Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Характеристика фенотипических и функциональных свойств антигенпрезентирующих клеток у больных туберкулезом легких

На правах рукописи

РР1

РАСПАЙ Жанар Мейрамбеккызы

ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕНОТИПИЧЕСКИХ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ АНТИГЕНПРЕЗЕНТИРУЮЩИХ КЛЕТОК У БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ЛЕГКИХ.

14.00 36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск 2008

003449616

Работа выполнена в Государственном учреждении научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения Российской Академии медицинских наук

Научный руководитель

Доктор медицинских наук, профессор

Черных Елена Рэмовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Абрамов Валерий Васильевич

ГУ НИ Институт клинической иммунологии

СО РАМН, г Новосибирск

доктор медицинских наук, профессор

Шурлыгина Анна Вениаминовна ГУ НИ Институт клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, г Новосибирск

Ведущая организация:

НИ Институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н Ф. Гамалеи Российской Академии медицинских наук

Защита диссертации состоится «_» _ 2008 года в «_» часов на заседании

диссертационного совета Д 001 001 01 при ГУ НИ Инсппут клинической иммунологии СО РАМН по адресу 630099, г. Новосибирск, ул Ядринцевская, д. 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИ Института клинической иммунологии СО РАМН, г Новосибирск

Автореферат разослан «¿[)> ьштл^ъЯ 2008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук ____Кудаева О.Т

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Туберкулез (ТБ) является древнейшим заболеванием В странах Западной Европы и США меры принятые по борьбе с этим недугом оказываются эффективными, и в настоящее время в указанных регионах ТБ относится к группе оппортунистических заболеваний, присущих исключительно вторичным иммунодефицитам В то же время в Индии, Китае, странах Африки, Латинской Америки и СНГ, несмотря на использование широкого спектра терапевтических мероприятий, частота туберкулёзной инфекции, ей осложнений и сопутствующая летальность занимают первое место среди всех инфекционных заболеваний [CDC, 1989, Shafer RW, 1991, Ravighone МС, 1992, Selwyn Р А, 1992, WHO, The World Health Report, 1999]

Важную роль в генерации адекватного иммунного ответа при ТБ играют антигенпрезентирующие клетки (АПК), представленные моноцитами, макрофагами и дендритными клетками (ДК), которые являются компартментом ангигенпрезентирующих клеток с выраженной иммунорегуляторной активностью [Ellner J J, 1997] Поэтому дисфункции антигенпрезентирующих клеток обсуждаются в качестве одного из существенных механизмов нарушения антигенспецифического ответа Так, при туберкулезной инфекции моноциты периферической крови, с одной стороны, характеризуются признаками активации, а с другой - выраженными нарушениями регуляторной активности [Vanham G, Edmonds К, 1996, Vanham G, Toossi Z , 1997] Существует большое количество исследований, в которых показано, что антигены Mycobacterium tuberculosis (МТБ) при инфицировании макрофагов и дендритных клеток способны изменять их функциональные свойства [Nigou J., 2001; Giacomim Е, 2001, Post FA., 2001, Hickman SP, 2002, Geijtenbeek TBH, 2003, Koul A, 2004] Однако антигенпрезентирующая функция моноцитов и генерируемых из них макрофагов и ДК, продукция этими клетками цитокинов, способность активировать Th-l/Th-2 ответ у больных ТБ, особенно с учетом антигенспецифического Т- клеточного ответа, остаются во многом неисследованными Поэтому изучение особенностей фенотипа и функциональных свойств моноцитов, генерированных из них макрофагов и дендритных клеток у больных ТБ представляет большой научный и практический интерес. Исходя из этого, была сформулирована цель работы на основании исследования фенотипических и функциональных свойств моноцитов, макрофагов и дендритных клеток у больных туберкулёзом легких охарактеризовать компартмент антигенпрезетирутощих клеток (АПК) и изучить их роль в развитии Т- клеточных дисфункций при туберкулезной инфекции

Для достижения этой цели предусматривалось решение следующих задач

1 Провести сравнительное исследование фенотипических и функциональных свойств моноцитов периферической крови (содержание С014+СШ6+ клеток, экспрессию ко-стимуляторных молекул, внутриклеточную продукцию цитокинов, супрессорную активность моноцитов) у здоровых доноров и больных ТБ легких с сохранным и сниженным антигенспецифическим ответом

2 Оценить фенотипические (содержание СЭ14+, СО 16* клеток, экспрессию ко-стимуляторных молекул) и функциональные свойства макрофагов (спонтанную и ЬРЭ-стимулированную продукцию цитокинов, аллостимуляторную активность), полученных из моноцитов периферической крови здоровых доноров и больных туберкулёзом лёгких, в том числе у пациентов в зависимости от уровня РРО-стимулированного Т- клеточного ответа

3 Провести сравнительное исследование поверхностных маркеров, характеризующих дифференцировку и созревание №N-0 индуцированных дендритных клеток у здоровых доноров и больных ТБ

4 Изучить функциональные свойства (спонтанную и ЬР5-стимулированную продукцию цитокинов, продукцию N0, аллостимуляторную и ТЫ/ТМ-стимулирующую активность) ДК у больных ТБ, в том числе пациентов с сохранным и сниженным ответом на РРЭ

Научная новизна. В представленной работе впервые показано, что при ТБ изменены все типы АПК Наиболее выраженные изменения выявлены в группе пациентов со сниженным антигенспецифическим Т-клеточным ответом В частности, впервые продемонстрировано, что в периферической крови больных ТБ легких увеличена фракция моноцитов с внутриклеточной экспрессией 1Ь-10, которая сосредоточена преимущественно среди С014+СБ16+ клеток Причем увеличение фракции СШ4+СШ6+ моноцитов, обладающих супрессорной активностью, наблюдается у больных со сниженным ответом на РРИ Впервые изучены свойства макрофагов, генерированных из моноцитов периферической крови больных ТБ лёгких Установлено, что аллостимуляторная активность макрофагов у больных ТБ угнетена и это ассоциировано со снижением экспрессии НЬА-ОЯ и костимуляторных молекул и повышенной продукцией противовоспалительных цитокинов (11.-10, И-6) При этом выявленные дисфункции наиболее выражены в группе РРЭ-анергичных пациентов

Получены новые данные, характеризующие свойства ДК, индуцированных из моноцитов периферической крови в присутствии ОМ-СЭР и 1Ш-а у больных ТБ Показано изменение ряда фенотипических свойств, свидетельствующее о нарушении дифференцировки и активации ДК при ТБ инфекции Кроме этого, выявлены нарушения

функциональных свойств IFN-a-индуцированных ДК, которые проявляются сниженной продукцией IFN-y, IFN-a и нитрооксида, усилением продукции IL-10, угнетением аллостимуляторной активности, а также способности к индукции ТЫ цитокинов Причем нарушение антигенпрезентирующей функции и способности ДК активировать Thl ответ сопряжено с угнетением антигенспецифического Т-клеточного ответа

Полученные в целом данные свидетельствуют о важной роли ангигенпрезентирующих клеток в поддержании Т-клеточного ответа

Теоретическая и практическая значимость. Выявление сопряженности между нарушением антигенспецифического ответа и дисфункциями ангигенпрезентирующих клеток (моноцитов периферической крови и генерированных из них макрофагов и ДК) раскрывает новые аспекты патогенеза туберкулезной инфекции.

