Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Микробициды с анти-ВИЧ-активностью



Гилязова Алла Владимировна

МИКРОБИЦИДЫ С АНТИ-ВИЧ-АКТИВНОСТЬЮ

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2010 г.

1 8 НОЯ 2010

004613036

Работа выполнена в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Карамов Эдуард Владимирович доктор медицинских наук Лукашов Владимир Владимирович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Ярилин Александр Александрович доктор медицинских наук, профессор Кадагидзе Заира Григорьевна

Ведущая организация:

ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России

Защита диссертации состоится » 2010 г. в часов на

заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.017.01 в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России по адресу:

115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦ Институт

иммунологии» ФМБА России.

Автореферат разослан «06 »2010 г.

Ученый секретарь

Совета по защите докторских

и кандидатских диссертаций, -

доктор медицинских наук

Сеславина Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Пандемия ВИЧ/СПИДа продолжает оставаться одной из основных проблем здравоохранения во всем мире, несмотря на все усилия по предотвращению и контролю ВИЧ-инфекции. В настоящее время более 33 млн. людей живут с ВИЧ-инфекцией. По данным UNAIDS за 2009 год зарегистрировано 2,5 млн. смертей и около 2,7 млн. новых случаев ВИЧ-инфекции, большинство из них среди женщин [Rohan L.C. et al, 2010]. В России в период до 2001 г. среди выявленных случаев преобладали мужчины (75-88%). Но уже к 2006 г. доля ВИЧ-позитивных женщин составила 44% и продолжает расти. Увеличивается и число детей, инфицированных ВИЧ-позитивными матерями. Такое тендерное распределение ставит обязательным вопрос о разработке эффективных способов предотвращения передачи ВИЧ женщинам и блокирования половой передачи ВИЧ.

Поиск новых перспективных соединений, предотвращающих передачу ВИЧ-инфекции, является одной из актуальных задач здравоохранения, поскольку существуют трудности в разработке вакцин, отсутствуют средства специфической профилактики и появляются варианты ВИЧ-1, обладающие лекарственной устойчивостью [Hughes L.M. et al, 2007]. Частью комплексного подхода в системе профилактических мер против распространения ВИЧ/СПИДа является разработка и применение микробицидов.

Микробициды - это препараты, гелевые или мазевые композиции, содержащие активные вещества, способные предотвращать половую передачу ВИЧ и других инфекций, передающихся половым путем (гонорея, хламидиозы, генитальный герпес). Такие продукты предназначены, прежде всего, для женщин, которые могут пользоваться данным средством профилактики независимо от полового партнера.

Многие микробициды успешно прошли доклинические испытания, но их безопасность для человека и эффективность остаются нерешенной проблемой. Важность клинических испытаний была проиллюстрирована исследованиями ноноксинола-9, который вызывал физические повреждения слизистой оболочки, что повышало риск ВИЧ-инфицирования. Такой опыт способствовал разработке критериев, которые должны быть использованы в качестве стандартов при проведении клинических испытаний [Moscicki А.В., 2008].

Согласно последним публикациям около 70 новых соединений находятся на стадии подготовки к исследованиям как спермициды и/или микробициды местного действия и 7 препаратов в настоящее время проходят клинические испытания. Они включают в себя поверхностно-активные вещества (ПАВ), анионные полимеры, ингибиторы проникновения ВИЧ в клетку, ингибиторы обратной транскриптазы. Предполагается, что

2,5 млн. случаев ВИЧ-инфекции, если он будет использован 20% женщин в 50% небезопасных половых актах [Hughes L.M. et al, 2007].

Для создания компонентов вакцин и микробицидов, направленных против актуальных вариантов ВИЧ, циркулирующих на определенной территории, а также для того, чтобы понять эпидемиологию и происхождение ВИЧ-1, необходим постоянный мониторинг распространения ВИЧ-эпидемии. ВИЧ-инфекция на территории России и бывшего СССР в основном вызвана двумя субтипами А и В, а также рекомбинантным субтипом А/В. Генетический анализ определил субтип А как доминирующий в большинстве регионов. В то же время в Калининграде и в Череповце выявлен рекомбинантный вариант А/В (CRF03). Кроме того, исследования, проведенные различными группами авторов, выявили появление других субтипов ВИЧ, которые способны вызвать новые вспышки эпидемии [Гилязова A.B. и др., 2010]. Таким образом, обнаружение новых вариантов вируса и прогноз развития эпидемии являются важными аспектами в разработке профилактических средств против ВИЧ-1.

Целью данной работы был поиск соединений, подавляющих репликацию ВИЧ-1 в различных вирус-клеточных системах, а также определение молекулярно-генетической структуры вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в Московской области.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучение молекулярно-генетической структуры вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в Московской области.

2. Изоляция актуальных штаммов ВИЧ-1 от инфицированных лиц с ранней инфекцией.

3. Исследование цитотоксических свойств потенциальных микробицидов, относящихся к различным классам химических веществ (растительные полифенолы, гуминовые вещества, кремниевые наночастицы и аддукты нанокластеров углерода).

4. Оценка антивирусной активности соединений различной природы in vitro с использованием референс-штамма и первичного изолята ВИЧ-1.

5. Поиск комбинаций препаратов, проявляющих синергизм при ингибировании ВИЧ-инфекции in vitro.

Научная новизна работы

Получены новые данные по молекулярно-генетической структуре вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в Московской области. Результаты свидетельствуют об увеличении эволюционной дистанции между циркулирующими вариантами ВИЧ.

Получены клинические изоляты ВИЧ-1, представляющие собой актуальные штаммы, которые вызывают инфекцию на территории Московской области.

Впервые исследованы индивидуальные соединения класса полифенолов, выделенные из растений семейства Euphorbiaceae, на цитотоксичность и эффективность в отношении ВИЧ-инфекции in vitro.

Впервые проведен анализ гуминовых веществ как соединений, перспективных для разработки микробицидов.

Впервые изучены цитотоксические, антивирусные и вирулицидные свойства кремниевых наночастиц и аддуктов нанокластеров углерода на модели ВИЧ-инфекции in vitro. Впервые показана возможность комбинированного использования этих препаратов в комплексе с другими анти-ВИЧ-соединениями.

Найдены эффективные соединения с высокими индексами селективности, которые могут стать основой для разработки специфических анти-ВИЧ-микробицидов.

Научно-практическая значимость работы

Разработка эффективных микробицидных препаратов позволит снизить распространение ВИЧ/СПИД половым путем. В данной работе изучена анти-ВИЧ-активность соединений, принадлежащих к различным классам химических веществ: растительные полифенолы, гуминовые вещества, кремниевые наночастицы, адцукты нанокластеров углерода.

Цитотоксичность препаратов, их антивирусное и вирулицидное действие были проверены с использованием стандартных методик, что позволяет сравнивать результаты с последующими исследованиями, а также с литературными данными. В результате такого сравнения возможен отбор наиболее эффективных соединений в отношении ВИЧ-инфекции in vitro.

Полученные клинические изоляты представляют собой актуальные штаммы ВИЧ, циркулирующие в Московской области в настоящее время. Данные первичные штаммы могут быть использованы для оценки эффективности потенциальных кандидатных микробицидов и компонентов анти-ВИЧ-вакцин.

В результате исследований выявлены наиболее активные соединения, перспективные для создания нового типа микробицидных препаратов, которые позволят быстро и эффективно предотвратить передачу ВИЧ-инфекции половым путем. Обнаружение комбинаций препаратов, подавляющих ВИЧ-инфекцию in vitro, делает возможным использование активных соединений в более низких концентрациях, что уменьшит цитотоксичность.

Выявление малой токсичности для клеток препаратов наночастиц кристаллического и пористого кремния, а также аддуктов нанокластеров углерода открывает возможность изучения этих образцов в качестве систем доставки анти-ВИЧ-микробицидов.

- Данные по молекулярной эпидемиологии ВИЧ-инфекции в Московской области, описанные в настоящей работе, могут быть использованы для разработки региональных вакцин. На основании полученных результатов

можно судить о путях и источниках распространения эпидемии и проводить профилактическую работу значительно эффективнее.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на следующих Всероссийских и Международных конгрессах, конференциях и симпозиумах: Microbicides 2008 (February 23-27, 2008, New Delhi, India); Теоретические и практические аспекты современной эпидемиологии (28 января 2009 г., Москва); 5th European Conference on Clinical and Social Research on AIDS and Drugs (April 28-30, 2009, Vilnius, Lithuania); X Международном Конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (20-23 мая, 2009 г., Казань); Актуальные вопросы инфекционной патологии (23-24 сентября 2009 г., Ростов-на-Дону); Keystone Symposia Meeting «Overcoming the Crisis of ТВ and AIDS» (October 20-25, 2009, Arusha, Tanzania); III Международной конференции по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии и Американо-Российском научном семинаре по профилактике ВИЧ (2830 октября 2009, Москва); III-й Ежегодной научной конференции молодых ученых НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (20 апреля 2010 г., Москва); Microbicides 2010 (May 22-25, 2010, Pittsburgh, USA); NIH Workshop on Building U.S. Russia Collaborative Research Teams in HIV Prevention Science (May 27, 2010, St. Petersburg, Russia); Международной конференции «Актуальные проблемы развития биоорганической химии» (20-21 сентября, 2010 г., Ташкент).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных и выводов. Библиографический указатель включает 130 источников, в том числе 10 отечественных и 120 зарубежных. Диссертация содержит 40 таблиц и 32 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Сыворотки, Сыворотки получены от 360 ВИЧ-позитивных лиц в ГУЗ МО «Московский областной Центр по борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями», инфекция которых была подтверждена методом ИФА и иммуноблота. До момента забора крови пациенты не получали антиретровирусной терапии. Для субтипирования был отобран случайным образом 61 образец.

