Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Структурные изменения в опухоли и печени мышей при нарастании множественной лекарственной устойчивости перевиваемой лимфосаркомы RLS40 в условиях полихимиотерапии

На правах рукописи

Сенькова Александра Васильевна 003490548

СТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ОПУХОЛИ И ПЕЧЕНИ МЫШЕЙ ПРИ НАРАСТАНИИ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ПЕРЕВИВАЕМОЙ ЛИМФОСАРКОМЫ М^о В УСЛОВИЯХ ПОЛИХИМИОТЕРАПИИ

00

Ы.ОЗгвТ^ патологическая анатомия 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 А ш гт

Новосибирск - 2010

003490548

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и в Институте химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН (г. Новосибирск)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук, профессор

Агеева Татьяна Августовна Зенкова Марина Аркадьевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук

доктор медицинских наук, профессор

Филимонов Павел Николаевич Шурлыгина Анна Вениаминовна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «Рд »¿¡-1- 2010 г. в «10.00» на заседании диссертационного совета Д 208.062.05 при Новосибирском государственном медицинском университете (630091, Новосибирск, Красный проспект, 52; тел.: (383) 229-10-83)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского государственного медицинского университета

Автореферат разослан « » ЯШа^И- 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

А. В. Волков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Несмотря на значительные достижения противоопухолевой терапии гемобластозов (Имянитов Е. Н., Моисеенко В. М., 2008), имеется ряд проблем, сдерживающих полноценное и максимально эффективное использование программной полихимиотерапии (далее - ПХТ): во-первых, это выраженная токсичность многокурсовой ПХТ (Sanderson Н. et al., 2004); во-вторых, это формирование в опухоли множественной лекарственной устойчивости (далее - МЛУ) - приобретение опухолевыми клетками перекрестной резистентности к цитостатикам с разными механизмами действия и внутриклеточными мишенями (Ставровская А. А., 2000). Эти две проблемы могут усугублять друг друга и значительно снижать эффективность лечения.

Резистентность опухолевых клеток к химиотерапии может быть следствием разнообразных процессов: от снижения внутриклеточной концентрации противоопухолевого препарата, обусловленного его выведением в межклеточную среду АТФ-зависимым трансмембранным белком Р-гликопротеином, являющимся продуктом гена MDR1, до нарушения механизмов апоптоза в самих опухолевых клетках (мутация или снижение экспрессии гена р53, нарушающие его проапоптотическую функцию и/или гиперэкспрессия гена bcl-2, вызывающая нечувствительность клеток к индукции апоптоза) (Filipits М., 2004).

Основные механизмы формирования лекарственной резистентности опухолей изучены и описаны в литературе, однако эти обширные знания еще в полной мере не нашли применения в практической онкологии, в частности в лечении гемобластозов, которое предполагает проведение повторных курсов ПХТ, осложняющихся прогрессированием и модификацией процессов МЛУ.

Исследование фармакокинетики противоопухолевых препаратов свидетельствует о том, что они, как и большинство лекарственных средств, подвергаются биотрансформации в печени с образованием токсических метаболитов, которые могут вызвать повреждение гепатоцитов (Jaeschke Н. et al., 2002). Поражение печени является одним из основных факторов, ограничивающих проведение программной ПХТ в полном объеме, поскольку развитие постцитостатических осложнений в этом органе может быть причиной смертельных исходов у больных в период химиотерапевтического лечения.

В настоящее время в литературе широко представлены экспериментальные исследования о влиянии цитостатических препаратов на морфофункциональное состояние печени, при этом мало работ посвящено исследованию влияния многократного воздействия комплекса цитостатиков на организм животного с опухолью, обладающей нарастающей резистентностью к химиотерапии.

з

Мембранный транспортер Р-гликопротеин (далее - P-gp) - белковый продукт гена MDR1 - обнаруживается в клетках органов, участвующих в метаболизме и выведении лекарственных препаратов, в том числе и в печени (Ambudkar A. S. et al., 1999). Изменение его экспрессии развивается в ответ на воздействие различных повреждающих агентов (Fardel О. et al., 1998; Hartmann M. et al., 2001). Данное обстоятельство может изменять процессы метаболизма цитостатиков в органах и тканях и, соответственно, влиять на эффективность лечения и токсичность ПХТ (Tan В. et al., 2000; TeradaT., Inui К., 2007).

Изучение взаимосвязи структурных изменений в печени и прогрессирования множественной лекарственной устойчивости в опухоли, возникающих после воздействия нескольких курсов ПХТ, представляет интерес как для клинической, так и для экспериментальной медицины. Указанные обстоятельства определили цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования. Изучить особенности патоморфологических изменений в опухоли и печени мышей в условиях прогрессирования множественной лекарственной устойчивости перевиваемой лимфосаркомы RLS40 в процессе полихимиотерапии.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние многокурсовой полихимиотерапии на динамику роста перевиваемой лимфосаркомы мыши RLS40 и продолжительность жизни животных-опухоленосителей.

2. Исследовать чувствительность клеток перевиваемой лимфосаркомы мыши RLS40 к цитостатикам без лечения и после нескольких курсов полихимиотерапии.

3. Определить уровни экспрессии генов, участвующих в формировании множественной лекарственной устойчивости (mdrla, mdrlb) и реализации программы апоптоза (р53, bcl-2), в клетках перевиваемой лимфосаркомы мыши RLS40 без лечения и после нескольких курсов полихимиотерапии.

4. Изучить морфологические изменения и экспрессию Р-гликопротеина в опухоли в зависимости от числа курсов полихимиотерапии.

5. Сравнить морфологические изменения и уровень экспрессии Р-гликопротеина в печени мышей при проведении многокурсовой полихимиотерапии животным-опухоленосителям и животным без опухолевого процесса.

6. Изучить морфологические изменения и уровень экспрессии Р-гликопротеина в печени мышей с лимфосаркомой RLS40 без лечения и при проведении полихимиотерапии с использованием различных схем селекции лекарственно-устойчивых опухолевых клонов.

Научная новизна исследования. Впервые показано, что проведение многокурсовой ПХТ сопровождается прогрессированием лекарственной резистентности в клетках мышиной лимфосаркомы Ш^о, изначально проявляющей фенотип множественной лекарственной устойчивости, с дополнительным снижением чувствительности опухолевых клеток к доксорубицину и винкристину, нарастанием экспрессии гена тс1г1Ь и увеличением экспрессии Р-гликопротеина на мембране опухолевых клеток.

Доказано, что повторные циклы введения цитостатиков вызывают нарушение механизмов апоптоза в клетках лимфосаркомы ЯЬБдо, выражающееся в снижении объемной плотности опухолевой ткани в состоянии апоптотического распада, гиперэкспрессии гена Ьс1-2 и изменении уровня экспрессии гена р53.

Впервые выявлено, что клональная селекция клеток опухоли с нарастанием их лекарственной устойчивости обусловливает повышение токсической нагрузки на печень, выражающееся в нарастании деструктивных изменений, снижении процессов репаративной регенерации и увеличении экспрессии Р-гликопротеина на мембране гепатоцитов.

Впервые установлено, что проведение полихимиотерапии вызывает нарастание деструктивных изменений и увеличение уровня Р-гликопротеина в печени у безопухолевых животных, и более значительное - у мышей с лимфосаркомой ИГ^о параллельно с нарастанием МЛУ в клетках опухоли.

Теоретическая и практическая значимость. Разработаны две экспериментальные модели формирования МЛУ. Достоинством модели с пассированием опухоли является возможность проводить неограниченное количество курсов ПХТ для изучения влияния многократного цитостатического воздействия на клетки опухоли. Преимуществом второй модели с проведением последовательных курсов химиотерапии является ее адекватность естественному процессу развития МЛУ.

Полученные результаты исследования дополнили новыми сведениями генетические механизмы прогрессирования МЛУ в результате воздействия нескольких курсов химиотерапии на опухоль, изначально резистентную к ряду цитостатических препаратов, что нередко встречается при лимфомах высокой степени злокачественности у человека.

