Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Бета-гептилгликозид-мурамилпептид в экспериментальной терапии и профилактике сепсиса и септических поражений почек

На правах рукописи

МУЛИК ЕВГЕНИЙ ЛЕОНИДОВИЧ

р-ГЕПТИЛГЛИКОЗИД-МУРАМИЛПЕПТИД В ССПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ТЕРАПИИ И ПРОФИЛАКТИКЕ СЕПСИСА И СЕПТИЧЕСКИХ ПОРАЖЕНИЙ ПОЧЕК.

14.00.25. - фармакология, клиническая фармакология.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

КУПАВНА-2002

Работа выполнена в ЦНИИ Вакцин и сывороток им. И.М. Мечников РАМН и НИИ Морфологии человека РАМН.

Научный руководитель: кандидат медицинских наук,

О. В. Калюжин

Научный консультант: доктор медицинских наук

А. П. Дрожжин

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор, академик РАЕН И.Е. Ковалев доктор медицинских наук профессор Т.А. Воронина

Ведущая организация: Российский государственный медицински Университет

Защита состоится «___»_2002 года в_часов

На заседании диссертационного совета Д217.004.01

(142450, Московская область, поселок Старая Купавна, ул. Кирова, 23) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНЦ БАВ

Автореферат разослан «___»_2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Л.В. Корольчеш

6 5~4<Г. ГР с?

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Одним из основных направлений лечения сепсиса является ютибактериальная терапия. В 40-е годы на 60 тысяч обшехирургических больных шстота развития сепсиса составляла 0,6%, по секционным материалам достигала 1,5% -12%, а в период Второй мировой войны - 22,1% (С.С. Гирголаев, 1951, И.В. Давыдовский, 1956). Применение антибактериальных препаратов позволило в 1ервые годы снизить частоту развития септических состояний до 2,1%, однако иирокое и нерациональное их использование обусловило появление штибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов, что вновь привело к ,'величению частоты возникновения сепсиса до 3,4% (A.A. Балябин, 1986, B.C. ^альченко, 1988).

Серьезной проблемой стало возникновение внутрибольничного сепсиса зследствие оперативных вмешательств, реанимационных мероприятий, сложных ^агностических и лечебных процедур. В последние годы отмечено повышение частоты случаев токсико-септических состояний, например, в больницах США эна повысилась на 139% (Marik P.E. et al., 1995).

Установлено, что сепсис - это двухфазный иммунный процесс: после гипервоспалительного ответа с избыточной продукцией фактора некроза опухоли [ФИО) и интерлейкина-1 (ИЛ-1) следует гиповоспалительная фаза, которая ассоциируется с иммунной недостаточностью («иммунопараличем») /Volk H.-D. st al., 1996/. При бактериемии нередко происходит инфицирование почки с отсроченным (спустя несколько недель) появлением в ней гнойного очага. Последний при интенсивной антибактериальной терапии может подвергаться обратному развитию, но не ликвидируется полностью, и при снижении иммунореактивности организма может вновь возникнуть септицемия или даже септикопиемия. Бактериальные поражения почек возникают и восходящим путем. При этом патологический процесс может ограничиться бактериальной инвазией клеток эпителия и близлежащих тканей, однако в ряде случаев наблюдается проникновение бактерий в лимфо- и кровоток с развитием генерализованной инфекции и формированием метастатических очагов. При этом судьба микроорганизма зависит от его устойчивости к действию неспецифических и специфических гуморальных и клеточных бактерицидных систем хозяина (Карлов В.А., 1986). В связи с ростом удельного веса пиелонефритов и снижением эффективности монотерапии антибиотиками, все более важным становится терапевтические подходы, направленные на стимуляцию собственных иммунных процессов организма. Актуальной и востребованной представляется работа, направленная на разработку средств и методов терапии сепсиса, основанных на снижении избыточной продукции провоспалительных цитокинов в гнпервосп алительную фазу септического процесса и реактивации

неспецифических и специфических звеньев иммунитета в фа «иммунопаралича».

Одной из наиболее перспективных групп иммуномодуляторов являют производные мурамилдипептида (МДП) - компонента бактериальной стенки ря бактерий (Chedid L., 1986). Несмотря на то, что синтезировано больш количество дериватов МДП, лишь некоторые из них нашли клиническ применение или находятся на разных стадиях клинических испытаний. Среди н можно отметить отечественный препарат Ликопид, представляющий собой ! ацетилглюкозаминил-МДП (Пинегин Б.В. и соавт., 1997), xopoi зарекомендовавший себя в лечении заболеваний, связанных с вторнчн иммунной недостаточностью.

Ранее в эксперименте показана способность Р-гептилгликозид-М! существенно снижать летальность животных на моделях септикотоксем! вызванной Salmonella typhi (Калюжин O.B. и соавт., 1999). Однако механизмы, счет которых этот гликопептид стимулирует резистентность организма условиях септических моделей, до конца не ясны. Кроме того, представляет актуальным исследование профилактической и терапевтической активности гептилгликозид-МДП при экспериментальном сепсисе, вызванном другш грамотрицательными и грамположительными бактериями. Рациональнь выглядит изучение эффективности ß-гептилгликозид-МДП на септическ моделях с использованием возбудителей, характерных для гематогенш поражений почек.

Цель исследования

Целью работы является изучение профилактических и терапевтическ эффектов ß-гептилгликозид-мурамилдипептида (Глимурида) п; экспериментальном сепсисе и септических поражениях почек, вызванш различными грамотрицательными и грамположительными бактериями, исследование механизмов реализации этих эффектов.

Задачи исследования

1. Исследовать влияние Глимурида на выживаемость животных экспериментальным сепсисом, вызванным Escherichia coli, Staphylococcus aura Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa.

1. Исследовать действие Глимурида на бактериальную обсемененнос внутренних органов и биологических жидкостей организма животных экспериментальным сепсисом.

3. Исследовать динамику патоморфологических изменений в почечн паренхиме при сепсисе на фоне применения Глимурида.

4. Изучить влияние Глимурида на некоторые показатели иммунитета, фактеризуюшие основные звенья противоинфекционного иммунного ответа при ссперименталыюм сепсисе.

Научная новизна работы

Впервые изучена профилактическая и терапевтическая активность эигиналыюго деривата мурамилдипептида - ß-гептилгликозид-урамилдипептида (Глимурида) при экспериментальном сепсисе, вызванном эзбудителями, характерными для инфекционных заболеваний почек (Е. coli, S. ureus, P. vulgaris, К. pneumoniae, P. aeruginosa).