Выделение и анализ нуклеиновых кислот. Выделение РНК ВИЧ из сыворотки крови проводилось по методу Боома и соавторов [Boom R. et al, 1990]. К сыворотке добавляли лизирующий буфер, суспензию силикагеля,

встряхивали и инкубировали при комнатной температуре. После этого силикагель осаждали центрифугированием, полученный осадок промывали, высушивали. Нуклеиновые кислоты элюировали дистиллированной водой. Вирусспецифическую ДНК из РНК получали методом обратной транскрипции. Амплификацию нуклеотидных последовательностей генома ВИЧ-1 проводили методом гнездовой ПЦР, используя полимеразу AmpliTaq (Applied Biosystems, США). Анализ препаратов ДНК проводили методом горизонтального электрофореза в 1%-ном агарозном геле (Serva, Германия). Полученные участки нуклеотидных последовательностей генома ВИЧ-1 имели длину: для участка env - 270 нуклеотидных остатков, включая область V3, для участка гена gag - 729 нуклеотидных остатков, включая полноразмерную последовательность белка р17 и частичную последовательность белка р24.

Определение нуклеотидных последовательностей. Реакцию секвенирования проводили с использованием коммерческого набора Big Dye Terminator v 1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США). Продукты, полученные в результате реакции секвенирования, были использованы для прямого определения нуклеотидных последовательностей автоматическим методом на приборе ABI™ 373 DNA Sequencer (Applied Biosystems, США).

Методы филогенетического анализа. Для манипулирования группами генетических последовательностей - хранения, отбора индивидуальных последовательностей, форматирования, трансляции, визуального контроля, определения консенсусных последовательностей, для выравнивания генетических последовательностей - использовали компьютерные программы BioEdit версии 7.0.9.0 и CodonCode. Филогенетические деревья с корнем, основанные на матрице генетических дистанций, строили методом присоединения соседей (модель Кимуры) [Kimura М., 1981], используя программу MEGA, версия 4.1 [Kumar S. et al, 1993]. Для расчета синонимичных и несинонимичных дистанций использовали метод Неи-Годжобори, для нуклеотидной р-дистанции - однопараметрическую модель Джукса-Кантора. Достоверность филогенетических отношений определяли методом бутстреп-анализа.

Культуры периферических лимфоцитов доноров. Мононуклеарные клетки периферической крови (МПК) человека выделяли по методике, рекомендованной ВОЗ [WHO-UNAIDS Guidelines for standard HIV isolation and characterization procedures, 2002] с использованием среды для изоляции лимфоцитов (LSM, Invitrogen, США). Собранные МПК отмывали, подсчитывали и активировали фитогемагглютинином (ФГА, Sigma, США). Инкубация с ФГА проходила 72 часа, затем лимфоциты переводили в полную ростовую среду, содержащую интерлейкин-2 (ИЛ-2, Roche, Швейцария).

Изоляция штаммов ВИЧ-1. Изоляция вируса из донорских лимфоцитов осуществлялась согласно рекомендациям ВОЗ [WHO-UNAIDS Guidelines for standard HIV isolation and characterization procedures, 2002].

Протокол включал в себя сокультивацию ВИЧ-инфицированных МПК с активированными ФГА МПК, полученными от здоровых доноров. Содержание ВИЧ-1 определяли по наличию антигена р24 методом ИФА каждые 3-4 дня.

Первичные изоляты пассировались 2-3 раза в донорских МПК (в ростовой среде, содержащей 200 ед/мл ИЛ-2 и 2 мкг/мл полибрена). На 7 и 10 сутки проводился отбор проб для определения содержания ВИЧ методом ИФА. Полученную вируссодержащую культуральную жидкость освобождали от клеток низкоскоростным центрифугированием, разделяли на порции и хранили при температуре -80°С. Биологическую активность вирусных стоков оценивали путем титрования TCID50.

Растительные полифенолы. Сотрудниками Института биоорганической химии им. академика Садыкова A.C. АН РУз были получены и охарактеризованы в химическом отношении 12 новых соединений, выделенных из экстрактов различных видов растений семейства Euphorbiaceae. Экстракция соединений проводилась из сырья с помощью органических растворителей.

Гуминовые вещества. Различные гуминовые вещества предоставлены для исследования проф. И.В. Перминовой (Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова).

Наночастицы кристаллического и пористого кремния. Препараты кремниевых наночастиц предоставлены проф. В. Ю. Тимошенко (Физический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова). Водная суспензия кристаллического кремния получена помолом порошка кристаллического кремния c-Si в воде. Водная суспензия пористого кремния p-Si приготовлена помолом пленки мезопористого кремния в воде.

Аддукты нанокластеров углерода. Аддукты нанокластеров углерода (АНКУ) разработаны в НТЦ Прикладных нанотехнологий (г. Санкт-Петербург), получены в результате переработки каменноугольных смол и предоставлены проф. А. Н. Пономаревым. Общая структурная формула аддуктов: [OH]k - [С]п - (0HS02)m. Средний размер нанокластеров составлял 1-30 нм.

Клеточные культуры. Использовалась перевиваемая Т-лимфобластоидная линия CD4+ клеток СЕМ-SS [Nara P.L. et al, 1987], которую культивировали в ростовой среде RPMI-1640 (Invitrogen или Sigma, США) с 10% сыворотки эмбрионов коров (Sigma, США), 2 мМ L-глютамина (ПанЭко, Россия) и 100 мкг/мл гентамицина (KRKA, Словения).

Вирус. В работе использовали штамм HIV-1Bru - референс-штамм, активно реплицирующийся в Т-лимфобластоидных клеточных линиях. Вирусные стоки HIV-1BRU получали в результате острой инфекции клеток СЕМ SS вируссодержащими супернатантами.

Определение 50%-ной инфекционной дозы ТСГО50. Титрование вируссодержащих жидкостей HIV-1BruH клинических изолятов проводили на

клетках линии СЕМ-SS и на донорских МПК соответственно. На 6-7 сутки отбирали образцы для определения содержания р24 методом ИФА. Расчет TCID50 проводился по стандартной методике Рида и Менча [Virology methods manual, 1996].

Иммуноферментный анализ для определения антигенов ВИЧ-1.

Уровень развития инфекции в контрольных и опытных вариантах оценивали по содержанию р24 антигена методом иммуноферментного анализа с помощью коммерческих тест-систем согласно инструкции производителя.

Изучение цитотоксических свойств препаратов. Цитотоксическое действие тестируемых препаратов оценивали, сравнивая жизнеспособность клеток в присутствии различных доз соединений с жизнеспособностью клеток без соединения. Жизнеспособность клеток определяли двумя методами: путем подсчета клеток в камере Горяева после окрашивания витальным красителем трипановым синим (0,2%) или с помощью МТТ-метода [Mosmann Т., 1983]. 50%-ая цитотоксическая доза (TD50) была рассчитана с помощью линейно-логарифмической интерполяции.

Исследование антивирусной активности соединений. Клетки, чувствительные к ВИЧ, инкубировали с различными концентрациями соединений в течение 2 часов и затем заражали вирусом (100TCID50). Через 24 ' часа производили смену ростовой среды на свежую. Аналогичную процедуру проводили на 2-е и 3-й сутки после заражения. На 6-7 сутки по количеству вируса (метод р24 ИФА) определяли уровень ингибирования инфекции.

Расчет 50% эффективной дозы (ED50) проводили с помощью линейно-логарифмической интерполяции. Перспективность изучаемых соединений оценивалась по индексу селективности (IS), который рассчитывается как отношение TD50 к EDi0-

Исследование вирулицидного действия соединений. Изучение вирулицидного действия препарата проводили следующим образом: к вируссодержащей жидкости добавляли сухие навески или раствор препарата до достижения определенных концентраций. Полученный супернатант использовали для заражения клеток, чувствительных к ВИЧ. На 6-7 сутки по количеству вируса (метод р24 ИФА) определяли уровень ингибирования инфекции.

Методы статистического анализа. Учитывая, что в медико-биологических исследованиях при малых выборках (менее 20) статистические методы не могут адекватно отражать распределение, результаты экспериментов приведены в виде таблиц или диаграмм, показывающих средние значения соответствующих данных и стандартное отклонение (M±SD).

