Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Миелоидные супрессорные клетки при экспериментальной туберкулёзной инфекции

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Центральный научно-исследовательский институт туберкулёза» Российской академии медицинских наук

на правах рукописи

005059647

Цыганов Евгений Николаевич

4с

Миелоидные супрессорные клетки при экспериментальной туберкулёзной инфекции

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

16 МАП --'¡1

Москва 2013

005059647

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Центральный научно-исследовательский институт туберкулёза» Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Лядова Ирина Владимировна Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Атауллаханов Равшан Иноятович. Федеральное государственное бюджетное учреждение Государственный научный центр «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства»

доктор медицинских наук, профессор Владимирский Михаил Александрович. Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится - 7 июня 2013 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 208.130.01 в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации (123098, Москва, ул. Гамалеи, 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Автореферат разослан «2Я » апреля 2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Туберкулёз (ТБ) является одним из наиболее распространённых инфекционных заболеваний в мире и наиболее распространённой причиной гибели населения от инфекционного бактериального заболевания (WHO, 2011). Предупреждение распространения ТБ требует разработки новых методов его диагностики, лечения и профилактики. Решение этих задач невозможно без понимания клеточных и молекулярных механизмов, обеспечивающих иммунологический контроль над развитием заболевания, и выяснения патогенетических путей его прогрессирования.

Изучению патогенеза ТБ посвящено большое количество исследований. Эти исследования позволили установить роль Т-лимфоцитов, макрофагов и нейтрофилов в инициации и развитии противотуберкулёзного иммунного ответа, в формировании гранулём; выявили ключевые цитокины, необходимые для эффективной противотуберкулёзной защиты (ИФН-у, TNF-a и др.), основные медиаторы антимикобактериальной активности фагоцитов (активные формы азота, кислорода и др.) (Flynn J. L. et al., 2001). Было показано, что дефекты в этих звеньях иммунного ответа приводят к развитию тяжёлых форм ТБ, что связано с нарушениями иммунологического контроля уже на начальных этапах инфекции М. tuberculosis. Заболевание ТБ, однако, встречается и у лиц без выраженных признаков иммунодефицитов. При этом течение заболевания и скорость его прогрессирования могут быть различными. Факторы, определяющие особенности течения ТБ и скорость его прогрессирования у иммунокомпетентных хозяев остаются не до конца понятными.

Недавние исследования, проведённые в ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН на модели экспериментальной ТБ инфекции у мышей, показали, что быстрое прогрессирование ТБ характеризуется развитием сильного воспалительного ответа, а также накоплением в лёгочной ткани инфицированных мышей необычной популяции клеток с фенотипом Gr-ldlm (Lyadova I. V. et al., 2010). Основной особенностью этих клеток являлась экспрессия маркёров, характерных для нейтрофилов (Gr-1, Ly-6G), но на уровне, существенно более низком, чем это свойственно нейтрофилам. Природа клеток Gr-ldim, их присутствие в других органах инфицированных мышей (в частности, в органах кроветворения), а также их вклад в прогрессирование ТБ оставались непонятными. В то же время, в литературе имеется большое количество работ, посвящённых изучению подобных клеток (клеток с фенотипом Gr-ld,m) при других патологических состояниях. Показано, что клетки Gr-1dlm экспрессируют маркёр миелоидных клеток CDllb, образуются и в больших количествах накапливаются при опухолевых заболеваниях, травмах, некоторых инфекциях (Gabrilovich D. I. et al,, 2009). При этих патологиях клетки Gr-1 , как правило, представляют собой незрелые миелоидные клетки (предшественники гранулоцитов, моноцитов, дендритных клеток), которые образуются под воздействием воспалительных факторов, обладают способностью подавлять Т-

з

клеточный ответ и за счёт этого вносят вклад в патогенез основного заболевания. Такие клетки в англоязычной литературе принято называть супрессорными клетками миелоидного происхождения (от английского myeloid-derived suppressor cells, MDSC; в настоящей работе - МС - миелоидные супрессоры (Gabrilovich D. I. et al., 2009).

Известно, что прогрессирование ТБ часто сопровождается снижением количества и функциональной активности Т-лимфоцитов (Ловачёва О. В., 1993; Pilheu J. A. et al., 1997; Bold Т. D. et al., 2011). Причины Т-клеточной анергии при ТБ до настоящего времени остаются не до конца понятными. Нами было предположено, что клетки Gr-ld,m, обнаруженные ранее в лёгких мышей с быстро прогрессирующей ТБ инфекцией, могут представлять собой незрелые миелоидные клетки, обладать супрессорной активностью и за счёт этого вносить вклад в прогрессирование заболевания.

Цель настоящей работы - изучение популяционного состава, фенотипа, супрессорной активности и роли клеток Gr-l<Iim при экспериментальной туберкулёзной инфекции.

Задачи исследования:

1. Исследовать динамику накопления клеток Gr-ldimCDl lb+ в лёгких, костном мозге и селезёнке мышей в процессе развития экспериментальной ТБ инфекции.

2. Охарактеризовать поверхностный фенотип (экспрессию маркёров Ly-6G, Ly-6C, F4/80, CD49d) и морфологию ядра клеток Gr-ldimCDl lb+.

3. Оценить способность клеток Gr-ldimCDllb+ к супрессии Т-клеточного ответа (пролиферации Т-клеток и секреции ИФН-у).

4. Изучить механизмы супрессорной активности клеток Gr-ldiroCDllb+.

5. Исследовать влияние клеток Gr-ldimCDllb+ на течение туберкулёзной инфекции у мышей.

Научная новизна.

1. Впервые показано, что у мышей прогрессирующая туберкулёзная инфекция сопровождается образованием и накоплением в КМ и селезёнке популяции клеток Gr-ldimCDllb+.

2. Продемонстрировано, что образующиеся в условиях прогрессирующей туберкулёзной инфекции клетки Gr-ldimCDllb+ не являются нейтрофилами, представляют собой незрелые миелоидные клетки и обладают способностью подавлять пролиферацию Т-клеток и секрецию ИФН-у.

3. Обнаружено, что способность клеток с фенотипом Gr-ldiraCDllb+ подавлять Т-клеточный ответ при туберкулёзной инфекции опосредована продукцией оксида азота (II) и не связана с продукцией активных форм кислорода или ферментативной активностью аргиназы I.

4. В экспериментах с адоптивным переносом продемонстрирован вклад незрелых миелоидных клеток в супрессию иммунного ответа при туберкулёзной инфекции.

В целом, в работе получены оригинальные данные о накоплении незрелых миелоидных клеток (клеток с фенотипом Gr-ldimCDl lb+) при прогрессирующей ТБ инфекции, показана их роль в супрессии протективного противотуберкулёзного Т-клеточного ответа, продемонстрирован их вклад в прогрессирование ТБ инфекции. До настоящего времени такие сведения в литературе отсутствовали. Кроме того, до настоящего времени считалось, что накапливающиеся при ТБ инфекции Gr-1-экспрессирующие клетки представляют собой гранулоциты и вносят вклад в патогенез ТБ, главным образом, за счёт повреждения тканей (Eruslanov Е. В. et ah, 2005; Keller С. et ah, 2006). Результаты настоящей работы впервые демонстрируют, что клетки Gr-1+ CDllb+, в больших количествах образующиеся при прогрессирующей ТБ инфекции, характеризуются невысоким уровнем экспрессии маркёра Gr-1, представляют собой не нейтрофилы, а незрелые миелоидные клетки, представлены, главным образом, клетками моноцитарного типа, и могут оказывать влияние на течение ТБ инфекции за счёт супрессорного воздействия на протективный Т-клеточный ответ.