Данное исследование выявило морфологические особенности поражения и динамику экспрессии Р-гликопротеина в печени в условиях многокурсовой ПХТ с нарастанием лекарственной резистентности опухоли, что может приводить к изменению процессов метаболизма лекарственных препаратов и должно учитываться при выборе подходов к лечению опухолевого процесса и методов терапии сопровождения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Проведение повторных курсов полихимиотерапии мышам с перевиваемой лимфосаркомой RLS40, изначально имеющей фенотип множественной лекарственной устойчивости, сопровождается замедлением регрессии опухолевого узла под действием противоопухолевой терапии, снижением чувствительности опухолевых клеток к цитостатикам, увеличением экспрессии генов, участвующих в формировании множественной лекарственной устойчивости, а также повышением устойчивости опухолевых клеток к индукции апоптоза под действием цитостатических препаратов.

2. Нарастание лекарственной резистентности перевиваемой лимфосаркомы RLS40 под действием полихимиотерапии вызывает повышение токсической нагрузки на печень, выражающееся в нарастании деструктивных изменений в паренхиме печени, снижении в ней репаративной регенерации, увеличении экспрессии Р-гликопротеина на мембране гепатоцитов.

Апробация работы. Материалы исследования были представлены на III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2007), на конкурс-конференции студентов и молодых ученых НГМУ «Авиценна» (Новосибирск, 2008), на Всероссийской юбилейной научно-практической конференции патологоанатомов с международным участием к 100-летию профессора П. Г. Подзолкова «Актуальные вопросы современной патологии» (Красноярск, 2008), на научной конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2008), на IV Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в онкогематологии» (Новосибирск, 2008), на III съезде Российского общества патологоанатомов «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Самара, 2009), на научной конференции «Медицинская геномика и протеомика» (Новосибирск, 2009).

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в учебный процесс и научно-исследовательскую деятельность на кафедрах патологической анатомии и гистологии, эмбриологии, цитологии Новосибирского государственного медицинского университета и в научно-исследовательскую деятельность лаборатории биохимии нуклеиновых кислот Института химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН (далее СО РАН).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, из них 2 -в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК для публикаций основных результатов исследования.

б

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 173 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 53 рисунками и содержит 10 таблиц. Библиографический указатель включает 71 отечественных и 134 зарубежных источника литературы.

Личный вклад автора. Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Лабораторные животные. В работе использовали 14-недельных мышей-самцов линии CBA/LacSto (далее - СВА) развода вивария Института цитологии и генетики СО РАН. Животных содержали в виварии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН в стандартных условиях в пластиковых клетках по 8-10 особей при естественном освещении на гранулированном корме при обычном питьевом режиме. Животных выводили из эксперимента путем дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом.

Все манипуляции с лабораторными животными проводили в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). Протокол экспериментов был согласован с Комитетом по этике Новосибирского государственного медицинского университета (Протокол №9 от 15.01.09 г.).

Опухолевая модель. Для экспериментов использовали перевиваемую лимфосаркому мышей RLS40, полученную из резистентной к циклофосфану лимфосаркомы RLS (Mironova N. et al„ 2006), Устойчивость опухоли RLS к апоптогенам была получена путем многократного перевивания рецидивов опухоли LS, возникающих после воздействия низких доз циклофосфана (Каледин В. И. и др., 2006). В результате последовательной культивации клеток линии RLS на среде с повышающейся концентрацией винбластина была получена клеточная линия RLS40, которая имеет высокие уровни экспрессии генов МЛУ и поддерживается в культуре при концентрации винбластина 40 нМ.

Экспериментальная часть. С целью изучения механизмов прогрессирования МЛУ в опухоли при различных схемах селекции лекарственно-устойчивых опухолевых клонов, а также зависимости токсического действия ПХТ от наличия опухолевого процесса и чувствительности опухоли к химиотерапии были разработаны две экспериментальные модели.

Модель № 1. Суспензию клеток опухоли RLS40 в физиологическом растворе (5х106 кл/мл) объёмом ОД мл трансплантировали мышам внутримышечно в правую заднюю лапку для формирования солидной опухоли. На 7-ой день опухолевого роста мышей делили на две группы по 15 особей в каждой. Первой группе вводили стандартную комбинацию цитостатиков (схема CHOP), второй группе животных не вводили лекарственных препаратов (контроль). Препараты растворяли в физиологическом растворе непосредственно перед использованием и вводили в дозировках, составивших 1/5 ЛДда: циклофосфан - 50 мг/кг, доксорубицин - 4 мг/кг, винкристин - 0,1 мг/кг однократно в хвостовую вену, преднизолон - 5 мг/кг в течение 5 дней внутрибрюшинно. Контрольные животные получали инъекции физиологического раствора внутрибрюшинно. На 10-е сутки после введения цитостатиков (17-е сутки роста опухоли) мышей умерщвляли, из опухолевой ткани готовили суспензию опухолевых клеток путем дезинтеграции, гомогенизации и двукратной фильтрации. В суспензии определяли количество опухолевых клеток путем подсчета в камере Горяева. Далее суспензию разводили так, чтобы концентрация опухолевых клеток составляла 5х106 кл/мл. Часть суспензии использовали для внутримышечной трансплантации интактным животным в количестве 5x106 кл/мл в объёме 0,1 мл, а часть - для приготовления первичной культуры клеток. На 7-е сутки после имплантации опухоли, подвергавшейся ПХТ, мышам снова проводили курс ПХТ (CHOP), а контрольную группу оставляли без лечения. Всего было проведено четыре пассажа опухоли на мышах с последующим введением цитостатиков.

Забор материала для молекулярно-биологического исследования производили на 7-е сутки после введения цитостатиков при первом пассаже опухоли и на 10-е сутки-при проведении остальных пассажей опухоли и соответствующих курсов ПХТ. Забор материала для гистологического исследования производили на 1-е, 3-е и 7-е сутки после проведения ПХТ при первом пассаже опухоли, на 7-е и 10-е сутки - при втором и третьем пассажах и на 7-е, 10-е и 14-е сутки после проведения ПХТ при четвертом пассаже опухоли.

Модель № 2. Мышей линии СВА делили на три группы по 50 особей в каждой. Первой и второй группе животных внутримышечно в правую заднюю лапку трансплантировали суспензию клеток лимфосаркомы RLS40 в физиологическом растворе (1х10б кл/мл) объёмом 0,1 мл для формирования солидной опухоли, третью группу оставляли без воздействия. На 7-ой день опухолевого роста мышам из второй и третьей групп вводили комбинацию цитостатиков, аналогичную модели № 1 (схема CHOP). На 7-е сутки после проведения первого курса ПХТ (14-е сутки роста опухоли) часть мышей умерщвляли, выделяли клетки опухоли для приготовления первичной культуры.

8

Оставшимся мышам как с перевитой опухолью, так и без опухоли проводили второй и третий курсы ПХТ с интервалом в 7 дней. На 7-е сутки после проведения второго и третьего курсов ПХТ (21-е и 28-е сутки роста опухоли) мышей выводили из эксперимента. В первой группе наблюдали развитие и прогрессирование опухолевого процесса без лечения.

Забор материала для гистологического исследования производили на 1-е, 3-й и 7-е сутки после каждого курса ПХТ. Забор материала для молекулярно-биологического исследования проводили на 7-е сутки после проведения очередного курса ПХТ.

Оценка эффективности ПХТ. Динамику роста опухоли в месте перевивки отслеживали, измеряя пораженную лапку штангенциркулем. Объем опухолей определяли путем перемножения трех взаимно перпендикулярных размеров опухоли. Торможение роста опухоли (ТРО) рассчитывали по формуле: ТРО (%) = (V контроль-V опыт) / V контроль х 100 %, где V контроль - средний объем опухолей в группе контроля, см3, V опыт - средний объем опухолей в группе ПХТ, см3. Также определяли продолжительность жизни (ПЖ, сутки) животных с перевитой опухолью без лечения и при проведении ПХТ.