Для статистической обработки результатов и построения графиков использовали компьютерные программы Microsoft Office Excel и SigmaPlot.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-инфекции в Московской

области

1.1. Анализ эпидемиологических данных.

Для изоляции актуальных штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в настоящее время в Московской области, мы исследовали когорту из 360 ВИЧ-инфицированных лиц, не получавших антиретровирусной терапии.

По литературным данным в период до 2001 г. среди выявленных случаев ВИЧ-инфекции преобладали мужчины (75-88%), а уже к 2006 г. доля ВИЧ-позитивных женщин составила 44% и продолжает расти. В нашей когорте женщины составляли 48,2% (табл. 1). Основной рост числа инфицированных наблюдался у женщин в возрастных группах 21-30 лет, у мужчин - 26-35 лет.

Табл. 1. Распределение ВИЧ-инфекции среди мужчин и женщин.

Группы пациентов по возрасту Всего, % Мужчины, % Женщины, %

Всего 100 51,2 48,2

< 20 лет 0,9 0 0,9

21 -25 лет 17,8 5,6 12,2

26-30 лет 37,5 17,8 19,7

31-35 лет 29,3 16,1 10,3

36 - 40 лет 9,4 16,0 3,3

41 -50 лет 8,0 5,6 2,4

Табл. 2. Распределение пациентов по основным путям передачи ВИЧ-инфекции среди мужчин и женщин.__

Группы пациентов Мужчины, % Женщины, %

ВВН* ГС** ВВН* ГС**

Всего 55,1 39,4 20,5 77,5

< 20 лет 0 0 0 2

21 - 25 лет 2,7 7 0 25

26 - 30 лет 18,4 14 14 23

31-35 лет 21 8,3 5 15

36 - 40 лет 6,5 5,5 0,5 6,7

41 -50 лет 6,5 4,6 1 5,8

*ВВН - потребители внутривенных наркотиков **ГС - гетеросексуальный путь передачи

Главным фактором риска заражения в период с 1996-2006 гг. являлось внутривенное употребление наркотических веществ. К настоящему времени начинает расти доля гетеросексуального пути передачи инфекции, что указывает на выход ВИЧ-эпидемии из традиционных групп риска.

В исследованной нами когорте число людей, инфицированных гетеросексуальным путем, составило 57,9%. Из них женщины составляют 77,5%. Среди мужчин преобладал путь передачи через употребление внутривенных наркотиков - 55,1% (табл. 2).

1.2. Изучение молекулярпо-генетической структуры ВИЧ-1.

Для выявления субтипической принадлежности актуальных вариантов ВИЧ-1 были определены нуклеотидные последовательности участков генов env (петля V3) и/или gag (р17/р24) ВИЧ-1 для 61 ВИЧ-инфицированного лица.

В результате филогенетического анализа ни для вирусов субтипа А, ни для вирусов субтипа В не было обнаружено кластрирования и корреляции между полом пациента или путем передачи инфекции и субтипом вируса.

У исследованных пациентов трудно проследить общий источник заражения, т.е. обнаруживаются индивидуальные вирусные варианты. До недавнего времени гетерогенность вируса субтипа А, циркулирующего на территории бывшего СССР была ниже по сравнению с более ранними эпидемиями в США или Западной Европе [Lazouskaya N.V. et al, 2005].

Отсутствие гомогенности среди исследованных вариантов ВИЧ свидетельствует об увеличении эволюционной дистанции между циркулирующими вариантами ВИЧ по сравнению с данными, полученными на более ранних этапах развития эпидемии [Lukashov V.V. et al, 1998].

Из результатов нашего исследования можно сделать вывод о том, что сохраняется тенденция превалирования субтипа А в российской эпидемии ВИЧ: анализ нуклеотидных последовательностей по обеим областям генома env и gag показал наличие двух субтипов - А (93,4%) и В (6,6%). Варианты ВИЧ-1 субтипа А (ВВН-А) являются доминирующими выявляются у 93,5% ВВН и 100% лиц, инфицированных при гетеросексуальных контактах.

2. Изоляция клинических штаммов ВИЧ-1

Изоляция штаммов была проведена для 13 лиц с ранней ВИЧ-инфекцией (до 12 месяцев), не получавших антиретровирусного лечения. В течение сокультивации ВИЧ-инфицированных. МПК с МПК, полученными от здоровых доноров и активированными ФГА, производился отбор проб для определения наличия вируса методом ИФА р24 (табл. 3).

Поскольку в последующих двух пассажах наиболее активная репликация наблюдалась для штамма, изолированного от пациента с кодом СК-8, то именно он был выбран для оценки антивирусной активности различных соединений.

-г"

I-447о.

-4С2ДО

4—4«

В

Рис. 1. Филогенетический анализ последовательности елу УЗ (слева) и gag р!7/р24 (справа) у ВИЧ-положительных лиц по данным секвенирования. Референс-последовательности АУ766077.1, АР061595, АУ766064.1 и АБОб! 606 взяты из ГенБанка. Показаны значения бутстрел-анализа выше 70.

Табл. 3. Оптическая плотность проб, полученных при сокультивации ВИЧ-инфицированных МПК с донорскими МПК. Оптическая плотность, р24

ИФА.

Код пациента

Сутки СК-1 СК-2 ск-з СК-4 СК-5 СК-6 СК-7 СК-8 СК-9 ск-10 ск-11 ск-12 ск- 13

3 1,527 0,066

4 0,081 0,020 0,110 0,060 0,236 0,125 0,009 0,578 0,016 0,033

8 0,029 0,031 0,040 0,048 0,049 0,314 0,059 0,025 0,368 0,252 0,002 0,008

12 0,003 0,033 0,042 0,807 0,108 3,183 0,005 0,063

15 0,068 0,830 0,072 0,010 0,000

16 0,043 0,071 2,887 0,450 3,500 0,073 0,297

18 0,058 0,340 0,656

19 0,038 0,048 0,263

20 0,034 0,050 2,880 3,500 0,200

22 0,057 0,092 2,922 0,009 0,059

24 0,061 0,015 0,951 0,041 0,081 2,517

25 0,085 2,535 0,039 0,014

26 0,056 0,013 0,368 0,039 0,062 2,509

28 0,078 0,026 0,047 0,058 2,530

29 0,083 0,309 2,795 0,000

32 0,041 2,669 0,006

3. Поиск анти-ВИЧ-соедииеиий в ряду полифенолов растений

В данной работе исследована группа из 12 растительных полифенолов. Все исследованные соединения имели примерно одинаковую цитотоксичность для клеток СЕМ SS, 50%-ная токсическая доза находилась в пределах 117-300 мкг/мл. При этом наименьшей токсичностью обладали соединения №1, 8 и 11: жизнеспособность культивируемых клеток снижалась на 10,2%, 18,3% и 1,7% соответственно в присутствии концентрации 10 мкг/мл.

При изучении антивирусных свойств было установлено, что выделенные из растений вещества обладают ингибирующей активностью в отношении ВИЧ-инфекции. В результате этих исследований были выявлены четыре соединения, эффективно подавляющих ВИЧ-инфекцию (№ 1, 2, 5 и 12): 50%-ная эффективная доза составляла 0,29; 3,1; 8,8 и 0,36 мкг/мл соответственно.

Соединения № 3,4, 6, 7, 10, 11 обнаруживали меньшую эффективность и имели большую величину ED50 - 23,5-28,0 мкг/мл. Для соединений № 8 и 9 50%-ная эффективная доза не была достигнута.

На основании полученных результатов можно выделить два наиболее перспективных соединения с индексами селективности от 100 до 1000: №1 -1034,0; №12-472,0.

Для подтверждения эффективности четырех наиболее активных соединений, перспективных для разработки анти-ВИЧ-микробицидов, была проведена оценка их цитотоксичности для МПК здоровых доноров и антивирусной активности в отношении первичного изолята СК-8. В таблице 4 приведены данные по двум вирус-клеточным системам по значениям 50%-

ной токсической дозы, 50%-ной эффективной дозы и индексам селективности, который рассчитывали как отношение Т05о к ЕО50.

Табл. 4. Цитотоксические и эффективные дозы, индексы селективности исследованных растительных полифенолов.__

№ Т05о, мкг/мл ЕЙ««, мкг/мл 1Б (ТО5„/ЕО50)

соединения СЕМ 8Я МПК НПМвяи/ СК-8/ НПМвки/ СК-8/

СЕМЭЗ МПК СЕМ 88 МПК

1 300 371,5 0,29 0,3 1034,5 1238,3

2 145 221,3 3,1 2,8 46,8 79,0

3 120 23,8 5,0

4 135 27,0 5,0

5 117 285,1 8,8 4,5 13,3 63,4

6 170 25,0 6,8

7 132 28,0 4,7

8 215 >100 н/р"

9 185 >100 н/р

10 145 27,5 5,3

11 215 23,5 9,1

12 170 263,0 0,36 0,7 472,2 375,7

* н/р - невозможно выполнить расчет

Сравнивая эти параметры, можно сделать вывод о значительной корреляции данных, полученных в референс-системе и в системе первичный изолят/МПК. Цитотоксичность растительных полифенолов для мононуклеаров оказалась ниже в 1,3-2,4 раза.

