Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Межклеточные взаимодействия и множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток

РГ8 од

РОССНПСПАЯ АКЛДБииЯ UEMIUItllCIÜiX НАУК

опкологтЕсюш нлуччия центр

На правах рукояти УМ 616 018-006. 04-085. 277. 3-002. 4:577. 352

ejihcekimoba ajiiia валерьевна

ттшггочник взмиодепствия и шюиественная

ле11л1хтпк1шлп устойчивость опухолевых клеток

14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учепой степени кандидата биологических наук

uockba 1305

Работа выполнена в лаборатории генетики опухолевых клеток Н кшщерогенева Онкологического научного центра РАИН

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор А. А. Ставровская

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Е П. Копнин доктор биологических наук А. В. Зеленин

Ведунье учреадеиие: Мздико-генетическиЯ научный центр РАЫН Институт генетики человека

на заседании специализированного Ученого Совета / К. 001.17.01/ ОНЦ РАМН / 115478 Иэсква, Каонрское изссе, 24 /

Зшцкта состоится

Ученый секретарь специализированного Ученого Совета доктор медицинских наук, профессор К С. Турусов

/стула гссгь араблзит

Данная работа посвяцена исследованию механизмов возникновения и раавитг кноквственной лекарственной устойчивости (ЫЛУ) в гетерогенных популяциях опухолевых кгеток. Хорошо известно, что всякая влокачественная опухоль гзтерогеина по своему составу (Норрпвг 1982). Генетические события, определяющие опухолевуо прог («ссию, дают воэиояиость отдельным субпопуляциям с повывенньм злокачественный потенциалом размножаться: нарастает инвазия, клетки «етастааируггг, развивается лекарственная резистентность. . На продвинутых стадиях опухолевой прогрессии днссеминация опухолей и резистентность к хишопрепаратаи являются основной причиной неудач в лечении злокачественных новообразований Это делает особенно необходимым исследование .шсарствениой устойчивости опухолевых клеток и закономерностей, определяющих ее развитие в клеточных популяциях, где могут присутствовать как резистентные к хишопрепаратан, так и чувствительные клетки.

..Одним из белков, обуславливающих устойчивость опухолевых клеток к лечению, является Р-гликопротеин (Pgp), повышение функции которого . приводит к резистентности опухолевых клеток к широкому кругу лекарственных препаратов (винка-алкалоиды, колхицин, антрациклины, подофилотоксины и др.). Хотя в последние годы обнаружены и другие белки, обуславливающие ИЛУ, лекарственная устойчивость,связанная с гиперэкспрэссией Pgp, остается в центре внимания исследователей (Bradly, Ling 1994). Это. объясняется тем, что ответственность данного типа лекарственной устойчивости за неудачи химиотерапии некоторых злокачественных новообразований показана (Goldstein et al. ,1989, Chan et al. ,1991). Кроме того, Pgp представляет собой весьш консервативный, сохранившийся в эволюции белок, определяющий одну из важных защитных систем клетки. Изучение этого белка и связанной с ним МЛУ представляет существенный интерес для фундаментальных исследований. В послед-ие годы достигнут значительный прогресс б понимании механизмов регуляции гена ШРЛ,

- г -

кодирующего Pgp (Simon and SchindlerД994,Chin et al.,1995). Однако, на клеточном уровне исследования регуляции Pgp проводятся, в основной, на гомогенных по признаку резистентности к препаратам сублиниях клеток, полученных путем многоступенчатой селекции клеток in vitro лекарственными веществами. Исследования механизмов развития Pgp-оОусдовленной Ш1У в гетерогенных клеточных популяциях, т.е. в условиях, приближенных к ситуациям, сущэствувдим в опухоли, практически не проводились. Эти исследования необходимы, поскольку показано, что межклеточные взаимодействия играют важную роль в различных биологических, процессах: дифференцировке, пролиферации, прок лении метастатического потенциала клеток, развитии различных типов лекарственной устойчивости. Исследования роли межклеточных взаимодействий для поддержания и/или возникновения Pgp-опосредованной ШУ позволяют перевести изучение этого типа лекарственной устойчивости на новый уровень - уровень клеточных популяций. Эти исследования цэгут дать сведения о том, как регулируется Pgp в организме.

