Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Митогенные факторы микроорганизмов и их роль в развитии противоинфекционного иммунитета

18 3': Р. "

АКАДЕМИЯ МЬДОЯЦНСКИХ НАУК СССР НАУЧНО-И ССКЕДОВАТЕПЬСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОЕОГО КРАСНОГО ЗНАМИМ

институт эпидемиологии и кикговиолоп®

ИМЕЛИ ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА II.«.ГАМАЛЕИ

На правах рукописи

ПРОНИН АЛЕКСАВДР ЕАШЛЬЕШЧ

МИТОГЕШНЕ ШТОРЫ МИКРООРГАНИЗМОВ Ч ИХ РОЛЬ В РАЗВИТИИ ПРОтаВСЯНФЕгаЛОШЮГО ИММУНИТЕТА

14.0Э.Э6 - аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктор« биологических наук

Москва - 1990 г.

Работа выполнена в Научно-исследовательском ордена Трудового Красного Знамени институте эпидемиологии и мик] биологии имени почетного £_дцемика Н.Ф.Гамалеи А!ЛН СССР

ОфишалънЕе оппоненты:

члем-корресиовденг АМН СССР, профессор Б.Ф.СЕ.1ЕН0В

4 доктор биологических наук, профессор' А.А.МИХАЙЛОВ

доктор медицинских наук В.В."03ИНСЕй

Ведущее учреждение: Институт иммунологии Минздрава С

/Г /9S ?

Защита состоится "AJ" is199 /г.

в__часоэ на заседания Специализированного совета

Д 001.С. 01 по заадаге диссертаций ка соискание ученой creí доктора наук при Научно-исследовательском институте ьпадемиология и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи ЛШ СССР 1123098, Москва, ул.Гамалеи, 18).

С диссертацией мояно ознакомиться в библиотеке ШЭЛ игл. Н.Ф.Гамалея АМН СССЛ

Ученый секретарь

Специализированного совета доктор медицинских наук

Е.И.КОПТЕйОВА

. ОЩЛЯ /APAKTSPI'iCTKLA РАБОТЫ

' Актуальность пгюблеглн. Согласно клонально-селекцпоЕЕой теории Ф.ГорНста внедрение в организм хозяина патогенного еткрооргапп:»:а ДСЛЗНО приводить К ИВДуКЦЯЯ СПеЦИ&РЖЫХ к дакншу ЯН$6ХаСОНН«5Г "агенту клонов лимфоцитов. Однако реально kj. первых э.агш иг.иук-ког^ ответа активируется широкий спектр ¿мл/нокомпегенгких 'Lieтек. Отчасти 3'j.j связано с экспрессией ьа поверхности кгддого микроорганизма целого набора антигенных детерминант, отчасти - о тем. что микроорганизм!! содержат '5акторц, вызывающие неспецяфяческую зкти-запмю лимфоцитов - митогеннке факторы (Ш>).

Относительно роли Ш в патогенезе ян^екцконньх заболеваний существуют весьма противоречивые сведения. Нэкоторые исследователи {Cironowita Б. et al., 1974 ; Cout=i.:jho А., I960; Guilberg И., 1987) считают, что лимфоциты имеют особое рецепторы, сиоцфтшиз к наиболс. древкам к аирскораспространенпьм структурам мяхрооргакизмоз, и ре-агашя с ними соответствующих лкгандов вызывает поликлокадьную стимуляцию лилйоцятов. При этой предполагается, что ¡«¿5 обеспечивают быстрый и интокслбкий ответ организма на внедрение т/кородаого агента (Petit J",-С., Vnannis S.R., 1974; Clark BJM Lerîbottev .T.A., KC6). Кроме того, рекрутирование значительного количества низко-а$фкнкнх лин^оцитоз является предпосылкой для созревания куцуйо-компетенткш. клеток, сопроэояваэдегося позшюяивм их аа«5ааитвта (ïonaца-'а s., 1988). С другой стороны имеются сведения о том, что стн:.ул.щая лимфоцитов МФ монет вызвать ]\аззятяэ аутоиммунного процесса (Лямперт II.М., 1977, IS88; Fripai I). et al., 1977), ивдуцк- . ровать в иммунной системе нежелательные сумы Шестеренка В.Г., IS86: Kamblin i.-s., 1988). Не исключено, что сильная, запредельная активация иммунной системы ¡-ЛФ является одним из механизмов, сбеспечивашлх ускользание патогена co защитных сасгем хозяина я перенате.кц *к> везоудптеля. Подтверждением служат данхко о мптоген-ной активности такт; общеизвестных факторов паютзнпости, как эндо-, экзо- и энтеротоксады (Маянский АЛ1., Клашн Б.Л., 1978; Маямокий А.Н., 19 SO ; Frank S ot al., 197*7), геио- и стрептолмзлны, белок А, лкпополиоахарядц (¿¡L'C), коклюшный токсин (Brader В.H. et al., IS77; Бакане 3?., Greer J., 1978; Gray L.3. et el., 1989 ) К ЕР»

Г.'.'.сктднеся в литературе данные показжавх, что №5 выявляются

как у патогенных, так к у иепатогенных бактерий (Маянский А.К., 1930; Ariizuai К., 1986). Тем не менее, в некотор_л работах показана прямая связь патогенного эффекта с наличием МФ СйаяшаецЫег Ы.Ь. е'г I., IS84; Cole B.C. el; ul., 1562, 1983) . Засчитает отдельного рассмотрения и гот йакт, что многие хороша изученные МФ связываются либо с молекулами главного-.комплекса гистосовместямосгк (иа^ог iiiitocoiapatibility complex - МНС), либо с другими прадсгавитолями суперсемейства имиуноглобулкшодобннх молекул (Bcalzc Д. А., ¿ndere Ё.М., S935; Cole B.C. et al.t 1982; iemeJ.d 3., 1989). С:учайна ля а та связь? Хорошо известно, что Т-ллеяки распознают антигены только в комплексе с молекулами МНС (йеномен МНС-рестрикции) (.см. Брокдз E.J 1937), прячем Т-хелнеры, как правило, рестриктир зани по 1а элтй-геяам (антигенам ШС П класса), а цнтотоксические Т-ликфошты - по антигенам "ЧС I класса l Zinkernagel Е.и., 1973). Почему возник такой механизм узнавания антигенов Т-кяеткамд и имеет ли он отно- .'. шение к МФ, активно связывающимся с молекулами ШС?

Кроме этих часто теоретических вопросов, изучение Mi может иметь ваянса значение я с практической точки зрения. Известно, чтс наиболее капрженный протекгдвный иммунитет развивается в тех случаях, когда он индуцируется неизмекеннши детерминантами патогеннос-ти, эк&лрессярованнши только у вирулентных штаммов возбудителя. Именно с эта мокет быть связана большая эффективность постинфекпи-оикого ишушпета по сравнен®) с поотвакцинальнш. Стимуляция ик-тактннх лимфоцитов ия витро $актсра\ш патогенноети (или МФ в комплексе с Факторами яаюгешшети) с последующим отбором протективных Т-клетэчнкх клоноь и введением их исходному донору - один из теоретически возможных способов создания протектквного иммунитета, сравнимого по напряяенностд с постайекщюнкнм, бээ стадия заболевания.

Цель с. задачи исследования. Цель рабом состоит в том, чтобы выяснять, способствую? или препятствуют {,!Ф развитию специфического протекторного пммунитатг при инфекциях с разными типами паразитизма и на основании получение: данных псшгаться объяснить причины длительного сохранения в процессе эволюции КФ, их пре/ллуцествеккой ассоциации с молекулами MHO.