Морфологические методы исследования. Для гистологического исследования опухолевые узлы и печень экспериментальных животных фиксировали в 10 %-ном растворе нейтрального формалина. Забранные образцы подвергали стандартной обработке: производили обезвоживание в растворах этилового спирта возрастающей концентрации, просветляли ксилолом и заключали в парафин. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Гистологические препараты изучали на световом микроскопе Axioimager A1 ("ZEISS", Германия).

Морфометрическое исследование гистологических образцов проводили согласно основным принципам стереологии в морфометрии (Weibel Е. R. et al„ 1979; Автандилов Г. Г., 1990). На световом уровне стереометрические параметры ткани печени и опухолевых узлов высчитывали при увеличении микроскопа 400 или 1000 раз с использованием закрытой тестовой системы из 25 точек, подсчитывая в каждой группе 100 полей зрения. При морфометрическом исследовании опухоли определяли объемные плотности (Vv) зон некроза, апоптоза и суммарных деструктивных изменений. При морфометрическом исследовании печени подсчитывали объемные плотности (Vv) нормальных гепатоцитов, дистрофически измененных гепатоцитов, некрозов паренхимы печени, суммарных деструктивных изменений, а также численную плотность (Nai) двуядерных гепатоцитов.

Иммуноморфологическое исследование ткани опухоли и печени проводили согласно методическим рекомендациям фирмы-производителя («АЬсат», Англия). Перед реакцией иммунного окрашивания производили демаскировку антигенов тканей посредством нагревания на водяной бане в 10 мМ цитратном буфере (рН6,0), блокировали эндогенную пероксидазу 3 %-ным раствором Н202. Затем инкубировали срезы с первичными антителами к Р-гликопротеину (ab 3364, «АЬсат», Англия) по стандартной методике в разведении 1 :40. Для иммунного окрашивания использовали полимерную систему детекции с пероксидазной меткой Novolink Polymer («Novocastra», Великобритания). Ядра клеток докрашивали гематоксилином.

Оценку иммуногистохимического окрашивания препаратов опухоли и печени проводили полуколичественным методом. При исследовании препаратов опухоли, окрашенных антителами к P-gp, рассчитывали индекс метки (ИМ) как отношение числа иммуногистохимически позитивных клеток с окрашенной мембраной на 100 опухолевых клеток. При исследовании препаратов печени, окрашенных P-gp, использовали полуколичественную шкалу интенсивности окраски цитоплазматической мембраны гепатоцитов: отсутствие экспрессии -мембрана не окрашена; низкий уровень экспрессии - мембрана окрашена по периметру < 50 %; средний (умеренный) уровень экспрессии - мембрана окрашена по периметру > 50 %; высокий уровень экспрессии - мембрана окрашена полностью по всему периметру (100 %).

Определение уровней экспрессии генов mdrla, mdrlb, bcl-2, р53 методом ОТ-ПЦР. Уровни экспрессии генов, участвующих в формировании МЛУ (mdrla, mdrlb, bcl-2, р53) определяли методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с использованием в качестве внутреннего стандарта мРНК р-актина.

Для этого из первичной культуры клеток опухоли RLS40 выделяли суммарную клеточную РНК с помощью стандартной SDS/фенольной экстракции. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически (X = 260 нм), сохранность выделенной РНК проверяли с помощью электрофореза в 1 %-ной агарозе. Синтез кДНК проводили с использованием выделенной суммарной клеточной РНК, рандомизированного гексануклеотидного праймера и обратной транскриптазы M-MLV. Амплификацию проводили с парами праймеров к генам mdrla, mdrlb, bcl-2, р53 и Р-актину, выбранных с использованием программы OLIGOS и синтезированных в технологической лаборатории ИХБФМ СО РАН. Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 8 %-ном полиакриламидном геле. Полученные изображения полос обрабатывали с помощью компьютерной денситометрии (Gel-Pro Analyzer 4.0).

Определение чувствительности клеток к цитостатикам (МТТ-тест).

Чувствительность к цитостатикам клеток опухоли RLS40 без лечения и после проведения нескольких курсов ПХТ определяли с помощью МТТ-теста, который основан на способности живых клеток превращать соединения на основе тетразола (МТТ) в ярко окрашенные кристаллы формазана, что позволяет спектрофотометрически оценивать количество живых клеток в препарате.

Для этого клетки и клетки, подвергавшиеся цитостатическому воздействию, высаживали в 96-луночные планшеты по 4x104 клеток на лунку, добавляли доксорубицин (в концентрациях 0,5 - 40 мкМ), либо винкристин (в концентрациях 0,1-4 мкМ) и инкубировали в течение 48 ч при 37 °С в атмосфере 5 % С02. Затем добавляли раствор МТТ, инкубировали в течение 3 ч в тех же условиях, среду удаляли, образовавшиеся в клетках кристаллы формазана растворяли в 100 мкл DMSO и спектрофотометрически измеряли оптическую плотность. Рассчитывали концентрацию препарата, при которой погибает 50 % клеток (IC50). За 100 % принимали количество живых клеток в контроле.

Статистический анализ. Для обработки полученных результатов использовали следующее специальное программное обеспечение: Gel-Pro Analyzer 4.0, Adobe Photoshop C52, VideoTesT Morphology 5. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ статистической обработки данных Statistica MS Excel, OriginPro 7.5. Для выявления статистической значимости различий использовали параметрический критерий Стьюдента. Различия сравниваемых величин считали достоверными при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Прогрессирование лекарственной устойчивости лимфосаркомы RLS40 и токсическое действие многокурсовой ПХТ изучали на двух моделях. В модели № 1 производили пассирование опухоли от одной мыши к другой с последующим проведением ПХТ для изучения многократного цитостатического воздействия на опухоль. В модели № 2 проводили три последовательных курса ПХТ одной группе животных для изучения токсического влияния цитостатиков как на опухоль, так и на организм животного-опухоленосителя.

Влияние ПХТ на рост перевиваемой лимфосаркомы МЫШИ RLS40 и продолжительность жизни животных-опухоленосителей

Введение химиотерапии достоверно уменьшало размеры опухолевого узла, хотя и не вызывало полной регрессии опухоли в месте перевивки как при пассировании опухоли с последующим введением цитостатиков, так и при

проведении трех последовательных курсов ПХТ одной группе животных.

и

Степень эффективности действия цитостатиков была различной в зависимости от числа курсов ПХТ, воздействовавших на опухоль. Торможение роста опухоли (ТРО) после первого курса ПХТ при пассировании опухоли (модель № 1) составило 36,6 %, после второго - 58,7 %, т.е. на начальных этапах лечения наблюдалось усиление эффекта от химиотерапии. После третьего курса ПХТ индекс ТРО составил 50,5 %, а после четвертого - 45 %. Таким образом, при последующих курсах химиотерапии было отмечено снижение эффективности лечения. Аналогичную закономерность наблюдали и в модели № 2.

Гибель мышей с опухолью без лечения начиналась на 18-е сутки после перевивки опухоли и их средняя продолжительность жизни (ПЖ) составила 20,2 ± 0,4 дней, а мышей с опухолью, подвергавшейся трем курсам ПХТ - на 20-е сутки и их средняя ПЖ составила 22,2 ± 0,5 дней.

Особенности гистологического строения лимфосаркомы мыши КЬЯда в зависимости от числа курсов ПХТ, воздействующих на опухоль

Микроскопически опухолевый узел в бедре построен из мономорфных атипичных лимфоидных клеток с частыми митозами. Рост опухоли инвазивный, с разрушением мышц бедра. Метастазы опухоли определяются в печени, легких, почках и располагаются преимущественно периваскулярно.

В ткани опухоли без лечения и после проведения ПХТ наблюдали гибель клеток как путем некроза, так и путем апоптоза. При пассировании опухоли без введения цитостатиков доля апоптотических телец в ткани опухоли не изменялась независимо от номера пассажа, в то время как доля некрозов в ткани опухоли после четвертого пассажа возрастала в 2 раза по сравнению с первым пассажем опухоли. При пассировании опухоли с введением комплекса цитостатиков происходило снижение объемной плотности апоптических телец в 1,7 раза после четырех курсов ПХТ при неизменной доле некрозов, что говорит о повышении устойчивости опухолевых клеток к индукции апоптоза под действием цитостатических препаратов.