При этом помимо таких интегральных показателей, как выживаемость и родолжнтельность жизни, большое внимание уделено исследованию актериальной обсеменносги внутренних органов и тканей, динамики атоморфологических изменений в почечной паренхиме и иммунологических 5вигов на всех этапах развития сепсиса.

Описано новое направление применения иммуномодуляторов-урамилпептидов в профилактике и комплексной терапии сепсиса.

Впервые разрабатывается схема комбинированного лечения сепсиса и гматогенных заболеваний мочеполовой системы (МПС) с применением нтибактериальных препаратов и иммуномодулятора Глимурида.

Теоретическая и практическая ценность исследования

Большое теоретическое значение имеет определение принципиальной эзможности и целесообразности применения иммуномодуляторов-урамилпептидов в профилактике и лечении сепсиса, вызванного различными рамотрицатедьными и грамположительными бактериями, и септических сражений почек.

Научный интерес представляют данные по патоморфологическим зменениям в почечной паренхиме и динамике иммунологических расстройств в азвитии сепсиса.

Практическая значимость работы заключается в том, что настоящее сследование является серьезным шагом в расширении сферы применения !урамилпептидов.

Положения выносимые на защиту

• Профилактическое и терапевтическое применение ß-гептилгликозид-МДП существенно улучшает показатели выживаемости и продолжительности жизни животных при экспериментальном сепсисе, вызванным Б. coli, S. aureus, P. vulgaris, К. pneumoniae, P. aeruginosa.

• Глимурид снижает бактериальную обсемененность внутренних органов I биологических жидкостей при сепсисе.

• Глимурид снижает выраженность воспалительных изменений в почечно1 паренхиме при сепсисе и ускоряет их разрешение.

• Производные МДП оказывают значительный модулирующий эффект н; концентрацию противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови 1 активность макрофагов, лимфоцитов и нейтрофилов пр( экспериментальном сепсисе.

Апробация диссертации

Материалы диссертации представлены на: 2-ом Съезде иммунологов Россш (Сочи, 1999), 3-ем международной конференции по восстановительной медицин! (Московская область, Одинцовский район, поселок санатория им. Герцена М1 УДП РФ, 2000), конференция, посвященная 120-летию 29-ой городско) клинической больницы (Москва, 2000), 2-ой Российской конференции молоды: ученых (Москва, 2001), научной конференции по актуальным вопроса» инфекционной патологии (Нальчик, 2001).

Структура диссертации

Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы описания материалов и методов исследования, результаты собственны: исследований, заключение, выводы и список литературы. В начале работь приводится список используемых сокращений. Диссертация написана на русскои

языке на_страницах машинописного текста, иллюстрирована 31 таблицами

3 схемами, 42 рисунками. Указатель литературы содержит_источника, в ток

числе_отечественных и_иностранных автора.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проводились на базе лаборатории непарентеральных м его до: иммунизации ЦНИИ Вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН 1 лаборатории клеточной иммунопатологии и биотехнологии НИИ Морфологи] человека РАМН.

Глимурид (Р-гептилгликозид-мурамилдипептид) синтезирован на кафедре рганической химии Симферопольского государственного университета октором химических наук, профессором кафедры А.Е. Земляковым (А.Е. емляков, В.Я. Чирва 1987).

В опытах использовали мышей С57В1/6 и F) (СВАхС57В1/6) (Центральный итомник экспериментальных животных, отделение «Крюково») обоего пола :ассой 14 - 16 г. Животных содержали в условиях вивария ЦНИИ Вакцин и ывороток им. И.И. Мечникова РАМН и НИИ Морфологии человека РАМН.

Выбор антибактериальных средств основывался на результатах определения увствительности к ним используемых в работе микроорганизмов и литературных анных. Чувствительность микроорганизмов к антибактериальным препаратам пределяли диско-диффузионным методом, для этого использовали бумажные иски производства bioMerieux (Франция), включающие в себя: гентамицин, оксициклин, эритромицин, офлоксацин, цефотаксим. При зоне задержки роста :икроорганизмов вокруг диска с антибиотиком до 10 мм штамм считали стойчивым, 11-15 мм - малочувствительным, более 15 мм - чувствительным.

В серии предварительных экспериментов были отобраны следующие нтибиотики: гентамицина сульфат («Мосхимфампрепараты», Россия) для S. ureus, Е. coli, цефотаксим («LEK», Словения) для P. vulgaris К. pneumoniae, Р. eruginosa.

Для моделирования сепсиса внутрибрюшннно вводили штамы К. pneumoniae К16; P. aeruginosa - № 1677 (6-ой серотип); P. vulgaris - Аз 177; S. aureus - № 7; Е. coli - К87. При изучении показателей выживаемости и продолжительности :изни использовали минимальные дозы возбудителя, вызывающие 100% - гибель сивотных (107 микробных тел для К. pneumoniae и 108 для P. aeruginosa, Р. ulgaris, Е. coli и S. aureus), при исследовании обсемененности и ммунологических показателей - сублетальные дозы (I04 микробных тел для К. neumoniae и 105 для P. aeruginosa, P. vulgaris, Е. coli и S. aureus).

р-гептилгликозид-МДП и антибиотики разводили в 0,9%-раствора хлорида атрия. Р-гептилгликозид-МДП вводили per os ежедневно в дозе 1 мг/кг. ентамицин вводили внутримышечно (в/м) ежедневно в дозе 50 мг/кг, ефатоксим - 500 мг/кг.

Все препараты применяли в течение 5 дней, начиная со дня заражения. 1ервая группа экспериментальных животных получала Р-гептилгликозид-МДП и 00 мкл 0,9%-раствора хлорида натрия в/м, вторая - антибиотик и 100 мкл 0,9%-аствора хлорида натрия per os, третья - комбинацию иммуномодулятора и нтибиотика. Мыши контрольной группы получали ежедневно по 100 мкл 0,9%-аствора хлорида натрия per о.ч и в/м.

Для определения обсемененности внутренних органов животных вскрывали а 2-й день после заражения сублетальной дозой. На чашки Петри с МПА делали ысевы из крови и внутренних органов: печени, селезенки, почек и мочевого узыря. Рассчитывали индекс обсемененности (ИО) - отношение положительных

проб высева микроорганизмов ко всем проводимым пробам посева из различи! органов и тканей.