В соотвегсазий о этим, в основные задачи работы входило:

I. Исследовать штогеннузо активность препаратов, иолучакнгес от янйекшюнтге агентов, различаемся по вчруденткос«х и сяссоС-нссти к внутриклеточному ларазятязля, зозшлшуг связь мезду млто-генностоЮ и патегейкоегь», а ?акке причины отсутствие митоганнс.. активности у рила микроор11опйзпев.

2. Изучить Функциональную активность клеток, стимулированных ин витр">, по способности оказывать сулрсссорнсо или хелперное действие з различию: системах паразит-хозяин, установить законсмэрнос-ти активация лго.йоидннх клеток по супрессорному или хчлперко'лу пути и проанализировать возможные последствия такой активации для организм.

3. Исследозать действие № в условиях ян биво и вияенить, существует ли связь чевду степенью митогенностя я специфичностью эзвива-ющогося ответа, а также мезду митогеннозтью и илмунсдепрессивнш действием инфекционного агента.

4. Провести сравнительный анализ мыве? с медленной гриппозной инфекцией на линиях C57BV" и CSA, различающихся по чувствительности лимфоцитов к гомогенному действию вируса гриппа, с целью обнаружения кклунапатологяческях расстройств, езязанша о. кеслегуйяческям мятогеинш. деЁствяем вируса.

5. На основании полученных данных и анализа литературного материала попытаться ctóoсталировать гипотетическую модель, описывающую механизм появления к сохранения в процессе эволюции ижунной спстемн млтоганнък факторов и их роль в индукции противоппфекшенно-го иммунитета.

В работе ьиявленн к охарактеризован»! kobhg мятогектн фактор^ - А-зависю.'Шй, т/вствительш;"; к тргпепну Т~клеточкый мктох-ек M.artii- • ritidis с молекулярной массой 23-27 кД а гачакгозоспевдпчгооскай jiCtv-iMK s.gigantea , CD'i'h Т-клетки. Показано, что в

интимной бактериальной культуре УФ часто находятся в заблокированном состояния (например, иоля-3 антиген брушда) либо их активность компенсируется действию комлоисагов с протпзололо;шш свойствами ( токсн саркоспоридий, аргшппгдоса'.м.чаза микотглазм). На основан:::! этих данных предложен дкхакизц регуляции гзашодо^езгая в система паразит-хозяин, обесавтяъжъаИ длятельнуэ перскстекцию микроорганизмов.

Впзрзыа вроелсиега связь мззду способность::) !.ÍS микроорганизмов акиоирозать супроссоржо ала хелпоряне клетки и остротой внзываьмо-го этими микроорганизма™ .инфекционного процесса. Установлено, что быстрое удаление кнссекцяонного агента из организма коррелирует с активацией под действие?.! этого ий$екщ'.онйого агента хелпзрнкх меток.

На примере ряда лягионеллезнвх препаратов показано, что специфичность пролзйера'лшно? активности тленных лимйоздннх киаток кахо-

дится в обратной зависимости от уровня митогенной активности вводимого в организм антигена.

Впервые установлено, что бактериальные препарат, оказывающие сглъное мигогенное действие в условиях ин вктро, н ранние сроки пос ле введения в организм вызывают развитее иммунодепрессии.

Впервые проанализирована связь между протективдостью антигенного препарата к его митогенностью и покаьано, что протективные пре паратя, ь отличие от непротемквюк, оказывают митогеинов действие на лямфоидиые клетки.

Проанализирован иммунологический статус мышей с медленной гриппозной инфекцией я установлено, что одной из причин яыкуподеп-рессйя, связанной вероятно с штогеннш действ.-м вируса гриппа у ак?;иаирозанных животных, является индукция суирессорных клеток, подавляюг-ос продукцию интердзйкика-1 и не действующих на продукцию интерлейкина-2.

На основании полученных в работе данных сделано заключение о тол, что Щ определенного инфекционного агента активируют преимущественно те популяции лшЗоаднкх клеток, которые выполняют основную защитную функцию при вызываемой ш янйекщш.

Предложена гипотетическая модель, объясняющая причины возникновения МКС-рестрикции в связи с типом, паразитизма .инфекционного агента, при изы длительного существования в.процессе эволюции мито-генных факторов и их роли в форляхлшаняи цротехдашного иммунитете..

Научно-г актическая значимость работы

В работе теоретически обоснован и получил первое экспериментальное подтверждение новый способ вакцинации, суть которого состояв в активации лямйоддных клеток ингактккх доноров в условиях ш витро живыми или инахтявироваяныии щадяпдали методами инфекционными агентами, содержащими КФ. Последущее введение исходному донору ахтиви-резанинх ЛИГ.ЙОНЯТОЕ, оезобогдешшх от антигенного материала, позволяет в нудный момент создать протектявный иммунитет без инъекции чужеродных бактериальных компонентов. Метод позволяет: а) получать лимфоццныв клетки, специфически реагирующие на неизмененные факторы патогекности, введение которых в организм небезопасно; б) проводить закцинацию в отношении тех инфекций, для которых эффективные ваздшш отсутств^т; в) производить вакцмнацию в течение суток я только в тот момент, когда возникает реальная угроза заражения или на ранних стадиях ¡даоекцки.

Данные с высоком протективног« действен бактериалышх прапара-

тов, обладающих некоторой штогенной активностью, позволяют рекомендовать тест на митогенность в качестве одного из методов первичного скрининга вакцинных препаратов.

Изученный в работе митогэн еарксспорпкй, cti-d.q .лрувдяй только cdu'1" Т—icietkíí, монет быть использован для направленной коррекции кпунодей...л1тов по хелперпнм клеткам ишаржер, при СПИД?. в коглплек-се с методами удаления вируса из организма).

Дашшо об обнаружении при медленной гриппозной инфекции суп-рессорных клеток особого типа, ингибирующих продукцию интерлепыша-!, и данные о восстановлении активности лимфоцитов таких яивогных после удаления супрессоров и замени A-клеток, могут быть основой для отбора детей с аналогичной патологией я направленного поиска средств пгядуноксрвэкции при медленное гриппозной янфекшт.

Анализ воздействия на {диунокошегентнне клетки ряда с'актзри-алькнх препаратов позволяет рекомендовать некоторое пз них ; например, цитолизин легяонелл, ^ЕПА) отдельно ид;: в комплексе с ¡садио-модулятора?«! в качестве компонентов вакцин.

.'.¡етод определения I1E-I в 'сункййональном гесте о использование;* !.iAC позволяет использовать вместо дорогах «изей лы;m: СЗК/BeJ, не отвечающих на ЛПС, болеа дсетушак ата>гашс ллнна C573I/G, кв рес-гдруэдих на НАС. Способ получения КонА-Сл^стов с пог.;сяы> Koi-A-ceîa-розн дает возможность быстро освобождать клетки от ¡.'.итогена при тестировании биологическсч-актитпсстп ИЛ-2 я уровня экспрессии рецепторов к '.'Ji-2.

Аппобалвд. Диссертация апробирована на гокфероццаи отдела кл-муиояогия ЬП'ГЛЗМ игл. И.О.Гамалеи MZ СССР 29 января I9S0 года. Основные положения, вопедь-яо в работу, были долояекн я обсуждены на 20 ?ле.7,дун?'гадг:к:с1 всесоюзных и региональных кон$ереш:;;ях, симпозиума:;, заседание науччкх обществ, перечень которых приводен в конце, автореферата.