Результаты проведенных исследований позволяют использовать их в решении многих практических задач, связанных с вопросами диагностики, прогноза и лечения пациентов с ТБ инфекцией Установленная взаимосвязь между изменениями фенотипических и функциональных свойств АПК и снижением антигенспецифического ответа обосновывает возможность использования указанных параметров для прогнозирования характера течения туберкулезной инфекции и позволяет рассматривать АПК в качестве новой мишени имунотерапевтических воздействий у больных ТБ легких. Отработка методов генерации JFN-a-индуцированных ДК m vitro позволит использовать эти клетки не только для оценки их функциональной активности, но и применения в качестве клеточных вакцин ангигенспецифической иммунотерапии, особенно у больных с наличием множественной лекарственной устойчивости М tuberculosis к базовой химиотерапии При этом, учитывая измененный профиль цитокинов, секретируемых ДК, можно полагать, что адьювантная цигокинотерапия может повысить стимулирующий эффект иммунотерапии ДК Основные положения, выносимые на защиту:

1. Течение активных форм туберкулеза легких происходит на фоне изменения фенотипических и функциональных свойств всех трех типов АПК - моноцитов периферической крови, полученных из них макрофагов и ДК

2. Наиболее выраженные изменения фенотипических и функциональных свойств моноцитов, макрофагов и ДК у больных ТБ лёгких характерны для больных ТБ со сниженным антигенспецифическим Т-клеточным ответом

3. Усиление продукции IL-10 и угнетение антигенпрезентирующей функции (аллостимуляторной активности) являются общими признаками дисфункций различных типов АПК (моноцитов, махрофагов, дендритных клеток) у больных туберкулезом легких

Объем и структура диссертации. Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и результатов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов Материал изложен на 103 страницах машинописного текста, включающего 8 таблиц и 11 рисунков Прилагаемая библиография содержит ссылки на 140 литературных источников, в том числе 129 иностранных

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на Всероссийской конференции молодых ученых "Проблемы фундаментальной и прикладной медицины» (Новосибирск, 2006), Всероссийской научно-практической конференции "Дни иммунологии в Сибири» (Омск, 2007), Объединенном иммунологическом форуме (Санкт - Петербург, 2008) Апробация диссертации состоялась 26 июня 2008 года на расширенном семинаре ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для опубликования результатов работ на соискание ученой степени кандидата наук

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования. Диссертационная работа основана на результатах клинико-иммунологического обследования больных туберкулёзом легких, находящихся на лечении в филиале ГБУЗ НСО ГОНТБ специализированной туберкулезной хирургической больницы города Новосибирска за период 2005-2008 годов

В исследование были включены 196 больных туберкулезом легких и его осложнениями Большинство пациентов на момент взятия крови характеризовались тяжелым течением ТБ инфекции 53,1% с деструктивными и диссеминированными формами ТБ, 57,4% с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), 86,7% с бацилловыделением Контрольная группа была представлена 128 здоровыми донорами крови, сопоставимыми по полу и возрасту

Мононуклеарные клетки (МНК) периферической крови выделяли центрифугированием цельной, гепаринизированной венозной крови в градиенте плотности фиколла-верографина (р=1,078, фиколл-Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Швеция, верогрэфин-Spofa, Чехия) Для оценки пролиферативной активности МНК клетки культивировали в концентрации 100 тыс./лунку при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% С02, в 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических исследований в полной культуральной среде, содержащей RPMI-1640, дополненной 0,3 мг/мл L-глютамина, 5 мМ HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина и 10% инактивированной сыворотки доноров АВ (IV) группы Для стимуляции клеток использовали туберкулиновый

очищенный белковый дериват (PPD) в концентрации 50 мкг/мл Интенсивность пролиферации оценивали на 6-ые сутки по включению в нуклеопротеидные фракции клеток 3Н-тимвдина, вносимого за 18 часов до окончания культивирования (1 мкКи на лунку) Подсчет радиоактивности производили в жидкостном сцинциляционном счетчике SL-30 (Intertechnic, Франция) В зависимости от уровня пролиферативного ответа МНК на PPD больные были разделены на 2 подгруппы, с сохранным (>12500 имп/мин) и со сниженным (<12500 имп/мин) ответом на PPD

Моноциты выделяли в 6-луночных планшетах (Nunclon, Дания) путем прилипания к пластику МНК (ЗхЮ6 клеток/мл) в присутствии 5% сыворотки AB(IV) группы Для оценки супрессорной активности исследовался эффект удаления моноцитов (прилипающей к пластику фракции МНК) на пролиферативную активность МНК, стимулированных PPD Усиление ответа после удаления прилипающей фракции клеток свидетельствовало о наличии у них супрессорной активности О величине супрессорной активности судили по индексу влияния (ИВ), рассчитанному как отношение значения пролиферации в культурах МНК, лишённых прилипающей фракции моноцитов, к уровню ответа МНК.

Поверхностные маркеры клеток и внутриклеточную экспрессию цитокинов определяли методом проточной цигофлуориметрии в соответствии с методикой Becton Dickinson, отработанной с небольшими модификациями в Лаборатории иммунопатологии ИКИ СО РАМН (зав лабораторией, д-р мед наук В С. Кожевников). Подготовленные пробы исследовали на лазерном клеточном сортере-анапизаторе FACSCahbur (Becton Dickinson, США) с использованием программы CelíQuesí (Becton Dickinson, США). Процент позитивных клеток, экспрессирующих соответствующие CD-маркеры, рассчитывался среди 10 000 клеток в соответствующих регионах Определение процентного содержания клеток с внутриклеточной экспрессией цитокинов проводили после пермеабилизации клеток.