Для определения фагоцитарной активности нейтрофилов делали мазок предметном стекле, высушивали его и фиксировали 10 минут в метаноле. Окрас мазков производили по Романовскому-Гимзе. Подсчитывали процент актив] фагоцитирующих клеток - фагоцитарное число (ФЧ) и среднее чис. поглощенных микробов на один макрофаг - фагоцитарный индекс (ФИ).

Изучение влияния Глимурида на митоген-индуцированную пролифераци лимфоцитов проводили, используя метод, описанный Stromberg et al. (198< Пролиферативную активность оценивали с помощью индекса пролифераш (ИП), вычисленного по формуле: ИП = А:В, где А и В - включение Нз-тимиди (имп/мин) в пробах с митогеном (липополисахарид или конканавалин А) и б него соответственно.

Продукцию ФИО и ИЛ-1 индуцировали по методу методу, описанно? Lovett et al. (1986). Тестирование ИЛ-1 проводили по методу Uede et al. (1986] использованием в качестве индикаторных клеток тимоцитов мышей C57BL Активность ФИО определяли по лизису ФНО-чувствителышх клеток L-929 (Fi and Gifford, 1983).

Полученные данные подвергалиси статистической обработке использованием параметрических и непараметрических методов. Достоверное различий между двумя независимыми количественными показателями п] нормальной распределенной совокупности оценивали, используя двусторонш вариант критерия Стьюдента. Анализ повторных изменений (например, сравнен; признаков, установленных до н после лечения) проводили вычислением парно критерия Стьюдента или критерия Вилкоксона в зависимости от ви. распределения. Для выявления различий между группами по выделеинь качественным признакам использовали точный критерий Фишера. Статастичеа значимыми считали различия при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе исследования изучали влияние Р-гептилгликози мурамилдипептида (Глимурида) на выживаемость животных экспериментальным сепсисом, вызванным 100%-летальными дозами различна микроорганизмов, характерных для гематогенного поражения почек: aeruginosa, К. pneumoniae, Е. coli, S. aureus, P. vulgaris. Эффект действ] вещества изучали в двух вариантах применения - при профилактическс введении и терапии на фоне сепсиса.

Результаты исследований показали, что испытываемый иммуномодуляп при профилактическом приеме per os в дозе 1мг/кг за 24 часа до заражения п

эазному влиял на выживаемость экспериментальных животных в зависимости от шда возбудителя (таб. 1).

Профилактическое применение Глимурида без дальнейшего введения штибиотиков существенно снижало летальность от экспериментального сепсиса, ¡ызванного всеми использованными возбудителями, кроме P. aeruginosa. Зыживаемость животных, зараженных К. pneumoniae, Е. coli и S. aureus, -оставляла 80%, Р. vulgaris - 20%. В последнем случае увеличение выживаемости 5ыло статистически недостоверно.

Следует отметить, что эффект профилактического введения Глимурида был юпоставим с терапевтическим действием антибиотиков: летальность в условиях модели с К. pneumoniae составляла 100%, Е. coli и S. aureus - 80%, Р. vulgaris -10%.

Максимальный эффект достигался применением ß-гептилгликозид-МДП с юследующим введением антибактериальных препаратов. Важно, что такой юдход позволял снизить летальность в модели сепсиса, вызванного Р. aeruginosa, огда как ни антибиотик, ни глимурид в отдельности не влияли на выживаемость.

Полученные данные демонстрируют значительное избирательное повышение >езистентности животных к бактериальным инфекциям под действием [рофилакгического введения иммуномодулятора.

Для изучения терапевтического эффекта Глимурида, применяемого на фоне епсиса, препарат вводили ежедневно. Первое введение Глимурида осуществляли ерез 30 минут после заражения в дозе 1мг/кг per os. Как показано в табл. 2, 'лимурид существенно снижал летальность мышей с экспериментальным епсисом, вызванными S. aureus, Е. coli и К. pneumoniae. Эффект юноиммунотерапии этого вещества в модельных системах с использованием казанных возбудителей был сопоставим с действием монотерапии нтибиотиками. Выживаемость в модели с Е. coli составляла: иммунотерапия -0%, антибиотикотерапия - 60%; S. aureus - соответственно 40% и 60%; К. neumaniae - 60% и 60%. Максимальный терапевтический эффект достигался омбинированным применением ß-гептилгликозид-мурамилдипептида и нтибакгериальных препаратов, что проявлялось достаточно большой ыживаемостью животных (К. pneumoniae - 100%; Е. coli - 100%; S. aureus - 60%; '. vulgaris - 60%).

Следует отметить наблюдавшуюся в большинстве экспериментов тенденцию увеличению продолжительности жизни животных, зараженных Р. aeruginosa, олучавших монотерапию иммуномодулятором (длительность жизни животных оходила до трех суток).

Таким образом, данный этап исследований продемонстрировал способность репарата снижать летальность животных с экспериментальным сепсисом, ызванным определенными возбудителями, и потенцировать действие ятибиотиков.

Таблица ]

Влияние профилактического введения р-гептилгликозид-МДП на выживаемость мышей линии Р, при внутрибрюшинном заражении

Группы животных Возбудитель Гибель животных (%) Выживаемость (%)

1-й день 2-й день 3-й день 4-й день 5-й день

Контроль Р. aeruginosa 100 0

I 60 20 20 0

и-# 100 0

III # 40 20 20 20

Контроль К. pneumoniae 20 60 20 0

I 20 80*

II # 20 80*

III« 100*

Контроль Е. coii 80 20 0

1 20 80*

11 ♦ 20 80*

III ♦ 100*

Контроль P. vulgaris 100 0

I 80 20

II # 40 20 40

Ш# 40 60

Контроль S. aureus 40 60 0

I 20 80*

II ♦ 40 60

III ♦ 100*

В таблице представлены типичные данные одного ш трех независима экспериментов.

Группы животных: I - Р-гептилгликозид-МДП, II - антибиотик (♦-генгамицин, i офлоксацин), Ш - р-гептилгликозид-МДП и антибиотик. * - р < 0,05 по отношению к контролю.