~ублпк.'-тг-;и. Основные положения диссертаций опубликованы в 4С научных работах-

Структура и ооъем дяссмзтапгск. ' Работа напилена по традиционного плану л включает сл^дутдие разделы. "Введение", "Обзор лктера-турк" у 2 главы), "Соо'стзепнне (гсследо&агг.те" 15 глав). "Обоузденпе" "Зкзодн" г: "Cunee;-: литературы" (707 источников, ъ том числе 101 работу стечзстБзкных авторов). Общий объем диосертатгли 310 страниц.

COßSPSÄtMS РАБОТЫ • £• -атераалы и методы исследования I.I. .'Уитеовад работы

Ыикоплав'ж. М,arthntidis PG6, A.laidlawii, ü.fenaantan'-, Ii.pneumoniae, и. urealitioua были выращенк в лаборатории шкоилагм а 1/~<рорд1 бактерий (руководитель - акадешш АМН СССР, профессор С-В.Прозоровский). Аьтитеннио препараты миколлазм к L-форм бактери! бь-'ли гюлученч с „к. с. ласор.мпкоплазм и Ь^рорм бактерий Л.Г.Гориной.

Bordfcieiia pertussis . Антигенные препарата бордетелл (лташ 305, серовар 1,2.0) онли получены с.е.с. лаборатории коклюша и дру-сордетеллеьов (руководитель - д.и.а. И.А.Лаггдева) К Л.АмалмкоЗ. ЛПС в.pertussis бнл получен водно-феяолькой экстракцией :.aiK-podHtÄ клаток с.в.с. В. Л.Львове,: (лаборатория хила и бактериальшд: антигенов, руководитель - дроф, Б.А.Дматри0в).

Ксктаийки ток си г: (KT"! пол^че*: И.А.Лапаевсй О': проф. C;»t о J. (.tnih-'v) . Определение наличия лейкоцитолеммулируащаго фактора :: лрстектиБной. активности исследованных препаратов лроводилось з лаборатории И. А.Лаг целой ка иышах сь яга массой 16-20 г., которым внутривенно азедкла 0.2 ».¡л препарата.

Bruce IiагаЪогЬия . Бруцеллезный протективний белковополисаха-piViFiiii' антиген (БПА) получен д.м.н. Е.А.Драновокой. (лаборатория бруцеллеза, руководитель - к.м.н, В*А.Рубина) из s-фрм бруцелл ( з.аЪогЬуз, атамм 39) уксуснокислым гидролизом вксушенчих ацетоном микробных клеток (Дранозская Е.А. и др., 1385). В ряде опытов БПА зблучаяк в дозе I мР. ч

Брупе'-лсзннл ЛИС полусен с.к.с. З.Е.!&ликовш (лаборатория бруцеллеза) и.-тодом водно-лянольной экстракции бактериальных клеток (Львов ВЛ. и соавт., 1985). Т>р°паратн полисахаридов, жидка А я . ЛВС B.uclitensis , а гахве подг-В антиген, цмаличесхий х-локан и ре-копструирогяниый поли-В антиген (Л00 бруцелл, обработанный циклическим глкжа^ои) бьагд предоставлены с.н.с. В.Л.Лы?о.ьым (лаборатория сл'жк мчлробнкх антигенов).

- If^ionslia prsi_Tj-.ophiIa . Ehra мм Philadelphia 1 первой серогруя пы, мугантпкй штата, а также препараты легионелл сьли солучеян в лаборатории яесионзллсза (рукоьоднтзлъ-д.б.к. И.С.Тартакозекий). Поре; цо&аплеяг.еи в культуру бактериальная взвесь прогревалась при 1С0°С в течение X часа. ЛПС легионелл был получек Б«В.Еруслаиов1йл яо методу cit-.?hev- а.к. (1982). Цитолизин легисчелл (молекулярная пасса ->'? ьД> выдолзн и йхарак'серазоваи к.ал. Ю.ф.Бёлнм а гсаат. (1936,

1288). Основной белок внешней мембраны легионслл с ьюлехуллраой массой 29 кллодальтон выделен а очищен с..с. А.В.Радионовым (лаборатория химаи микробных антигенов).

Другие бактериальные препараты. В работе такхе испсльзовакц •ЧадссадоЧЕКО КЧДКОСТИ ИЗ культур Pseudomonas aeruginosa, >?roteua vulgaris, Escherichia coli, Clostriüiua defi-J.le, Klebsiella рлечло-nlas . Все указанные препараты получены а лаборатории оптйко-фнзаче-ских.методов исследования (руководитель - к.м.к. К.И-.Самойленко). Белковый антиген Р.aeruginosa выделен А.Д.Александровы!.

Ваоус гриппа А, шташ. ИБН (ЯДН) поддергивался нг =-дневных куриных эмбрионах с.н.с. Е.П.Марчияк (лаборатория латентных инфекций, руководитель проф, В.А,Зузв). Использовали алдантоасауз жидкость, содеркащую актакткый вирус :'_".а за; ;>с, инактивирозакный облучением з дезе 1,8 Кр, в концентраций 2ü гемагглйтанирувт&х единиц

в I МЛ.

Sar'.oaystj в Ricranteg . ?&крйпасту сгриоспоридай В1щелеяк аз мыац падевода а Институте микробиологаа Уядьерсдтета им. А. .Гумбольдта (Берлин, ГДР) Х.-Ю.Тктцем е Т.Моктагом. Галактоза-специфический лэк-тин (СИ) саркоопоредкй выделен из СГЭ Т.Моняагса ка айсакчцх колонках с сепароыом Н ЮОО-гал. Токсин саркосиорждай (СГТ. зидйяез аз СГЗ на.колонках с сеаадехосм С-'!со.

. Зивотный. В работе использовала слздуэдпе зады глвот.та:, полученных из I иомника "Столбовая" ¿Ш СССР: мып:е£ лчз:»й G3A, £57ль/6,

ВАТдБ/с, DBA/2,AS1.,BI0. Вгч.обоах ДОЛОВ ВЗСОМ 16-13 Г, Г.рЬ'С ЛПЯйЛ Вастар а Август обоих полоз зесом I20-1*0 г, морская сз/.чок о бокс полов массой до 200 г и кроликов породы каяшалла несом до 3 кг. Пупованнузс и донорскую кровь брали з аланяхе "Шарите" (¿ерлав, ГДР), Мышей СрН/Не-Т , не отвечающие на ЛИС, иолучалл аз иитомыкка Онкологического центра АШ СССР.

1.2. Оснозкые методы работы

Наделение популяций лимфоцитов, обогащенных Х- и Е-кгзткама, производила на колонках с нейлоновой ватой. Для удаления T-iae:?o;-; суспензий обрабатывала монокденилгнима а^а-ателама аоотал £нтах-а:-а Th.y-1.1 фзрмы Besten Dickinsoji (Ci-IA) а комплементом. В качестве комплемента асгсльзозагш. оаааротф' кроляка, проверенную на токсичность я адсорбарозаануа низкотемпературной araposoi.

3x10° клеток суспендировали в 0,1 мл анти эл а анкусаровгла 45 мднут при 37°С. После окончания срока гнкубацйз суспензию ц нтра-фугировала, суг.еряатант отбрасывала, а осадо:-: ресусазадаровала ь о:-;-

- а -

воротке кролика, разведенкой 1:5» Затеи клетки, вновь инкубировала 45 минут и промывали при 4°С СЦ 'среда центрифугирования - среда ,'з 129, 5 % эмбриональной сыворотка, 10 мМ HE5ES, 50 мкг/мл гента-мцакз).