Таким образом, установлено, что все исследованные растительные полифенолы обладают низкой цитотоксичностью для клеток Т-лимфобластоидной линии. Показано, что для мононуклеаров периферической крови здоровых доноров токсическая доза выше, чем для клеток СЕМ Наиболее эффективные в отношении референс-штамма соединения (№1, 2, 5 и 12) обнаружили также значительную активность в отношении первичного изолята: индексы селективности оказались выше для системы СК-8/МПК, максимально приближенной к модели естественной ВИЧ-инфекции, за исключением соединения №12, для которого ИС снизился в 1,2 раза.

4. Изучение цитотоксичности и антивирусной активности гуминовых веществ

Гуминовые вещества (ГВ) - это сложные смеси устойчивых к биодеструкции высокомолекулярных темноокрашенных органических соединений природного происхождения, образующихся при разложении растительных и животных остатков под действием микроорганизмов и абиотических факторов среды [Орлов Д.С., 1990].

Табл. 5. Цитотоксическая и эффективные дозы, индексы селективности исследованных гуминовых веществ._

№ соединения Шифр Происхождение ТВ50, мкг/мл 1Л)5 ;. мкг/мл (ТОи/ЕШ,,)

СЕМ МПК Н1У-1ВЕи/ СЕМ 58 СК-8/ МПК Н1У- ¡вки/ СЕМ ББ СК-8/ МПК

1 СНА-БЩ ГК* угля > 100 >1000 0,29 0,29 2000-4000 >3448,3

2 СНА-1гк ГК угля > 120 2,6 200-300

3 СНА-ет.02 ГК угля >135 >1000 0,34 0,27 2000-4000 >3703,7

4 СНА-АСК ГК угля > 150 >1000 0,64 0,38 2000-4000 >2631,6

5 аю-Ро«01 ГК угля > 100 0,32 2000-4000

6 РРА-Т5 98 ФК** торфа > 100 3,1 200-300

7 РНА-БКЗОО ГК торфа > 150 2,4 200-300

8 РРА-БкЮО ФК торфа >70 2,25 200-300

9 РРА-ЭкЗОО ФК торфа > 100 2,2 200-300

10 РНА-Т598 ГК торфа > 120 0,48 2000-4000

11 рнк-йккга нГВ*** торфа >100 1,45 200-300

12 СНР ГКугля > 100 >1000 0,32 0,29 2000-4000 >3448,3

* ГК - гуминовые кислоты,; ** ФК - фульвокислоты, *** нГВ -нефракционированные гуминовые вещества

Наши исследования показали, что соединения, принадлежащие к классу гуминовых веществ, являются малотоксичными. Изучение цитотоксических свойств показало, что в присутствии соединений № 6, 7, 9, 10 и 11 в концентрациях 1,0-1,5 мг/мл жизнеспособность клеток снижалась от 15 до 20% по сравнению с контролем. Остальные соединения (№ 1, 2, 3, 4, 5, 8, 12) обнаруживали еще меньшую токсичность, уменьшая число живых клеток менее чем на 10%, или не оказывали цитотоксического действия при той же концентрации.

В исследованиях антивирусных свойств было установлено, что соединения на основе гуминовых кислот (ГК) угля (№ 1, 3, 4, 5 и 12) обладали высокой ингибирующей активностью в отношении ВИЧ-инфекции. 50% эффективная доза (ЕВ50) этой группы соединений находилась в пределах 0,3-0,64 мкг/мл. Соединения на основе ГК торфа (№6 и 7) обнаруживали меньшую эффективность и имели в 5-10 раз большую величину ЕО50 2,4 и 3,1 мкг/мл соответственно. Фульвокислоты торфа (№8 и 9) эффективны в той же степени, за исключением соединения №10, активность которого сравнима с активностью ГК угля (табл. 5).

Индексы селективности, как показатель терапевтической ценности препаратов, для ГК угля находились в пределах 2000-4000, а для ГК торфа -200-300. По индексу селективности ГК угля представляются более

перспективными в качестве активного компонента для микробицидных препаратов. Поэтому 4 препарата из этого класса были отобраны для тестирования в системе первичный изолят/МПК. Все 4 препарата оказались малотоксичными для МПК: 50%-ная цитотоксическая доза не была достигнута при использованных концентрациях. Также эти соединения проявили высокую антивирусную активность в отношении первичного изолята СК-8 in vitro.

5. Изучение цитотоксических, антивирусных и вирулицидных свойств кремниевых наночастиц

В последнее время внимание исследователей в области нанотехнологий привлечено к кремниевым нанокристаллам, поскольку они обладают интересными физико-химическими свойствами [Тимошенко и др., 2006]. Исследования последних лет продемонстрировали перспективность нанокристаллов кремния (ne-Si) для использования в различных областях экологии, биотехнологии и медицины. Наноструктурированный пористый кремний по сравнению с обычным кремнием является перспективным биоматериалом с множеством преимуществ [Park J.H. et al, 2009].

В данной работе были исследованы водные суспензии наночастиц кристаллического и пористого кремния. Наши результаты показали, что препараты кристаллического (c-Si) и пористого (p-Si) кремния обладают низкой токсичностью: TD50 составила 257,0 мкг/мл и 162,2 мкг/мл, соответственно (рис. 2).

Рис. 2. Жизнеспособность клеток СЕМ ББ в присутствии различных концентраций суспензий кристаллического (с-Б!) и пористого кремния (р^), выраженная в процентах от контроля клеток, М±8Б.

Изучение анти-ВИЧ-активности показало, что оба препарата не обнаруживают ингибирующего эффекта в субтоксических концентрациях (рис. 3), но проявляют заметный вирулицидный эффект (рис. 4).

! 3-

[

; О» ■в"

— c-SI

-p-Si

О 0.5 1 1.5 2

Концентрация, log мкг/мл

Рис. 3. Антивирусная активность кремниевых наночастиц, выраженная в процентах от контроля инфекции, М±БО.

Сочетание высокой площади поверхности нанокристаллов, низкой токсичности для клеток и вирулицидного действия на ВИЧ-1 in vitro свидетельствует о возможности использования данных препаратов в составе композиций микробицидов нового поколения.

Концентрация, мг/мл

Рис. 4. Вирулицидный эффект кремниевых наночастиц, выраженный в процентах от контроля инфекции, М±БЭ.

17

6. Исследование цитотоксичности, антивирусной активности и вирулицидного эффекта аддуктов углеродных нанокластеров

В последнее время развитие нанотехнологий привело к значительным успехам в области биоинженерии, молекулярной биологии, диагностики и терапии. Получение новых наноматериалов с помощью модификации поверхности, связывания с лигандами (полимерами, углеводородами, пептидами, белками, нуклеиновыми кислотами) делает их важным инструментом современной науки. Несмотря на многочисленные исследования, безопасность и токсичность наночастиц остается предметом дискуссий.

Мы исследовали аддукты нанокластеров углерода, полученные переработкой каменноугольных смол, на цитотоксичность, антивирусную активность и вирулицидный эффект. АНКУ представляет собой новое функционализированное углеродное соединение, обладающее высокой растворимостью в полярных растворителях, в том числе в воде. Данный препарат относится к группе фуллероидов - гигантских каркасных однослойных или многослойных молекул, составленных из сочетания углеродных гексагонов и пентагонов.

Все исследованные водорастворимые аддукты углеродных нанокластеров (эталон, №2, №5, №6, АНКУ и раствор АНКУ ВТП), являются малотоксичными для клеток СЕМ ББ: 50%-ная токсическая доза не была достигнута. При этом наименьшей токсичностью обладали препарат №5 (натриевая соль АНКУ) и легкая фракция АНКУ (раствор АНКУ ВТП): жизнеспособность культивируемых клеток снижалась на 14,7-15,2%, в присутствии препарата в концентрации 100 мкг/мл. Остальные образцы проявляли несколько большую токсичность, снижая жизнеспособность клеток на 20-37,4% при той же концентрации. Низкая токсичность препаратов АНКУ также была выявлена и в МПК здоровых доноров.

В вирус-клеточных системах Н1\Мвки/СЕМ ББ и СК-8/МПК было показано наличие невысокой анти-ВИЧ-активности: Е05о составила от 21,4 до 27,6 мкг/мл для разных препаратов (табл. 6).