Таблица 2

Влияние введения р-гептшшшкозид-МДП на фоне сепсиса на .шиваемость мышей линии И] при шгутрибрюшинном заражении шэгеыными микроорганшмами_

Группы животных Возбудитель Гибель животных (%) Выживаемость (%)

1-й тень 2-й аень 3-й день 4-й день 5-й день

Контроль Р. aeruginosa 100 0

1 80 20 0

II # 100 0

ш# 100 0

Контроль К. pneumoniae 20 60 20 0

I 20 20 60

и а 40 60

Ш# 100*

Контроль Е. coli 80 20 0

1 20 20 60

11 ♦ 20 20 60

II! ♦ 100*

Контроль Р. vulgaris 100 0

1 80 20

II # 40 20 40

III и 40 60

Контроль S. aureus 40 60 0

1 60 40

II ♦ 40 60

III ♦ 40 60

В таблице представлены данные одного типичного из трех независимых хпериментов.

Группы животных: 1 - р-гептнлглнкозид-МДП, И - антибиотик (♦-гентамицин, #-}>локсацин), III - Р-гептилгликозид-МДП и антибиотик. * - р<0,05 по отношению к контролю.

В следующей серии экспериментов мы изучали действие Глимурида : высеваемость возбудителей из тканей и органов зараженных животных. Опьл проводили с введения Глимурида профилактически и на фоне сепсиса.

Результаты исследований показали, что препарат, применяемый per os в до 1мг/кг за 24 часа до заражения, оказывал существенное влияние на показате. высеваемости микроорганизмов из внутренних органов и биологическ! жидкостей, а также на индекс обсемененности (ИО). Установлено, ч применение препарата у животных, зараженных К. pneumoniae, как в комплексе антибиотиком, так и в виде монотерапии вызывало снижение данного показате (0,27 и 0,33, соответственно) по сравнению с группой контроля (0,67) (рис.1). К в группе мышей, получавших монотерапию антибиотиком, составлял 0,4.

У животных, зараженных P. aeruginosa, обнаруживается схожая картина, п] которой отмечается снижение обсемененности тканей при антибиотикотераш (И0=0,67) и ее сочетании с профилактическим введением иммуномодулято (0,4) (рис.2). В случае профилактического введения Глимурида без дальнейше применения антибиотика отмечено максимальное снижение ИО (0,33), сравнении с контрольной группой. В опытах с использованием Е. о эффективность применения данного мурамшшептида также достаточно нагляш действие Глимурида (И0=0,33) несколько превышало действие монотерап: антибиотиком (0,47) (рис.3). ИО при всех вариантах экспериментальн профилактике и терапии значительно отличался от показателей контрольн группы (0,73).

В условиях модели с внугрибрюшиыным заражением S. aureus отмечалась же тенденция к снижению обсемененности тканей во всех изучаемых групп (рис.4). Максимальный эффект был выявлен в группе «антибиотик + Глимур (профилактика)» (0,53). ИО у животных, получавших монотераш антибиотиком, составлял 0,73, профилактику иммуномодулятором - 0,76. контроле ИО был равен 1,0.

У животных, зараженных P. vulgaris, имелось выраженное снижен высеваемости бактерий из тканей и биологических жидкостей в группе мыш< получавших антибиотикотерапию (И0=0,27) и потенцирование данного эффек при сочетании с профилактическим введением Глимурида (0,13) (рис. Монопрофилакгика Глимуридом, также снижала данный показатель (0,4 однако не столь выраженно (контроль - 0,8).

При экспериментальной терапии Глнмурид (1мг/кг) применялся per ежедневно, начиная со дня заражения. Последнее введение препарг осуществляли за 1 час до умерщвления животных. р-гептилгликозид-MJ оказывал существенное влияние на показатели индекса обсемененности сравнению с контрольной группой при всех вариантах применения: комплекса терапия с антибиотиками и ионотерапия. Однако по сравнению профилактическим введения эффективность введения Глимурида на фоне сепст по всем экспериментальным группам {К. pneumoniae, P. aeruginosa, Е. coli, vulgaris, S. aureus) была несколько ниже.

Профилактический эффект препарата может быть объяснен стимуляцией звеньев неспецифической резистентности организма животных. Терапевтическое действие Глимурида, очевидно, также связано с активацией начальных стадий специфического иммунного ответа. В литературе уже имелись указания на то, что в модели сепсиса, вызванного К. pneumoniae, обнаружена связь терапевтической активности мурамилдипептидов не только со стимуляцией факторов неспецифической резистентности, но и с активацией Т-клеточного звена иммунитета, что и привело к снижению обсемененности внутренних органов.

При обоих вариантах применения Глимурида (профилактика и терапия) большое значение имеет регуляция продукции провоспалительных цитокинов клетками макрофагального ряда, что будет обсуждено ниже.

Согласно литературным данным, существует целый ряд вариантов моделирования септического поражения почек: внутривенное введение патогенных микроорганизмов с нарушением оттока мочи (В.С Рябинский 1963, Ю.А. Пытель 1977); внутримышечное введение взвеси суточной культуры микроорганизмов в 10% растворе СаСЬ (В.Г. Тепляков и соавт., 1996). Также возможно развитие септических поражений почек при внутрибрюшинном введение взвеси патогенных микроорганизмов. Ишемия почечной паренхимы вызывает нарушение жизненно важных функции почек: участие в процессах гомеостаза, дезинтоксикации, регуляции водно-солевого баланса и многих других. Это характеризуется развитием таких состояний, как острая и хроническая почечная недостаточность.

Мы воспроизвели моделирование сепсиса с внутрибрюшинным введением микроорганизмов. Уже спустя 1 час после инфицирования у животных возникает бактериемия, проявляющаяся положительными посевами крови и обсеменением внутренних органов. Выброс микробов в кровь происходит волнообразно. Штаммы микроорганизмов вызывают выраженный хемотаксис преимущественно полиморфноядерных лейкоцитов. В других случаях способствуют образованию в органах некрозов, в которых отмечались скопления бактерий при отсутствии заметного лейкотаксиса, в данном случае ограничения не происходило, и инфекционный процесс приобретал септическую форму течения. Возможно, что в основе механизма определяющего форму септического процесса лежат особенности реакции лейкоцитов на микроорганизмы с различными биологическими свойствами.