Измекоаве кот^ентоации А-клеток» Для удаления макрофагов к сус-п&наьи оялеаоцитов добавляла карраганан фирмы Серва (ФРГ') аз раоче-га 200 мкг/мл и инкубировали суспензию в течение 1 ч при 37°С. Трижды промывали клетки СИ.

В ряде опытов сплэноцаты для частичного удаления A-клеток инкубировала 2 pasa по 30 ша на пластиковых чашках Петри диаметром 10 см (100 млн клеток на чашку в 10 мл) или 1-2 часа в культуральяых МЕкрошкшше.тах с плоским дном (500000 клеток а*, лунку в 0,2 ыя среды

Обработка митомици'ном д облучение. клеток суспендировали в I ш С, содержащей 50 шо1-матошцина С, и инкубировали при 37°С з течение ЗС даяут, после чего суспензия троекратно отиыаали СЦ. '

При постановке смеваниой культуры лимфоцитов а стимуляции. Т-кле точных линий Ядерные клетки (стимуляторы) облучала в дозе 3300 рад на установке ЗКУ-П.

Определение числа ига* тюцигов. Число тиыоцитов, имеющих рецепторы к агглатиниау земляного ореха, определяли следувдим образом. 4хЮ8 тамоцятов в I ид смешивали с равным объемом раствора (I мг/мл в JSP), инкубировали 10 мчнут при.комнатной температуре. Проинкубированные клетки наносили на раствор 20 % эмбриональной телячьей сыворотки (16 мл) в пробирке с круглым дном и еще раз инкубировали при комнатной температуре 20 минут. рка+ клетки собирали со дна пробирки, а ни" тимоцати - в иатерфазе. Для разрушешя агрегатов TRK* тиыоциты промывали 0,15 M D-галактозой и инкубировали в том же-растворе 20 минут при комнагпой температуре.

. Постановка реакции бдасттраносссрмацай <РБТ). Для постановки РБТ готовила суспоизио лш/фзидцих меток в среде культашроьанил (CK): в среде RPlîl 1640 с 5-IC % эмбриональной телячьей сыворотки (Флоу, Великобритания), 10 Ш iffiSBS , 2 мМ ь-глутамава, 5x10"% 2-меркап-тоэтанола и 50 мкг/мл гентамициьа.

Инкубацию осуществляла в 96-луночншс шише таг различных ферм (Linbro, Costar, Balcon Plástico, США; Яхшс , Дания). Б каздуа лунку вносили до 250 ?ыслч клеток. При исследовании яеспецифической Л1Х).ид$зрац1ш îjictok под действием китогенов время инкубации составляло 48-60 часов, при. исследовании специфической пролиферации под дейстяиен специфического антигена - 96-120 часов.

Инхубэциа производила з С02-иысубаторе фирмы яегаеиа (Кэдер-

ндц) при 5 % С02, 90 % влажности и 37 °С. За 16 часов до окончания рока инкубации, в каждую лунку вносили по X мкКи 3Н-тимвдияа с уде-хной активностью I кИ/Ш з обьеиа 5 шел.

Меченые клетки .переносили с помощью ха4 тестера фцяш Флоу (Ве-[ияе 'ританая) на стекловолоишстке фильтры gf/c (Ватман, Великббри-:авдя). Подсчет радиоактивности осуществлял на сц«:тилляционн шт. 3 -спектрофотометрах Mark III(США).

В качества неснецяфическкк штогешшх препаратов использовали :онканаважн А в дозо 20 даг/мл (КонА, Сигма, (Ж), фитогемагглэти-шн Р (з дозо 0,5 шл/т (Дгфко/США), липецолнеахарид к.coli ; )III :34 в дозе 100 мкг/ия. (^гфко, США), дакстрансульфат в дозе >0 мкг/мл (Сервй, ФИ?).

Одредёление продукции иктерлеакина-2. Тестируешгэ клетки <п.-вдт-таровали в течение 50 часов КонА или другим млтогелом), поело чего 5обиралл культуралышй су па она? ант, который замораживали и хранит три -70°С. Часть суперкатакто?. предварительно даализоЕ&ли против ЗФР. Частичную очистку сунернатаньоз проводили на колонкам ß TSK--гелем Ш50 (Япония), уравновешениях раствором-Хеккса (размер колонок 25x2,5 6м). В качестве тест-сестеш использовали КонА-бласта иди перевиваем пктерлейкин-2-зашси1уа линию ctll-2 .

Получение КонА-блаотоз. Спленоцати «шей или треках свиеок сти'ф'ларовали в течение 3-4 суток КояА или КснА-свфарозой. КонА-бда- ' о га осЕобогдаля от клеточябго детрита центри^гггероваясем, нодзчиты-вали число аавых клеток, разводили их CK я разливали сусшзнзлп по i 40000 клеток в 96-луночиые планшеты. К клеткам добавляла теошруе-мнЗ супернатанг в различных разведениях и ОД Й «¿-гаткшанноздда для блокирования активности оставшегося КонА.' Планшеты с КонА-бластами инкубировали в СО^кикубаторо в течение 20 часов. За 4 часа до окончания зыкубации в кадзуэ лунку вносили 2-4 ккКв %-тиш1дяиа в объеме 10-20 ыкл. Подсчет радиоактивности осуществляли таким на способом, капе н при постановке РБТ.

Клетка C2I&-2 поддергивали в CK, содержащей 10-20 единиц ИЛ-2 в х мл, шняясреду через 2 суток. Исходно з флахен'па 50 мл вноси*i 50-100 тнелч клеток в объема 5 т. lfm тестирования активности К2-2 культуру CTLti-2 промывали, подсчитывали количество нтавих клеток, . разводили суспензшо в СИ и разливали по лункам 96-дупочнкх шшкше-тоб (10 тысяч клеток на лунку объемом 0,2 мл). •

' Функциональная оценка экспрессии, рецепторов к ИД-2.

Для оценки экспрессии рецепторов к ИЛ-2 zccxeßyewe клетки стимулировали тем или инум актегеном или митогокои в точение 3-4 су-

ток. Затем клетки промывали СЦ, разводила суспензию в СК и разливали со лункам 96-луночных планшете -> (40 тысяч клеток на лунку} . В лу* ки вносили стандартный препарат Ш-2"(Ш-2 фирмы "Сигма" США или реке. пикантный человеческий ИЛ-2 произвЬдства ШТК "Бкоген" ИОО АН Латв.ССР).

Вре.'"н инкубац&и составляло 20 часов. Уровень пролиферации определяла так soк ai: и npz тестировании активности ИЛ-2.

Определение- активности ИД-I» Для получения сунернатанта, содержащего ИЛ-I, клетки перитонеапьного экссудата'или спленоциты (нефрак ционированЁыз жж A-клетки селезенки) отполировали в течение'16 часов ?итогенами. Супернатанты хранили при -20°С. В качестве стандартного препарата ИЛ-1 был использован ILC-I, выделенный кз культуры клеток Pjeai'i .стйьулпрэваннкх форболшристатацетатом. Препарат был получал с.н.с. Г.А.Головановой (лаборатория клеточного иммунитета, руковоi тель - д.б.н. А.В.Сакин).

Тестирование активности И1-1 осуществляли на тямоцатах. Дня су-дернатаптоз, полученных поело стйьуляции клзток ЛИС, использовали -га моцитн гдгпей cjH/EeJ , не отвечающих иа ШО, а для супернатактоз, подученнкх после епщуляпди клеток ALAG - тимодиты мшшй C57BL/6 , Ее отвечающих на этот шюген.