Цели и вадтн исследования: целью кашей работы было исследование влияния межклеточных взаимодействий на развитие и поддержание множественной лекарственной устойчивости в гетерогенных клеточных популяциях.

Основные вадачм исследования:

Определить: 11 влияют ли взаимодействия между КХ-резистентными и КХ-чувствительными клетками на чувствительность последних к. цитостатикам;

2. изменяются ли активность Pgp при взаимодействиях КХ-чувствителных и КХ-резистентиых клеток;

3. каковы закономерности этих взаимодействий;

4. какие механизмы определяют влияние резистентных клеток на чувствительные.

Научная поттпа л практическая ценность работы: Использованные подходы позволили впервые показать, что взаимодействия между . чувствительными клет1сами и клетками, обладающими МЛУ, могут приводить к повышению устойчивости чувствительных вариантов' к цитостатикам. Впервые показано, • что межклеточные взаимодействия приводят к повышению экспрессии Pgp клетками и к увеличению его активности. Были определены вакономернности и механизмы, обуславливающие данный эффект. Впервые показано, что висогарезистентные варианты вырабатывает растворимый фактор, активирующий работу Pgp и повышающий экспрессию белка в чувствительных клетках. Таким образом, в данной работе впервые обнаружено, что регуляция Pgp, одной из важнейших защитных систем клетки, может осуществляться в результате влияния одних клеток на другие. Наши данные позволили подойти к исследованию МЛУ на популяциониом уровне.

Апробация работы; Диссертация апробирована и рекомендована к защите на совместной конференции лабораторий генетики опухолевых клеток и цитогенетики НИИ канцерогенеза. Основные положения работы были преде, авлены на Симпозиуме. < Современные тенденции в вирусологии и иммунологии опухолей>, посвященном 100-летию Л. Л. Зилъбера (Москва, 1994),'1 Международной конференции «Reversal of multidrug resistance in сапсог> (Швейцария,1994), V Международном Конгрессе <Anti-cancer treatmano (Париж,. 1995), Мелздународной конференции <Drug Resistance in Cancer>(Дублин,1995), Всероссийском Симпозиуме «Биология клетки в культуре> (Санкт-Петербург, 1995). Публикации: По теме диссертации опубликовано 6 работ. Структура и оОъвч доссетацит диссертационная работа состоит из введения, -обзора литературы, ;рзультатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и библиографии. Материалы диссертации изложены на 121 стр, работа иллюстрирована 7

гиОл. и £8 рис.

МАТЕРИАЛЫ М МЕТОДЫ

Дм исследования межклеточных взаимодействий в смешанных культурах необходимо , чтобы исследуемые линии различались пг> * генетической метке. Ш выбрали известную систему; в которой используется дефект по ферменту гшюксантинфосфорибоьилтрансферазе (ГФРТ) (SzybalsKi and Szybaisk . 1902). Этот дефект позволяет npii помовд набора селективных оред разделять клетки, отличаодиеся do атой генетической метке. 1. селективные среди

1.ГАТ - стандартная среда, содержащая гипоксантин 13.6 мкг/ид, аминоптерин 0.176 мкг/мл, тимидин а 876 мкг/мл (Flow) испольвовалась для выявления ГФРТ+клеток, способных расти в данных условиях, клетки ГФРТ'на ней погибают;

2. среда с 6ТГ- 6ТГ (Sigma) 1 мкг/мл г» использовалась, для выявления ГФРТ клеток . клетки ГФРТ^на ней погибают;-

а среда с КХ - КХ (Merck) с концентрациями от 0.001 до 0.05 мкг/мд;

4. ГАТ + КХ- среда - содержала компоненты ГЛТ и КХ в раадичньа

♦

концентрациях, позволяла определять влияние колхицина на ГФРТ клетки в смешанных ку ьгурах,

5. 6ТГ + КХ - среда содержала компоненты 6ТГ и КХ. позволяла определять влияние колхишна на ГФРТ клетки в смешанных культурах.

Основная модель - эмбриональные фибробласты джуигарского хомячка -"ЭФ-4/21, трансформированные вирусом SV-40 (Каклакова и др. ,1072). Из этой исходной линии получена сублиния ДУ-15, которая характеризуется ГФРТ-негативным фенотипом (Какпакова и «р., 1976). В дальнейшем из линии ДМ-1Б были получены все резистентные к колхицину . сублинии.

