Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Механизмы и роль атерогенной модификации липопротеидов в атерогенезе

На правах рукописи

УДК 577.112.384.4 + 616.894

Мельниченко Александра Александровна

Механизмы и роль атерогснной модификации липопротеидов в атерогенезе

14.03.03- патологическая физиология

5 ДЕК 2013

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА-2013

005541830

Работа выполнена в лаборатории клеточных механизмов атерогенеза отдела молекулярной и клеточной патофизиологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» РАМН

Научные консультанты: Собеиин Игорь Александрович Доктор медицинских наук

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт клинической кардиологии имени А.Л. Мясникова, Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития Российской Федерации

Ведущий научный сотрудник лаборатории медицинской генетики отдела сердечно-сосудстой патологии

Бобрышев Юрий Вениаминович Доктор биологических наук

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» РАМН

Ведущий научный сотрудник лаборатории клеточных механизмов атерогенеза отдела молекулярной и клеточной патофизиологии

Официальные оппоненты: Кухарчук Валерий Владимирович

Доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт клинической кардиологии имени А.Л. Мясникова, Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития Российской Федерации Руководитель отдела проблем атеросклероза Манухина Евгения Борисовна Доктор биологических наук, профессор

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» РАМН

Главный научный сотрудник группы регуляторных механизмов адаптации Архипенко Юрий Владимирович Доктор биологических наук, профессор

Государственное учебно-научное учреждение Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова заведующий лабораторией адаптационной медицины

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «26» декабря 2013 года в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д 001.003.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской академии медицинских Наук, по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан 26 ноября 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук Скуратовекая Лариса Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Сердечно-сосудистые заболевания стоят на первом месте в качестве причины смерти в России, США и Европе (Windecker S., 2013; Quarles L.D., 2013). Подавляющая часть сердечно-сосудистых заболеваний является следствием атеросклероза магистральных сосудов (Pranavchand R., 2013). Еще в 1947 году Н. Н. Аничковым было продемонстровано, что накопление холестерина в интиме артерий является одним из первых проявлений атеросклероза (Аничков H.H., 1947; Cianciola N.L., 2011). Транспорт холестерина в организме осуществляется липопротеидами. Источником липидов в интиме сосудов являются липопротсиды низкой плотности (ЛНП) (Vukovic I., 2006; Alaupovic, 1971 P.; Cookson F.B., 1971). Нативные ЛНП (нЛНП), выделенные из крови здоровых людей, не вызвают накопления липидов в культуре клеток (Badimön L., 2009). С другой стороны, многими исследователями (Soran Н., 2011; Orsö Е., 2011) было показано, что почти любая модификация (окисление, дегликозилироваиие, вортексирование, протеолиз, липолиз и др.) нЛНП приводит к их усиленному захвату как субэндотелиальными, так и другими видами клеток.

Возникает вопрос, почему столь различные изменения в ЛНП приводят к одному и тому же эффекту - внутриклеточному накопленишо липидов. При изучении внутриклеточного накопления холестерина, вызванного ЛНП, модифицированными нейраминидазой, липолитическими, протеолитическими ферментами в нашей лаборатории (Orekhov A.N., 1989; Sobenin I.A., 1996; Tcrtov V.V., 1998) было показано, что все эти модификации приводят к самоассоциации ЛНП. Также было продемонстрировано, что именно ассоциаты модифицированных ЛНП обладают атерогенными свойствами, то есть вызывают накопление холестерина в клетках. Другими исследователями также были получены аналогичные данные о том, что интенсивное встряхивание или вортексирование (Walters M.J., 2010), окисление медью и железом (Satchell L., 2012; Saputri F.C., 2012), обработка гипохлоритом (Guha М., 2010), миелопероксидазой (Панасенко О.М., 2004), фосфолипазой А2 (Yamamoto К., 2011), сфингомиелиназой (Sneck М., 2012), протеазами (Piha М, 1995),

гликозидазами (Панасенко О.М., 2006) приводит к самоассоциации ЛНП и их последующему внутриклеточному накоплению.

В крови больных сердечно-сосудистыми заболеваниями не были обнаружены ЛНП, совпадающие по строению с модифицированными in vitro. Нашей группой были выделены из крови и изучены циркулирующие множествено-модифицированные ЛНП (цммЛНП) (Orekhov A.N. et al., 1989; Tertov V.V. et al., 1990), которые характеризовались пониженным содержанием сиаловой кислоты, маннозы и других Сахаров. Эти же частицы были обнаружены другими исследователями - так называемые мелкие, плотные ЛНП (La Belle M. et al., 1990; Avogaro P. et al., 1991) и электроотрицательные (Avogaro P. et al., 1988) ЛНП. Циркулирующие в крови модифицированные ЛНП, как и модифицированные in vitro ЛНП обладали двумя общими свойствами: вызывали внутриклеточное накопление липидов и обладали склонностью к самоассоциации. При этом было показано, что существует прямая зависимость между размером ассоциатов и их атерогенными свойствами (Orekhov A.N. et al., 1991 a; Tertov V.V. et al., 1990; Tertov V.V. et al., 1992).

Однако оставались не вполне понятными механизмы атерогенной модификации ЛНП и её роль в атерогенезе. Оставались без ответа и другие вопросы. Каков механизм ассоциации ЛНП? Можно ли повлиять на этот процесс?

Известно, что ЛНП способны не только к самоассоциации, но и к ассоциации с компонентами внеклеточного матрикса (Soto Y, 2012) и образованию циркулирующих иммунных комплексов (Lopes-Virella M.F., 2013; Tertov V.V., 1996). Но как сам процесс ассоциации, так и атерогенные свойства ассоциатов изучены недостаточно. Циркулирующие иммунные комплексы могут служить маркерами предрасположенности к инфаркту миокарда (LopesVirella M.F., и др., 2012), но неизвестно, насколько велика прогностическая и диагностическая роль этого параметра. Не разработаны тест-системы для оценки атерогенного потенциала крови больного на основе измерения

показателей атерогенной модификации ЛНП, которые могли бы применяться в клинической практике.

Цель настоящей работы

Целью настоящей работы явилось углублённое изучение механизмов атерогенной модификации липопротеидов низкой плотности (ЛНП), циркулирующих в крови пациентов; исследование роли этой модификации в атерогенезе; разработка на основе накопленных знаний инновационных подходов к диагностике и терапии атеросклероза, в том числе:

- способов диагностики бессимптомного атеросклероза на основе принципиально новых атерогенных показателей,

- средств, имеющих антиатеросклеротический терапевтический потенциал, проявляющийся в предотвращению самоассоциации ЛНП, которая ведёт к инициации атеросклероза на уровне клеток сосудистой стенки.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

Основные задачи исследования:

1. с помощью морфологических методов изучить локализацию липидов в начальных атеросклеротических поражениях;

2. исследовать механизмы устойчивости к ассоциации циркулирующих в крови человека множественно модифицированных ЛНП;

3. разработать клеточную модель липоидоза для изучения клеточных проявлений атеросклероза и оценки атерогенности компонентов крови;

4. изучить роль самоассоциации ЛНП в усилении атерогенного потенциала липопротеидов;

5. найти эффективные ингибиторы ассоциации ЛНП и накопления ассоциатов в артериальных клетках;

6. оценить диагностическую и прогностическую значимость таких показателей атерогенности липопротеидов, как уровень цммЛНП в крови и уровень холестерина в циркулирующих иммунных комплексах, создать на их основе диагноститческую тест-систему.

Научная новизна

Разработана новая клеточная модель на основе макрофагов моноцитарного происхождения, выделенных из крови человека. Данная модель; проще, доступнее и экономичнее используемой ранее клеточной модели на основе субэндотелиальных клеток аорты человека. Результаты экспериментов, проведённых на разработанной модели, аналогичны результатам, полученным на культивируемых субэндотелиальных клетках. Показано, что для изучения атерогенеза на клеточном уровне и оценки атерогенного потенциала ЛНП данная модель является информативной и адекватной.

Продемонстрировано, что липопротевды низкой плотности образуют крупные нерастворимые комплексы (ассоциаты). Изучено три варианта ассоциации - самоассоциация ЛНП, ассоциация с компонентами внеклеточого матрикса и образование циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), содержащих цммЛНП. Во всех трех случаях образуются ассоциаты, которые стимулируют захват липопротеидов клетками и подавляют деградацию липидов цммЛНП, и, тем самым, вызывают накопление внутриклеточных липидов, то есть усиливают атерогенный потенциал цммЛНП.

Исследованы возможности модуляции самоассоциации ЛНП. Выявлены амфифильные полимеры (полаксамеры), которые в зависимости от их гидрофобных свойств влияют на самопроизвольную ассоциацию ЛНП. Показано, что полаксамеры с большей гидрофобностью останавливают процесс ассоциации ЛНП, но не вызывают диссоциацию образовавшихся комплексов. Эти вещества можно рассматривать как перспективные агенты с точки зрения прямой антиатеросклеротической терапии.

В новых экспериментальных условиях подтверждены ранее полученные данные о том, что иммунные комплексы, состоящие из модифицированных ЛНП и аутоантител против модифицированных ЛНП, обладают высоким атерогенным потенциалом на уровне артериальных клеток. Разработаны оптимизированные методики для определения в крови уровня цммЛНП и холестерина ЦИК (Х-ЦИК), которые являются маркерами развития атеросклероза. Выявлена диагностическая значимость в отношении раннего атеросклероза двух параметров: уровня цммЛНП и Х-ЦИК. Проведено

6

сравнение данных параметров. Впервые установлена прогностическая значимость ЛНП-содержащих ЦИК, определяемых по уровню Х-ЦИК, в отношении прогрессирования раннего атеросклероза. По диагностической и прогностической значимости цммЛНП и Х-ЦИК значительно превосходят широко применяемые для диагностики атеросклеротических болезней показатели липидного обмена.

Теоретическая и практическая значимость

Впервые установлена прогностическая значимость ЛНП-содержащих ЦИК, определяемых по уровню Х-ЦИК, в отношении прогрессирования раннего атеросклероза. По диагностической и прогностической значимости цммЛНП и Х-ЦИК значительно превосходят широко применяемые для диагностики атеросклеротических болезней показатели липидного обмена.

Выявлены амфифильные полимеры (полаксамеры), которые в зависимости от их гидрофобных свойств влияют на самопроизвольную ассоциацию ЛНП. Показано, что полаксамеры с большей гидрофобностыо останавливают процесс ассоциации ЛНП, но не вызывают диссоциацию образовавшихся комплексов. Эти вещества можно рассматривать как перспективные агенты с точки зрения прямой антиатеросклеротической терапии.

В результате проведенной работы было продемонстрировано, что уровень Х-ЦИК коррелирует со степенью выраженности и распространенностью атеросклеротических поражений и обладает высокой диагностической и прогностической значимостью. Разработан макет аналитической тест-системы (мАТС) для одновременного определения контролируемых специфических биомаркеров, в частности, Х-ЦИК, общего холестерина, холестерина ЛНП и ЛВП, а также триглицеридов. Созданный мАТС предназначен для применения в практической медицине в целях экспрессной диагностики сердечно-сосудистых патологий.

Основные положения, выносимые на защиту

1. На начальных стадиях атсрогенеза существенная часть липидов накапливается в клетках сосудистой стенки, а не только вне клеток, и инициация атерогенеза сопровождается накоплением внутриклеточных липидов (клеточным липоидозом).

2. Для воспроизведения клеточного липоидоза - ключевого процесса атерогенеза на клеточном уровне - разработана модель на основе первичной культуры моноцитов-макрофагов, выделенных из крови человека. Разработанная клеточная модель адекватна задачам изучения механизмов липоидоза и может быть использована для оценки атерогенного потенциала плазмы (сыворотки) крови, липидных и нелипидных компонентов крови.