500 тысяч тидацитов иякублровалп вдасте с тес тиру еглзм супарна-тактом и ФГа (0,5 мкл/юх) в 36-луночных планшетах. Общий объем среды в лунке был равен 0,2 ш. Бремя инкубацки составляю 3-4. суток. За 16 часов до огончашя культивирования з.каздую лупку вносили пс I мкКи 3Д-'шлидана в объеме 5 икл (удельная активность I кЦ/кМ) > Подсчет радиоактивности осуществляли как описано ранее."

Постановка смазанной культуры лиу#оцитоб (СКД). 3 части опытов была исслэдована реакция з СКЛ. При постановке*однонаправленных СКЛ стимулирувщиа клетки (750 тысяч - I миллион яа дукку 95-луночного планшета) облучали в дозо 3300 рад'и смешивали с 250-500 тыс. отвечающих клеток. Культуры пьл'убировали в СК в течение 120 часов. Пролиферацию оценивали, как описано ранее.

Постановка цкготокоичеокого аффекта иммунных лю4югатсв

Подготовка клеток-мишеней. В качестве клеток-мишеней использовали перктокеальныб макрофага, которые метили хромаю и натрия, со-дергащш 51сг . 3 ка. дую лунку 96-луночного планшета вносила по 50-100 тысяч живых клеток-маленей. Планшеты инкубировали е течение I суток, после чего лункп промывали подогретой СЦ. К промытым клеткам-шеенятл добавляли 0,25-1 миллион спленоцитов или лимфоцитов лим$ати--чеок«;-: у плев и клкубиройаш шанаеты ещэ 4 или IS часов. После окон-

чания срока инкубации надосадочкув япдкость из каздой лунки переносили в пластиковые амдулн я просштивали радиоактивность на {{-счетчике Магс-П (Нлдерланда). Цатотокслческий аффект определяли по

формуле: ЦЭ = х 100, где а, ъ и с - активность изотопа соот-

ветственна в культурах с тестируемыми лимфоцитами, с додэцилеульфа-тоы натрия и с СК.

Иигибицая миграции макрофагов и лейкоцитоз. Тестируем!*- клетки трявдз промывали СЦ и осадком заполняли капилляры с внутренним диа-мзтром 0,2-0,5 ш. Капилляра с клетками разрезали на отрезки длиной 5 ым, которые помещали на дно лунок Уб-луночщк плаииетов одпим концом к краю лункп. Лушп. предварительно заполняли СК и тестируемым антигеном или без неге. Планшеты инкубировали в СОз-иккуб.теоре з точение 16-16 часоз, поело чего кзциллярц из лунок убирали, а зоны миграции переносили с помощью аппарата ,:.:/дг.рофог" на бу/,'.агу. Прочей, ингибицки миграции вычисляли по формула: ИМ - ах ICO, где а п - вес гон мзграцап в лунках без антигена (а) или с антигеном ( ъ).

Определение числа антителопродтцптопопегх клеток прог.-.г.одали по методу Jerne Я,К!., Hordin А.А. (1963).

Хелпвряые линии, специфичные к «ЖЩ, получали по методике К.Мар-апиец и соавт. (1983). tóurcaft СБА иммунизировала в основание хвоста снягеннылн еплейбциташ, галгенизированныьзг ФИ1Ц. Через 4 суток зосле ;íтипизации у ютвотньк.'забпради регионарные лимфатические yam и селезенку. Сплепоцпты облучали в дозе 330D рад, освобождали от эсктро-. шзтов п гапго;п1?ировеж ФИ2Ц. Клетки лимфатических узлоз триздц про-т ' мьвали и росуспендировалл в СК или в полной сродо Xscove . Получен- ] ные суспензии скааивали и разлизали до пластиковый культуральзым флаконам ( Falcon Plastics, СНА) и инкубировали в С02 инкубаторе. Через 7 су .oí-: о суспензий отбирали: л добавляла в каядай флакон по 3 мл свег.сн сред» с 20 миллионами ешц'епннх гапхенизирогапных а облученных сцлэноцптов. Отсбранпив клетки использовали для постановки опыта или замораживали в жидком азотаг как било■ описано,вше. К} ль туры использовали т ранен чем через месяц'посла* нетала инкуб -v-ции, когда в ;.с:в:;х остслзглкоь только Sby-I -позитивные клетки.

Достоверность лодученал: результатов'отпивала с пошяью.критерия Стыдента. При исследовании зависимости хфемжфврацая "от кондент-рацик клеток для наядой суешнр.пп ,'нахсдчла 'формулу' линейкой регрессии. Число различных типов клеток, лидаглрудасс пролифзрацша.опрс— дздлли из годом, тфедяоавяным ОДвхвеа «.'J. (19S2)...

* • •

2. Результаты исследований и тс обсуядеш. • 2.1. Сравнительный анализ Ш

Ш> 'обнаружены практически во яе.ех исследованных сеызйстЕах и даже родак бактерий .вклотач иатогешшз и неиатогеняш для человека виды. Очевидно, что поликлоналънач стиг.уляцяя большого количества клонов лимфоцитов может иметь для организма хозяина как полодитель-. ные, так и отрицательные последствия. В тел случаях, когда вызвавший инфекция агент разшокается в фагоцитирующих клзтках, принципиальное значение имеот активация ма'.рофагов. Для зкстраклеточных инфекционных агентов псликлональная активация, по-видимому, менее важна, поскольку в этом случав макрофаги фагоцитирую? микроорганизма даке без дополнительной стимуляции,-

При .сслодоваваи активности целого ряда микроорганизмов, принадлежащих к рэ^тачныы таксонам, относящихся либо к вне-, либо к внутриклеточным паразитам, было установлено, что в целом внутриклеточное инфекционные агенты активируют лтафцаты сильнее, чем внеклеточные (средние индексы стимуляции равны соответственпо 5,13.±0,27 и 1,46+ +0,46). Мнколлазыы, паразигируавде на ыеьйранэ клетбк'хозяина,' Занимают промежуточное положзнио (средний индекс стимуляции 2,92+0,43). Однако отсутствие реакции еще'на означает отсутствия ?<Й в бактериальной куль-хурэ. Низкая датогенная активность шкет быть связана, а частность , с видовыми и линейными различиями в чувствительности к д&шо.'.'у виду »ккрооргакпзшв. Так, у кроликов, шлей 0573L/G к,пи ВЮ.Ег. , В ОГДПГЧЛО ОТ i/шай ДЙУГЖГ ЛИйЛЙ И Крыс, ii.arthritldis 9 не только не стимулировала лимфоциты, но и угнетала из. пролиферацию. Аналогичные данные была получены для L.pneumophila , и S.gigaatfa и вируса гриппа А (щтаад tksh) у мышей СВА, лимфоциты которых баз предварительной сенсибилизации ко реагировали яа эти микроорганизмы (таблица I).

йцэ одной причиной отсутствия мамганного эффекта после добавления дольной культуры шкроорганиздав ушот быть наличии в ней не только но и факторов, кнгибирующкх бластерэлсфорггздяо. Так, лн-rai.ipiijt.1 фракции, зцделенныэ ьз M.arthrttidis и M.ferawitaEs обладает только ингпбирующимн свойствами, Поверхностные белки (ЛВ) мито-генных K.arthntjLdi?, м.pneumoniae ингибировали пролифэрмито шщр-Щ1тов. Напротив, цельные культуры M.feriterrtaiae но стамулировата бласттхшсформэдщ), a ITS активировали лклфциот ник (таблица I). Ккгибирухясчо свойства ПЕ u.o.ttiLTitidia саязачи исклотиталъно с гло-буллрыкг Оечк&хш, после осеаденан которых оставшиеся компонент об-ладаля такой лв митогекной актитжостьа, как походим культура ыцас-

Таблица 1

Свойотва митогенкых Факторов и Факторов, ингибирувщкх бласт-трансформацго лимфоцатоЕ, у различных инфекционных агентов

Инфекционный - ¡Ингнб'лруящие тент слабошто

¡топко компоненты

]л1итогеннне факторы

!

