Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Микровезикулы крови в патогенезе острой гемостатической реакции

уи344ЬЬ

На правах р\ кописи

ЗУБАИРОВА ЛЯЙЛИ ДИЛЯЗЕРОВНА

МИКРОВЕЗИКУЛЫ КРОВИ В ПАТОГЕНЕЗЕ ОСТРОЙ ГЕМОСТАТИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ

14 00 16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

' ^ СЕН2<}пд

КАЗАНЬ - 2008

003446581

Работа выполнена в Гос\ дарственном обраюватстьном учреждении высшего профессионального образования «Казанским государственьш мсднцинскии яниверситег Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный консультант:

Доктор медицинских наук, профессор Бойч\к Сергеи Васнтьевич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских нау к, доцент Доктор медицинских наук профессор Доктор медицинских наук, профессор

Кисе тев Сергей Васильевич Фассахов Рустем Салахович Поздеев Оскар Кимович

Ведущая организация'

ГОУ ВГТО «Новосибирский государственный медицинский университет Федера тьного агентства но здравоохранению и социачьному развитию»

Защита диссертации состоится «/ /» года в

часов на заседании диссертационного совета Д 208*034 01 при ГОУ ВПО Казанском государственном медицинском университете Росздрава по адрес\ 420012 г Казань ул Бутаерова. 49

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Казанскою юсударственнного медицинского университета

Автореферат разослан

2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета ,7

локтор медицинских наук, профессор чУ'/С)М Затятютдинова

ОГицлн хлрпмсрисшкл работы

Акту л ii.nocib проблемы

санкционирование системы гемостаза в физиологических условиях включено в эффективное кровоснабжение тканей преду преждение кровопотерь тромбозов ишемий и инфарктов защиту от диссеминации бактерий и токсинов В то же время чрезвычайные по силе или продолжительности воздействия вовлекают реакции гемостаза в механизмы заболевании как в качестве центральных звеньев патогенеза так и в качестве ус\1\бляющих первичное повреждение [Балхда ВП, 1995 Петрищев НН, 2000, Баркаган ЗС, 2001 Воробьев А И 2001, Макацария АД, 2002, Кузник Б И, 2004] Несмотря на значительный прогресс, достигну тын в понимании механизмов свертывания крови и тромбообразовання артериальная, венозная или системная тромбоэмболия остается основной причиной смерти и нетрудоспособности населения индустриально развитых стран [Kordstrom М et al, 1992, Sallah S et al 2002, Nowak-Gottl U et al, 2003/2004]

Развитие теории свертывания крови в основе которой лежит главенство тканевого фактора в инициации тромботического процесса а также активное участие клеток крови и эндотелия в ключевой составляющей свертывания -генерации тромбина расставляет новые акценты в патогенезе тромбозов Гиперкоагуляционное или претромботнческое состояние развивается ^ак следствие преобладания активации прокоагулянтных факторов над антикоагу шинными представления о которых продолжают уточняться Нескотько десятилетий назад клеточные и плазменные компоненты системы гемостаза были дополнены субклеточными этементами - мембранными фрагментами - микровезикулами отделяемыми при активации и апоптозе клеток и обладающими прокоагу лянтной активностью клеточного источника (Wolf Р 1967, Зубаиров ДМ и др 1974] Они признаны не тотько полноправными компонентами системы гемостаза но и рассматриваются в качестве важнейших участников инициальных событий активации свертывания крови и тромбообразовання [Зубаиров ДМ 2000, Scholz Т et al. 2002, Furie В et al 2005 Sinaundze E I etal 2007] Везикуляция клеток рассматривается, как способ увеличения прокоагу лянтной поверхности, поскольку также, как и активированные клетки, микровезикулы снабжены аминофосфолнпидами необходимыми для сборки факторов свертывания крови в теназньш (1Ха с Villa) н протромбиназнын (Ха с Va) комптексы Функциональные комплексы адгезии на микровезим тлх происходящих из тромбоцитов опосредуют и\ взлимодействие с фактором фон Вииебранда колтагеном, фибрином и фибриногенох! [Miyazaki Y et al 1996, Siljander P et al 1996, Holme P A et al 1997] Однако микровезикуты не только нес\т доступный фосфатидилсерин и адгезивные белки или комплексы но также дрхгие прокоагулянтные молеку ты и в первую очередь тканевой фактор если они происходят из клеток экспрессирующич эти вещества [Muller I et al, 2003]

Роть микровезикул в паготогических процессах остается предметом дисьлссии С одной стороны выявтяется повышение \ ровня микровезику л крови

при целом ряде заболевании сопровождающихся пшерколгу темней JMallat Z et a I 2000 Кип Н К el al 2003 Preston R A etal 2003] Вместе с тем в контексте гемостатических реакции повышенный уровень микровезикул не обя;ательно ведет к тромбозу поскольку они «опт также стиугу лировать экспрессию •штикоагулянтной активности активированного протеина С [Tans G etal 1991] а содержание фасфатидилсерина может меняться в зависимости от типа клетки предмета и условия индукции хшкровезику ляции [Wcerheim AM et al 2002, Frevssinet J-M 2003] Кроме того высокий уровень ушкровезикул может быть проявлением адаптивных изменений при патологии Так при аутоиммунной громбоцнтогтенни более высокий уровень микровезикул был обнаружен у пациентов без геморрагических осложнений, что предполагает их адаптивною гемостатическую роль Это продемонстрировано также при гемофилии, где уровень микровезикул выше нормального и может повышаться при ра¡витии острого кровотечения, как отражение мобилизации системы гемостаза без у грозы троушотических осложнений так как имеется недостаточность образования тромбина [Horstman L L et al, 1992 Proulle V et al, 2001] To есть микровезикулы, участвующие в физиологическом гемостазе в цетом вьитолняют адаптивную фу нкцию

Предполагается что механизмы вовлечения микровезику л в физиологические и патологические процессы многообразны Допускается что их количество - определяющий физический фактор, что подразумевает проявление патогенных свойств микровезикул только посте достижения их числа внепороговых значений Исходя из концепции гомеостаза, уровень этих субклеточных образований, вероятно, отражает баланс между пролиферацией активацией и смертью клетки Сдвиг в одном из этих направлений ведет к патологическим нарушениям с существенными изменениями в составе микровезику л зависящими от природы стимула а дополнительно образующиеся микровезикулы вызывают усиление ответа в клетках-мишенях или реципиентах

С тех пор как достигнут относительный консенсус в определении этих субклеточных образований характеристики микровезику л пополняются в рамках расшифровки механизма отторжения фрагментов клеточных мембран и внекоагу ляционного значения этого процесса - их роли как одной из форм межклеточной сигнализации Вместе с тем с точки зрения интегрального вклада микровешку тяццонного механизма в адаптивные и патогенные последствия уюбилизацнп системы гемостаза in упо представляется важным определение зичамнки микровезику ляции на ранних этапах гемостатической реакции Kpoyie того система гемостаза, как всякая открытая система в организме использует ра личные сценарии развития реакции при воздействии разных стимулов Расшифровка особенностей микровезику ляции в этих обстоятельствах расширит представления о уюхлнизмах острых гемокоагу ляционных реакций и о во'люжности применения количественных и качественных характеристик микрове5ик\ л как маркера при изучении колгу ляционных нарушении

Исходя из этого предпринято настоящее исстедованне в котороу! определены следующие челн и задачи

Цель псслсдонлмпя

Опредетсние патогенетической рот микровезик) ляции клеток ьрови при острых гемостагическич реакциях

Задачи исследования

1 Оценить динамику мнкровезикуляцни в ответ на краткосрочный однократный стресс при острой кровопотере соотнести ее с изменениями гемостаза

2 Определить рои. вазоактивны.х гормонов - адреналина и вазопрессина как индукторов мнкровезикуляцни при острой гемостатическон реакции

3 Определить динамик) микровезик) ляции при псрсистенции внутрисосудистого прокоаг) пят ного стрессора -на ранних сроках эндотоксинемии ч в ходе развития синдрома

две

4 Исстедовать прокоагулянтный фенотип микровезик) л и оценить динамик) их колзгчества в системном кровотоке и на )частке активации гемостаза индуцированного на фоне гиперкоаплемии физиотогическими родами

5 Провести сравнитепьное исследование количественных и качественных характеристик чнкровезнкут при физиологическом и оперативном родоразрешении

На\ иная новизна

Впервые исстедованл динамика уровня микровезик) ляции в крови на ранних стадиях мобилизации гемостатических реакций ш м\о как функции разчичных моделей активации клеток-эффекторов гемостаза Показано что острые стрессоры - массивная кровопотеря эндотоксинемия гиперадреналинемия 1 -дсзаушно-Х-О-аргинин-ва зопрессннсушя. инициирующие гиперкоагуляцию ицдуцируют отделение клеточных микровезикул и диссеминацгао их в системный кровоток в короткие сроки (15 мин\т) Вьмвлено что интенсивность микровезикуляции под втиянием однократных стрессоров -адренаишемии и кровопотери меняется кратковременно Длительное усиление микровезик) тяции при эндотоксинемии сопровождается развитием диссеминированного вн\трисос\дистого свертывания

Впервые определен уровень и прокоаг)аянтный фенотип микровезик)л в системном кровотоке и в маточной крови в динамике родоразрешения Вьщвтено пространственное ограничение микровезик) тяционной реакции при физиологическом родоразрешении характеризующееся образованием в 11 раз ботьшего котичества микровезик)! с двукратно повышенной экспрессией фосфатидитсеринов на паацентарнои площадке Впервые выявлено принципиачьнос разтичие процесса микронезик\ тяции при физиологическом и оперативном родоразрешении, состоящее в образовании микровезик) т с повышенной экспрессией фосфатидитсеринов е. системной цирку пяции в динамике кесарева сеченич Таким образом показан один из механизмов

декиаптации гемостатического ответа и повышенного риска развития тромбогеморрагического синдрома при оперативном родоразрешении

Праыпчсская значимость состоит в разработке нового подхода к оценке патогенеза коаглляцнонныч пару шений как базы для совершенствования диагностики и методов терапии протромботическнх состояний основанного на расширении шаний о механизмах вовтеченных в формирование гиперкоаплемии Полл-ченные данные о динамике микровезнку ляшш в кров1! отражающей степень мобилизации системы гемостаза позволяют считать образование микровезнку т универсатьным механизмом стрессовой реакции клеток и испотьзовать определение количества микровезикул дтя выявтения инициальной стадии острой гнперкоап лемии Прокоагулянтный фенотип микровезнку л оцениваемый методом проточной цитомстрни по уровню связывания липофитыгого фтюорохрома мероцианина 540 может нспотьзоваться как маркер доя выявтения инициирования гиперкоагуляции Отсутствие видовой специфичностн маркера позвотяет применять данный метод исстедования и в экспериментах на животных Результаты проведенного исследования могут быть испочьзованы патофизиотогами и гемостазиочогами в научной практической и учебной работе

Внедрение результатов исследования в практику. Теоретические потожения рафаботанные в диссертационном исследовании, внедрены в научно-педагогическ\ю деятетьность кафедр патотогической фнзиотогки и биохимии Казанского государственного медицинского университета Росздрава при изучении механизмов тромбообразования и свертывания крови Вновь нспотьзованные лабораторные методы внедрены в таборатории иммунологии Респхбтиканского центра по профилактике и борьбе со СПИД и ИЗ МЗ РТ и клинико-диагностической паборлторни ГУ «Межрегиональный клинико-диагностический центр » МЗ РТ о чем свидетельствуют соответствующие акты внедрения

Основные поюжения, выносимые на защиту:

1 Уситение микровезикч тяции клеток сосудистого сектора является типовой реакцией на острый стрессор, рашивающейся в течение 15 минут при этом мобтизуется попу тяция микровезнку 1, содержащая в составе птидныч ппотов экто-5' нуклеотидазу и обогащенная прокоагу тянтными фосфатндилсеринами Пик микровезик\ тяции совпадающий с максимальным vcкopeниeм свертывания крови позвотяет считать микровезнкучы патогенетическим фактором гиперкоагу тяции при остром стрессе

I Динамика интегральной микровезнкуляции в крови отражает варианты клеточных реакций на стиму т - при однократном стрессе реакция развивается '.а минуты в соответствии с рефтскторным принципом нервной регуляции свертывания крови Персисгенция стрессора сопровождается продлением мнкровеинфляционной реакции в течение часов с распространением в кровоток частиц, обогащенных фосфатндичсеринамн В организме претерпевшем прокоагу пянтнмо перестройку микровезнку тяция в ответ на остр\ю активацию гемостаза ограничена рамками токатьного адаптивного ответа

1 Слщсственнос чстснне микровеппл ляционнон реакции под влиянием чрезвычайных по продолжительности и cine прокоагу чянтных стрессоров сопровождается ра шитисм явной картины синдрома ДВС при эндогоксинемии и ботее интенсивной чокальнои мнкровешну чяциеи с диссемшыциен в системную циркуляцию микровезикул с повышенной экспрессией фосфатидилсеринов кореттирующей с цирк\ тяциеи активированных тромбоцитов при оперативном родоразрешении

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены на V Всероссийской конференции Всероссийской ассоциации по изучению тромбозов геморрагии и патологии сосудистой стенки, «Тромбозы, геморрагии ДВС-синдром Проблемы течения» - Москва - 2000, Региональной конференции «Акгуальние проблемы теоретической и прикладной биохимии» - Ижевск 2001, Первой Всероссийской наччнои конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» - Москва -2003 Третьем Российском конгрессе по патофизиологии ' Дизрсгутяционная патология органов и систем' Москва 2004, Второй Всероссийской научной конференции «Клиническая гемостазиология и гемореотогия в сердечнососудистой хирургии»- Москва- 2005, Всероссийской конференции Всероссийской ассоциации по изучению тромбозов, геморрагии и патолоти сосудов 'Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром Современные достижения" -Ярое 1авль - 2005 Нервом Всероссийском форуме «Инновационные технологии медицины XXI века» - Москва - 2005, Всероссийской конференции с международным участием «Гемореология в макро- и микроциркуляции» Ярославль 2005, Третьей Международной конференции молодых врачей «3-rd Young Medics International Conference». Армения, Ереван 2005 Беломорском симпозиуме "Актуальные вопросы гсмостазиологии и трансфузиологии -Архангельск- 2005 VIII World Congress International society for adaptive medicine. Moscow 2006 Всероссийская конференция с между народным участием 'Тромбозы в клинической практике факторы риска, диагностика терапия' - Санкт-Петербург. 2007

Личный вклад автора.