При проведении трех последовательных курсов ПХТ в ткани опухоли было выявлено нарастание объемной плотности некрозов в 3 раза по сравнению с исходным уровнем, доля апоптотических телец оставалась неизменной в течение всего эксперимента, что может говорить о снижении способности опухолевых клеток подвергаться апоптозу под действием цитостатических препаратов. В группе с самопроизвольным ростом опухоли Ы^о без введения цитостатиков было выявлено нарастание доли некрозов и апоптоза в ткани опухоли в 9,9 и 3,4 раза, что является закономерным при естественном течении опухолевого процесса.

Исследование чувствительности клеток лимфосаркомы МЫШИ RLS40 к цитостатикам после нескольких курсов ПХТ (МТТ-тест)

При пассировании опухоли доза доксорубицина, при которой погибает 50 % клеток (IC50) для опухоли после четырех курсов ПХТ увеличивалась в 2,2 раза по сравнению с опухолью, не подвергавшейся лечению, а 1С50 винкристина сначала снижалась, но после четвертого курса ПХТ возрастала в 1,3 раза от исходного уровня. После проведения трех последовательных курсов ПХТ значения 1С50 доксорубицина и винкристина увеличивались в 1,8 и 2,1 раза по сравнению с интактной опухолью. Таким образом, многократное воздействие комплекса цитостатиков на опухоль, изначально проявляющую МЛУ-фенотип, приводит к дополнительному нарастанию резистентности опухолевых клеток к цитостатикам, входящим в использованную схему ПХТ.

Определение уровней экспрессии генов, участвующих в формировании МЛУ, в клетках лимфосаркомы мыши RLS40 после нескольких курсов ПХТ

(ОТ-ПЦР)

Опухоль RLS40 характеризуется высоким уровнем экспрессии гена mdrlb (Mironova N. et al., 2006). После четырех курсов ПХТ при пассировании опухоли уровень экспрессии гена mdrlb возрастал в 1,3 раза, а при трехкратном введении комплекса цитостатиков - в 2,8 раза по сравнению с исходным уровнем (рис. 1). Экспрессия гена mdrla не изменялась в обеих экспериментальных моделях.

Различия в динамике экспрессии гена mdrlb при различных схемах селекции лекарственно-устойчивых опухолевых клонов можно объяснить тем, что пик экспрессии данного гена приходится на 2 - 3 сутки после воздействия на клетку повреждающих агентов (Islam М. О. et al., 2002). Следовательно, более сильная активация гена mdrlb будет происходить при коротких промежутках между курсами введения цитостатиков (7 дней - модель № 2), и менее выраженная - при более длинных интервалах между курсами ПХТ (17 дней - модель № 1).

Модель № 1

RLS40 ПХТ1 ПХТ2 I

Модель № 2

п

RLS40 ПХТ1 ПХТ2 ГШЗ

Модель № 1

HLS40 ПХТ1 ПХТ2 ПХТ4

Модель JV° 2

t10 2 "

RLS40 ПХТ1 ПХТ! ПХТЭ

Экспрессия гена тс1г1Ь Экспрессия гена Ьс1-2

Рис. 1. Уровни экспрессии генов, участвующих в формировании МЛУ в клетках перевиваемой лимфосаркомы КЬ84о после ПХТ

Как при пассировании опухоли с последующим введением цитостатиков, так и при проведении трех последовательных курсов ПХТ экспрессия гена bcl-2 увеличилась в 2 раза (рис. 1), что является естественным ответом на воздействие повреждающих клетку факторов, в том числе и химиотерапевтических агентов (ReedJ. С., 1997).

Экспрессия гена р53 менялась по-разному в моделях № 1 и № 2. При пассировании опухоли экспрессия гена р53 повышалась после четырех курсов ПХТ в 1,6 раза по сравнению с нелеченой опухолью, при проведении трех последовательных курсов ПХТ после первого и второго курсов введения цитостатиков экспрессия гена р53 снижалась в 4,4 раза, а после третьего -несколько повышалась. Однако гибели опухолевых клеток путем апоптоза не происходило из-за гиперэкспрессии гена bcl-2.

Полученные данные по экспрессии мРНК генов bcl-2 и р53 в обеих экспериментальных моделях представляются закономерными. В результате прогрессирования опухолевого процесса происходит отбор и накопление клеток с генетическими нарушениями, которые могут обеспечить их дальнейшее выживание (Li G., Bush J. А., Но V. C., 2000). Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что прогрессирование лекарственной устойчивости лимфосаркомы RLS40 связано как с нарастанием экспрессии гена mdrlb, так и нарушением механизмов апоптоза в опухолевых клетках.

Исследование экспрессии Р-гликопротеина в клетках лимфосаркомы мыши RLS40 без лечения и при проведении ПХТ

Интенсивность экспрессии Р-гликопротеина (P-gp) на мембране опухолевых клеток отражает степень резистентности опухоли к повреждающим воздействиям (Stouch T. R., Gudmundsson О., 2002). Иммуногистохимически было выявлено, что клетки лимфосаркомы RLS40 исходно экспрессируют Р-гликопротеин: около 30 % опухолевых клеток изначально являлись P-gp-положительными. Проведение многокурсовой ПХТ в различных режимах сопровождалось значительным увеличением экспрессии данного белка на мембране опухолевых клеток. При пассировании опухоли после проведения первого курса ПХТ количество P-gp-положительных клеток составило 55,5 + 1,5 %, после второго-76,9 ±0,65%, после третьего - 86,4 ± 1,2 %, а после четвертого курса-88,2 ± 1,5 % (рис. 2). При проведении трех последовательных курсов ПХТ также наблюдали нарастание экспрессии P-gp в клетках опухоли: после первого курса химиотерапии количество P-gp-положительных клеток составило 60,9 ± 0,5 %, после второго - 63,3 ± 0,45 %, после третьего курса ПХТ - 85,9 ± 1 % (рис. 3).

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 -

контроль 1 пассаж 2 пассаж 3 пассаж 4 пассаж га-840 И_840 + ПХТ ИЬ&Ю + ПХТ га.Э40 + ПХТ Р1_340 + ПХТ без лечения

□ Р-др - положительные клетки □ Р-др - отрицательные клетки

Рис. 2. Экспрессия Р-гликопротеина в клетках лимфосаркомы мыши 1^1^340 при пассировании опухоли с последующим проведением ПХТ

100 90

Ш

ь.

контроль без лечения

РЬЭ40 + ПХТ №1

ЯЬБ40 + ПХТ

№2

ВЬЭ40 + ПХТ

№3

□ Р-др - положительные клетки □ Р-др - отрицательные клетки

Рис. 3. Экспрессия Р-гликопротеина в клетках лимфосаркомы мыши Ю^о при проведении трех последовательных курсов ПХТ

Структурные изменения в печени мышей при пассировании лимфосаркомы Ы^о без лечения и при проведении ПХТ

В печени животных-опухоленосителей как без лечения, так и после проведения ПХТ имела место диффузно-очаговая инфильтрация опухолевыми клетками, в прилежащей ткани развивались тяжелые деструктивные и дисциркуляторные изменения: нарушение балочного строения, коллапс синусоидов, гидропическая и баллонная белковая дистрофия гепатоцитов, частые моноцеллюлярные и очаговые некрозы, центролобулярное полнокровие.

При пассировании лимфосаркомы КЬ84(| без введения цитостатиков инфильтрация ткани печени клетками опухоли сопровождалась тяжелыми альтеративными изменениями, прогрессивно нарастающими по мере роста опухоли: с 19 ± 0,9 % на 8-е сутки после перевивки опухоли до 54,2 ± 1,3 % на

15

21-е сутки роста опухоли. Причем на начальных этапах альтеративные изменения в печени были представлены преимущественно дистрофически измененными гепатоцитами, а в более поздние сроки преобладали некрозы паренхимы печени. По мере роста опухоли численная плотность двуядерных гепатоцитов снижалась в 2 раза, что свидетельствует о снижении регенерации в печени при прогрессировании опухолевого процесса.

Выраженное повреждающее действие опухолевого процесса на печень может быть связано как с инвазивным ростом клеток опухоли, сдавливающих и/или заполняющих синусоиды, так и с опосредованным действием растущей опухоли на организм опухоленосителя через развитие синдрома эндогенной интоксикации (Лосева М. И. и др., 2005).

При сравнении морфологических изменений, развивающихся в печени на одни и те же сроки при последовательных пассажах опухоли без введения цитостатиков, выявлено нарастание доли некрозов в паренхиме печени после четвертого пассажа в 1,8 раза по сравнению с первым пассажем опухоли при неизменной доле дистрофически измененных гепатоцитов (табл. 1). Численная плотность двуядерных гепатоцитов после четвертого пассажа опухоли уменьшилась в 2 раза по сравнению с первым пассажем.

Подобная динамика может быть связана с тем, что в процессе перевивания опухоли «приживаются», формируя впоследствии опухолевую массу, те клетки, в которых экспрессированы механизмы устойчивости к повреждающим воздействиям. В связи с этим можно предположить, что даже простое пассирование опухоли от одного животного к другому без введения цитостатиков ведет к нарастанию агрессивных свойств опухоли.

Таблица 1

Результаты морфометрии гистологических срезов печени мышей с перевиваемой лимфосаркомой Ш^о при пассировании опухоли без введения цитостатиков и с последующим проведением ПХТ (М±гп)

Сутки после Дистрофия гепатоцитов, Уу, % Некрозы гепатоцитов, Уу, %

проведения ПХТ | 1^40 + ПХТ КЦ>40 | МА«, + ПХТ

1 пассаж

7-е сутки 16,1 ±0,8 1 21,9 ±0,7* 19,1 ± 1 | 23,1 ±0,8*

2 пассаж

10-е сутки 22,2 ± 1,2 | 18,8 ±0,7* 25,1+0,9 | 25,9 + 0,9

3 пассаж

10-е сутки 16,2 ± 0,6 | 15,1 ±0,7 29,7 ± 1 | 27,7 ±0,9

4 пассаж

10-е сутки 17 ±0,8 | 15,5 ±0,9 33,8 + 1,3 | 30,6 ±1*

* достоверные отличия от значений в группе без проведения ПХТ при р < 0,05

При пассировании лимфосаркомы Ш^о с последующим проведением

ПХТ на начальных этапах роста опухоли (8-е сутки после перевивки) у животных была выявлена более скудная опухолевая инфильтрация паренхимы печени, при этом объем деструктивных изменений был в 1,5 раза больше по сравнению с контрольной группой животных, которым производили пассирование опухоли без проведения ПХТ. На более поздних сроках роста опухоли (21-е сутки) при проведении ПХТ объемная плотность суммарных деструктивных изменений, представленная преимущественно некрозами паренхимы печени, продолжала нарастать в 1,8 раза от исходного уровня, но оказалась меньше, чем у животных -опухоленосителей, не подвергавшихся цитостатическому воздействию, в 1,2 раза.

Подобная закономерность может быть связана с тем, что на раннем этапе развития опухолевого процесса именно цитостатики оказывают выраженное токсическое действие на органы и ткани, превосходя негативное воздействие самой опухоли, на более поздних сроках после перевивки опухоли, повреждающее действие опухоли превосходит токсическое воздействие ПХТ.

При сравнении морфологических изменений, развивающихся в печени в одни и те же сроки при пассировании опухоли с последующим проведением ПХТ, было выявлено, что при увеличении числа курсов ПХТ, воздействующих на опухоль, от пассажа к пассажу происходит изменение соотношения деструктивных изменений: если при первом пассаже опухоли, когда на опухоль и на печень воздействовал только один курс ПХТ, была приблизительно одинаковая доля дистрофий и некрозов - 21,9 ± 0,7 % и 23,1 ±0,8%, соответственно, то при четвертом пассаже, когда на опухоль воздействовало четыре курса ПХТ, а на печень - только один, объемная плотность некрозов в печени возросла в 1,3 раза, а дистрофий - уменьшилась в 1,4 раза по сравнению с первым пассажем опухоли и составила 15,5 ± 0,9 % и 30,6 ± 1 %, соответственно (табл. 1). При проведении ПХТ численная плотность двуядерных гепатоцитов после четвертого пассажа опухоли уменьшилась в 1,8 раз по сравнению с первым пассажем.

Таким образом, клональная селекция клеток опухоли с нарастанием их лекарственной устойчивости может обусловливать повышение токсической нагрузки на печень. Поэтому даже при пассировании опухоли с последующим введением цитостатиков, когда на опухоль воздействует несколько курсов ПХТ, а на печень - только один курс ПХТ, происходит более выраженное нарастание тяжелых деструктивных изменений в паренхиме печени.

Структурные изменения в печени при проведении трех курсов ПХТ мышам без опухоли и с перевиваемой лимфосаркомой Ш^о

При проведении трех курсов ПХТ как животным с перевитой опухолью, так и без опухоли были обнаружены выраженные деструктивные изменения в паренхиме печени, но динамика данных изменений в процессе многокурсовой ПХТ значительно отличалась в этих группах.

При проведении трех курсов ПХТ мышам без опухоли объемная плотность суммарных альтеративных изменений в паренхиме печени, представленных преимущественно дистрофически измененными гепатоцитами, на 1-е сутки после проведения первого курса ПХТ составила 50,8 ± 2,3 %, на 3-й и 7-е сутки - уменьшалась до 40,4 ±2,2% и 28,3 ±1,3%, соответственно. При проведении второго и третьего курсов ПХТ доля суммарных альтеративных изменений в паренхиме печени на 1-е и 3-й сутки после введения цитостатиков достоверно не отличалась от аналогичных показателей при проведении первого курса ПХТ, а на 7-е сутки составила 48,4 ± 2,4 % после второго курса и 51,6 ± 1,1 % после третьего, что в 1,7 и 1,8 раза больше, чем при проведении первого курса ПХТ (табл. 2). При подсчете численной плотности двуядерных гепатоцитов было выявлено, что на 3-й сутки после каждого курса ПХТ наблюдается более высокие значения данного показателя по сравнению с 1-ми и 7-ми сутками после введения цитостатиков (рис. 4). Амплитуда этого подъема была одинакова при проведении всех трех курсов ПХТ.

Таблица 2

Результаты морфометрии гистологических срезов печени мышей без опухоли и с лимфосаркомой И^о при проведении трех курсов ПХТ (М±т)

Сутки после Дистрофия гепатоцитов, \Ч', % Некрозы гепатоцитов, Уу, %

проведения ПХТ Безопухолевые Опухоль ИЬЗад Безопухолевые Опухоль 1*1^)40

ПХТ№1

1-е сутки 33,7 ± 2,2 40,7 ± 3,2 17,1 ± 1,1 13,5 ± 1,2

3-е сутки 24 ± 2,1 20,6 ±1,6 16,4 ± 1,4 19,2 ±1,3

7-е сутки 15,7 ±0,9 27,7 ± 1,6* 12,6 ± 1 18 ± 1,35*

ПХТ №2

1-е сутки 27,5 ±1,5 25,9 ±1,2 19,7 ± 1,7 24 ±1*

3-е сутки 26,6 ±1,7 40,7 ±2,1 17,6 ±1,4 20,8 ± 1,3

7-е сутки 31,4+1,8 29,6+1,9* 17 ±1 37,9 ± 3,7*

ПХТ №3

1-е сутки 27,2 ± 1,2 34,3 ±3* 13,6 ±1,3 40,8 ± 3,6*

3-е сутки ' 27,9 ±1,3 36,9 + 2,6* 9,6 ± 0,9 47,7 ±4,1*

7-е сутки 28,7 ± 1,2 - 22,9 ± 1,2 -

* достоверные отличия от значений в группе безопухолевых животных при р < 0,05

т ПХТ№1 ПХТ №2 ПХТ №3

Сутки после проведения ПХТ

а ПХТ □ RLS40 + ПХТ

Рис. 4. Численная плотность двуядерных гепатоцитов после проведения трех курсов ПХТ безопухолевым мышам и мышам с лимфосаркомой RLS40

При проведении трех курсов ПХТ мышам с лимфосаркомой RLS40 было выявлено, что на 1-е и 3-й сутки после проведения первого курса ПХТ объемная плотность суммарных альтеративных изменений составила 53,8 ± 3 % и 39,8 ±2%, соответственно, была представлена преимущественно дистрофическими изменениями и достоверно не отличалась от того же показателя в группе безопухолевых животных, которым ПХТ вводилась в аналогичном режиме. На 7-е сутки после проведения первого курса ПХТ животным-опухоленосителям доля суммарных альтеративных изменений составила 45,7 ± 1,5 %, что в 1,6 раза больше, чем в группе мышей без опухоли, подвергавшихся ПХТ. При проведении остальных курсов ПХТ мышам с лимфосаркомой RLS40 деструктивные изменения в печени продолжали прогрессивно нарастать, в итоге составляя около 85 % от всей паренхимы печени (табл. 2). При проведении многокурсовой ПХТ мышам с перевитой опухолью также было выявлено нарастание численной плотности двуядерных гепатоцитов на 3-й сутки после проведения каждого курса химиотерапии, но амплитуда данного подъема снижалась по мере роста опухолевого узла (рис. 4).

Таким образом, наличие опухолевого процесса оказывает значительное влияние на переносимость и токсичность многокурсовой ПХТ, что обусловлено как повреждающим воздействием комплекса цитостатиков на печень, так и действием растущей опухоли на организм животного-опухоленосителя, и усугубляется прогрессированием лекарственной резистентности данной опухоли за счет гиперэкспрессии гена mdrlb, а также за счет нарушения механизмов апоптоза в клетках опухоли, что может приводить к нарушению метаболизма и распределения цитостатиков с нарастанием их концентрации не в опухоли, а в органах и тканях, отвечающих за выведение из организма ксенобиотиков, в первую очередь, в печени.

Исследование экспрессии Р-гликопротеина в печени мышей с лимфосаркомой Ш^о без лечения и при проведении ПХТ

Печень интактных животных обладает развитой системой мембранных белков-транспортеров: суммарно доля гепатоцитов с умеренным и высоким уровнем экспрессии Р-гликопротеина (P-gp) составила около 40 % от всей популяции клеток печени. При проведении трех курсов ПХТ мышам без опухоли было отмечено нарастание экспрессии P-gp на мембране гепатоцитов: при проведении первого курса ПХТ суммарная доля гепатоцитов с умеренной и высокой экспрессией P-gp составила 55,8 ± 0,5 %, при проведении второго -58,3 ± 0,5 %, при проведении третьего курса - 63 ± 0,65 %. При отсутствии опухолевого процесса происходит постепенное нарастание экспрессии P-gp после воздействия нескольких курсов ПХТ. При проведении трех последовательных курсов химиотерапии мышам с лимфосаркомой RLS40 наблюдалось резкое и более выраженное нарастание экспрессии P-gp: при проведении каждого курса ПХТ суммарная доля гепатоцитов с умеренной и высокой экспрессией P-gp составила около 70 % от всей популяции клеток печени.

При пассировании опухоли с последующим введением комплекса цитостатиков, т. е. когда на опухоль воздействовало несколько курсов химиотерапии, а на печень - только один, отмечено увеличение доли гепатоцитов с умеренным и высоким уровнем экспрессии P-gp. При первом пассаже опухоли с проведением ПХТ суммарная доля гепатоцитов с умеренной и высокой экспрессией P-gp составила 57,8 ± 0,45 %, при втором - 59,8 ± 0,5 %, при третьем - 63,3 ± 0,5 %, а при четвертом пассаже - 64,9 ± 0,3 % (рис. 5). Таким образом, по мере нарастания лекарственной резистентности опухоли происходит увеличение экспрессии P-gp на мембране гепатоцитов как одного из механизмов защиты от повреждающего воздействия (Silverman J. A., Thorgeirsson S. S., 1995).

отсутствие экспрессии P-gp

отсутствие экспрессии P-gp

высокая

2,8%

низкая

умеренная экспрессия P-gp 45%

умеренная экспрессия P-gp

44,8%

1 пассаж опухоли + ПХТ

4 пассаж опухоли + ПХТ

Рис. 5 Экспрессия Р-гликопротеина в гепатоцитах при пассировании лимфосаркомы RLS40 с последующим проведением ПХТ

выводы

1. Введение комплекса цитостатиков уменьшает размеры опухолевого узла и вызывает увеличение продолжительности жизни животных-опухоленосителей, но эффективность полихимиотерапии снижается по мере увеличения количества курсов химиотерапии, действовавших на опухоль.

2. Многократное воздействие комплекса цитостатиков на лимфосаркому мыши Ы^до, изначально проявляющую фенотип множественной лекарственной устойчивости, вызывает дополнительное снижение чувствительности опухолевых клеток к доксорубицину и винкристину, входящим в использованную схему полихимиотерапии.

3. Повторные курсы введения цитостатиков снижают способность клеток лимфосаркомы мыши М^о подвергаться апоптозу:

а) при пассировании опухоли с последующим введением цитостатиков происходит снижение объемной плотности апоптических телец в ткани опухоли в 1,7 раза после четырех курсов химиотерапии, тогда как при пассировании опухоли без введения цитостатиков данный показатель не изменялся; при проведении трех последовательных курсов полихимиотерапии выявлено отсутствие изменений доли апоптозов в опухолевой ткани, тогда как при естественном развитии опухоли без лечения она нарастала;

б) после воздействия нескольких курсов полихимиотерапии в опухолевых клетках выявлено нарастание экспрессии гена Ьс1-2 в 2 раза и изменение экспрессии гена р53 с нарушением его проапоптотической функции.

4. Проведение многокурсовой полихимиотерапии как при пассировании лимфосаркомы ИЬБ^, так и при проведении трех последовательных курсов лечения сопровождается увеличением в клетках опухоли уровня экспрессии гена тсЫЬ (в 1,3 и 2,8 раза) и увеличением числа Р-гликопротеин положительных клеток (с 30 % до 85 % от всей популяции опухолевых клеток).

5. Введение комплекса цитостатиков животным без опухоли сопровождается развитием деструктивных изменений в печени, которые занимают до 50 % от всей паренхимы, при этом регенераторная активность печени не снижается. Проведение полихимиотерапии на фоне роста перевитой лимфосаркомы Ю^о в мышцах бедра и метастазирования данной опухоли в печень характеризуется нарастанием суммарных деструктивных изменений, занимающих более 80 % паренхимы печени, а также снижением в ней процессов регенерации.

6. Нарастание лекарственной устойчивости пассированной опухоли в результате воздействия на нее четырех курсов химиотерапии сопровождается повышением токсической нагрузки на печень, подвергавшейся одному курсу химиотерапии, что приводит к нарастанию объемной плотности некрозов

паренхимы печени в 1,4 раза и снижению численной плотности двуядерных гепатоцитов в 1,8 раза.

7. При многократном воздействии комплекса цитостатиков происходит увеличение экспрессии Р-гликопротеина на мембране гепатоцитов у интактных (безопухолевых) животных, и более значительное - у животных -опухоленосителей. Нарастание лекарственной резистентности опухоли сопровождается более выраженной активацией Р-гликопротеина в печени под действием полихимиотерапии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные в исследовании данные о прогрессировании лекарственной резистентности опухоли, изначально имеющей МЛУ-фенотип, после проведения ПХТ первой линии, а также данные о сопутствующем нарастании деструктивных изменений в печени в этих условиях должны учитываться гематологами и онкологами при лечении первично-резистентных опухолей. Полученные в исследовании данные могут быть внедрены в учебную программу на кафедрах патологической анатомии в раздел «Общие вопросы опухолевого роста», гематологии в раздел «Лечение неходжкинских злокачественных лимфом», фармакологии в раздел «Противоопухолевые препараты: механизмы действия, показания, противопоказания, побочные эффекты».

