Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Минимальная остаточная болезнь у больных острыми миелоидными лейкозами

^ 0 д На правах рукописи

9 ИЮЛ '007 Гальцева Ирина Владимировна

Минимальная остаточная болезнь у больных острыми миелоидными

лейкозами

14.00.29 - Гематология п переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1997

Работа выполнена в Гематологическом научном центре РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор В.Г. Савченко

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор А.К. Голешсов доктор медицинских наук, профессор Д.А. Торубарова

Ведущее учреждение: Онкологический научный центр РАМН

Защита состоится "_"_1997г. в_час.

на заседании диссертационного Совета Д 001.45.01 в Гематологическом научном центре РАМН {Москва, 125167, Новозыковский проезд, д.4а)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РАМН

Автореферат разослан "_"_1997г.

Ученый секретарь диссертацинного Совета кандидат биологических наук

В.Д.Реук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность. В настоящее время после проведения интенсивной химиотерапии у 60%-70% больных с острыми миелоиднъми лейкозами (ОМЛ) достигается полная ремиссия, причем 20% - 25% из этих больных имеют выживаемость более 5 лет.

Современная терапия острых миелоидных лейкозов строго стандартизирована, так как до настоящего момента не существует широко используемых прогностических тестов, основанных на данных начальной диагностики, позволяющих изменять дальнейшую тактику лечения: В связи с этим, с одной стороны, возрастает частота осложнений от проводимой химиотерапии, с другой стороны не всегда адекватен выбор терапии в период ремиссии и высок риск рецидивов, случающихся в 50% - 70%.

Возврат болезни, по утверждениям многих авторов (Сатрапа D. et at., Drach J. et al., Wörmann В. et al., Loken M. et al. и многие другие), происходит вследствие присутствия в костном мозге пациентов резидуальных лейкемических клеток, оказавшихся резистентными к проводимой индукционной химиотерапии. Возможным подходом к более адаптированной терапии в ремиссии может быть идентификация количества резидуальных лейкемических клеток в аспирате костного мозга от пациентов с острыми миелоидными лейкозами в полной ремиссии.

Морфологический метод не позволяет определять неопластические клетки, содержащиеся менее чем в 1% от клеточной популяции- Благодаря появлению современных методов, таких как мультипараметрнческой проточной цитометрии, генетического типирования, флюоресцентной in situ гибридизации стало возможным определение количества лейкемических клеток, находящихся ниже уровня, выявляемого морфологическим методом. Основной методологический принцип вышеперечисленных методов заключается в использовании того, что лейкемические клетки могут быть отличимы от нормальных гемопоэтичсских предшественников по ряду критериев. Одним из наиболее просто тестируемых признаков лейкемических клеток является необычная экспрессия поверхностных антигенов, обнаруживаемая у 70%-95% больных с острыми миелобластными лейкозами (Wörmann В. et al.). С помощью метода иммунофенотипирования и проточной цитометрии возможно установление антигенного профиля лейкемических клеток до начала лечения и проведение дальнейшего отслеживания в ремиссии остаточной популяции клеток по аберрантным фенотипам. Данный метод обладает высокой степенью чувствительности (Ю-4), большой скоростью анализа (1000 клеток в секунду) и позволяет выполнять количественный анализ, благодаря которому определяется нарастание или убывание резидуальных клеток. Именно последнее преимущество метода выделяет его среди других современных методов и позволяет обнаруживать минимальную резидуальную болезнь (МРБ) и проводить её мониторинг. По результатам многих исследований (Loken MR., KÖnemann S., Buchner Т., Hiddemann W., Wörmann В., Reading C.L., Drach J., Van Dongen J.J.M., Campana D., и др.) подтверждается взаимосвязь между длительностью ремиссии и количеством резидуальных лейкемических клеток, и выявление минимальной остаточной болезни коррелирует с сокращением продолжительности ремиссии. Таким образом, использование метода проточной цитометрии для определения

минимальной остаточной болезни может способствовать лучшей оценке результативности режимов химиотерапии, прогнозированию ранних рецидивов, определению показаний к интенсификации химиотерапии. Поэтому ЦЕЛЯМИ данной работы стали определение резидуальных лейкемических клеток по иммунофенотипическим признакам, позволяющих отличать последние от нормальных гемопоэтических клеток, выявление и мониторинг минимальной остаточной болезни в период ремиссии. Нахождение корреляции между минимальной остаточной болезнью и длительностью первой ремиссии.

Для решения поставленных целей принят ряд ЗАДАЧ:

1. Вьивить на лейкемических бластах антигенный профиль до начала химиотерапии у каждого конкретного больного с помощью методов иммунофенотипирования и проточной цитометрии, которые будут использованы на всех этапах исследования.

2. У каждого пациента установить аберрантный фенотип и выявлять посредством аберрантой экспрессии антигенов резидуальные клетки в морфологически подтверждённой ремиссии.

3. Определять количество резидуальных лейкемических клеток и установить критерий минимальной остаточной болезни в ремиссии.

4. Провести мониторинг количества резидуальных лейкемических клеток на протяжении ремиссии.

5. У каждого пациента сопоставить длительность первой ремиссии и наличие или отсутствие минимальной остаточной болезни.

Научная новизна.