Определен алгоритм исследования предполагающий интегральную оценку количества микровешку i и их прокоагу лянтнэго фенотипа в динамике гемостатического ответа. инициированного тремя прокоагулянтными стрессорами - острой кровопотерей, эндотоксинемней родоразрешением Проведен анализ научной читературы собрана и структурирована информация по проблеме исследования определены методики проведено разделение на тогически завершенные этапы Для изучения посгавченной проблемы с моим \частием проведены экспериментальные исследоьания микровешку чяционной реакции при постгеморрагической и индуцированном эндотоксином гиперкоагу темии Под моим руководством проведено исследование особенностей \шкрове$ик\ ляции при фтио логическом и оперативном

родоразрешенни Проведена статистическая обработка группировка ашчи-, реп чьтатов интерпретированы по именные данные Публикации

По теме диссертации опубтиковано 36 работ из них 9 - в журналах рекомендованных ВАК Минобразования Российской Федерации

Объем и структура диссертации

Диссертация шчожена на 224 страницах машинописного текста Состоит нз введения обзора литературы описания материалов и методов исследования. 3 глав с изложением результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения выводов практических рекомендаций и списка литературы Работа иллюстрирована 24 таблицами. 33 рисунками Библиография содержит 314 источников, в том числе 47 отечественных и 267 зарубежных авторов

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы н методы исследования

Эксперимента чьные модели Острая кровопотеря

Кровопускание из мобичизованной под местной анестезией бедренной артерии в объеме 1 5 мл/100г ушссы тс та соответствующее острой массивной потере крови [Зубаиров Д M 1957, Imai Y, 1996] производитесь 12 бодрствующим обездвиженным кроликам Забор проб крови в течение часа осуществится тефлоновыми канюлями которые использовали для кровопускания Количество микровезижуч и состояние гемостаза оценивали до кровопускания и мере? 5 15 30 60 минут - после в отдельной серии экспериментов на 6 животных регнстировачось артериальное давление на кимографе

Адреналннемия и вазопрессинемия

ч бодрствующих1 обездвиженным кроликам вводили внутривенно 1 мкг/кг синтетичесюш аналог вазопрессина 1-дезамино-8-0-аргинино-вазопрессин (десмопрессин. DD A VP) яв тяющшга агонистоУ! \4-рецегтторов (adiuretin FERRING) в 1 5 мт 0 85% раствора NaCl [Bernât А, 1997] 10 кроликам внутривенно вводили 0 5 мг/кг хлористоводородного адреналина в 1.5 уп 0 85% раствора NaCl [Ingram G 1С 1961] 8 контрольныу! животным такого же веса вводили внутривенно 1.5 мч 0 85% раствора NaCl Кровь для исследования по ту чачи и 5 бедренной артерии тефтоновыми канючями количество угикровезик\л и скорость свертывания крови оценивали до введения агонистов и через 5 15, 30 60 минут - посте введения

Эндотоксинемия

15 крочикам вводнчн внутривенно эндотоксин Е coli полученный ультразвуковой дезинтеграцией с постедующиУ! у чьтрацентрифу гированиеУ! и гельфильтрацней дв\ кратно первый раз 1 мг/кг н через 24 часа 3 мг/кг [Bronza J Р 1(>90. Perlik V 2005] 12 контрольным животньш вводит равный объем 0 85% раствора NaCl Кровь дчя исследования почучали из бедренной артерии тефлоновыуш канючями через 5 15 30 60 минут и 24 часа посте однократного введения эндотоксина далее чере? 15 30 120 мин посте повторной инъекции эндотоксина

Клинические гр\ ппы

Клиническии материал представлял собой результаты обследования 47 беременных женщин родорл ¡решенных путем операции кесарево сечение и через естественные родовые пути в родильном отделении клиники им проф В С Груздева, а также 20 нсберсменных женщин репродх ктивного возраста

Производилось динаушческое исследование микровезикуляции в последовоу! и раннем послеродовоу! периодах физиологических родов а также при кесаревом сечении Исследовались пробы цитратной периферической крови в 1 и 3 периодах физиологических родов до разреза на коже и после извлечения плода при операции кесарево сечение, а также исследовалась ретроплацентарная кровь

На проведение исследования получено одобрение Республиканского Комитета по Этичссыш вопросаУ! при проведении клинических испытании-исследовашш лекарственных средств при Министерстве Здравоохранения Республики Татарстан Bceyi женщинам была предоставлена информация о сути проводимого исследования с подпнсаниеУ! добровольного информированного согласия на участие

Основными критерияуш включения в группы для исследования явились отсутствие клинических, и лабораторных признаков коагу лоплтическнх расстройств серьезной экстрагенитллкно» гатолсгии, тяжелого геслша а также по исходам родоразрешения (без патологической кровопотери) Средняя кровопотерч составила 180 77 + 9,02 мл при физио логических родах и 459,29 + 19 43 мл при кесаревоУ1 сечении

Забор периферической крови осуществлялся венепункцией иглой G21 регроплацентарную кровь собирали при ее свободном истечении из полости матки сразу после рождения последа при физиологических родах и забирали непосредственно из полости матки после извлечения последа при кесаревоУ1 сечении

Выделение микровезику л

0 9 мл крови набирали в пробирки содержащие 0.1 мл профильтрованного стерильного 3,8% раствора цитрата натрия (разведение 9 1) для стабилизации ретроплацентарнои крови использовали разведение 8 2 Стабилизированную кровь ценлрифугировалн 15 ушнлт при 1500 g. отделяли бесклеточную плазму

Для оценки общего геуюстатнческого потенциала и разУ1еров микровезику л применялась у льтрафильтрацня бестроУ1боцитарной плазмы Использовалась сконструированная науш тефлоновая ячейка где под давлением 2 атм обеспыленного воздуха (Мембранный кохшрессор ЗМА Киев) производили фильтрацию через > льтрафильтр Synpor VUFS (Прага) с разу1ером пор ~0„2 У1км Оценка активности экто-5'-ну клеотидазы

Кровь для определения активности экто-5'-нх клеотидазы стабилизировали кристаллическим гепариноУ! (Spofa Прага) Активность фермента определяли по 1ПУ1СНСНИЮ скорости гщролиза аденозин-э'-уюнофосфата при избирательном ингибнровлнни 5'-нуклеотидазы ионами никеля с последующим тестированием неорганического фосфата Метод включает в себя два параллельных определения

ферментативном активности в maíMC с аденоиш- 5'-монофосфлтом в качестве субстрата В первом опредетении в отсутствии ионов ннкечя оценивается общая фосфатазная активность во втором - присутствие ионов никетя специфически подавпяет 5'-нх клеотидаз\ и таким образом опрсдетяется гидропнз только неспсцифической щеточной фосфатазой Разница активностей (в единицах освобожденного неорганического фосфата) дает активность 5'-ну клеотидазы и выражается в наномолях субстрата гидролизом иного в 1 секлнд\ 1 литра раствора (нанокаталах л"' нкат ч'1)

Подсчет котичества микровезнку т в проточном цитометре Бесклеточная пчазма разводитась раствором Cell Wash (Becton Dickinson США) 1 10 и исследовачась методом проточной щггометрии на приборе FACS Calibur (Becton Dickinson) Абсотютное котичество микровезикул в 1 мкл определяли по светорассеиванто за фиксированное время (60 секунд) с испотьзованием программы Cell Quest регистрируя количество событий за единицу времени [Abrams С S 1990] Регистрация прямого малоугтового (FSC) и бокового (SSC) светорассенвания в логарифмическом режиме позволича дискриминировать мнкровезикулы в отдельной зоне Оценка ремоделирования мембраны

Нарушение асимметрии клеточной мембраны оценивалась окрашиванием клеток и мнкровезику т фтлорохромом мероцианннол! 540 (МС540) Регистрация клеток и микровезикул с повышенной интенсивностью флуоресценции выявляет изменения упаковки мембранных фосфочипидов при их перемешивании (scrambling) [Flesch F М. 2001 R Jessel R. 2002] и совпадает с экспрессией фосфатвди гсернна при ее вьмв тении аннекенном V [Мустафнн И Г , 2005]

Экспрессию фосфатидичсерина с помощью МС540 опредетяли стедующим образом 0 5 мт крови в полистиротовых пробирках 12x75 мм (Falcon 2052) подвергачи тизнрованию (лизирутощий раствор Becton Dickinson) для уда пения эритроцитов трижды центрифугировали по 15 минут при 1500g дтя удатення продуктов тнзиса Осадок клеток ресуспенз1фовати в 1 мт раствора Cell Wash (Becton Dickinson) Маточный раствор МС540 (концентрация 1мг/мт) в объеме 5 мкл вносит в 1 mi клеточной суспензии, содержащей 1 10б кл/мл (конечная концентрация МС540 5мкг/мл) ити 1мт плазмы в разведение 1 2 раствором Cell Wash Пробы перемешивачи и инкубировали в течении 5 минут в темноте при комнатной температуре Регистрацию резучьтатов осуществили на втором детекторе FL2 цитометра

Определение фенотипа МС540 положитетьных клеток Оиенкч фенотипа клеток связывающих мероцианин проводичи по экспрессии тромбоцитарного пикопротеида Ilb-IIIa посте окрашивания моноклона 1Ы1ЫМИ антителами F1TC-CD61 (Becton Dickinson) в реакции прямой имм\нофч\оресиенцни Разтнчные обтасти эмиссии испотьз\емых ф^орохромов по5ВОЧИТИ произвести одновременную оценк\ фенотипа MC540f клеток крови Дчя исключения неспсцифической фтхорссцснцни проводити рсакпию с отрппатечьным изотипнчсским контротсм (испочьзовачи

иммуноглобу тины мыши того же изотипа меченные аналогичным флуорохромом FITC)

Скрининг гемостаза и цпгограммл крови

Колгуляционную активность в экспериментальных сериях определяли по времени свертывания крови в аппарлте Базарона ГЦ при \Т С и 100% влажности на поверхности парафина Скрининговую оиснк\ системы гемостаза ь клинических группах производили по уровню фибриногена активированному частичном) троУ1ботастиновоу[) времени, протромбнновоУ1У времени ь коаг) ломстре Thrombotimer 4 (Beluik Elektronik) ЦнтограмУ!) крови

определяли в гематологическом анализаторе MICROS-bO-18 АБХ Коушьютерную элекгроколгу логрлфию (КЭлКГ) осуществляли с применением аппарата - коагу лограф Н-334 оценивали параУ1етры Т1-образование тромбина Т2-образование фибрина. Атах-ушкашальная амплитуда AI-амплитуда чере1 10 минут от начала ретракции (отражает фибринолитическу ю активность крови которая высчитвается по формуле ФА=А1х100/Ашах (%) Оценка активности тромбина

Активность тромбина определяли спектрофотометрическн (Specol 20 С Zeiss) по гидротизу хроуюгенного субстрата S-2238 в цельной крови и в птазУ1е Аушдолитическуто активность троУ1бнна выражали в нМ расщепленного S-2238 за 1 ч чикл бахал Для определения лмидолитическои активности тромбина в цетьнон крови и плазуш 0 025 уп исстедхемого материала центрифугировали в одноразовыл по tj ¡стироловых кюветах для спектрофотометргш помещенных в бакет-ротор при 3000 g 15 mihi Не взмучивая осажденные клетки, на них настаивали 1,4 мт 0 05 М Трис-НС1, 0,1 М NaCI 20 mM EDTA pH 7,9 и 0,075 мл \ мМ paciBopa S-2238 п одновременно включали секундомер В течение 30 с измеряли поглощение при 405 нм и далее гомерення повторяли через 10 лпш на протяжешш 1 часа [Begum S ,1988]

Определение растворимых фибрин-уюномерныч комплексов в плазме крови

Использован набор РФМК-тест («Технология Стандарт» Россия Варна) т) Принцип метода опредетения растворимых фибрин-мономерных коуштексов в птазме крови заключается в регистрации времени (сек) появления зерен (паракоагу лята) фибрина посте добавления к ней раствора орто-фенантротина гидрохлорида с последующим переводом результатов (сек) е количество РФМК (мг%)

Оценка концентрации внеклеточного гемоглобина

Концентрацию внеклеточного гемоглобина служившего маркером геуюлиза оценивали по поглощению при 540 нм в кварцевых мпкромоветах птазчш крови повторно центрифугированной 20 минут при 2670 g |GemerE W 1980] в спектрофотометре Spekol 20 (С Zeiss Jena)

Статистический анализ потученных результатов проводили на псрсонлльноУ! компьютере с применением пакетов прикладных програуш «Exelb и «BIOSTAT» Достоверность раз тичии полученных резу льтатов оиенивали по

критерию С'тьюдента. Коррелятивный анализ результатов проводили с применением параметрического метода Спирмена. '

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Прежде всего была произведена оценка объекта исследования путем 1 определения размеров и коагуляционной активности микровезикул. Фильтрация | бесклеточной фракции плазмы через фильтр с размерами пор ~0,2 мкм выявила: до фильтрации количество микровезику л при проточной цитометрии составляло | 123810.2±11706,4/ мкл, после фильтрации 17020,0*972,1/ мкл (13.7%), активность экто-5'-нуклеотидазы - 68,7±7.3 нкат-л"1 и 7,8±0.9 нкат-л ' (11.4%). \ соответственно (рис. 1).