В развитии патоморфологической картины септических изменений выделяют три стадии - инициальную, промежуточную и позднюю. При проведении экспериментального сепсиса инициальная стадия развивается на 30 минут после введения взвеси микроорганизмов; промежуточная - через 3 часа; поздняя -спустя сутки (П.А. Кривошеин, 1987). Исходя из этого, мы провели гистологическое исследование ткани почек в указанные сроки. В модели с использованием E.coli удалось получить наиболее яркие гнойно-воспалительные изменения в почках.

Рис. 1. Влияние Глимурида на бактериальную обсемененность внутренних органов мышей, линии FI( зараженных культурой К. 0,67+0,31 pneumoniae ___

0,71

SB

& 0.6-

0

х 0,5-и ^

1 5 0.4

*> т

.8 Р о.з-

0 Ä И 0.2-О

1 0.1-

о

1 2 3 4 5 6

По оси абсцисс: 1 - контроль, 2 - Гяимурид (профилактика), 3 - Глимурид (лечение), 4 - антибиотик, 5 -антибиотик + глимурид (профилактика), 6 - антибиотик + Глимурид (лечение)

Рис. 2. Влияние Глимурида на бактериальную обсемененность внутренних органов мышей линии Fb зараженных культурой P. aeruginosa

По оси абсцисс: 1 - контроль, 2 - Глимурид (профилактика), 3 - Глимурид (лечение), 4 - антибиотик, 5 - антибиотик + Глимурид (профилактика), 6 - антибиотик + Глимурид (лечение).

* - р < 0,05 по отношению контролю.

Рис. 3. Влияние Глимурида на бактериальную обсемененность внутренних органов мышей линии Fi, зараженных культурой Е . coli.

По оси абсцисс:1 -контроль,2 -Глимурид

(профилактика), 3 - Глимурид (лечение). 4 - антибиотик. 5 - антибиотик + Глимурид (профилактика). 6 - антибиотик + Глимурид (лечение)

Рис. 4. Влияние Глимурида на бактериальную обсемененное tj, в л утренних органов мыш ей линии Fj, зараженных культурой S. aureus.

-О

£ I

2 3 4 5

контроль, 2 - Глимурид

По оси абсцисс: 1 (профилактика), 3 - Глимурид (лечение), 4 - антибиотик. 5 - антибиотик + Глимурил (профилактика). 6 -антибиотик + Глимурид (лечение). * - р<0,05 по щлош сню к конролю.

Рис. 5. Влияние Глимурида на бактериальную обсемененность внутренних органов мышей линии F 1, зараженных культурой Р. vulgaris. __ JUt i.«.,3L-

o,e

I в ё

I 5 Ü

12 3 4

По оси абсцисс: \ - контроль, 2 - Глимурид (профилактике), 3 - Глимурид (лечен не), 4 - антибиотик, 5 антибиотик + Глимурид (профилактика), 6 - антибиотик + Глимурид (лечение).

* - р < 0 ,0 5 по отношеню * ко и ролю.

При применении антибиотика был продемонстрирован наиболее часты! результат разрешения воспалительного процесса - необратимые изменении паренхимы, характерные для перехода в хроническую стадию. При монотерапш Глимуридом мышей, зараженных внутрибрюшинно взвесью Е. coli., картин: пиелонефрита также отмечалась, однако патологические изменения были мене) выражены, чем при приеме только антибиотика, а также не было выраженно1 картины хронизации процесса.

Комплексная терапия антибактериальным препаратом и иммуномодуляторои приводила к быстрому разрешению патоморфологических измененш практически без остаточных изменений. Высокую активность по снижении выраженности острого гнойного воспаления в почечной паренхиме имел i профилактический прием Глимурида. Так же, как и в предыдущем случае, н отмечалось выраженных признаков хронизации воспаления.

Большой интерес представляют полученные нами данные по иммунны» изменениям, происходящим в ходе септического процесса на фоне применена деривата мурамфщипеотида. Эти данные помогают понять механиз» терапевтической и профилактической активности Глимурида.

Одной из мишеней биологического действия мурамилпептидов являютс: лимфоциты. Доказана способность этого класса иммуномодуляторо] регулировать функциональную активность различных субпопуляций Т-клеток, В лимфоцитов и естественных киллеров. Причем производные мурамилдипептида i некоторые другие иммуномодуляторы (Тамирид) оказывают как опосредованно макрофагами, так и прямое действие на эти клетки, играющие ключевую роль i эффекгорных и регуляторных иммунных процессах при инфекциях (Дрожжи! А.П., 2001, Пинегин Б.В. и соавт., 1997).

Одним из показателей функционального состояния лимфоидных клето: является их пролиферативная активность. В связи с вышесказанным mi исследовали спонтанную и митоген-стимулярованную пролиферации лимфоцитов, выделенных у животных с экспериментальным сепсисом в разны сроки после заражения на фоне профилактического и терапевтическоп применения ß-гептилгликознд-МДП.

В качестве митогенов использовали субошимальные дозы Т- и В-клеточны: стимуляторов пролиферации: Кон-А и ЛПС соответственно. Дозы митогенов (п 1 мкг/мл Кон-А или ЛПС) подбирали в предварительной серии эксперименто так, чтобы они вызывали 30-50% активацию деления клеток в сравнении оптимальной дозой. Внутрибрюшинное заражение животных сублетальным; дозами различных возбудителей первоначально (через 4 часа после заражения вызывало выраженную тенденцию к активации спонтанной пролифераци лимфоцитов. В модельной системе с использованием E.coli стимуляци пролиферации была статистически достоверной (р<0,05). Через 24 часа от начал эксперимента активация сменялась угнетением, сохраняющимся к 48-му час после заражения. Что касается митоген-стимулированной пролиферации, т отмечена ее достоверное подавление во все сроки исследования.

Таблица 3. Влияние профилактического введения Глимурида на пролиферативную активность лимфоцитов у мышей линии Бь выделенных через 4 часа после заражения * (М + ш)

Культура Спонтанная пролиферация лимфоцитов (импульсов/мин) Пролиферация, стимулированная митогенами (импульсов/мин)

Кон-А 1 мкг/мл ЛПС 1 мкг/мл

Контроль Тест Контроль Тест Контроль Тест

P. aeruginosa 752±85 785193t 31281336t 3007±278t 2345±403 2745+381

К. neumoniae 740±77 918189t 40171351t 4990±329J 2538±236 3234±467

P. vulgaris 694±53 768165t 4052±434t 4467±588 2147±256t 3078±253

Е. coli 910±64f 1019184t 3671±390t 45981450 18341226t 28731292*

S. aureus 726±71 803168t 29051185t 43341402t 2578±291 29351363

Интактные мыши 567149 5271±472 31821376

* - Глимурид (1мг/кг) применялся per os однократно за 24 часа до заражения, t- р<0,05 - по отношению к интактным мышам.