Практическая значимость

Работа проведена на экспериментальной модели и носит, прежде всего, фундаментальный характер: получены новые данные об образовании незрелых миелоидных клеток при прогрессирующей ТБ инфекции и роли этих клеток в супрессии иммунного ответа и прогрессировании ТБ инфекции. Эти результаты расширяют существующие представления о патогенезе ТБ. Практическая значимость работы состоит в том, что создана основа для разработки новых методов патогенетической терапии ТБ, в частности, методов таргетной терапии, направленной на подавление образования или активности незрелых миелоидных супрессорных клеток. Разработка таких методов для комплексного лечения других тяжёлых заболеваний (например, онкологических) в настоящее время активно ведётся (Gabrilovich D. I. et al„ 2009). Полученные в работе результаты могут найти применение и для мониторинга течения ТБ -результаты, полученные на экспериментальной модели, свидетельствуют о том, что определение содержания миелоидных супрессорных клеток при ТБ позволяет судить о тяжести инфекционного процесса. Материалы диссертации используются в курсе лекций для аспирантов и ординаторов ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН, в лекциях для клинических иммунологов.

Внедрение результатов исследования

Материалы диссертационного исследования используются в курсе лекций для ординаторов и аспирантов ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН, а также в курсе лекций по клинической иммунологии «Иммунология для врачей».

Положения, выносимые на защиту:

1. У мышей прелетальная стадия ТБ инфекции сопровождается накоплением в лёгких, костном мозге и селезёнке клеток Gr-li"nCDllb+ и одновременным уменьшением содержания в указанных органах зрелых нейтрофилов - клеток Gr-lhlCDl lb+.

2. Клетки Gr-ldimCDllb+, накапливающиеся при ТБ, представляют собой незрелые миелоидные клетки, преимущественно моноцитарного типа, обладают способностью супрессировать Т-клеточный иммунный ответ и за счёт этого могут вносить вклад в прогрессирование инфекции.

Апробация диссертации состоялась 25 марта 2013 года на научной конференции отделов иммунологии и микробиологии ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН.

Основные положения диссертации были представлены на конференциях молодых учёных «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулёза взрослых и детей» в 2010 и 2012 годах (г. Москва), на XIV Международном иммунологическом конгрессе в 2010 г. (г. Кобэ, Япония), конференции «Keystone Symposia: Hematopoiesis» в 2011 году (г. Биг-Скай, США), конференции «Актуальные вопросы борьбы с туберкулёзом» в 2011 году (г. Москва), Конгрессе международного общества аналитической цитометрии в 2012 году (г. Лейпциг, Германия), X конференции иммунологов Урала в 2012 году (г. Тюмень), конференции «Keystone Symposia: Host Response in Tuberculosis» в 2013 г. (г. Вистлер, Канада). По результатам работы опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 научные статьи, опубликованные в изданиях рецензируемых ВАК.

Структура и объём диссертации.

Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (2 главы), материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований (8 глав), обсуждения полученных результатов и выводов. Список литературы включает 192 источника, из них 11 отечественных и 181 иностранная работа. Диссертация иллюстрирована 4 таблицами и 17 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы

В обзоре литературы приведены сведения о механизмах формирования противотуберкулёзного иммунного ответа, обсуждается роль воспалительных реакций в патогенезе ТБ, рассматриваются примеры и возможные механизмы подавления Т-клеточного иммунитета при ТБ. Кроме того, подробно описаны имеющиеся в литературе данные о фенотипе, субпопуляционном составе и функциональной активности клеток МС, обнаруживамых при различных патологических состояниях.

Материалы и методы

Животные

В экспериментах использовали мышей инбредных линий I/StYCit (I/St), A/JsnYCit (A/Sn) и C57BL/6YCit (C57BL/6), поддерживаемых в питомнике ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных за № 755 от 12.08.1977» Министерства Здравоохранения. В опытах использовали самок в возрасте 2-4 месяцев.

Экспериментальная туберкулёзная инфекция

В работе использовали микобактерии М. tuberculosis штамма H37Rv. Замороженные аликвоты микобактерии размораживали, наращивали в течение 14 дней в жидкой среде Дюбо (Difco Laboratories, США) с добавлением 0,5% БСА, переводили в ФСБ, содержащий 0,05% Tween-80 и 0,1 мМ ЭДТА, и фильтровали через фильтр с диаметром пор 5 мкм (Millipore, США) для удаления агрегатов микобактерий. Количество микобактерий в суспензии определяли подсчётом микроколоний (Lyadova I. etal., 1998).

Мышам вводили внутритрахеально 50 мкл приготовленной суспензии, содержащей 2,Зх103 колониеобразующих единиц. За развитием инфекции следили, оценивая вес мышей в различные сроки после инфицирования. Для определения количества микобактерий в лёгочной ткани верхнюю долю правого лёгкого гомогенизировали, готовили аликвоты и культивировали их на агаре Дюбо. Подсчет колониеобразующих единиц проводили через 14-20 дней.

Получение суспензий клеток лёгочной ткани, костного мозга и селезёнки экспериментальных мышей.

Мышам вводили летальную дозу тиопентала натрия и выделяли селезёнку, лёгкие и кости бедра и голени. Нижнюю долю правого лёгкого измельчали ножницами, инкубировали в среде RPMI-1640, содержащей коллагеназу 1а и ДНКазу I, и переводили в среду для культивирования (RPMI-1640, содержащую 5% ЭТС, 10 мМ HEPES, 10 мМ заменимые аминокислоты, 10 мМ L-глутамин, 2 мМ пируват натрия и 0,04% Р-меркаптоэтанол) (Lyadova I. et al., 1998).

Для получения клеток КМ выделяли берцовые и бедренные кости экспериментальных животных и промывали их средой 199, содержащей 1% ЭТС и 1 мМ HEPES. Выделенные клетки дважды центрифугировали и переводили в среду для культивирования. Для получения суспензий клеток селезёнки гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе, полученные

7

суспензии осаждали центрифугированием, эритроциты лизировали с использованием ИН^-лизис-буфера, после чего суспензии трижды центрифугировали и переводили в среду для культивирования.

Подсчёт жизнеспособных клеток проводили на гематологическом анализаторе Coulter A-Tdiff (Beckman Coulter, США) или методом эксклюзии трипанового синего с использованием камеры Горяева.

Анализ популяций клеток методом проточной цитометрии.

Для идентификации различных популяций клеток и анализа их фенотипа использовали проточную цитометрию. Анализируемые клетки (5x10s клеток/пробу) обрабатывали немечеными антителами анти-CD 16/32 (блокирование Fc-рецепторов) и флуоресцентно мечеными антителами, специфичными к исследуемым маркёрам. Клетки отмывали, фиксировали в 1% ПАФ и анализировали на проточном цитофлуориметре BD FACSort (BD, США) с использованием программного обеспечения CellQuest Pro (BD, США). Анализ данных проводили с использованием программного обеспечения FlowJo (TreeStar, США).