I_

{Отзечазэщие {Неотгечающие виды и линии;или слабоот-

жсвотншс- {вечаювде виды {и линии

М.а1^Ьг1Ь.141зАргининдезаш- Белок с мо- ?Лши: СНА, Мь^л:

паза, глобу- лекулярпой влъв/с, С57ВЬ/б,

лярные мог,с- массой „ агй.юла/2 БЮ.Вг:

ранние белки, 23-25 кД крниы кролики липиды

Ы.£егтепЪ&па Лидиды

Поверхностные оэлки

Мши СБА

К.рпсиаопхае Глобулярные банки поверхностной мембраны

МемЗрашгае компоненты, освобожденные ог глобулярных белков

-Мыш СБА

1«. рпе'-ШО-ph.Ha Белки внешней мемЗраны с молекулярной массой 29 н 24 кД, цитолизин лпо юрские СВИНКЕ 5 МШИ С57БЬ/6 ИНПЕ ВА1)3/с, В10.БГ, ЬВА/2, .АХВ, СВА

З.рег1;изз1а Не сбнаруаюнк ШС, поверхностные мембранные белки, коклшннй токсин Мили СВА, съкк

В-иеН/Ьеш^з Белковополи-в.въопгав оахарздннй ^ ачгй1вн(ЕПА),

циклический глюхан

ЛПС, О-сцвцд-- ¡¡&>рские фический по- свинки, дисяхарид, мыли Сш.

аихягон полз-В, лнпид А

Токсин с молекулярной массой 9 кД

Гачзкгозо-сяецкфше-ский дентин с мэлекуляр-ной массой 60 кД

Морские свинки, крысы, 'юловеа

Мяли СШ

Вирус гриппа (штамл гх®)

Гемагглютл- Мыши нлк, недра- с57Вт,/б меявдаза

Мили СБА

плазмы. При фракционирования супернат&нта культуры u.arthritidie ■ на колонке с гелем ни-50 нпболее активная в ьштогенном отношении фракция находилась в зоне с молекулярной массой-23 кД и была чувствительна к трипсину и прогреванию (таблица 2).

Таблица 2

Свойства штогеияого фактора Mycoplasma arthritidie (MAC) L. Молекулярная масса - 23-25 кД

2. Тэрмастабильноеть - нагревание при 56—70°С в течение I часа инактивирует яа 85 %. Обработка трипсином - инактивирует

3. Мктогенная ахтивность MAC: ' а) зависит от А-клэток,

б) снижается после разделения клеток на нейлоновой вате,

в) блс лруется после обработки клеток шноклональкыми антителами против thy-1.1 и кощихемавтом,

г) блокируется декстрансульфатом при его добавлении к клеткам до MAC.

i. MAC активирует:

а) тимоцнты,

б) часть клеток, реагирующих на КонА,

в) ззее клетки, реагирующие на ФГА,

г) Т-хелперную линза, специфкчн; о к ФИЩ и рестрихтпроваяную до Н-2^, но подавляет специфическую "пролиферации клеток этой линии,

д) клетки, подавляющие ответ на H.erthrltidie (у мапей СБА, роагируодо на MAC), ' '

е) клетки, стинуляЕТвдие ответ на M.^rtbritidis (у мшгей С57ПЬ/б , лиьйоцигн которых пролифорирувт под" действием MAC только в присутствие 2-шркаптоатанола).

5. MAC вызывает:

а) усиление чувствительности лнщюцитов к ннтерлойкпну-г,

б) продукции M-1-подобного фактора,

в) продукции йЯ-2-подобного фактора.

патогенные свойства выявлены практически у всех исследованных Фракций B.perfcuasie и б_ли связаны главным образом с ЛЕВ, либо с кок-лыскьм токсином. При етоы прямой корреляции иодду галогенной активностью разхичнкх кохлпонэнтоэ B.r-rtusBle и юг протективныш "вой-ствгка вжалоно не было. Однако субфракции, не обладзюоде свойства-

me штг-ена, из закидали мышей от заражения бордетеллами. Очень слабой мктогенной активностью обладает белкоБополисахарздннй антиген (BILÍ.) В.г-ЪогЬиэ , используемый при вакцинации против бруцеллеза (Драновская В. А. и соавт., 1985). В то все время ЛПС, ввделе5мый из ôpy^d.rui, является достаточна ояашл мнтстеном.

Известно, что у больных бруцеллезом коров обнаруживается антитела г. так называемо^ поли-В антигену. Такие антитела не р-нвияш?--ся у вакцинированных лзвотных. В.Л.Льбоз и соавт. (1986) установили, что полк-В антиген представляет собой Л1С бруцелл, 'демицеллированный шг-слическим глшаяом. Поли-В антигены стимулировали ли;л$ощ1тк мыди примерно 2 раза слабее, че - чистый ШС. Считается, что митогонкач активность ЛИС связана с ллпидом А. После сбработкч липида А циклическим глкжсном его митогенн?я актизность пслнсстьи блоккрозалгсь.

Seo наследованный белковые препараты легиенелл обладата слабой .'.к того иной активностью (индекс стимуляции но провьшал 2,3), тогда как легионеллезний ЛПС стц:.у"лировач лк.м£оцити морских свинок так же сильно, как КонА.

Для микроорганизмов, не содергащгх ЛПС, основным Wb могут быть к белковые компоненты. Известно, нзарпмзр, что штегеннач активность вируса гриппа связана с гемагглэтияетсм. Другим примером мзязг слу-елть Caroocyctie g? gante а . После центрч^тировакзя ультразвукового дезинтегратора макропдет salgante а был получен экстракт (СГЗ), :<о-■ торкЗ сти/ф-ларовал ирожферацзл лхфоцзтов человека, шрзг.Ь£ евднкд, 1:рыск. При аффинной хроматографии на колонках о иммобилизованной ¡ галактозой материал, обладающий гемагглютгшируищеЯ активностью, содь сровался 0,15 M галактозой з составлял пркмзрко 16 % от исходного препарата СГЗ 'по белку. Именно этот фактор (¿gKnin's.gigentea с молекулярной массой 50 кД - СГЛ) симулировал' пролиферацию лгофцктов. В экстракте мскроцяст сарсоссордци! нрксутстЕовал и нлзкомолекуляр-нцй (9 :<Д) токсин, который апгнбировэд бласттрансформацка, екзезн-нун СГД.