3. На разработанной клеточной модели липоидоза показано, что ассоциация ЛНП усиливает атерогенный потенциал липопротеидо в, стимулируя захват ЛНП макрофагами.

4. Самоассоциация ЛНП подавляется амфифильными блок-сополимерами окиси пропилена и окиси этилена, так называемыми полаксамерами. Способность полаксамеров ингибировать ассоциацию зависит от гидрофильно-липофильного баланса и критической концентрации мицеллообразования, что свидетельствует об определяющей роли гидрофобных взаимодействий в ассоциации ЛНП.

5. Результаты клинического исследования бессимптомного атеросклероза позволили установить, что уровень холестерина циркулирующих иммунных комплексов и уровень цммЛНП в сыворотке, являющиеся маркерами атеросклероза, обладают высокой диагностической значимостью.

6. Результаты клинического исследования показали, что уровень холестерина циркулирующих иммунных комплексов имеет высокую прогностическую значимость для оценки развития бессимптомного атеросклероза

Реализация результатов работы

Материалы диссертации были представлены в виде докладов и тезисов докладов на следующих научных мероприятиях: 78th European Atherosclerosis

8

Society Congress (EAS), Hamburg, Germany, June 20-23, 2010; 79th European Atherosclerosis Society Congress (EAS), Gothenburg, Sweden, 26-29 June, 2011; 80th European Atherosclerosis Society Congress (EAS), Milan, Italy, May 25 -28 , 2012; Arteriosclerosis, Thromdosis and Vascular Biology. 2011 Scientific Sessions. April 28-30, 2011, Chicago, Illinois; Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology Scientific Sessions 2013. May 1-3,2013, Lake Buena Vista, Florida.

На основе полученных в работе данных зарегистрирован 1 патент: Орехов АН, Собенин ИА, Кириченко ТВ, Мясоедова ВА, Мельниченко АА, Орехова ВА. Способ профилактики и лечения атеросклероза. Патент на изобретение № 2455016 от 07 октября 2012 г.

На основе полученных в работе данных зарегистрированы 9 патентных заявок, представленных в списке опубликованных работ по теме диссертации.

На основе результатов проведённых исследований разработан лабораторный регламент макета аналитической тест-системы для применения в медицине при экспрессной диагностике атерогенных дислипидемий при сердечно сосудистых патологиях.

Работа апробирована 25 сентября 2013 года в ФГБУ "НИИ ОПП" РАМЫ на межлабораторной конференции с участием лаборатории клеточных механизмов атерогенеза, лаборатории молекулярной физиологии, лаборатории регуляции репаративных процессов, лаборатории общей патологии микроциркуляции.

Личный вклад автора.

Автор принимала непосредственное участие в получении исходных данных и их обработке, представляла полученные результаты на международных конференциях, принимала активное участие в подготовке публикаций по выполненной работе. К защите представлены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей.

Публикации по теме диссертации.

По результатам исследований опубликовано 29 научных работ, в том числе 9 тезисов докладов на международных и всероссийских конференциях, 6 статей в научно-практических рецензируемых сборниках и 11 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, одна глава в книге и две монографии.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 252 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение и выводы. Библиографический список использованной литературы содержит 213 источников, в том числе 13 отечественных и 200 иностранных. Текст иллюстрирован 50 рисунками и 12 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Аугопсийный материал

Грудную аорту Человека извлекали через 1.5—3 ч после внезапной смерти у 7 мужчин в возрасте 30—60 лет. Сосуды вскрывали продольно и промывали изотоническим фосфатным буферным раствором (ИФБ). Внешне непораженные участки и участки с атеросклеротическими изменениями обнаруживали макроскопически согласно классификации Совета по атеросклерозу Американской ассоциации сердца (Velican С, 1978). Макроскопически непораженные участки имели гладкую поверхность просвета. Микроскопически они классифицировались как интимальное утолщение с двумя структурированными субслоями: протеогликановым слоем и мышечно-эластическим слоем. После макроскопической идентификации участки образцов размером 5 х 10 мм2 вырезали перпендикулярно длинной оси сосуда. Нефиксированные образцы погружали в OCT compound (Miles Inc., Elkhart, IN, США), замораживали в жидком азоте и готовили криостатные срезы толщиной 5 мкм.

Гистохимическое выявление лнпидов

Для гистохимического выявления липидов масляным красным О срезы фиксировали 4%-ным формальдегидом в течение 4 мин, а затем окрашивали (Pearse, 1969).

Исследование посредством трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ)

Из различных зон каждой исследуемого тканевого образца сосудов вырезали, как правило, по 4-5 1 мм3 кусочков, которые фиксировали в 1- 2,5%. глутаровом альдегиде, на фосфатном буфере (РН 7,2). Затем тканевые образцы постфиксировали в 1% 0s04, как правило, на том же буфере, проводили через спирты возрастающей концентрации, окись пропилена (или ацетон) и заливали в аралдит, Ультратонкие срезы получали на ультрамикротомах LKB-111. Ультратонкие срезы обрабатывали цитратом свинца и уранилацетатом, а затем изучали под электронным микроскопом Hitachi Н7000.

Электронно-микроскопический гистохимический анализ.

Визуализацию нейтральных липидов выполняли, используя 0s04, (Guyton JR, 1988). Идентификацию неэтерифицированного холестерина проводили с использованием филипина по описанному протоколу (Kruth, 1984). В ряде опытов окрашивание филипином комбинировали с обработкой образцов 0s04 для визуализации нейтральных липидов. Далее образцы заключали в аралдит согласно рутинному протоколу. Ультратонкие срезы изучали с помощью электронного микроскопа Hitachi Н7000.

Хроматографическое определение липидов на криостатном срезе

Для хроматографического определения липидов на криостатном срезе интимальный слой отделяли от медии под бинокулярным контролем с помощью микродиссекционного пинцета. Фосфолипиды, триглицериды, холестерин и эфиры холестерина разделяли тонкослойной хроматографией на силикагеле с последующим количественным измерением (Mukhin et al., 1991).

Первичная культура субэндотелиальных клеток аорты человека

Выделение и культивирование клеток производили из грудного отдела аорт мужчин и женщин в возрасте 40-65 лет в течение 1.5-3 часов после внезапной смерти. Причиной смерти в подавляющем большинстве случаев была острая сердечно-сосудистая недостаточность. Субэндотелиальные клетки выделяли из различных участков интимы аорты, различавшихся по степени атеросклеротического поражения, путем обработки коллагеназой и культивировали в соответствии с методом Орехова и соавторов (Orekhov A. N., 1987). Обработку аутопсийпого материала проводили в стерильных условиях. После механического удаления адвентиции аорту рассекали вдоль и промывали в среде 199, содержащей по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина и 2,5 мкг/мл фунгизона. Из лоскута аорты вырезали участки, не пораженные атеросклерозом, а также участки, соответствующие жировой полосе или липофиброзной бляшке, в соответствии с классификацией Stary (693,694,696). Затем с помощью пинцетов интиму отделяли от медии, при этом разделение слоев происходило по внутренней пограничной эластической мембране (548). Полученный материал пинцетами разделяли на волокна. К измельченной интиме добавляли 0,15% раствор коллагеназы II типа (Worthington Diagnostic System, США) в среде 199, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Flow, Великобритания), 2 мМ L-глутамин, 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 2,5 мкг/мл фунгизона (все реактивы Grand Island Biological Company - GIBCO, США) из расчета 10 мл раствора фермента на 1 г сырой ткани. Инкубацию интимы с коллагеназой проводили на водяной бане при 37°С с постоянным перемешиванием со скоростью 50 об/мин (Aquaterm, New Brunswick Scientific Company, США) до практически полного растворения ткани, что обычно занимало 2-3 часа. Эффективность растворения ткани оценивали визуально. Полученную суспензию клеток фильтровали через стерильную нейлоновую сетку и центрифугировали при 4°С в течение 20 мин при 1800 g на низкоскоростной центрифуге (Beckman TJ-6, Beckman Division, США). Осажденные клетки промывали в 10 мл ростовой среды 199, содержащей антибиотики и 10% эмбриональную телячью сыворотку, и повторно центрифугировали при тех же условиях. Осадок ресуспендировали в

12

10 мл ростовой среды и производили подсчет полученного количества клеток в счетной камере. Клетки рассаживали в пластиковый стерильный 96-гнездный микротест для тканевых культур (Nunclon, Дания) из расчета 2-4x104 клеток на 1 см2 культуральной поверхности. Клетки культивировали при 37°С в насыщенной водяными парами атмосфере, содержащей 95% воздуха и 5% углекислого газа в увлажняемом С02-инкубаторе (Forma Scientific, США). Смену среды проводили через день. Для экспериментов использовали 7-10-дневную первичную культуру клеток. Такая культура представляет собой смешанную клеточную популяцию, состоящую преимущественно из типичных и модифицированных гладкомышечных клеток (13,14,548). Клетки, полученные из непораженных и атеросклеротических участков интимы аорты человека, культивировали раздельно и использовали в экспериментах различных типов, что позволяло в дальнейшем использовать две клеточных модели, различающихся по своим свойствам. Первичную культуру клеток, выделенных из непораженных атеросклерозом участков интимы аорты, использовали для воспроизведения процессов атерогенеза на клеточном уровне и оценки антиатерогенных свойств исследуемых веществ. Антиатерогенным действием называли эффекты, препятствующие основным проявлениям атерогенеза на клеточном уровне, и, прежде всего, накоплению внутриклеточного холестерина. Первичную культуру клеток, выделенных из пораженных атеросклерозом участков интимы аорты, использовали для оценки антиатеросклеротических свойств исследуемых веществ.

Антиатеросклеротическим действием называли эффекты, проявляющиеся в уменьшении содержания внутриклеточного холестерина по сравнению с исходным уровнем.

Культура моноцитов-макрофагов крови человека

Моноциты крови человека выделяли из крови здоровых добровольцев и культивировали до их созревания в макрофаги. Из локтевой вены здорового донора утром натощак брали 50 мл крови в стерильную пластиковую пробирку объемом 50 мл, содержащую 5 мл стерильного 3,8% цитрата натрия в 0,15 М изотоническом фосфатном буфере (ИФБ) (рН=7,35). Кровь центрифугировали в

течение 20 мин при 1800 g на центрифуге Beckman TJ-6. Плазму крови удачяли, а клеточный осадок, содержащий форменные элементы крови, доводили до первоначального объема стерильным ФИБ. В стерильную пластиковую пробирку вносили фиколл (Flow Labolatories, США) из расчета 0,5 мл на 1 мл полученной суспензии форменных элементов крови. На фиколл наслаивали суспензию форменных элементов крови и центрифугировали в течение 30 мин. при 1800 g. В стерильных условиях пипеткой с границы раздела плотности отбирали фракцию лейкоцитов. Полученные клетки ресуспендировали в 1 мл стерильного ИФБ, доводили стерильным ИФБ до 50 мл и центрифугировали в течение 15 мин при 1800 g. Последнюю процедуру отмывки клеток проводили трижды. Затем осадок лейкоцитов ресуспендировали в 1 мл среды 199 (GIBCO Europe, UK), содержащей 2 мМ L-глютамина, 100 Ед/мл пенициллина, 2,5 мкг/мл фунгизона и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Serva, USA). Количество полученных клеток подсчитывали под микроскопом Amplivai (Carl Zeiss, Германия) в гемоцитометре. Клетки рассаживали в стерильные 48-луночные планшеты для клеточных культур (Nunc, Denmark) с плотностью 105 клеток на 1 см2 культуральной поверхности. Клетки инкубировали в СО2-инкубаторе (5% С02 и 95% атмосферного воздуха) при 100% влажности и 37°С в течение 1 часа, после чего неприкрепившиеся клетки (грагулоциты) удаляли путем трехкратного промывания средой 199. К прикрепившимся клеткам (агранулоцитам) добавляли по 250 мкл среды 199, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, антибиотики (преднизолон, стрептомицин и фунгизон), а также глютамин. Полученную чистую культуру моноцитов культивировали в С02-инкубаторе (5% С02 и 95% атмосферного воздуха) при 100% влажности и 37°С в течение 14 суток до превращения их в макрофаги (784). Смену инкубационной среды проводили каждые 48 часов. В экспериментах использовали культуру на 14-й день культивирования. Полученную таким образом культуру моноцитов-макрофагов крови человека использовали в клинических исследованиях при серийных измерениях атерогенных свойств сыворотки крови (ее способности вызывать накопление внутриклеточного холестерина).