Отмечена достаточно высокая частота экспрессии на миелоидных бластных клетках лимфоидных антигенов, из которых преобладающее значение имеют антигены ассоциированные с Т-клеточной линией дифференцировки.

Установлено, что среди аберрантного фенотипа, определяемого на резидуальных лейкемических клетках, асинхронная экспрессия миелоидных антигенов встречается в 1,7 раза чаще, чем аномальная коэкспрессия лимфоидных и миелоидных маркёров.

Обнаружено, что аномальная коэкспрессия В-лимфоидных и миелоидных маркёров встречается в 2,3 раза реже, чем коэкспрессия Т-лимфоидных и миелоидных антигенов.

Выявлена взаимосвязь длительности первой ремиссии и количества резидуальных клеток. Показано, что при наличии больше 0,12% резидуальных клеток (минимальная остаточная болезнь присутствует) продолжительность ремиссии составляет менее 6 месяцев, тогда как при количестве резидуальных клеток менее 0,12% ( минимальная остаточная болезнь отсутствует) больные находятся в ремиссии больше 6 месяцев.

Прослеживается тенденция к нарастанию количества резидуальных клеток в М4 и М5 подтипах острого миелобластного лейкоза по сравнению с М2 и МЗ подтипами в независимости от предложенного лечения.

При остром миелобластном лейкозе медиана продолжительности первой ремиссии в 2,5 раза короче у пациентов с минимальной резидуальной болезнью по сравнению с пациентами без минимальной резидуальной болезни.

Наиболее прогностически неблагопрятной и чаще встречающейся аномальной комбинацией является аберрантный фенотип СВ34/СОч?65. Благоприятный прогноз ассоциируется с аберрантными комбинациями С034/СЭ13, С034/С1)15, коэкспрессия С019 с маркёрами СОЗЗ и СП34. Практическая ценность.

Определены аберрантные фенотипы, позволяющие обнаруживать резидуальные лейкемические клетки.

Установленные прогностические значения отслеживаемых аномальных комбинаций помогут более полной оценке ремиссии.

Выявлена взаимосвязь длительности первой ремиссии и количества рсзидуальных клеток у больных с острыми миелодными лейкозами, находящихся на курсах химиотерапии, а также установлено, что наличие минимальной остаточной болезни является прогностическим признаком раннего развития рецидива. Внедрение в практику.

Полученные данные могут быть использованы в практической работе отделений, специализирующихся на лечении больных острыми. лейкозами. Результаты работы докладывались на гематологических симпозиумах, в стендовых докладах, опубликованы в отечетвенной и Зарубежной печати. Публикации.

По теме диссертации опубликовано 2 работы, 3 статьи в редакции. Апробация диссертации.

Основные положения диссертации доложены на Международных школах гематологов в г. Москве: июнь 1995г., январь, июнь 1996г.; Всероссийском декаднике по гематологии, апрель 1997г.; Международном симпозиуме по острым лейкозам в г. Мюнстер, ФРГ, февраль 1997г. Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 111 страницах, состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 10 отечественных и 163 зарубежных источников литературы. В работе 24 таблицы, 7 рисунков (из которых 5 рисунков включают по 2 гистограммы), 2 графика, 1 схема. Диссертация выполнена в отделении гемобластозов и трансплантации костного мозга (зав. - профессор, доктор медицинских наук В.Г. Савченко) ГНЦ РАМН (директор - академик А.И. Воробьев).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ В настоящей работе приводятся результаты проведённого обследования 37 первичных больных и 20 больных в ремиссии, находившихся на лечении в двух отделениях химиотерапии гемобластозов ГНЦ РАМН за период с марта 1994 года по сентябрь 1996 года. У всех 37 первичных пациентов диагностирован ОМЛ.

Среди них было 25 женщин и 12 мужчин в возрасте от 16 до 61 года, медиана возраста составила 37 лет. Общая характеристика больных представлена в таблице 1.

Таблица 1

Распределение первичных больных по полу, возрасту и подтипам ОМЛ (согласно

FAB классификации).

ОМЛ

подтип женщины возраст мужчины возраст всего

М2 11 16-61 3 24-58 14

МЗ 4 26-40 2 16,27 6

М4 9 17-52 6 17-54 15

М5 1 43 1 43 2

Всего 25 12 37

медиана 37 36

возраста

Критерием включения больных в исследование являлось отсутствие химиотерапии до момента диагностики.

У 35 больных диагноз ОМЛ был установлен на основании обнаружения >30% бластных клеток в костном мозге, у 2-в периферической крови, идентификация подтипов ОМЛ производилась с помощью цитохимических маркерных реакций и иммунофенотипирования.

Всем пациентам с ОМЛ проводилась химиотерапия по стандартным программам и до начала химиотерапии они были рандомизированы и включены в протокол лечения. Первый индукционный курс химиотерапии выполнялся по одной из следующих схем : "7 + 3" (рубомицин 45мг/мг), "7 + 3" (рубомицин 60 мг/м2), "7 + 3" + вепезид-16, ВРМ-83. Дальнейшие курсы индукции-консолидации у части больных изменялись, что диктовалось особенностями клинического течения заболевания или проявлением токсичности.