- 5 -

2. Липни izeqtok, гхиюлъвосаппые в рзбото: ТАБЛИЦА 1.

наос. видовая и генетическая рост рост уровень тканевая штка на на устойч.

принадлежность (акт. ГФРТ) 6ТГ ГАТ к КХ

ДЭФ-4/21 фзгбробластн дгунгарского • хомячка ГФРТ+ - + 1

SU-15 _ « _ ГФРТ" - 1

ДУ-0.1/1 . н _ ГФРТ" + - и

ДМ-7/1 _ и _ ГФРТ" + - 1000

да-бо/1 — — ГФРТ" + - 4420

М- 500/1 _ II _ ГФРТ" + - 42600

l.fcA RH 7777 гепатоиа ГФРТ+ - + 1

крысы

ИЕТ - SR- РК- Ш1- 20-1 ГФРТ+ . - + 23

(2ПК-20-1) ' 'фгбробласты с1фийского хомяка

its взланош человека ГФРТ4" — > ' 1'

rS-0.5 ' _ II _ ГФРТ+ - 130

3. Ко-культпвировапна чупствгг^е^иих и разистептпих я колхшщпу

ахеток Смесь чувствительных и резистентных клеток высевали на

5

чашки диылетром 35 или 90 мм Costar) по 5-6x10 клеток на чашку, (120-160 клеток/ьмг - в плотной культуре и 20-30 клеток/мм2- в редкой). Через 24 часа после посева клеток стандартную среду уеняли

на Сессывороточную и клетки культивировали в ней последующие 48 часов. Затем клетки высевали на селективные среды для анализа эффективности образования колоний (ЭОК). Схема опыта представлена на щс. 1

ДЭФ-4/21

ДИ-РЕЗ

кот роль

6ТГ

1А"Г ГА7 + КХ коипродь 6ТГ

ДЭ0>-4/21 + ДМ-РЕЗ

контроль

6ТГ

ГАТ

ГАТ + КХ

Рис. 1. Схема ко-культивирования чувствительных и резистентных к КХ клеток: 1 - чувствительные к КХ клетки, ГФРТ ; 2 - резистентные к КХ клетки, ГФРТ ; 3 - смесь чувствительных и резистентных клеток.

Для определения влияния КХ-устойчивых клеток на чувствительные при их механическом разделении чувствительные и резистентные клетки высевали в чашки, разделенные перегородками на сектора. В данных условиях клетки не могли непосредственно контактировать друг с другом, но культуралъная среда была обшей. Контрольные культуры

засевали отдельно. Культивирование проводилось в течение 3 суток. á.Auwsí3 c^stmmnacTH образования rzoxomtfi (ЗОН): Для оценки SOR клетки всех культур высевали в количестве 200- 1000 клеток/ чашку 35мм (Costar) на селективные среды и 1Шкубировали при +37 в БХ СС^в течение 7-8 дней, колонии окрашивали краской Гимза и подсчитывали при увеличении в 24 раза

5.Ноучоппз DJniamtn срзди, пзпдтиюпироошпоП рэпиетопгтта клоткоия па пуЕЪтюпхзлыюсть глотах к !ÜL- Собирали . несколько вариантов сродн, в которой культивировали резистентные (или кинтролышз). клетки (кондиционированные среды или И-средг 1) полную среду na которой росли чувствительна и резистентные 'клетки (с cuuopoTicoíl). ссб!фали через 48 или 72 их культивирования и фильтровали чзреэ нэгйраны 0.22кзш (Millipore), 2) при достипмпш клетками ¡.шослоя среду шняли на бессывэроточиую, клетки культивировали на ней 24 ч., затем среду собирали и фильтровали. Влияние К-сроды на чувствительность клеток к цитостатикам определяли двуш методами: анализом ЗОН (как описано выше) и при использовании ШТ-теста

О. UTT-7at&: ютлоримэтрический .метод оценки цитотоксической

*

активности препаратов с поноць» НГТ (ШТ-тест) проводили по методу (Carmichaol et al. ,1987).

7. !!з1тзрэппэ схпптости Р-глняопротоппа (Pgp):

а) оценка выведения клетками Родашша123 : Для оценки активности Р-ЕГР использовался флуоресцентный краситель Родамин123 (Sigma) и FACScan (Bectoñ Dickinson) анализ (E&udina et al., 1994).