Макрофаги получали путем культивирования прилипающей фракции МНК периферической крови в 6-луночных планшетах (Nunclon, Дания) в полной культуральной среде RPMI-1640, дополненной 5% аутошгазмы, 2% сыворотки крови плодов коровы (Биолот, С-Пб, Россия), 5х10"5М 2-меркаптоэтанолом (Serva), 2xI0"3M пирувата Na (Sigma-Aldnch), 1% раствором незаменимых аминокислот в присутствии гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF, 50нг/мл, Sigma-AJdnch) в течение 6 суток. Продукцию цитокинов оценивали в супернатантах 6-суточных культур Мф, а также в 24-часовых супернатантах Мф, нестимулированных и стимулированных липополисахаридом (LPS Ecoli 0111:В4, Sigma-Aldrich) в дозе 10 мкг/мл Концентрацию цитокинов определяли методом иммуноферментного анализа, используя соответствующие тест-системы производства «Векгор-Бест», Новосибирск (TNF-a, IL-1, RAIL-1, IL-6),

«Цитокин», Санкт-Петербург (IL-10) или R&D Systems (TGF-ßi) Аллостимуляторную активность Мф оценивали в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ) при культивировании МНК доноров (0,1х106/лунку) в присутствии аллогенных Мф здоровых доноров или больных ТБ в соотношении 10 1 в течение 5 суток

ДК получали путем культивирования прилипающей фракции МНК в течение 4 сут в среде RPMI-1640 с 10% сыворотки крови плодов коровы (Биолот, Санкт-Петербург) в присутствии GM-CSF (40 нг/мл, Sigma-AIdnch) и IFN-a (Роферон-А, 1000 Ед/мл, Roche, Швейцария) последующим дозреванием в течение 24 часов в присутствии 10 мкг/мл липополисахарида (LPS E.coh 0111В4, Sigma) Содержание цитокинов определяли в супернатантах 5-суточных культур ДК и в 48-часовых супернатантах нестимулированных и стимулированных LPS дендритных клеток с помощью наборов для иммунофермектного анализа (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) Для исследования ТЫ/ТЬ2-стимулирующей активности ДК оценивалось количество CD3+ Т-клеток с внутриклеточной экспрессией IFN-y и IL-4 во вторичной СКЛ, индуцированной ДК больных ТБ и доноров

Аллостимуляторную активность ДК оценивали в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ) при культивировании МНК доноров (0,1хЮб/лунку) в присутствии ДК (в соотношении 10 1, 50 1, 100 1) больных ТБ и здоровых доноров в течение 5 суток Уровень продукции оксида азота (NO) определяли в 3-х суточных культурах ДК с помощью оценки содержания стабильного конечного продукта NO2" Математическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной, параметрической и непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием программы «STATISTICA 6 0» Результаты работы и их обсуждение.

Отправной точкой исследования стала сравнительная оценка супрессорной активности циркулирующих моноцитов у здоровых доноров и больных ТБ Как следует из данных таблицы 1, однократное удаление прилипающей фракции МНК у здоровых доноров достоверно не влияло на уровень PPD-стимулированного пролиферативного ответа, в то время как у больных ТБ сопровождалось достоверным усилением интенсивности пролиферации При этом, в подгруппе больных со сниженным ответом на PPD супрессорная активность встречалась в 87,5% случаев, тогда как в подгруппе пациентов с сохранным антигенспецифическим ответом встречалось в 2 раза реже

Чтобы выяснить, с чем связано изменение функциональной активности моноцитов, на следующем этапе был проведен анализ фенотипических маркеров, а также внутриклеточной продукции TNF-a и IL-10 моноцитами периферической крови у больных ТБ

Таблица 1

Эффект удаления прилипающей фракции МНК на РРО-индуцированный __пролиферятивный ответ__

Исследуемый параметр Доноры (30) Больные ТБ (38) Больные с сохранным ответом на РРЭ (28) Больные со сниженным ответом на РРО (10)

РРО-ответ МНК (имп/мин) 28 452 ± 4121 20 535 ± 1903 27 680 ±2301 6 231 ±1130'

РРБ-ответ МНК, лишенных прилипающих клеток (имп/мин) 28 573 ±5326 24 469 ±2053 27 499 ±2398 16 148 ± 2131

Индекс влияния (ИВ) 1,06 ±0,19 1,93 ±0,43* 1.19 ± 0,09 4.3 ±1,5*' "

Супрессорная активность моноцитов (частота встречаемости, %) 50% (15/30) 39% (9/23) оо у

Примечание: * - достоверность различий (Ри<0,05) по сравнению с соответствующей группой здоровых доноров, - достоверность различий (Ру<0,05) по сравнению с группой больных с сохранным ответом на РРО. Здесь и далее в таблицах: II - непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни. В скобках - количество наблюдений. " - различия показателей при частотном анализе по критерию х - квадрат между подгруппами больных с сохранным и сниженным ответом на РРО

Анализ экспрессии молекул, участвующих в презентации антигена и костимуляции у больных ТБ выявил снижение относительного количества моноцитов, несущих НЬА-ЭЯ и СИ86 молекулы (Рис.1). Причем уменьшение доли СЭ86+ клеток регистрировалось как в группах больных со сниженным, так и сохранным ответом на РРЭ. Аналогичным образом, снижение количества НЬД-О!^ моноцитов регистрировалось с одинаковой частотой у больных с РРО-анергией и сохранным антигенспецифическим ответом.

□ Доноры

! Больные ТБ

90

80

70

V- уи

^

ГТ 50

о

I 40

о

2 30

20

10

0

1 —5— п=10

* ш X

1 1

п=9

*

■1ш ж ■■Ид ШШд

!

( п=30

СО 86

ьиа-ОР:

Рисунок 1. Экспрессия ПЬА-ОК и СШ6 на моноцитах периферической крови доноров и больных туберкулёзом.

Примечание: * - достоверность различий по сравнению со здоровыми донорами (рц<0,05).

В то же время относительное количество СВ14тСО!6+ моноцитов у больных ТБ в периферической крови было достоверно выше по сравнению со здоровыми донорами (Табл.2).

Таблица 2

Содержание С014+СШ6+ моноцитов в периферической крови здоровых доноров и больных ТБ легких.

Показатель Здоровые доноры (п) Больные ТБ (п) Больные с сохранным ответом на РРО (п) Больные со сниженным ответом на РРП (п)

СЭ14+СШ6* моноциты, % 8,9+1,2 (15) 18,0±1,2* (65) 15,4±1,0 (37) 21,4±2,4" (26)

Частота больных с повышенным количеством СП 14+СЭ16+ моноцитов, % 40% (26/65) 25,6%(10/39) 61,5% (16/26)

Примечание: *- достоверность различий показателей по сравнению с донорами. " - достоверность различий между группами пациентов. (Ри< 0,05); в скобках - число наблюдений.

Причём в подгруппе больных с РРО-анергией было повышено как относительное содержание С014+С016+ моноцитов, так и частота встречаемости больных с повышенным количеством С014+С016+ клеток.

Исследование внутриклеточной продукции цитокинов (Рис.2) выявило значимое снижение у больных относительного количества моноцитов, продуцирующих ТЫР-а, а также существенное увеличение моноцитов с внутриклеточной экспрессией 1Ь-10, что явно указывало на изменение регуляторной функции моноцитов.

18 16 14

со

£ 12 I 10

0

1 8

о

2 0

Рисунок 2 Внутриклеточная продукция ТОТ-а и 11-10 моноцитами периферической крови здоровых доноров и больных ТБ.

Примечание: * - достоверность различий по сравнению со здоровыми донорами (ри<0,05).