В период индукции-консолидации 12 пациентов вышли из исследования по следующим причинам: 4 пациентов умерло от инфекционных осложнений, 6 оказались резистентными к проводимой химиотерапии и двое пациентов отказались от дальнейшего лечения, хотя находились в полной ремиссии.

Ремиссия подтверждалась морфологическим исследованием костного мозга в период индукции (после первого и второго курса химиотерапии) и считалась достигнутой при уровне бластных клеток менее 5%, при отсутствии экстрамедуллярных очагов и восстановлении гемопозза.

Впоследствии анализировалось 20 пациентов, которым на протяжении полной ремиссии, что регулярно подтверждалось морфологическим исследованием костного мозга, выполнялся мониторинг резидуальной болезни. Поддерживающую терапию по стандартному протоколу получало 14 больных, 6-вышли из стандартного протокола.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Для определения резидуальных лейкемических клеток у больных с ОМЛ применялся метод прямой и непрямой иммунофшооресценции и мультипараметрическая проточная цитометрия. Первое исследование образцов костного мозга (выделялась мононуклеарная фракция) от 37

первичных больных выполнялось на этапе диагностики с целью установления лейхемического иммунофенотипа.

Использовалась панель, состоящая из 20 моноклональных антител (мкАТ), конъюгироваиных с одним из двух флюорохромов: Р1ТС, и фикоэритрин (РЕ) (см. таблицу2). С помощью мкАТ определялись поверхностные лимфоидные и миелондные антигены на популяции бластных клеток, указанные в таблице 3.

Таблица 2

Характеристики используемых моноклональных антител.

препараты мкАТ флтооро- CD принад- класс Ig npoinno^atuan

хром лежность KOMnaiiim

DAKO-CD34 FITC CD34 Gl DAKO

НРСА - 2 РЕ CD34 Gl BectonDickinson

Anti-HumanCD45 FITC CD45 Gl Sigma

Anti-CD15 РЕ CD15 M Sigma

Leu - М7 РЕ CD13 Gl Becton Dickinson

Leu - МЗ FITC CD 14 Gl Becton Dickinson

Leu - М9 РЕ CD33 Gl Becton Dickinson

Leu-9 FITC CD7 Gl Becton Dickinson

Anti-HumanCD5 FITC CDS Gl Sigma

CD2 РЕ CD2 Gl Caltag

Му-7 РЕ CD13 Gl Coulter

CD10 РЕ CD10 Gl Caltag

DAKO-CD4 РЕ CD4 Gl DAKO

DAKO-CD19 РЕ CD19 Gl DAKO

VIM-2 CDw65 M Behring

DAKO- FITC гликофорин А Gl DAKO

Glycophorine А

норм, иммуноглоб. FITC Gl DAKO

мыши

норм, иммуноглоб. РЕ Gl DAKO

мыши

норм, иммуноглоб. FITC G2 BectonDickinson

мыши

норм, иммуноглоб. FITC M Sigma

мыши

Таблица 3

Определяемые во время диагностики поверхностные антигены на бластных клетках .у больных ОМЛ. 0

ассоциированные с T- клетками ассоциированные с В- клетками ассоциированные с миелоиднымн клетками ассоциированные с клетками предшественниками

CD 2 CD 10 CD 13 CD 34

CD 4 CD 19 CD 14

CD 5 CD 15

CD 7 CD 33

CDw 65

Техника окраски.

Костно-мозговой аспират (1-2 мл) переносили в пробирку с гепарином и мононуклеарную фракцию клеток изолировали путем центрифугирования в градиенте плотности изопак фиколла (р=1,077г/см3) в течение 30 минут, клетки дважды отмывали фосфатным буфером, инкубировали при t-+4QB течение 30 минут с мкАТ (в качестве изотипичеких контролей использовались нормальные мышинные иммуноглобулины) и, после инкубации дважды отмывали фосфатным буфером.

Окрашенные клетки анализировали на проточном цитометре модели EPICS-C фирмы Coulter с аргоновым лазером мощностью 2000 мВт с трехдекадной системой логарифмического усиления. Оценка антигенного профиля при острых лейкозах проводилась на властной популяции, которую на скатограмме изолировали с помощью электронного окна. При двухцветном окрашивании использовались два флюорохрома FITC и РЕ.

В каждом образце иееледовалось 5000 клеток при одноцветном проточцоцигометрическом анализе и 10000 клеток при двухцветном. Экспрессию каждого антигена считали позитивной если количество бластных клеток, связанных с соответствующим антителом превышало 20% от общего количества просчитанных клеток (по отношению к изопшному контролю). После получения результатов по всему набору мкАТ устанавливали лейкемический фенотип.

Второе исследование костного мозга выполняли в период морфологически подтверждённой ремиссии. На этом этапе непосредственно выявлялись резидуальные клетки и определялось их количество. Аепират костного мозга забирался после 2 или 3 курса химиотерапии, в зависимости от того, достигалась ремиссия после 1 или 2 курса химиотерапии. Таким образом, все образцы костного мозга были получены и исследованы в подтверждённой продолжающейся ремиссии. Надо отметать, что только при восстановлёном гемопоэзе (учитывались показатели периферической крови, при лейкоцитах больше 1 х 109/л, гемоглобине более 90 г/л, тромбоцитах более 40 х 109/л) и в сроки не менее 30 дней после курса химиотерапии были взяты образцы костного мозга.