б)оценка накопления чюченного Н-винбластина: проводилась по методу, описанному в работе (Erokhlna et al.,1994).

S. Яйспка окспрвссли Pgp с похос&п иоиокюпавышх аптитед~ (ЦкЛТ) it Pgp: использовали ЖАТ UIC2 к Pgp человека, любезно предоставленные доктором Б. Б. Шчетнером, на фиксированных препаратах по общепринятой методике, используя непрямой

ишфноиерокскцазиый метод.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЩЩШ 1. Совшетвое культквнровааж чуветвятежьвих и висоюоревнстептви. клеток: вямявио ва вихютпиость чувстпитольпих платок в с рода с вояхнцивои Была определена зависимость ЭОК клеток ЕЭ5-4/21 от присутствия в среде КХ, как растущих отдельно, так и посла их совестного культивирования с вьеокорезкстектныш клетками суййшшн Ш-600/1. Результаты одного из таких экспериментов представлены в Та0л2. Определение ЭОК подтвердило, что ГФРТ+ клетки ДЭФ-4/21 не способны расти на среде, содержащей 6ТГ, но формируют колонии на среде ГАТ. Исследование юрфологки выроста колоний подтверждает этот вывод, поскольку чувствительные и резистентные клетки существенно различались по морфологии. Колони» клеток, выростах ва среде с 67Г, имели морфологию, характерную для клеток №600/1, тогда как колонии клеток, выросших на среде ГАТ и ГАТ+КХ, не отличались от ДЭФ-4/21. При воздействии КХ число колоний клеток ДЭФ-4/21 на среде ГАТ снижалось более,чей на 30Z В то же время, те же самые клетки после их ко-культивирования с резистентньш формировали колонии на среде ГАТ с КХ с более высокой частотой. Били проведены эксперименты по ко-культивированию с использованием других линий клеток дхунгарского хомячка с высокими уровням» устойчивости в качестве резистентных партнеров. Чувствительный! клетками служили клетки линии ДЭФ-4/21. Эффект увеличения ЭОК чувствительных клеток на среде с КХ. наблюдался во • всех экспериментах при ко-культивировании с клетками ДМ-7/1, ДЦ-50/1 и ДИ-БОО/1. С каждой сублинией проведено не менее 3 экспериментов.

'аблица 2

Эффективность образования колония КХ-чувствительных (ДЭФ- 4/21), К-розкстентных (ДЦ-500/1) клеток и их смеси на различных ;еле!стивнш средах (среднее число колоний на 200 посеянных клеток)

Селест, сроды ДИ-500/1 ДЭФ-4/21 ДМ-4/21 + ДМ-500/1 после 3- дней ко-культивирования

Контроль • заз± ю.о 22. 0±2. Б 42. 3±10. 2

6ТГ 13. 0± 2. 9 0 24. о+а 1

ГАТ 0 16.3+1.7 18.0±1. б

ГАТ+КХ:

Э. Olí.ocr/üi - 11.2t 1.2 20. 3t 1.1

Сравнение средних значений проводили по критерии Стьщента . ззличия достоверны при Р-0.001.

ия большей демонстративности ш ввели понятие - Индекс ииваемости клеток ДЭФ-4/21 на среде с 0.01жг/мл КХ (JIEX) • эоз; на среде с КХ (ГАТ+КХ)

IHK--:-:- X 1001

ЭОК на контрольной среде (ГАТ)

¡ушарные результаты по всем опытам приведены на pro. 2 T&oi» ¡разом, ко-культивирование с клетками высоко резистентных- линий, «водило к повышению устойчивости чувствительных клеток" » КХ. Это вышение составляло от 1.7 до 2.2 раз, что соответствует начальным! овняы развития МЛУ.