Таким образом. 86-88% микровезикул имели размеры более 0,2 мкм. а 1214% - менее 0,2 мкм. Скорость свертывания рекальцифицированной плазмы! крови составляла 0,014±0.00018 с'1. бестромбоцитной плазмы: отцентрифутированной в течение 15 мину т

А

Х 1>!;' л."

Ж

"Э Ьг <7 V У

50

Ш

---■......

0 ,ю фильтрации о посла фильтрмщи '

Рис. 1 Оценка размеров микровезикул методом фильтрации А. Проточная цитометрия плазмы до фильтрации - левая панель, после фильтрации правая панель. Б. Уровень экто 5'-нуклеотидазной активности

при 3000 об/мин. - 0.0055±0,0003 с" (р<0,001, п=6). а после фильтрации через фильтр со средним диаметром пор 0.2 мкм свертывание замедлялось до 0.0023±0.0002 с"1 (р<0,001; п=6). То есть удаление фракции микровезикул с размерами более 0.2 мкм. составляющих по нашим данным 86-88% общей популяции, приводила к снижению гемокоагуляционного потенциала бестромбоцитной плазмы крови. Таким образом, в стабилизированной плазме крови присутствуют микровезикулы, обладающие коагу ляционной активностью.

Микровезику.тнция в крови в динамике острой к'ровоио гери.

Кровотечение вызывает адаптационные реакции, направленные на сохранение адекватного кровообращения, среди которых - повышение скорости свертывания крови. Первичный ме.ханшм ускорения тромбиногенеза остается

неясным, гак как при легальном анализе сдвигов, происходящих в системе свертывания | крови после острой кровопотери. обращает на себя внимание нормальный уровень ({»акторов V. LX. X XI. XII. антитромбина Ш. уменьшение содержания фибриногена, протромбина. (|»актора VIII, антитромбина П.

В наших экспериментах острое кровопускание из бедренной артерии > бодрствующих кроликов сопровождалось снижением кровяного давления на 25.2±6 4 мм Hg (ркО.01; н=6). которое возвращалось к исходному у ровню через 60 минут Развитие гиперкоагулемии проявлялось устойчивым сокращением времени I свертывания крови, начиная с 5 минуты после кровопускания с 987,45±48,65 до ! 543.67+50.99 сек. (р<0,01; и=12), не достигающим исходных значений в течение 60 j минут наблюдения - 627.30±61,90 сек. (р<0.01: п=12) Максимальное ускорение ] свертывания наблюдалось на 15-й минуте - 418.4±72.3 сек. (р<0,001; п=12). Активность тромбина в цельной крови до кровопотери составляла 0.41+0.21 нМ/час расщепленного хромогенного субстрата S-2238. через 15 минут после кровопускания - 0.81± 0.11 нМ/час (р < 0.05; п=12). то есть тромбин, образуясь в больши;. 1 количествах, цирку лировал в крови

120 т

12 3 4

!- исходный уровень, 2 - 5 минул, 3-15 минут. 4-30 минут. 5 - 60 минут ЕШЭ время свертывания крови ("») "——активность 5-нуклеотндазы (нкаг) |

Рис. 2 Сравнительная динамика микровезикуляиии и времешевертывания крови при кровопогсре ***- р<0,001, **- р<0,01, *- р<0,05 по сравнению с уровнем до кровопотери

Исследование активности мембранного эктофермента 5'-нуклеотидазы в бесклеточной фракции стабилизированной плазмы выявило достоверный рост на 15 минуте после кровопускания с 4I.23i4.27 до 91.34±19.67 нкагл1 (р<0.01. п=12). Поскольку фильтрация плазмы приводила к снижению активности экто-5'-нуклеотидазы на 88.6%. можно заключить, что фермент преимущественно связан с поверхностью микровезикул, а возрастание активности в плазме свидетельствовало об усилении процесса микровезикуляции в крови.

Полученные нами результаты демонстрируют, что микровезикулы крови \ являются пусковым фактором острой постгеморрагической гиперкоагулемии. поскольку их образование и циркуляция в системном кровотоке индуцировано на ранних этапах - через 15 минут после кровопускания и совпадает с тромбинемией и ускорением свертывания.

При соотнесении динамики свертывания и митровезикуляции видно (рис. 2), что усиление мнкровезикуляции немного отстает от развития гиперкоагулемичеекой реакции, которая сохраняется и после того, как уровень 5'-нуклеотидазы снижается Это можег объясняться тем, что образование теназного и протромбиназного комплексов начинается на поверхности активированных клеток еще до отделения микровезикул. Пик активности фермента соответствует максимальному ускорению свертывания. Коэффициент ранговой корреляции для времени свертывания крови и активности экго-5' -нуклеотидазы составил -0.700 (р<0.05;

п=12). то есть выявлена отрицательная коррелятам средней степени.

_ . . . __ , __ . , . , , |

160 140 120 100 80 60 40

|

1 - исходный уровень. 2 - 5 минуг. 3-15 минут, 4 -30 минут. 5 -60 минут ЕШШ время свертывания крови ("») "" акгавность 5-нхтоиотидазь|

Рис. 3. Сравнительная динамика мгафовезикуляции и времени свертывания крови под влиянием адреналина **- р<0.01. *- р<0,05 по сравнению с исходным

уровнем

Являясь стрессором, острая кровопотеря включает адаптивный ответ, реакции которого обусловлены активацией гиноталамо-пшофизарно-надпочечниковой системы. Сигнализация с участием катехоламинов и вазопрессина приводт- к быстрым ответам сердечно-сосудистой системы, частью адаптивной реакции является и активация системы гемостаза. Для уточнения механизма мнкровезикуляции при острой кровопотере мы применили внутривенное введение хлористоводородного адреналина и синтетического аналога вазопрессина - 1-дезамино-8-0-аргинин-вазопрессина с последующей регистрацией динамики свертывания крови и активности экто-5 '-нуклеотидазы. 1-дезамино-8-0-аргинин-

вазопрессин является синтетическим более устойчивым и длительно действующим аналогом вазопрессина. Взаимодействуя с V; типом но не с VI типом рецепторов, он не вызывает заметного повышения кровяного давления.

Полученные результаты свидетельствуют. что инициаторами микровезикуляции являются как адреналин, так и I -дезамино-Х-В-аргинин-вазопрессин. однако характер микровезикуляции под влиянием этих агонистов различается (рис.3. 4). Было выявлено, что время свертывания крови под влиянием адреналина достоверно сокращается уже через 5 минут, оставаясь пониженным через 15 минут и возвращаясь к нормальным значениям начиная с 30-й минуты

Динамика под влиянием 1-дезамино-8-0-аргинин-вазопресеина отличалась -достоверное сокращение времени свертывания происходило через 15 минут и в течение часа к исходному значению не возвращалось Усиление микровезикуляции под влиянием адреналина и 1-дезамино-8-0-аргинин-вазопрессина совпадало с таковым после острой кровопотери Достоверный рост уровня микровезикул, содержащих экто-5'-нуклеотидазу. в кровотоке отмечался через 15 минут после введения агонистов. Адреналинемия вызывала краткосрочный ответ: как гиперкоагулемическая реакция так и микровезикуляция разрешались в течении часа. Снижение уровня микровезикул совпадало с ослаблением гиперкоа« л лемической реакции 1-дезамино-8-0-аргинин-вазопрессин индуцировал постепенное и более длительное отделение микровезикул, гиперкоагулемическая реакция также была растянута во времени и скорость свертывания крови не достигала исходных значений до конца наблюдения. Достоверное возрастание уровня микровезикул и ускорение свертывания под действием 1-дезамино-8-0-аргинин-вазопрессина совпадали по времени (на 15-й минуте).

120

10

6

8

2'

4

Рис. 4. Сравнительная динамика микровезикуляции и времени свертывания крови под влиянием 1-дезамино-8-0-арпшин-ва »пресс ина

***- р -0.001. **- р 0.01. *- р 0,05 по сравнению с исходным уровнем

Наши рс 'л тьтаты демоистрир\кп что микровезикх ты содержащие экто-5 -нуклеотидазу локалтиующуюся в составе типидньгх птотов мобн пиуются не позднее 15 минут после воздействия острого стрессора Быстрое (в течение часа) снижение уровня экто-5 -ну клеотидаза-содержащих микровезикул кроме элиминации, может являться, по крайней мерс частично резутьтатом н\ включения в состав образующихся микротромбов

По нашим данным активность экто-5 -ну клеотидазы в гепарннизированнои плазме крови составляет 5 5,5±15,7 нкатл"1, а в сыворотке крови —П,3±12,3 нкат л"1 (р<0 05, п=6) то есть около 25% мшфовезикул вовлекается в сгусток

С учетом данных литерапры, наиболее вероятными клеточными источниками микровезикул при постгеморрагической реакции являются тромбоциты и эндотелиоциты Индуцированное стрессом повышение уровня катехоламинов сопровождается дозозависимой активацией тромбоцитов посредством комбинированного вовтечения а:- и (5;- адренорецепторов [\оп Капе1 Я е{ а1 2000] Агонпст V; рецепторов - 1-дезамино-8-0-аргишш-вазопрессин вызывает в тромбоцитах повьпиение уровня цитогогазматического Са~* и отдетение микровезикул т \itro [НоШтап Ь Ь с[ а1 1995] Рассматривая в качестве источника микровезикул эндотелиоциты, стедует сказать, что у здоровых людей окото Р% микровезикул крови содержат эндотетнатьные маркеры [Вегсктат Я ] е( а! 2001] При стимуляции [5:-адрснорецепторов эндотелиоцитов происходит выделение в кровоток факторов коагуляции и фибрннолиза, кроме того о гделенис эндотелиальных микровезикх л может иметь и отдельньш механизм, связанный с освобождсштем адгезивного гликопротеина фактора фон Витлебранда, у величение его синтеза и секреции наблюдается под втиянием адреналина н вазопрессина [Байа У Н й а1 1999. Мапписс1 М с! а! 2003] Общим для процессов микровезикутяции и секреции является мобилизация внутриклеточных ионов катьция из депо

В цетом механизм острой гиперкоагу лемщгеской реакции возникающей в ответ на кровопотерю, с учетом потученных резу тьтатов постедоватетьно включает в себя рефтекгорное усиление секрещш вазопрессина и адренаттша, воздействие этил гормонов на Угвазопрессиновые и адренергические рецепторы эвдотетиоцигов и тромбоцитов, стимулящпо их аденилатциклазной системы вход в клетку Са4+ и активацию скрембтазы. ведущие к перемеишваншо фосфолштидов между бнечоями наружной клеточной мембраны и вынос фосфатидилсерина на поверхность клеток, последнее событие сопровождается увепшчением прокоагулянтной активности клеток сосудистого сектора и от лечением микровезикут Обнаруженная динамика микровезикуляции при острой кровопотере и в ответ на адаптогенные гормоны позвотаег заключить что образование и отдетение в кровоток мнкровезим ч является кохшонентом острого ответа клеток сосхднстого сектора на стрессор развивающееся в течение нескольких минут При этом однократный стим\л вызывает краткосрочную гипермикровезик\чяцию в цетом корречирующмо с гиперкоаг\лемисй Динамика микровезикутяции при ботее продотжитетьном воздействий повреждающего фактора ста та цечыо дачьнейшнх исследований

M пкроне зику шния н динамике jn к> i okciiiicmiiii

Свертывания крови при бактериатыюм сепсисе инд\ цирустсч активированными эндотоксином моноцитами и поврежденным эндотелием внутри сосудистой системы Активация TLR4 моноцитов/макрофагов птидом А запускает биосшпе i медиаторов воспаления активирует продукции! костиму ляторных молекул адаптивного иммунного ответа В мононуклеарных и эндотелпальных клетках лнпид А стим\ тирует продукцшо тканевого фактора (RaetzC R H et al, 2002, Opal S M et al 2003] Изучение динамики образования микровезику т в артериальной кров» начиная с первыч же минут эндотоксинечии и в дальнейшем после повторного введения ЛЛС явилось цетью наши* экспериментов

Введение крошкам ЛПС сопровожда тось развитием лихорадочной реакции температура тела повышалась с 38 27+0 06 до 39 39+0 25 (р < 0 001 п=15) в течение 24 часов Скорость свертывания крови имета двухфазную динамику после однократного введения ЛПС (1мг/кг) происходило кратковременное достоверное ускорение свертывания на оО минуте с 577 о±27 2 до 386 3±33,5 сек (р<()01, п=15) которое к 24 часам сменялось замедлением до 1042 4±1012 сек (р<0,01, п=15) и продолжаю замедтяться после повторного введения ЛПС (Змг/кг) состав тяя к концу наблюдении 1653 3+98 6 сек (р<0 01 п=15) V 5% подопытных живо тьыч уже через 15 минут посте повторного введения ЛПС кровь не свертывалась более 60 минут

При выявлении РФМК отмечено их повышенное содержание через М) минут посте введения ЛПС с 3 5±0 01 до 28 0±0 06 мг% (р < 0 0001 п=6) и далее до конца набтюдеши Поскотьку РФМК представтяют собой продукт действия активного тромбина, такой уровень свидетельствовал об интенсивном внутрисосудистом свертывании Таким образом экспериментальна л эндогоксинемия сопровождатась кратковременной гиперкоагу тяциеи котораг сменялась развитием синдрома ДВС и гипокоагу ляцией после повторного введения ЛПС