Резидуальные лейкемические клетки в ремиссии обнаруживали благодаря аберрантному лейкемическому иммунофенотипу. Мононуклеарные клетки, окрашивали парами мкАТ, соответствующие аномальным комбинациям антигенов, экспрессируемых на популяции бластных клеток до лечения у каждого конкретного больного. Все ремиссионные образцы исследовалась с помощью двухцветного анализа. На проточном цитометре подсчитывался процент клеток с одновременной позитивностью по двум антигенам. На скатограмме предварительно выделялась популяция клеток, находящаяся в мононуклеарной области. Просчитывалось 10000 клеток.

Аберрантная экспрессия антигенов включала следующие комбинации: 1) одновременная экспрессия лимфоидных CD2, CD5, CD7, CD19 и миелоидных антигенов; 2) асинхронная экспрессия зрелых CD 13, CD 14, CD 15, CDw65 и незрелых CD34 миелоидных антигенов.

Выбор вышеперечисленных аномальных комбинаций антигенов опирался на фундаментальные исследования немецких авторов (Terstappen L.W.MM., Loken M.R., Könemann S., Buchner Т., Hiddemann W„ Wörmann B.)

и ряда других исследователей (Reading C.L., Drach J., Van Dongen J.J.M., Сатрапа D., Macedo G. и др.).

В период сохраняющейся ремиссии проводился мониторинг резидуальных лейкемических клеток также по образцам костного мозга. Интервалы между исследованиями были 3-6 месяцев. Констатация рецидива служила основанием прекращения исследования для данного больного.

Методика выполнялась в лаборатории физиологии кроветворения (зав. проф. Чертков И.Л.) под руководством к.м.н. Митерева Г.Ю.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕЙКЕМИЧЕСКОГО ИММУНОФЕНОТИПА НА ЭТАПЕ ДИАГНОСТИКИ.

У всех больных с ОМЛ в период диагностики; на скатограмме преобладала бластная популяция (в большинстве случаев практически тотальное замещение других клеточных линий).

У двоих пациентов миелобласты не экспрессировали миелоидные маркёры, у троих экспрессировали один миелоидный антиген, что составило 8,1% от всех больных, 14 пациентов экспрессировали два миелоидных антигена и это составило 37,8%, у 12 больных выявилась экспрессия трёх миелоидных маркёров, что составляет 32,4%, 6 пациентов (16,2%) экспрессировали четыре миелоидных антигена.

Таким образом, два и более миелоидных антигенов экспрессировалось у 32 пациентов (86,5%).

Частота встречаемости лимфоидных антигенов была,следующая: CD2 экспрессировался у 7 пациентов (18,9%), CD 4 - у 3 пациентов (8.1%), CD5 - у 7 пациентов (18,9%)), CD7 - у 11 пациентов (29,7%), CD 10 - у 2 больных (5,4%), CDI9 - у 4 больных (10,8%). Аналогичные результаты были получены Bradstock et al. на 301 пациенте в возрасте от 15 до 60 лет с недавно диагносцированным ОМЛ.

Суммируя данные по позитивности лимфоидных антигенов у всей группы первичных больных установлено, что в 43% случаев ОМЛ определялись иммунофенотипические признаки лимфоидной линии. Такая же частота экспрессии лимфоидных маркёров описана Macedo et al. и соответствует данным Terstappen et al. Частота встречаемости антигенов, ассоциированных с В-линией была значительно меньше, чем антигенов специфичных для Т-линии. Полученные результаты согласуются с результатами исследований Del Vecchio L. et а1,и Lo Coco F. et al.

На популяции бластных клеток среди миелоидных маркёров с большей частотой обнаруживалась позитивная экспрессия CD33 и CD13, составившая 60% и 57% соответственно, CDw65 выявлен в 45,8% из 24 случаев ОМЛ, которым ставилась реакция с мкАТ VIM2. Позитивность CD 15 подтверждена в 18,9%, а позитивность CD 14 в 13,5% случаев от всего количества ОМЛ. Низкая частота встречаемости CD 14 и CD15 при ОМЛ подтверждалась Bradstock et al. на большой группе пациентов и составляла менее 20%. Позитивная экспрессия CD34 на лейкемических бластах была в 64% случаев, что соответствует результатам многих исследователей, по данным которых

уровень экспрессии CD34 колеблется от 45% до 67% среди взрослых пациентов с OMJI.

Не прослеживается чёткой зависимости между иммунофенотипом и подтипом ОМЛ ( М2, МЗ, М4, М5), только у семи пациентов, из которых пять с МЗ и двое с М2, антигенный профиль соответствует определённому подтипу ОМЛ. На практике, как указывалось некоторыми авторами, только подтипы М1, Мб, М7 без сомнения могут быть определены по антигенному профилю.

Отмечается большая частота встречаемости позитивной экспрессии CD 19 при М2, определённая в 35,7% от 14 случаев М2, по сравнению с подтипами МЗ, М4, М5, составляющая 4,3% от 23 случаев этих лейкозов. По данным Hurwitz et al, Kita K.et al, Dongen и других авторов уже была обнаружена корреляция между CD19 и FAB М2 случаями с t (8; 21).