ивк

Рис.2. ИВК клеток линии ДЭФ-4/21: светлые столбики- ДЭФ-4/21 контроль, темные столбики - после ко-культивирования в плота культуре с резистентными к колхицину клетками линий: 1 - ДМ-7/1; - ДИ-50/1; 3 - ДМ-500/1

г. Исследование ваконочериостеИ, определяющих влияние ревистевтиих клеток па чувствитольаие

а) Исследование видовой специфичности эффекта: влиян резистентных клеток джунгарского хомячка на чувствительные клет гепатомы крысы линии ЫсШ7777. На рис 3. приведены данные одно из таких экспериментов. Видно, что ко-культивирование с клетка линий ДМ-7/1 и ДМ-500/1 приводило к значительному увеличение И клеток МЬШ7777, на клетки влияли оба резистентных партнер Эффект ко-культивирования в этой системе приводил к увеличен ИВК чувствительных клеток МсШ7777 в 3-3.5рааа, что выше, чей системе с использованием клеток ДЭ&-4/21 в качест чувствительного партнера Вероятнее всего это обьясняет тканевой принадлежностью клеток крысы: известно, что клетках печени наблюдается повышенная экспрессия гена МЭР и он, по-видимому, может«, активироваться легче и интенсивне

там образом, эффект воздействия резистентных клеток на гойчивость к XX чувствительных вариантов не зависит от видовой гшадлеяноети чувствительных клеток.

350

зоо

250 200 150 100 50 О

1 2 3

НС. з:. ИВК клеток гепатомы крысы ЛЙНШ )<feARH7777: 1 - McARH7777 ятроль; 2 - после консулы газирования с резистентными к КХ гтками Л1шии Ж-7/1; 3 - после ко-культивиробания с клетка)® п!и ДМ-500/1

I Завис ишсть эффекта от уровня устойчивости резистентных клеток: i того, чтобы проверить будут ли влиять на устойчивость зствительных клеток к КХ клетки с невысокими уровнями зистентности в качестве партнеров с МЛУ были выбраны две линии эток: ДМ-0.1/1 и 2ПК-20-1 ( уровень резистентности 11 и 23 раза этветственно)'. Анализ ЭОК. показал, что ИВК - клеток не зличивается при ко-культивировании данных линий (рис.4). Это -сазывает, что клетки с невысокими уровнями устойчивости не здействуют на чувствительные варианты. Возможно это влияние более збо выражено и данными методами не регистрируется.

ивк

ч ь , V i Г

т

< < * А ^ ' * ^ > ч i S * \ ! <> Й4 <

1 S 1 - ^

г-i- I [ 1 •

1 ]

—±—

•

X У д

.ц.

1 шш ¿1Л А 1 1

1 2

Рис. 4. ИВК чувствительных к КХ клеток длунгарского хошч}са: 1 -ю-культивирование клеток линии ВЭФ-4/21 с клетками ДЦ-0.1/1 (светлый столбик - контроль, темный - после ко-культивирования); 2 - ко-культивирование клеток линии ДМ-15 с клеткаыи 2ПК-20-1 (светлый столбик - контроль, темный - после ко-культивирования). 3. Нсследовапио механизмов» определяющих влияние резнстситвих клеток па устойчивость чувствительных вариантов к колхицину:

а) Изучение зависимости изменения чувствительности клеток к КЯ от контактов между резистентными и чувствительными клетками. Анализ ЭОК показал, что ИВК для клеток после ко-культивирования при редкой плотности эасева также увеличивался по сравнению с ИВК клеток, росвих отдельно. Уровень повышения ИВК был практически такой хе, как и опытах по ко-культивированию в плотном аасеве. Совместное культивирование чувствительных и резистентных клеток в чашках, разделенных на сектора (т.е. исключение непосредственных контактов между клетками) также не снимало эффекта появления резистентности к КХ у клеток линии ДЭФ-4/21, ИВК повышался практически на ту же

величину. Эти данные даст основание предположить, что повышение резистентности к ' цитостатику после ко-культивирования КХ-чувствительных и КХ-резистентных клеток не требует непосредственных контактов между клеткам!! и происходит 8а счет выделения резистентными клетками в культурадьную ср^ду какого-то растворимого фактора

б) Влияние среда, юшдициоинрованной резистентными клетками

(К-среды) на устойчивость чувствительных кяеток к КХ. Данные

/

экспериментов со средой, кондиционированной резистентными клетками, (К-срздой) подтвердили предпологвние о том, что повышение устойчивости клеток к цитостатику происходит за счет выделения резистентными клетками растворимого фактора(ов). Анализ ЭОК показал, что после 3 дневного культивирования клеток ДЭФ-4/21 в К-среде, полученной от выокорезкстентных клеток ддунгарского хомячга, чз'сло колоний с среде с КХ увеличивалось: их ИВК был вьгаэ, чем у тех же клэток, росши па К-среде от чувствительных клеток. Однако, величина повышения ИВК в этом случав была несколько шш>, чем при непосредственном ко-культивированин (в 1.4-1.5 и 2 раза, соответственно) (рис.5). Это иолно объяснить разными причинами, например, частичной инактивацией данного фактора при переносе среды и снижением его концентрации. Нужно заметить, что в работах по изучению выделения клетками ростовых факторов такта отмечалось менее выраяэнное действие К-среды, содеряащрй ростовые факторы, по сравнению с непосредственными контактами между клетками (Ставровская и др., 1986).

Чтобы проверить, Судет ли воздействовать К-среда на устойчивость чувствительных клеток не только к КХ, но и другим препаратам круга шу, мы применили ИТТ-тест. Щри воздействии К-среды, полученной от высокорезистентной линии ДМ-500/1, устойчивость клеток линии ДЭФ-4/21 как к КХ, так и другим препаратам круга 1Ш - винбластину

и винкристину увеличивалась. При воздействии среды, кондиционированной высокорезистеитньш клетками устойчивость клеток меланомы человека линии ггб к колхицину, винбластину и винкристину такяе повышалась. Это ещэ раз подтверждает, что воздействие носит невидоспецифический, достаточно общий характер.

120

ивк

Рис.5. ИВК после роста на различных. К-средах: светлые столбики-

ДЭ<Еь4/21 после роста на К-среде от чувствительных клеток; темные -ДЭФ-4/21 после роста на К-среде от резистентных клеток 1- линии ДМ-7/1; 2- линии ДО-500/1

4. Исследование функции Р-гллкопротеяпа после взаимодействия ЯЛ-чувствительних и КХ-резистевтних вариантов.

а) Исследование выведения клетками Родамина123. Следующим этапом работы было выяснение причин повышения устойчивости к колхицину клеток линии ДЭФ-4/21 после их ко-культивирования с резистентными вариантами: мы проверили, изменяется ли при этом активность Р8р. Известно, что активность РВр может быть оценена по интенсивности

выброса из ююток флуоресцентных красителей (ИеуГакЬ еЬ а1. .1989, ЕдисИпа е1 а1. ,1993). Нлетки, не зкспрессирувдие этот белок, после обработки Родамином123. отмывания и последующей инкубации в среде без красителя не выбрасывают его и остаются окрашенными, тогда как резистентные клетки с активно работащиы Ргр/ выбрасывают флуорохром „ и становятся темными..

Рис.6. Интенсивность флуоресценции клеток после выброса Родамина123: а) ДЭ&-4/21; б) ДИ-7/1; в) смесь ДЭФ- 4/21 +№7/1, составленная непосредственно перед экспериментом; г) смесь ДЭФ-4/21*ДИ-7/1 после 3 дней ко-культивирования.

На рис. в видно, что КХ-резистентные клетки выбрасывают Родамин123 более интенсивно, чем чувствительные (рис.6а,0; -'сигнал от КХ-реэистентных клеток смещен в< левую, более <теыную> область графика). Кривая на рис.бг (интенсивность флуоресценции смаси КХ-резистентных и КХ-чувствительных клеток после 3 дпэй ко-культивирования) отличается от кривой на рис. бв (интенсивность флуоресценции тех яе клеток, смешанных непосредственно перед опытом). Видно, что после ко-культивирования .количество клеток с более низкими значениями интенсивности флуоресценции увеличивается по сравнению со смесью, приготовленной непосредственно перед оптом. Это показывает, что в смешанной популяции клеток после ко-культивирования увеличена фракция клеток с активным Рет>.

б) Исследование накопления клетками н-вннб ластика.

функциональную активность ррр в клетках оценивали также по кх способности накапливать 'н-винбластин в присутствии и без верапамила. Верапамил, конкурируя с винбластином за специфическое место связывания на белке, способствует накоплению цитостатика в клетках, экспрессируидих Р^р. Анализ накопления 5Н-винбластина проводился после культивирования клеток в К-средах в течение 3 суток. Суммарные данные трех экспериментов приведены в Табл.3

После роста в К-среде, полученной от резистентных клеток, аккумуляция меченного препарата клетками линии дез>-4/21 снижалась на 25Х по сравнению с теми же клетками, росшими на среде, полученной от чувствительных клеток. Верапамил повышал накопление винбластина как в контрольных, так и обработанных К-средой клетках, что говорит в. пользу того,, что данный эффект реализуется через активацию Рвр

Таблица 3.

Влияние среды, кондиционированной резистентными клетками, на накопление клетками ДЭФ-4/21 ^Ьвннбластина

содержание вгагбластина в клетках Клетки (пикомоль/мг белка/ЗОмин)

- верапашл +верапамил(2.5x10 Ю

ДЭФ-4/21 5.2 t 0.1 6.5 + 0.1

контроль

ДЭФ-4/21

К-среда 4.0 ± 0.07 Б. 6 ± 0.03

ДЦ-500/1

5. Нссходовшио урошш сяепрэссня F-cxjiT&tjpoTcnna при m-nyjaT'miipoEanmi гсхэтогс troxanotsit гхтяг cS с геггтгепхгг/ ДО-500/1 о по1Х)цьп UkAT. Следуюгяы патом было ревзние вопроса, га ¡меняется аи экспрессия Porp при воздействии внсокорезистентных клеток на чувствительные варианта Дяя этого была выбрана следуппдя система: чувствительные клетки иэлалоиы человека + резистентные клетки цяунгарского хомячка, что позволило при помощи видоспецифичных ükAT четко дифференцировать чувствительшэ и резис-житные варианты. Для эценки экспрессии Pgp использовали ütAT к Pgp UIC2. Эти ШАТ видоспецифичны и связываются только с Pgrp человека, что позволило проводить . реакцию в сlkсанной культуре, при этом все клетки линии Щ-500/1 были не о крапе ны. Кромэ того, иорфо логические особенности г акте помогали хорош различать клетки линий ДО- 500/1 u cS. Оценку

проводили при ув. XI00, подсчитывали число окрашенных и неокрашэннь клеток на каждом стекле. Было проведено три 8кслеришн?а, на кадду точку - не менее двух повторов, на каадом стекле аналиэировш окраску 200 клеток линии л£. Контролем служили клетки, обработали*, только вторыми АТ (неспецифическое окрашивание). Данные г связыванию ИкАТ ШС2 клетками пб приведены в табл. 4.

Таблица4 Количество чувствительных клеток -меланомы, окралгеннь ШАТ ШС2 после ко-культивирования с высокорезистентными к Г клетками:

вариант I окрашенных

опыта клеток

пб 3. 42И.10

совм. рост

пб 1а 271 4. 79

+

ДМ-500/1 ■0

пб-0.5 81 271 2.25

Как видно из данных, приведенных в таблице 4, число клетон меланомы, которые связывают моноклональные антитела ШС5 значительно увеличивается (практически в 4 раза) после совместно: культивирования с кетками ДМ-500/1. Клетки линии пб-О. 5, обладают* уровнем резистентности к КХ 130 раз практически все (более802) бш окрашены. Клетки линии ДМ-500/1 не окрашивались. На основе этог можно сделать вывод, что количество клеток, экспрессирущих Рдр

эзрастает в популяции клеток rS в результате воздействия на них J20K0 резистентных клеток ДУ-500/1.

З8удьтаты, приведенные в этой разделе свидетельствуют о том, что зэдействие резистентных клеток на чувствительные приводит к зеличенню. активности Р-гликопротеина. Pgrp активируется под зздействиеи растворимого фактора(ов), выделяемого ¡¡сокоревистентными кдеткаии и содоргшзэгося в кудьтуральной среде, згда наш работа была выполнена, появились данные Fidler et al L994) о возютазсти изменения ответа опухолевых клеток на шиотерапию под воздействием органного микроокругвния. Авторы ;лагтг предположение, что цикроокружение индуцирует гр-ассоциированный фэнотип в опухоли под воздействием )гакоспоциф:{ческих щггокинов, но не связывают данный эффект с ззмошостьо влияния резистентных клеток на чувствительные. Совсем здавно появилась работа, в которой авторы изучали влияние клеток, Зладаюпщх УЛУ, на чупствитольныэ варианты. Однако в их системе &фэкта повышения резистентности найдено не было, что может быть зпзоно с особенностям! выбранной подели и уровнем резистентности соточшя линий." (Bradloy and Pitts, 1994). Полученные нами данные зидетельствуюг о той, что Рагр мояэт активироваться не только гготоксическими веществами, но н факторами, выделяемыми клетками, tor фактор, воздействующий на активность Pgp, вырабатывается йокоревйстентными клетками ДУ-7/1, ДО-БО/1 и ДО-500/1. Все эти тин имеют общее происхождение (Абдряшитов и др. ,1989). Вопрос о зм, характерно ли выделение такого фактора для клеток других линий классическим ткпой ЦЛУ, требует дальнейшего изучения. Излученные гзультаты подтверждают, представление о- том, что различные геточные . системы защиты иогут функционировать на многоклеточном эовне. Эти данные важны как для понимания возникновения и задержания ЫЛУ в клеточных популяциях в опухолях in vivo, так и