При исследовании динамики экто-5 -нуклеотидаза-содержащич микровезику т, выявтено их достоверное увеличение к 30 минуте после введения ЛПС с 48,48+13 58 нкат Г1 до 109,88+14.42 нкатл' (р<0.01 п=15) через оО минут когда мы отметили кратковременное ускорение свертывания активность сохранялась достоверно высокой 91 12+19,08 нкат т1 (р<0 01 n= 15) Дальнейшие изменения носити волнообразный характер активность нескотько снижалась к 24 часам не возвращаясь к исходным значениям и вновь значите тьно возраста й до 144 76+15 36 нкат т"1 (р<0.01 и=15) после повторного введения эндотоксина

Популяция микровезик\л является гетерогенной как по липидному, так и бетковому составу что связано со структурными и функциональными особенностями клеток, из которых они происходят и природой активирмощею сигнала В наших экспериментах признаком гетерогенности явилось pas игла- ь динамике общего числа микровезим т по ре$ультатам проточной цитомстрии и пот тяцпн содержащей экто-5 -ну кдеотидазу (рис 5) а также экспрессии на поверхности микровешк\л фосфатвдилсерина (рис 6)

Общее количество микровезикул при подсчете в проточном цитометре достоверно возрастало с 15-ой минуты с 105099Л± 10070.9/мкл до | 145558,4±10166,6/мкл (р<0,05; и-15). достигая промежуточного пика к моменту достоверного ускорения свертывания через 60 минут 199381,2±16943,6/мкл | (р<0,01: п=15), к 24 часам составляло 185813,3±11488.9/мкл (р<0.01; п=15). и | продолжало нарастать до конца наблюдения, составляя к 26 часам 291105.4± 16327.5/мкл (р<0.01; п=15). |

Рис. 5 Сравнительная динамика ушкровезику ляции и свертывания крови I при эндотоксинемии **-р<0.01, *-р<0,05 по сравнению с исходным уровнем |

Возрастание общего количества микровезикул до 189%. а экто-5 -нуклеотидаза содержащих - до 188% от исходного уровня соответствовало максимальному ускорению свертывания, в то время как повышение общего количества до 276%, а экто-5 -ну клеотидаза содержащих - до 298% через сутки после начала эксперимента - резкой гипокоагу лемии на фоне развивающего | диссеминированного внутрисосу дистого свертывания крови.

Ua RiWl

5зтр1г 10 I Paticrtt ID

Pjtient Name Gat* G1

GattJ Everr: 4вПЬ Тлз1 brerts SiODO

№rto ечепь г Gated X Tctal CV

487C0 100 00 97 SI 273 03

M1 31135 £¡3 80 62 27 313 3D

NQ 2t)67 8 DB 5 9.. ti5 7?

Sample ID 2 РЯ1-П1 ID

Рзп=га Nams Сз^1 ' 1

Gat?d Bjeorts -WOM Tetal burts ЗДИий

bterVtr Event; I 03ed 1 Тда! с'

Wi 40)61 130 00 Sill 267 4«

Ml 31203 84 112 6; 41 лпез

№ 3137 0 r'J (l n iir 78

Sample ID 3 Patient Warns Gated Events 45836

Patitra ID Gate П

Total Events. 5КЮ0

bfart^r Bjenti г Gated H Total CV

Д1 42833 100 Da i5 B7 213 50

Ml 20370 SI 56 52 74 157 10

M2 7101 10SS 14 JU 02 36

Sample ID 4 Patient Name Gated Events 44550

Patient 1П Cat»- i", |

Total SuuDli

Marker Ei/errts г Gat^d T. Total Lv

At 44456 MI 275JN Mi 4545

lOUDU Л 11 :45 33 91 ВО 15 0" 1B'J 17 in 20 4 0u 66 05

Рис 6 Экспрессия фосфатидилссрина по связыванию мероцианина (МС540) микровезикулами в динамике эндотоксинемип 1-ис\одныи уровень 2- 15 мнтт 3- 30 минут 4- 60 мину г посте однократного введения ЛПС Окрашиванием микровезикут типофитьным фт\оро\ромом мероцианином 540 (МС540) мы оценивали нарушение асимметрии клеточной мембраны Регистрация интенсивности фт\оресценции выявляет ишенени^ упаковки мембранных фосфолипидов при их перемешивании (5сгатЬ1т§) и

отражает экспрессию фосфатидитсерина При исследовании связывания микровезикулами мероцианина выявлено что эти частицы являются фосфатиднтсерин положительными что соответствует механизм} и\ образования в ходе мембранного ремоделирования клеточного источника Кроме того, был обнаружен фено.нен образования популяции частиц с повышенным содержанием этого прокоагхлянтного фосфолипида на 15-30 минутах эндотоксинемии, сохранявшейся и через 24 часа, что видно на цитофлуореграмме (рис 6), в области, выделенной маркером М2, соответствующей более интенсивному свечению флуорохрома Через 30 минут эндотоксинемии экспонирование фосфатиднлсерина возрастает с 5,96±0 71% до 14 21±0,53% (р<0,05, п=6), а через 24 часа составляло 9,69±0,82%

В обнаруженном отделении микровезикул в кровоток на ранних сроках эндотоксемии могут участвовать медиаторы системного воспалительного ответа Поскольку эндотоксинемня приводит к активации комплемент,! а цитотоксический коушлекс С5Ь-9 известен как один из наиболее ующных инициаторов микровезику ляции in vitro [Sims Р J et al 1988], мы определили уровень свободного гемогтобнна в плазме как маркер лизиса эритроцитов

Уровень плазменною гемоглобина достоверно возрастал через 30 ушнут после однократного введения ЛПС с 0.1774 ± 0,0139 до 0 2547 ± 0 0298 (E5jo) (р<0,05, п=15), многократно возрастал к 24 часам от начала эксперимента 1,6685±0 5097 (Е,-4о) (р<0 01, п=15) и вновь повышался после введения второй дозы эндотоксина до конца эксперимента 2 7956±0,2718 (Е>ю) (р<0 001, п=15) Резкий рост уровня пла ¡менного гемоглобина, наблюдавшийся нами на протяжении всего эксперимента свидетельствует о перуганентном гемолизе Индукционный период комплеУ1ент-зависимого гемолиза составляет около 5 минут [Галембская Л В 1998]

Таким образоУ1, нельзя исключить участия коушлеуюнта в инициации образования микровезикул поскольку динамика плазменного геуюглобинл и уровень микровезику ляции после однократного введения ЛПС совпадают (рис 7) Коэффициент ранговой корреляции для активности экто-5'-нуклеотидазы и уровня плазменного гемоглобина составил 0 900 для параметров от начала до 60 минут наблюдения (р<0,05) то есть в этог период выявлена корреляция высокой степени В то же время через 24 часа и после повторного введения ЛПС уровень плазУ1енного геуюглобина резко возрастает (до 940% - 1572%) значительно превосходя степень возрастания количества микровезику л

ТакнУ1 образоУ1 патогенетическими факторами инициальной гнперкоагу лемип при эндотоксинемии по нашну! данным являются микровезику лы крови Уже через 15 минут эндотоксин индуцирует везику ляцию клеток сосудистого сектора которая продолжается и усиливается на протяжении генерализованного феноУ1ена Швартцущна Обращает на себя внимание то что инициация мнкровезику.ляции совпадает по времени с аналогичным npoueceoyi инд\ щгрованным острой кровопотереп адреналинсушеи и вазопрессннсмиен

Рис. 7 Сравнительная динамика микровезикуляции и уровня плазменного гемоглобина при эндотоксинемии ***- р<0,()01; **- р<0.01; *- р<0.05 по сравнению с исходным уровнем Выявленный нами рост числа микровезикул с появлением популяции с высокой степенью экспрессии фосфатидилсерина свидетельствует об инициации С'а"'-зависимого рсмоделирования клеточных мембран и выносом фосфатидилсерина на наружный слой. Вместе с тем. достоверное ускорение свертывания крови при эндотоксинемии отмечено через 60 минут на фоне промежуточного пика микровезикуляции. то есть для достижения необходимого уровня тромбинообразования внутри сосудистой системы необходимы как фосфолипидные площадки, так и требующее времени экспонирование активированными клетками-эффекторами индукторов гемостаза, в первую очередь тканевого фактора.

Реакция Швартцмана с двукратным введением ЛПС - классическая модель тяжелого сепсиса, осложняющегося ДВС с характерной агрегацией тромбоцитов, сладжированием эритроцитов, аккумуляцией нейтрофилов. повреждением эндотелия с апоптозом и некрозом различной распространенности, окклюзией сосудов|5юи!<уе Н.е( а1. 2006]. О развитии ди с с е м и н и ров а н н о го внутрисосу дистого свертывания в наших экспериментах свидетельствует резкое замедление свертывания крови и повышение уровня РФМК - продуктов действия тромбина. Кроме того, через 24 часа эндотоксинемии и после повторного введения ЛПС в наших экспериментах значительно возрастал уровень плазменного гемоглобина (до 940% - 1572% от исходного уровня), что является дополнительным маркером тромбогеморрагического синдрома, так как

выявление большого чиста фрагментов эритроцитов и свободного гемоглобина характерно дтя синдрома ДВС любого происхождения [Баркаган 3 С и др 1988 Dolca A et aL 198К] Индуцированное дв\ кратным введением ЛИС днссеминнрованное внутрисосу дистое свертывание сопровождается циркутяцией в кровотоке повышенного котичества микровезик\ л превышающего исходный уровень в 2,7 раза При этом попу чяция микровешку л, являющихся носителем экто-5'-нхклеотидазы в составе липидных тотов. дополнительно мобилизуется после второй инъекции ЛПС То есть перманентно образующиеся под втиянием ЛПС микровезику ты с прокоагулянтным фенотипом, которые легче чем клетки, могут быть подхвачены током крови и распространятся за преде ты места инициации свертывания, становятся компонентом патогенеза развивающегося синдрома ДВС

С учетом потученных результатов, события при эндотоксинемии включают индуцированнмо ЛПС и/или комплементом активацию клеток и отделение микровезику т с повышенной экспрессией фосфатидитсернна, предоставтяюших фосфолипидные птощадки для коагуляции, инициацию внешнего пути свертывания, гиперкоагуляцию Персистенция прокоагу тянтного стрессора сопровождается гипермикровезикуляцией, которая, выходя за рамки адаптивного ответа становится частью патогене?а ДВС создавая уставил для непрерывной системной активации свертывания крови и гипокоагу ляцни Однако прокоагулянтный стимул может действовать не одномоментно а длительно приводя к формированшо нового стационарного состояния в системе гемостаза исследование характера микровезикуляции в таких обстоятельствах явились следующей задачей работы

Системный и местнып уровни микровезикуляции при физиологических родах и кесаревом сечсннн.

Уникальными физиологическими вызовами системе гемостаза явояюгея беременность и родоразрешение Гемостаз необходим в ходе имплантации развития плаценты и при ее отделении от стенки матки в родах Результатом приспособительной эндокриногенной системной и локальной перестройки системы является умеренная кровопотеря сопровождающая процесс естественных родов у человека которую принято считать и называть «физиологической» «допустимой» или «адаптивной» [Сидетьникова В М И др. 2004 Маршатов Д В 2005] При острых стрессах в том числе массивной кровопотере по данным наших экспериментов, в периферической крови наб подается гипер\шкровезик\ тяция соответствующая развитию гиперкоагу темии В то же время моби тизация гемостатического механизма в родах происходит на фоне уже сформировавшейся перестройки системы свертывания крови Для выявления реализации микровезику тяционного механизма при физиологическом гиперкоагу ляционном состоянии \ беременных а также в периферической и маточной крови в динамике родоразрешения нами проведено исследование количества и прокоаг\ тянтных свойств микровезику л

2.1

Для интегрального суждения о состоянии системы крови использовался дифференциальный подсчет клеток крови и скрининг гемостаза по уровню фибриногена. АЧТВ и протромбиновому времени (Г1В). Нами не обнаружено патологических отклонений в гемограмме и системе гемостаза ни в одной из обследованных групп женщин, что и определяло включение пациенток в группы по исследованию микровезикуляции При анализе временных показателей Т1 и Т2 методом компьютерной электрокоагулографии (КэлКГ) выявлена тенденцию к снижению параметра Т1. свидетельствующая об ускорении тромбинообразования при физиологическом родоразрешении по сравнению с этим показателем в контрольной группе небеременных женщин не достигавшим, впрочем, достоверных значений. Отмечалась также тенденция к повышению фибринолитической активности (Ашах. ФА (%)) перед родоразрешением.

В то время как стандартные скрининговые методы оценки гемостаза не выявили достоверных изменений в системе, исследование микровезикуляции показало наличие реакций прокоагу лянтного характера. Оценка общего количества микровезикул в пробах периферической и ретроплацентарной крови

производилась в проточном цитометре. На рисунке 9 представлена типичная цитофлуореграмма пробы плазмы, полученной после центрифугирования цитратной крови роженицы.

ВнлИиа.лВ

5 У'ГРПЯщ I I ПП«| —гттггпт-«? Ш1 Щ* 1В1

ЯС-Нф!

П1>:Ы1р|1спК& 10:11 ПТЬ-ГЧ

мулеяи, г,с II и-ПигаВетгягГрХЙ.

1ЯмпгНГ.ил:4*|0с

1СС С»п Цма: ишг I ¡5) Т: г...