Световая и конфокальная микроскопия.

Для анализа морфологии клеточных ядер с помощью световой микроскопии получали цитоспины клеточных суспензий, окрашивали их по Романовскому-Гимзе и анализировали под световым микроскопом.

Для анализа образцов методом конфокальной микроскопии исследуемые клетки фиксировали раствором 5% ПАФ в ФСБ, окрашивали красителем DAPI, помещали под покровное стекло в заключающей среде (50% раствор глицерина в ФСБ) и анализировали на конфокальном микроскопе Leica TSC SPE (Leica, Германия).

Выделение популяций Gr-lh'CDllb+ и Gr-ldlmCDl lb+ из суспензий клеток КМ методом магнитной сепарации.

В ряде экспериментов производили обогащение суспензий клеток КМ популяциями Gr-lh,CDllb+ и Gr-ld,mCDl lb+. Обогащение проводили с помощью двухэтапной магнитной сепарации с использованием магнитных частиц фирмы Miltenyi Biotec (Германия). На первом этапе проводили сепарацию клеток по маркёру Gr-1, что позволяло отделить клетки с высоким уровнем экспрессии Gr-1 (Gr-lh'CDllb+) от остальных клеток (Gr-ld'mCDllb+ и Gr-1" CDllb" ), на втором этапе проводили сепарацию по маркёру CDllb, что позволяло отделить клетки Gr-ldiraCDllb+ от клеток Gr-1 CDllb. Концентрации антител анти-Gr-l и анти-CDllb были подобраны в предварительной серии экспериментов.

Оценка супрессорной активности клеток КМ.

Супрессорную активность клеток КМ и их субпопуляций оценивали по подавлению ими пролиферации клеток селезёнки и продукции ИФН-у. Клетки селезёнки обрабатывали CFSE и культивировали в лунках 24- или 96-луночных планшетов (8,5х105 клеток/мл), предварительно покрытых антителами анти-CD3. К культурам клеток селезёнки добавляли клетки КМ, тестируемые на супрессорную активность (в соотношении 1:1). В качестве отрицательного

s

контроля использовали культуры клеток селезёнки, не стимулированные антителами анти-СБЗ и культивированные без клеток КМ; в качестве положительного контроля использовали культуры клеток селезёнки, стимулированные антителами анти-СОЗ без добавления клеток КМ. Через 4 дня отбирали супернатанты культур и оценивали содержание в них ИФН-у и оксида азота (N0). Для оценки пролиферативной активности, клетки обрабатывали антителами анти-СБ4 и анти-СБ8 и оценивали интенсивность флуоресценции CFSE в каждой субпопуляции с помощью проточной цитометрии.

Для изучения механизмов супрессорной активности в ряде экспериментов к культурам клеток добавляли ингибитор индуцибельной NO-синтазы L-NMMA (моноацетат №-монометил-Ь-аргинина, Merck, Германия), ингибитор аргиназы I L-NOHA (моноацетат №-гидрокси-Ь-аргинина, Merck, Германия) или фермент каталазу, удаляющую из среды Н202 (Sigma, США). В некоторых экспериментах клетки селезёнки культивировали с популяцией клеток КМ, разделяя их мембранным фильтром «TransWell» с диаметром пор 3 мкм (Corning, США).

Определение содержания ИФН-у в лёгочной ткани и культуральных супернатантах. Измерение количества оксида азота.

Определение продукции ИФН-у в гомогенатах верхней доли правого лёгкого или супернатантах клеточных культур проводили методом иммуноферментного анализа с использованием набора Mouse IFN-gamma ELISA-Ready-SET-Go! (eBiosciencc,CLLIA) в соответствии с рекомендациями производителя.

Для определения содержания в культуральных супернатантах оксида азота (II) использовали реакцию Грисса (Green L. С. et al., 1982).

Статистическая обработка результатов.

Значения, полученные в экспериментах, приведены как Среднее ± Стандартная ошибка среднего. Статистическую обработку результатов проводили, используя программу GraphPad Prism 4 (GraphPad Software Inc., США). Для сравнения групп использовали тест Манна-Уитни. Достоверными считали различия при р<0,05.

Результаты исследований

1. Динамика появления клеток при инфекции М.

tuberculosis у мышей I/St.

Исследования клеток

Gr-ldiraCDl lb+ проводили на модели экспериментальной ТБ инфекции у мышей. В экспериментах использовали мышей линии I/St, высоко чувствительных к ТБ инфекции (Nikonenko В. V. et al., 2000). Мышей инфицировали путём внутритрахеального введения М. tuberculosis (2,3 х 103 КОЕ/мышь). О прогрессировании инфекции судили по потере веса - одному из основных прижизненных показателей прогрессирования ТБ. Предварительные эксперименты показали, что в течение первых двух недель после заражения мыши набирали вес, а с 17-19 дня начинали его терять. К 24-ому дню потеря веса составляла около 15% (15 ±2% (признак прелетальной стадии инфекции); на 26 - 27 дни после инфицирования мыши погибали. Определение количества микобактерий в лёгочной ткани показало, что на 17 день после заражения оно составило 4,3 ± 2,0 х 105 КОЕ, а на 24 день - 2,0 ± 0,9 х 107 КОЕ, т.е. возрастало в 50 раз по сравнению с 17 днём.

Полученные результаты позволили выделить две стадии инфекции у мышей I/St: начальную, протекающую без видимых проявлений заболевания (дни 1-15) и стадию прогрессирования инфекции, на которой мыши прекращали набирать вес и начинали его терять (начиная с 17 дня). В связи с этим, в дальнейшей работе все эксперименты проводили в следующие сроки:

день 0

4.53%jg|Sí- Gr-lhi - Gr-ld,m

2.00%-

KM

Г

■ Gr1* Grl"

день 24

6.76% -Gr-lhl

lnJ

102. 42.2% Шш*- -Gr-ldlm

10°. Г"

5 lo-

Лёгкие

-»■епм

-*-Gr1tflm

Селезёнка

-e-Grl™ -»-Gr1dl1

дни после инфицирования

в км

-»Grl"

—Gri"™ mt \ „ ***

У / \_ ##

------L

дни после инфицирования дни после инфицирования

Лёгкие

5 ч,

Селезёнка

-»•Gr1»

дни после инфицирования дни после инфицирования дни после инфицирования

Рис. 1. Прогрессирование ТБ инфекции сопровождается накоплением клеток в лёгких, КМ, селезёнке инфицированных мышей. А - накопление клеток СМ^СОПЬ* в лёгочной ткани - пример цитометрических данных; Б и В -Динамика изменения процентного (Б) и абсолютного (В) содержания клеток Сг1<|"г'СВ11Ь+ (сплошная линия) и Сг-1|"СОНЬ+ (пунктирная линия) в различных органах. Обозначены различия по сравнению с днем 0 (*) и днём 17 (#): *, # - Р < 0,05;

**,т - р<0,01; ***,ют- Р<0,001.

«день 0» (контрольные, не заражённые мыши), «день 17» (переход от начальной стадии инфекции к стадии прогрессирования), «день 24» (прелетальная стадия инфекции).