• - 20 -

регуляции работы Ргр в нормальных тканях. Вопрос о природе I свойствах Рдо-регулирующего фактора нуждается В' дальнейшее изучении.

ВЫВОДЫ

1. Совместное культивирование чувствительных и высокореаистентиых » колхицину фибробластов длунгарского хомячка поЕыааеТ устойчивост! чувствительных клеток к цитостатику. Повышение устойчивост! чувствительных клеток к колхицину не наблюдается при их совместно) культивировании с низко реаистентными к препарату клетками.

2. Извинение устойчивости клеток к колхицину не зависит от видово; и тканевой принадлежности чувствительных к цитостатику клеток.

а Влияние резистентных к колхицину клеток на чувствительные н< зависит от плотности засева культур, и наблюдается при механически разделении клеток.

4.' В результате влияния высоко резистентных . к колхицину клето! джуигарского хомячка на чувствительные варианты повышаете! устойчивость клеток не только к колхицину, но и другим препарата: круга множественной лекарственной устойчивости.

5. Повышение лекарственной устойчивости происходит за сче' выделения высоко резистентьш клетками джуигарского хоыячз: растворимого фактора(ов)

6. Увеличение, устойчивости клеток к колхицину' обусловлен Р-гликопротеином: под влиянием высокореаистентиых клето джуигарского хомячка увеличивается число клеток, выводящих Родами 123, снижается накопление клетками винбластина и увеличиваете число клеток, связывающих моноклонэльные антитела

Р- гликопротеину.

7. Полученные данные показывают, что фактореы), выделяемы высокорезистентными к колхицину клетками джуигарского хомячк регулирует активность Р-гликопротеина, межклеточные взаимодействи

19ют на множественную пикаретвенную устойчивость опухолевых )ТОК.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТБИВ ДИССЕРТАЦИИ.

Ellseenkova А. V., Abdrjashitov R. I., Kakpakova Е. S. The role of ;orcellular interaction in the development of tumor multidrug ¡istance. Anti-cancer drugs, 1994, p.9,

Stavrovskaya A. A., Egudlna S. V. , Kakpakova E. S., Eliseenkova , Abdrjashitov R. I., Frolova E. Y. , Turkina А.й Test for •lycoprotein CPfirp) activity-useful tool for experimental and nical research. ibesCs in XXIJ toeting ISOBM, 1994, p. 246.

Eliseenkova A. V., Abdrjashitov R.I. , Kakpakova E. S. , vrovskaya A; A. Interaction between drug-rosistant and g-sensittve colls: the role in multidrug resistance. Tfaes&$ in th International Congress on anti-cancer chemotherapy, 1995. 65.

Ellseenkova A.V. , Abdrjashitov R. Г., Kakpakova E. S., vrovskaya A. A. Colchicine-resistance and enchancement of lycoprotein activity after co-cultivation of drug-sensitive is with f multidrug resistant variants. Cell Biology irrational. 1995, 19, N2. p. 113-119.

3tronskaya A. A.. Fllllpova N. A. , Rybalklna E. Yu. , Egudina S. V. , il A. A. , Eliseenkova A. V., Stavrovskaya A. A. Alteration of uiln syntesis in human melanoma cells selected in vitro i'or .idrug resistance. Experiirental Tox. and Pathol.. 1995, >. 157-166.

Елисеенкова A.B. , Какпакова E.C. , "Абдрашитов P. И. , Ставропская Исследование влияния межклеточных взаимодействий на рственную устойчивость, обусловленную Р-гликопротеином. огические иеи5раии, 1995. Т. 12 N6, С. 599-607.