р<0,05 - по отношению к нелеченному инфицированному контролю.

Таблица 4. Влияние введения Глимурида на фоне сепсиса на пролиферативную активность лимфоцитов у мышей линии Р|, выделенных через 4 часа после заражения * (М + ш)

Культура Спонтанная пролиферация лимфоцитов (импульсов/мин) Пролиферация, стимулированная митогенами (импульсов/мин)

Кон-А 1 мкг/мл ЛПС 1 мкг/мл

Контроль Тест Контроль тест Контроль Тест

P.aeruginosa 752185t 10781104tt 31281336t 39331412t? 23451403t 26741332

К. neumoniae 740±77f 1097±96 t} 40171351t 47951540t 25381236t 31781406

Р. vulgaris 694153t 976±88tJ 4052±434t 45901387 21471256t 29071275$

Е. coli 910±64f 1319±143tt 36711390t 43571402 18341226t 24791224tt

S. aureus 726171t 985180t} 29051185t 41231354tt 2578+291 307312703

Интактные мыши 567±49 52711472 31821376

* - Глимурид (1мг/кг) применялся per os однократно через 30 минут после

заражения.

t- р<0,05 - по отношению к интактным мышам.

р<0,05 - по отношению к нелеченному инфицированному контролю.

Таблица 5 Влияние профилактического введения Глимурида на пролиферативную активность лимфоцитов у мышей линии Б», выделенных через 48 часов после заражения * (М + ш)

Культура Спонтанная пролиферация лимфоцитов (импульсов/мин) Пролиферация, стимулированная митогенами (импульсов/мин)

Кон-А 1 мкг/мл ЛПС 1 мкг/мл

Контроль Тест Контроль Тест Контроль Тест

P. aeruginosae 456±37t 582154} 2097±244t 37241411t} 2019±225t 2787+200}

К. pneumoniae 461171 610162} 31041287t 46921393} 22511218t 31031280}

F. vulgaris 501123 «О 2016±I95t 4925+47fit 2128±174f 2794+319}

Е. coli 445±48t 638158} 2641±236t 4414+668J 1497±209t 1973±158t}

S. aureus 412±65t 619174} 2273±212t 30131276t} 2590±257t 3066+290

Интактные мыши •567149 5271±472 3182±376

* - Глимурид (1мг/кг) применялся per os однократно за 24 часа до заражения, t- р<0,05 - по отношению к интактным мышам.

}- р<0,05 - ло отношению к иелеченному инфицированному контролю.

Таблица 6 Влияние введения Глимурида на фоне сепсиса на пролиферативную активность лимфоцитов у мышей линии Бь выделенных через 48 часов после заражения * (М + ш)

Культура Спонтанная пролиферация лимфоцитов (импульсов/мин) Пролиферация, стимулированная митогенами (импульсов/мин)

Кон-А 1 мкг/мл ЛПС 1 мкг/мл

Контроль Тест Контроль Тест Контроль Тест

eruginosae 456±37f 852185U 2097±244f 43871387t} 20191225t 32811327}

К. pneumoniae 461±71 865190t} 3104±287f 52641503} 22511218t 3350+421}

P. vulgaris 501±23 781169t} 2016±195f 5195+497} 21281174t 34721361}

E. coli 445±48f 883185t} 26411236t 48411566} 14971209t 32971215}

S. aureus 412±65| 9611107t} 22731212t 49131406} 25901257 35971382}

Интактные мыши 567±49 527J1472 31821376

* - Глимурид (1мг/кг) применялся per os ежедневно со дня заражения. Последнее

введение препарата осуществляли за 1 час до выделения лимфоцитов. ■)■- р<0,05 - по отношению к интактным мышам.

}- р<0,05 - по отношению к нелеченному инфицированному контролю.

Однократное профилактическое применение Глимурида в дозе 1мг/кг per os ызывало у мышей с экспериментальным сепсисом восстановление угнетенной понтанной и стимулированной пролиферативной активности лимфоцитов, ыделенных через 4, 24 и 48 часов после заражения. Причем во многих случаях, собенно при исследовании через 4 и 48 часов от начала эксперимента, оказатели пролиферации достоверно не отличались от показателей интактных мвотных (таб.3,4, 5, б).

В целом сходные закономерное™ изменения пролиферативной активности имфоцитов обнаружены и при применении иммуномодулятора на фоне сепсиса, [ечение Глимуридом стимулировало деление лимфоцитов во все сроки сследования практически во всех модельных системах.

Таким образом, выявлена способность оригинального производного МДП оссгганавливать спонтанную и стимулированную митогенами пролиферативную ктивность лимфоцитов при ее угнетении в ходе септического процесса.

Далее мы исследовали влияние профилактического введения и применения лимурида на фоне сепсиса на фагоцитарную функцию нейтрофильных ранулоцитов при экспериментальном сепсисе через 48 часов после заражения в руппах животных, получающих а) антибиотикотерапию, б) комбинацию рофилакгаческого введения Глимурида с лечением антибиотиком, в) вмбинированное лечение Глимуридом и антибиотиком.

Профилактическое и терапевтическое применение Р-гептилгликозид-МДП [авало выраженный стимулирующий эффект на фагоцитарную функцию [ейтрофилов только на модели сепсиса, вызванного S.aureus (процент активно Фагоцитирующих клеток - фагоцитарное число (ФЧ) и среднее число юглощенных микробов на один макрофаг - фагоцитарный индекс (ФИ)). В юследнем случае профилактический прием Глимурида в дозе 1мг/кг за 24 ч до аражения на 25% увеличивал количество активных нейтрофилов (ФЧ) и вызвал [екоторую тенденцию к активации ФИ. А сочетание профилактического грименения иммуномодулятора и лечения антибиотиком приводило к 44%-ому ювышению числа активных фагоцитов. Терапевтическое применение гммуномодулятора вызывало увеличение ФЧ. На других моделях существенного шияния на активность нейтрофилов не выявлено. Обращает на себя внимание, гго в моделях с грамположительным сепсисом глимурид восстанавливал тнетенную фагоцитарную активность нейтрофилов. Вероятно, при рамотрицательном сепсисе эндотоксины или другие бактериальные компоненты I метаболиты вызывают более стойкое подавление метаболической активности 1ейтрофилов, резистентное к действию мур ам ил пептидов.