Табл. 6. Цитотоксичность и антивирусная активность исследованных препаратов АНКУ.___

Образец Т05о, мкг/мл Е05о, мкг/мл К (ТОм/Е05о)

СЕМ 88 МПК НПМщш/ СЕМ 8Б СК-8/ МПК ШУ-1вю/ СЕМ 85 СК-8/ МПК

Эталон >100 27,5 >7,3

№2 >100 595,7 26,3 21,6 >7,6 27,6

№5 >100 441,6 24,8 22,9 >8,1 19,3

№6 >100 812,8 26,6 23,2 >7,5 35,0

АНКУ >100 676Д 21,4 24,8 >9,3 27,3

Р-рАНКУ ВТП >100 26,8 >7,5

В результате исследования вирулицидного эффекта было показано, что все образцы способны инактивировать вирус, предотвращая заражение клеток-мишеней. Наиболее эффективным препаратом является легкая фракция АНКУ (раствор АНКУ ВТП): при добавлении 0,75 мг/мл препарата уровень инфекции снижается до 0%. После инкубирования вирусного стока с каждым из остальных препаратов в концентрации 3 мг/мл уровень инфекции клеток составлял 0,3-0,9% от контроля инфекции (без препарата). Таким образом, для вирулицидного действия ЕО50 для легкой фракции АНКУ (раствор АНКУ ВТП) составила < 0,2 мг/мл, а для остальных образцов < 1 мг/мл (рис. 5).

Концентрация, мг/мл

Рис. 5. Вирулицидный эффект водорастворимых адцуктов нанокластеров углерода, выраженный в процентах от контроля инфекции, М±50.

Таким образом, принимая во внимание дешевизну исходного сырья для получения изученных веществ, АНКУ являются перспективными для дальнейших исследований с использованием других моделей, направленных на разработку микробицидов с анти-ВИЧ-действием.

7. Поиск эффективных комбинаций соединений, подавляющих ВИЧ-

инфекцию

Комбинирование различных соединений способно повысить эффективность потенциального микробицида в отношении ВИЧ-инфекции. Поэтому нами был проведен поиск эффективных комбинаций различных соединений, подавляющих репликацию ВИЧ.

Синергидный эффект был обнаружен при совместном применении азидотимидина (АЗТ) с препаратами аддуктов углеродных нанокластеров. Мы показали, что АЗТ в концентрации 10"5мМ совместно с любым из препаратов углеродных нанокластеров полностью предотвращает ВИЧ-инфекцию. Для препарата кристаллического кремния такая закономерность

не была обнаружена: при использовании комбинации (100 мкг/мл) и АЗТ (10"5мМ) уровень инфекции снижался на 7,4%, при использовании комбинации с-81 (10 мкг/мл) и АЗТ (10'5мМ) - на 6,8% по сравнению с соответствующими контролями наночастиц (табл. 7).

Было изучено комплексное действие аддуктов нанокластеров углерода и наиболее эффективных соединений из классов растительных полифенолов -№1 и №12, - которые были отобраны по максимальным значениями К. В случае использования полифенола №1 в концентрации 0,1 мкг/мл уровень инфекции составлял 92%. При добавлении к клеткам кроме полифенола препаратов аддуктов нанокластеров углерода №2, 5, 6 в концентрации 10 мкг/мл или 100 мкг/мл снижался до 0-0,1%. В случае использования полифенола №12 в концентрации 0,1 мкг/мл уровень инфекции составлял 89,6%. При добавлении к клеткам кроме полифенола препаратов аддуктов нанокластеров углерода №2 или №5 в концентрации 10 мкг/мл или 100 мкг/мл снижался до 0,0-0,1%. В случае использования препарата №6 или АНКУ в концентрации 100 мкг/мл результат был такой же: снижение инфекции до уровня 0,0% и 0,2% соответственно (табл. 8).

Табл. 7. Совместное действие АЗТ и углеродных нанокластеров или кристаллического кремния. Уровень инфекции, % от контроля инфекции,

М±БО.

Концентрация АЗТ, иМ ю-5 0

Концентрация препарата АНКУ, мкг/мл 1000 100 10 0 1000 100 10

Эталон 0,5±0,1 0,6±0,0 0,7±0,1 88,4±0,3 0,0±0,0 8,3±0,3 88,4±2,1

№2 0,0±0,0 0,0±0,0 0,1 ±0,1 0,0±0,1 5,8±0,1 87,2±1,0

№5 0,7±0,1 0,8±0,2 0,9±0,2 0,3±0,1 4,4±0,4 85,0±1,4

№6 0,0±0,1 0,2±0,1 0,4±0,1 0,0±0,0 6,2±0,3 86,3±0,5

АНКУ 0,3±0,1 0,4±0,1 0,5±0,1 0,0±0,0 2,9±0,1 75,3±1,5

с-81 0,0±0,0 92,и2,9 92,7±3,9 33,3±0,7 77,7±0,4 99,5±1,3

Табл. 8. Совместное. действие растительных полифенолов (ПФ) и углеродных нанокластеров. Уровень инфекции, % от контроля инфекции, М^.

Концентрация полифенола ПФ №1,0,1 мкг/мл ПФ №12, 0,1 мкг/мл

Концентрация препарата АНКУ, мкг/мл 1000 100 10 0 1000 100 10 0

№2 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 92,0±0,б 0,0±0,0 0,0±0,1 0,1±0,0 89,б±0,3

№5 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,1 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0

№6 0,0±0,0 0,0±0,0 0,1±0,1 0,2±0,1 0,2±0,1 59,8±0,3

АНКУ 0,0±0,0 0,0±0,0 64,6±2,2 0,0±0,0 0,0±0,0 93,6±0,3

Аналогичные эксперименты были проведены и для наиболее эффективных соединений из классов гуминовых кислот - №1 (СНА-БШ) и

№12 (СНР), которые были отобраны по минимальным значениям ЕО50. При комбинированном использовании препаратов гуминовых кислот и различных препаратов аддуктов нанокластеров углерода для ингибирования ВИЧ-инфекции в вирус-клеточной системе НГ\МВяи/СЕМ ББ был обнаружен синергидный эффект. Добавление 100 мкг/мл или 10 мкг/мл препаратов аддуктов нанокластеров углерода к СНА-БШ в концентрации 0,01 мкг/мл приводило практически к полному подавлению инфекции. Совместное использование гуминовой кислоты СНР в концентрации 0,01 мкг/мл и различных препаратов АНКУ в концентрации 100 мкг/мл также предотвращало развитие инфекции (табл. 9).

Совместное использование растворов кристаллического или пористого кремния с растительными полифенолами и гуминовыми кислотами приводило к незначительному снижению уровня инфекции по сравнению с контролями.

Табл. 9. Совместное действие гуминовых кислот и аддуктов нанокластеров углерода или кремниевых наночастиц. Уровень инфекции, % от контроля инфекции, М±БР.__

Концентрация гуминовой кислоты ГК №1 (СНА-5Н4), 0,01 мкг/мл ГК №12 (СНР), 0,01 мкг/мл

Концентрация препарата, мкг/мл 1000 100 10 0 1000 100 10 0

№2 0,б±0,0 0,7±0,1 1,4±0,5 0,0±0,0 0,0±0,0 51,2±0,9

№6 0,0±0,0 0,0±0,0 0,2±0,1 0,0±0,0 0,3±0,5 105,3±1,5

АНКУ 0,0±0,0 0,0*0,0 0,0±0,0 91,6±6,3 0,7±0,1 0,9±0,1 2,2±0,3 95,9±9,3

Р-р АНКУ ВТП н/в* 0,0±0,1 0,5±0Д н/в 0,0±0,0 6,2±0,3

с« 2,1±0,7 10б,1±0,0 10б,1±0,0 1,0±0,1 35,4±0,5 98,5±1,5

р-Б! 0,0±0,0 89,8±0,1 90,1±1,8 0,5±0,1 91,2±0,4 92,8±1,9

*н/в - не выполнено

выводы

1. Определена первичная структура участков генов env и gag вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в Московской области. Доминирующим является субтип А (93,4%), доля субтипа В составляет 6,6%.

2. Среди исследованных вариантов ВИЧ-1 не было обнаружено кластрирования и корреляции между полом пациента или путем передачи инфекции и субтипом вируса.

3. Изолировано два актуальных штамма ВИЧ-1, циркулирующих на территории Московской области.

4. Показана низкая цитотоксичность в клетках Т-лимфобластоидной линии СЕМ SS и в мононуклеарных клетках периферической крови ряда соединений, принадлежащих к различным классам химических веществ: растительные полифенолы, гуминовые вещества, кремниевые наночастицы и аддукты углеродных нанокластеров.

5. Выявлена высокая антивирусная активность гуминовых веществ и двух соединений из класса растительных полифенолов в различных вирус-клеточных моделях, в том числе с использованием актуального штамма ВИЧ-1.

6. Обнаружен синергидный эффект ингибирования ВИЧ-инфекции in vitro при комбинировании аддуктов нанокластеров углерода с азидотимидином, растительными полифенолами и гуминовыми кислотами.

7. Отобраны соединения с наибольшими индексами селективности, низкой цитотоксичностью и высокой антивирусной активностью, которые могут быть кандидатными микробицидами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Карамов Э.В., Гарманова A.B., Хаитов P.M. Мукозный иммунитет и его особенности. Иммунология, 2008, т.29, №6, с.377-384.