В указанные сроки в лёгких, костном мозге и селезёнке опытных мышей оценивали содержание клеток, экспрессирующих маркёры Ог-1 и СОНЬ. При анализе обращали внимание не только на наличие или отсутствие экспрессии маркёра Ог-1, но и на уровень его экспрессии, то есть, отдельно определяли содержание клеток Ог-1ыСВ11Ь+и клеток вгЧ^СО! 1Ь+ (далее для краткости эти популяции клеток обозначаются как «клетки Сг-11"» и «клетки Ог-1с11т», соответственно). У здоровых мышей Ог-1-экспрессирующие клетки были представлены, в основном, популяцией клеток с высоким уровнем маркёра Сг-1

- клеток ОМ1" (Рис. 1А). На цитометрических графиках эта популяция клеток была локализована компактно, в виде отдельного, чётко локализованного пятна (Рис. 1).

Помимо популяции Ог-1ь', в органах здоровых мышей присутствовали клетки со сниженным уровнем экспрессии маркёра Ог-1 - Ог-1Ага, однако они не формировали отдельной, хорошо заметной популяции, и были немногочисленными (Рис. 1А).

При инфекции, содержание клеток Сг-1Ы и Ог-1(1'т во всех исследованных органах значительно менялось (Таблица I, Рисунок 1Б и 1В).

В КМ содержание клеток Ог-!11' уменьшалось на 17 день после инфицирования в 1,6 раза (абсолютное количество, р<0,05) и ещё более заметно на 24 день: абсолютное количество в 4,7 раза (р<0,001), процентное содержание

- в 2 раза (р<0,001). Содержание клеток в г-И"" уменьшалось в 2 раза (абсолютное количество) на 17 день (р<0,05), но значительно возрастало на 24 день: абсолютное количество - в 3 раза, относительное количество - в 5,5 (р<0,001).

В лёгких на 17 день инфекции отмечалось увеличение процентного и абсолютного содержания обеих популяций клеток (Сг-1ы - в 2 и 4 раза, Ог-1а'ш

- в 5 и 10 раз, р<0,05, Таблица I), что может быть связано с их усиленной миграцией из КМ в очаг инфекции. На 24 день после инфицирования содержание клеток Ог-11,1 в лёгких уменьшалось до значений, наблюдаемых у здоровых мышей, а содержание клеток Ог-1а"п существенно возрастало, достигая значений, в 18 (относительное количество) и 40 (абсолютное количество) раз превышающих соответствующие значения у здоровых мышей (р<0,001, Таблица I).

Похожие изменения происходили и в селезёнке: на 17 день инфекции в селезёнке отмечалось увеличение процентного (в 1,3 раза, р<0,05) и абсолютного (в 1,8 раза, р<0,05) содержания клеток Ог-!1"; на 24 день количество клеток Ог-1ы, как и в лёгких, возвращалось к исходному, а количество и процент клеток Ог-1£,"Т1 существенно возрастали (в 9 и 7 раз по сравнению со здоровыми мышами, соответственно, р<0,001).

Таблица 1. Процентное и абсолютное содержание клеток Gr-lhl и Gr-ldlm в КМ, лёгких и селезёнке здоровых и инфицированных мышей I/St в различные сроки после заражения. Обозначены различия по сравнению с днём 0 (*) и днём 17 (#): *, # - Р < 0,05; **, Ж - Р < 0,01; ***, т# - Р < 0,001.

Процентное содержание

популяция день КМ Лёгкие Селезёнка

Gr-lhl 0 29,60 ± 1,10 5,96 ± 0,58 1,23 ± 0,09

17 27,35 ± 1,06 11,75 ±2,73 * 1,60 ±0,05 *

24 10,80 ±2,03 ***# 6,87 ±0,86 1,38 ±0,24

Gr-ldim 0 6,19 ±0,31 1,54 ±0,14 0,85 ±0,11

17 4,85 ± 0,54 7,65 ±0,35 * 0,82 ± 0,09

24 34,18 ± 1,57 *** # 28,71 ±3,98 ***# 7,23 ± 1,07 ***#

Абсолютное содержание

популяция день КМ Лёгкие Селезёнка

Gr-lhi 0 2,96 ± 0,26 0,23 ± 0,03 0,73 ±0,10

17 1,81 ±0,05 * 1,01 ±0,40 * 1,34 ±0,22 *

24 0,62 ±0,13 ***# 0,68 ±0,13 0,86 ±0,14

Gr-ldim 0 0,63 ± 0,07 0,06 ±0,01 0,80 ± 0,27

17 0,32 ±0,03 * 0,62 ±0,14 * 0,66 ± 0,03

24 1,95 ±0,22 ***# 2,39 ±0,35 ***# 5,51 ± 0,85 ***#

Таким образом, при развитии ТБ инфекции содержание клеток Gr-lh' временно (на 17 день) увеличивалось в лёгких и селезёнке, а в костном мозге уменьшалось. Эти данные могут быть связаны с мобилизацией зрелых гранулоцитов (клеток Gr-lh') и их миграцией из КМ в очаг инфекции в ответ на инфекцию М. tuberculosis. Содержание клеток Gr-ld,m, напротив, по мере прогрессирования инфекции возрастало во всех органах. По данным Hestdal и соавт., клетки со сниженным уровнем экспрессии маркёра Gr-1 представляют собой незрелые миелоидные клетки (Hestdal К. et al., 1991). В связи с этим можно предположить, что наблюдаемое нами накопление клеток Gr-ld'm во всех исследованных органах и одновременное снижение количества клеток Gr-lhl в КМ являются следствием изменения процессов гемопоэза происходящих в ответ на инфекцию. Основной характеристикой таких изменений, по-видимому, является «сдвиг миелопоэза влево»: ускоренная продукция большого количества «незрелых» клеточных форм вместо образования зрелых миелоидных клеток в нормальных (физиологических) количествах («экстренный гемопоэз» (Шмелёв Н. А., 1959; Panopoulos A. D. et ai, 2006).

2. Накопление клеток Gr-ld,m при прогрессирующей ТБ инфекции у мышей различных линий.

Полученные результаты об ассоциации между накоплением клеток Gr-ldim и прогрессированием ТБ у мышей I/St поставили вопрос о том, является ли эта ассоциация особенностью мышей I/St или же она характерна и для мышей других линий. Для ответа на этот вопрос мы исследовали содержание клеток Gr-ld,m в органах мышей линий A/Sn и C57BL/6, инфицированных М. tuberculosis (мыши этих линий более резистентны к ТБ инфекции, чем мыши I/St) (Nikonenko В. V. et al, 2000).