Комбинированное применение с антибиотиком позволяло восстановить ФЧ у кивотных, инфицированных К.pneumoniae и E.coli.

Таким образом результаты этой серии экспериментов свидетельствуют о шособноста Глимурида повышать показатели фагоцитарной функции «йтрофильных гранулоцитов.

Мультиорганные поражения и гибель животных с экспериментальным сепсисом во многом определяются активностью клеток моноцитарно-макрофагального ряда, в частности продукцией ими провоспалительных цитокинов.

Нами изучена способность Глимурида регулировать продукцию ИЛ-1 и ФНО ex vivo макрофагами, выделенными в разные сроки после заражения (таб.7). Макрофаги, выделенные через 4 часа после заражения, обладали повышенной цигокин-продуцирующей активностью в сравнении с клетками интакгных животных. Через 24 часа во всех модельных системах наблюдалось снижение способности макрофагов к продукции ИЛ-1 и ФНО. Достоверно пониженный уровень секреции ИЛ-1 сохранялся и к 48-му часу эксперимента в моделях с P.aeruginosa и E.coli. Эти различия были статистически недостоверны, хотя в целом к этому сроку г других модельных системах, за исключением стафилококкового сепсиса, также отмечена тенденция к снижению продукции ИЛ-1 и ФНО в сравнении с интактными животными.

Глимурид как при профилактическом, так и при терапевтическом использовании не вызывал достоверного изменения исходно повышенной выработки цитокинов макрофагами, выделенными через 4 часа «я начала эксперимента. Однако через 24 и 48 часов после заражения отмечена реактивация подавленной продукции ИЛ-1 и ФНО. Причем, если при профилактическом приеме иммуномодулятора выработка цитокинов восстанавливалась до уровня интакгных животных, то при терапевтическом применении Глимурида продукция ИЛ-1 и ФНО, как правило, превышала таковую у интакгных животных.

Помимо исследования способности Глимурида регулировать продукцию ИЛ-1 и ФНО макрофагами ex vivo (таб.7), нами исследована динамика изменений концентраций этих цитокинов в сыворотке крови в моделях экспериментального сепсиса, в том числе на фоне применения данного производного МДП.

Во все сроки изучения отмечен повышенный уровень указанных провоспалительных цитокинов в сыворотке зараженных животных. Максимальные концентрации отмечены через 4 часа после заражения, через 24 часа активность обоих цитокинов в сыворотке несколько снижалась, а через 48 часов отмечался достоверно повышенный уровень только ФНО, хотя и показатели ИЛ-1 были в целом выше, чем у интакгных животных.

Глимурид в двух вариантах применения (профилактика и лечение) вызвал существенное снижение сывороточных концентраций провоспалительных цитокинов через 4 и 24 часа от заражения. К 48 часу эксперимента при профилактическом приеме иммуномодулятора сохранялась тенденция к снижению незначительно повышенного уровня ФНО, в то время как терапевтическое использование Глимурида поддерживала несколько повышенную концентрацию ИЛ-1 и ФНО в сыворотке крови.

Таким образом, эта и предыдущая серии экспериментов свидетельствуют о способности Р-гептилгликозид-МДП подавлять избыточную продукцию провоспалительных цитокинов от vivo при септических заболеваниях, а также

Таблица 7 Влияние Глимурида на секрецию ИЛ-1 и ФНО ex vivo макрофагами, выделенными у мышей линии С57В1/6

через 4 часа после заражения

Культура Активность ИЛ-1 (индукция пролиферации тимоцитов), у.е. Активность ФНО (лизис клеток L-929), у.е.

Контроль Профила ктгаса+ Лечение + Контроль Профила кткка+ Лечение +

Р. aeruginosa 3,9±0,3 t 4,110,4 f 4,0±0,5 t 25±6 t 2415 t 2715 t

К. pneumoniae 4,310,4 f 4,2±0,5 t 4,310,4 t 24±5 t 2614 t 2314 f

Р. vulgaris 4,2±0,4 f 4,410,4 t 4,110,3 t 2517 t 2313 t 2614 f

Е. coli 4,8Ю,5 t 4,710,4 f 4,510,4 t 2814 t 27±5 t 2615 t

S. aureus 3,7±0,3 t 3,910,4 t 3,6Ю,3 t 1914 t 2015 t 1813 f

Интактные мыши 2,310,3 1214

через 24 часа после заражения

Культура Активность ИЛ-1 (индукция пролиферации тимоцитов), у.е. Активность ФНО (лизис клеток L-929), у.е.

Контроль Профила ктика+ Лечеине+ Контроль Профила ктика+ Лечение +

P. aeruginosa 1,810,1t 3,ОЮ,4$ 3,510,3tí 513 1116 1614tí

К. pneumoniae 1,910,2t 2,610,3$ 3,310,3tí 914 1714 19±5tí

P. vulgaris 1,810,2t 2,7+0,2+ 4,(ttO,3tt 613 I312Í 1813tí

E. coli 1,710,2t 2,310,4 2,910,3J 5±3 1415t 2014tJ

S. aureus 2,610,3 2,510,4 3,710,4tí 12+5 1313 1414

Интактные мыши 2,310,3 1214

через 48 часов после заражения

Культура Активность ИЛ-1 (индукция пролиферации тимоцитов), у.е. Активность ФНО (лизис клеток L-929), у.е.

Контроль Профила ктика+ Лече!гие+ Контроль Профила ктика+ Лечение +

P. aeruginosa 1,910,2 2,810,3t 3,810,4tt 1114 1315 1814

К. pneumoniae 2,110,3 2,7Ю,3$ 3,810,3tt 1013 1113 2113U

P. vulgaris 2,0М,3 2,610,lt 43±0»5tt 913 1512t 1912tJ

E. coli 1,9Ю,1 2,410,3t 3,510,4tt 813 15+2J 2014t$

S. aureus 2,410,4 2,ЗЮ,5 3,910,3 ft 1114 1412 1913t

Интактные мыши 2,310,3 1214

В таблице представлены данные трех независимых экспериментов.

р<0,05 - по отношению к шт.ктным мышам. {- р<0,05 - по отношению к нелеченному инфицированному контролю.