Получение сыворотки крови

Кровь из локтевой вены в количестве 5-7 мл забирали стерильным одноразовым пластиковым шприцом в сухую пластиковую пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 15 мл. Пробирку с кровыо выдерживали при комнатной температуре в течение 1 часа для образования сгустка, затем в холодильнике при +4°С в течение 1 часа для ретракции сгустка. Сгусток отделяли стеклянной палочной от стенок пробирки. Пробирку центрифугировали в настольной центрифуге Beckman TJ-6 при 1800 g в течение 15 мин. Полученную сыворотку крови (без примеси эритроцитов) разливали в пластиковые пробирки типа «Эппендорф» по 1 мл. Образцы сыворотки крови хранили в замороженном состоянии (при -18°С) до проведения измерения атерогенности и других биохимических параметров.

Оценка антиатерогеиного эффекта в модели in vitro

Накопление внутриклеточного холестерина в первичной культуре субэндотелиальных клеток из непораженной интимы аорты человека индуцировали с помощью атерогенной сыворотки крови, как описано выше. Одновременно с атерогенной сывороткой крови человека в инкубационную среду добавляли исследуемое вещество в различных концентрациях. Обычно использовали логарифмический диапазон концентраций исследуемого вещества. Инкубацию, экстракцию липидов из клеток, определение клеточного белка и расчет атерогенного эффекта проводили, как описано выше. Базовый атерогенный эффект сыворотки крови рассчитывали как разницу между содержанием внутриклеточного холестерина в контроле и в клетках, инкубированных в присутствии атерогенной сыворотки без добавления исследуемого вещества, и принимали за 100%. Антиатерогенный эффект исследуемых веществ определяли как их способность статистически достоверно препятствовать накоплению внутриклеточного холестерина, индуцированному атерогенной сывороткой крови.

Определение пролиферативной активности

Клетки, выделенные из нормальных или пораженных атеросклерозом участков интимы аорты человека, инкубировали в течение 24 ч в присутствии

15

10 мкКи/мл [3Н] -тимидика. По окончании инкубации липиды из клеток экстрагировали, как описано выше, а фиксированные на пластике клетки растворяли в в 50 мкл 0,2 н. NaOH при комнатной температуре в течение 12-16 часов. После растворения радиоактивность измеряли на сцинтилляционном счетчике 1215 Rackbetall (LKB, Швеция).

Определение синтеза клеточного белка

Клетки, выделенные из нормальных или пораженных атеросклерозом участков интимы аорты человека, инкубировали в течение 24 ч в присутствии 10 мкКи/мл [|4С]-лейцина. По окончании инкубации липиды из клеток экстрагировали, как описано выше, а фиксированные на пластике клетки растворяли в в 50 мкл 0,2 н. NaOH при комнатной температуре в течение 12-16 часов. После растворения радиоактивность измеряли на сцинтилляционном счетчике 1215 Rackbetall (LKB, Швеция).

Определение синтеза коллагена

Клетки, выделенные из нормальных или пораженных атеросклерозом участков интимы аорты человека, инкубировали в течение 24 ч в присутствии 5 мкКи/мл [ЗН]-пролина. По окончании инкубации включение меченого пролина в обработанную коллагеназой фракцию культуральной среды определяли по методу Peterkofsky и Diegelmann (571). Из культуры отбирали 500 мкл среды и переносили в стеклянные пробирки. Клетки промывали 2 раза по 250 мкл ФИБ и смывы переносили в те же пробирки. Пробы нагревали в течение 15 мин при 80°С для инактивации протеиназ. После охлаждения до +4°С в пробы добавляли 1 мл 20% ледяной трихлоруксусной кислоты (ТХУ), содержащей 2 мМ пролина. Спустя 10 мин пробы центрифугировали (10 мин, 3500 g). Супернатант отбрасывали, а осадок промывали трижды 1 мл 5% ТХУ, содержащей 1 мМ пролина. Промытый осадок растворяли в 0,4 мл 0,1 N NaOH, разделяли на аликвоты по 200 мкл и нейтрализовали равным объемом 0,08 N HCl. К одной из аликвот добавляли 80 мкл 60 шМ HEPES, содержащего 0,2 мМ фенилметилсульфонилфторида, 0,25 мМ СаС12, 1,25 мМ N-этиленамида, и 20 мкл раствора коллагеназы (1 мг/мл) (Worthington Diagnostic System, США). К другой аликвоте, служившей бланком, добавляли те же вещества за

16

исключением коллагеназы. Пробы инкубировали 4 часа при 37°С. Инкубацию остановливали добавлением 0,5 мл 10% ТХУ, содержащей 0,5% таниновой кислоты. После центрифугирования в течение 10 мин при 1800 g определяли радиоактивность супернатанта на сцинтилляционном счетчике 1215 Rackbeta И (LKB, Швеция). Синтез коллагена определяли по формуле 2*([с1рт]образца -[<1рт]бланка)/(клеточный белок, мкг).

Изучение внутриклеточного метаболизма эфиров холестерина

Клетки, выделенные из нормальных или пораженных атеросклерозом участков интимы аорты человека, инкубировали в течение 24 ч в присутствии ЛНП, меченых [3Н]-холестериллинолеатом. После инкубации липиды из клеток экстрагировали по методу Нага и Radin, как описано выше (256), а из культуралыюй среды - по методу Bligh и Dyer смесью хлороформ - метанол в объемном соотношении 1:2 (80). Нейтральные липиды хроматографировали на силикагеле в системе п-гексан - диэтиловый эфир - уксусная кислота в объемном соотношении 75:23:2. Сканирование хроматограммы проводили при длине волны 200 нм на сканнере Shimadzu CS-930 (Shimadzu Corporation, Япония). Участки силикагеля, соответствующие свободному холестерину и эфирам холестерина соскребали и измеряли радиоактивность на сцинтилляционном счетчике 1215 Rackbeta II (LKB, Швеция).

Изучение внутриклеточного синтеза липидов

Клетки, выделенные из нормальных или пораженных атеросклерозом участков интимы аорты человека, инкубировали в течение 24 ч в присутствии 10 мкКи/мл меченого [14С]-олеата (225). После инкубации липиды из клеток экстрагировали по методу Нага и Radin, как описано выше (256). Хроматографию и денситометрию липидов проводили, как описано выше. Участки силикагеля, соответствующие фосфолипидам, триглицеридам и эфирам холестерина соскребали и измеряли радиоактивность на сцинтилляционном счетчике 1215 Rackbeta II (LKB, Швеция).

Выделение и фракционирование лнпопротеидов низкой плотности. Доноры.

В работе была использована плазма и сыворотка крови мужчин и женщин в возрасте от 30 до 60 лет, больных ишемической болезнью сердца (ИБС), и здоровых лиц (25-55 лет), у которых отсутствовали признаки ИБС в анамнезе и при медицинском обследовании. Содержание холестерина и триглицеридов в плазме крови не превышало 200 мг/дл и 150 мг/дл, соответственно.

Получение плазмы и сыворотки крови

Для получения плазмы кровь забирали утром натощак в пробирку с цитратом натрия (конечная концентрация - 0,38%). Препараты центрифугировали 10 мин при 800xg (2500 об/мин) на цетрифуге TJ-6 (Beckman Instruments, Inc., США). Для предотвращения окисления ЛНП в ходе выделения к полученной плазме добавляли 10 мМ ионола.

Для получения сыворотки кровь забирали из локтевой вены в пластиковую пробирку и инкубировали 1 час при 37°С. Образовавшийся сгусток отделяли от стенок пробирки, после чего сыворотку центрифугировали в течении 15 мин при 800xg (2500 об/мин).

Выделение суммарной фракции липопротеидов низкой плотности из плазмы крови

К плазме добавляли бромид натрия (NaBr) из расчета 0,5 г соли на 1 мл, разливали по 5 мл в 16х76-мм поликарбоновые центрифужные пробирки (Beckman Instruments, Palo Alto, CA) и наслаивали сверху по 5 мл раствора NaBr с плотностью 1,019 г/мл. Пробы центрифугировали в течение 2 часов при 41000 обУмин на центрифуге L8-55 (ротор 65Ti; Beckman Instuments, Inc., США). После ультрацентрифугирования отбирали зону, содержащую ЛНП. В образцы ЛНП снова добавляли NaBr из расчета 0,3 г соли на 1 мл пробы, повторно центрифугировали в тех же условиях и отбирали зону ЛНП. Полученные липопротеиды диализовали при 4°С в течение ночи против 4000

объемов ИФБ pH 7,4 и после этого стерилизовали фильтрацией (диаметр пор 0,45 мкм).

Определение концентрации белка в препаратах ЛНП

Концентрацию белка в препаратах липопротеидов определяли по методу Lowry et al. (1956) с модификациями. К пробе объемом 5-20 мкл добавляли 200 мкл свежеприготовленного 0,2 N раствора NaOH, содержащего 0,01% тартрата калия-натрия, 0,005% сульфата меди и 0,02% карбоната натрия, 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия (Boehringer Mannheim, Германия), затем 20 мкл 1 N реактива Фолина (Sigma Chemical Company, США), перемешивали и выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут, после чего измеряли оптическую плотность проб на спектрофотометре "Multiscan МСС" при длине волны 690 нм и рассчитывали концентрацию белка в препарате. В качестве стандарта использовали раствор БСА.

Получение фракций нативных и циркулирующих множественно модифицированных липопротеидов низкой плотности

ЛНП разделяли на нативные и циркулирующие модифицированные методом лектин-хроматографии на Ricinus communis агглютинин (РКА120) агарозе, как описано ранее (Tertov et al., 1990). Для разделения липопротеидов колонки, содержащие 1 мл РКА120-сефарозы (Sigma-Aldrich, США), уравновешивали 10 мл ИФБ, pH 7,2. Наносили 0,5-1 мл препарата липопротеидов, содержащего от 0,2 до 2 мг белка. Колонку промывали тремя миллилитрами ИФБ. При этом на выходе получали фракцию липопротеидов с нормальным содержанием сиаловой кислоты — нативные липопротеиды низкой плотности. Для удаления неспецифически связавшихся с сорбентом липопротеидов колонку промывали десятью миллилитрами ИФБ. Фракцию липопротеидов с низким содержанием сиаловой кислоты - циркулирующие множественно модифицированные липопротеиды - элюировали тремя миллилитрами 50 мМ галактозы.

К полученным липопротеидам добавляли бромид натрия из расчета 0,3 г на 1 мл образца и концентрировали методом ультрацентрифугирования, затем

19

диализовали против 4000 объемов ИФБ, как описано выше. Анализ ЛНП

Экстракция липидов из ЛНП. Суммарные липиды ЛНП экстрагировали по методу Bligh and Dyer, 1967. Для этого к 25 мкл ЛНП, содержащим 20-35 мкг белка добавляли 450 мкл смеси хлороформ-метанол 1:2 (объем-объем), встряхивали и инкубировали при комнатной температуре 2 часа в закрытых пробирках. Далее смесь центрифугировали (4500 об/мин, 15 мин) и супернатант переносили в другую пробирку. Осадок ресуспендировали в 120 мкл дистиллированной воды и повторяли экстракцию хлороформ-метанолом, описанную выше. Супернатанты объединяли и добавляли бООмкл смеси хлороформа и воды в объемном соотношении 1:1, интенсивно встряхивали и центрифугировали 10 минут при 4500 об/мин. Затем тонкой пастеровской пипеткой отбирали хлороформную фазу, упаривали ее до сухого остатка, который растворяли в 50 мкл смеси хлороформ-метанола 2:1 (объем-объем).

Анализ липидов ЛНП при помощи тонкослойной хроматографии.

Изменения липидного состава ферментативно модифицированных липротеидов оценивались при помощи тонкослойной хроматографии. На пластины для тонкослойной хроматографии (Merck, Германия) наносили полученный экстракт липидов ЛНП, а также стандарты липидов. Нейтральные липиды отделяли при помощи хроматографии в системе гексан-ацетон 1:3 (объем-объем). Состав фосфолипидов анализировали при помощи тонкослойной хроматографии в системе хлороформ-метанол-уксусная кислота-вода 25:15:4:2 (объем-объем-объем-объем). Для визуализации пиков фосфолипидов пластину погружали в раствор CuS04(3%)/H3P04(8%) и затем осуществляли нагревание пластины до 150°С. Далее пластины сканировались при помощи денситометра Shimadzu CS-930 (Shimadzu, Япония) при длине волны 200 нм.

Электрофорез в полиакриламидном геле. Анализ фрагментации апоВ белка ферментативно модифицированных ЛНП проводили при помощи фореза в полиакриламидном геле (ПААГ), используя буферную систему Laemmly (Laemmly et al., 1970). Гели с концентрацией полиакриламида 3 и 7% готовили

20

на основе исходного 30% акриламида и 0,8% Ы,Ы-бис-акриламида. Концентрирующий гель - 4% полиакриламид в 0,125 М Трис-HCl, рН 6,8, 0,1% додецилсульфат натрия. Разделяющий гель - 7% полиакриламид в 0,375 М Трис-HCl, рН 8,8,0,1 % додецилсульфат натрия.

Электрофоретический буфер - 0,05 М Трис, 0,384 М глицин, рН 8,3, Исследуемые образцы (5-10 мкг белка) растворяли в 0,01М Трис-HCl, рН 8,0, 0,001 М ЭДТА, 1% додецилсульфат натрия и нагревали 5 минут при 100°С. При проведении электрофореза поддерживалось напряжение 60 вольт, после вхождения белков в разделяющий гель напряжение поднимали до 120 вольт. Использовали прибор для вертикального электрофореза с пластинами размером 10x10 см, толщина геля 1 мм. Окрашивание геля производили 0,1 25% раствором Coomasie Blue R-250 (Sigma, США).

Электрофорез в агарозном геле. Суммарный поверхностный заряд частиц ЛНП определяли с помощью электрофореза в агарозном геле (Schalkwijk С. et al., 1998). Агарозный гель - 1% агароза в 40 мМ вероналовом буфере, рН 8,5 (40 мМ 5,5-диэтибарбитуровая кислота, 4 мМ ЭДТА). Буфер для электрофореза -10 мМ Трис-глицин, рН 8,0. Исследуемые образцы белка (5 мкг) растворяли в 10 мМ Трис-глициновом буфере, рН 8,0, содержащем 10% глицерин. Электрофорез проводили в течение 45 минут при напряжении 90 В. Для анализа ЛНП использовали 1 % агарозный гель. Гель фиксировали 100 % метанолом (30 сек), окрашивали при помощи красителя Fat Red 7В. От избытка красителя избавлялись 70 % метанолом. Электрофоретическую подвижность модифицированных ЛНП сравнивали с нативными ЛНП.

Определение тиобарбитуровая кислота (ТБК)-реактнвных продуктов. К

образцу ЛНП концентрацией 0,4 мг/мл по белку объемом 0,5 мл добавляли 25 мкл 20 мМ ионола (для предотвращения окисления во время теста), перемешивали, добавляли 1,5 мл 1,5% Н3Р04 и 0,5 мл 0,5% ТБК, перемешивали, неплотно прикрывали пробирки пробками, выдерживали при 100°С в течение 45 минут, охлаждали до комнатной температуры, добавляли по 2 мл //-бутанола, тщательно перемешивали и центрифугировали 20 минут при 3000

об./мин для достижения расслоения фаз. Далее отбирали верхнюю бутанольную фазу и определяли спектр ее поглощения в области от 515 нм до 550 нм относительно бутанола. Рассчитывали оптическую плотность при 532 нм относительно двух базовых длин волн - 515 нм и 550 нм.

D532/51S/550=D532-0,5*(D515+D5SO)

Содержание ТБК-реактивных продуктов выражали через эквивалентное количество МДА, считая мольный коэффициент экстинкции МДА при 532 нм равным 1,56* 105 M'W:

(МДА), мкМ=6,41* D532/515/55о*(2000/(объем образца в мл) )

(МДА), нмоль/мг белка = ((МДА), мкМ/ (белок, мг/мл) (Uchiyama et al

1978)

Определение содержания сиаловой кислоты в ЛНП. Использовались по 4 аликвоты из каждого препарата (2 - опытные, 2- контрольные для определения поправки на содержание ТБК-реактивных продуктов). К образцу, содержащему 50-100 мкг ЛНП (по белку), добавляли равный объем трихлоруксусной кислоты, после чего перемешивали и инкубировали 20 минут при 4°С. Пробы центрифугировали при 4500 обУмин в течение 10 минут; к осадку добавляли 200 мкл ОДН H2SO4 и перемешивали. Образцы гидролизовали при 80°С в течение 1 часа. После охлаждения к опытным образцам добавляли 10 мкл 0,2M NaI04 в 9 M Н3РО4, к контрольным - 10 мкл 9М Н3Р04; образцы тщательно перемешивали и инкубировали 20 минут при комнатной температуре. Далее к опытным образцам добавляли 100 мкл 10% NaAs02 в 0,5М Na2S04 и 0,1N II2SO4, к контрольным 100 мкл 0,5М Na2S04; образцы тщательно перемешивали до исчезновения желто-коричневого окрашивания. Сразу после этого к пробам добавляли 250 мкл 0,6% раствор тиобарбитуровой кислоты в 0,5М Na2S04, перемешивали. Далее образцы инкубировали на кипящей водяной бане в течение 15 минут. В охлажденные пробы добавляли 400 мкл трет-бутанола. Образцы интенсивно перемешивали на вортексе в течение 5 секунд дважды с интервалом 5 минут. Пробы центрифугировали при 4500 об/мин в течение 10

минут для разделения фаз. Из органической фазы отбирали 250 мкл и переносили в 96-луночную планшету и измеряли оптическую плотность при 540 нм (Multiskan Bichromatic (Labsystems OY, Helsinki, Финляндия)). Среднее значение, полученное в контрольных пробах, характеризует содержание ТБК-реактивных продуктов. Его вычитали из среднего значения, полученного в опытных образцах. В качестве стандарта использовался раствор водный сиаловой кислоты 1мг/мл.

Определение степени ассоциации ЛНП и размера ассоциатов

Определение относительного размера ЛНП (метод флуктуации светопропускания). Степень ассоциации ЛНП оценивали методом регистрации флуктуации светопропускания луча лазерного света длинной волны 780 нм на двухканальном агрегометре (модель LA220, НПФ БИОЛА, Россия) (Tertov et al., 1989; 1992). Метод основан на том, что относительная дисперсия колебаний оптической плотности, вызванных случайными изменениями в количестве частиц, попадающих в оптический путь лазерного луча, отражает отклонения от их среднего размера, то есть степень их ассоциации. Увеличение флуктуации светопропускания свидетельствует об увеличении взвешенного среднего оптического радиуса частиц. Это дает возможность оценить изменения среднего размера частиц ЛНП в условных единицах. Данный метод дает качественно схожие результаты с результатами, полученными методом квазиупругого светорассеяния, позволяющего непосредственно определять размер частиц ЛНП (Tertov et al., 1992).

Для изучения ассоциационной способности ЛНП их, как правило, предварительно освобождали от имеющихся ассоциатов путем фильтрования через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и инкубировали при 37°С в изотоническом фосфатном буфере (ИФБ; GIBCO, Paisley, Великобритания; КС1 0,2 г/л, КН2Р04 0,2 г/л, NaCl 8 г/л, Na2HP04 1,15 г/л, рН 7,2), содержащем 1 мг/мл ЭДТА.

Определение размера ассоциатов ЛНП. Размеры частиц ЛНП и ассоциатов липопротеидов определяляи методом квазиупругого лазерного рассеивания на приборе Autosizer 2 (Malvern Instrument, Великобритания).

Основные характеристики использованных в работе полаксамеров. В

работе использованы полаксамсры Р85, L61, L81, L64 и F68 (BASF, США), Основные характеристики полаксамеров приведены в таблице 1.

Ультразвуковое сканирование сосудов

Протокол ультразвукового обследования включал сканирование обеих сонных артерий в В-режиме в трех проекциях до области каротидного синуса с помощью линейного датчика 7,5 МГц. Толщину интимомедиального слоя измеряли по видеозаписи с помощью компьютерной программы Prosound (R.Seltzer, США). Измерения проводили на участке общей сонной артерии длиной 10 мм, непосредственно прилегающему к каротидному синусу. Статистическая обработка данных

Статистическую оценку достоверности различий проводили с использованием пакета SPSS версии 12.0 (SPSS Inc., США). Графическую обработку данных проводили с использованием пакета SigmaPlot версии 7.0 (SPSS Inc., США). Достоверными считали различия при 95% вероятности безошибочного прогноза. Характер распределения признака определяли с помощью F-теста и теста Колмогорова-Смирнова. После оценки вариабельности признака в отношении нормальности распределения для межгрупповых сравнений использовали тест Манна-Уитни или групповой t-тест, для оценки изменений показателей в динамике использовали тест Уилкоксона или парный t-тест. Для сравнения распределений номинальных показателей и категорийных величин использовали показатель хи-квадрат по Пирсону с поправкой по Йетсу. Для оценки связи клинико-биохимических показателей и их изменений использовали корреляционный анализ по Пирсону с поправкой Бонферрони и регрессионный анализ. В окончательном виде данные для непрерывных величин представляли в виде среднего арифметического значения с указанием стандартной ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Морфологическая визуализация и анализ распределения липидов в атеросклеротнческнх поражениях человека.

Электрониомикроскопический анализ артериальных тканевых образцов обнаружил присутствие клеток, содержащих в цитоплазме липидные включения. В непораженных атеросклерозом образцах интимы липидные включения («липидные капли») встречались достаточно редко, однако в атеросклеротических поражения присутствие липидов интиме являлось характерным явлением. В некоторых интимальных клетках липидные включения были многочисленными, что позволяло классифицировать такие клетки как пенистые клетки.

Электрониомикроскопический гистохимический анализ обнаружил присутствие нейтральных липидов и неэтерифицированного холестерина как в прилюминалыюм, так и в примедиальном субслое интимы. В отличие от прилюминалыюго субслоя, где присутствие нейтральных липидов и неэтерифицированного холестерина было зафиксировано во внеклеточном матриксе, отложение этих компонентов в примедиальном субслое ассоциировалось в основном с измененными эластическими волокнами. В примедиальном субслое 10—15 % эластических волокон имели признаки изменений в результате вакуолизации матрикса этих волокон.

Вакуолизация эластических волокон является, видимо, результатом образования безэластиновых полостей внутри относительно гомогенного эластинового матрикса волокон. Такие полости в эластических волокнах наблюдались как в периферических, так и в центральных частях волокон. Полости в матриксе эластических волокон часто соединялись. Нейтральные липиды преимущественно были локализованы в зонах расположения таких полостей в эластичных волокнах (рис. 2, а, б). При гистохимическом окрашивании с использованием филипина, комплексы филипин-стерол, представлящие собой ламеллярные структуры с расстоянием между ламеллами 10—20 нм, наблюдались в ассоциации с разрушающимися эластическими волокнами (рис. 2, в). В примедиальном субслое комплексы филипин-стерол

были обнаружены также во внеклеточном матриксе интимы, где они примыкали к внешней границе эластических волокон. Использование комбинации действия 0б04 и гистохимического окрашивания филипином показало, что некоторые полости в эластических волокнах были заполнены нейтральными липидами и неэтерифицированным холестерином.

Рисунок 2 - Одновременная визуализация нейтральных липидов (по методу: ОиуШп, Юетр, 1988) и неэтерифицированного холестерина (с использованием филипина (по протоколу: КгиЛ, 1984), локализованных внутри поврежденною эластического волокна в интиме аорты (а-в). б - деталь рисунка, а; стрелки показывают зоны локализации нейтральных липидов (а) и на кристаллы неэтерифицированного холестерина (е), выявленного посредством реакции с филипином; э — эластин; масштабная линейка: 1 (а), 0.2 (б) и 0.1 (в) мкм.

В работе мы также проверили, совпадают ли данные по определению количества разных классов липидов, определенных с помощью химического

26

анализа после экстрагирования из криостатных зон интимы аорты и последующим хроматографическим разделением, с содержанием липидов, определенным гистохимически в последовательных срезах тех же образцов ткани. Морфометрический метод использовали для оценки количества липидов, наблюдаемых с помощью окрашивания масляным красным О, тогда как с помощью химического анализа идентифицировали триглицериды, холестерин, эфиры холестерина и фосфолипиды в одних и тех же локусах интимы.

Установили, что между общим количеством липидов, обнаруженных с помощью окрашивания, и количеством эфиров холестерина, свободным холестерином и фосфолипидами существует положительная корреляция (г = 0.72—0.95). Положительная корреляция существовала и между вне- и внутриклеточными липидами (окрашивание масляным красным О) и количеством свободного холестерина, эфиров холестерина и фосфолипидами (г = 0.68—0.95). Не обнаружили значимой корреляции между количеством триглицеридов, идентифицированных химическим способом, и количеством липидов, определенных морфометрически после окрашивания.

Оптимизация клеточной модели для оценки атерогенности ЛНП

Ранее в нашей лаборатории было показано (Супрун, 2000), что адекватной моделью для изучения накопления внутриклеточного холестерина является культура субэндотелиальных клеток, выделенных из непораженной интимы аорты человека. Было продемонстрировано, что первичная культура клеток, выделенных из непораженных участков интимы аорты человека, может считаться адекватной моделью для воспроизведения ключевых проявлений атеросклероза in vitro.

В данном исследовании был рассмотрен вопрос о возможности использования для исследования накопления внутриклеточных липидов более простой в применении и однородной культуры клеток моноцитов-макрофагов, выделенных из крови человека. Для этого сравнили внутриклеточное накопление липидов, вызванное добавлением в культуру моноцитов-

макрофагов и в культуру клеток, выделенных из интимы аорты человека сывороток, полученных от 20 больных ишемической болезнью сердца.

Коэффициент корреляции между данными, полученными на этих моделях, составил 0,95 (р=0,012). В настоящем исследовании мы применяли модель моноцитов-макрофагов, так как она не менее информативна, чем более сложная модель клеток, выделенных из интимы аотры человека, но гораздо более доступна.

Ассоциация ЛНП - ключевой фактор их атерогенностн

Самоассоциация ЛНП

Под самоассоциацией ЛНП мы понимаем самопроизвольное слияние или слипание липопротеидов между собой. Нативные липопротеиды низкой плотности, выделенные из крови здоровых людей не подвержены самоассоциации (ТеЛоу УУ, 1992 ), в то время как модифицированные любым способом ЛНП агрегируют между собой, одновременно они вызывают накопление липидов в культуре гладкомышечных клеток.

Ранее было продемонстрировано (Аксенов, 2007), что дегликозилирование, протеолитическая и липолитическая модификация приводит к самоассоциации ЛНП. Циркулирующие множественно модифицированные ЛНП также склонны к самопроизвольной ассоциации и проявляют атерогенные свойства.

В работе мы использовали два разных подхода для определения степени ассоциации липопротеидов низкой плотности: метод регистрации флуктуации светопропускания и метод квазиупругого лазерного рассеивания. В первом случае мы определяем относительное изменение размера частиц, во втором -абсолютный размер.

На рисунках 3 и 4 представлены результаты экспериментов по исследованию самоассоциации липопротеидов двумя методами. Из данных, представленных на рисунках, видно, что тенденция одинакова при измерении как относительного, так и абсолютного размера частиц. Далее мы, в-основном,

использовали метод флуктуации светорассеяния, т.к. этот метод позволяет изучать ассоциацию ЛНГ1 в динамике.

я м о

& В

-I

о |

Ё О

й «

о н

и о

I ©

1200% 1000% 800% 600% 400% 200% 0%

_

50 100 150 200

Время, мин

250

300

Рисунок 3 - Самоассоциация ЛНП, полученных от больных ИБС, зарегистрированная методом измерения флуктуации светопропускания, Среда инкубации - ИФБ, рН 7.4, концентрация ЛНП 1,1 мг белка/мл, температура инкубации 37°С, скорость перемешивания 100 об/мин.

£82 -

2®о -

243 -

222 -

2 £22 — 182.',-

С чео -

X 149 -

Ч !2> -

а гаа-

о

гз -

§ €0 -

Он <5 -

20 -

о -

Время, мин

Рисунок 4 - Самоассоциация ЛНП, полученных от больных ИБС, зарегистрированная методом квазиупругого лазерного рассеяния. Среда инкубации - ИФБ, рН 7,4, концентрация ЛНП 1,1 мг белка/мл, температура инкубации 37°С, скорость перемешивания 100 об/мин.

Ассоциация с внеклеточным матриксом

Известно, что в интиме артерий присутствуют компоненты соединительнотканного матрикса, а именно коллаген, эластин (Ве^еЛоп РЯ, 2013 ), фибронектин, гепарин и другие. ЛНП образуют комплексы с ними, в частности, с глюкозоаминогликанами (впшуавап вЯ, 1972). Мы поставили перед собой задачу выяснить, влияет ли добавление в культуру одновременно с ЛНП таких глюкозаминогликанов, как гиалуроновая кислота, хондроитин-сульфат и синтетический гликозаминогликан, декстран-сульфат, на ЛНП-опосредованное накопление холестерина клетками. Как видно из данных рисунка 5, ни гиалуроновая кислота, ни хондроитин сульфат, ни гепарин не влияли на внутриклеточное накопление липидов, в то время как добавление декстран сульфата одновременно с ЛНП вызывало почти двукратное увеличение уровня холестерина в культивируемых клетках.

Н--1--

О 5 10 15

Рисунок 5 - Накопление внутриклеточного холестерина макрофагами при добавлении ЛНП и различных глюкозоаминогликанов. Данные представлены в виде среднего трех определений ± стандартное математическое отклонение. *, достоверное отличие от контроля, р<0,05.

Также мы исследовали, каким образом добавление эластина влияет на липопротеидопосредованное накопление холестерина. Выделенный из интимальиого слоя аорты человека эластин вызывал увеличение внутриклеточного холестерина примерно на 300%, в то же время

30

делипидированный эластин практически не влиял на содержание холестерина. Наряду с этим, внесение в культуру делипидированного эластина вместе с ЛНП приводило к существенному (более, чем 3-кратному) накоплению холестерина в культивируемых клетках.

Во внеклеточном матриксе также присутствуют коллаген, фибронектин и гепарин (Huang AS, 2013 ). Денатурированный коллаген - желатин вызывал значимое - на 50% - увеличение содержания внутриклеточного холестерина. Добавление гепарина или фибронектина отдельно накопления внутриклеточных липидов не вызывало. Одновременное же внесение гепарина и фибронетктина с ЛНП вызывало такое же, как в случае с коллагеном, т.е. 1,5 кратное, увеличение содержания холестерина в клетках.

Ранее было продемонстрировано, что внутриклеточное накопление холестерина, вызванное холестеринсодержащими частицами, зависит от размера последних или их способности образовывать нерастворимые ассоциаты. Поэтому было интересно выяснить, образуют ли липопротеиды низкой плотности нерастворимые комплексы с гликозаминогликанами, эластином, коллагеном, фибронектоном и пр.?

Для этого ЛНП в концентрации 100 мкг белка/мл инкубировали в культуральной среде в течение 24 асов при 37°С в С02 инкубаторе. Через определенные промежутки времени образовавшуюся смесь подвергали центрифугированию с усилием 10 тысяч g в течение 20 минут. Полученный осадок анализировали на содержание суммарного холестерина, подвергали центрифугированию (10.000xg, 20 мин) и в осадке определяли суммарный холестерин. В условиях культивирования частицы коллагеназа-резистентного дебриса и эластина образовывали нерастворимые комплексы с ЛНП, причем эластин связывал ЛНП эффективнее и быстрее чем дебрис. Среди использованных нами глюкозаминогликанов лишь декстран-сульфат образовывал нерастворимые ассоциаты с ЛНП. За 24 часа инкубации в условиях культивирования ЛНП с декстран-сульфатом, дебрисом и эластином в

осадок выпали ассоциаты, содержащие 20, 30 и 37% от исходных липопротеидов, соответственно.

Исследуемые гликозаминогликаны, а именно хондроитин-сульфат, гиалуроновая кислота и гепарин, не приводили к образованию нерастворимых ассоциатов с ЛНП. Желатин и фибронектин при инкубации с ЛНП в условиях культивирования не вызывали появления холестерина в осадке, в то время как при инкубации липопротеидов с фибронектином и гепарином или фибронектином, гепарином и желатином в течение суток в осадок выпадали ассоциаты, содержащие 73% и 82%, соответственно, от исходно внесенных в инкубационную смесь ЛНП.

При сопоставлении данных, полученных в экспериментах представленных выше, очевидно, что внутриклеточное накопление холестерина возникает в случае инкубации ЛНП в комбинации только с теми агентами, которые образуют с липопротеидами нерастворимые ассоциаты. Одновременно, исследованные компоненты внеклеточного матрикса, которые не образуют в условиях культивирования нерастворимых ассоциатов с ЛНП, не способны вызывать внутриклеточное накопление холестерина. Была обнаружена прямая зависимость между уровнем холестерина в нерастворимом ассоциате, образующемся в условиях культивирования, и увеличением содержания холестерина в моноцитах-макрофагах (коэффициент корреляции равен 0.925).

Образование циркулирующих иммунных комплексов.

В течение последнего десятилетия была продемонстрирована тесная корреляция между уровнем ЦИК в крови и количеством инфарктов миокарда и других сердечно-сосудистых катастроф у пациентов с сахарным диабетом 2 типа (Lopes-Virella MF, 2012), а также связь повышенного уровня ЦИК, содержащих гликозилированные и окисленные ЛНП, с повышенным риском ретинопатии у пациентов с сахарным диабетом 1 типа (Lopes-Virella MF, 2012). С другой стороны, на эпидемиологической выборке из почти 2000 изначально здоровых людей было показано (Ravandi А, 2011), что IgG и IgM, содержащие

ЦИК, не являются независимыми предикторами событий сердечно-сосудистых заболеваний, но могут влиять на риск ССЗ, связанный с повышенным уровнем окислительных биомаркеров. Также было показано, что включение ЦИК в тучные клетки приводит к экспрессии последними провоспалительных цитокинов (ЬарраЫпеп .1, 2011). Таким образом, ЛНП-содержащие циркулирующие иммунные комплексы могут играть роль в развитии атеросклероза.

Нами был исселдовано влияние нативных, модифицированных и входящих в состав ЦИК липопротеидов низкой плотности на содержание липидов в культуре моноцитов-макрофагов. Были получены образцы сыворотки крови трех здоровых лиц и сыворотки крови трех больных ИБС. Выделенные ЛНП были разделены с помощью лектин-хроматографии на РКАпо-агарозе на подфракцию нативных (нЛНП) и циркулирующих множественно-модифицированных липопротеидов (цммЛНП). Ниже приводятся данные, полученные с использованием липопротеидов, выделенных из сывороток крови здоровых лиц и сывороток крови пациентов. Инкубация моноцитов-макрофаговв течение суток в среде, содержащей 100 мкг/мл нативных ЛНП, полученных от здоровых лиц, не вызывало изменений внутриклеточного содержания фосфолипидов и нейтральных липидов (рис. 6). Такие же результаты были получены в случае нЛНП пациентов с коронарным атеросклерозом. Напротив, 100 мкг/мл цммЛНП пациентов вызывали увеличение внутриклеточного уровня свободного и этерифицированного холестерина в 1,6 и 2,4 раза, соответственно, а также увеличение уровня триглицеридов на 39% (рис. 6). ЛНП, входящие в состав циркулирующих иммунных комплексов, вызывали увеличение уровня холестерина, его эфиров и триглицеридов. При этом содержание фосфолипидов в моноцитах-макрофагах достоверно не изменялось (рис. 16).

100 90 80 70 60

Я Контроль

Я нЛНП (здоровые лица)

50 -Н

V цмглЛНП (здоровые яйца)

40 -30 -20 -10 -0 -

■ нЛНП (пациенты с коронарным

атеросклерозом} ШцммЛНП (пациенты с коронарным

атеросклерозом) И ЦИК-ЛНП (пациенты с коронарным атеросклерозом)

Фосфолипиды Триглицериды Свободный Эфиры

холестерин холестерина

Рисунок 6 - Влияние нативных ЛНП, цммЛИП и ЦИК-ЛНП на содержание липидов в моноцитах-макрофагах.

Данные представлены в виде среднего трех определений ± стандартное математическое отклонение. *, достоверное отличие от контроля. р<0,05.

Модуляция ассоциации ЛНП полаксамерами

Ранее нами было продемонстрировано, что модифицированные любым способом ЛНП (Аксенов, 2007) образуют ассоциаты, и эти ассоциаты проявляют атерогенные свойства, вызывая накопление внутриклеточных липидов. Была выявлена прямая зависимость между размером ассоциатов ЛНП и их способностью вызывать накопление липидов в клетках, причем нативные ЛНП не образовывали ассоциатов и не обладали атерогенными свойствами, т.е. не вызывали накопление внутриклеточных липидов. Можно сделать предположение, что без модификации ЛНП невозможна их ассоциация, без ассоциации ЛНП не проявляются их атерогенные свойства. Исходя из этого, особый интерес представляет поиск модуляторов процесса ассоциации ЛНП.

Известно, что липопротеид-дефицитная сыворотка (Talbot RM, 2003), бычий сывороточный альбумин (БСА), липопротеиды высокой плотности (ЛВП) (Khoo JC, 1990) здоровых лиц и аполипопротеид ЛВП - ароА-I являются эндогенными ингибиторами ассоциации ЛНП. Все они являются крупными частицами с амфифильными свойствами, которые, по-видимому, экранируют поврежденные участки цммЛНП, препятствуя их самоассоциации. Экзогенные

ингибиторы самоассоциации липопротеидов мало изучены. Между тем, поиск и изучение нетоксичных и биодоступных ингибиторов Нами были изучены амфифильные блоксополимеры окиси пропилена (ОП) и окиси этилена (ОЭ), так называемые полаксамеры, в качестве возможных ингибиторов ассоциации цммЛНП. Основные характеристики использованных в работе полаксамеров полаксамеров приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Основные характеристики использованных в работе полаксамеров

Полаксамер ММ Состав ГЛБ* ККМ при 37° С, % ККМ при 37°С, мМ

L 61 1900 Э02П03оЭ02 3 0,002% 0,01

L 64 3000 ЭО.зПОзоЭОо 15 0.03 % 0,1

L 81 2750 ЭО3ПО40ЭО3 2 0,0007% 0,0026

Р85 4500 Э026П04оЭ026 16 0.02 % 0.044

F68 8400 Э08оП027Э08о 29 0,4% 0.044

Мы исследовали действие полаксамеров с различным количеством гидрофильных и липофильных групп, которые определяли их амфифильные свойства. Были использованы гидрофобные полаксамеры L61 и L81, (ГЛБ 3 и 2), полаксамер F68, обладающий высоким значением ГЛБ 29 и выраженными гидрофильными свойствами и полаксамеры Р85 и L64 с умеренными гидрофильными и липофильными свойствами (ГЛБ 16 и 15, соответственно). Эта часть работы была проведена в сотрудничестве с кафедрой ВМС

Химического факультета МГУ, (зав. лабораторией - профессор A.A. Ярославов).

Были получены данные, из которых следовало, что полаксамеры с выраженными и умеренными гидрофобными свойствами (Р85, L61, L64 и L81) в концентрациях близких или больших ККМ останавливают ассоциацию цммЛНП, наряду с этим гидрофильный полаксамер F68 в любой концентрации не влиял на процесс самоассоциации цммЛНП. Известно, что поверхность цммЛНП значительно изменена по сравнению с нативными липопротеидами (Мельниченко, 2006) и возможно, что экспонируются гидрофобные участки апоВ-100, что приводит к потере устойчивости частиц ЛИП в растворе и их стремлению к слипанию и дальнейшему слиянию. При добавлении полаксамеров; частица цммЛНП стабилизируется, но образовавшиеся агрегаты не распадаются.

Исследованная в работе возможность модуляции процесса самоассоциации ЛНП различными полаксамерами можно рассматривать как предпосылку к созданию лекарственного средства, которое будет влиять на развитие атеросклероза на самой начальной стадии - стадии накопления липидов в сосудистой стенке.

Разработка методов диагностики факторов атерогенности

Разработка и модификация метода определения уровня цммЛНП в

сыворотке

Как было показано выше, сыворотка больных с коронарным атеросклерозом вызывает накопление липидов в клетках, выделенных из непораженной интимы аорты человека, т.е. атерогенна. Циркулирующие множественно модифицированные ЛНП и антитела к ним также являются атерогенными компонентами сыворотки больных ССЗ. Было показано, что биохимический состав, физические характеристики, а также взаимодействие с клеточными рецепторами данных липопротеидов кардинально отличается от нативных ЛНП. Основное различие заключается в низком содержании сиаловой кислоты, терминальном сахаре биантенной цепи аполипопротеина

(ano) В. Учитывая, что после удаления сиаловой кислоты, терминальным сахаром становится галактоза, был разработан способ выделения модифицированных ЛНП на сорбенте с иммобилизованным агглютинином Ricinus communis (РКА120). Данный агглютинин имеет высокое сродство к терминальной бета-галактозе и низкое сродство к другим сахарным остаткам, входящим в состав полисахаридных цепей ЛНП (Baenziger JU, 1979). Таким образом, цммЛНП связвались на колонке с пришитым РКА120 и элиюровались 50мМ раствором галактозы (Tertov W, 1990).

В данном исследовании был разработан метод для определения содержания циркулирующих множественно модифицированных ЛНП в сыворотке крови. Этот метод основан на связывании цммЛНП с помощью иммобилизованного на пластик РКА120, с последующим измерением связавшегося апоВ конъюгированными с пероксидазой поликлональными антителами. Данная методика была использована при разработке макета аналитической тест-системы для применения в медицине при экспрессной диагностике атерогенных дислипидемий при сердечно сосудистых патологиях

Сравнение диагностической значимости цммЛНП и ЦИК-ЛНП

Как было сказано выше, уровень ЦИК, цммЛНП и атерогенность сыворотки крови (способность сыворотки вызывать внутриклеточное накопление холестерина) являются факторами риска развития атеросклероза. Мы обследовали три группы пациентов, у которых определили указанные параметры и выяснили, есть ли корреляция между ними.

Было обследовано три группы пациентов:

I. пациенты без симптомов атеросклероза, II. пациенты с выраженной гиперхолестеринемией, III. пациенты с клиническими проявлениями атеросклероза (ишемическая болезнь сердца, перенесенный инфаркт миокарда, перенесенный инсульт).

В первую группу вошли 58 человек, мужчины от 45 до 70 лет и женщины после менопаузы, уровень холестерина в сыворотке которых составлял менее 6,5 ммоль/л (250 мг/дл).

Во II группу вошли 134 пациента с гиперхолестеринемией - мужчины 45-69 лет и женщины после менопаузы, уровень холестерина в сыворотке которых составлял более 6,5 ммоль/л (250 мг/дл). Средний уровень холестерина ЛНП в группе составил 6,85 ммоль/л, а ИМТ был 27,1 кг/м2.

В III группу вошли пациенты 53-78 лет с клиническими проявлениями атеросклероза (ишемическая болезнь сердца, перенесенный инфаркт миокарда, перенесенный инсульт).

Регулярный прием антиоксидантов, ацетилсалициловой кислоты или любого другого препарата с антиоксидантными свойствами являлся критерием исключения. Женщины в пременопаузе или принимающие гормональные контрацептивы были исключены. Также критериями исключения были печеночная дисфункция, выраженное ожирение (индекс массы тела> 32 кг/м2), сахарный диабет 1 типа, неконтролируемая артериальная гипертензия (диастолическое артериальное давление> 105 мм рт.ст.).

Из крови пациентов получали сыворотку крови и определяли ее атерогенность на культуре клеток, выделенных из непораженных участков интимы аорты человека, как это описано в материалах и методах. Атерогенный эффект сыворотки определяли как отношение накопленного внутриклеточного холестерина к контрольному опыту (без добавления сыворотки). Холестерин ЦИК определяли ферментативным колориметрическим методом после осаждения циркулирующих иммунных комплексов, как это описано в Материалах и методах 2,5% раствором ПЭГ6000. Уровень цммЛНП в сыворотке крови определяли путем связывания с Ricinus Communis, как это описано в материалах и методах, в исследовании применяли отношение апоВ цммЛНП к общему апоВ сыворотки крови, который определяли ИФА при связывании с поликлональными антителами к апоВ, как это описано в Материалах и методах.

При анализе полученных во всех трех группах данных были выявлены следующие зависимости. Существует прямая корреляция (р=0,027) между способностью сыворотки пациентов вызывать накопление внутриклеточных липидов при добавлении изучаемых сывороток к культуре клеток выделенных из непораженной интимы аорты человека, т.е. их атерогенностыо и уровнем цммЛНП в изучаемых сыворотках, также существует корреляционная связь Р<0,001 между атерогенностыо сывороток и относительным содержанием цммЛНП в общем пуле ЛНП сывороток.

Оценка диагностической и прогностической значимости ЦИК

Выше было показано, что уровень холестерина ЦИК (Х-ЦИК) коррелируег со степенью выраженности и распространенностью атеросклеротических поражений и обладает высокой диагностической значимостью. Прогностическая значимость данного параметра ранее не изучалась. Можно предположить, что ЛНП-содержащие ЦИК имеют большое значение в прогрессировании атеросклероза, поскольку могут вызывать накопление холестерина в клетках сосудистой стенки. В данном исследовании была изучена связь между уровнем Х-ЦИК и прогрессированием атеросклероза.

В проспективном 2-летнем исследовании участвовали 98 мужчин в возрасте 40-74 лет с ранним бессимптомным атеросклерозом сонных артерий. Ультразвуковое обследование проводилось трижды перед включением в исследование, 1 раз в 3 месяца в течение первого года наблюдения, 1 раз в 6 месяцев в течение второго года наблюдения, и трижды по окончании исследования. Протокол ультразвукового обследования включал сканирование обеих сонных артерий в B-режиме в трех проекциях до области каротидного синуса с помощью линейного датчика 7,5 МГц (12). Толщину ИМС измеряли по видеозаписи с помощью компьютерной программы Prosound (R.Seltzer, США). Измерения проводили на участке общей сонной артерии длиной 10 мм, непосредственно прилегающему к каротидному синусу. Содержание холестерина и триглицеридов в сыворотке крови определяли с помощью ферментативных наборов (Boehringer Mannheim GmbH, Германия). Уровень

иммунного холестерина определяли по содержанию холестерина в ЦИК, выделенных из сыворотки крови путем преципитации иммунных комплексов полиэтиленгликолем 6000.

В таблице 2 представлены исходные клинические и биохимические характеристики участников исследования. Для установления диагностической и прогностической значимости уровня иммунного холестерина и других липидных показателей, их пороговые значения для данной выборки были определены методом наибольшего у\ Пороговое значение для иммунного холестерина составило 16 мкг/мл. У пациентов с повышенным уровнем иммунного холестерина также отмечалось повышенное содержание общего холестерина и холестерина ЛНП. Средняя и максимальная толщина ИМС у пациентов с повышенным уровнем Х-ЦИК была достоверно выше, чем у пациентов с нормальным уровнем Х-ЦИК (Таблица 16).

Таблица 2 - Исходные клинические и биохимические показатели.

Показатель Все больные Х-ЦИК Х-ЦИК

(п=98) <16.0 мкг/мл >16.0 мкг/мл

(п=55) (п=43)

Толщина ИМС, мм 0,939±0,015 0,920±0,008 0,963±0,018 *

Возраст, лет 60,6±0,8 60,2±0,5 61,1±0,8

Общий холестерин, мг/дл 230±3 221±2 241±3 *

Триглицериды, мг/дл 197±10 204±6 188±9

Холестерин ЛВП, мг/дл 42,6±1,1 42,0±0,6 43,4±1,0

Холестерин ЛНП, мг/дл 149±4 141±2 159±3 *

Х-ЦИК, мкг/мл 14,9*0,7 9,3±0,6 22Д±2,8 *

*, достоверное различие между больными с нормальным и повышенным уровнем Х-ЦИК, р<0,05.

Анализ сопряженности липидных показателей с исходной толщиной ИМС сонных артерий выявил, что только уровни Х-ЦИК и холестерина ЛНП были достоверно сопряжены со степенью выраженности каротидного атеросклероза и при этом имели высокие значения относительного риска и отношения шансов (таблица 3).

Таблица 3 - Диагностическая значимость липидных показателей и Х-ЦИК.

Показатель X* Р Относител Отношени Чувствительность Специфичность

ьный риск е шансов ,% ■ %

Х-ЦИК 8,490 0,045 1,18 1,43 64,7(62,1-67,1) 60,1 (56,8-65,9)

Холестерин 7,103 0,048 1,12 1,36 61,8(56,6-66,9) 42,8 (38,7-47,1)

ЛНП

Холестерин 3,987 0,159 1,12 1,33 61,8 (58,2-65,4) 45,3 (39,3-51,3)

ЛВП

Общий 1,606 0,374 1,13 1,21 61,5(58,4-65,1) 45,8 (39,4-52,3)

холестерин

Триглицери 0,128 0,820 0,97 0,94 50,2(39,9-61,0) 38,1 (34,1-42,2)

ДЫ

Примечание: в скобках указан 95% доверительный интервал.

Показатель Х-ЦИК имел наивысшую чувствительность и специфичность по сравнению с другими липидными параметрами, то есть обладал диагностической ценностью. Следует отметить, что такие показатели, как общий холестерин, холестерин ЛНП и липопротеидов высокой плотности (ЛВП), характеризовались чувствительностью, сравнимой с Х-ЦИК, но их специфичность была низкой. Уровень триглицеридов сыворотки крови не имел достоверной диагностической значимости.

Увеличение толщины ИМС сонных артерий составило в среднем 0,029±0,011 мм за 2 года наблюдения при исходной средней толщине ИМС 0,939±0,015 мм (р=0.028). Таким образом, динамика изменений толщины ИМС может быть расценена как медленное, но статистически достоверное прогрессирование каротидного атеросклероза. Индивидуальные изменения толщины ИМС расценивались как прогресс, регресс или стабильное состояние

на основании статистически достоверных различий между средними величинами трех измерений при включении и по завершении исследования. Прогрессирование атеросклероза было отмечено у 52 больных (53,1%). Спонтанная регрессия была отмечена у 21 больного (21,4%). Соответственно, у 25 больных (25,5%) за 2 года наблюдения толщина ИМС достоверно не изменилась.

Таблица 4 - Прогностическая значимость липидных показателей и Х-ЦИК.

Показатель х2 Р Относи тельны й риск Отношение шансов Значимость повышенных показателей, % Значимость нормальных показателей, %

Х-ЦИК 15,602 0,001 2,57 6,25 63,5 78,3

(53,6-71,5) (67,1-87,3)

Холестерин 0,031 0,904 0,96 0,92 72,4 58,1

ЛПНП (67,7-77,6) (53,5-62,9)

Общий 0,031 0,904 0,97 0,91 64,3 39,0

холестерин (56,0-72,8) (34,2-43,5)

Триглицериды 0,010 0,973 0,99 0,98 36,3 34,8

(31,0-41,3) (30,1-39,0)

Холестерин 0,008 0,986 1,00 1,00 48,0 43,4

ЛПВП (42,4-53,7) (38,7-47,4)

Примечание: в скобках указан 95% доверительный интервал.

Анализ сопряженности липидных показателей с динамикой изменений толщины ИМС выявил, что только уровень Х-ЦИК был достоверно сопряжен с прогрессированием каротидного атеросклероза и имел высокие показатели относительного риска и отношения шансов (таблица 4). Повышенный уровень Х-ЦИК, наряду с повышенным общим холестерином и повышенным холестерином ЛНП, имел достаточно высокую прогностическую значимость. Повышенный уровень триглицеридов сыворотки крови, как и сниженный уровень холестерина ЛВП, не имели прогностической значимости в отношении прогрессирования каротидного атеросклероза. Нормальный уровень Х-ЦИК (менее 16 мкг/мл) был единственным параметром, предвещающим отсутствие

прогрессировать каротидного атеросклероза в течение 2 лет с прогностической значимостью 78,3% (таблица 4). Нормальные уровни общего холестерина, холестерина ЛНП и ЛВП и триглицеридов не обладали достоверной прогностической ценностью.

Разработка аналитической тест-системы для оценки атерогенных свойств сыворотки

В процессе проведенной работы было продемонстрировано, что уровень холестерина ЦИК (Х-ЦИК) коррелирует со степенью выраженности и распространенностью атеросклеротических поражений и обладает высокой диагностической прогностической значимостью. Поэтому нами разработан макет аналитической тест-системы (мАТС) для одновременного определения контролируемых специфических биомаркеров, в частности, холестерина ЦИК, общего холестерина, холестерина ЛНП и ЛВП, а также триглицеридов. Созданная АТС обеспечивает возможность проведения анализа и регистрации результата и предназначена для применения в медицине в целях экспрессной диагностики сердечно-сосудистых патологий.

Для определения этих биомаркеров применен модифицированный (минимизированный) ферментативный метод, позволяющий уменьшить объем образца и реакционной смеси, и, как следствие этого, снизить стоимость анализа. Значения определенных биомаркеров позволят не только установить диагноз и определить тип дислипидемий, но и оценить риск наиболее опасных проявлений сердечно-сосудистых патологий.

Предлагаемая АТС позволяет определять новые виды и сочетания биомаркеров, которые, наряду с традиционными факторами риска, помогут идентифицировать лиц, имеющих высокий риск развития атеросклеротических заболеваний, и предпринять своевременные меры по ранней профилактике атеросклероза.

Лабораторный регламент на создание макета аналитической тест-системы для применения в медицине при экспрессной диагностике атерогенных дислипидемий при сердечно сосудистых патологиях приведен в Приложении к работе.

выводы

1. С помощью микроскопических методов визуализирована локализация жировых накоплений в стенке аорты при атеросклерозе. Показано, что на начальных стадиях атерогенеза существенная часть липидов накапливается в клетках сосудистой стснки, а не только вне клеток - инициация атерогенеза сопровождается накоплением внутриклеточных липидов (липоидозом).

2. Для воспроизведения липоидоза, а также для оценки атерогенного потенциала сыворотки крови информативной и адекватной моделью является первичная культура клеток, выделенных из непораженных атеросклерозом участков интимы аорты и первичная культура моноцитов-макрофагов, выделенных из крови человека. Модель на основе макрофагов гораздо проще и экономичнее модели на основе интимальных клеток аорты человека.

3. На разработанной клеточной модели показано, что самоассоциация ЛНП, ассоциация ЛНП с компонентами соединительнотканного матрикса, а также образование циркулирующих иммунных комплексов, содержащих цммЛНП, стимулирует захват липопротеидов клетками, усиливая их атерогенный потенциал.

4. Самоассоциация ЛНП, вызывающая клеточный липоидоз, подавляется амфифильными блок-сополимерами окиси пропилена и окиси этилена, так называемыми полаксамерами. Способность полаксамеров ингибировать ассоциацию зависят от гидрофильно-липофильного баланса и критической концентрации мицеллообразования, что свидетельствует о значительной роли гидрофобных взаимодействий в ассоциации ЛНП.

5. Уровень цммЛНП в сыворотке и уровень холестерина циркулирующих иммунных комплексов, являющиеся маркерами атеросклероза, обладают высокой диагностической значимостью для оценки степени бессимптомного атеросклероза.

6. Уровень холестерина циркулирующих иммунных комплексов, помимо диагностической значимости, имеет высокую прогностическую значимость в отношении бессимптомного атеросклероза.

45

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ:

1. Добрецов Г.Е., Гуларян С.К., Панасенко О.М., Мельниченко А.А., Орехов А.Н. Заряд поверхностного слоя циркулирующих множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности. II Биологические мембраны. - 2006. - Т. 23. - №5. - С. 420-425.

2. Никитина Н.А., Собенин И.А., Мясоедова В.А., Коренная В.В., Мельниченко А.А., Халилов Э.М., Орехов А.Н. Антиатерогенный эффект флавонондов винограда в модели ex vivo. // Бюлл. эксп. биол. мед. - 2006. - Т. 141.-№6.-С. 660-663.

3. Панасенко О.М., Мельниченко А.А., Аксенов Д.В., Тертов В.В., Каплун В .В., Собенин И .А., Орехов А.Н. Агрегация ЛПНП, индуцированная окислением, приводит к увеличению их захвата гладкомышечными клетками аорты человека. И Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2007. - Т. 143. - № 2. - С. 159-162

4. Букринский М.И., Свиридов Д.Д., Карагодин В.П., Собенин И.А., Сазонова МЛ., Коренная В.В., Орехова В.А., Иванова М.М., Мясоедова В.А., Мельниченко А.А., Савинкова И.Г., Орехов А.Н. Повреждение механизмов обратного транспорта холестерина, вызванное вирусом иммунодефицита человека: роль АБСА 1-зависимого пути. // Бюллетень Московского общества испытателей природы - 2009. - Т. 114. - №3. - С. 297-301.