При инфицировании мышей М. tuberculosis дозой 2,3x103 КОЕ, мыши I/St погибали к 26-27 дню инфицирования, мыши C57BL/6 - через 27-29 дней, мыши A/Sn - через 33-35 дней после инфицирования. У здоровых мышей I/St, C57BL/6 и A/Sn процентное содержание клеток Gr-ldim было невысоким (1,6 ± 0,1%, 8,6 ± 3,2% и 2,1 ± 0,2%, соответственно). На 24 день инфекции у мышей I/St содержание клеток Gr-ldim увеличивалось в 25 раз по сравнению со здоровыми мышами и достигало 41 ± 4% от всех клеток лёгкого (р<0,01). На 26 день после инфицирования у мышей C57BL/6 содержание клеток Gr-ldim увеличивалось в 2,5 раза по сравнению со здоровыми мышами и достигало 21,4 ± 3,5% от всех клеток лёгкого (р<0,05). У мышей A/Sn содержание клеток Gr-ld,m увеличивалось в 8 раз на 24 день инфекции и в 32 раза - на 31 день инфекции. В это время у мышей A/Sn содержание клеток Gr-ld,ra в лёгких составляло 68 ± 4%. Таким образом, у мышей всех исследованных линий на прелетальной стадии инфекции отмечалось существенное накопление клеток Gr-ld,m в лёгких. Содержание этих клеток более 20% являлось характерным признаком прелетальной стадии ТБ инфекции.

3. Характеристика поверхностного фенотипа клеток Gr-ld,m и Gr-11".

Полученные результаты об ассоциации между прогрессированием ТБ инфекции и накоплением в периферических органах клеток Gr-ld'ra поставили вопрос о природе этих клеток. Согласно данным литературы, при других патологических состояниях (в частности, при опухолевых процессах) клетки Gr-ld,m представляют собой незрелые миелоидные клетки гранулоцитарного либо моноцитарного типа. При этом гранулоцитарные и моноцитарные клетки различаются по ряду характеристик: гранулярности, уровню экспрессии маркёров Ly-6G, Ly-6C, F4/80, CD49d, структуре клеточного ядра. В связи с этим мы исследовали указанные характеристики у клеток Gr-ld,m, обнаруженных нами у мышей, инфицированных М, tuberculosis. Исследования проводили на мышах I/St на 24 день после заражения, когда содержание клеток Gr-ld,ra достигало максимальных значений. Одновременно изучали фенотип зрелых гранулоцитов - клеток Gr-lhl (Hestdal К. et al., 1991).

Анализ бокового светорассеяния (показатель, отражающий степень гранулированное™ клеток) показал, что клетки Gr-ld'm обладают меньшим боковым светорассеянием, чем типичные гранулоцитарные клетки Gr-lhl.

На поверхности клеток Gr-lhl, находящихся в КМ, лёгких и селезёнке здоровых мышей, как и ожидалось, отмечался высокий уровень экспрессии

13

маркёра Ьу-60. Подобный фенотип (Ьу-бй11') характерен для зрелых нейтрофилов. У инфицированных мышей уровень экспрессии Ьу-бв на клетках Ог-1 ' снижался, хотя и оставался достаточно высоким (Рис. 2). На клетках Ог-1с1'т уровень экспрессии маркёра Ьу-бв (как в КМ, так и в лёгких, и селезёнке) был существенно ниже, чем на клетках Ог-1|п, что свидетельствовало о том, что популяция Ог-1Лт отличалась от типичных нейтрофилов (Рис 2).

Известно, что моноцитарно-макрофагальные клетки характеризуются экспрессией маркёра Р4/80. Анализ экспрессии данного маркёра показал, что клетки Ог-111' в КМ, лёгких и селезёнке здоровых и инфицированных мышей, не экспрессируют этот маркёр. Напротив, клетки ОМ111"1 экспрессировали маркёр Р4/80 (Рис. 2). Эти особенности экспрессии маркёра Р4/80 были характерны для клеток ОМ*1"11, находящихся в КМ, лёгочной ткани и селезёнке как здоровых, так и инфицированных мышей. Таким образом, для клеток ОМ"™ была характерна ко-экспрессия маркёров гранулоцитов (Ьу-бв) и моноцитов (Р4/80).

Обе популяции клеток - и СМ1", и Сг-1<|"11, - экспрессировали на высоком уровне маркёр Ьу-6С (Рис. 2). Экспрессия этого маркёра характерна для моноцитов, макрофагов и нейтрофилов.

Р4/80

С049с1

Рис. 2. Экспрессия маркёров Сг-1, Ьу-6С, Р4/80, Ьу-СС, (1)4911 на клетках Сг-1а,т и Сг1'" в КМ здоровых и инфицированных мышей. Приведены примеры гистограмм для клеток КМ здоровых (Л) и инфицированных (Б) мышей, характеризующих экспрессию указанных маркёров, и суммированные данные (В) среднего значения флуоресценции (МИ) указанных маркёров на популяциях клеток Сг-1<1|т и Сг-1'" в КМ здоровых (день О - «д 0») и инфицированных (день 24 - «д24») мышей.

По данным Haile и соавт., одной из фенотипических характеристик миелоидных клеток моноцитарного типа, отличающих их от миелоидных клеток гранулоцитарного типа, является экспрессия маркёра CD49d (Haile L. А. et al, 2010). В связи с этим, мы проанализировали экспрессию маркёра CD49d на клетках Gr-lhl и Gr-ldlm. Мы наблюдали более высокий уровень экспрессии маркёра CD49d на клетках Gr-ldim по сравнению с клетками Gr-lh', что можно рассматривать как признак принадлежности клеток Gr-ld,m к моноцитарной популяции миел9идных клеток (Рис. 2). Следует отметить, что анализ фенотипа популяций Gr-lh' у здоровых и у инфицированных мышей выявил их различия: на клетках Gr-lh' инфицированных мышей экспрессия маркёра CD49d была выше, а экспрессия маркёра Ly-6G - ниже, чем на клетках Gr-lhl здоровых мышей. Кроме того, у инфицированных мышей клетки Gr-lh', формально попадавшие на цитометрическом графике в регион «Gr-lhl», отличались от аналогичной популяции здоровых мышей: фактически, они представляли собой скорее «продолжение» популяции Gr-ldim, а не отдельную популяцию клеток (Рис. 1А).

В целом, по нашим данным, клетки Gr-ld,m в лёгких, КМ, селезёнки у здоровых и инфицированных мышей имели фенотип Gr-ldimCDl lb+Ly-6Gd,m F4/80+Ly-6ChiCD49dh', клетки Gr-lhi у здоровых мышей - Gr-lhiCDllb+Ly-6Ghi F4/80"/lowLy-6Ch'CD49d"/low, а у инфицированных животных - фенотип Gr-lhi/dim CD1 lb+Ly-6Ghi/dimF4/80"/low Ly-6Ch'CD49dlow/dim. Полученные данные позволили нам предположить, что клетки Gr-ldim, накапливающиеся у мышей на прелетальной стадии инфекции, представляют собой незрелые миелоидные предшественники, вероятно, моноцитарного типа (о последнем свидетельствовала экспрессия на них маркёров F4/80 и CD49d). Кроме того, полученные нами результаты указывали на то, что у мышей с ТБ инфекцией все Gr-1-экспрессирующие клетки представляют собой миелоидные клетки разной степени зрелости. Степень их дифференцировки в сторону образования гранулоцитов, по-видимому, тем ниже, чем ниже экспрессия маркёров Gr-1 и Ly-6G. Последнее предположение хорошо согласуется с данными литературы (Hestdal К. et al, 1991; Satake S. et al, 2012).