2. Зебницкая И.С., Гарманова A.B., Алексеева Л.П., Зенин П.В., Крыжановская O.A., Хаметова K.M., Корнилаева Г.В., Гудима Г.О., Карамов Э.В., Сидорович И.Г. Двойная инфекция ВИЧ/туберкулез: серологические исследования. Российский аллергологический журнал,

2009, №3, пр. 1,с.219-220.

3. Гилязова А. В., Зенин П. В., Пронин А. Ю., Серков И. Л., Хаметова К. М., Орлова-Морозова Е. А., Жукова Е. В., Корнилаева Г. В., Пастернак А. О., Лукашов В. В., Карамов Э. В. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-1 в Московской области. Вопросы вирусологии,

2010, №5, с.25-29.

4. Корнилаева Г.В., Перминова" И.В., Гилязова A.B., Хаметова K.M., Карамов Э.В. Гуминовые вещества как перспективные соединения для создания микробицидных препаратов. Российский иммунологический журнал, в печати.

5. Гилязова A.B., Корнилаева Г.В., Пономарев А.Н., Черешнев В.А., Карамов Э.В. Микробициды с анти-ВИЧ-активностью на основе адцуктов углеродных нанокластеров. Российский иммунологический журнал, в печати.

6. Пронин А.Ю., Гарманова A.B., Серков И.Л., Зенин П.В., Крыжановская O.A., Жукова Е.В., Орлова-Морозова Е.А., Хаметова K.M., Корнилаева Г.В., Карамов Э.В. Мониторинг ВИЧ-инфекции в Московском регионе. Теоретические и практические аспекты современной эпидемиологии: материалы научно-практической конференции, посвященной 75-й годовщине со дня рождения акад. РАМН Б.Л. Черкасского (Москва, 28 января 2009 г.), Моск.мед.акад. им. И.М. Сеченова [под общ.ред. H.H. Филатова, И.В. Михеевой], М.: Санэпидмедиа, 2009, с. 104-105.

7. Karamov Е., Pronin А., Kornilaeva G., Serkov I., Zenin P., Zhukova E., Garmanova A., Orlova-Morozova E., Khametova K., Lukashov V. Genetic variability of HIV in Russia. 5th European Conference on Clinical and Social Research on AIDS and Drugs, Vilnius, Lithuania (28-30 April 2009), Abstract book, p.53.

8. Карамов Э.В., Пронин А.Ю., Лукашов B.B., Серков И.Л., Гарманова A.B., Зенин П.В., Жукова Е.В., Крыжановская O.A., Орлова-Морозова Е.А., Хаметова K.M., Павлова Т.В., Корнилаева Г.В. Молекулярная эпидемиология ВИЧ/СПИД в России. Актуальные вопросы инфекционной патологии. Сборник докладов научно-практической конференции, посвященной 100-летию Ростовского НИИ микробиологии и паразитологии (23-24 сентября 2009 г., г. Ростов-на-Дону), изд-во НМД Логос, 2009, с.370-376.

9. Зебницкая И.С., Гарманова А.В., Алексеева Л.П., Зенин П.В., Крыжановская О.А., Хаметова К.М., Корнилаева Г.В., Карамов Э.В. Характеристика сывороток пациентов с двойной инфекцией ВИЧ/туберкулез. Актуальные вопросы инфекционной патологии. Сборник докладов научно-практической конференции, посвященной 100-летию Ростовского НИИ микробиологии и паразитологии (23-24 сентября 2009 г., г. Ростов-на-Дону), изд-во НМЦ Логос, 2009, с.416-420.

10. Karamov Е., Zaycev I., Zenin P., Meshandin A., Zebnickaya I., Gilyazova A., Alekseeva L., Komilaeva K., Sidorovich I., Demikhova O. HIV-1/AIDS-TB crisis in Russia. Keystone Symposia Meeting «Overcoming the Crisis of ТВ and AIDS», 20-25 October, 2009, Arusha, Tanzania, Abstract Book, p.85.

11. Gilyazova A., Zenin P., Serkov I., Pronin A., Khametova K., Kryzhanovskaya O., Orlova-Morozova E., Zhukova E., Komilaeva G., Lukashov V., Karamov E. Monitoring of HIV-1 infection in Moscow and Moscow region. 3th Eastern Europe and Central Asia AIDS Conference EECAAC, US-Russia HIV Prevention Science Workshop (October 28-30, 2009, Moscow), Abstract book, vol.2, p.28.

12. Karamov E., Zaytsev I., Zenin P., Meshandin A., Gilyazova A., Zebnickaya I., Komilaeva G., Alekseeva L., Khametova K. Kryzhanovskaya O. Analysis of sera from patients coinfected with HIV and ТВ // 3th Eastern Europe and Central Asia AIDS Conference EECAAC, US-Russia HIV Prevention Science Workshop (October 28-30, 2009, Moscow), Abstract book, vol.2, p.34.

13. Komilaeva G.V., Pavlova T.V., Kukhanova M.K., Gilyazova A.V., Zenin P.V., Khaitov M.R., Karamov E.V. New stable nucleoside analogs as microbicides. 3th Eastern Europe and Central Asia AIDS Conference EECAAC, US-Russia HIV Prevention Science Workshop (October 28-30,

- 2009, Moscow), Abstract book, vol.2, p.217.

Подписано в печать 30.09. ю Формат60X84/16 Бумага офисная «5уе1оСору». Тираж 100 экз. Заказ №744 Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Передача ВИЧ-инфекции через слизистые оболочки.16

Рациональность использования микробицидов.20

Механизмы действия микробицидов.22

Энхансеры защиты вагинальной слизистой.22

Поверхностно-активные вещества (ПАВ).24

Ингибиторы проникновения/фузии.26

Ингибиторы репликации.30

Экспериментальные системы для оценки эффективности микробицидов

32

Клеточные модели.35

Тканевые экспланты.38

Животные модели.43

Доклинические и клинические испытания микробицидов с анти-ВИЧактивностью.46

Доклинические исследования.47

Клинические исследования.50

Будущие направления разработки микробицидов.56

Заключение.57

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.58

Сыворотки.58

Клеточные культуры.58

Культивирование суспензионных лимфобластоидных клеточных линий. 58

Криоконсервация суспензионных клеточных культур.59

Культуры донорских МПК.59

Вирусы.60

Соединения.61

Растительные полифенолы.61

Гуминовые вещества.63

Наночастицы кристаллического кремния.65

Наночастицы пористого кремния.65

Аддукты нанокластеров углерода.65

Получение и определение нуклеотидных последовательностей.66

Изоляция РНК ВИЧ-1 из клинических образцов.66

Получение вирусспецифической ДНК из РНК.67

Амплификация нуклеотидных последовательностей генома ВИЧ-1.68

Анализ препаратов ДНК.69

Определение нуклеотидных последовательностей.70

Поиск и использование полученных ранее генетических последовательностей.70

Методы филогенетического анализа.71

Подготовка последовательностей для анализа.71

Определение эволюционных дистанций и построение филогенетических деревьев.71

Определение 50%-ной инфекционной дозы (ТСГО50).72

Изучение цитотоксических свойств соединений.72

Исследование антивирусной активности соединений.74

Исследование вирулицидного действия соединений.75

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ ВИЧ-1.75

Методы статистического анализа.76

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.77 1

Молекулярная эпидемиология ВИЧ-инфекции в Московской области.77

Анализ эпидемиологических данных.77

Молекулярно-генетическая структура штаммов ВИЧ-1, циркулирующих е

Московской области.79

Филогенетический анализ.81

Изоляция штаммов ВИЧ-1.84

Определение 50%-ной инфекционной дозы (ТСГО50).86

Поиск анти-ВИЧ-соединений в ряду полифенолов растений.88

Изучение цитотоксичности и антивирусной активности гуминовых веществ.95

Изучение цитотоксических, антивирусных и вирулицидных свойств кремниевых наночастиц.101

Исследование цитотоксичности, антивирусной активности и вирулицидного эффекта углеродных нанокластеров.103

Поиск эффективных в отношении ВИЧ-инфекции комбинаций соединений.107

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.116

Молекулярная эпидемиология вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в

Московской области.116

Изоляция актуальных штаммов ВИЧ-1.119

Цитотоксичность и антивирусная активность соединений, относящихся к различным химическим классам.121

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.126

ВЫВОДЫ.128

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.129

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АНКУ - аддукты нанокластеров углерода

ВИЧ-1 - вирус иммунодефицита человека 1-го типа

ВПГ — вирус простого герпеса

ВПЧ - вирус папилломы человека

ВТП - высокотемпературный пек

ГК - гуминовые кислоты

ДК - дендритные клетки

ЗППП - заболевания, передающиеся половым путем ИЛ-2 - интерлейкин-2

И1 JUL ill - инфекции, передающиеся половым путем

JITC - лимфоидная ткань слизистых оболочек

МПК — мононуклеарные клетки периферической крови

МСМ - мужчины, имеющие секс с мужчинами

ОТ - обратная транскриптаза

ПАВ - поверхностно-активное вещество

ПФ - полифенол

СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита СТП - среднетемпературный пек ТИ - терапевтический индекс (индекс селективности) ФГА - фитогемагглютинин