: I «|ыа 0|я . От Тиа1 Вчт,га:1>Я£-г Аигмсаг: Ш741

НЕС«. ГтСг.й Г. Тар! З.йья .Мхз^Ч. Г ¡^Ш УС

В: И11» » И Я 71 III 11) 1В

Я1 1К Р1Т ИТ 1>Ы 14» >!!■

Рис. с>. Цитофлу ореграмма плазмы роженицы К1 - микровезикулы

РБС-Н - прямое малоугловое светораесеивание 85С-Н - боковое светораесеивание

Область соответству ющая зоне микровезику л, содержит 98.9% зарегистрированных событий. В этой области осуществлялся подсчет количества микровезикул. Следует отмстить, что на сегодняшний день еще не существует универсальных норм количества микровезикул в крови человека Поэтому в наших исследованиях мы. во-первых, использовали для сравнения пробы крови

одной и той же пациентки в динамике родоразрешения а во-вторых проводили статистический аначи s в относительных величинах (%) так как столкт тись со значитетьными индивиду зтьными колебаниями числа микровезикул в периферической крови

Оценка особенностей микровезику тяциоиного механизма при острой гемостат1пгеской реакции в динамике родоразрешения выявила его пространственное ограничение В периферической крови у беременных повышено общее количество микровезикул с 61353,0±1901,4/мкл (n=I0) у небеременных до 84667,1 + 13164,5/мкл (р <0,05. п=13) что со1ласуется с данными других авторов, использовавших различные методы оценки микровезикуляции [Субханкулова А Ф , 1987, Bretelle F et al 2003, Combes V et al 2003] При физиологическом родоразрешении нами не выявлено изменений уровня микровезикул в периферической крови то есть дополнительной диссеминации микровезикул в системный кровоток Уровень в первом периоде родов - 79145,4±12676,9/мкл, в третьем - 68101,8±22520,2/мкл р >0,05 (п=13)

На плацентарной площадке происходит выраженная активация клеток, проявляющаяся высоким уровнем микровезикуляции, о чем свидетельствует в 11 раз большее количество этих частиц в ретроплацентарной крови -749120 1±48504.8/мкл по сравнению с 68101 8±22520,2/мкл (р <0 001 п=13) в периферической крови после родоразрешения

Histogram S

File Mochaeva platelets Sample ID 21 0 Patient ID Mochaeva pla Tube Panel Acquisition Date

Gate No Gate Gated Events 2

Total Events 23505

Mart Left R Even % Ga % Tc A 1 c 235' 100 100' M 9 E 114i 48 48,

Рис 10 Гистограмма, иллюстрирующая экспрессию мотеку т CD61 (зона Ml) на поверхности фосфатидилсерин-позитивных клеток, (по резутьтатам двойного окрашивания МС540 и amri-CD61-MAT и анализа в режиме dot-plot)

Поскольку биологический потенциал микровезикул обусловлен не тотько их количеством, но и фенотипом мы исследовати экспрессию на них фосфатидилсернна, используя в качестве маркера связывание флюорохрома МС540 Параллетьно оценивали тот же параметр на клетках Для определения фенотипа клеток экспонирующих фосфатидилсерин использованы мкАТ CD61 Обработанные мкАТ CD61 (меченные FITC) пробы клеточной взвеси полученные посте лизирования эритроцитов анализировати методом проточной цитометрии с регистрацией результатов на первом (FL1) канале флх оресценции Клетки экспрессировавшие фосфатидитсернн свя швали мкАТ CD61, то есть явтялись тромбоцитами (рис 10)

У беременных отмечена тенденция к поьышеншо экспрессии фосфатидилсерина на тромбоцитах которая достигала достоверных значении ь первом периоде родов - 9,7±3 6% (п=10) 19,8±8 4% (р>() 05 п=П) 21 "±3 4% (р<0,()5, п=П) В ходе физиологического родора¡решения в периферическом крови она достоверно не менпась 15,9 ± 2 1% (р>() 05 п=ТЗ) но возрастала на плацентарной площадке где экспонирование фосфатидилсерина на тромбоцитах свидетельствующее о реаранжировке их мембран было наибольшим и составил'! 25 5±0,5% (р<() 01 п=13) (рис 11)

Экспонирование фосфатидилсерина на мнкровезику лах достоверно возрастало у беременных 23 3±2,2% (р<0 05 п=13) и в первом периоде родов 25 8±0 6% (р<0 05 п—13) по сравнению с уровнем у небереуюнных ь 4±0 9% (п—10)

GsbircvariDV^PL 003

10 1С-МС5чО

Histogram Statistics

File Sabirzyanova PL 003 Log Data i Sample ID 29 04 05 Patient ID

Tube Panel

Acquisition Düte 3-Jun-5 Gate G1 Gated Events 54835 Total Evei X Parameter FL2 H MC540 (Log)

Market Left Right Events % Gated % Total

All 1 9910 M1 38 9910

54835 12764

100 00 23 28

97 88 22 78

s*birzy-3nm-a pl l'u-

10*" 10

Mt W»

Histogram Statistics

File Sabirzyanova PL 002 Log D

Sample 10 29 04 05 Patient

Tube Panel

Acquisition Date 3-Jun 5 Gate (

Gated Events 51724 Total E X Parameter FL2 H MC540 (Log)

Marker Left Right Events. % Gated % Total

All 1 9410 Ml 38 9910

51724 8443

100 00 16 32

91 68 14 97

Рис 11 Уровень экспрессии фосфатидилсерина на тромбоцитах оценивасушй по интенсивности свечения флуорохрома МС 540 002-периферическая кровь 003-ретроплацентарная кровь

В динаутке родов показатель в периферической крови не уюнялся также как и на троуюоцигах 26,1±0 9% (р>0.05, п=13) В то же вреУ1я на плацентарной площадке где как выявлено науш общее количество мнкровезику л больше чем на периферии значительно выше и содержание на мнкровезику лах фосфатидилсерина 54 6±2 7% (р<() 01 п=13)(рнс 12) Коэффициент ранговой

ьорреляции для экспресии ФС на микровсзнку тах н тромбоцитах в динамике (|)ишолопгчсского родоразреиения составит 0 700 что соответствует корреляции средней степени

Таким образом, новое стационарное состояние системы гемостаза, формирующееся при беременности в ходе физиологического родоразрешения реализ\ется пространственно ограниченной реакцией тромбоцитов и вокальным образованием прокоагулянтных микровезикул в крови, и'писающейся из маточных сосудов

Histogram Statistic

File Gilmoutdmova MP 001 SaTiple ID 29 04 05 Tube

Acquisition Date 3-Jun-5 Gated Events 53564 X Parameter FL2-H MC540 (Log)

Log Data Units Linear Valu Patient ID Gllmoutdmova M Panel Gate G1

Total Events 54630

Markei Left Righ Events % Gatec % Tota Mean All 1 991 5356' 100 ОС 98 Di 5 49 Mi 7 991 1252' 231С 22 93 1724

A

Hstog-am Statistics

File Qlmoutdnova MP 002 Sample ID 29 04 05 Tube

Acquisition Date ?-Jirv5 Gated Events 53214 X Parameter FL24H MC540 (Log)

Log Data Uiits Linear Values Patient ID Glmoutdno/a MP Panel Cate G1

Total Events S1075

Marter Lelt Right Events % Gated % Total Mean All 1 9910 53214 tOOOO £0 41 7 37 Ml 7 9910 14363 26 99 56 56 22 48

Б

Histogram Statistic

File Gilmoufdinova MP 003 Sample ID 29 04 05 Tube

Acquisition Date 3 Jurv5 Gated Events 58800 X Parameter FL2 И MC540 (Log>

Log Data Units Linear Value Patient ID Gllmoutdmova Mf Panel

Gate No Gate Total Events 58800

Marker Left Right Events % Gate a % Tota Mean All 1 991 5880C 100 00 100 00 207 88 M1 17 991 38207 64 St 64 98 318 80

В

Рис 12 Экспрессия фосфатидитсерина на микровезнку лах оцениваемая по интенсивности свечения фшоорохрома МС 540 А - первый период родов Б -третий период родов. В - регроптацентарная кровь

Оперативное родора ¡решение являясь не физиологическим расширяет активационные механизмы гемостаза Кесарсг.о сечение несмотря на длительный опыт его применения и постоянное совершенствование несет в себе значительную угрозу здоровью матери, в первую очередь в связи с высоким риском развития тромбогеморрагических ослоиснений Кровотечения при кесаревом сечении встречаются в 3-5 раз чаще, чем при естественном родоразрешенни причем в 68 4% случаев они имеют коагулопатнческин механизм [Кулаков В И И др , 2004] Мы провели изучение количественных и качественных характеристик микровешку л в динамике оперативного родоразрешения, включив в группу обследованных только женщин с неослолшенным течением беременности и показаниями к операции со стороны птода Средняя кровопотеря в ходе оперативного родоразрешения составила 459 29 ± 19,43 мл Скрининговые характеристики гемостаза и цитограмма крови не имели патологических отклонений, что и определило включение пациенток в группу по исследованию микровезикуляции При анализе временных показателей Т1 и Т2 КэтКГ выявлена тенденцию к снижению параметра Т1 до операции свидетельствующая об ускорении тромбинообразования и повышению Т1 в динамике оперативного вмешательства, которая, впрочем не достигала достоверных значений Отмечалось увеличение параметров Атах, ФА(%) свидетельствующее об активации фибринслиза перед родоразрешением и в ходе операции, однако также только в виде тенденции

Количество микровезикул в периферической крови перед началом операции составило 123319,5±3541 1 2/мкл по сравненшо с уровнем у небеременных 61353 0±1901.4/мкл (р <0 05, п=Ю\ в динамике вмешательства количество микровезикул снижалось до 77304 8±2525 0/мкл (р <0 05 п=14). что могло быть результатом их потребления Ретроплацентарная кровь содержала микровезикул в 11.2 раза больше, чем периферическая 865813,5±36394 3/мкл (р <0 001 ц=14) что соответствовало уровню выявленному при физиологическом родоразрешенни и свидетельствовало о выраженной локальной микровезикуляции Достоверного различия в общем количестве микровезикул в ретроплацентарной крови при физиологическом и оперативном родоразрешенни мы не наблюдали

В ходе оперативного родоразрешения достоверно возрастала экспрессия фосфатидилсерина на тромбоцитах в периферической крови с 17,6 ± 1,3% до 29 5 ± 3,9% (р<0 05 п=14), свидетельству я о нарушении мембранной асимметрии с переносом анионных фосфолипидов из цнтоплазматического листка клеток на наружный Достоверно высокиу! было также экспонирование фосфатидилсерина на тромбоцитах в ретроплацентарной крови 23,8 ± 4.8% (р<0,05, п=14) В целом степень активации тромбоцитов оцениваемая по нарушению асимметрии мембранных фосфолипидов в динамике оперативного вмешательства выше чем при физиологических родах

Принципиально сходная динамика экспонирования фосфатидилсерина при кесаревом сечении обнаружена на микровезикулах Значительно (до 157%)

возрастала экспрессия фосфатидилсерина на микровезикулах в периферической грови 32 6 ± 2 9% по сравнению с дооперационным уровнем 20 8 ± 2 2% (р<0 05 а=14) Имея в виду выявленное нами снижение общего количества этих частиц при кесаревом сечении следует отметить что остающиеся в циркучяции микровезикуты экспонир\ют больше фосфатиднтсерииа Это может быть объяснено образованием н\ и5 активированных тромбоцитов что согласуется с отмеченной выраженной экстернализацией фосфатидилсерина на этих метках в периферической крови в динамике кесарева сечения То есть при кесаревом сечении относительно более выражена активация и микровезикуляция тромбоцитов в периферической крови Наибольший уровень фосфатидилсерина обнаружен на микровезикулах в ретроптацентарной крови 43 0 ± 1,3% (р<0,01 п=14) (рис 13)

Таким образом при фи ню логических родах образующиеся в значительном количестве микровезикулы с повышенным содержанием фосфатидилсерина ограничены итацентарнон площадкой где они выполняют адаптивную гемостатическую функцию наряду с другими прокоагулянтными компонентами в первую очередь повышенной экспрессией тканевого фактора Расширение ооны активации гемостаза при кесаревом сечении принципиально изменяет характер микровезикуляцин В ретропдацентарной крови обнаруживается высокий уровень микровезикул, экспрессирующих повышенное количество фосфатидилсерина, что также как при физиологических родах отражает местный адаптивный ответ системы В то же время выраженная активация тромбоцитов и микровезикуляция сопровождается распространением микровезик\л в периферическую кровь Учитывая прокоагу лянтный потенциал микровезик\ т этот механизм может являться фактором риска тромбогеморрагических осложнений кесарева сечения при наличие таких отягчающих факторов как неадекватный хирургический гемостаз декомпенсированная экстрагенитальная патология осложнения беременности

Таким образом для исследования значения микровезикуляцин, как функции разтичных моделей активации клеток-эффекторов гемостаза проведено исследование трех сценариев активации гемостаза однократное воздействие чрезвычайного стрессора - острая кровопотеря, персистенция чрезвычайного стрессора - эндотоксннсмия в дозах моделирующих септическое состояние острый стресс на фоне прокоаг\ тянтной моду тяции системы гемостаза -родоразрешение

Явтяясь процессом характерным для жизнедеятельности клеток интегральная микровезику тяция соответствует трем вариантам ответов на стимул В первом стхчае реакция клеток развивается за минуты олражая рефлекторный принцип нервной регу тяции свертываемости крови Во втором -нарастает в течение часов и достигает декомпенсированнои степени под влиянием перепрограммирующего клетки-мишени и инд\ цир\ ющего непрерывный процесс вн\трисос\дистого свертывания ЛПС В третьем -микровезику тяцнонная реакция ограничена рамками локального адаптивного

ответа на стрессор в организме обеспечившем приспособтение системы гемостаза к изменившимся условиям Таким образом как быстрые кратковременные ответы системы гемостаи, характерные для острой кровопотери, гипсрадрсиалииемии так и длитетьные как, например во время беременности имеют в своей основе микровезикуляционные клеточные реакции При этом адаптивный вариант микровезикуляции ограничен во времени итн в пространстве, в наших экспериментах такими являлись постгеморрагическая постадреиатиповая реакции и физиологическое родеразрешенне