4. Анализ морфологии ядер клеток Gr-ld'm и Gr-lh'.

Для более точной характеристики клеток Gr-lhl и Gr-ldlm мы проанализировали морфологию их клеточных ядер. Популяции клеток КМ обогащали клетками Gr-lhiCDllb+ и Gr-ldlraCDl lb+ (далее в тексте упоминаются как клетки «Gr-lhl» и «Gr-ld,m» соответственно) с помощью магнитной сепарации. Морфологию ядер определяли с использованием световой микроскопии, окрашивая выделенные клетки по Романовскому-Гимзе, или с помощью конфокальной микроскопии после окрашивания ядер красителем DAPI (Рис. 3).

По данным световой микроскопии, большинство клеток (около 80%), обогащённых популяцией Gr-1 ', имели сегментированные, палочкообразные или "тонкие" кольцевидные ядра, т.е. принадлежали к гранулоцитам (здесь и ниже классификация типов клеток приводится по Biermann Н. et al., 1999).

15

Г . *А « 1 ь ..................1

Ф % £

в

й

Рис. 3. Морфология клеточных ядер популяций клеток Сг-1|"С011Ь+ (А, В) и Сг1ЛтСОИЬ+ (Б, Г). Исследования проводили с использованием световой (А, Б) и конфокальной микроскопии (В, Г). Строчными буквами курсивом на А и Б отмечена форма ядра: а - сегментированные, Ь - «тонкие» кольцевидные, с - палочковидные, (I -«толстые» кольцевидные, е- бобовидные,/- «сплошные» округлые.

Большинство клеток в популяции, обогащённой клетками Ог-Г||Ш, имели бобовидные ядра, "толстые" кольцевидные ядра (толщина «обода» больше диаметра центрального «отверстия» в ядре) или представляли собой крупные клетки со «сплошным» ядром и небольшим количеством цитоплазмы. Такие клетки можно было отнести к клеткам моноцитарного типа (клетки с бобовидным и «толстым» кольцевидным ядром) или ранним миелоидным предшественникам (крупные клетки с большим «сплошным» округлым ядром). Клетки гранулоцитарного типа встречались редко (не более 10% клеток) (Рис. 3 А и Б).

Аналогичные результаты были получены с использованием конфокальной микроскопии при исследовании популяций, обогащённых клетками Ог-1ы и вг1 ,ш. В популяции, обогащённой клетками Сг-1Ь|, основная часть клеток имела ядра, характерные для гранулоцитов. В популяции, обогащённой клетками Ог14т, клетки с характерными для гранулоцитов ядрами встречались редко, большинство клеток имели несегментированные округлые ядра или "толстые" кольцевидные ядра (Рис. 3 В и Г).

16

В целом, результаты, морфологии ядер клеток Ог-Г1,т и Ог-1ы

клеток гранулоцитарного типа. Однако, по ы здоровых мышей, они менее

полученные нами при анализе фенотипа и свидетельствуют о следующем:

1. У здоровых мышей клетки СМ111 представляют собой зрелые нейтрофилы.

2. Клетки Ог-1'||т представляют собой незрелые миелоидные клетки, о чём свидетельствует морфология клеточного ядра и одновременная экспрессия на них маркёров моноцитов (Р4/80) и нейтрофилов (Ог-1 и Ьу-бй - на сниженном уровне).

3. У мышей, находящихся на прелетальной стадии ТБ инфекции, популяция клеток Ог-1111 состоит из сравнению с клетками Ог-1 дифференцированы, о чём свидетельствует сниженный уровень экспрессии маркёров Ог-1 и Ьу-бО и повышенный уровень экспрессии маркёра С049с1.

5. Супрессия Т-клеточного ответа клетками КМ инфицированных мышей.

Как отмечалось выше, в доступной литературе отсутствуют сведения о роли клеток ОМ11"11 при ТБ инфекции. Однако в литературе имеются сведения о том, что клетки Ог-1с|1т, обнаруживаемые при других патологических состояниях, обладают супрессорной активностью, в частности, способны подавлять Т-клеточный иммунный ответ. В связи с этим, мы решили оценить супрессорную инфекции.

А *

х

5 1

активность клеток Ог-1Аш, обнаруженных нами при ТБ

В

д.

Д

* 0 60" 1 ** ** г—, ва

<5 ^ / / у

< к & О-4

Г V'»

-

,5?

Рис. 4. Супрессорная активность популяций клеток КМ, полученных от здоровых («день 0») и инфицированных («день 17» и «день 24») мышей. Показано влияние «неразделённых» клеток КМ, полученных от здоровых или инфицированных мышей, на пролиферацию клеток селезёнки: С04+ (Л) и С08+ (Б). В - влияние клеток КМ здоровых или инфицированных мышей, на продукцию ИФН-у клетками селезёнки, Г и Д - влияние популяции, обогащённой клетками вместил на пролиферацию клеток селезёнки С04+ (Г) и продукцию ИФН-у клетками селезёнки (Д).

На первом этапе исследовали супрессорную активность "неразделённых" клеток КМ. Клетки получали от здоровых («день 0») и от инфицированных мышей на разных стадиях ТБ инфекции («день 17» и «день 24»). Клетки КМ добавляли к клеткам селезёнки, полученным от здоровых мышей и стимулированным антителами aHTH-CD3 («отвечающие» клетки). Оценивали влияние клеток КМ на пролиферацию Т-лимфоцитов (отдельно для популяции Т-лимфоцитов CD4+ и CD8+) и продукцию в культурах ИФН-у.

Добавление к клеткам селезёнки клеток здорового КМ практически не влияло на пролиферативную активность Т-клеток селезёнки (Рис. 4 А и Б). Напротив, добавление клеток КМ, полученных от инфицированных животных, вызывало подавление Т-клеточной пролиферации. Клетки КМ, полученные от мышей, находившихся на начальной стадии прогрессирования ТБ («день 17»), ингибировапи пролиферацию Т-лимфоцитов CD4 на 38 ± 12%, Т-лимфоцитов CD8 - на 31 ± 8%. Клетки КМ мышей, находившихся на прелетальной стадии инфекции («день 24») практически полностью отменяли деление «отвечающих» клеток, блокируя его на 85 ± 10% (для клеток CD4+) и на 60 ± 22% (для клеток CD8+).

Помимо Т-клеточной пролиферации, также оценивали влияние клеток КМ на секрецию в культурах ИФН-у (Рис. 4В). Клетки КМ здоровых мышей существенного влияния на продукцию ИФН-у не оказывали. Клетки КМ, полученные от инфицированных мышей («день 24») подавляли продукцию ИФН-у на 90 ± 2% (р<0,001).

В целом, развитие ТБ инфекции сопровождалось появлением и постепенным увеличением супрессорной активности клеток КМ, которая выражалась в подавлении Т-клеточной пролиферации и секреции ИФН-у.

6. Супрессия Т-клеточного ответа клетками Gr-ldm.