5. Орехов А.Н., Собенин И.А., Орехова В.А., Мельниченко А.А., Мясоедова В.А., Мухамедова Н.М., Свиридов Д.Д., Карагодин В.П. Клеточные модели для поиска веществ, способствующих обратному транспорту холестерина.//Физиотерапия-2011.-Т. 12.-С. 1134-1146.

6. Собенин ИЛ., Карагодин В.П., Мельниченко АЛ., Орехов А.Н. Иммунный холестерин в крови - прогностическая ценность. // ФИЗИОТЕРАПИЯ - 2011. - Т. 12. - С. 1147-1155.

7. Sobenin I.A., Suprun I.V., Karagodin V.P., Feoktistov A.S., Melnichenko АЛ., Orekhov A.N. The interaction of plasma sialylated and desialylated lipoproteins with collagen from the intima and media of uninvolved and atherosclerotic human aorta. // J Lipids - 2011. - V. 2011. - P. 254-267.

8. Bobryshev Yu.V., Karagodin V.P., Kovalevskaya Zh.I., Myasoedova V.A., Shapyrina E.V., Salyamov V.I., Kargapolova Yu.M., Galaktionova D.Yu., Melnichenko АЛ., Orekhov A.N. The number of cells and the cell proliferation in intima of various human arteries. // Cell and Tissue Biology - 2012. - V. 6. - № 1. -P. 29-39.

9. Sobenin I.A., Karagodin V.P., Melnichenko A.A., Bobryshev Y.V., Orekhov A.N. Diagnostic and Prognostic Value of Low Density Lipoprotein-Containing Circulating Immune Complexes in Atherosclerosis. // J Clin Immunol. - 2013. - V. 33.-№2.-P. 489-495.

10. Sobenin I.A., Orekhova V.A., Melnichenko A., Bobryshev Y.V., Orekhov A.N. Low density lipoprotein-containing circulating immune complexes have better

prognostic value in carotid intima-media thickness progression than other lipid parameters. // Int J Cardiol. - 2013. - V. 166. - № 3 - P. 747-748.

11. Mclnichenko AA, Akscnov DV, Myasoedova VA, Panasenko OM, Yaroslavov AA, Sobenin IA, Bobryshev YV, Orekhov AN. Pluronic block copolymers inhibit low density lipoprotein self-association. // Lipids - 2012. - V. 47. -№ 10. - P. 995-1000.

Статьи в иных рецензируемых научных журналах:

12. Орехов А.Н., Карагодин В.П., Мельниченко А.А., Кириченко Т.В., Смутова В.А., Чернова У.В., Сафонова В.М., Калабушев С.Н., Пшежецкий А.В. Сиаломика и атеросклероз. // Фундаментальные науки и практика - 2010. Т. 1. № 4. - С. 59-65.

13. Мухамедова Н. М., Свиридов Д. Д., Карагодин В. П., Мельниченко А. А., Мясоедова В. А., Орехова В. А., Собенин И. А., Орехов А. Н. Исследование влияния белков, потенциально вовлеченных в отток холестерина, на экспорт холестерина из макрофагов. // Проблемы и перспективы современной науки. -2011. - Т. 3.-№ 1.-С. 68-73.

14. Орехов А.Н., Собенин И.А., Орехова В.А., Мельниченко А.А., Мясоедова В.А., Мухамедова Н.М., Свиридов Д.Д., Карагодин В.П. Клеточные модели для поиска веществ, способствующих обратному транспорту холестерина. // Проблемы и перспективы современной науки - 2011. - Т. 3. - № 1.-С. 98-103.

15. Мельниченко А.А., Аксенов Д.В., Панасенко О.М., Ярославов А.А., Орехов А.Н. Подавление инициирующей атерогенез ассоциации липопротеидов низкой плотности с помощью плюроников. // Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, фармакологии и медицине. Том 3. Сборник статей Второй Международной конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, фармакологии и медицине», 26-28.10.2011, Санкт-Петербург, Россия. Санкт-Петербург, Издательство Политехнического университета, 2001. С. 191-197.

16. Мельниченко А.А., Аксенов Д.В., Панасенко О.М., Ярославов А.А., Орехов А.Н. Влияние плюроников F68 и Р85 на ассоциацию липопротеидов низкой плотности. // Естествознание и гуманизм - 2011. - Т. 7. - № 1. - С. 61-64.

17. Мельниченко А.А. Аксенов Д.В., Панасенко О.М., Ярославов А.А., Орехов А.Н. Влияние плюроников L61 и Р85 на процесс ассоциации липопротеидов низкой плотности. // Естествознание и гуманизм - 2011. - Т 7. -№ 1. - С. 64-67.

Глава в книге

Mclnichenko А.А., Aksenov D.V., Myasoedova V.A., Panasenko O.M., Yaroslavov A.A., Sobenin I.A., Bobryshev Y.V., Orekhov A.N.// 2012. - V. 47. - No. 10. - P. 995-1000. Orekhov AN, Sobenin IA, Melnichenko AA, Myasoedova VA, Bobryshev YV. Use of natural products for direct anti-atherosclerotic therapy. Current Trends in Atherogenesis, Rita Rezzaniln (ed), Tech, 2013, Chapter 9, pp.187-217. ISBN 980953-307-832-3, http://dx.doi.org/10.5772/5296

Монографии

Мельниченко A.A., Аксенов Д.В., Орехов А.Н. Атерогенность липопротеидов. Механизмы, роль ассоциации.// LAP LAMBERT Academic Publishing, Saarbrucken, Germany, 2012.178 с.

МельниченкоА.А., Орехов А.Н., Собенин И.А.. Механизмы и роль атерогенной модификации липопротеидов в атерогенезе. .// LAP LAMBERT Academic Publishing, Saarbrucken, Germany, 2013. 242c. ISBN: 978-3-659-24312-7 Патентные заявки:

1. Орехов АН, Собенин ИА, Мясоедова ВА, Мельниченко АА, Орехова ВА. Патентная заявка от 05.03.2011 «Способ профилактики атеросклероза у женщин старшего возраста», регистрационный № 2011108528

2. Орехов АН, Собенин ИА, Кириченко Т.В., Мясоедова ВА, Мельниченко АА, Орехова ВА. Патентная заявка от 01.06.2011 «Способ профилактики и лечения атеросклероза», регистрационный номер № 2011121976

3. Орехов АН, Собенин ИА, Мясоедова ВА, Мельниченко АА, Орехова ВА. Патентная заявка от 03.11.2011 «Способ лечения атеросклероза, основанный на воздействии на иммунокомпетентные клетки сосудистой стенки», регистрационный номер № 2011144530

4. Орехов АН, Собенин ИА, Мельниченко АА. Патентная заявка от 03.11.2011 «Способ экспресс-диагностики атерогенных дислипидемий при сердечно-сосудистых патологиях», регистрационный номер № 2011144523

5. Орехов АН, Собенин ИА, Мясоедова ВА, Мельниченко АА, Орехова ВА. Патентная заявка от 03.11.2011 «Противовоспалительное антицитокиновое средство, обладающее прямым антиатеросклеротическим действием», регистрационный номер № 2011144526

6. Орехов АН, Собенин ИА, Кириченко Т.В., Мясоедова ВА, Мельниченко АА, Орехова В А. Патентная заявка от 03.11.2011 «Антиатеросклеротическое средство, обогащенное фитоэстрогенами, предназначенное для женщин после менопаузы», регистрационный номер № 2011144528

7. Орехов АН, Собенин ИА, Карагодин ВП, Мельниченко АА, Мухамедова НМ. Патентная заявка от 03.11.2011 «Способ профилактики атеросклероза, основанный на оттоке холестерина из клеток сосудистой стенки», регистрационный номер № 2011144524

8. Орехов АН, Собенин ИА, Кириченко ТВ, Мясоедова ВА, Бобрышев ЮВ, Мельниченко АА, Орехова ВА. Патентная заявка от 24.10.2012 «Способ лечения атеросклероза, основанный на антицитокиновом действии», регистрационный номер № 2012145159

9. Орехов АН, Чернова ЕВ, Бобрышев ЮВ, Мельниченко АА, Орехова ВА. Патентная заявка от 24.10.2012 «Способ оценки риска сердечно-сосудистых заболеваний», регистрационный номер № 2012145160

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

апоВ-100 - аполипопротеид В-100

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГЛБ - гидрофильно - липофильный баланс

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФБ — изотонический фосфатный буфер, рН 7,4

ККМ — критическая концентрация мицеллообразования

ЛНП - липопротеиды низкой плотности

ЛВП - липопротеиды высокой плотности

МДА — малоновый диальдегид

МПО - миелопероксидаза

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЭГ - полиэтиленгликоль со средней мол. массой 6000

ТБК — 2-тиобарбитуровая кислота

Х-ЦИК — холестерин, содержащийся в циркулирующих иммунных комплексах ЦИК - липопротеидсодержащие циркулирующие иммунные комплексы цммЛНП - циркулирующие множественно модифицированные ЛНП ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Abstract

Melnichenko Alexandra Alexandrovna The Mechanisms and the Role of Atherogenic Modification of LDL in Atherogenesis

In most industrialized countries, cardiovascular disease (CVD) takes the leading position in the structure of morbidity and mortality, and leads to escalation of health care costs. Atheroslerosis is the primary pathogenetic background for the development of most cases of CVD, including acute myocardial infarction, chronic heart failure, stroke, and peripheral arteriosclerosis. This study was undertaken to elucidate biochemical mechanisms, which lead to atherosclerosis development, namely, atherogenic modification of low density lipoprotein (LDL). It was shown that MDA-induced LDL modification, as well as the treatment of native LDL with proteolytic, lipolytic and deglycosilating enzymes lead to substantial changes in protein, lipid and polysaccharide moieties of LDL particles, and promotes self-association of the modified LDL. Native and in vitro modified LDL differ in spatial arrangement of apoB-100 on the surface of LDL particles, while naturally occurring modified LDL demonstrate another pattern of apoB-100 arrangement. These differences explain the increase in hydrophobic properties of in vitro and in vivo modified LDL, which, in turn, promotes self-association of modified LDL. The effects of several block copolymers of ethylene and propylene oxide (polaxamers) characterized by different hydrophilic-lipophilic properties on LDL association were studied. Moderately lipophilic polaxamers (P85, L64 and L61) inhibited the process of LDL self-association; on the opposite, highly hydrophilic polaxamer F68 produced no effect on LDL aggregation.

Since in vivo modified LDL possesses high antigenic properties, it induces the production of anti-LDL autoantibodies followed by formation of LDL-containing circulating immune complexes (LDL-CIC). In the two-years prospective study performed in 98 asymptomatic men aged 40-74, it has been shown that the increased level LDL-CIC has a high diagnostic and prognostic significance in subclinical atherosclerosis. In this study, the rate of atherosclerosis progression was estimated by high-resolution B-mode ultrasonography as the increase in intima-media thickness (IMT) of common carotid arteries. Among all baseline lipid parameters, only LDL-CIC and LDL cholesterol were contingent with the extent of early carotid atherosclerosis. The increased levels of LDL-CIC, total serum cholesterol and LDL cholesterol had similar prognostic significance with the respect of atherosclerosis progression. The normal level of LDL-CIC (below than 16.0 ng/ml) was the only lipid parameter that predicted the absence of carotid atherosclerosis progression for two following years at prognostic value of 78.3 %. The results of clinical study allowed assuming that LDL-CIC level is not only as a marker of early atherosclerosis, but also has a sufficient prognostic value for clinical implications.

The automated test system designed for diagnostics of subclinical atherosclerotic disease based on quantitative measurement of LDL-CIC level and other lipid parameters was developed.

Подписано в печать:

26.11.2013

Заказ № 9227 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 vvww.autoreferat.ru