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Моделирование синдрома множественной лекарственной устойчивости в эксперименте на мышах с перевиваемой лимфосаркомой RLS40 / А. В. Сенькова, О. А. Шкляева, Т. А. Агеева, М. А. Зенкова // Бюллетень сибирской медицины. -2008.-Т. 7.-С. 113-118.

2. Варианты моделирования множественной лекарственной устойчивости в эксперименте in vivo / А. В. Сенькова, Т. А. Агеева, О. А. Патутина, М. А. Зенкова // Вестник Новосибирского государственного университета. Серия: Биология, клиническая медицина. - 2009. - Т. 7. - Выпуск 4. - С. 95-102.

3. Агеева Т. А. Динамика патоморфологических изменений и репаративной регенерации печени у мышей с перевиваемой лимфосаркомой при моно- и полихимиотерапии / Т. А. Агеева, Н. А. Попова, А. В. Сенькова // Сибирский консилиум. - 2007. - № 7 (62). - С. 153.

4. Агеева Т. А. Морфофункциональные особенности поражения и репаративной регенерации печени у мышей с перевиваемой лимфосаркомой без лечения и при введении цитостатиков / Т. А. Агеева, Н. А. Попова, А. В. Сенькова // Сибирский консилиум. - 2007. - № 7 (62). - С. 153-154.

5. Агеева Т. А. Морфофункдиональные изменения печени мышей с перевиваемой лимфосаркомой без лечения и при введении цитостатиков / Т. А. Агеева, Н. А. Попова, А. В. Сенькова // Актуальные вопросы современной патологии: материалы Всероссийской юбилейной научно-практической конференции патологоанатомов с международным участием к 100-летию профессора П. Г. Подзолкова. - Красноярск, 2008. - С. 48-51.

6. Изучение феномена формирования множественной лекарственной устойчивости в процессе ПХТ на модели перевиваемой лимфосаркомы мышей RLS40 / А. В. Сенькова, О. А. Шкляева, Н. JI. Миронова, Н. А. Попова, Т. А. Агеева, М. А. Зенкова Н Фундаментальные науки - медицине : материалы ежегодной научной конференции. - Новосибирск, 2008. - С. 141-148.

7. Нарушение апоптоза как один из механизмов множественной лекарственной устойчивости на примере перевиваемой лимфосаркомы мышей RLS40 / А. В. Сенькова, О. А. Шкляева, Т.А.Агеева, М. А. Зенкова // Актуальные вопросы патологической анатомии: материалы III съезда Российского общества патологоанатомов. - Самара, 2009. - С. 456-458.

8. Токсическое поражение печени при полихимиотерапии лекарственно-резистентного опухолевого процесса / А. В. Сенькова, Т. А. Агеева, М. А. Зенкова, О. А. Патутина // Медицинская геномика и протеомика: материалы научной конференции. - Новосибирск, 2009. - С. 71.

9. Сенькова А. В. Моделирование синдрома множественной лекарственной устойчивости in vivo / А. В. Сенькова // «Авиценна-2008» : материалы ежегодной конкурс-конференции студентов и молодых ученых - Новосибирск, 2008. - С. 8485.

Автор искренне признателен за поддержку и квалифицированную помощь участникам совместных исследований: сотрудникам лаборатории регуляции экспрессии генов ИЦГ СО РАН к.б.н. Поповой H.A., к.б.н. Каледину В.И., к.м.н. Николину В.П., заведующему кафедрой патологической анатомии НГМУ академику Шкурупию В.А., сотрудникам кафедры патологической анатомии НГМУ, сотрудникам лаборатории биохимии нуклеиновых кислот ИХБФМ СО РАН, сотрудникам лаборатории структурных основ патогенеза социально-значимых заболеваний НЦКЭМ СО РАМН. Автор приносит искренние слова благодарности научным руководителям-д.м.н., профессору Агеевой Т.А. и д.б.н., профессору Зенковой М.А.

Отпечатано в типографии Новосибирского государственного Технического университета 630092, г. Новосибирск, пр. К. Маркса, 20, тел./факс: (383) 346-08-57 формат 60x84 1\16, объем 1.5 п.л., тираж 100 экз. заказ № 475 подписано в печать 24.12.09 г.

Актуальность проблемы. Противоопухолевая терапия гемобластозов (опухолевых заболеваний крови) за последние десятилетия достигла значительных успехов: повысилось число полных ремиссий, увеличилась безрецидивная выживаемость больных, описаны случаи выздоровления (Поспелова Т.И. и др., 2004). Это связано с использованием эффективных программ полихимиотерапии (ПХТ), в которых используются определенные сочетания противоопухолевых препаратов с различным механизмом действия и токсическим профилем (King P., Perry М., 2001), а также с внедрением молекулярно-биологических методов верификации опухолевого клона, что делает возможным проведение направленного лечения (Ляхович В.В. и др., 2004; Имянитов E.H., Моисеенко В.М., 2008).

Вместе с тем, имеется ряд проблем, сдерживающих полноценное и максимально эффективное использование программной ПХТ: во-первых, это выраженная токсичность многокурсовой химиотерапии (Sanderson Н. et al., 2004); во-вторых, это формирование в опухоли множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) - приобретение опухолевыми клетками перекрестной резистентности к цитостатикам с разными механизмами действия и внутриклеточными мишенями (Ставровская A.A., 2000). Эти две проблемы могут усугублять друг друга и значительно снижать эффективность лечения.

Резистентность опухолевых клеток к химиотерапии может быть следствием разнообразных процессов: от снижения внутриклеточной концентрации противоопухолевого препарата, обусловленного активным выведением вещества в межклеточную среду АТФ-зависимым трансмембранным белком Р-гликопротеином (P-gp), являющимся продуктом гена MDR1, до нарушения механизмов апоптоза в самих опухолевых клетках (мутация или снижение экспрессии гена р53, нарушающие его проапоптотическую функцию и/или гиперэкспрессия гена Ьс1-2, вызывающая нечувствительность клеток к индукции апоптоза) (РШркэ М., 2004).

Основные механизмы возникновения МЛУ достаточно подробно изучены и описаны в литературе, однако эти обширные знания еще в полной мере не нашли применения в практической онкологии, в частности в лечении гемобластозов - опухолей, для которых цитостатическая терапия является приоритетной. Как правило, течение лейкозов и лимфом характеризуется наличием рецидивов, что предполагает проведение повторных курсов высокодозной полихимиотерапии, осложняющихся прогрессированием и модификацией процессов множественной лекарственной устойчивости, детальные механизмы которых до конца не ясны. Попытка перенести ситуацию, зачастую происходящую в клинике, в экспериментальные условия в определенной степени поможет переосмыслить подходы к терапии гемобластозов.

В настоящее время при лечении лейкозов и лимфом, как правило, используют не один цитостатик, а комбинацию химиотерапевтических агентов. При этом веским аргументом в пользу полихимиотерапии считается возможность суммации терапевтического действия используемых препаратов на опухоль при распределении их токсических эффектов по разным органам и снижении за счет этого общетоксического влияния на организм опухоленосителя (Поддубная И.В., 2002; Гольдберг В.Е., Матяш М.Г., 2004).

Исследование фармакокинетики противоопухолевых препаратов свидетельствует о том, что они, как и большинство лекарственных средств, подвергаются биотрансформации в печени с образованием токсических метаболитов, которые могут вызвать повреждение гепатоцитов (ТаеБсЫсе Н. е1 а1., 2002). Поражение печени является одним из основных лимитирующих факторов, ограничивающих проведение программной ПХТ в полном объеме, поскольку развитие постцитостатических осложнений в этом органе может быть причиной смертельных исходов у больных в период химиотерапевтического лечения.

В настоящее время в литературе широко представлены экспериментальные исследования, в которых производится однократное введение химиотерапевтических препаратов интактным животным в режиме монотерапии. Тогда как даже стандартный курс ПХТ подразумевает длительное и многократное введение комбинации цитостатических препаратов. При этом встречается мало исследований, в которых бы исследовалось влияние многократного воздействия комплекса цитостатиков на организм не только интактного животного, но и животного с опухолью, обладающей нарастающей резистентностью к химиотерапии.