TriiriMMF 301

М1

II2 Я5 M51J

Hislograrn S

File Trofimova MP 001 Log Data Units L Sample ID 3 08 05 Patient ID Trofim Tube Panel

Acqu'iition Date 3 Aug Gate No Gate Gated Events 53445 Total Events 534 X Parameter FL2 H MC

Marl Left R Even % Gz % T( Mea Geo W CV Medi Peak

1 12

534 129

100 100 24 74

9 i 31

502 24 I 301

2 1 23

1

Histogram St

File Trofimova MP 002 Log Data Units Lin. _

Sample ID 3 08 05 Patient ID Trofimov ^

Tube Panel "

Acquisition Date 3 Aug 5 Gate No Gate _

Gated Events 54630 Total Events 5463C X Parameter FL2 H MC54

Marl. Left Ri Event % Gal % To Meal Geo M CV Medi Peak Ai 1 E 546 10011001 20 £ 43 2871 25 1 M 12 £ 152' 27 27 £ 68; 38 £ 145 28 6 2

Tit'ii-iCwM" 0.4

Histogram St

File Trofimova MP 004 Log Data Units Ltn

Sample ID 3 08 05 Patient ID Trofimov -

Tube Panel ß

Acquisition Date 3 Aug 5 Gate No Gate

Gated Events 54360 Total Events 5436C -

X Parameter FL2HMK4

Marl- Left Ri Evenl % G«i % To Meai Geo M CV Medi Peak AI 1 E 5431 1001 1001 14? 56 235. 52 1 M 12 £ 2001 36 £ 36 i 35: 28 t 147' 27 £ Л

Pm. 13 )м.прги.ня фосфа ги цгкерина на микронешмла' оцениваемая но интенсивнойн исчиши ф1юор\\ро\и MC 540 \-шоперщии Б - после оперший В - peipomaneH гарная iipopi

Затяжные и интенсивные во «действия вызывают более существенное у сипение ушкровезику дяции которое сопровождается выявлснныу1 при феномене Шварцмана развитису) явной картины диссеминированного внлтрисосудистого свертывания а распространение прокоагулянтных микровезику! в системный кровоток при оперативноч! вмешатетьстве -потенциальным механизмом скрытого внлтрисосудистого свертывания То есть распространение в кровоток ушкровезику л, являющихся носителеУ! биологически активных эффекторов гемостаза является прямым патогенетическим маркероу1 гиперкоагл ляции

ВЫВОДЫ

1 Патогенетическими факторами острой адаптивной постгеморрагической гиперкоагл леуши являются микровезикулы крови Пик циркуляции в кровотоке микровезикул содержащих экто-5 -нуклеотидазу - компонент липидных плотов - соответствует максимальному ускорению сверлывания крови Начинающаяся нормализация коагуляционных свойств крови сопровождается снижением количества микровезику л

2 Адреналин и агонист V: рецепторов - 1-дезамино-8-0-аргинин-вгзопресснн являются индукторами ушкровезику ляции Посгадреналиновая гнперушкровезикуляция - кратковременна совпадает с периодоУ! ускорения гемокоагу ляции. снижение уровня микровезику ч соответствует замедлению свертывания крови Достоверное возрастание уровня микровезикул и ускорение свертывания крови при 1 -де замино-Н-О-аршнин-вазопрсссинемии совпадают

3 Микровезикулы являются триггерох! развития гнперкоагу ляции при эндотокеннемии Резкое (двукратное) возрастание числа микровезикуп и появление популяции с высоким >ровнеУ1 экспрессии фосфатидилсерина свидетельствующие о переносе прокоагх лянгного фосфатидилсерина на наружный листок бислоя соответствует макстшльному ускорению свертывания крови

4 Индуцированные липополиса\аридоУ1 (эндотоксином) диссеушнированное внх трисосу дистое свертывание крови и гипокоагу ляцня характеризуется циркуляцией в системноу! кровотоке повышенного количества микровезикул превышающего исходный уровень в 2,7 раза

5 Активация свертывающей системы крови при физиологических родах на фоне прокоагулянтнон перестройки у беременных характеризуется локальной пространственно ограниченной микровезику ляцией клеток Количество микровезику л с дву кратно повышенной экспрессией фосфатидилсерина на плацентарной площадке на участке активации гемостаза мноюкратно превышает таковое в снстехшом кровотоке где при физиологичсскоУ1 родора зрешенни ни уровень ни экспрессия фосфатидилсерина микровезику лами не меняются

(> Оперативное родора зрешение нарушает локализованность ушкровезику ляцноннои реакции сопровождаясь диссеминациеи в системный

кровоток тромбоцитов и MitkpoBCîiiKNi с повышенной экспрессном прокоап лянтного фосфатидилсерина на н\ поверхности

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Исследование плазмы полученной после центрифугирования стабилизированной крови, методом проточной циточетрии позволяет

2 производить подсчет количества микровезикул в единице объема крови При регистрации спонтанного прямого малоуглового (FSC) и бокового (SSC) светорассеивания в логарифмическом режиме микровезику лы дискриминируются в отдельной зоне и возможен и\ подсчет за фиксированное время Кратное повышение уровня микровезику л соответствует гиперкоагуляцин и может слу лаггь ее маркером

1 Прокоагу лянтный фенотип микровезику л оцениваемый методом проточной цитометрнн по уровню связывания липофильного флюорохрома мероцнанина 540, может использоваться как маркер при исследовании механизмов гиперкоагуляции Отсутствие видовой специфичности маркера позволяет причешиь данный метод исследования и в экспериментах на животных

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зубаирова J1. Д. Активность 5'-нуклеотидазы альвеолярных макрофаюв при анафилактическом шоке / Л Д Зубаирова, А И Рахматуллина//Казанский мед журнал-1984 -№1 -№1 -С 62

2. Зубаиров Д M Патофизиологическое и клинико-диагностическое значение микровезику ляции в крови /ДМ Зубаиров И А Андрушко. J1 Д. Зубаирова//Гематология и трансфузиология - 1999 -Т 44 №5 - С 24-30

3. Zoubairo\ D Micro\ esicles and Lysosomes are the Effectors of Physiological Hypercoagulability in Mammals / D Zoubairoy, I Anc.nishko L. Zoubairo\a // XVII Congress of International Society on Thrombosis and Haemostasis Washington -1999 -P 954

4. Микровезику лы в крови больных острыми лейкозами /ДМ Зубаиров II А Андрушко JI. Д. Зубаирова, Г Ю Свннтенок//Биохимия на рубеже XX1 века межрегиональный сборник научных трудов - Рязань 2000 - С 211-214

5. Выявление гемокоагу ляционнои активности ленкозных клеток при остром У1иелобластноУ1 лейкозе и хроническом ушеюлейкозе / Д M Зубаиров И А Андрушко Л. Д. Зубаирова Г Ю Свинтснок, А Р Ахмадеев, В H Григорьев 3 M Нехорошкова // Казанекий мед журнал -2000 -Т 81, №3 С 185-188

6. Микровешку лы в крови больных острьши лейкозами /ДМ Зубаиров И А Андрушко Л. Д. Зубаирова Г Ю Свинтснок А Р Ахмадеев В H

Григорьев 3 М Нехорошкова // Казанский мед журит -2000 - Т 81 №4 -С 269-271

7. Роль микровезик\ляции в непрерывном свертывании крови при вирусных бактериальных и микоплазменных инфекциях /ДМ Зубаиров И А Андрушко В X Фазьпов Л. Д. Зубаирова Л И Мальцева//V Всероссинская юнференция Всероссийской ассоциации по изучению тромбозов геморрагий и патологии сосудистой стенки «Тромбозы геморрагии ДВС-синдром Проблемы лечения» -М 2000 - С 76-78

8. Micro\esicles-moduIators of haemostasis in acute and chronic infections / L. Zoubainna D Zonbairo\ I Andrushko V Fazilo\,L Malceva // Supplement to the journal Thrombosis and Haemostasis Juli 2001 (ISSN 0340-6245) XVI11 Congress of The International Society on Thrombosis and Haemostasis - Pans, 2001 - P 761

9. Зубаиров Д M Роть микровезикул в регуляции свертывания крови / Д М Зубаиров И А Андрушко, Л. Д. Зубаирова // Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии материалы региональной конференции -Ижевск. 2001 -С 36-41

1 О.Пертурбация эндотелия - причина острой гиперкоагу темни /ДМ 3\баиров И А Андр\шко Л. Д. Зубаирова, Г Ю Свинтенок//Казанский мед журнал - 2002 -Т 83 № 5 - С 327-334

11.Механизмы острой гиперкоагллемии после острой кровопотери /ДМ Зубаиров И А Андрушко Л. Д. Зубаирова, Г Ю Свинтенок // Первая Всероссийская научная конференция «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» - М 2003 - С 28

12 Механизмы острой постгеморрагической гиперкоагллемии /ДМ Зубаиров II А Андрушко Л. Д. Зубаирова Г Ю Свинтенок // Тромбоз, гемостаз и реология -2003 - №1 -С 27-31

13.Нарушение липндной асимметрии при термогемолизе эритроцитов человека /ДМ 3\блиров И А Андрушко Г Ю Свинтенок Д М Садыкова А К Зыятдннова Л. Д Зубаирова//Гематология и трансфу знология - 2003 -Т 48 № 3 - С 33-35

14.Диагностическое значение микровезию, ляции в крови человека и животных/Д М Зубаиров Г Ю Свинтенок И А Андр\шко Л. Д. Зубаирова // Академия наук Респ\блики Татарстан Сборник аннотированных отчетов по НИР Этап 2003 г - Казань, Изд-во «Фэн» -2003 -С 67-69

15.Клеточные микровезикл лы в динамике экспериментальной эндотоксиемии / Л. Д. Зубаирова, И А Андр\шко Г 10 Свинтенок И Г М\стафин Д М Зубаиров // Третий Российский конгресс по патофизиологии

Ди¡регуляционная патология органов и систем' -М 2004 - С 69

16.3уб.шрова Л. Д. Роль клеточных микровешку л в свертывании крови / Л Д Зчбаирова Д М Зубаиров // Забайкальский медицинский вестник - 2004 -№4 -С 39-43

17.Повышснис свертываемости крови после острого арлернального кровотечения / Д М 3\баиров И А Андр\шко Л. Д. Зубаирова Г 10

Свшпснок // Сборник работ Гсматотогичсского Научного Центра РАМН Патофизиология крови Экстремальные состояния -М 2004 - С 44-49

18. Кшнико-диагностическое значение микровсзик\ тяции в крови больных/Л. Д Зублпрова Г 10 Свинтенок , И А Андрушко Д М Зубаиров// Академия наук Ресилбтики Татарстан Сборник аннотированных отчетов по НИР Этап 2004 г - Казань, Изд-во «Фэн» -2004 -С 69-70

19.Функцни и диагностическое значение микровезикул в крови / JI. Д Зубанрова Д М Зубаиров, И А Андрушко Г Ю Свинтенок, И Г Мустафии// Вторая Всероссийская научная конференция «Клиническая гемостазиотогия и геморсология в сердечно-сосудистой хирургии» -М,2005 - С 109-110

20.3убаиров Д М Роть микровезикул в гемостазе - новое направление в изучении патофизиотогни гемостаза /ДМ Зубаиров Л. Д. Зубаирова // Вестник гематологии - 2005 -Т 1 №2 - С 15-20

21.Микровезикулы в крови / Д М Зубаиров, И А Андрушко Л. Д. Зубаирова, Г Ю Свинтенок И Г Myстафнн // На\коемкие технологии - 2005 -Г 6 №8-9- С 54-58

22. Яковлев Н В Клеточные микрочастицы в динамике операции кесарево сечение / Н В Яковлев, Л. Д. Зубапровл Ф А Абдутхаев // Вторая Всероссийская научная конференция «Клиническая гемостазиотогия и геморсология в сердечно-сосудистой хирургии» - М , 2005 - С 111

23.Проточная цитометрия в оценке механизмов маточного гемостаза в последовом и раннем постеродовом периодах / А А Хасанов, Л. Д. Зубам рои л Н В Яковлев Ф А Абдулхаев // Первый Всероссийский форум «Инновационные технологии медицины XXI века» - М , 2005 - С 281-283

24.Роть клеточных микровезикул в механизмах маточного послеродового гемостаза / Н В Яковтев Л. Д. Зублмронл А А Хасанов Ф А Абдутхаев// Международная конференция ' Гемореотогия в микро- и макроциркл тяции' -Яроставть 2005 - С 96

25.Ктеточные микровезикулы в динамике экспериментальной эндотоксинемии / Л. Д. Зубанрова, Д М Зубаиров И А Андрушко Г Ю Свинтенок. И Г М\стафин // Всероссийская конференция Всероссийской ассоциации по изученшо тромбозов, геморрагии и патотогии сосудов 'Тромбозы геморрагии ДВС-синдром Современные достижения' - Ярославть 2005 - С 39

26.3лблнрова Л. Д. Участие микровезнку т в развитии синдрома ДВС / Л Д >\баирова Д М 3\баиров // Беломорский симпозиум "Актлальные вопросы гсмостазиотогин и трансф\зиологии' - Архангельск 2005 - С 51-54

27.Ф\нкции и диагностическое значение микровезикул в крови-Бетоморский симпозилм 'Актуатьные вопросы гсмостазиотогин и трансфузиологии / Л. Д Зубаирова, Д М Зубаиров И А Андрушко Г Ю Свинтенок И Г Мустлфин - Архангетьск 2005 - С 75

28 The lolc of cell dcrncd microparticlcs in uterine postpartum hacmostasis during \agmal and cesarean deinen. / N V Yako\lex L. I). Znbainna A \

klmsancn F A Abdulhac\ The //3-rd Young Medics International Conference -Yerc\an 2005 - P 14

29.Патофи июлогическое и клинико-диагностическое ¡начение микровезикуляции в крови человека и животных /ДМ Зубаиров И А Андрушко J1. Д Зубаирова Г Ю Свинтснок // Академия наук Республики Татарстан Сборник аннотированных отчетов по НИР Этап 2005 г - Казань 11зд-во «Фэн» -2005 -С 60-62

30.Микровезику ляция при физиологических родах и кесаревом сечении / Н В Яковтев JI. Д Зубаирова А А Хасанов, Ф А Абд\лхаев // Казанский мед журнал -2006 -Т 87. № 3 - С 203-207

31.Zubainna L. D Cell-derned microparticles in the course of delivery / L D Zubairova. N V Yako\ le\ D M Zubairo\ // VIII World Congress International society for adaptne medicine - Moscow 2006 -P 55-56

32.Ктеточные микровезику ты в динамнке экспериментальной эндотоксинемии / Л. Д. Зубаирова, Д М Зубаиров И А Андрушко Г Ю Свинтенок И Г М\стафин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2006 -№11 -С 517-520

33.0 механизме гемостатического действия десмопрессина / Д М Зубаиров И А Андрушко JI. Д. Зубаирова Г Ю Свинтенок // Тромбозы, кровоточивость и ботезни сосудов -2007 -№6 -С 10-14

34.Липпдные рафты в микровезику чах при генерализованном феномене Шварцмана / J1 Д. Зубаирова, Д М Зубаиров, И А Андрушко Г Ю Свинтенок И Г Мустафин // Всероссийская конференция с международным участием 'Тромбозы в клинической практике факторы риска диагностика терапия - Санкт-Петербург. 2007 - С 72

ЗЗ.Зубаирова J1. Д. Роль лейкоцитов и лейкоцитарных микровезику л в атерогенезе и тромбообразовании / Л Д Зубаирова Д М Зубаиров // Всероссийская конференция с международным участием Тромбозы в клинической практике факторы риска диагностика, терапия' - Санкт-Петербург Кчинико-лабораторный консилиум - 2007 -№16 - С 10-19

36.Из\"чение механизма гемостатического действия десмопрессина /ДМ 3\баиров И А Андрушко, Л. Д. Зубаирова, Г Ю Свинтенок // Бюччетень экспериментальнойбиочогии и медицины -2007 -№8 -С 167-169

Микровезикулы крови в патогенезе острой гемостатичсской реакции Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук / Зубаирова Л Д

Подписано в печать 04 07 2008 Бумага офсетная 60x84/16 Ризография Объем 2,0усл-печ л Тираж 100 Заказ № 38

120012, г Казань Бутлерова 49 типография КГМУ

Актуальность проблемы. Система гемостаза обеспечивает сохранение рови в жидком состоянии в пределах кровеносных сосудов и предотвращение кровотечений за счет образования тромбов в области повреждения. Адекватное функционирование системы в условиях физиологической активации включено в эффективное кровоснабжение тканей, предупреждение кровопотерь, тромбозов, ишемий и инфарктов, защиту от диссеминации бактерий и токсинов. В то же время чрезвычайные по силе или продолжительности воздействия вовлекают реакции гемостаза в механизмы заболеваний, как в качестве центральных звеньев патогенеза, так и в качестве усугубляющих первичное повреждение [Баркаган З.С., 1988; Балуда В.П. и др., 1995; Петрищев Н.Н., 1999; Баркаган З.С. и др., 2001; Воробьев А.И. и др., 2001; Макацария А.Д. и др., 2002; Шиффман Ф.Д., 2002; Кузник Б.И., 2004; Воробьев А.И., 2005].

Нарушения гемостаза, проявляющиеся кровоточивостью, обусловлены наследственными или приобретенными дефектами любого из компонентов физиологического механизма. В патогенезе тромбозов сохраняет актуальность классическая триада Р. Вирхова - изменения в сосудистой стенке, изменения свертываемости крови, изменения кровотока, которые детализируются в ходе исследований, проводимых на клеточном и молекулярном уровнях. Тем не менее, несмотря на значительный прогресс, достигнутый в понимании механизмов тромбообразования, артериальная, венозная или системная

Заключение 165

Выводы .179

Практические рекомендации 181

Указатель литературы 182

ПРИЛОЖЕНИЯ 224

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Система гемостаза обеспечивает сохранение крови в жидком состоянии в пределах кровеносных сосудов и предотвращение кровотечений за счет образования тромбов в области повреждения. Адекватное функционирование системы в условиях физиологической активации включено в эффективное кровоснабжение тканей, предупреждение кровопотерь, тромбозов, ишемий и инфарктов, защиту от диссеминации бактерий и токсинов. В то же время чрезвычайные по силе или продолжительности воздействия вовлекают реакции гемостаза в механизмы заболеваний, как в качестве центральных звеньев патогенеза, так и в качестве усугубляющих первичное повреждение [Баркаган З.С., 1988; Балуда В.П. и др., 1995; Петрищев Н.Н., 1999; Баркаган З.С. и др., 2001; Воробьев А.И. и др., 2001; Макацария А.Д. и др., 2002; Шиффман Ф.Д., 2002; Кузник Б.И., 2004; Воробьев А.И., 2005].

Нарушения гемостаза, проявляющиеся кровоточивостью, обусловлены наследственными или приобретенными дефектами любого из компонентов физиологического механизма. В патогенезе тромбозов сохраняет актуальность классическая триада Р. Вирхова — изменения в сосудистой стенке, изменения свертываемости крови, изменения кровотока, которые детализируются в ходе исследований, проводимых на клеточном и молекулярном уровнях. Тем не менее, несмотря на значительный прогресс, достигнутый в понимании механизмов тромбообразования, артериальная, венозная или системная тромбоэмболия остается основной причиной смерти и нетрудоспособности населения индустриально развитых стран. Эпидемиологические данные показывают, что у 45% всех умерших причиной смерти является атеротромбоз, частота тромбоза глубоких вен нижних конечностей в общей популяции составляет около 160 случаев на 100 ООО населения, а частота фатальной тромбоэмболии легочных артерий - 60 на 100 000 населения [Nordstrom М. et al, 1992]. Частота венозной тромбоэмболии у больных злокачественными опухолями составляет от 7 до 50% [Sallah S. et al, 2002]. Тромботические осложнения наблюдаются у 5,3 пациентов на 10 000 детей, госпитализированных в течение года [Nowak-Gottl U. et al, 2003/2004].

Гиперкоагуляционное или претромботическое состояние развивается как следствие преобладания активации прокоагулянтных факторов над антикоагулянтными. Развитие теории свертывания крови, в основе которой лежит главенство тканевого фактора в инициации тромботического процесса, а также активное участие клеток крови и эндотелия в ключевой составляющей t свертывания — генерации тромбина, расставляет новые акценты в патогенезе тромбозов. Уточняется последовательность включения коагуляцйонных факторов в процесс формирования фибринового сгустка, молекулярные механизмы инициации, усиления и распространения свертывания, а также участие клеточных структур, в том числе тромбоцитов, эндотелиоцитов и лейкоцитов в коагуляцйонных событиях.

Несколько десятилетий тому назад клеточные и плазменные компоненты системы гемостаза были дополнены субклеточными элементами — мембранными фрагментами тромбоцитов, отделяемыми при их стимуляции и обладающими прокоагулянтной активностью клеточного источника — «тромбоцитарный фактор 3» [Hardisty R. М., 1966; Wolf Р., 1967]. Первоначально их роль в гемокоагуляции недооценивалась и они назывались «тромбоцитарной пылью», однако к настоящему времени тромбоцитарный фактор 3 идентифицирован как микровезикулы (М). Они признаны не только полноправными компонентами системы гемостаза, но и рассматриваются в качестве важнейших участников стартовых событий в активации системы свертывания крови и тромбообразования, поскольку обогащены анионными фосфолипидами, необходимыми для инициации, усиления и распространения гемостатического процесса [Зубаиров Д. М.,2000; Scholz Т. et al, 2002; Miiller I. et al, 2003; Furie B. et al, 2005].

Физиологические гемостатические реакции ограничены участком повреждения стенки сосуда. Один из механизмов ограничения - локализация активации свертывания на поверхности поврежденных или стимулированных клеток. Причем необходимо участие клеток, экспрессирующих тканевой фактор (ТФ) и клеточных мембран, на которых могут протекать зависимые от прокоагулянтных фосфолипидов реакции активации свертывания крови. Клеточная мембрана становится активным участником в реакциях свертывания крови вследствие нарушения ассиметрии фосфолипидов, присущей мембране нестимулированных клеток.

Для мембран покоящихся клеток характерно асимметричное распределение фосфолипидов. Наружный слой мембраны формируется преимущественно из холиновых фосфолипидов, а обладающие прокоагулянтными свойствами аминофосфолипиды - фосфатидилсерин (ФС) и фосфатидилэтаноламин (ФЭ) находятся на цитоплазматической стороне мембраны. Асимметричное распределение фосфолипидов поддерживается АТФ-зависимой транслоказой, перемещающей аминофосфолипиды с наружной стороны мембраны на внутреннюю, и АТФ-зависимой флоппазой, осуществляющей' медленный транспорт аминофосфолипидов и холиновых фосфолипидов с внутреннего на наружный слой мембраны. С а" -зависимая, энергонезависимая скремблаза осуществляет неспецифическое перемешивание липидов в мембране [Williamson P. et al, 1992; Smeets E.F. et al, 1994; Dekkers D.W.C. et al, 2002].

Повышение концентрации внутриклеточного Ca~ ингибирует транслоказу, активирует скремблазу [Williamson P. et al, 1995; Dachary-Prigent J. et al, 1995; Sims P. J. et al, 2001], что приводит в экстернализации прокоагулянтных фосфолипидов, результатом чего является формирование и отшнуровывание микровезикул, несущих в своем составе фосфатидилсерин [Sims P. J. et al, 1989; Zwaal R. F. A. et al, 1992; Weiss H. J., 1994; Freyssinet J. M; 2003]. Таким образом, происходит потеря атромбогенности наружной мембраны клетки, а отделившиеся микровезикулы распределяются на тромбогенной поверхности и в кластерах по соседству с активированными и адгезировавшими тромбоцитами [Siedlecki С. A. et al, 1999]. Некоторое количество этих частиц уносится током крови и циркулирует, вероятно, вплоть до удаления фагоцитами, для которых экспрессируемый фосфатидилсерин является одним из универсальных маркеров узнавания и фагоцитоза [Fadok V. A. et al, 1992; Madeo F. et al, 1997; Ishimoto Y. et al, 2000; Hanayama R. et al, 2002].

Таким образом, так называемая пассивная роль везикуляции клеток рассматривается, как способ увеличения прокоагулянтной поверхности для оптимального пространственно ограниченного гемостаза, при условии, если микровезикулы преимущественно сохраняются на участке активации и адгезии тромбоцитов. Также как и активированные тромбоциты, они снабжены аминофосфолипидами, необходимыми для сборки витамин К-зависимых факторов свертывания крови, известных как теназный (1Ха с Villa) и протромбиназный (Ха с Va) комплексы. Функциональные комплексы адгезии, такие как GP Ib-IX-V и GP Ilb-lIIa на микровезикулах, происходящих из тромбоцитов, в условиях физиологической активации могут опосредовать их взаимодействие с фактором фон Виллебранда, коллагеном, фибрином и фибриногеном [Miyazaki Y. et al, 1996; Siljander P. et al, 1996; Holme P. A. et al, 1997].

Однако микровезикулы не только несут доступный ФС и адгезивные белки или комплексы, но также и другие прокоагулянтные молекулы, и, в первую очередь, тканевой фактор (ТФ), если они происходят из клеток, экспрессирующих эти вещества. В плазме крови ТФ - трансмембранный гликопротеин, инициирующий внешний путь свертывания, ассоциирован с тромбоцитарными микровезикулами [Miiller I. et al, 2003]. Более того, появляются свидетельства того, что микровезикулы вовлечены в качестве основных участников в процессы межклеточной передачи функционально компетентного ТФ. То есть они могут выполнять как активную роль в инициации свертывания, так и приобретении клетками — участницами гемостаза прокоагулянтного фенотипа [Eilertsen К.-Е. et al, 2005].

В патологических ситуациях, когда клетки находятся под влиянием чрезвычайного стрессора, интенсивность микровезикуляции, а также состав М меняются. Повышенное количество М расширяет зону тромбообразования, в то время как изменения их состава может нарушить локализованность реакций. Так при воздействии на тромбоциты С5Ь-9 комплекса комплемента, или в условиях кровотока при "высоком напряжении сдвига" [Sims P.J. et al, 1988; Miyazaki Y. et al, 1996], адгезивный комплекс GPIIb-IIIa на микровезикулах не активирован и они могут быть более легко подхвачены потоком крови, что приводит к диссеминации их прокоагулянтного потенциала. То есть реализация биологического потенциала М in vivo может иметь как адаптивный, так и патогенный эффект.

Если в определении микровезикул, как субмикроскопических ■ мембранных пузырьков, отделяемых при активации и апоптозе клеток, достигнут за последние годы консенсус, то оценка их роли в патологических процессах остается предметом дискуссии. С одной стороны, выявляется повышение уровня микровезикул крови при целом ряде заболеваний, сопровождающихся гиперкоагулемией. Уровень тромбоцитарных микровезикул повышается при инфаркте миокарда [Mallat Z. et al, 2000], гипертензии [Preston R.A. et al, 2003], диабете [Nomura S. et al, 1995] и раке желудка [Kim Н.К. et al, 2003]. Эндотелиальные микровезикулы преобладают при остром коронарном синдроме [Mallat Z. et al, 2000] и сахарного диабета 1 типа. Кроме того, у больных сахарным диабетом, повышается число лейкоцитарных микровезикул [Sabatier F. et al, 2002]. У ВИЧ-инфицированных пациентов также выявляется повышенное количество микровезикул, экспрессирующих молекулу CD4 [Aupeix К. et al, 1997]. Повышенное количество гранулоцитарных и лимфоцитарных микровезикул обнаружено при преэклампсии [Van Wijk М. J. et al, 2002]. При тяжелых травмах увеличено количество циркулирующих лейкоцитарных М, содержащих адгезивные маркеры (Fujimi S. et al, 2003). В этих ситуациях микровезикулы могут рассматриваться, как потенциальные факторы риска тромбозов, так как они прокоагулянтны de facto, как и те, что циркулируют в здоровом организме [Freyssinet J-M., 2003]. В большинстве этих исследований делается вывод о том, что лечение должно понизить уровень микровезикул [Boulanger С. М. et al, 2001; Rossig L. etal, 2001].

Вместе с тем, в контексте гемостатических реакций повышенный уровень микровезикул не обязательно ведет к тромбозу, поскольку они могут также стимулировать экспрессию антикоагулянтной активности активированного протеина С [Tans G. et al, 1991], а содержание ФС может меняться в зависимости от типа клетки, предмета и условия индукции микровезикуляции [Weerheim А. М. et al, 2002; Freyssinet J-M., 2003]. Кроме того, высокий уровень микровезикул может быть проявлением адаптивных изменений при патологии. Так, при аутоиммунной тромбоцитопении, более высокий уровень микровезикул был обнаружен у пациентов без геморрагических осложнений, что предполагает их защитную гемостатическую роль [Horstman L. L. et al, 1992]. Это продемонстрировано также при гемофилии, где уровень микровезикул выше нормального и может повышаться при развитии острого кровотечения [Proulle V. et al, 2001] как отражение постоянной мобилизации системы гемостаза без угрозы тромботических осложнений, так как имеется недостаточность образования тромбина. Таким образом, микровезикулы, участвующие в физиологическом гемостазе, в целом выполняют адаптивную функцию, а важнейшее значение среди них отводится микровезикулам тромбоцитарного происхождения.

Предполагается, что механизмы вовлечения микровезикул в физиологические и патологические процессы многообразны. Допускается, что их количество в биологических жидкостях является определяющим физическим фактором. Это, в свою очередь, позволяет говорить о возможности проявления эффекторных патогенных свойств микровезикул только после достижения их числа определенных (внепороговых) значений. Исходя из концепции гомеостаза, уровень этих субклеточных образований, вероятно, отражает баланс между пролиферацией, активацией и смертью клетки. Сдвиг в одном из этих направлений обычно ведет к патологическим нарушениям с существенными изменениями в составе микровезикул, зависящими от природы стимула. В этом контексте дополнительно образующиеся микровезикулы -вообще «патогенны», так как они могут вызывать усиление ответа в клетках-мишенях или реципиентах, в то же время микровезикулы, обнаруживаемые у здоровых индивидуумов в целом играют адаптивную роль. Присутствие микровезикул в рамках гомеостаза свидетельствует о том, что большинство из них «полезны» до тех пор, пока их количество удерживается в рамках базального уровня, четкие границы которого до настоящего времени не определены. Именно эти базовые предпосылки и легли в основу использованных нами схем исследования микровезикуляции.

С тех пор, как достигнут относительный консенсус в определении этих субклеточных образований, характеристики микровезикул пополняются в рамках расшифровки механизма отторжения фрагментов клеточных мембран и внекоагуляционного значения этого процесса - их роли, как одной из форм межклеточной сигнализации. Вместе с тем, с точки зрения интегрального вклада микровезикуляционного механизма в адаптивные и патогенные последствия мобилизации системы гемостаза in vivo, представляется важным определение динамики уровня микровезикуляции на ранних этапах гемостатической реакции. Кроме того, система гемостаза, как всякая открытая система в организме, использует различные сценарии развития реакций при воздействии различных стимулов. Особенности микровезикуляции в этих обстоятельствах, расширят представления об острых гемокоагуляционных механизмах и о возможности применения количественных и качественных характеристик микровезикул, как маркера при изучении коагуляционных нарушений.

Исходя из этого, предпринято настоящее исследование, в котором определены следующие цели и задачи.

Цель исследования. Определение патогенетической роли микровезикуляции клеток крови при острых гемостатических реакциях. Задачи исследования.

1. Оценить динамику микровезикуляции в ответ на краткосрочное однократное воздействие стрессора при острой кровопотере, соотнести ее с изменениями гемостаза.

2. Определить роль вазоактивных гормонов — адреналина и вазопрессина как индукторов микровезикуляции при острой гемостатической реакции.

3. Определить динамику микровезикуляции при персистенции внутрисосудистого прокоагулянтного стрессора - на ранних сроках эндотоксинемии и в ходе развития синдрома ДВС.

4. Исследовать прокоагулянтный фенотип микровезикул и оценить динамику их количества в системном кровотоке и на участке активации гемостаза, индуцированного на фоне гиперкоагулемии физиологическими родами.

5. Провести сравнительное исследование количественных и качественных характеристик микровезикул при физиологическом и оперативном родоразрешении.

Научная новизна исследования заключается в выявлении роли микровезикуляции клеток крови как патогенетического фактора гиперкоагулемии. Получены следующие теоретические и практические результаты, содержащие научную новизну:

Впервые исследована динамика уровня микровезикуляции в крови на ранних стадиях мобилизации гемостатических реакций in vivo, как функции различных моделей активации клеток-эффекторов гемостаза. Показано, что острые стрессоры - массивная кровопотеря, эндотоксинемия, гиперадреналинемия, 1-дезамино-8-Т)-аргинин-вазопрессинемия, инициирующие гиперкоагуляцию, вызывают отделение клеточных микровезикул и распространение их в системный кровоток в короткие сроки (15 минут). Выявлено, что интенсивность микровезикуляции под влиянием однократных стрессоров — адреналинемии и кровопотери меняется кратковременно. Длительное усиление микровезикуляции при эндотоксинемии сопровождается развитием диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови.

Впервые определен уровень и прокоагулянтный фенотип микровезикул в системном кровотоке и в маточной крови в динамике родоразрешения. Выявлено пространственное ограничение острой микровезикуляционной реакции при физиологическом родоразрешении, характеризующееся образованием в 11 раз большего количества микровезикул с двукратно повышенной экспрессией фосфатидилсеринов на плацентарной площадке. Впервые выявлено принципиальное различие процесса микровезикуляции при физиологическом и оперативном родоразрешении, состоящее в образовании микровезикул с повышенной экспрессией фосфатидилсеринов в системной циркуляции в динамике кесарева сечения. Таким образом, показан один из механизмов дезадаптации гемостатического ответа и повышенного риска развития тромбогеморрагического синдрома при оперативном родоразрешении.

Научно-практическая значимость состоит в разработке нового подхода к оценке патогенеза коагуляционных нарушений, как базы для совершенствования диагностики и методов терапии протромботических состояний, основанного на расширении знаний о механизмах, вовлеченных в формирование гиперкоагулемии. Полученные данные о динамике микровезикуляции в крови, отражающей характер мобилизации системы гемостаза, позволяют считать образование микровезикул универсальным механизмом стрессовой реакции клеток сосудистого сектора и использовать определение количества микровезикул для выявления инициальной стадии острой гиперкоагулемии. Прокоагулянтный фенотип микровезикул, оцениваемый методом проточной цитометрии по уровню связывания липофильного флюорохрома мероцианина 540, может использоваться как маркер для выявления инициирования гиперкоагуляции. Отсутствие видовой специфичности маркера позволяет применять данный метод исследования и в экспериментах на животных. Результаты проведенного исследования могут быть использованы патофизиологами и гемостазиологами в научной, практической и учебной работе.

Основные положения, выносимые на защиту. 1. Усиление микровезикуляции клеток сосудистого сектора является типовой реакцией на острый стрессор, развивающейся в течение 15 минут, при этом мобилизуется популяция микровезикул, обогащенная прокоагулянтными фосфатидилсеринами и содержащая в составе липидных плотов экто-5 — нуклеотидазу. Пик микровезикуляции, коррелирующий во времени с максимальным ускорением свертывания крови, позволяет считать микровезикулы патогенетическим фактором гиперкоагуляции при остром стрессе.

2. Динамика интегральной микровезикуляции в крови отражает варианты клеточных реакций на стимул - при однократном стрессе реакция развивается за минуты, в соответствии с рефлекторным принципом нервной регуляции свертывания крови. Персистенция стрессора сопровождается продлением микровезикуляционной реакции в течение часов с распространением в кровоток частиц, обогащенных фосфатидилсеринами. В организме, претерпевшем прокоагулянтную перестройку, микровезикуляция в ответ на острую активацию гемостаза ограничена рамками локального адаптивного ответа.

3. Существенное усиление микровезикуляционной реакции под влиянием чрезвычайных по продолжительности и силе прокоагулянтных стрессоров, сопровождается развитием картины синдрома ДВС (при эндотоксинемии) и интенсивной локальной микровезикуляцией с диссеминацией в системную циркуляцию микровезикул с повышенной экспрессией фосфатидилсеринов, кореллирующей с циркуляцией активированных тромбоцитов (при оперативном родоразрешении).

Апробация работы. Основные положения и результаты 'работы доложены на: V Всероссийской конференции Всероссийской ассоциации по изучению тромбозов, геморрагий и патологии сосудистой стенки, «Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром. Проблемы лечения».- Москва — 2000; Региональной конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии».— Ижевск- 2001; Первой Всероссийской научной конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии».- Москва - 2003; Третьем Российском конгрессе по патофизиологии "Дизрегуляционная патология органов и систем" Москва, 2004; Второй Всероссийской научной конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии».- Москва.- ' 2005; Всероссийской конференции Всероссийской ассоциации по изучению тромбозов, геморрагии и патологии сосудов "Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром. Современные достижения".- Ярославль— 2005; Первом Всероссийском форуме «Инновационные технологии медицины XXI века».— Москва- 2005; Всероссийской конференции с международным участием «Гемореология в макро- и микроциркуляции», Ярославль, 2005; Третьей Международной конференции молодых врачей «З-rd Young Medics International Conference», Армения, Ереван, 2005; Беломорском симпозиуме "Актуальные вопросы гемостазиологии и трансфузиологии".- Архангельск— 2005; VIII World Congress International society for adaptive medicine, Moscow, 2006, Всероссийской конференции с международным участием "Тромбозы в клинической практике: факторы риска, диагностика, терапия". — Санкт-Петербург. - 2007.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 36 работ, из них 9 — в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования Российской Федерации.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 224 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав с изложением результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 24 таблицами, 33 рисунками. Библиография содержит 314 источников, в том числе 47 отечественных и 267 зарубежных авторов.

ВЫВОДЫ

1. Патогенетическими факторами острой адаптивной постгеморрагической гиперкоагулемии являются микровезикулы крови. Пик циркуляции в кровотоке микровезикул, содержащих экто-5'-нуклеотидазу — компонент липидных плотов — соответствует максимальному ускорению свертывания крови. Начинающаяся нормализация коагуляционных свойств крови сопровождается снижением количества микровезикул.

2. Адреналин и агонист V2 рецепторов - 1-дезамино-8-0-аргинин-вазопрессин являются индукторами микровезикуляции. Постадреналиновая гипермикровезикуляция - крагковременна, совпадает с периодом ускорения гемокоагуляции, снижение уровня микровезикул соответствует замедлению свертывания крови. Достоверное возрастание уровня микровезикул и ускорение свертывания крови при 1 -дезамино-8-D-аргинин-вазопрессинемии совпадают.

3. Микровезикулы являются триггером развития гиперкоагуляции при эндотоксинемии. Резкое (двукратное) возрастание числа микровезикул и появление популяции с высоким уровнем экспрессии фосфатидилсерина, свидетельствующие о переносе прокоагулянтного фосфатидилсерина на наружный листок бислоя, соответствует максимальному ускорению свертывания крови.

4. Индуцированные липополисахаридом (эндотоксином) диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови и гипокоагуляция характеризуется циркуляцией в системном кровотоке повышенного количества микровезикул, превышающего исходный уровень в 2,7 раза.

5. Активация свертывающей системы крови при физиологических родах на фоне прокоагулянтной перестройки у беременных характеризуется локальной пространственно ограниченной микровезикуляцией клеток. Количество микровезикул с двукратно повышенной экспрессией фосфатидилсерина на плацентарной площадке на участке активации гемостаза многократно превышает таковое в системном кровотоке, где при физиологическом родоразрешении ни уровень, ни экспрессия фосфатидилсерина микровезикулами не меняются.

6. Оперативное родоразрешение нарушает локализованность микровезикуляционной реакции, сопровождаясь диссеминацией в системный кровоток тромбоцитов и микровезикул с повышенной экспрессией прокоагулянтного фосфатидилсерина на их поверхности.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Исследование плазмы, полученной после центрифугирования стабилизированной крови, методом проточной цитометрии позволяет производить подсчет количества микровезикул в единице объема крови. При регистрации спонтанного прямого малоуглового (FSC) и бокового (SSC) светорассеивания в логарифмическом режиме микровезикулы дискриминируются в отдельной зоне и возможен их подсчет за фиксированное время. Кратное повышение уровня микровезикул соответствует гиперкоагуляции и может служить ее маркером.

2. Прокоагулянтный фенотип микровезикул, оцениваемый методом проточной цитометрии по уровню связывания липофильного флюорохрома мероцианина 540, может использоваться как маркер при исследовании механизмов гиперкоагуляции. Отсутствие видовой специфичности маркера позволяет применять данный метод исследования и в экспериментах на животных.