□ Доноры В Больные ТБ

п=8 *

т

*

п=32

-1-

п=16 п=18

Т^-а И-10

Интересно, что моноциты с внутриклеточной экспрессией 1Ь-10 были сосредоточены преимущественно в популяции СО!6* клеток (Таблица 3).

Таблица 3

Внутриклеточная экспрессия 1Ь-10 в субпопуляциях С01б+ и Сй 16' моноцитов у здоровых доноров и больных ТБ

Группы Субпопуляция моноцитов(%)

С0144"С016+ 1ЫО+СО)6+ 1Ы0+СО16-

Доноры (п=8) 8,2 + 1,9 2,0 ± 0,92 0,3 ±0,12

Больные ТБ (п=5) 29,8 + 7 * 12,1 + 3,1 * 0,86 + 0,45

Примечание. *- достоверность различия средних значений у больных ТБ по сравнению с донорами, Ри<0,05.

Таким образом, супрессорный характер функциональной активности моноцитов обусловлен как возрастанием доли С014~С016+ клеток, так и увеличением внутриклеточной продукции 1Ь-10 клетками данной фракции моноцитов

Отправной точкой исследования макрофагов стало изучение фенотипических свойств генерированных клеток. При анализе экспрессии С086 молекулы (Рисунок 3) на поверхности генерированных макрофагов было выявлено, что в целом по группе обследованных больных относительное количество СВ8б-позитивных клеток было статистически значимо снижено по сравнению со здоровыми донорами.

□ Доноры ■ Больные ТБ

□ Пациенты с сохранным ответом на РРЭ 9 Пациенты со сниженным ответом на РРО

С086+ Н1_А-0(Ч+

Рисунок 3. Фенотипическая характеристика макрофагов, генерированных из

моноцитов периферической крови здоровых доноров и больных туберкулёзом.

Примечание: * - достоверность различий (Ри<0,05) по сравнению с группой здоровых доноров, достоверность различий (Ри<0.05) по сравнению с группой больных с сохранным ответом на РРИ.

Причем значимое снижение экспрессии данной молекулы на поверхности макрофагов выявлялось исключительно у пациентов со РРЭ-анергией, в то время как в группе пациентов с сохранным антигенспецифическим ответом снижение относительного содержания С08б+ макрофагов было выражено незначительно и проявлялось лишь в виде тенденции При анализе экспрессии НЬА-ПИ. молекулы на поверхности генерируемых макрофагов, достоверных различий в общей группе больных по сравнению со здоровыми донорами выявлено не было Однако у больных со сниженным антигенспецифическим ответом регистрировалось статистически значимое снижение относительного количества ПН-позитивных макрофагов как по сравнению с группой доноров, так и по сравнению с пациентами из оппозитной группы

Полученные данные об изменении фенотипических свойств макрофагов явились аргументом в пользу предположения о дисфункциях этих клеток, как возможной причины нарушения антигенспецифического ответа у больных ТБ

Анализ функциональных свойств макрофагов включал исследование продукции цитокинов (ЮТ-а, 1Ь-1, КА1И, 1Ь-6, 1Ь-10, ТСР-Р), а также их аллостимуляторной активности

Таблица 4

Содержание цитокинов в супернатантах от 6-суточных культур макрофагов

Цитокин, пг/мл Здоровые доноры Больные ТБ Пациенты с сохранным ответом наРРО Пациенты со сниженным ответом на РРО

1Ь-1 769+199 (8) 375+140(12) 397±198 (7) 345±217 (5)

ЯА1Ы 9896+405 (10) 10508+247(12) 10560+250(7) 10435±517 (5)

ЯА1Ь-1/1Ы 27,6±12,1 (8) 212,7±120,1(12) 112,0±37,8 (7) 353,6±289,3 (5)

ТКТ-а 557±95 (14) 447+70 (25) 508±120 (И) 399+8 (14)

11.-6 2119±39 (10) 1739±173 (13) 1820±220 (7) 1645+292 (6)

1Ы0 60,9+31,7 (9) 114,9±34,9 (14) 62,3±29,5 (8) 185,1+63,4*''(6)

ТвР-р! 1198±127 (7) 1835±423 (И) 1895±612 (7) 1733±569 (4)

Примечание значения концентрации цитокинов представлены в пг/мл,

* - достоверность различий по сравнению с группой здоровых доноров, Рц<0,05

* - достоверность различий по сравнению с группой пациентов с сохранным ответом на РРЭ, Ри<0,05 В скобках указано количество исследуемых (п)

Как видно из данных Табл 4, продукция 1Ь-10 у больных ТБ была повышена. Это

проявлялось в виде тенденции в общей группе больных и значимого усиления в подгруппе

пациентов со сниженным антигенспецифическим ответом Анализ продукции цитокинов в

24-суточных культурах не стимулированных и ЬРЗ-стимулированных макрофагов показал,

что у больных ТБ усилена спонтанная продукция 1Ь-б и ЬРБ-стимулированная продукция

1Ь-10, наиболее выраженная у пациентов со сниженным антигенспецифическим ответом.

Исследование аллостимуляторной активности генерированных макрофагов показало, что в общей группе больных ТБ выявлялась тенденция к снижению уровня данного показателя (Рис.4). □ Доноры (п=14) И Больные ТБ (п=27)

0 Пациенты с сохранным ответом на РРО (п=21) ■ Пациенты со сниженным ответом на РРО (п=6) 18000

х 15000

1 12000 с 9000

5 6000

* 3000

о

Рисунок 4 Аллостимуляторная активность макрофагов, полученных из моноцитов периферической крови здоровых доноров и больных туберкулёзом.

Примечание: * - достоверность различий (Ри<0,05) по сравнению с соответствующей группой здоровых доноров, "- достоверность различий (Ри<0,05) по сравнению с группой больных с сохранным ответом на РРО.

При этом пролиферативный ответ МНК здоровых доноров, индуцированный в СКЛ макрофагами энергичных больных, был значимо ниже по сравнению с ответом, индуцированным макрофагами от реактивных пациентов и здоровых доноров.

Заключительным этапом работы стало исследование характеристик №N-0 индуцированных ДК (1Р"М-ДК). Как видно из рисунка 5, по сравнению со здоровыми донорами у больных туберкулезом увеличено содержание С014+ клеток в исследуемых культурах.

□ Доноры (п=14) Ш Больные ТБ (п=36)

□ Пациенты с сохранным ответом на РРй (п=26) ■ Пациенты со сниженным ответом на РРО (п=10)

* 40 о

35

<и

£ 30

* 25 л

¡5 20

5. 15 се

X 10 о

4 5 0

С014+ С025+ С01а+ С083+

Рисунок 5. Сравнительная характеристика поверхностных маркеров НТЧа-

индуцированных дендритных клеток здоровых доноров и больных туберкулёзом.