В следующей серии экспериментов исследовали супрессорную активность клеток Gr-ld,m. Популяции клеток, обогащенные клетками Gr-ld,m, получали из клеток КМ здоровых («день 0») или инфицированных («день 24») мышей методом магнитной сепарации. Полученные клетки добавляли к культурам клеток селезёнки, стимулированным антителами анти-СБЗ, и оценивали влияние клеток Gr-ldlm на пролиферацию и продукцию ИФН-у.

Добавление клеток Gr-ld,m, выделенных из КМ заражённых мышей, вызывало подавление пролиферации Т-лимфоцитов на 70 ± 4% (Рис. 4Г). Помимо этого, клетки Gr-ldlra, полученные от зараженных мышей, ингибировапи секрецию ИФН-у (супрессия на 80 ± 7%, Рис. 4 Д). Такой же супрессорной активностью обладали и клетки Gr-ldim, выделенные из КМ здоровых мышей (подавление пролиферации на 73 ± 15%, подавление продукции ИФН-у на 84 ± 3%) (Рис. 4 Г и Д).

Таким образом, незрелые миелоидные клетки Gr-ldira, накапливающиеся при ТБ инфекции, обладали способностью подавлять пролиферацию Т-лимфоцитов и продукцию ИФН-у в культурах клеток селезёнки.

126-s" 100-

!• О-

s

§

О.

***

ш

II

I

e

г

£

■iP Jp .V* /

V V # J*

Рис. 5. Исследование механизмов супрессорной активности клеточных популяций КМ. Клетки селезёнки культивировали с клетками КМ от инфицированных мышей («день 24») в присутствии или отсутствии L-NMMA (ингибитор iNOS), L-NOHA (ингибитор аргиназы I), каталазы (элиминирует Н2О2). Изучали влияние названных веществ на пролиферацию Т-клеток CD4+ (А) и продукцию в культуре ИФН-у (А).

7. Анализ механизмов супрессорной активности клеток Gr-l'hm.

Известно, что супрессорная активность МС может быть обусловлена различными механизмами, в частности, продукцией активных форм кислорода (АФК), азота (N0), ферментативной активностью аргиназы I. Для того, чтобы изучить роль этих механизмов в обнаруженном нами подавлении Т-клеточного ответа, мы исследовали влияние на супрессорную активность клеток Gr-ldlm ингибиторов, специфичных для каждого из указанных выше механизмов.

При культивировании клеток селезёнки с «неразделёнными» клетками КМ инфицированных мышей, подавление каталитической активности аргиназы I (с использованием специфического ингибитора L-NOHA) и элиминация из культуральной среды АФК (путём добавления фермента каталазы) к отмене супрессии Т-клеточного ответа не приводили. Пролиферация Т-клеток и секреция ИФН-у были подавлены и оставались на том же уровне, что и в культуре без добавления ингибиторов (в этих экспериментах супрессия пролиферации составила - 53 ± 4%, продукции ИФН-у - 77 ± 5%). Напротив, добавление к культурам клеток ингибитора индуцибельной синтазы оксида азота (L-NMMA) вызывало отмену супрессии и восстанавливало пролиферацию и продукцию ИФН-у до уровней, отмечаемых в контрольных культурах клеток (Рис. 5). Такой же эффект мы наблюдали и при добавлении L-NMMA к культурам, в которых в качестве супрессоров использовали популяции, обогащенные клетками Gr-ldlm. Полученные результаты свидетельствовали о том, что основным механизмом подавления Т-клеточного ответа in vitro в наших исследованиях являлась продукция N0 супрессорными клетками. В пользу этого свидетельствует отмена супрессии ингибитором индуцибельной NO-синтазы, а также результаты измерения в культурах клеток селезёнки содержания нитрита N02~ - производной формы NO. В клеточных

культурах, в которых была выявлена супрессия, отмечался высокий уровень продукции N0. Добавление L-NMMA к культурам приводило к значительному (в 2 - 3 раза, р<0,01) снижению концентрации аниона N02~, что сочеталось с отменой супрессии Т-клеточного ответа. Таким образом, можно заключить, что на нашей модели, супрессия Т-клеточного ответа in vitro была опосредована продукцией NO, обусловленной ферментативной активностью индуцибельной NO-синтазы и не зависела от продукции АФК и ферментативной активности аргиназы I.

В литературе встречается указание на то, что для супрессии Т-клеточного ответа необходимо образование контактов между миелоидными клетками и клетками-мишенями. Мы проверили этот факт, отделив культивируемые клетки селезёнки от клеток КМ инфицированных мышей мембранным фильтром «TransWell» с диаметром пор 3 мкм. Данный фильтр не препятствует диффузии цитокинов, но препятствует межклеточным взаимодействиям. Такое разделение «отвечающих» клеток и «клеток-су прессоров» отменяло супрессию Т-клеточного ответа (пролиферацию и секрецию ИФН-у в культурах). Уровень N0 при этом в культуральной среде в лунках с использованием фильтров «TransWell» не отличался от такового в контрольных культурах клеток селезёнки (без добавления «клеток-супрессоров»). Полученные результаты свидетельствуют о том, что для осуществления супрессорной активности миелоидные клетки, присутствующие в КМ мышей при ТБ инфекции, нуждаются в образовании межклеточных контактов с клетками-мишенями. Эти результаты согласуются с результатами, полученными на других моделях (Gabrilovich D. I., 2012).

8. Влияние адоптивного переноса клеток Gr-ldim на продукцию ИФН-у в

лёгочной ткани.

Проведённые нами исследования продемонстрировали накопление клеток Gr-ld,m в процессе развития ТБ инфекции и их способность подавлять Т-клеточный ответ in vitro, что указывало на возможный вклад этих клеток в прогрессирование инфекции. Чтобы оценить влияние клеток Gr-ld,m на иммунный ответ in vivo, были проведены эксперименты по адоптивному переносу этих клеток.

Донорами клеток Gr-ldlm служили мыши I/St, инфицированные М. tuberculosis. Через 24 дня после заражения (т.е. в сроки, когда в КМ и других органах количество клеток Gr-ldim было максимальным, см. Рис. 1), получали, суспензии клеток КМ и обогащали их клетами Gr-ld,m с помощью магнитной сепарации. Полученные клетки Gr-ldlm переносили мышам-реципиентам. Реципиентами служили мыши I/St, которые были инфицированы М tuberculosis. Перенос клеток Gr-ld'm мышам-реципиентам производили дважды -на 17 и 20 дни после их инфицирования. Мышам контрольной группы вводили инъекции эквивалентных объёмов ФСБ. Влияние клеток Gr-ld,m на Т-клеточный ответ оценивали, сравнивая продукцию ИФН-у в лёгочной ткани мышей опытной и контрольной групп.

Выбор сроков переноса был обусловлен тем, что: а) у мышей противотуберкулёзный Т-клеточный имунный ответ формируется, как правило, к концу 2-3 недели после инфицирования (Lyadova I. et al„ 1998); б) на нашей модели, у мышей I/St после 3 недели инфекции отмечалось быстрое прогрессирование

инфекционного процесса. Таким образом, перенос клеток Gr-ldlra на 17 и 20 дни после инфицировния позволял оценить их влияние на состояние Т-клеточного иммунитета на

относительно стабильной стадии инфекционного процесса.