Таким образом, при ОМЛ среди миелоидных маркёров наиболее часто экспрессируются CD33 и CD13. Экспрессия CD34 не является обязательным признаком миелоидных бластных клеток. Достаточно высока частота экспрессии лимфоидных антигенов, из которых преобладающее значение имеют антигены, ассоциированные с Т-клеточной линией, в особенности CD7.

ВЫЯВЛЕНИЕ РЕЗИДУАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ПО АБЕРРАНТНОМУ ИММУНОФЕНОТИПУ.

Резидуальные лейкемические клетки ь ремиссии обнаруживались по аберрантному лейкемическому иммунофенотипу, определённому до лечения. Костный мозг от 20 пациентов анализировался в подтверждённой продолжающейся ремиссии, и первое определение резидуальных лейкемических клеток приходилось на период индукции-консолидации. Частота встречаемости аномальных комбинаций с коэкспрессией лимфоидных и миелоидных маркёров приведена в таблице 4. Коэкспрессия CD2 и CD 13 составила 5% от 20 случаев ОМЛ, CD2 и CD33 - 5%, CD2 и CDw65 - 5%. Аналогичные результаты получены для CD5 и CD13, CD5 и CD33, CD5 и CDw65. В качестве патологической комбинации (в нормальном костном мозге не определяется) рассматривалось сочетание CD5 и CD34, выявленное в 10% случаев.

Таблица 4

Частота выявления аномальных сочетаний лимфоидных и миелоидных антигенов на резидуальных клетках у 20 пациентов с ОМЛ.

Т-клсточные антигены мяелоидные антигены

CD13 CD33 CD34 CDw65

CD2 1* 1 1

(5%)** (5%) (5%)

CD5 1 1 2 1

(5%) (5%) (10%) (5%)

CD7 3 3 3

B-клеточные антигены (15%) (15%) (15%)

CD19 2 2 2

(10%) (10%) (10%)

Примечание: * число пациентов, ** процент случаев.

Самый высокий процент встречаемости среди лимфоидных маркёров, экспрессируемых одновременно с миелоидными, подтверждён для CD7 и составлял 15% для комбинации CD7 и CD 13, 15% для CD7 и CD33, 15% для CD7 и CDw65.

Сочетание CD 19 и CD 13 обнаружилось в 10% случаев, такой же процент выявлен идя комбинаций CD 19 и CD33, CD 19 и CD34.

Полученные результаты частоты встречаемости перечисленных аберрантных фенотипов практически полностью совпадают с данными С. L. Reading et al.

В следующей таблице 5 приведено общее количество случаев экспрессии каждого лимфоидного антигена в сочетании с миелоидными. В большинстве случаев определяется экспрессия CD7 с миелоидными антигенами (CD 13 и/или CD33, и/или CDw65). Коэкспрессия Т-лимфоидных и миелоидных маркёров в сумме составляет 35% от 20 случаев OMJI (7 пациентов из 20), а коэкспрессия В-лимфоидных и миелоидных антигенов встретилась в 15% случаев (3 пациента из 20) и этот результат аналогичен данным Syrjala et al. Общее количество одновременной экспресии Т-лимфоидных и В-лимфоидных антигенов с миелоидными антигенами составляет 40% (8 пациентов из 20). Аналогичные результаты частоты встречаемости коэкспрессии Т-и В-лимфоидных с миелоидными, всех лимфоидных маркеров с миелоидными. описаны Reading et al.

Таблица 5

Общая частота сочетаниой экспрессии Т-или В-кяеточных антигенов с миелоидными антигенами, экспрессируемых на резидуалышх клетках у 20

больных ОМЛ.

лямфондные антигены CD2 CDS CD7 CD 19

число больных I (5%)* 2 (10%) 6 (30%) 3 (15%)

Примечание: * процент^лучаев.

Асинхронная экспрессия миелоидных антигенов обнаружена у 70% пациентов (14 пациентов из 20). Частота комбинаций с асинхронной экспрессией миелоидных антигенов рассматривается в таблице 6.

Таблица 6

Асинхронная экспрессия миелоидных антигенов у пациентов с ОМЛ.

комбинации маркёров частота встречаемости (%)

CD34/CDw65 9(45)

CD34/CD15 4(20)

CD34/CDI4 1 (5)

CD34/CD13 7(35)

Наибольший процент случаев (45%) асинхронной экспрессии был установлен для комбинации CD34 и CDw65. Majdic et al. обнаружили, что 91% изученных ОМЛ реагировало с мкАТ VIM2 (анти CDw65). Macedo et al., исследуя костный мозг здоровых доноров подтвердил, что нормальные CD34 позитивные клетки одновременно не экспрессируют CDw65. Следовательно, можно утверждать, что комбинация антигенов CD34 и CDw65 является аномальной, а доя ОМЛ частота коэкспрессии этих маркёров достаточно высока, учитывая, что CD34 экспрессируется при ОМЛ от 40% до 60%.

В 20%> случаев на резидуальных опухолевых клетках определена коэкспрессия CD34 и CD15. Reading et al. определили данную комбинацию в 18% из 265 пациентов с ОМЛ, Terstappen et al. выявили в 25% асинхронную экспрессию CD34 и CD15, исследуя 80 пациентов с ОМЛ. Gerhartz et al-, используя культуральный метод и двойное окрашивание, не обнаружили подобной аномальной комбинации на нормальных клетках костного мозга.