Примечание: * - достоверность различий (Ри<0,05) по сравнению с соответствующей группой здоровых доноров, достоверность различий (Рц<0,05) по сравнению с группой больных с сохранным ответом на РРО.

!

_ —т-

1 * #

* # Х-1 ^ ¡вр ■ т 1

г| и 1 1

Причем в группе пациентов со сниженным ответом на РРО количество этих клеток было в 2 раза выше, чем у больных из оппозитной группы, и в 4 раза выше, чем у здоровых доноров. Относительное содержание зрелых активированных ДК, экспрессирующих молекулу С025, у больных ТБ было снижено более чем в 2 раза (Рис.5).

Анализ относительного содержания С011с"С0123+ 1РЫ-ДК выявил также снижение количества этих клеток у больных туберкулезом легких (Рис. 6).

Рисунок 6. Фенотипическая характеристика IFNa- индуцированных дендритных клеток, у здоровых доноров и больных туберкулёзом.

Примечание: * - достоверность различий (Ри<0,05) по сравнению с соответствующей группой здоровых доноров, * - достоверность различий (Ро<0,05) по сравнению с группой больных с сохранным ответом на PPD.

Наиболее выраженное снижение данной субпопуляции ДК наблюдалось у пациентов с сохранным ответом на PPD, тогда как у больных со сниженным PPD-ответом уменьшение CD1 lc'CD123 клеток было менее выраженным и недостоверным.

Выявленные фенотипические особенности IFN-ДК свидетельствуют о снижении эффективности генерации и активации ДКу больных ТБ легких.

Исследование продукции цитокинов в супернатантах 5-суточных культур ДК, активированных в течение последних 24 ч LPS, показало, что IFN-ДК здоровых доноров характеризуются высоким уровнем продукции TNF-a, способны секретировать IFN-y, IL-10 и практически не продуцируют IL-4 (Таблица 5). По сравнению со здоровыми донорами, у больных ТБ уровень продукции IFN-y ДК был снижен в 6 раз.

Таблица 5

Содержание цитокинов в супернатантах от 5-суточных культур IFN-ДK.

1Ж-у, пг/мл !Ь-4, пг/мл ШБ-а, пг/мл 1Ь-10, пг/мл

Здоровые доноры 110,5±59,8 4,4+1,8 8!7,7±63,1 73,3±14,8

(13) (13) (13) (8)

Больные ТБ 18,3 ±1,8* 5,7 ±2,3 933,6 ±36,3 280,7 ± 69,6

(29) (20) (21) (18)

Пациенты с сохранным 19,5 ±2,1* 7,1+3,0 944,5 ± 50,5 191,4 ±83,9

ответом на РРО (23) (15) (14) (П)

Пациенты со сниженным 13,9 ±3,7* 1,4 ±0,6 911,7 ±44,7 421 ± 107,1*

ответом на РРО (6) (5) (7) (7)

Примечание * - достоверность различий (Рц<0,05) по сравнению с группой здоровых доноров В скобках указано количество обследованных человек

В то же время продукция 1Ь-10 в целом по группе была достоверно повышена Более того, в группе пациентов со сниженным ответом на РРО значение данного показателя более чем в 5 раз превышало значение аналогичного показателя у здоровых доноров

Одной из характерных особенностей 1П\Т-ДК доноров является способность к продукции 1РЫ-а

Таблица 6

Продукция П^Л'чх и оксида азота 1КУ-ДК здоровых доноров и больных ТЕ легких.

Группы Продукция 1РЫ-а, пг/мл (п) Продукция N О, мкМ(п)

Спонтанная ЬРЗ-стимулированная

Здоровые доноры 82,7 ± 7,5 (4) 82,9 ±5,9 (4) 17,6 ±2,5 (11)

Больные ТБ 44,5 ±8,8 (13) 39,3 ±7,7* (16) 11,1 ±1,5* (13)

Пациенты с сохранным ответом на РРО 67,0 ± 16,2 (5) 60,9 ± 19,2 (5) 11,9 ±2,1 (9)

Пациенты со сниженным ответом на РРО 30,5 ± 7,0*'* (8) 29,5 ±5,5* (11) 10,0 ±1,7 (3)

Примечание * - достоверность различий (Ри<0,05) по сравнению с донорами, * - достоверность различий (Рц<0,05) по сравнению с оппозитной группой больных

Как видно из данных таблицы 6, у больных ТБ легких отмечалось снижение продукции 1РЫ-а, которое было наиболее выраженным в группе пациентов с РРО-анергией Ещё одной особенностью 1РМ-ДК у больных ТБ явилось снижение продукции N0, которое регистрировалось вне зависимости от уровня ответа на РРО

Функциональную активность ПЭД-ДК оценивали в смешанной культуре лимфоцитов Как видно из Рисунка 7А, в целом по группе больные ТБ легких отличались сниженной аллостимуляторной активностью ДК, что проявлялось более низким уровнем пролиферации в СКЛ при всех исследуемых соотношениях МНК и ДК При этом анализ больных, оппозитных по уровню РРО-ответа, показал, что угнетение аллостимуляторной активности выявлялось именно в подгруппе пациентов со сниженным ответом на РРО (рис 7 Б)

Соотношение МНК: ДК

8000 т

_ 6000 -л | а. |

■§■•5 4000-Е 5 о 5

а 2000 ■ С

-- РРО-отвечающие больные (п=15) -- РРР-анергичные больные (п=12)

# г

А

#

-—-г

-

(100-1) (50:1)

Соотношение МНК:ДК

(10 :1)

Рисунок 7 Аллостимуляторная активность дендритных клеток, генерированных из

моноцитов периферической крови здоровых доноров и больных туберкулезом.

Примечание * - достоверность различий (рц<0,05) по сравнению с донорами

* - достоверность различий (ри<0,05) по сравнению с оппозитной группой больных

На следующем этапе была проведена сравнительная оценка способности 1ТО-ДК доноров и больных ТБ активировать Т-хелперные клетки 1- и 2-го типа (ТЫ и ТЫ) Для этого исследовалось количество Т-клеток с внутриклеточной экспрессией 1Ш-у и 1Ь-4 во вторичной СКЛ, индуцированной 1Ш-ДК больных ТБ или здоровых доноров Как видно из данных Таблицы 7, относительное содержание СБЗ+ Т-клеток с внутриклеточным содержанием в присутствии ДК здоровых доноров возрастало более чем в 4 раза, тогда как количество СЭЗ+ Т-клеток с внутриклеточной экспрессией 1Ь-4 увеличивалось незначительно. ДК больных также усиливали внутриклеточную продукцию ШЫ-у и существенно стимулировали внутриклеточную продукцию 1Ь-4 При этом наибольшие различия выявлялись в группе РРО-анергичных больных

Таблица 7

Влияние 1ЕМ-ДК здоровых доноров и больных ТБ легких па внутриклеточную продукцию Т-клетками №N-7 и 1Ь-4.