Проведённые исследования показали, что у реципиентов клеток Gr-ldlm содержание ИФН-у в гомогенатах лёгочной ткани было достоверно ниже, чем у мышей контрольной группы (301 ± 130 и 831 ± 165 нг/долю лёгкого, соответственно, р<0,05) (Рис. 6). Полученные данные подтвердили предположение о том, что клетки Gr-ld,m могут подавлять Т-клеточный иммунный ответ в очаге инфекции (лёгочной ткани).

В целом, проведённые исследования показали, что характерным признаком прогрессирующей ТБ инфекции у мышей является образование и накопление в лёгочной ткани, КМ, селезёнке большого количества клеток Gr-ldlm. Анализ фенотипа, морфологии и функциональной активности этих клеток свидетельствует о том, что они представляют собой незрелые миелоидные клетки преимущественно моноцитарного типа, обладают способностью подавлять Т-клеточный иммунный ответ и за счёт этого могут вносить существенный вклад в патогенез ТБ инфекции.

2 2000-1 о £ :0> К

К §

1000-

8~ rf

Рис. б. Влияние адоптивного переноса клеток Сг-1'||т на продукцию ИФН-у в лёгочной ткани.

Выводы

1. У мышей прогрессирование туберкулёзной инфекции сопровождается накоплением в лёгких, костном мозге и селезёнке клеток, имеющих фенотип Gr-ld,mCDllb+. Увеличение содержания клеток Gr-ldlmCDllb+ является характерным признаком прелетальной стадии инфекции и достигает в лёгких 29 ± 4%, в КМ - 34 ± 2%, в селезёнке - 7 ± 1%.

2. Появление и увеличение содержания клеток Gr-ld,mCDllb+ в лёгких, костном мозге и селезёнке мышей, инфицированных М. tuberculosis, сопровождается уменьшением содержания в этих органах клеток Gr-lh' CD1 lb+ (гранулоцитов).

3. Клетки Gr-ldimCDllbH , накапливающиеся в легких и других органах мышеи с прогрессирующей ТБ инфекцией, имеют фенотип Ly-6GdimF4/80+Ly-6Chi CD49d , т.е. характеризуются одновременной экспрессией маркёров нейтрофилов (Ly-6G, Gr-1) и моноцитов (F4/80).

4. Особенности морфологии ядер клеток Gr-ld,mCDllb+ (ядра моноцитарного типа) свидетельствуют о принадлежности этих клеток к незрелым миелоидным клеткам, преимущественно моноцитарного типа.

5. Клетки Gr-ldimCDllb+ проявляют супрессорную активность: подавляют пролиферацию Т-лимфоцитов CD4+ и CD8+ и продукцию ИФН-у.

6. Супрессорная активность клеток Gr-ldimCDllb+ опосредована продукцией оксида азота и требует установления межклеточных контактов с клетками-мишенями.

7. Особенности поверхностного фенотипа, морфологии ядер и наличие супрессорной активности у клеток Gr-ld,mCDllb+ позволяют отнести эти клетки к популяции клеток МС (супрессорных клеток миелоидного происхождения).

8. Адоптивный перенос клеток Gr-ld,m CD1 lb+ мышам, инфицированным М. tuberculosis, вызывает подавление продукции ИФН-у в лёгочной ткани, что свидетельствует о вероятном вкладе клеток Gr-ld,m CDllb+ в патогенез прогрессирующей туберкулёзной инфекции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Lyadova I., Kapina M., Shepelkova G, Sosunov V., Majorov К., Tsiganov E.. Shmitova N., Winslow G 2009. The pattern of pro-inflammatory gene expression in phagocytes determines the outcome of Mtb infection. Keystone Symposia: Tuberculosis - Biology, Pathology and Therapy, p. 115.

2. Цыганов E. H. 2009. Анализ экспрессии факторов воспаления в макрофагах мышей, чувствительных и резистентных к туберкулёзной инфекции. Конференция молодых учёных Ломоносов - 2009. стр. 41 - 42. Издательство МГУ, Москва.

3. Lyadova I., Tsiganov E.. Shmitova N. 2010. A role for macrophages and granulocytes in lung tissue inflammation and tuberculosis progression. 14th International Congress of Immunology.

4. Lyadova I.V., Tsiganov E.N.. Kapina M.A., Shepelkova G.S., Sosunov V.V., Radaeva T.V., Majorov K.B., Shmitova N.S., van den Ham H.J., Ganusov V.V., De Boer R.J., Racine R., Winslow G.M. 2010. In mice, tuberculosis progression is associated with intensive inflammatory response and the accumulation of Gr-1 cells in the lungs. PLoS One. 5(5):el0469, стр.: 1 - 16.

5. Цыганов E. H. Изучение экспрессии факторов воспаления в фагоцитах мышей, чувствительных и резистентных к туберкулёзной инфекции. 2010. Инновационные технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулёза у взрослых и детей стр. 135 - 137. Издательство ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН, Москва.

6. Tsiganov E.. Razinkova A., Lyadova I. 2011. Hematopoietic shifts during experimental tuberculosis infection. Keystone Symposia: Hematopoiesis.

1. Цыганов E. H.. Разннкова A. M., Лядова И. В. 2012. Появление незрелых миелоидных клеток в лёгочной ткани мышей при инфекции М. tuberculosis. Вестник Уральской Медицинской Академической Науки. №4, стр.: 180.

8. Лядова И. В., Цыганов E. Н.. Костюкевич М. В. 2012. Нейтрофилы при туберкулёзе: протекция или патология. Туберкулёз и болезни лёгких. № 7, стр.: 12-21.

9. Lyadova I.V., Tsiganov E.N. 2012. Phenotypic and morphological analysis of Gr-1 ln7Ly-6Gd'm cells, a marker of severe rapidly progressing tuberculosis infection in mice. CYT02012.

10. Nikitina I.Y., Tsiganov E.N.. Vasilyeva I.A., Lyadova I.V. 2012. The degree of CD4 T cell differentiation as marker of tuberculosis severity and progression. The Journal of Immunology: abstracts of the European Congress of Immunology. — Glasgow, 2012,-P.600.

11 .Tsiganov E.N.. Razinkova E.V., Radaeva T.V., Nikitina I.Yu., Sosunov V.V., Lyadova I.V. 2013. Gr-ld,m cells accumulating at advanced stage of Mtb infection represent immature myeloid cells with immune suppressor activity. Host Response in Tuberculosis, Keystone Symposia.

Список условных сокращении

АФК - активные формы кислорода

БСА - бычий сывороточный альбумин

ИФН-у - интерферон-у

КМ — костный мозг

КОЕ - колониеобразующие единицы

ПАФ - параформальдегид

ТБ - туберкулёз

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка

DAPI - 4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид

HEPES - Ы-2-гидроксиэтил-пиперазин-Ы-2-этансульфоновая кислота

М. tuberculosis - Mycobacterium tuberculosis

iNOS - индуцибельная синтаза оксида азота (II)

L-NMMA - моноацетат №-монометил-Ь-аргинина

L-NOHA - моноацетат №-гидрокси-Ь-аргинина

MFI - mean fluorescence intensity - среднее значение флуоресценции

NO - оксид азота (II).

Подписано в печать: 28.04.2013 Объем: 1,0 усл. п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 116 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru