация нативных ЛНП с миелоперокендазои в присутствии субстратов фермента (Н^О;. СП приводит к изменению коиформаиии макромолекулы ало В на поверхности частит.! натнвных ЛНП Эти изменения отчасти сходны с теми, которые происходят на поверхности цммЛНП - вычалено два антитела одинаково азаимодействузоншх с циркулирующими множественно модифицированными лигинроттидами и натнвнымн ЛИП Так, антитело 2ЕЗ предпочтительно взаимодействуете модифицированными мнелопероксидазой лнпопротендами и цммЛНП чем с натнвнымн {таблица 8) В то же время, антитело 5Р8 одинаково взаимодействовало с натнвнымн, ЦммЛНП и модифицированными мнслолероксилазой лнпопротендами Таким образом, при сравнении антигенных профилей цммЛНП и лнпопротеило». модифицированных миелопсроксилазой выявлено только два совпадения Видимо, модификация ЛНП мнелопероксидазой не может привести к появлению иммЛ1 !П

Изучение конфирмационных щмененнц анпК иод в гинннем ней ра М1НI ила зы.

При сравнен и и способности моноклинальных антител к апоВ-100 белку взаимодействовать с папиными и обработанными нейрамнннлазон лнпопротендами было показано, что анпттела ЗС8, 2ЕЗ, 5Р8 и 7С2 предпочтительно связывались с фермептативно-моднфнцированными ЛНП Другое клоны 4СН, 201 и 304 одинаково взаимодействовали с нагнвнымн и ферменпггивно модифицированными ЛНП Результаты типичных

Таблица 9. Антигенные различи* ало В-100 натнинмх. цмнЛНП и обработанных нейраминидазой ЛЯП М - антитело достоверно лучше связывается с ЛИП, модифицированными ферментом. Н - антшело лучше снизывается с нативными ЛИП, 0 - различия в связывании антитела с нативными и модифицированными ферментом ЛНП не достоверны, М. р - совпадения антигенного профиля иммЛНП И ферментативно модифицированных ЛНП клан цчч.тни . лее н м

4СИ а 0

2ЕЗ м м

51* 0 м

М I)

7С2 м м

Ю4 0

Ряс 20 Концентрационные зависимости взаимодействия натпвных ЛНП (/) и натииных ЛНП. предварительно модифицированных нейраминидззой (2) с моноклонапьными антителами к апо-В человека (клоны 2ЕЗ, ЗС4) На графиках показаны данные типичного эксперимента, результаты которого представлены как среднее трех определений ± стандартное математическое отклонение экспериментов с моноклональньши антителами 2ЕЗ и 3G4 приведены на рисунке 20 Из четырех клонов, показавших лучшее связывание с цмЛНП по сравнению е нативнычи ЛНП, два антитела 2ЕЗ и 7С2 также предпочтительно распознавали модифицированные нейраминидазой ЛНП (таблица 9) Другое антитело 4CII не выявило различий как между на гимн ими и цммЛНП, так н между магнвнычи и модифицированным и нейраминидазон лнпогфотеилами Только три из семи антител одинаково взаимодействовало с цммЛНП н липорпротендами, модифицированными пейрамииидазой Это говорит о незначительном сходстве поверхностных структур цммЛНП н обработанных пейраминндалой лнпопротеидов

3.3.6 С о] roc ta и. it пне результатов изучении конформ анионных изменений ;шоВ ичч.ШП н ферм штатив но модифицированных липанротендом.

Описанные выше результаты изучения взаимодействия моноклонапьных антител с цммЛНП и ферментативно модифицированными лнпогфотендами обобщены в таблице 10 Из данных таблицы 10 видно можно сделать вывод, что ни одна из использованных ферментативных модификаций не воспроизводит антигенный профиль, свойственный для цммЛНП Для большинства ферментативных модификаций количество антител одинаково распознающих цммЛНП и ферментативно модифицированные л ипопротеиды составляет три из семи использованных в работе. В слу чае модификации ЛНП миеноиероксндазой выявлено два совпадения с антигенным профилем цммЛНП Можно также отметать некоторые обшис закономерности взаимодействия чоноклональных антител к anoB G елку с модифицированными различным образом лниопротеидами Так, антитело 2ЕЗ лучше реагирует с иммЛНП, лнпопротендамн модифицированными хичотрипенном. фосфолнпазой А2, миелоперокендазой, нейраминндааой чем с натнвнымн лнпопротендамн

Таблиц;»] 0 Антигенные различия В-100 натнвных н обработанных различны ми ферментами ЛИП М - антитело достоверно лучше связывается с ЛИП. модифицированным и ферменшм, 1 1 - антитело лучше связывается с катиными Л1ГП. О - различия в связывании антитела с натнвнымн и модифицированными ферментом ЛНП не достоверны. М. О - совпадения антигенного профиля цммЛНП и ферментатнвно модифицированных ЛИП

ЗГЙ и м н и 0 м \|

4СИ 0 11 II II 0 II 0

2ЕЗ м м 0 м 0 ы м

5Р8 0 (1 м 0 0 м

2С1 м 0 0 0 0 0 0 тег м 0 0 0 м 0 м зш 0 0 £ 0 м н 0

• •

Вероятно. распознаваемый этим антителом фрагмент апоВ белка с 3728 по 4306 аминокислотный остаток, становится более доступным для взаимодействия с антителом в результате большинства исследовании \ модификаций Л НИ С другой стороны, антитело 5F8 выявило различим между модифицированными и нативнымн Л НИ. только е случае модификаций фосфолиназон Л2 м нейраминндазой Возможно, соответсзиующнй фрагмент агюВ (1-1297 аминокислотные остатки) устойчив к большинству исследован пых модификаций

3.4 Экзогенные ингибиторы ассоциации Л НИ.

На роль ингибиторов ассоциации могут претендовать так называемые плюроникн амфифильные блок-сополимеры окиси пропилена (ОП) и окиси этилена (ОЭ) Из литературных данных известно, что амфифильные биомолскулы такие как аполипротенн A-V. альбумин способны подавлязъ ассоциацию ЛНП Было высказано предположение, что экзогенные биодоступные амфифильные полимеры также способны влиять на ассоциацию Л1ЕП Для оценки ассоциации ЛНП и влияния плюроннков на ассоциацию ЛИП было использовано два метода - метод флуктуиинн свстопропускания и метод квазнупру того лазерного рассеивания Во всех случаях результаты, полученные при помощи двух методов оценки ассоциации ЛНП. были сходными Ассоциация ЛНП индуцировалась путем инкубации эмульсии ЛНП при ЗТ'С при постоянном перемешивании В данных экспсрнметнтах использовалась общая фракция ЛНП, выделенных из крови больных середечно-сосудистымн заболеваниями Было проведено сравнительное исследование действия плюроннков с различными i ндрофнлыю-липофилышмн свойствами на процесс ассоциации ЛНП Так, использовались плюраннк К 68. обладающий высоким значением ГЛБ 29 и выраженными гидрофильными свойствами, нлюроннк L61.

0 12 3 4 5

Врем и, *1

Рнс 21 Кинетические кривые изменения среднего размера частиц ЛНП под влиянием плюроника Р85 Среда инкубации ИФБ, рН 7.4. концентрация ЛНП 2,5 мг белка мл. температура инкубации 37°С. скорость перемешивания 1000 об мин Кривая 11) суспензия ЛНП в отсутствие ллюроника Р85, кривые (2) и (3) в присутствии, соответственно, 0,1% и 0.01% плюроника Р85 характеризующийся значительной гидрофобностью (ГЛБ 3), и плюроиик PS5 с умеренный к гидрофильными и липофильнымм свойствами (ГЛБ 16) В экспериментах были использованы концентрации ппюронинов кратные ККМ амфифильных блок'соцолимеров Эта часть работы была проведети в сотрудничестве с кафедрой ВМС Химического факультета МГУ, (лап лабораторией ■ профессор А А Ярославов).

3.4.1 Влияние плюроника Р85 на ассоциацию ЛИП.

Ma рисунке 2) приведены типичные кинетические кривые изменения размера ассоциатов ЛНП в случае спонтанной ассоциации и в присутствии плюроника PS S Видно, что при спонтанной ассоциации происходит образование ассоциатов ЛНП и увеличение их размера в зависимости от вымени инкубации (Рис 21. кривая I ) В то же время в случае присутствия в инкубационном среде различных концентраций пдюроннка PS5 формирование ассоциатов заметно ншнбнровалось Так. добавление к змульсни ЛНП до начала ннкубзцнн плюроника Р85 а концентрации 0Г1% (в'в кнгибирояало процесс ассоциации после 4.5 часов инкубации иа 93%. а применение концентрации 0.01% вызывало подавление процесса ассоциации после 4,5 часов инкубации на 79 %(Рнс 21, кривые 2 и 3)

Аналогичные данные были получены другим методом На рисунке 22 представлены типичные кривые изменении флуктуации светопропуекания змульсни ЛНП в присутствии различных концентраций плюроника в инкубационной среде Как видно из рисунка 22, наименьшая концентрации плюроника Р85 0 001 % не оказывала влиянии на процесс ассоциации ЛНП

Когда плюроник Р85 добавлялся в эмульсию ЛНП а ходе инкубации, то есть когда процесс ассоциации частиц уже был инициирован, также

160 о —

0 2 4 6

Время, Ч

Рис 23 Кинетические кривые изменения среднего размера частиц ЛНП под влиянием плюроника PS5 Среда инкубации ИФБ, рН 7,4, концентрация ЛНП 2,5 мгбелка'мл, температура инкубации 37°СГ скорость перемешивания 1000 об мин Кривая ( I ) - суспензия ЛНП в отсутствие плюроника Р85, кривая (2) - ш присутсвии 0,1 % плюроника PS5, добавленного после 2 часов инкубации кривая (3) - в присутсвии 0,1 % плюроника PS5, добавленного после 1часа инкубации наблюдалось предотвращение ассоциации липопротендов (Рис 23). Плюроннк Р85 в концентрации 0,1% добавлялся к эмульсин ЛНП после первого и после второго часа инкубации, в обоих случаях не происходило дальнейшего увеличения среднего размера частой, т е ассоциация полностью подавлялась Необходимо отметить, что добавление плюроника не вызывало уменьшение среднего размера ассоииатов, можно предположить, что гюл действием плюроника не происходило диссоциации образовавшихся ассоциатор ЛНП

3.4.2 Влияние плюроипкя F68 ни ассоциацию Л НИ

Было показано, что другой плюроннк - F68. характеризующийся выраженными гидрофильными свойствами и высоким значением ГЛБ, не оказывает влипни» на процесс ассоциации частиц ЛИП На рисунке 24 приведены типичные кинетические кривые изменения флуктуации свстопропускания в присутствии плюроника F68 в концетрации 0,4% и в отсутствие плюроника (Рис 24, кривые I и 2) Использование большей концентрации плюроника F68 (4%) также не приводило к угнетению процесса ассоциации ЛНП(Рнс 24. кривая 3)

J.4.J It.iнинне плюроника L6I на ассоциацию .11111

Применение обладающего выраженными гидрофобными свойствами и низким значением ГЛБ плюроника L6I приводило к подавлению ассоциации ЛНП Гак, в концентрации 0.022% юнороник L6I на 78% ипгнбнровал рост флуктуации светопропуекания эмульсии ЛНП после 2 часов инкубации (Рис 25, кривая 2) Использование большей концентрации плюроника L6I - 0,22% приводило к почти полному подавлению ассоциации ЛИИ. а применение меньшей кон цен грации 0,0022% не влияло на ассоциацию частиц ЛИП (рнс 25 кривая 3) Представляется интересным тот факт, что как в случае плюроника

РЙ5, так и н случае плюроника L61 подавление процесса ассоциации вызывалось только а концентрациях превышающих или близких к К К M Так, ККМ для PS5 составляет 0,01-0.03% н в концентрациях больших, чем 0,01% наблюдалось значительное угнетение ассоциации, а при уменьшении концентрации плюроника до 0.001% ингнбнруюшее действие не развивалось ККМ плюроника L61 равна 0.022% и использование концентраций больших, чем 0.022% эффективно ннгнбнровало ассоциацию ИНН. я то время как меньшие концентрации - 0,0022% не оказывали влияние на процесс ассоциации

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что способность амфнфнльных сополимеров окиси пропилена и окиси этилена ннгибировять ассоциацию ЛИП прямо зависит от выраженности гидрофобных свойств плюроника Плюронккн с выраженными и умеренными гидрофобными свойствами способны значительно ннтнбнровать ассоциацию ЛНП Необходимо отмстить, что степень подавления ассоциации прямо зависит от концентрации плюроника Очевидно, именно мицеллярнак форма плюроника способна выбывать ингибирование ассоциации частиц ЛНП, а уннмеры плюроннков интбирузощнми свойствами не обладают

И ||

§ 5

0 12 24 36 45 60 72 54 46 105 120

Время, ч

Рис 24 Кинетические кривые изменения флуктуации светопропускания суспензии ЛИП под влиянием плюроника Р68 Среда инкубации ИФБ, рН 7,4. концентрация ЛНП 0,5 мг белка.'мл, температура инкубации !*7сС. скорость перемешивания 100 обмин Кривая (1) - суспензия ЛНП в отсутствие плюроника Р68. кривая (2) а присутствии 0,4% плюроника Р68

О 12 24 36 48 6« 72 94 % 10» 120

Время, ч

Рис.25 Кинетические кривые изменения флуктуации светапропускания суспензии ЛИП под влиянием плюроника 1,61 Среда инкубации ИФБ. рН 7,4. концентраций ЛИП и,5 мг белка.'мл, температура инкубации 37еС, скорость перемешивания 100 обмин Кривая (1) - сусленэия ЛНП в отсутствие плюроника 161 кривая (2) в присутствии 0,022% плюроника Ш, кривая (3) в присутствии 0,0022% плюроника 1.61

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. 4Л Илняннс различных модификаций Чвспшы натнвных .11111 на устойчивость ЛНПВПршеНЛиН 1С win мши г

Ранее в нашей лаборатории было установлено существование в плазме крови бальных атеросклерозом циркулирующих модифицированпых ЛНГ1 {Orckhov et al, 1989, Tcttov et al, 1990) В ходе изучения цммЛНП было показано, что помимо измененных физико-химических свойств они отличаются от иатмвных липоцротеилов атерогенностью и повышенной склонностью к ассоциации Эти два свойства цммЛНП тесно связаны степень ассоциации прямо коррелирует со способностью вызвать накопление лнпнлов в культуре клеток 8 данной работе была предпринята попытка получил, ответ ня ряд вопросов какие изменения в структуре частиц нйтивных ЛИП должны произойти для того чтобы у липопротендов появилась склонность к ассоциации, какая in vitro модификации наиболее близки к той. что происходит' in vivo и ведет к появлению цммЛНП'?

Чтобы ответить на эти вопросы мы подвергали ЛНП различным модификациям, затрагивающим основные компоненты частицы лнполротснда Из полученных нами результатов можно заключить, что модификация любого из компонентов частицы нативных ЛНП белковой ее части, лип ид ной полиелчирндной ведет к снижению устойчивости липопротендов к ассоциации и к значительным изменениям конфорчаини апоВ белка Так. использованные нами протеолнтнческне ферменты стимулировали ассоциацию ЛНП и вызывали расщепление апоВ белка. По-видимому, такое нарушение структуры поверхности частицы ЛНП дестабилизирует ее и вызывает структурные перестройки в частице, снижая устойчивость к ассоциации Кроме того, в отсутствии ферментов или в присутствии ингибитора лротсолигичоскнх ферментов ассоциации не наблюдалась Это доказывает, что описанная нами ассоциация ЛИП связана именно с протеолитнчеекой модификацией л нгто протеидов

Поскольку различные проттеолитнческне агенты, такие как чнчая триптаза. металлопротеинаш. калликренн. лнзосмальные протеазы обнаруживаются в участках сосудов, пораженных атеросклерозом (Dorm К с| а!. 2UO0). то можно полагать, что ассоциация ЛНП, инициированная протегогизом, может иметь место m vivo. В пользу данного предположения свидетельствуют сдслуюише факты Фрагментнрованный агю В-100 неоднократно обнаруживался в ЛНП, выделенных из участков артерий, пораженных атеросклерозом (Lojda 2. et ah 1984, Stembrecher U P el al, 1992) в то время как в артерии без заметных очагов поражения фрагменты апо В-100 не обнаруживались (Yla-Hertitiala S е» al, I'JgK) ЛНП. изолированные из сосудов, подвергнутых атеросклерозу, имели пониженную плотность. что свидетельствует о частичной потере белка в результате его протеолиза (СЪао е| al, 1990). Полученные нами результаты, в целом, не противоречат работам, посвященных изучению влияют различных нротеолитическнх фермеров на ассоциацию ЛНП Так. было показано, что использование протеаз с высокой субстратной специфичностью (кядлнкреин. тромбин, плазмин) не приводит к ассоциации частиц ЛНП (Piha М el aL 1995) В то же время такие протеолнтическис ферменты как чнмотрипсин, отличающиеся низкой субстратной специфичностью н описпляюшие отапоВ значительные пептидные фрагменты, вызывали слияние частиц ЛНП (Peniikinncn el al. 1996, Piha M ei а]. 1995) Значительная протеолитаческая деградация агюВ под действием трипсина и химотрнленна продемонстрирована и в данной работе

Другой модификацией стимулирующей ассоциацию ЛНП является лнполнз фосфолнпидов поверхности ЛНП Лнполитическая модификация в данной работе моделировалась при помощи фосфолнназы А2 и фосфолнпазм С обоих случаях наблюдалась стимуляция ассоциаций ЛНП В случае увеличения концентрации фермента повышалась и степень ассоциации модифицированных ЛНГ1 В то же время при использовании ингибитора фосфолнпаз или в отсутствие фермента ассоциации ЛНП не наблюдалось Эти результаты согласуются с данными, полученными Hakala f Hakala er а! Hakala et al 2003) В лих работал было показано, что фосфмялк» А2 стимулирует агрегацию частиц ЛНП. а в прнсугствни гепарина и прозеогликано» вызывает слияние частиц липопротендов Ассоциация ЛНП под влиянием фосфолнпазы С была продемонстрирована в работе tin (Liu et al 1993)

Причины наблюдаемой ассоциации заключаются, по-видимому, и увеличении гидрофобностн частицы ЛНП под действием фосфолипаз Так, в нашей работе было продемонстрировано повышение уровня лнзофосфсггиднлхолиня и диацилглицеролл под действием- соответственно, фосфолнпазы А2 и фосфолнпазы С Известно, что лнзофосфотидидхолин и диацилглицерол способствуют формированию гидрофобных мнкродоменов на поверхности частицы ЛНП (Hevonoja el al 2000) Таким образом, можно предположить, что гидролиз фосфолнпидов инициированный фосфолиназамн A J и С приводит к модификации физико-химических свойств поверхности частиц ЛНП Так как рядом авторов было установлено присутствие ряда л и политических ферментов, в том числе фосфолнпазы А;, в очаге атеросклеротнчеекого поражения (He^onoja ei al 2Q0Q. ÔOmi К et al, 2000), то продемонстрированная нами ассоциация ЛНП под воздействием фосфолипаз вполне возможно имеет место и m vivo. Это предположение также косвенно подтверждает факт повышения уровня фософлипазы А3 в плазме больных сердечно-сосудистыми заболеваниями (Hurt-Camejo К el al 2001) В то же время, попытки обнаружить присутствие внеклеточной фосфолнпазы С в стенке сосуда успехом не увенчались Уровень диаиилглннерола в ЛНП выделенных из участков ате|юсклеротичсскнх поражений также не был гюнытеп

Eme одни« фермером, который предположительно вызывает модификацию ЛНП in vivo является миелопероксидата Этот фермент отсутствует в непораженных участках аорты, но обнаружен в АКТИВНОМ состоянии в интиме аорты с характерными атеросклсротическимн повреждениями В данной работе миелопероксидата использовалась для моделирования окислительной модификации Присутствие МПО в среде инкубации ЛНП приводило к уменьшению устойчнвочтн лнпоггротекдов к ассоциации В отсутствие фермента или его субстрата перекиси водорода ассоциации не наблюдалось Это значит, что фермент, вероятно, через образование гнпохлорита снижает устойчивость частиц ЛНП к ассоциации

Рассуждая о механизмах ассоциации ЛНП под действием мислоперокснлазы. можно предположить, что гнлохлорит действует на аминокислотные остатки или углеводную компоненту artoB (Jerlich et al 1998) Помимо этого, возможно н опосредованное нарушение конформаини апоВ через воздействие HOC1/OCI' на фосфолипнды или холестерин (Carret al, 2000. Ha/cn et al 19%), расположенные в непосредственной близости от ало В Гнпохлорит также разрушает линндорастворнмыс антнокеидлнгм в ЛНП, снижая их резистентность к окислительной модификации Подобные химические реакции приводят к значительным изменениям физико-химических свойств гюверхностн ЛНП Увеличивается полярность липмдной фазы, снижается подвижность .шильных цепей фосфолнпилов. увеличивается отрицательный потенциал поверхности частицы ЛНП Такие значительные нарушения физико-химических свойств поверхности ЛНП, по всей вероятности, приводят к потере устойчивости ЛНП, как коллоидной системы Результатом и ваяется усиление ассоциации ЛНП. продемонстрированное также Jerlich (Jerlich et al 2000) Таким образом, результаты работы позволяют заключить, что миелоперокендаза способна модифицировать физико-химические свойства поверхности ЛИГЕ таким образом, что они теряют устойчивость к ассоциации

В литературе широко обсуждаете* возможность модификации ЛНП in vivo при окислительном и карбонильном стрессе Предполагается, что в возникновении повреждений частии ЛНП н стенки сосуда при атеросклерозе важную роль играют вторичные продукты свободнорадикального окисления 1НПИД011 альдегид но и природы, накапливающиеся в процессе окислительной деструкции лмпидных гндроперокендов Типичным примером таких альдегидов чвляется МДА Было показано, что альдегиды, генерируемые при деструкции липоперокендов а окисленных ЛНП, образуют адлукты с с-змнногруппамн лнэиновых остатков молекул апоВ, вызывая изменение структуры молекулы белка и модификации частиц ЛНП (Uchida К,. 2003) Кроме того, большое количество ннзкомолекулярнмх альдегидов, способных модифицировать ЛНП накашивается в процессе автоокисленнн глюкозы Свободная, а также связанная с белками глюкоза подвергается неферментативным и ферментативным модификациям, в результате которых образуются ни1Комолекулярные альдегиды, такие как глноксаль, мстилглнокеаль, 3-деоксиоюкозон и глнкольальдегнд (ЧЪопзэИеу Р et al, 1999, Клоп Н ei al, 2003, ßeisswengcr Р ci aJ, 2003), В данной работе было проведено исследование влияния альдегидов эндогенного происхождения глиоксаля. метилглноксаля и МДА на ассоциацию ЛНП Было установлена, что все использованные альдегиды стимулировали ассоциацию ЛНП Параллельно, было показано, что • истицы ЛНП, обработанные МДА, метмдгпмокеалем н глиоксалсм, обладают значительной злектрофоретической гюдвижностью по сравнением с нативнымн ЛНП При сравнении >щ данных с данными по ассоциации ЛНП ясно видно, что наиболее сильную aipcraiiHK» вызывают именно тс альдегиды (метил глноксаль>т лиоксаль>МДА}. ори модификации которыми отмечены изменения в степени уяектрофореткческой подвижности ЛИП Эти результаты не противоречат данным полученным ранее (Sclwlkwuk ei at, 1998, Knoll eial 2003)

Для моделирования десналируютен модификации в данной работе использовалась бактериальная нейрлмниндата Было продемонстрировано значительное снижение устойчивости к ассоциации натнвныч ЛИП обработанных нейрамниндазой Эти результаты дополняют ранее полученные данные, свидетельствующие о значительной роли лесиалнрунзщсй модификации лнпопротецлов низкой плотности в лтерогенезе Так. было показано, что цммЛНП отличаются от нативных ЛНП сниженным содержанием сналовон кислоты (Orekhov е» al, 1990, Тетюч el а!. 1992) В пммЛНП, выделенных нз крови больных атеросклерозом, содержание сналовон кислоты было в среднем в 2-3 раза ниже, чем в натнвных лмпопротсидак (Tertov el al, 1992. 1995 J Была установлена достоверная обратная корреляции между содержанием сналовон кислоты в Л НИ и способностью лнпопротендов вызывать накопление лил н дон in vino (Onekhcv et al. 1992). Кроме того, натнвные липолрогеиды моровых лиц после удаления сналовой кислоты бактериальной нейраминнлззой приобретши атерогениые свойства {Orekhov с» а). 1989. f99J) Наконец, было продемонстрировано достоверное снижение уровня сиадовой кислоты в результате иикубаинн липопротендов с аутологнчной плазмой (Tertov el al, 1998)

В зависимости от характера модификации были продемонстрированы разноплановые изменения, происходившие в структуре частицы ЛИП расщепление апоВ белка в результате прогеолитической модификации, изменение липидиого состава лнпопрозеидов, обработанных фосфолкназами, накопление ТБК-реак-гнвных продуктов вследствие окисления чнелопероксидазоЙ Все эти различные по своей природе изменения различных компонентов частицы ЛИП дестабилизируют частицу ЛИН и приводят к потере устойчивости к ассоциации

С физико-химической точки зрения ЛИП представляют собой мелкодисперсную липндиую эмульсию я водной среде У стойч ивос гь такой коллоидной системы обусловлена тем обстоятельством,, что неполярные лиг иды ядра ЛНП экранированы от гидрофильного окружения полярными группами фосфолипндоа и аноВ-КЮ, экспонированными в сторону волной среды В результате любой ш использованных нами модификаций происходит нарушение поверхностной структуры ЛНП, обнажение неполнрных гидрофобных участков и, благодаря этому, возникает возможность взаимодействия частиц между собой В настоящей работе мы подтвердили, что модификация любого компонента частицы ЛНП приводит к ассоциации лнпопротендов Помимо ферментативной модификации разнообразные физические факторы, такие, например как изменение сапьватцой оболочки частниы ЛНП. стимулируют ассоциацию частиц ЛНП Поверхность ЛИП в целой заражена отрицательно [Панасеико с солит . 11 Как н любая заряженная частица ЛНП в водной среде окружены сольватнон оболочкой, целостность которой определяет устойчивость частиц ЛИП к ассоциации и стабильность коллоидной системы в целом [Зонтаг, Штрснге, 1973] Поскольку формирование сольватзюй оболочки напрямую зависит от физико-химических свойств поверхности частицы, то можно ожидать, что любое изменение структурной организации поверхности ЛНП приведет к нарушению со льва гной оболочки, а значит, повлияет на устойчивость частиц ЛНП к ассоциации

Нарушения сольвагтной оболочки в данной работе добивались путем добавления в среду инкубации ЛНП политтнленгликоля (ПЭП Оказалось, что любое из указанных нарушений сольватнон оболочки ЛНП приводило к нх ассоциации, причем цммЛНП агрегировали быстрее нативных Этот факт сше раз подтверждают высокую склонность цммЛНП к ассоциации

4,2 Изучение »¡информационных изменении лпоИ белка hmfviЛ 1111 it ферментатипно моднфнннроианнмv JlMN

Повышенная склонность к ассоциации является обшнм свойством всех исследованных типов модифицированных ЛН11

Этот вывод позволил сформулировать другой вопрос на который мы пытались ответить в данной работе какая нз использованных нами модификации наиболее близка к той, что происходит in vivo и ведет к появлению цмм J1 Hfl9 Ответ на этот вопрос мог пролить свет на причины возникновении цммЛНП Специфичность изменений, происходящих в частице ЛИП в результате? той или нной модификации, подтверждает сравнительное исследование изменений конформаини агЕоВ белка модифицированных различным о 65 разом липопротеидов При любой использованной модификации нцсиподилось значительное изменение информации апоВ Ие только протсолитическа« модификация способствует изменению структуры аполнпопротеина В- I ОО, но также липолнтнческая. дегликознлнрнрукицая, окислительна» мидификацин также приводят к перестройкам апоВ Ранее информационные перестройки апоВЧОО индуцированные лнполиэом и выражающиеся в изменении нммунорсактивнисти моноклональных антител, сокращении доли о - спирали н увеличение содержания ß - складчатого слоя в структуре белка выпи продемонстрированы в ряде работ(Asatiyan е< al, 2004. Cliaiihan et al. 199 7)

Довольно сложно отметить обилие закономерности при сравнении профилей антигенных изменений апоВ под действием различных ферментов Сравнение антигенных профилей цммЛНП и ферме» ггативио модифицированных /1ИГ1 приводит к выводу', что ни одна ферментатнипан модификация не воспроизводит изменении структуры аиоВ, происходящих в цммЛНП В то же время известно, что цммЛНП характеризуются модификацией всех известных компонентов лилопротендной частицы Подученные данные подтверждают предположение о том. что формирование структуры цммЛНП является следствием множественной модификации лилопротендной частицы и невозможно указать конкретную модификацию, ответственную ta нояилснис цммЛНП

4,3 Экзогенные ингибиторы ассоциации .11111

Таким образом, склонность к ассоциации является общим и важнейшим свойством как in «сто, так и m vivo модифицированных ЛНП Возможности модуляции ассоциации ЛНП изучены недостаточно С целью поиска ингибиторов ассоциации было проведено сравнительное исследование влияния различных амфифнльных блок сополимеров оксида пропилена н оксида зтнлена - гинороннков на ассоциацию ЛНП В работе использовалось три плюроника отличающихся но выраженности гндрофнлмю-липофипьиых свойств Удилось показать, что плюроннки Р85 и L61, характеризующиеся выраженными или умеренными липофилыгымн свойствами, способны значительно ннгнбнровать ассоциацию ЛНП В то же время гидрофильный плюроник не оказывал влияния на ассоциацию липопротендных частиц Полученные данные косвенно подтверждают предположение, впервые выдвинутое Rhoo и соавторами (К1кю et al, 1490} о роли гидрофобных взаимодействий в процессе ассоциации ЛНП Предположительно, в ходе инкубации при постоянном перемешивании происходят конформацнониые изменения структуры ЛНП, приводящие к зкепозиции гидрофобных участков на поверхности частиц Далее начинает происходить взаимодействие гидрофобных участков разных частиц, приводящее к ассоциации ЛИП В случае присутствия а эмульсин ЛИТ) 4змфнфкдг.ных ас теста, лнпофнльная часть амфифклыюй молекулы может взаимодействовать с гидрофобными доменами нв поверхности частит.! ЛНП экранировать их и, таким образок, предотвращать процесс ассоциации ЛНП По видимому, плюроникк образуют с ЛНП комплекс и стабилизируют, таким образом, частицы лнпопротендов Это предположение подтверждается в работе Мошл и соавторов (Могйа с! а Г 2002}, показавших, что плюроник 1-Я Г сходный по свойствам с использованным нами 1,61, образует при инкубации с ЛНП комплекс диаметром 30 им Также нам удалось показать, что плюроник и не вызывают диссоциации уже образовавшихся ассоциатор ЛНП. но предотвращают дальнейшую ассоциацию частиц Вероятно, это может означать, что амфнфильные полимеры способны стабилизировать не только натнвные частицы ЛЕШ, но и образующиеся ассоцнаты. однако не способны обратить процесс ассоциации вспять

Примечательно» что минимальная ннгибируюшая концентрация пдюроннка тесно связана с крнтческой концентрации мнцеллообразовання (ККМ) Как для плюроника Р85. так н в случае плюроинка 1.61 концентрации меньшие ККМ не оказывали влияния на процесс ассоциации Эта закономерность, состонщая в проявлении биологической активности пдюроннка только в концентрациях превышающих ККМ. отмечается в большинстве работ, посвященных изучению свойств пдюронмков

Учитывая большое значение ассоциации ЛНП в патогенезе атеросклероза, полученные данные о возможности подавления ассоциации с помощью плюронмкоа могут стимулировать разработку новых подходов к терапии и профилактике атеросклероза С другой стороны, получены новые данные о разносторонней биологической активности плюроников Причины влиянии плюроннков на ассоциацию ЛНП. закономерности взаимодействия полимеров с частицами липолротендов заслуживают дальнейшего изучении Решение этих вопросов позволит окончательно раскрыть механизмы ассоциации лнп выводы

1 Циркулирующие в крови частицы множественно модифицированных ЛНП нестабильны и склонны к ассоциации, что отличает их от нативных ЛНП

2. Обработка нативных ЛНП лротеолнтнчееккмн, лилолитическимн, десиалируюшими, индуцирующим окисление ферме игами, ал Метками эндогенного происхождения приводит к существенным изменениям белковой, липндной и полисахзрнднон компонентов липапротенднон частицы и стимулирует ассоциацию модифицированных ЛИП.

3 Пространственное расположение апоВ-КЮ белка, ответственного за стабилизацию частиц ЛНП, в цммЛНП и модифицированных m M tro ЛНП отличается от расположения алоВ белка в плтниньн ЛНП

4 Ни одна нз модификации протсолнтическая. лнполнтнческая, дссналирукицая, окислительная, модификация эндогенными альдегидами не пыэывост изменен ни пространственного расположении .moll белка сходных с изменениями, происходящими в цммЛНП, что свидетельствует о множественном характере модификаций, приводящих к формированию цммЛНП в крови

5 Амфнфильные блок-сополимеры окиси пропилена и окиси этилена, т и плюроннки способны подавлять ассоциацию ЛНП. но не вызывают диссоциацию ассоцнатов ЛНП

6 Способность плюроннков ингибировать ассоциацию ЛНП и минимальная ингнбируюшая концентрация зависят от гндрофильно-липофильного баланса и критической концентрации мнцеллообразовлпни, что свидетельствует о значительной роли гидрофобных взаимодействий а ассоциации ЛНП

104

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1 Аничкин НН. Частная патологическая анатомия Сердце и сосуды - Второе издание - Москва-Ленинград Медгнз, 1947

2 Климов А И , Инкульчевл H Г. Липиды, лннопрогеиды и атеросклероз • Санкт-Петербург Изд-во «Пнтер». 1995.

3 Панасенко ОМ. Мельниченко АА, Аксенов ДВ. Вахрушева ТВ, Супрун ИВ. Янушевская HB, Власик ТН, Собеннн И А, Орехов AI I Мнслопероксмдаза. модифицируя поверхность и снижая устойчивость к ассоциации лнпопротсииов низкой плотности крови человека, повышает их атерогенный потенциал, fi Бнол мембраны -2004 -T2I - С 498-505

•I Панасенко ОМ. Тертой ВВ, Мельниченко АА, Аксенов ДВ, Собеннн И А, Каплун ВВ. Супрун ИВ, Орехов Ali Связь размера деглмкоэнднрованных различными ферментами аиоВ-содержащнх лнпопротеннов с н\ а терем с иным потенциалом Н Биол мембраны -2006 -Т 23. - С 43-52

J Тертов ВВ M но жсств енн о- модиф н цнрова ннис л м п ort рс те нд и низкой плотности, циркулирующие в крови человека // Ангиология н сосулистая хирургия-1999 -Т 5 -С 218-236

6. Янушевская ЕВ. Валентинова HB. Медведева HB. Морозкнн АД, Власик ТН Иммунохимическая гетерогенность липопротсинов низкой плотности человека //Ангиология и сосудистая хирургия -1999 -Т5. - С 24Î-255

7 Aggerbeck LP. Kezdy FJ and Scanu AM Enzymatic probes oflipoproiein structure Hydrolysis of human scrum low density lipoprotein^ by phospholipase A2//J Biol Chem -1976 -V, 251 -P H23-3830

8 Alaupovic P. Apoliproproteins and lipoproteins // Atherosclerosis -1971.

-V 13(2) -P M1-6

9 Arnold K, Amhofd 1, Zsehomig Or Wiege! D. Krumtoicgel M Characterization of chemical modifications of surface properties of low density lipoproteins if Biomcd Bioctum. Acta -1989 -V 48 - P 735-742

10 Arnold K. Hern Hann A. Gawrisch K, Pralsch L In Molecular Mechanisms of Membrane Fusion // New York -1987 - P 118-137

11. Arnold K. Zsc hornig O Aggregation of human plasma low density lipoproteins by means of polyethylene glycol), ft Biomed Bioclum Acta -1988 -V 47 -P 949934

12 Asatryan Liana. Ryan T Hamilton, J Mano Isas, Juliana Hwang, Rakez Kayed, and Alex Se^anion LDL phospholipid hydrolysis produces modified electronegative particles wilh an unfolded apoB-tOO protein Journal of Lipid Research -2ÜU5

V 46 -P 116-122

13 Asmis R and J elk J. Large variations in human foam cell formation in individuals a fully autologous m vitro assay based on the quantitative analysts of cellular neutral lipids II Atherosclerosis. -2000. -V 148 -P 243-253

14 Asmis R, Bcgley JG, Jelk J, and Eversen WV, Lipoprotein aggregation protects human monocyic-dcnvcd macrophages from OxLDL-mduced cytotoxicity

J Lipid Res -2005 -V 46 - P 1124-1132

15 Avogaro P. Bon GB aivd Caezolato G Presence of a modified low density lipoprotein in ImiHiiits •' Arterioscler Thromb Vase Biof -1988 -V if - P 79-87

16 Avogaro P, Ca&colato G and Bittolo-Bori G Some questions concerning a small, more electronegative LDL circulating in human plasma Atlteroiclerosis -I99| -V 91(i-2) -P 163-71

17 Bates SR, Wissler RW Effect of hyperhpemic serum on cholesterol accumulation in monkey aortic medial cells // Btochim Biopliys Acta -1976 -V 450(1) - P. 7888

18 Batrakova EV. Li S, Alakhov VY, Miller DW. Kabaoov AV Optimal structure requirements for pluforac block copolymers in modifying P-glycoprotcm drug efflux transporter activity in bovine brain microvessel endothelial cells I'nrttiacul Exp Tlier -2003 -V. 304. - P 845-854

I4) Bauinstark M\V, Kreui/ W. Berg A, Ere y ] and Kcul J Structure of human low-density lipoprotein subtract ions, determined by X-ray small-angle scattering ,/Bioehtm Biophys Acta [990 -V 1037 -P -IS-57

20 Beisswenger P., Ruggiero-Lopez D Metformin inhibition ofglycation processes U Diabetes Mdab -2003 -V 29 - P 6S95-103.

21 Belkner. ) , R Wleaner, J Ratlimnn, J Burnett, E Sigal. and H Kuhrv Oxygenation of lipoproteins by mammaltan lipoxygenases ."Eur J Biochem -1993 -V 213 -P 251-261

22. Berliner, J A. and J W Heinecke 1996 The role of ox idtzed lipoproteins in atherogencsis II Tree Radie Biol Med -19% -V 20(5 > - P 707-27

23.Brown MS and Goldstein JL Lipoprotein metabolism in the macrophage implications for cholesterol deposition in atlverosclcrosis Annu Rev Biochem -1983 -V 52 P 223-261

2<1 Buton X, Mamdouh 2, Ghosh R. Du H, Kunafcose G, Bcalit» N. Grabowski GA, Max field FR and Tab a s f Unique Cellular Events Occurring during the Initial Interaction of Macrophages with Matrix-retained or Methylated Aggregated Low Density Lipoprotein (LDL) Il J. Biol Chem -1999 -V. 274 - P 32112-32121

25 .Camejo G. The interaction of lipids and lipoproteins with the intcrccllulat matrix of arterial tissue its possible role m atberogenesis. II Adv Lipid Res -1982 -V 19 -P 1-53,

26. Carr A, McCall M. Fret B U Artenoscler Thtomb. Vase Biol -2000 -V 20 - p 1716-1723

27 Chao F F , Blancliette-Mackie E.J., Chen V J. Dickens B F . Berlin E . Amende L M. Skarbtos SI, Gamble W , Resau J H . Mergner W I , Krutb H S // Am J Patiiof -1090 -V 136 - P 169-179

28 Chauhan Viiula, Xingvu Wang, Tanya Ramsamy, Ross W Milne, and Daniel L Sparks Evidence for Lipid-Dependent Structural Changes in Specific Domains of Apoltpoprotein BI00 // Biochemistry -1998 V 37 - P. 3735-37-12

29 Own RM. Ftfher-P/oga K Effect of bypej-Jjpcimc serum lipoproteins on the lipid accumulation and cholesterol flux of rbbil aorttcmedial cells // Atherosclerosis -1977 -V 28 -P 339-353

30 Cookson FB The origin of foam cells m atherosclerosis H Br J Exp Pathol 1971 V.52(l) -P 62-9

31 Kndemann G. Stanton LW. Madden KS. Bryant CM. White RT, and Protter AA, CD36 is a receptor for oxidized tow density lipoprotein •' I Biol Chem -1993 V 268 -p i i8m-11816,

32 Esterbauer II, Gebicki J, Puhl H and Jürgens G The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL // Free Rad ic Biol Med -1992 -V 13. -P 341-390

33Fenskc [)B, Chana rs, Pannar YJ, Trdcaven WD and Cushley RJ Strucuire and motion of phospholipids in human plasma lipoproteins A 31P NMR study Biochemistry 1990 -V 29 -P 3973-3981

34 Fogelman AM. Shechter I. Seager J. Hokom M, Child JS and Edwards PA Malondratdehyde Alteration of Low Density Lipoproteins Leads to Cliolestetyl Ester Accumulation tu Human Monocyte-Macrophages ft Proc Natl Acad Sei USA -1980 -V 77 -P 2214-2218

35 Fowter SM, Scio MA. Haley NJ Characterization of hpid-laden aortic cells from cholestrol rabbits. IV. Investigation of macrophage-hke proteins of aonic cell populations // Lab Invest -1979 -V 41 - P 372-378

34. Frank JS and Fogelman AM, infrastructure of (He intuitu m WHHL and cholesterol' ultra-rapid freezing end frceM-etcbuig ttl Lipid Res. -19S9 -V 30 - P 967-978

37 Galis ZS, Sukhova GK. Lark MW and Libby Increased expression ofmaim melalloproteinascs arid matrix degrading activity in vulnerable regions of human alberosclcroneplaques //J. CliTL Invest-1994 V 94 P 2493-2303

38 Goldstein JL and Brown MS The low-dc№ily lipoprotein palhway and its relation to atherosclerosis // Annu Rev Biodiem -1977 - V 46 - P 897-930

39 Goldstein JL, Ho YK. Basu SK. and Brown MS Binding site on macrophages (bat mediales uptake and degradation of aeefylaied low density lipoprotein, producing massue cholesterol deposition. // Proc Nail Acad Sei USA -1979 - V 76 - P 333-337

40 Gorshkova Г.Ч. Menschikowski M and Jaross W Alterations in the physicoehemiçal characteristics of low and high density lipoproteins after lipolysis w ith pbospholipase A2 A spinlabel study Biochim Biophys Acta -1996 - V. 1300

P 103-113

41 Grainger dj. Kemp PR, Liu AC, Lawn RM and Metcalfe JC Activation of transforming growth factor-beta is inhibited in transgenic apohpoprotcm(a) nuce Nature -1994 -V 370 -P 460-462

42 Guyton JR and Klentp KF Development of die atherosclerotic core region Chemical and ultrastmciural analysis of microdissecied atherosclerotic lesions fitww human aorta // Arterioscler Thromb -1994 -V 14 - P 1305-1314

43-Guyton JR, Klemp KF, Black BL, and Bocan TM. Extracellular lipid deposition in atherosclerosis И Eur Heart J, -1990 - V If- Suppf E P 20-28.

44 Haberland ME, Fogelman AM The role of altered lipoproteins m the pathogenesis of atherosclerosis //Amer Heart J -1987 V 259.-P 11305-11311

45 Habcrland ME, Fotig D, Chen L Maalondi aldehyde-altered protein in atheroma of Wstanabc heriiabte hyperlipidenuc rabbits Science -1988 - V 241 P 215218

16 I Eakala J. Oonu К, Ala^Korpela M. Kovanen P M Aricmwelei Thromb Vase Biol -1999 - V 19 - P 1276-1283.

47 Hakala J. 06m K, Pennfcamen M, Hurt-Camejo E, Копшсп P » Arienoseler Thromb Vase Biol.-200]. - V 21 - PJ053-1058

4S Hakala. J К , К. Oomi. K.M. Ala-Korpela, and P T Kovanen Lipolytic modificalion of LDL by phapbolipase A2 induces panideggrcgaHaii m the absence and function m the presence of heparin ii Artenoscler Tluomb Vase Biol -1949 V, 19 -P 1276-1283

49 Hazetl U. van den Berg J J and Stocker R Oxidation of low-dens iiv lipoprotein by hypochlorite causes aggregation thai is mediated by modification of lysine residues rallier than lipid oxidation //Biochcm J -1994 - V. 302 ( Pt 1 ) - P 297-3U4

50 Hazen SW, Fu Hsu F, Duffin K, Hcmeske JW // Journal of BuKheimstiy -1996

V 271 - P 23080-23088

51 Hevonoja T , Penlikaincn M O , Kyvönen M Г , Koranen P Г , Ala-korpela M Biochini Biophys Acta -2000 -V 1488 - P 189-210

52 HoíTHF, Whnaker TE and O'Neil J Oxidation of low density lipoprotein leads to particle aggregation and altered macrophage recognitwn./<f J Biol Chein -1992

V 267 - P 602-609

53 1 lotopamen JM. Subramanian M Kmnunen KJ Sphingomyelinase induces lipid microdoiiiam formation in a fluid phosphatidylcholine sphingomyelin membrane Bioelwmistiy -1998 - V 37 - P 17562-17570

54 Huang H-\V. Goldberg EM. and Zidovetzkr R Ccramide induces structural defects into phosphatidylcholine bdayers and activates phosphohpase A2 // Biochcm Biophys. Res Commun -1996 -V 220 - P 834-838

55 Hun-Camejo. E , S Andersen, R. Standahi. В Rosen gren. P Sanipy, E Siadberg, and В Jobansen l-oeali/ation of nonpancrealic secreioiy pbosplwhpase Л2 iri normal and slhcrosclcroüc arienes Actrviiy of tbe isolaled enzyme im low-density lipoproieins (! Arteriöse!er Thromb. Vase Biol -1997 - V 17 -P 300-509

56 Hiut-Camcjo E . Caittejo G , Petlof H , Öomi К Kovanen P "Г V Cire Res -2001 - V 89 - P 298-304

57 Ivciius pH, The inwmclion beiween human ptasma bpoproietrvs and coroicclivc nssuc jjlycosammoglycans // JBiolChem -1972. - V 247 - P 2607-2613

58 Jerlicb А „ Fabian J. Tschabuschmg S, Smimovft Л, Horakova L. Hayn M. Auer H, üutlenbefger H. Lcis HJ. Tatzber F, Waqj G, Schaur RJ H Free Radical Biobgy & Mcdicme -1998 - V 24 - P 1139-114»

59 Jcffrsh A. Frite G, Kharrazt H, Hammel M. Tsehsbusctong S. Glatfer S. Schaur RJ U Biochnniea c< Bioplusika Acta -2000 - V 1481 - p 109-118

60 Kantinen M„ Pcntnla A and Kevinen IT Mast cells oflwo iypes differiiVB in neutral protease Composilion in the human aortic intima Demonstration of ¡rypta.se-and tryptase hymaseconlainmg mast teils in nonnal intimes, fattv streaks. and (he Shoulder regioas ofailteromas // Artenoscler Thromb -1994 V 14 p 966972

61 Kabanov А V . Butniko\iiF, V, Alnkbov V Y Plufonie block copolymere as novel polymer thcrapeulics For drug and genc deliveiy U Journal of Controllcd Release -2002 - V 82 - P 189-212

62 Kavvabe Y. Cvnshi O, Takasbima Y, Suzuki T. Obba Y and Kodaimv T Oxidalaou-■ridticcd aggregation of rabbit low-densiiy lipoprolein by аго Initiator И Arch ßiocbem ßiophvs -1994 -V 310(2) - P 4Я9-96

63 Khoo JC, Miller E, McLoushlin P and Steinbcrg В Preventton of low-density lipoproietn a^regation by high density lipoprolein tu- apobpoprotem A-I H J Lipid Res -1990 -V 31 -P 645-652,

04 Klentnian Y, Knil ES, Bûmes M, Aronson W, Piteger B and Schonfeld G Lipotysis ofLDL wflfl phosptoojjpase A2 alters ibc expression of selected apoB*ID0 epitopes and the interaction of LDL with celts H l Lipid Res -1988 - V 29 -p 729-743

65.Kiioii H M , Brown BE, Da vies M J. Deawl R T Glycation and glycoxidation of low-density lipoprotein b>' glucose and low-molecular mass aldehydes it Euf J Biochem. -2003.-V 270 - P 3572-3582

66 Kokkonen JO and Kovanen PT Proteolytic enzymes of mast cell granules degrade low density lipoproteins and promote their granule-mediated uptake by macrophages ra vitro // J Biol.Cheni -1989 - V 264 - P 10749^10755

67 Kokkonen JO, Vartiatnen M and Kovanen PT. Low density lipoprotein degradation % secretory granules of rat mast cells Sequential degradation of apohpoproiem B by granule chymase and carboxypeplidase A HI Biol Cheiu -1986 V 261 P 16067-16072

68 Kroon PA Fluorescence study of the motional states of core and surface lipids in native and reconstituted low density1 lipoproteins // Biochemistry -1994 - V, 33 -p A 879-4884

69 Knith HS, Huang W, Ishn t, and Zhang WY, Macrophage loam cell formation with native low density lipoprotein // J Biol Chen 2002 - V 277 - P 34573-34

70 Kruth HS. Jones NL, Huang W. Zhao B, Uhn I, Chang Jt Comb* CA, Malide D and Zhang WY Macropmocytosisis the endocytic pathway that mediates macrophage foam cell formation with native low density lipoprotein J Biol Chcm 2005. - V. 280. - P 2352*2360,

71 La Belle M, Krauss RM Differences in carbohydrate content of low density lipoproteins associated with Low density lipoprotein subclass patterns J Lipid Res -1990 V31 -P 1577-1588

72.Leake DS, Rankin SM and Collard J. Macrophage proteases can modify low density lipoproteins to increase their uptake by macropliagcs H FEBS Lett ¡990 -V.269 209-212

73 Liu H. Scrnba DG, and Ryan RO ft FEBS Let! ■ 1993 -V 316 P 27-33

74 Llotcntc-Cortes Vt Martincz-OonzaJez J. and Badimon L, LDL rcceplar-rclalcd protein mediates uptake of aggregated LDL in human vascular smooth muscle cells ¡7 Anenoscler Thromb Vase Biol -2000.-V 20 -P 1572-1579.

75 Lojda Z. Ruztcfcova M, Havrankova E and Synkova V Lysosomal protease« in the nomial and aihetoscleroiic arterial wall //J Histochcm -1984 V 16 -P 399 405

76 Lopes-Virella MF, Klein RL. Lyons TJ. Stevenson HC and WUttum JL Glycosylation of low-density lipoprotein enhances cholesteryl esier synthesis in human monocyte-dcnved macrophages Diabetes — 1988 -V.37 -P 550-555

77 Lottin 1I, Motta С and Simard G Differential effects of glycero- and sjihmgo-phosphol ipolysis on human high-density lipoprotein fluidity ■ ■ Bmchim Biophys Acta ^1996 -V 1301 -P 127-132

7S Lund'Katz S and Phillips MC Packing of cholesterol molecules tn human low-density lipoprotein. // Biochemistry -1986 -V 25 -P 1562-156-8

79 Lund-Katz Laboda HM. McLean LR and Phillips MC Influence of molecular packing and phospholipid type on rates of cholesterol excltangc Biochemistry -198« -V.27 -P 3416-3423

SO Matlley RW. Innerarity TL, Weisgrnber KH. Oh SY Altered metabolism (tn vivo and in vttro) of plasma lipoproteins alter selective modification of lysine residues of apoproteins //J C1in Invest -1979 -V64 -P 743-750.

HI. Маог. I , and M Aviram Macrophage released proteoglycans areinvolved in cellmediated aggregation of LDL fi Alherostleraxi* 1999 -V 42 -P 57-66

52 Muwwilz NR, Tso P, Drake DS, Frase S. Sabesin SM Dietary supplementation with Pluroatc L-81 modifies hepatic secretion or very low density lipoproteins in the mi it J Lipid Res -1986 -V 27(2) -P 196-207

53 Marathe S. Kunakose Ci, Williams KJ and Tubas 1. Sphingomyelinase, an enzyme implicated in atherogertesis, is present in atherosclerotic fesiortx arid brnds to specific components of the subendothehal extracellular mains <

Arlenoscler Thromb Vase Biol -1999 -V 19 -P 2648-265*

84 Mateu L, A Vila EM, Camejo G, Leon V and Lrscano N The structural stability of low-density lipoprotein A kinetic X-ray sc altering study of us interaction with arterial proteoglycans //Biochim. Biophys Acta-1984 -V 795 -P 525-534

85 Mattjus P and Slotte JP Does cholesterol discriminate between sphingomyelin and phosphatidylcholine in mixed monolayers containing both pliosphotipids'? // Chein Phys Lipids -1996 -V 81 -P 69-80

86 Menschikowski M. Kasper M, Latlkc P. Sclnenug A. Schiefer S. Stockmjier I I and Jarow W Secretory group 11 phosphatase A2 in human atherosclerotic ptiquei. Atherosclerosis -199S.-V.118. -P 173-1S1

87 Mora R, Lupu F. and Stmionescu N. Prelesional events m atlierogencsis Colocalization of apohpoprotein B, uriestcrtftcd cholesterol and extracellular phospholipid liposomes in ihe aorta of hyperlipidernic rabbit V Atherosclerosis -1987 -V 67 -P 143-154

88 Morita S, kawnbe M, Nakano M, Handa T Pluronic LSI affects the hprd panicle size and apohpoprotein B conformation ti Chemisny and Physics of Lipids -2003 -V 126 -P 39-498

89 Murphy HC, Ala-Korpela M. White J J. Raoof A, Bell JD. Barnard ML. Burns SP and ftes RA Evidence for distinct behaviour of phosphatidylcholine and sphingomyelin at the low density bpoprotem surface // Btochem Biophys Res Comnwin -1997 -V 2^1 -P 733-737

90 Navab M , Berlin« J A , Watson A D , Hama S Y . Temo M-C , I.wis A J SHama.M C Temto.A J Ltms. D M Shah. B. J Van Lenten. J S Frank, L L Oemer, P A Edwards, ami A M. Fogelman The yin and yang of oxidation in l he development of the fatty sircak !! Artenoscler Thromb Vase. Biol -19% -V 16 -P831- 842

9) Nievclstcin PFEM, Fogelman AM. Mollino G, and Frank JS, Lipid accumulation in rabbil aotiic HHima 2 hows after bolus infusion of low density lipoprotein A deep-etch and i mm uno localization study of ultrarapidly frozen tissue fl Artenoseler Thromb -1991 -V II -P 1795-1805

92 Nievelstein-Post P. Mottino G, Fogelman AM. and Frank J. An ultrastructural study of lipoprotein accumulation in cardiac valves of the tabbu ' Artcrioscler Thromb -1994 -V I4. -P 1151-1161

93 tihki S, Arnold k Surtacc dielectric constant. suriace hydrophobicity and membrane fusion // J Membr Biol -1990 -V 114 -P 195-203 y-tOomi K., Hakala JK, Anmla A, Ala-Korpeta M. and Kovancn FT,

Sphingomyelinase induces aggregation and fusion, bin phosphohpase A2 only-aggregation, of low density lipoprotein (LDL) particles Two distinct mechanisms leading to increased binding strength of LDL to human aortic proteoglycans J Biol Chem -1998 -V 273 -P. 29127-29134

95 Oomi K . Pent ik amen M O . Ala-Korpela M , Kovanen P T // J Lipid Res -2000 -V41 -P. 1703-1714

96 Orekhov AN. Teitov VV. Mukhin DN, Kotelmnsky VE. GIuJJkhti MA. Fnd MG. Suklwva GK. Khashimov KA and Sroimov VN Insolubihatauon of low density lipoprotein mduccs cholesterol accumulation in eulturcd subendolhehal cells of human aorta H Atherosclerosis-1989 -V 79 (l) P 59-70

97 Randan en K and Kovanen PT. Proteolysis and fusion of low density lipoprotein panicles independently strengthen their binding to exocytosed mast cell granules J.Biol Chcm -1994 -V 269 -P 2023-2031

98.Paananen K, Saarmen J, Anrula A, and Kovanen PT. Proteolysis and liision of low density lipoprotein parucles strengthen I heir binding (o human aortic proteoglycans //j BiolChem. 270 12257-12262, 1995

99 Peniiluiuien M. Lehtonen M, Kovanen P Hi Lipid Res -1996 -V 37 -p 26382649

100. Piha M. Lindsiedt L, and Kovanen PT • Biochemistry -1995 -V 34 P 10)20-1012

101 Rice-Ev.im C. and K R Bruckdprfer Free radicals. Iipopiotems and cardiovascular dysfnnclioti //Mol Aspects Med -1992 -V IJ(U -P 1-111

102 Romano M, Romano E, Bjorkerud D and Hurt-Camejo F Ultrastruclural localization of secretory type II pliosphohpase A2 in atherosclerotic aikd nonalherosderotic regions of human artenes A1 Arterioscler Thromb Vase Biol -1998 -V.I8 -P 519-525.

103 Ross R , Barker L Hyperlipidemia and atherosclerosis Science |97fi V 193 -P 1094-1100

104 Sartipy P. Johansen B. Camejo (J. Rosengren B, Bondjers G and Hurt-Camejo E Binding of human phosjilmlipase A2 type II to proteoglycans Differential effect ofglycosammoglycans on enzyme activity.//J Biol Chcm -1996 -V.27I

P26307-263IA f 05 A'chafkwijk CO. Vcrnieer MA. Slehouwer CD, ie Koppele J. Prmcen HM, van Hmsberph VW Effect of methylglyoxal on the physico-chemical and biological properties of low-density lipoprotein / Biochim Biophys Acta -1998 -V.I 394 -P 187-198

106 Schissel SL, Jiang XC. Twcedte-Hardnstn J. Jeong T-S, Hurt-Camejo E. Najtb J. Rapp J11. Williams KJ and Tabas I Secretory sphingomyelinase. a product oTthe acid sphingomyelinase gene, can hydrolyzc atherogenic lipoproteins at neutral pH Implications for atherosclerotic lesion development J Biol Chcm -1998 -V 273 -P 2738-2746,

107 Schissel SL. Tweedie-Hardman J. Rapp JH. Graham G. Williams KJ and Tabas I Rabbit aorta and human atherosclerotic lesions hydrolyze the sphingomyelin of retained low-density lipoprotein. Proposed role for arterial-wall sphingomyelinase in subendoihebal retention and aggregation J Clin Invest -1996 -V 98 -P 14551464

108 Slicn MM. Kraitss RM. Lmdgren FT and Forte TM Heterogeneity of scrum low density lipoproteins in normal human subjects it J Lipid Res. »1981 -V. 22 -P 236-244

109 Smith E. Crosbie I. and Carey S Prolhroinbin-rclaled antigens m human antic intima // Soma Thromb Hemost -1996 -V 22 -P.347-350

I (0. Smith EB The relationship between plasma and tissue lipids tn human atherosclerosis // Adv Lipid Res. -1974 -V 12 -P 1-49.

Ill Sommcr A. Prcnner E. Gorges R. Stflte H, Gnllhofcr H. Kostner GM. Paliauf F and Hermetter A Organization of ph os pb at idyle lioltne and sphingomyelin m tlw.-surface monolayer of low density lipoprotein and ltpoprotcm(a > as determined by time-resolved fluorometry ,7 J. Biol Chem -1992 -V 267 -P 2-1217-24222

N2 Steinbrecher U P . Lougheed M // Arteriosclcr Thromb -1992 -Vol 12 -P 608-625

113 Sukhova GK, Shi GP. Simon Dl Chapman HA and Libhy P Expression of the efastolytic catiicpsins S and K in human atheroma and regulation of their production m smooth muscle cells //J din, Invest -1998 -V 102 -P 576-583 IA Tertov W, Sobemn I A. Gabbaaov ZA, Popov EG, Jakkola O. Solakivi T. Nikkan T, Siturtvov VN, Orekhov AN Multiple-modified dcsialylalCd low-density lipoproteins lhai cause intracellular lipid accumulation Isolation, fractionation and characterization. Laboratory Investigations 1992 -V. 67 -P 665-675 15 Tanmanen M, Motlino G, Qiao jh, Breslow JL, and Frank JS. Ultrastructurc of early lipid accumulation in ApoE-deficienl mice //Arterioscler.Throrab Vase Biol -1999 -V 19 -P 347-853

116 Tertov VV, Bittolo-Bon G, Sobcnin IA, CazzoLato G, Orekhov AN and Aiogaro P Naturally occurring modified low density lipoproteins are similar if not identical more electronegative and desialytated bpoprotcin subtractions H Exp Mol Pathol-[995 -V 62(3) P 166-172

117 Tertov VV, Kaplun VV. Sobemn IA, Orekhov AN Low-density lipoprotein modification occurring in human plasma Possible mechanism of m vivo lipoprotein desialylation as a primary step of atherogenic modification ; Atherosclerosis ^1998 -V 138 -P 183-195

118 Tertov VV, Orekhov AN, Martsenyuk ON, Perova NV and Smirnov VN Low-density lipoproteins isolated from the blood of patients with coronary heart disease induce the accumulation of hpid3 in human aortic cells " Exp Mol Palhol -1989 -V 50(3). -P 337-347,

119 Tertov VV, Sobenin IA, Tonevitsky AG. Orekhov AN and Smimov VN, Isolation of atherogenic modified (desialytated) low density lipoprotein from blood of atherosclerotic patients separation from native lipoprotein by affimly chromatography U Biochem Biopliys Res Commun -1990 -V. 167(3) -P. 11221127

120 Thocnalley P J , Langborg A , Minlius U.S. Formation of glyoxal, methylglyoxal and 3-deoxyglucosone in tlie degradation of proteins by glucose // Biochem J -1999 -V.344 -P 109-116

CV'

121 Twstiu D. Dobnan A, Tasca C, Simionescu M, and S union esc u N, intimal thickenings of lwman aorta contain modified reassembled lipoproteins // Atherosclerosis -1995 -V. 112 -P 101-1M

122 Uchtyama M, Mishara M Determination of maloiialdehyde precursor in tissues by ihiobarbiturafic acid test ti Analytical Biochemistry' -1978 -V 86 -P 271-278

123 Xu. X X . and I Tablas Sphingomyelinase enhances low dcnsityhpoprotem uptake and ability la induce cholesterol ester accumulation in macrophage» J Biol Chcm -1991 -V 266 -P.24849 -24858

124 Yla-Henmala S . Jittkkota 0„ Ehnbolm C . Tikkaneri \\ J . Sdtakht T , Nikkarr T Hi. Lipid Res -198B. -V 29 -P 563-572

125 Zhang W-Y, Gaynor PM and Kmtli HS Aggregated low density lipoprotein induces and enters surtlice-corinected compartments of human monocyte-maciophages Uptake occurs independently of the low density lipoprotein receptor //J. Biol Chcm-1997 -V. 272. -P 31700 - 31706

выводы

1 Циркулирующие в крови частицы множественно модифицированных ЛНП нестабильны и склонны к ассоциации, что отличает их от нативных ЛНП

2. Обработка нативных ЛНП лротеолнтнчееккмн, лилолитическимн, десиалируюшими, индуцирующим окисление ферме игами, ал Метками эндогенного происхождения приводит к существенным изменениям белковой, липндной и полисахзрнднон компонентов липапротенднон частицы и стимулирует ассоциацию модифицированных ЛИП.

3 Пространственное расположение апоВ-КЮ белка, ответственного за стабилизацию частиц ЛНП, в цммЛНП и модифицированных m M tro ЛНП отличается от расположения алоВ белка в плтниньн ЛНП

4 Ни одна нз модификации протсолнтическая. лнполнтнческая, дссналирукицая, окислительная, модификация эндогенными альдегидами не пыэывост изменен ни пространственного расположении.moll белка сходных с изменениями, происходящими в цммЛНП, что свидетельствует о множественном характере модификаций, приводящих к формированию цммЛНП в крови

5 Амфнфильные блок-сополимеры окиси пропилена и окиси этилена, т и плюроннки способны подавлять ассоциацию ЛНП. но не вызывают диссоциацию ассоцнатов ЛНП

6 Способность плюроннков ингибировать ассоциацию ЛНП и минимальная ингнбируюшая концентрация зависят от гндрофильно-липофильного баланса и критической концентрации мнцеллообразовлпни, что свидетельствует о значительной роли гидрофобных взаимодействий а ассоциации ЛНП