CTL — cytotoxic Т- lymphocyte (цитотоксические Т-лимфоциты) DC-SIGN - dendritic cell-specific ICAM-grabbing non-integrin ED50 - 50% эффективная доза HIV-1 - Human Immunodeficiency Virus Type 1

HSV-2 - herpes simples virus type 2 (вирус простого герпеса 2-го типа) ÎS - индекс селективности mAbs - monoclonal antibodies

MTT - [l-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-3,5-diphenylformazan] PBMC - peripheral blood mononuclear cell PMPA - 9-[2-(phosphonomethoxy)propyl]adenine

SIV - simian immunodeficiency virus (вирус иммунодефицита обезьян) TD50 - 50% цитотоксическая доза

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Пандемия ВИЧ/СПИДа продолжает оставаться одной из основных проблем здравоохранения во всем мире, несмотря на все усилия по предотвращению и контролю ВИЧ-инфекции. В настоящее время более 33 млн. людей живут с ВИЧ-инфекцией. По данным ИМАГО Б за 2009 год зарегистрировано 2,5 млн. смертей и около 2,7 млн. новых случаев ВИЧ-инфекции, большинство из них среди женщин [105]. В России в период до 2001 г. среди выявленных случаев преобладали мужчины (75-88%). Но уже к 2006 г. доля ВИЧ-позитивных женщин составила 44% и продолжает расти. Увеличивается и число детей, инфицированных ВИЧ-позитивными матерями. Такое тендерное распределение ставит обязательным вопрос о разработке эффективных способов предотвращения передачи ВИЧ женщинам и блокирования половой передачи ВИЧ.

Поиск новых перспективных соединений, предотвращающих передачу ВИЧ-инфекции, является одной из актуальных задач здравоохранения, поскольку существуют трудности в разработке вакцин, отсутствие средств специфической профилактики, а также появление вариантов ВИЧ-1, обладающих лекарственной устойчивостью [59]. Частью комплексного подхода в системе профилактических мер против распространения ВИЧ/СПИДа является разработка и применение микробицидов.

Микробициды - это препараты, гелевые или мазевые композиции, содержащие активные составляющие, способные предотвращать половую передачу ВИЧ и других заболеваний, передающихся половым путем (гонорея, хламидиозы, генитальный герпес). Такие продукты предназначены, прежде всего, для женщин, которые могут пользоваться данным средством профилактики независимо от полового партнера.

Многие микробициды успешно прошли доклинические испытания, но их безопасность для человека и эффективность остаются нерешенной проблемой. Важность клинических испытаний была проиллюстрирована исследованиями ноноксинола-9, который вызывал физические повреждения слизистой оболочки, что повышало риск ВИЧ-инфицирования. Такой опыт способствовал разработке критериев, которые должны быть использованы в качестве стандартов при проведении клинических испытаний [82].

Согласно последним публикациям около 70 новых соединений находятся на стадии подготовки к исследованиям как спермициды и/или микробициды местного действия и 7 препаратов в настоящее время проходят клинические испытания. Они включают в себя поверхностно-активные вещества (ПАВ), анионные полимеры, ингибиторы; проникновения ВИЧ в клетку, ингибиторы обратной транскриптазы. Предполагается, что применение препарата даже с эффективностью 60% за 3 года предотвратит 2,5 млн. случаев ВИЧ-инфекции, если он будет использован 20% женщин в 50% небезопасных половых, актов [59].'Идеальные микробициды представляют собой безопасное, действенное и недорогое средство защиты от ВИЧ-инфекции, других ИППП и даже от нежелательной беременности [104].

Для создания компонентов вакцин и микробицидов, направленных против актуальных вариантов ВИЧ, циркулирующих на определенной территории, а также для того, чтобы понять эпидемиологию и происхождение ВИЧ-1, необходим постоянный мониторинг распространения ВИЧ-эпидемии. ВИЧ-инфекция на территории России и бывшего СССР в основном вызвана двумя субтипами А и В, а также рекомбинантным субтипом А/В. Генетический анализ определил субтип А как доминирующий в большинстве регионов. В то же время в Калининграде и в Череповце выявлен мозаичный вариант А/В. Кроме того, исследования, проведенные различными группами авторов, выявили появление других субтипов ВИЧ, которые способны вызвать новые вспышки эпидемии [1]. Таким образом, обнаружение новых вариантов вируса и прогноз развития эпидемии являются важными аспектами в разработке профилактических средств против ВИЧ.

Целью данной работы был поиск соединений, подавляющих репликацию ВИЧ-1 в различных вирус-клеточных системах, а также определение молекулярно-генетической структуры вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в Московской области.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучение молекулярно-генетической структуры вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в Московской области.

2. Изоляция актуальных штаммов ВИЧ-1 от ВИЧ-инфицированных лиц с ранней инфекцией.

3. Исследование цитотоксических свойств потенциальных микробицидов, относящихся к различным классам химических веществ (растительные полифенолы, гумиыовые вещества, кремниевые наночастицы и аддукты нанокластеров углерода).

4. Оценка антивирусной активности соединений различной природы in vitro с использованием референс-штамма и первичного изолята ВИЧ-1.

5. Поиск комбинаций препаратов, проявляющих синергизм при ингибировании ВИЧ-инфекции in vitro.

Научная новизна работы Получены новые данные по молекулярно-генетической структуре вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в Московской области. Результаты свидетельствуют об увеличении эволюционной дистанции между циркулирующими вариантами ВИЧ по сравнению с данными, полученными на более ранних этапах развития эпидемии.

Получены клинические изоляты ВИЧ-1, представляющие собой актуальные штаммы, которые вызывают инфекцию на территории Московской области.

Впервые исследованы индивидуальные соединения класса полифенолов, выделенные и очищенные из растений семейства Euphorbiaceae, на цитотоксичность и эффективность в отношении ВИЧ-инфекции in vitro.

Впервые проведен анализ гуминовых веществ как соединений, перспективных для разработки микробицидов.

Впервые изучены цитотоксические, антивирусные и вирулицидные свойства кремниевых наночастиц и аддуктов нанокластеров углерода на модели ВИЧ-инфекции in vitro. Впервые показана возможность комбинированного использования этих препаратов в комплексе с другими анти-ВИЧ-соединениями.

Найдены эффективные соединения с высокими индексами селективности, которые могут стать основой для разработки специфических анти-ВИЧ-микробицидов.

Научно-практическая значимость работы

Разработка эффективных микробицидных препаратов позволит снизить распространение ВИЧ/СПИД половым путем. В данной работе изучена анти-ВИЧ-активность соединений, принадлежащих к различным классам химических веществ (растительные полифенолы, гуминовые вещества, кремниевые наночастицы, аддукты нанокластеров углерода).

Цитотоксичность препаратов, их антивирусное и вирулицидное действие были проверены с использованием стандартных методик, что позволяет сравнивать результаты с последующими исследованиями, а также с литературными данными. В результате такого сравнения возможен отбор наиболее эффективных соединений в отношении ВИЧ-инфекции in vitro.

Полученные клинические изоляты представляют собой актуальные штаммы ВИЧ, циркулирующие в Московской области в настоящее время. Данные первичные штаммы могут быть использованы для оценки эффективности потенциальных кандидатных микробицидов и компонентов анти-ВИЧ-вакцин.

В результате исследований выявлены наиболее активные соединения, перспективные для создания нового типа микробицидных препаратов, которые позволят быстро и эффективно предотвратить передачу ВИЧ-инфекции половым путем. Обнаружение комбинаций препаратов, подавляющих ВИЧ-инфекцию in vitro, делает возможным использование активных соединений в более низких концентрациях, что уменьшит цитотоксичность.

Выявление малой токсичности для клеток препаратов наночастиц кристаллического и пористого кремния, а также аддуктов нанокластеров углерода открывает возможность изучения этих образцов в качестве систем доставки анти-ВИЧ-микробицидов.

Данные по молекулярной эпидемиологии ВИЧ-инфекции в Московской области, описанные в настоящей работе, могут быть использованы для разработки региональных вакцин. На основании полученных результатов можно судить о путях и источниках распространения эпидемии и проводить профилактическую работу значительно эффективнее.

Публикации по теме диссертации

1. Карамов Э.В., Гарманова A.B., Хаитов P.M. Мукозный иммунитет и его особенности. Иммунология, 2008, т.29, №6, с.377-384.

2. Зебницкая И.С., Гарманова A.B., Алексеева Л.П., Зенин П.В., Крыжановская O.A., Хаметова K.M., Корнилаева Г.В., Гудима Г.О., Карамов Э.В., Сидорович И.Г. Двойная инфекция ВИЧ/туберкулез: серологические исследования. Российский аллергологический журнал, 2009, №3,пр.1,с.219-220.

3. Гилязова A.B., Зенин П.В., Пронин А.Ю., Серков И.Л., Хаметова K.M., Орлова-Морозова Е.А., Жукова Е.В., Корнилаева Г.В., Пастернак А.О.,

Лукашов В.В., Карамов Э.В. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-1 в Московской области. Вопросы вирусологии, 2010, №5, с. 25-29.