Асинхронная экспрессия CD34 и CD 13 установлена в 35% случаев. Этот результат превышает процент, который получили Reading et al., составляющий 21%. Как показали Engel, Drach et al., выполняя сортинг популяций клеток с аберрантным фенотипом CD34+/ CD 13+, CD33+/ CD4+, CD33+/ CD3+, с последующей постановкой FISH, хромосомные аномалии были обнаружены особенно часто в популяции клеток CD34+/ CD 13+.

Коэкспрессия CD34 и CD14 встретилась в 5% из 20 больных с ОМЛ. Reading et al. также указывали на небольшой процент встречаемости этой комбинации. В исследованиях Macedo et al. не выявлено одновременной экспрессии CD34 и CD14 на клетках нормального костного мозга, полученного от 13 здоровых доноров, что даёт основание считать экспрессию CD34 и CD14 аномальной.

Из 20 исследованных пациентов только 8 экспрессировали по одной аномальной комбинации, что составляет 40%, у остальных пациентов определено по две и более пары аберрантного фенотипа, причём у 75% больных (15 пациентов из 20) сочетались комбинации асинхронной экспрессии миелоидных антигенов с коэкспрессией лимфоидных и миелоидных маркёров.

При рассмотрении иммунофенотипа всех 37 первичных больных с ОМЛ, аберрантная коэкспрессия поверхностных антигенов выявляется в 78% случаев (29 пациентов из 37). По данным Reading et al. аномальные комбинации поверхностных антигенов обнаружены в 85%, у Macedo et al. в 73%, Wôrmann et al. указывает на 60%>-90 %. Вероятно, некоторые различия в выявленном количестве аберрантного фенотипа зависят от набора мкАТ и от определения всех аномальных модификаций или их части (помимо коэкспресии миелоидных и лимфоидных маркёров, асинхронной экспрессии, отслеживание избыточной экспрессии или потерю миелоидных антигенов).

Анализируя аберрантные фенотипы, можно сделать вывод, что асинхронная экспрессия миелоидных антигенов встречается чаще в 1,7 раза чем аномальная коэкспрессия лимфоидных и миелоидных маркёров. Среди асинхронной экспрессии миелоидных антигенов комбинация CD34 и CDw65 обнаружилась в 45% случаев, что составляет самый высокий процент по отношению к остальным комбинациям. Коэкспрессия В-лимфоидных и миелоидных антигенов встречается в 2,3 раза реже чем коэкспрессия Т-

лимфоидных и миелоидных маркёров и в большем проценте случаев определяются комбинации CD7 с миелоидными маркёрами (CD13, CD33, CDw65), составляющие 30%.

ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ПЕРВОЙ РЕМИССИИ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВЫЯВЛЕНИЯ МИНИМАЛЬНОЙ РЕЗИДУАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ У БОЛЬНЫХ С ОМЛ.

МРБ устанавливалась благодаря точной количественной оценке резидуальных лейкемических клеток. Первое определение числа резидуальных клеток приходилось на период индукции - консолидации в подтверждённой продолжающейся ремиссии. В течение ремиссии проводился мониторинг резидуальных клеток.

Всю популяцию пациентов мы разделили на две группы по признаку продолжительности первой ремиссии. Между первой и второй группами пациентов обнаруживается значительная разница в длительности первой ремиссии. Одна группа больных находилась в первой ремиссии свыше 6 месяцев, другая группа больных сохраняла ремиссию до 6 месяцев, включительно. В первую группу вошло 12 больных, содержащих менее 0,12% резидуальных клеток, во вторую группу отнесено 8 пациентов с количеством остаточных клеток больше 0,12%. Таким образом, в процессе исследования эмпирически был установлен критерий прнсутсвия МРБ, которым являлось обнаружение больше 0,12% лейкемических клеток с двойной позитивностью аномальной комбинации антигенов в образцах костного мозга от больных с ОМЛ. Анализировались образцы костного мозга от трёх здоровых доноров, где количество клеток, окрашенных парами мкАТ, соответствующих всем аномальным комбинациям, определяемым у 20 пациентов на лейкемических клетках, не превышало 0,12%.

Методом статистического анализа (выполнен зав. лабораторией биостатистики информационных систем к.т.н, С.М.Куликовым) подтверждается эмпирически установленное пороговое значение количества резидуальных клеток. Для определения точного порогового значения использовалась специальная статистическая модель процесса, не учитывающая контрольные показатели (т.к. недостаточное число здоровых доноров), в которой предполагается, что вся совокупность наблюдений распадается на 2 подгруппы. Первая подгруппа - больные, у которых значение количества клеток меньше некоего порогового уровня, вторая - у которых значение больше некоего порогового уровня и эти две группы отличаются среднем временем наступления рецидива. Таким образом, случайный процесс наступления рецидива описывался трёхпараметрической вероятностной моделью, оценка порогового значения числа клеток и оценка длительности ремиссии в подгруппах на основе эксперементальных данных были получены методом максимизации правдоподобия (см. рис.1). Метод реализован в программе Microsoft Excel.

Рис. 1 Результат оценки порогового значения метом максимизации функции правдоподобия.