Источник ДК 1Ь-4

МНК (0) МНК (+ДК) ИВ МНК (0) МНК (+ДК) ИВ

Здоровые доноры (п=20) 1,9+0,3 6,1+0,5 4,8+0,9 1,8+0,1 2,2±0,3 1,3±0,2

Больные ТБ (п=36) 1,9±0,1 3,1±0,4* 1,8+0,2' 2,0+0,2 4,7+0,6* 2,2±0,2*

Пациенты с сохранным ответом на РРО (п= 17) 1,7±0,1 3,7±0,6 2,4+0,3* 1,8±0,2 2,8+0,4 1,6±0,1

Пациенты со сниженным ответом на РРО (п=19) 2,1+0,1 2,7+0,5''* 1,3±0,2*' * 2,4±0,3 6,7+1,1''* 2,8±0,3*'*

Примечание *- достоверность различий (рц<0,05) по сравнению с донорами, # - достоверность различий (рц<0,05) по сравнению с оппозитной группой больных

Так, ДК этих больных характеризовались наиболее низкой ТЫ- и повышенной ТЬ2-стимулирующей активностью и значимо отличались по этим параметрам от ДК больных с сохранным ответом на РРЭ

В настоящей работе исследовались функциональные свойства ДК генерируемых из моноцитов периферической крови больных ТБ, которые не имели непосредственного контакта с патогеном Поэтому выявленные дисфункции ДК, скорее всего, являются результатом изменения свойств циркулирующих моноцитов, нежели следствием инфицирования моноцитов и ДК микобактерией туберкулеза

Результаты, изложенные в диссертации, убедительно свидетельствуют о том, что у больных ТБ изменены все три типа АПК На уровне моноцитов это проявляется снижением экспрессии С086 и Ш-А-ОЛ молекул, появлением супрессорной активности, ассоциированной с увеличением субпопуляции С014+С01б* клеток, продуцирующей 1И0 На уровне макрофагов - это сдвиг баланса цитокинов в сторону продукции противовоспалительных цитокинов, в частности, усиление продукции 1Ь-10, а также снижение аллостимуляторной активности На уровне ДК - это снижение количества зрелых активированных ДК, несущих СП25 молекулу, подавление продукции 1Пчт-7, 1КЫ-сс и N0, усиление продукции 1Ь-10, угнетение аллостимуляторной и ТЫ-стимулирующей активности Общим дефектом, характерным для всех типов АПК, являются усиленная продукция 1Ь-10 и подавление аллостимуляторной активности, наиболее выраженные в группе пациентов со сниженным антигенспецифическим ответом

Выводы:

1 Больные туберкулезом легких характеризуются изменением фенотипических и функциональных свойств циркулирующих моноцитов, о чем свидетельствует снижение экспрессии ко-стимуляторных молекул (CD86) и антигенов ГКГ II класса (HLA-DR), увеличение субпопуляции CD14+CD16+ моноцитов и появление супрессорной активности моноцитов

2 Супрессорная активность моноцитов характерна для пациентов со сниженным антигенспецифическим ответом и опосредуется вовлечением CD14+CD16+ клеток, что подтверждается более выраженным увеличением их количества у PPD-ареактивных больных, преимущественной локализацией IL-10-позитивных клеток во фракции CD16+ моноцитов

3 Снижение экспрессии ко-стимуляторных молекул (CD86) и антигенов II класса ГКГ (HLA-DR) в культурах макрофагов PPD-анергичных больных и отсутствие указанных изменений у пациентов с сохранным пролиферативным ответом МНК на PPD указывает на нарушение дифференцировки/созревания макрофагов у больных с дефектом антигенспецифического ответа

4 Макрофаги, полученные из моноцитов больных со сниженным антигенспецифическим ответом, характеризуются нарушением антигенпрезентирующей и цитокинсекретирующей функций, что подтверждается усилением спонтанной продукции макрофагами IL-6 и LPS-стимулированной продукция IL-10, а также снижением аллостимуляторной активности макрофагов

5 Больные с активными формами туберкулеза легких характеризуются снижением эффективности IFNa -индуцированной дифференцировки и созревания ДК в культуре in vitro, о чем свидетельствует увеличение в культурах ДК относительного содержания клеток с маркером моноцитов (CD 14) и уменьшение доли зрелых активированных ДК, экспрессирующих молекулу CD25, а также количества клеток с рецептором к IL-3 (CD123)

6 Изменения функциональной активности ДК проявляются рядом общих (свойственных для больных туберкулезом легких в целом) и частных (характерных для больных с дефектом антигенспецифического ответа) дисфункций К первой категории относится снижение продукции дендритными клетками IFN-y, IFN-a и нитрооксида, ко второй - усиление продукции IL-10, угнетение аллостимуляторной активности ДК, снижение Th-1- и усиление ТЬ2-стимуляторной активности ДК

Список работ опубликованных по теме:

1 Леплина О Ю , Тихонова М А , Сахно Л В , Распай Ж М. Никонов С Д, Старостина Н В , Останин А А, Черных Е Р Фенотипическая характеристика дендритных клеток при различных патологиях //Медицинская Иммунология -2006 -т 8 -№2-3 -с 420-421

2 Сахно Л В , Леплина О Ю, Тихонова М А, Распай Ж М. Никонов С.Д, Жданов О А, Останин А А, Черных Е Р Фенотипические особенности дендритных клеток у больных туберкулезом легких //Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» 20-21 сентября г Красноярск-2006-с 79-81

3 Сахно Л.В , Леплина О Ю., Тихонова М А. Распай Ж М. Гилева И П., Никонов СД, Жданов О А, Останин А А, Черных Е.Р Характеристика дендритных клеток, генерируемых в присутствии интерферона-а, у больных туберкулезом легких//Проблемы туберкулеза.-2007.-№3 -с 42-46

4 Распай Ж М. Сахно Л В, Леплина О Ю., Никонов С Д., Жданов О А., Черных Е Р. Интерферон а-индуцированные дендритные клетки в лечении больных туберкулезом легких //Омский научный вестник.-2007 -№3(61) -с 117-118

5 Сахно Л В , Распай Ж М. Тихонова М А, Никонов С Д, Жданов O.A., Останин А А, Черных Е Р. Функциональные свойства макрофагов у больных туберкулезом легких // Омский научный вестник.-2007 -№3(61) -с 126-128

6 Сахно Л В , Леплина О Ю, Распай Ж М . Тихонова М А, Курганова Е В , Гилева И П, Никонов С.Д, Жданов О А, Останин А А , Черных Е Р. Функциональные свойства IFNa-индуцированных дендритных клеток у больных туберкулезом легких // Медицинская Иммунология - 2008 - т 10 - №2-3-с 151-158

7 Распай Ж М. Сахно Л В, Тихонова М А, Никонов С Д, Жданов О А, Останин А А, Черных Е Р. Характеристика фенотипических и функциональных свойств антигенпрезентирующих клеток у больных туберкулезом легких //Российский иммунологический журнал -2008,-т 2(11) -№2-3 -с.258-259

8. Сахно Л В , Распай Ж М. Тихонова М А, Останин А А, Черных Е.Р. Функциональные свойства макрофагов у больных туберкулезом легких//Сибирский медицинский журнал.-2008.-т. 23.- №3(1).-с 111-112

Подписано к печати 30.09.2008. Формат - 60x84 -1 печатный лист. Бумага офсетная. Печать: duplo dp - 43s. Тираж 100 экз № заказа 651. Типография ООО "ЮГУС-ПРИНТ". ИНН 5402467637 Новосибирск, ул Залесского, 4. Тираж 100 экз.

Актуальность исследования

Туберкулёз (ТБ) является древнейшим заболеванием. В странах Западной Европы и США меры, принятые по борьбе с этим недугом, оказываются эффективными, и в настоящее время в указанных регионах ТБ относится к группе оппортунистических заболеваний, присущих исключительно вторичным иммунодефицитам. В то же время в Индии, Китае, странах Африки, Латинской Америки и СНГ, несмотря на использование широкого спектра терапевтических мероприятий, частота туберкулёзной инфекции, её осложнений и сопутствующая летальность занимают первое место среди всех инфекционных заболеваний. Средой формирования туберкулезной инфекции в РФ и странах СНГ традиционно считаются учреждения исправительной системы. В тюрьмах и психоневрологических диспансерах каждый десятый болен туберкулезом. Однако в последние годы серьёзные запущенные формы заболевания выявляются у людей из относительно благополучных социальных групп [21, 103, 88, 102, 133].

Особое значение приобретает увеличение числа больных с тяжелыми остро прогрессирующими формами заболевания, первичной множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) к микобактерии туберкулеза, которые способствуют развитию эпидемии туберкулеза, а ее последствия, представленные в прогнозах для населения России и мира в целом, учитывая резко возросшую миграцию населения, крайне неблагоприятны. Поэтому особенно остро встает проблема поиска альтернативных методов лечения обреченных на неблагоприятный исход больных, как правило, молодого и среднего возраста. Указанная задача осложняется тем, что до сих пор патогенез ТБ остаётся во многом неясным.

Туберкулез относится к гранулематозным болезням. Туберкулезная гранулема квалифицируется как инфекционная, по патогенезу - иммунная с развитием клеточно-опосредованной гиперчувствительности IV типа к М.tuberculosis (МТБ), по морфологии - эпителиоидноклеточная с казеозным некрозом [6]. Важнейшая роль в защите от внутриклеточных патогенов (к которым относится и микобактерия) принадлежит врожденным и приобретенным реакциям клеточного иммунитета. Антигенпрезентирующие клетки (АПК), обладая цитотоксическими свойствами, являются с одной стороны эффекторными клетками врождённого иммунитета, а с другой стороны, являются связующим звеном между врождённым и приобретенным иммунитетом, инициируя адаптивный иммунитет [32].

Человек обладает высокой резистентностью к МТБ. Однако внутри человеческой популяции существуют большие индивидуальные вариации. Поэтому в одних случаях инфицирование заканчивается элиминацией микобактерии, в других - формированием первичного туберкулёзного комплекса с исходом либо в заживление с инкапсуляцией, обызвествлением или окостенением, либо прогрессирование с развитием различных форм генерализации. Чаще проявления первичного туберкулеза остаются неактивными (молчащими) в течение десятилетий или всей жизни индивида. Точные механизмы, лежащие в основе этого явления, еще до конца не объяснены. Реактивация или реинфекция туберкулеза и его клиническая манифестация развивается у 5-10% из числа всех инфицированных лиц. Как правило, эти процессы связаны с нарушением неспецифической резистентности и ослаблением специфического иммунитета. При этом дефект антигенспецифического Т-клеточного ответа может быть обусловлен усилением апоптоза Т-лимфоцитов, индукцией анергии Т-клеток, а также активной супрессией, опосредованной цитокинами и регуляторными Т-клетками с супрессорной активностью [56, 20, 51].

Важную роль в генерации адекватного иммунного ответа при ТБ играют АПК, представленные моноцитами, макрофагами и дендритными клетками (ДК), которые являются компартментом антигенпрезентирующих клеток с выраженной иммунорегуляторной активностью [32]. Поэтому дисфункции антигенпрезентирующих клеток обсуждаются в качестве одного из существенных механизмов нарушения антигенспецифического ответа. Так, при туберкулёзной инфекции моноциты периферической крови, с одной стороны, характеризуются признаками активации, а с другой - выраженными нарушениями регуляторной активности [124, 125]. Существует большое количество исследований, в которых показано, что антигены МТБ при инфицировании макрофагов и дендритных клеток способны изменять их функциональные свойства [79, 46, 86, 54, 44, 67]. Важно отметить, что резидентные макрофаги лёгкого в момент инфицирования не активированы и не способны полноценно элиминировать МТБ. Поэтому для развития полноценного противотуберкулезного ответа требуется постоянное пополнение пула этих клеток за счёт циркулирующих моноцитов периферической крови [32, 92]. При этом отсутствии информации о том, как функционируют макрофаги и дендритные клетки, сгенерированные из моноцитов периферической крови больных ТБ затрудняет осмысление иммунопатогенеза туберкулезной инфекции. Существуют исследования, свидетельствующие об изменениях количественных и функциональных свойств ДК при ТБ [52, 77]. Так, показано, что при ТБ в периферической крови больных ТБ снижается количество как миелоидных, так и плазмацитоидных ДК. Причем количественный дефицит плазмацитоидных ДК сопряжен с функциональными дисфункциями этих клеток, в частности снижением продукции IFN-a. [71]. Однако антигенпрезентирующая функция моноцитов и генерируемых из них макрофагов и ДК, продукция ими цитокинов, способность активировать Th-l/Th-2 ответ у больных ТБ, особенно с учётом антигенспецифического Т- клеточного ответа, остаются во многом неисследованными. Поэтому изучение особенностей фенотипа и функциональных свойств моноцитов, макрофагов и дендритных клеток у больных ТБ, представляет большой научный и практический интерес. Исходя из этого, были сформулированы цель и задачи исследования.

Цель исследования:

На основании исследования фенотипических и функциональных свойств моноцитов, макрофагов и дендритных клеток у больных туберкулёзом лёгких охарактеризовать компартмент антигенпрезентирующих клеток и изучить их роль в развитии Т- клеточных дисфункций при туберкулёзной инфекции.

Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих задач:

1. Провести сравнительное исследование фенотипических и функциональных свойств моноцитов периферической крови (содержание CD 14 CD 16 клеток, экспрессию ко-стимуляторных молекул, внутриклеточную продукцию цитокинов, супрессорную активность моноцитов) у здоровых доноров и больных ТБ лёгких с сохранным и сниженным антигенспецифическим ответом.

2. Оценить фенотипические (содержание CD14+, CD16+ клеток, экспрессию ко-стимуляторных молекул) и функциональные свойства макрофагов (спонтанную и LPS-стимулированную продукцию цитокинов, аллостимуляторную активность), полученных из моноцитов периферической крови здоровых доноров и больных туберкулёзом лёгких, в том числе у пациентов в зависимости от уровня PPD-стимулированного Т- клеточного ответа.

3. Провести сравнительное исследование поверхностных маркеров, характеризующих дифференцировку и созревание IFN-a индуцированных дендритных клеток у здоровых доноров и больных ТБ.

4. Изучить функциональные свойства (спонтанную и LPS-стимулированную продукцию цитокинов, продукцию NO, аллостимуляторную и ТЬ1/ТЬ2-стимулирующую активность) ДК у больных ТБ, в том числе пациентов с сохранным и сниженным ответом на PPD.

Научная новизна

В представленной работе впервые показано, что при ТБ изменены все типы АПК. Наиболее выраженные изменения выявлены в группе пациентов со сниженным антигенспецифическим Т-клеточным ответом.

В частности, впервые продемонстрировано, что в периферической крови больных ТБ лёгких увеличена фракция моноцитов с внутриклеточной экспрессией IL-10, которая сосредоточена преимущественно среди CD14+CD16+ клеток. Причем увеличение фракции CD14+CD16+ моноцитов, обладающих супрессорной активностью, наблюдается у больных со сниженным ответом на PPD.

Впервые изучены свойства макрофагов, генерированных из моноцитов периферической крови больных ТБ лёгких. Установлено, что аллостимуляторная активность макрофагов у больных ТБ угнетена и это ассоциировано со снижением экспрессии HLA-DR и костимуляторных молекул и повышенной продукцией противовоспалительных цитокинов (IL-10, IL-6). При этом выявленные дисфункции наиболее выражены в группе PPD-анергичных пациентов.

Получены новые данные, характеризующие свойства ДК, индуцированных из моноцитов периферической крови больных ТБ в присутствии GM-CSF и IFN-a. Показано изменение ряда фенотипических свойств, свидетельствующее о нарушении дифференцировки и активации ДК при ТБ инфекции. Кроме этого, выявлены нарушения функциональных свойств IFN-a-индуцированных ДК, которые проявляются сниженной продукцией IFN-y, IFN-a и нитрооксида; усилением продукции IL-10, угнетением аллостимуляторной активности, а также способности к индукции Thl цитокинов. Причем нарушение антигенпрезентирующей функции и способности ДК активировать Thl ответ сопряжено с угнетением антигенспецифического Т-клеточного ответа.

Полученные в целом данные свидетельствуют о важной роли антигенпрезентирующих клеток в поддержании Т-клеточного ответа и раскрывают новые аспекты патогенеза туберкулезной инфекции.

Практическая значимость.

Результаты проведённых исследований позволяют использовать их в решении многих практических задач, связанных с вопросами диагностики, прогноза и лечения пациентов с ТБ инфекцией.

Установленная взаимосвязь между изменениями фенотипических и функциональных свойств АПК и снижением антигенспецифического ответа обосновывает возможность использования указанных параметров для прогнозирования характера течения туберкулёзной инфекции и позволяет рассматривать АПК в качестве новой мишени имунотерапевтических воздействий у больных ТБ легких. Отработка методов генерации IFN-a-индуцированных ДК in vitro позволит использовать эти клетки не только для оценки их функциональной активности, но и применения в качестве клеточных вакцин антигенспецифической иммунотерапии, особенно у больных с наличием множественной лекарственной устойчивости М. tuberculosis к базовой химиотерапии. При этом, учитывая измененный профиль цитокинов, секретируемых ДК, можно полагать, что адьювантная цитокинотерапия может повысить стимулирующий эффект иммунотерапии ДК.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Течение активных форм туберкулеза легких происходит на фоне изменения фенотипических и функциональных свойств всех трех типов АПК — моноцитов периферической крови, полученных из них макрофагов и ДК.

2. Наиболее выраженные изменения фенотипических и функциональных свойств моноцитов, макрофагов и ДК у больных ТБ лёгких характерны для больных ТБ со сниженным антигенспецифическим Т-клеточным ответом.

3. Усиление продукции IL-10 и угнетение антигенпрезентирующей функции (аллостимуляторной активности) являются общими признаками дисфункций различных типов АПК (моноцитов, макрофагов, дендритных клеток) у больных туберкулезом легких.

Объём и структура диссертации:

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и результатов исследования, 3 глав

Выводы

1. Больные туберкулёзом легких характеризуются изменением фенотипических и функциональных свойств циркулирующих моноцитов, о чем свидетельствует снижение экспрессии ко-стимуляторных молекул (CD86) и антигенов ГКГ II класса (HLA-DR), увеличение субпопуляции CD14+CD16+ моноцитов и появление супрессорной активности моноцитов.

2. Супрессорная активность моноцитов характерна для пациентов со сниженным антигенспецифическим ответом и опосредуется вовлечением CD14+CD16+ клеток, что подтверждается более выраженным увеличением их количества у PPD-ареактивных больных, преимущественной локализацией IL-10-позитивных клеток во фракции CD16+ моноцитов.

3. Снижение экспрессии ко-стимуляторных молекул (CD86) и антигенов II класса ГКГ (HLA-DR) в культурах макрофагов PPD-анергичных больных и отсутствие указанных изменений у пациентов с сохранным пролиферативным ответом МНК на PPD указывает на нарушение дифференцировки/созревания макрофагов у больных с дефектом антигенспецифического ответа.

4. Макрофаги, полученные из моноцитов больных со сниженным антигенспецифическим ответом, характеризуются нарушением антигенпрезентирующей и цитокинсекретирующей функций, что подтверждается усилением спонтанной продукции макрофагами IL-6 и LPS-стимулированной продукция IL-10, а также снижением аллостимуляторной активности макрофагов.

5. Больные с активными формами туберкулеза легких характеризуются снижением эффективности IFNa -индуцированной дифференцировки и созревания ДК в культуре in vitro, о чем свидетельствует увеличение в культурах ДК относительного содержания клеток с маркером моноцитов (CD 14) и уменьшение доли зрелых активированных ДК, экспрессирующих молекулу CD25, а также количества клеток с рецептором к IL-3 (CD 123).

6. Изменения функциональной активности ДК проявляются рядом общих (свойственных для больных туберкулезом легких в целом) и частных (характерных для больных с дефектом антигенспецифического ответа) дисфункций. К первой категории относится снижение продукции дендритными клетками IFN-y, IFN-a и нитрооксида, ко второй - усиление продукции IL-10, угнетение аллостимуляторной активности ДК, снижение Th-1- и усиление ТЪ2-стимуляторной активности ДК.