4. Корнилаева Г.В., Перминова И.В., Гилязова A.B., Хаметова K.M., Карамов Э.В. Гуминовые вещества как перспективные соединения для создания микробицидных препаратов. Российский иммунологический журнал, в печати.

5. Гилязова A.B., Корнилаева Г.В., Пономарев А.Н., Черешнев В.А., Карамов Э.В. Микробициды с анти-ВИЧ-активностью на основе аддуктов углеродных нанокластеров. Российский иммунологический журнал, в печати.

6. Пронин А.Ю., Гарманова A.B., Серков И.Л., Зенин П.В., Крыжановская O.A., Жукова Е.В., Орлова-Морозова Е.А., Хаметова K.M., Корнилаева Г.В., Карамов Э.В. Мониторинг ВИЧ-инфекции в Московском регионе. Теоретические и практические аспекты современной эпидемиологии: материалы научно-практической-конференции, посвященной 75-й годовщине со дня рождения, акад. РАМН Б.Л. Черкасского (Москва, 28 января 2009 г.)/ Моск.мед.акад. им. И.М. Сеченова [под общ.ред. Н.Н.Филатова, И.В. Михеевой], М.: Санэпидмедиа, 2009, с. 104-105.

7. Karamov Е., Pronin А., Kornilaeva G., Serkov I., Zenin P., Zhukova E., Garmanova A., Orlova-Morozova E., Khametova K., Lukashov V. Genetic variability of HIV in Russia. 5th European Conference on Clinical and Social Research on AIDS and Drugs, Vilnius, Lithuania (28-30 April 2009), Abstract book, p.53.

8. Карамов Э.В., Пронин А.Ю., Лукашов B.B., Серков И.Л., Гарманова A.B., Зенин П.В., Жукова Е.В., Крыжановская O.A., Орлова-Морозова Е.А., Хаметова K.M., Павлова Т.В., Корнилаева Г.В. Молекулярная эпидемиология ВИЧ/СПИД в России. Актуальные вопросы инфекционной патологии. Сборник докладов научнопрактической конференции, посвящённой 100-летию Ростовского НИИ микробиологии и паразитологии (23-24 сентября 2009 г., г. Ростов-на-Дону), изд-во НМЦ Логос, 2009, с.З70-376.

9. Зебницкая И.С., Гарманова А.В., Алексеева Л.П., Зенин П.В., Крыжановская О.А., Хаметова К.М., Корнилаева F.B., Карамов Э.В. Характеристика сывороток пациентов с двойной инфекцией ВИЧ/туберкулез. Актуальные вопросы инфекционной патологии. Сборник докладов научно-практической конференции, посвященной 100-летию Ростовского НИИ микробиологии и паразитологии (23-24 сентября 2009 г., г. Ростов-на-Дону), изд-во НМЦ Логос, 2009, с.416-420.

10.Karamov Е., Zaycev I., Zenin P., Meshandin A., Zebnickaya I., Gilyazova A., Alekseeva L., Kornilaeva K., Sidorovich I., Demikhova O. HIV-1/AIDS-TB crisis in Russia. Keystone Symposia Meeting «Overcoming the Crisis of ТВ and AIDS», 20-25 October, 2009, Arusha, Tanzania, Abstract Book, p.85.

11.Gilyazova A., Zenin P., Serkov I., Pronin A., Khametova' K.,

Kryzhanovskaya O., Orlova-Morozova E., Zhukova E., Kornilaeva G.,

Lukashov V., Karamov E. Monitoring of HIV-l infection in Moscow and th

Moscow region. 3 Eastern Europe and Central Asia AIDS Conference EECAAC, US-Russia HIV Prevention Science Workshop (October 28-30, 2009, Moscow), Abstract book, vol.2, p.28.

12.Karamov E., Zaytsev I., Zenin P., Meshandin A., Gilyazova A., Zebnickaya I., Kornilaeva G., Alekseeva L., Khametova K. Kryzhanovskaya O. Analysis of tVi sera from patients coinfected with HIV and ТВ. 3 Eastern Europe and Central Asia AIDS Conference EECAAC, US-Russia HIV Prevention Science Workshop (October 28-30, 2009, Moscow), Abstract book, vol.2, p.34.

13.Kornilaeva G.V., Pavlova T.V., Kukhanova M.K., Gilyazova A.V., Zenin P.V., Khaitov M.R., Karamov E.V. New stable nucleoside analogs as tVi microbicides. 3 Eastern Europe and Central Asia AIDS Conference

EECAAC, US-Russia HIV Prevention Science Workshop (October 28-30, 2009, Moscow), Abstract book, vol.2, p.217.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных и выводов. Библиографический указатель включает 130 источников, в том числе 10 отечественных и 120 зарубежных. Диссертация содержит 40 таблиц и 32 рисунка.

ВЫВОДЫ

1. Определена первичная структура участков генов env и gag вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в Московской области. Доминирующим является субтип А (93,4%), доля субтипа В составляет 6,6%.

2. Среди исследованных вариантов ВИЧ-1 не было обнаружено кластрирования и корреляции между полом пациента или путем передачи инфекции и субтипом вируса.

3. Изолировано два актуальных штамма ВИЧ-1, циркулирующих на территории Московской области.

4. Показана низкая цитотоксичность в клетках Т-лимфобластоидной линии СЕМ SS ив мононуклеарах периферической крови ряда соединений, принадлежащих к различным классам химических веществ: растительные полифенолы, гуминовые вещества, кремниевые наночастицы и аддукты углеродных нанокластеров.

5. Выявлена высокая антивирусная активность гуминовых веществ и двух соединений из класса растительных полифенолов в различных вирус-клеточных моделях, в том числе с использованием актуального штамма ВИЧ-1.

6. Обнаружен синергидный эффект ингибирования ВИЧ-инфекции in vitro при комбинировании аддуктов нанокластеров углерода с азидотимидином, растительными полифенолами и гуминовыми кислотами.

7. Отобраны соединения с наибольшими индексами селективности, низкой цитотоксичностью и высокой антивирусной активностью, которые могут быть кандидатными микробицидами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Микробициды представляют собой препараты нового поколения, созданные на основе веществ с антивирусной активностью, способных ингибировать различные стадии репликации ВИЧ. Разработка микробицидных препаратов является важной и крайне актуальной задачей.

В соответствии с целями и задачами работы был проведен поиск новых эффективных анти-ВИЧ-препаратов среди различных классов химических соединений: растительные полифенолы, гуминовые вещества, наночастицы кристаллического и пористого кремния, аддукты нанокластеров углерода и их комбинации с природными соединениями.

Для изоляции актуальных штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в настоящее время в Московской области, была исследована когорта из 360 ВИЧ-инфицированных лиц, не получавших антиретровирусной. терапии. В процессе выполнения работы была изучена молекулярная эпидемиология ВИЧ-инфекции в Московской области. В результате нашего исследования можно сделать вывод о том, что сохраняется тенденция превалирования субтипа А в российской ВИЧ эпидемии: анализ нуклеотидных последовательностей по обеим областям генома env и gag показал наличие двух субтипов - А (93,4%) и В (6,6%).

Нами получено 2 штамма от лиц с ранней ВИЧ-инфекцией (до 12 месяцев), не получавших антиретровирусной терапии, один из которых был использования для тестирования соединений с наибольшими индексами селективности.

В данной работе исследованы 12 соединений класса полифенолов, выделенных из растений сем. Euphorbiaceae. Установлено, что все исследованные растительные полифенолы обладают низкой цитотоксичностью для клеток Т-лимфобластоидной линии. Показано, что для МПК здоровых доноров токсическая доза выше, чем для клеток СЕМ SS. Наиболее эффективные в отношении референс-штамма соединения (№1, 2, 5 и 12) обнаружили также значительную активность в отношении первичного изолята.

Изучена анти-ВИЧ-активность 12 соединений класса гуматов. Установлено, что все исследованные соединения являются малотоксичными и обладают достаточно высоким антивирусным эффектом. Определение химиотерапевтического индекса для некоторых из исследованных соединений было затруднено, так как для них не удалось обнаружить 50%-ную токсическую концентрацию в связи с малой цитотоксичностью. Однако даже приблизительный расчет показывает, что эта величина достаточно высока. Эти характеристики, а также огромные запасы этих природных веществ, указывают на перспективность разработки недорогих микробицидных препаратов.

Исследованы цитотоксические, антивирусные и вирулицидные свойства кремниевых наночастиц и аддуктов нанокластеров углерода. Было показано, что два препарата наночастиц кремния обладают низкой токсичностью, не подавляют вирусную репродукцию, но проявляют заметный вирулицидный эффект. Тогда как водорастворимые аддукты нанокластеров углерода проявляют и вирулицидное, и антивирусное действие. При совместном использовании АНКУ с АЗТ, растительными полифенолами или гуминовыми кислотами обнаружен синергидный эффект.

128