Статистический анализ доказывает, что резидуальные клетки в количестве 12 на 10 ООО исследуемых костно-мозговых клеток, являются пороговым значением в определении МРБ.

Первая группа больных без МРБ имела длительность ремиссии от 8 до 16 месяцев, из которых шестеро пациентов оставались в ремиссии (на момент последнего обследования-сентябрь 1996г.). Среди этих больных у двоих отмечается самая длительная первая ремиссия, наблюдаемая в течение 16 месяцев. Шесть пациентов дали рецидив в сроки от 8 до 14 месяцев и медиана длительности первой ремиссии у них составила 10,7 месяцев. Для всей группы медиана определена по кривым дожития и составляет 11,8 месяцев. Вторая группа больных с наличием МРБ имела длительность ремиссии от 3 до 6 месяцев включительно с медианой 4,7 месяца. В этой популяции преобладали пациенты с М4 и М5 вариантами ОМЛ, которые составляют 62,5% от всех пациентов с МРБ.

Методами статистического анализа (выполнены также в лаборатории биостатистики информационных систем Масловой Е.С.), при помощи критерия хи-квадрат, с применением статистического пакета SAS была изучена взаимосвязь основных характеристик пациентов: возраст, пол, подтип ОМЛ, схема индукционного курса химиотерапии, тип поддерживающей терапии в ремиссии, достижение ремиссии после первого или второго курса индукции с изучаемыми характеристиками: длительность первой ремиссии (больше 6 месяцев), количество резидуальных клеток (больше 0,12%). Статистически достоверных связей между вышеуказанными параметрами не обнаружено. Но, прослеживается тенденция к нарастанию резидуальных клеток параллельно с возрастанием варианта ОМЛ. При этом, выявлена статистически значимая взаимосвязь (р<0,0001) между длительностью первой ремиссии и количеством резидуальных клеток, подтверждающая, что при содержании последних выше порогового уровня сокращается продолжительность ремиссии до 6 месяцев включительно (см. схему 1, график 1).

Схема 1

Взаимосвязь количества резидуальных лейкемических клеток и длительности

ремиссии.

II

р

о

Д

0 Р

л е

ж м

я и

т с

е с

л и

ь и

н

0

с

г

ь

< 6 мес

> 6 мес.

числа резидуальных клеток ¿0,12% >0,12%

0 8

12 0

ч и с л о

б о л ь д ы

X

р < 0,0001

График1-

Графическое изображение взаимосвязи между количеством резидуалышх клеток и длительностью ремиссии.

Связь между количеством резндуалыак клеток и длнгелыюсгью первой ремиссии

«1

0.8 +

0.6

♦ рецедив О в ремиссии

р, о о 5

0.4

7 * <5 п

7 Во °

♦ 1 *

И 13 □

месяцы с момента начала первой ремиссии

рис.г

Р

1 .0

0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0

Безрецидивная выживаемость в зависимости от количества резидуальных клеток

О

4-1-

2 4 6 8 10 12 14 16 18

месяцы (от начала первой ремиссии)

Группы больных в зависимости от количества резидуальных клеток:

1 - резидуальных клеток > 0.12 %

2 - резидуальных клеток <= 0.12 %

Р< 0.0001

I I 1

Г-|

Кривые безрецидивной выживаемости строились по методу Каплан-Майера (выполнены в лаборатории биостатистики Е.С.Масловой), значимость отличия кривых дожития вычислялась на основе критерия Вилкоксона (см. рис. 2). Первая группа больных с количеством резидуальных клеток больше 0,12% имела длительность ремиссии до 6 месяцев включительно, а все пациенты с количеством резидуальных клеток менее 0,12% (2 группа) пережили 6 месяцев.

Оценка прогностического значения той или иной аномальной комбинации показана в таблице7, где для каждого аберрантного сочетания антигенов представлено количество всех случаев, экспрессирующих данный фенотип (среди 20 пациентов) и количество ранних рецидивов, предсказанных этой комбинацией (когда уровень резидуальных клеток был больше 0,12%).

Таблица7

Количество ранних рецедивов, предсказанных по аномальным комбинациям, экспрессируемым на резидуальных клетках у пациентов с ОМЛ.

аномальные комбинации антигенов

С034 / С034 I С015 СБ34 / С013 С034 / С014 СБЗЗ 1 С019 СБЗЗ / С07 С034 1 СВ19 С034 / СИ5 СБВ / С07

количест во случаев 9 4 7 1 2 3 2 2 3

количест во ранних реиизивов 6 0 0 1 0 2 0 0 2

Как видно из таблицы 7, наиболее прогностически неблагоприятным является фенотип С034/С0и'65, после которого следуют комбинации С07/СЭЗЗ или С07/СП13. Благоприятным прогнозом обладают сочетания СР34/С013 и С1334/С015, коэкспрессия СИ 19 с миелоидными маркёрами.

В качестве примера зависимости длительности первой ремиссии от количества резидуальных клеток приводятся гистограммы образцов костного мозга двух больных, находящихся в морфологически подтвержденной ремиссии (см. рис. 3, 4).

Мб^РЕ

С034 РЕ

з 3

А \lsIgM Р1ТС В СБш65 Р1ТС

Рис.3. Двухцветный проточноцитометрически анализ образца костного мозга от больного У.М.И., взятого в ремиссии. Клетки одновременно позитивные по двум антигенам находятся в квандраите 2. (А).Негативный контроль, где клетки, конъюгированные с изотипным контролем Мв^О РЕ и Р1ТС,

находятся в квандранте 3. (В).0,69% резидуальных опухолевых клеток одновременно экспрессируют антигены СБ34 и СО\у65. Длительность ремиссии составила 5,5 месяцев.

Мб^РЕ

1

СБ13РЕ

А МЙ^ Р1ТС В СБ34 Р1ТС

Рис.4. Двухцветный проточноцитометрический анализ образца костного от больного Д.Г.В., взятого в ремиссии. Клетки одновременно позитивные по двум антигенам находятся в квандранте 2. (А).Негативный контроль, где клетки, конъюгированные с изотипным контролем Мб^О РЕ и Мб^О Р1ТС находятся в квандранте 3. (В).0,01% резидуальных опухолевых клеток одновременно экспрессируют антигены С034 и СЭ13. Длительность ремиссии составила 14 месяцев.

Таким образом, выявлена взаимосвязь длительности первой ремиссии и количества резидуальных клеток, установившая, что при наличии последних в количестве больше 0,12% (МРБ+), продолжительность ремиссии составляет менее 6 месяцев и наоборот, при количестве клеток менее 0,12% больные находятся в ремиссии больше б месяцев. Пороговый уровень резидуальных клеток определён эмпирически и подтверждён методом статистического анализа. Прослеживается тенденция к нарастанию резидуальных клеток параллельно с возрастанием подтипа ОМЛ. Медиана длительности первой ремиссии в 2,5 раза короче у пациентов с МРБ по сравнению с пациентами без МРБ. Самый прогностически неблагоприятной аномальной комбинацией является аберрантный фенотип С1334/СОш65 и он же наиболее часто экспрессируется в популяции пациентов с МРБ. Сочетания СП34/СП13, С034/СБ15 и коэкспрессия СЭ19 с миелоидными маркёрами характеризуются благоприятным прогнозом.

ВЫВОДЫ.

1. У больных с острыми миелоидными лейкозами в период морфологически подтверждённой ремиссии заболевания выявляется персисгенция резидуальных опухолевых клеток.

2 Аберрантная экспрессия антигенов дифференцировки, определяемых с помощью проточной цитофлюорометрии, выявляется на опухолевых клетках у большинства больных острыми миелоидными лейкозами (78%).

3. Обнаружение в фазе ремиссии заболевания более 0,12% клеток, экспрессирующих аномальные сочетания антигенов, позволяет констатировать наличие минимальной остаточной болезни.

4. Выявлена статистически значимая взаимосвязь количества резидуальных клеток и длительности первой ремиссии, подтверждающая сокращение последней до 6 месяцев включительно при количестве клеток больше 0,12% (минимальная резидуальная болезнь присутствует), продолжительность ремиссии составляет больше 6 месяцев при количестве клеток менее 0,12% (минимальная резидуальная болезнь отсутствует). Медиана длительности первой ремиссии в 2,5 раза короче у пациентов с минимальной остаточной болезнью по сравнению с пациентами без неё.

5. Установлено, что на популяции резидуальных лейкемических клеток асинхронная экспрессия миелоидных антигенов встречается в 1,7 раза чаще, чем аномальная экспрессия лимфоидных и миелодных маркёров. Сочетание СВ34/СОи'65 обнаружено в наибольшем проценте случаев (45%) асинхронной экспрессии миелоидных антигенов.

6. Аномальная экспрессия В-лимфоидных и миелоидных маркёров встречается в 2,3 раза реже, чем одновременная экспрессия Т-лимфодных с миелоидной направленностью антигенами, в большем проценте случаев определяется аберрантный фенотип, включающий комбинации С07 с миелоидными маркёрами (30%).

7. Обнаружение на опухолевых клетках сочетаний аномальной экспрессии антигенов С034/С0\у65 свидетельствует о высокой вероятности развития раннего рецидива заболевания; выявление сочетаний таких антигенов как С013/С07, С033/С137, С034/14 также является фактором неблагоприятного

прогноза. Благоприятным прогнозом обладают сочетания антигенов С034/С013, С034/С015, и одновременная экспрессия С019 с СОЭ4 или СБЗЗ.

8. В период диагностики заболевания у больных с острыми миелоидными лейкозами чаще других антигенов миелоидной направленности на миелобластах выявляется экспрессия СБЗЗ и СО 13. Установлена высокая частота экспрессии лимфодных антигенов (43%), из которых доминирующее значение имеют антигены ассоциированные с Т-клеточной линией, в частности С07.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Гальцева И.В.,Митерев Г.Ю., Паровичникова Е.Н., Савченко В.Г. Детекция резидуалыюй минимальной болезни при острых мнелоидаых лейкозах. Тезисы докладов III Всероссийского съезда гематологов и трансфузиологов, Санкт-Петербург, 1996

2. Galtseva I., Miterev G., Parovitchnicova H., Kulikov S., Maslova H., Savchenko. Detection of minimal residual disease in AML patients. Annals of Hematology, suplí. 1, vol 74, abstract 214, 1997