',1ояг:о предположить, что in vivo з зависимсс-ти о г конкретных услог-кй многче микроорганизмы могут оказывать лпбо штогеняое, jlJo и м'.'у но с у np¿ с си вно е деЯсттаз. Существенное значение при этом mozgt имэть сооткагеяие медпу скоростью раямнояещтя к гибели мякроергзстз-. mob. basho такяе, лродуцарутотся ли эта факторы в окрукалаус среду иль' контактируют с клетками лмлгузпой систеш только после разрушена - паразита. Митсгешал активность внутриклеточных паразитов связана глаыгшл образом с компонентами, лнхэгрнроваяннмн в мембрану клзтки, тогда как экстраклеточниз паразктк и, оояасст, микопдазмы часто про-

дуцпрузт ш Vi лнгкбирунщиэ факторы в кругшющуа среду. Изменение уровня продукция либо ингибируищих, либо сздщуларувдих факторов прп .■изменении угловой жизнедеятельности микроорганизма в результате, на призер. активации защитных систем хозяина, ухжет, по-видимому, обос пзчииать регуляцию взаимоотношений в системе яаразит-хоэюш, дрепят .,7вуя активации иммунной систелог. Ваяно отютизъ, что мши СБА, чув ствгтсльнке, в отличие от шзей C57BL/6 , к токсическому действию ü.a/.-thritidiз , реагируют на MAC. M.arthritiüis оказывает идтоге; ное дойоткие на лимроцыта крыс и мшей, у которых ьиу.опл&зконяая кн фехция протекает s генерализованной дзорме, к не стимулирует лзшфоци-ты кроликов, у которых м.arthritisis индуцирует только артрит. ' L.p^euiophiic. практически ке активирует лимфоциты кышазЧ, у которш посла инфицирования лйгионеллами развивается тольхо токсический синдром и сильна стимулирует лимфоцит морских свинок, чувствительных к пневмонии, ьЕдуцарованной легпопелдагяг.

2.2. Характеристика субпокулавдй лимфоцитов. реагирующих на Ш микроорганизмов

Общепризнано, что при заболеваниях, зызвашго: облагатнымп вно-:слзточнкг.я инфекционными агентами, основной лтех&низм защити сшзан о сиктезслг антител, тогда как при факультативных и облигатках.внутри клеточных яЕфекюях х-лавнуи • защитную функцию выполняют Т-хлеткк "das С.Л., 1982) .

Дум. обсуждения роли М5 з создании протектизнсго иммунитета не-№?ловач:яс-е значение имеет характеристика субподуляций ликвидных: кло тек, рйагируюдуо: на тот или иной Одним из наиболее охарактеризованных ьй является ЛДС гогамт-рщательи^с бактерий. Известно, что ЛПС я.coli стжуирует главным образом В-клетасп. Цельная icy ль тура т,. pneumophila и ШС, выделенный из лзгионелл, такке стимулируют яре-:;мупесгв&:шо В-клетки (таблица 3). Кгке результаты были получены ¿ри исследовании Ш S.gi^soir.öa . Отаот на СГЗ и СГД был макикмачьним в культуре тиг.оцич.ов и m крикрзпдявдахед к нейлоновой вате клеток с&-лезс'.¿ки корско« свинки и крыса. СГТ не стимулировал ни одну из исс-ле: дс-ванних доауляций. У человека СП, так ке как и СГЭ. стшфлйрует нсклэчкте.'ьио C234GDV Т-клетки я прахтячесха не действует на 1-димфоцаты с фенотипом ЦГД/Т-супрессоров ( CD8+).

Из лВ, вэделзккых от зкс?раклаточ1шх паразитов, следует откатить белок с мол.г.. 16 кД, полученный из Р.аопasisosa й .Д. Александровым. В концентрации 0.5--5 шг/цд ое оказывал сильное щтогенное действие на еялзноццтк мьшей СБА к не стимулировал тимон^ты этих ни-

вотшх. После фракционирования спленоцнтов на колонках о нейлоновой ватой оелок Р.азгиг1поза (б концентрации 25 мхг/мл) в большей степени активировал фракцию, ббогащеннув Т-клоткаш. Фракция, сбсгущенная В-клоткаш, сильнее реагировала ка зге I® при'ею концентрации в к-'льтуре 2,5 мкг/мл (таблица 3).

Болеь подробно были исследопапи и кяеточнцо субпоиуляции, активируемые рядом мпкоплазмэкннх №. АЛгИ.сПа^И , в отлгаие от м.сгъь-и м^егпепъанз , активировала только В-клетки мышей (таблица. 3).

Таблица 3

Наличие у инфекционного агента Г- л/или В-клеточных гато-гекшк факторов и тип инфекционного процесса, вызываемого им

•Инфекционные ¡Наличие Т-|НатппЕе В- ; Тип ^секционного

агента ¡мнтогвшюй|митогенпой ; процесса

| \ активное ги;акгайпос.тЕ ;

1,.рп5иясрЫ1а (ЛПС) - + факультатавкнй

вкутрпклзточный

" (леКТИЬ СГЛ) - БНутрпКЛвТОЧНЫЙ

р.аегиз.1поса г . внеклеточный (секретируемый белок)

А.Ха1с11г».!Л - + сапрофит

а. лгЬ>1г1ыа1з -. ^ - мвмЗрангай

•л.ГеггепЬапг.

мембранный

к пгл активируй только СЭ5+С1),!-+ Т-.гслОгогат;!

7Л Секреторный белок но активирует тамоцнты, стш-улируот Т-кязтаи л концентрации 25 икг/мя л В-клетки в концентрация 1-2,5 мкг/ш

При исследовании Зласттрансйормащш, знззакпой 1.1АС (см. табл.2) з различных лиропднш: и гемопоэтичеекпх органах, било убтаиогшшо, что тнюцптс крысы реагируют на Г.1АС почти так , как :и ХопА. Клтет-к™ брш:ео*ших лка&ятгчеегшх узлов крысы практически ко отвечали на ЛПС, но активировались Ж. Напротив, ялотта костного мозга но реагировали на ¡У". Посла обработки меток .гадгатаческих. узлов, селезенки и тнг«зса крыс» аятплаи^оцчтарной сиворонкой и комплементом ответ па ГлАС в лл:з|х>узлах и в тимусе полностью блокировался, а и селезенке -существенно ангабировался (таблица 2). В оггатзх по удаления бромдсс-оксиуркдияом клеток, предактищрозашдх УАС, КопА или <5ГА, было показано, что "ЛАО л 2ГА стимулируют близкие субпощ^нцпи'лимфоцитов, составлятацго часть субпопуляции лимфоидних клеток, отзэчазэдях; на

на КонА. Однако, это не означает, что механизмы активации лкм£~42 тол под действием STA a MAC одинаковы. MAC, в отличье от <5ГА, хорошс стшлударуег тимоцнты крыс а мышей. Максимальная пролайератшзкая ак-тивнсо'1'ь была отмечена пр:л налачив 5 % макрофагов в культуре. При хккубацигл .спленонитов мкшей СВА с MAC уже через I сутки выявлялась клет\ц;,.инг2бкрухядаа отве-.1 на MAC, но стимулирующие пролиферацию :юд действием КонА. Специфические о.удрессоры сохранялись и после 4-< точней инкубална. спленоцктов с МАО, но их активность была ниже. Хел-изрнтац свойствам культуры, клеток, актквисоааняых 4 суток MAC, не обладали. Известно» что шит C57BL/5 .гораздо менее.'■"увствитеяьяы к токсическое д^ствию ii.arthritio.ts , чем мыши СМ, и гораздо быстрее выводят мдкеплазмк &того вида из организма. Спленоциты ышгей C373L/6 . Е отличхе от еяленоцитов мышей СБА, отвечают на MAC только в присутствии Й-уеркамоэтакола, а лимфеидцце дл<зтки мышей C5VBT,/i , активированные MAC, обладают только леллернымп свойствами

Для того, чтобы оолез подробно исследовать влияние MAC на спо-юбкеегь лимфзцмоэ распознавать чужеродные антигены, мклей СБА ш-мунизироъалу. сингеаннш спленоцвхами, модифицированными флюсресцекн-йзст;юц2анатом (ФИЩ), в.условиях, благоприятствуеш.ях индукции хел-аернш; моток. Затем получали г-шзтаи регионарных лимфатических узлов я г.еддерг. :валл да in vitro, в присутствия сингешых облучагоцее клеток. :,.о№ХВД"лроианкых ФИТЦ, в теченье 1-2 месяцев. В результате была яолучзнз'долговременная линия клетск, специфически пролийериругкцих иод действие:* спаленных, модкфацированакх MW, спленоцитов (лимфо-яш?:;, специфичные к ОИТЦ,- £СЛ). йС5 не реагировали на КонА л на ЛПС без отжулкрувдих метек, но 'после добавления ССЕ т: оилгеппы:.:. спле-«ецпта?.: иыла '»тыгзека стимуляция ответа последние.на КонА и, в особенном-;:, ::а ЛПС, MAC лр/ко активировал CCJI. Однако при этом нарушается способность QCJI распознавать специфический антител. f.