восстанавливать подавленную способность к продукции этих цитокинов ex vivo наблюдающуюся на поздних стадиях септического процесса.

Наши результаты любопытны с точки зрения современного представления с динамике иммунных нарушений при сепсисе и подходах к их коррекции. H.-D Volk et al. (1996.) показали, что при сепсисе первоначальная гилериммунны (гипервоспалительная) фаза, требующая подавления избыточной выработо провоспалительных цитокинов макрофагами, сменяется фазо? «иммунопаралича», при которой необходимо, наоборот, восстановлен и ( угнетенной активности моноцитов/макрофагов и других компонентов hmmvhhoi системы. Поэтому, если в первую фазу обосновано применение препаратов блокирующих эффекты ИЛ-1 и ФНО, то во вторую - средств, стимулирующие иммунную систему, в том числе макрофаги (интерферон-у, колониестсшулируюшш фактор гранулоцнтов и макрофагов). Таким образом применяя новое прокзБСДко; МДП, мы попытались исследовать возможность восстановления эффективно! работы иммунной системы в разные сроки после заражения возбудителем. Эгс доказывается снижением летальности и бактериальной обсемененносп внутренних органов и биологических жидкостей, а также снижениел выраженности и ускорением разрешения гнойного воспаления в почечной ткани.

Полученные нами данные говорят о возможности и целесообразности использования Глимурида на любой стадии септического процесса. Важнс отметить, что данный мурамилпептид оказывал эффект и при профилактическок приеме, и на фоне развивающегося септического процесса, причем эффект и в ток и в другом случае был сопоставим с действием антибиотика специальнс подобранного для данного микроорганизма. Вероятно, иммуномодулирующш эффекты Глимурида определяли и снижение изменений в почечной паренхиме характерных для перехода острого процесса в хронический пиелонефрит.

Результаты исследования говорят о перспективности применеши производного мурамилдипептида — Глимурида - как средства профилактики моно- и комбинированной терапии ряда бактериальных воспалительны? заболеваний, сопровождающихся иммунными нарушениями, в том числе токсико септических состояний и особенно септических поражений почек.

ВЫВОДЫ

1. Р-гептилгликозид-МДП (Глимурид) как при профилактическом, так и терапевтическом применении существенно снижает летальность мышей в моделях септических состояний, вызванных внутрибрюшинным введением культур К. pneumoniae, Е. coli и S. aureus; проявляет тенденцию к увеличению продолжительности жизни мышей, зараженных внутрибрюшинно летальной дозой P. aeruginosa, но не оказывает действие на модели инфекции, вызванной P. vulgaris.

I Профилактическое и терапевтическое применение ß-гептилгликозид-МДП ведет к снижению бактериальной обсемененности внутренних органов мышей, зараженных внутрибрюшинно культурами К. pneumoniae, Е. coli и S. aureus, Р. aeruginosa, Р. vulgaris.

!. Профилактическое и особенно терапевтическое использование ß-гептилгликозид-МДП в моделях септических состояний существенно снижает выраженность гнойного воспалительного процесса в паренхиме почек инфицированных мышей и ускоряет его разрешение.

I. Профилактическое и терапевтическое применение ß-гептилгликозид-МДП снижает повышенный на ранней стадии сепсиса уровень провоспалительных цитокинов (ФИО и ИЛ-1) в сыворотке крови и восстанавливает угнетенную на поздних стадиях септического процесса (через 24-48 часов после заражения) способность макрофагов к секреции ФИО и ИЛ-1 ex vivo.

5. ß-гептилгликозид-МДП восстанавливает спонтанную и стимулированную митогенами пролиферативную активность лимфоцитов при ее угнетении в ходе развития септического процесса, а также повышает фагоцитарную активность нейтрофильных гранулоцитов мышей с экспериментальным сепсисом.

6. Результаты исследования убеждают о перспективности включения ß-гептилгликознд-МДП в комплексную терапию ряда бактериальных инфекционных заболеваний, сопровождающихся иммунными нарушениями, в том числе токсико-септическнх состояний и особенно септических поражений почек.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Направленный поиск иммуномодуляторов гликозидов-мурамилпептидов. // Russian Journal of Immunology. - 1999. - v.4 (1). - p.253. (соавт. OJB. Калюжин, M.B. Шкалев, М.И. Калюжина, А.Е. Земляков.)

2. Новый дереват мурамиддипептида в лечении экспериментальных бактериальных перитонитов. // Сборник трудов, посвященный 120-и летаю 29 ГКБ. -2000. - с. 176. (соавт. Н.Г. Калина, О.В. Калюжин, Н.Е. Захарова.)

3. Применение ß-гептилгликозид-мурамилдипептида в экспериментальной терапии генерализованных бактериальных инфекций. // Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2000. - №4. - с.73 - 77. (соавт. О.В.Калюжин, Н.Г.Калина, М.И.Калюжина, А.Е.Земляков, М.В.Нелюбов, Ф.Н.Кузовлев, В.В.Сергеев.)

4. Глимурид в предотвращении хронизации уретритов микоплазменной этиологии. // Материалы III международной конференции по

восстановительной медицине. Московская область, Одинцовский район, поселок санатория им. Герцена МЦ УДП РФ. - 2000. - с. 347 - 348. (соавт. Калюжин О.В., Куэовлев Ф.Н., Караулов А-В.)

5. Профилактика и лечение септических поражений почек Глимуридом. Актуальные вопросы инфекционной патологии. // Материалы научной конференции, посвященной 30-летию кафедры инфекционных болезней. Нальчик. - 2001. - с. 31. (соавт. О.В. Калюжин, В.В. Калкжчн, Ф.Н. Кузовлер, М.В. Шкалев, AJvt Абидов.)

6. Амфифильный дериват мурамилдипептидов в терапии мышиной лимфомы EL-4. // Допросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. —2001. - №1. - с. 45 - 46. (соавт. Калюжин О.В., Нелюбов М.В., Кузовлев Ф.Н., Земляков А.Е., Шкалев М.В., Караулов A.B.)

7. Глимурид в экспериментальной профилактике и терапии септических поражений почек. // Материалы 2-ой Российской конеренции молодых ученых России с международным участием. - Москва. - 2001. - Т.1. - с. 185. (соавт. Калюжин О.В., Шкалев М.В., Калюжин В.В.)