¡1йс:.:отрл на то, что MAC, как с КонА, ядляатся Т-хлетсчяым мито-г^нс.м, кгханизм активации ду„\-£0ЦИ'-0"'< под действие:.! MAC имеет свои особенности.

Пос;;е добавления ^ -:.;ет;'.т;анюздда, конкурентного ингибитора КояА, глажь нредактавирсваняце MAC, сохраняли зролиферативную активность, Бролиферецая, индуцированная MAC, полностью ингибировалась ДО в концентрация 100 ккг/мл, если: добавлять его одновременно о MAC •¿eh до НАС. Блэстгрансфэрчация, вызванная КонА.. блокируется ДС в ..BUbKOii отеие-нп. Клетки, а^лавпроваянье з течение 4 суток МАО, в

присутствия: ингибиторов китогенной активности, включали "Д-таядан только яослэ добавления Ш-2, что указывает на аддукцию рецепторов к ИЛ-2 под действием МАС. Суаорнатзнт от культур, стимулированных МАС, содержал фактор, • поддергивазиций пролиферации КонА-бластов, гс-с— •гибкость которого на блокировалась после прогревания. ь тзтеьнг. I часа при 56°С. Так как после прогревания активность МАС падает па 85 %, моякс сделать вывод, что стимулирующее действие судерлатонта определяемся щтскином, напогадающим ИЛ—2.

Зависимость бдаоттраксдормадж дга^оцкгоя, вызванной Д!АС, от А-ялеток указывала яа способность МАС стимулировать прод^'.цшо й1-т. Поэтом!'' ъ последующих экспериментах суперяатанти из культур-: А-клё-ток мышаЕ ОБА, инкубировавшихся в точение I суток с КскА, с Ж5 кля без китог&нов бшш проанелизировгош в функциональном тесте на активность КД-1. С этой целью судернатапту в ¿«йкех • ргавзденеях до^атлам к ттюцитам мышей С57Я/б вместе с ФГА ияк без кохо. В высокой концентрации такой сушрчатект еказыва« стш^лирукхцее дзйстзиз ка ткмс-циты без добавления ФГА (что наблюдается пря уьзлачекл: концзкгра-ции К1-1 в культуре), а в* кизявх ковцэнтрецюсс - коотечг.трувщеэ действий с "ФГА. Так как МУЗ сам по себе такого действия не зкзквал, эффект, очевидно, связан' с цитоккном, напоминающе.! по езогм своЗгл--, вам М-1.

Поскольку способность продуцировать Х-Щ—31 ъ большей стояезя свойственна адгезквным.-.кдоткам, полученные дйшыс югут свидетельствовать о том, Ч"Ч> ГЛАС сильнее, чем КонА активирует кл&ткк, обладающие адгезивные свойства!®. Этот вывод подтверждается и в Еря:.;оХ опытах по исследованию блаеттракейормамд в популяциях еяленоцаюв, слабо или сильно прикрепляющихся к пластиковой псвгрхчоста.

Известно» что адтэзивнкв клетки неоданачоьы по сбохм сзойствэм.. Они могут выполнять функцию антигенпредстаьт"сотдюс или супрзссорннх клеток. При исследовании влияния МАС на клетки пергтокеального экссудата крысы было показано, что Ж! з катоганнах (ко не в супраг/то-геннызс) концентрациях подавляет раопластнваннэ части А-клоток, яз влияя на ш. шзнесдосойность. /двухчасовая ящугбэхет клеток солегешаг на пластиковой поверхности приводит к адсорбции около 40 % клэток. В присутствии Ж на поверхности остается только 2Ь % бгузкоцитоз. Слабоадгезивкне А-клетки селезенки, от-крегажя^иезя от поверхности пластика через сутки и позже под воздействием МАЙ, обладав суарэ-;-соряыда свойствами. Оетавшгеач яа позэргяосасг адтейгзнк? кезск» оказываэт на бласттраясформадав судроссорнсго действия, а, лалрог:.':-: стит.улируэт ее.

Таким образом, часть исслодозанних Ш стш^лирует преимущественно Е-клетки ( 1.рпешаорМ1а, A laidlawil) .другие (МАО, СГЛ) -преимущественно' Т-клетки. СГЛ активирует главным образом Т-клетки с фенотипом Т-хелперов, МАС - часть Т~клеток, реагируюпдах на КонА. Суммарный анализ полученных в работе данных, и данных литературы по более, чем 80 Ш микроорганизмов показывает, что среда внеклеточных инфекционных агентов В-штогз;ш встречаются в 3,2 раза чаде, чем Т-митсгекы... Дот факультативных внутриклеточных паразитов это соотношение равно уке 1,9 , а для облигатных внутриклеточных инфекционных агентов - 1,6 ; т.е. 1.S преимущественно стимулируют те популяции лздфэцитов, которые играют'основную роль в з адате от инфекции данного типа. Обращает на себя внимание и тот факт, что у мышей С5'?ьь/ь, резистентных к токсическому действию M.artliritidis и быстро выводящих шкою^зщ из организма, суярессорныа клетки под действием МАО не активируют i. Супроссорная активность ке заявлена и в культурах-ли^фэцитоз, активированных СГЛ. Как известно, S.gigantea также не способны длительно персисгароЕать в организме хозяина ( Tietz н.-г.

et al.,1986).Эти данные показываю?, что Ш могут оказывать существенное влияние на формирование ирогектизного иш^нитета и на персис-тенци» микроорганизма. Однако окончательное подтверждение или опро-фержение этого заклачешя макет быть получено только после экспериментов в условиях la vivo.

3. Сравнительный анализ дункцяональной активности клеток иммунь/й системы после воздействия бактериальных препаратов . различающихся по штогенным свойствам, в условиям jn vivo

Исследование действия Ш в условиях in vivo было начато с коклюшного токсина (КТ) преэде всего потому, что КТ - один из наиболее изученных. ks5, использующийся в качестве вакцинного препарата (таблица 4), Введение КТ вызывае~ существенные сдвиги в пролифератийной активности клеток из разных; органов. В селезенке наблэдается два пика розного увеличения пролиферации: через 4 и 18 суток после введения КТ. В тилусе yse к 4 суткам после ваэдейия "КТ отмочено резкое снижение пролиферативнсСактивности. В костном мозге, как и в селезенке, зарегистрировано 2 волны изменения ответа на КокА: чорез 4 и через 1'3 суток р-закцая бласттрансформацки стимулируется, а через' 8 суток -подавляется. Увеличение пролиферативнсй активности силеноцитов через 4 и 18 суток сопровождается накоплением в органе "хелперных" jujtok. В тяйусе, несмотря па снизепае ответа ка Кон А. после введения КТ, халазрнаг активность возралтата к 4 суткам, В костном мозге КГ знзк-