Все это обуславливает необходимость изучения морфофункциональных изменений в печени при многократном введении комплекса противоопухолевых препаратов при наличии факторов, усугубляющих токсическое влияние ПХТ на печень (например, прогрессирование опухолевого процесса и нарастание резистентности опухоли к цитостатической терапии).

Мембранный транспортер Р-гликопротеин обнаруживается в клетках органов, участвующих в метаболизме и выведении лекарственных препаратов, в том числе и в печени. Изменение в печени экспрессии Р-гликопротеина и соответственно кодирующего его гена MDR1 развивается в ответ на воздействие различных повреждающих факторов: воспаление, эндотоксикоз (Hartmann M. et al., 2001), экзогенные токсические агенты (Fardel О. et al., 1998). Данное обстоятельство может изменять процессы метаболизма и распределения цитостатиков как в самой опухоли, так и в органах и тканях, и, соответственно, влиять на эффективность лечения и токсичность химиотерапии.

Изучение взаимосвязи морфофункциональных изменений в печени и процессов прогрессирования множественной лекарственной устойчивости в опухоли, возникающих после воздействия нескольких курсов ПХТ представляет интерес, как для клинической, так и для экспериментальной медицины. Указанные обстоятельства определили цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования: Изучить особенности патоморфологических изменений в опухоли и печени мышей в условиях прогрессирования множественной лекарственной устойчивости перевиваемой лимфосаркомы БИ^о в процессе полихимиотерапии.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние многокурсовой полихимиотерапии на динамику роста перевиваемой лимфосаркомы мыши Ш^о и продолжительность жизни животных-опухоленосителей.

2. Исследовать чувствительность клеток перевиваемой лимфосаркомы мыши Ш^о к цитостатикам без лечения и после нескольких курсов полихимиотерапии.

3. Определить уровни экспрессии генов, участвующих в формировании множественной лекарственной устойчивости (тс1г1а, тс!г1Ь) и реализации программы апоптоза (р53, Ьс1-2), в клетках перевиваемой лимфосаркомы мыши ВД^о без лечения и после нескольких курсов полихимиотерапии.

4. Изучить морфологические изменения и экспрессию Р-гликопротеина в опухоли в зависимости от числа курсов полихимиотерапии.

5. Сравнить морфологические изменения и уровень экспрессии Р-гликопротеина в печени мышей при проведении многокурсовой полихимиотерапии животным-опухоленосителям и животным без опухолевого процесса.

6. Изучить морфологические изменения и уровень экспрессии Р-гликопротеина в печени мышей с лимфосаркомой М^о без лечения и при проведении полихимиотерапии с использованием различных схем селекции лекарственно-устойчивых опухолевых клонов.

Научная новизна исследования: Впервые показано, что проведение многокурсовой ПХТ сопровождается прогрессированием лекарственной резистентности в клетках мышиной лимфосаркомы Ш,840, изначально проявляющей фенотип множественной лекарственной устойчивости, с дополнительным снижением чувствительности опухолевых клеток к доксорубицину и винкристину, нарастанием экспрессии гена шёг1Ь и увеличением экспрессии Р-гликопротеина на мембране опухолевых клеток.

Доказано, что повторные циклы введения цитостатиков вызывают нарушение механизмов апоптоза в клетках лимфосаркомы М^о, выражающееся в снижении объемной плотности опухолевой ткани в состоянии апоптотического распада, гиперэкспрессии гена Ьс1-2 и изменении уровня экспрессии гена р53.

Впервые выявлено, что клональная селекция клеток опухоли с нарастанием их лекарственной устойчивости обусловливает повышение токсической нагрузки на печень, выражающееся в нарастании деструктивных изменений, снижении процессов репаративной регенерации и увеличении экспрессии Р-гликопротеина на мембране гепатоцитов.

Впервые установлено, что проведение полихимиотерапии вызывает нарастание деструктивных изменений и увеличение уровня Р-гликопротеина в печени у безопухолевых животных, и более значительное - у мышей с лимфосаркомой ЭД^о параллельно с нарастанием МЛУ в клетках опухоли.

Научно-практическая значимость работы: Разработаны две экспериментальные модели формирования МЛУ. Достоинством модели с пассированием опухоли является возможность проводить неограниченное количество курсов ПХТ для изучения влияния многократного цитостатического воздействия на клетки опухоли. Преимуществом второй модели с проведением последовательных курсов химиотерапии является ее адекватность естественному процессу развития МЛУ.

Полученные результаты исследования дополнили новыми сведениями генетические механизмы прогрессирования МЛУ в результате воздействия нескольких курсов химиотерапии на опухоль, изначально резистентную к ряду цитостатических препаратов, что нередко встречается при лимфомах высокой степени злокачественности у человека.

Данное исследование выявило морфологические особенности поражения и динамику экспрессии Р-гликопротеина в печени в условиях многокурсовой ПХТ с нарастанием лекарственной резистентности опухоли, что может приводить к изменению процессов метаболизма лекарственных препаратов и должно учитываться при выборе подходов к лечению опухолевого процесса и методов терапии сопровождения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Проведение повторных курсов полихимиотерапии мышам с перевиваемой лимфосаркомой М^о, изначально имеющей фенотип множественной лекарственной устойчивости, сопровождается замедлением регрессии опухолевого узла под действием противоопухолевой терапии, снижением чувствительности опухолевых клеток к цитостатикам, увеличением экспрессии генов, участвующих в формировании множественной лекарственной устойчивости, а также повышением устойчивости опухолевых клеток к индукции апоптоза под действием цитостатических препаратов.

2. Нарастание лекарственной резистентности перевиваемой лимфосаркомы Ы^о под действием полихимиотерапии вызывает повышение токсической нагрузки на печень, выражающееся в нарастании деструктивных изменений в паренхиме печени, снижении в ней репаративной регенерации, увеличении экспрессии Р-гликопротеина на мембране гепатоцитов.

Апробация работы: Материалы исследования были представлены на III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2007), на конкурс-конференции студентов и молодых ученых НГМУ «Авиценна» (Новосибирск, 2008), на Всероссийской юбилейной научно-практической конференции патологоанатомов с международным участием к 100-летию профессора П. Г. Подзолкова «Актуальные вопросы современной патологии» (Красноярск, 2008), на научной конференции «Фундаментальные науки — медицине» (Новосибирск, 2008), на IV Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в онкогематологии» (Новосибирск, 2008), на III съезде Российского общества патологоанатомов «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Самара, 2009), на научной конференции «Медицинская геномика и протеомика» (Новосибирск, 2009).

ВЫВОДЫ:

1. Введение комплекса цитостатиков уменьшает размеры опухолевого узла и вызывает увеличение продолжительности жизни животных-опухоленосителей, но эффективность полихимиотерапии снижается по мере увеличения количества курсов химиотерапии, действовавших на опухоль.

2. Многократное воздействие комплекса цитостатиков на лимфосаркому мыши ВД-^о, изначально проявляющую фенотип множественной лекарственной устойчивости, вызывает дополнительное снижение чувствительности опухолевых клеток к доксорубицину и винкристину, входящим в использованную схему полихимиотерапии.

3. Повторные курсы введения цитостатиков снижают способность клеток лимфосаркомы мыши ЫЬ84о подвергаться апоптозу: а) при пассировании опухоли с последующим введением цитостатиков происходит снижение объемной плотности апоптических телец в ткани опухоли в 1,7 раза после четырех курсов химиотерапии, тогда как при пассировании опухоли без введения цитостатиков данный показатель не изменялся; при проведении трех последовательных курсов полихимиотерапии выявлено отсутствие изменений доли апоптозов в опухолевой ткани, тогда как при естественном развитии опухоли без лечения она нарастала; б) после воздействия нескольких курсов полихимиотерапии в опухолевых клетках выявлено нарастание экспрессии гена Ьс1-2 в 2 раза и изменение экспрессии гена р53 с нарушением его проапоптотической функции.

4. Проведение многокурсовой полихимиотерапии как при пассировании лимфосаркомы Ы^о, так и при проведении трех последовательных курсов лечения сопровождается увеличением в клетках опухоли уровня экспрессии гена т<1г1Ь (в 1,3 и 2,8 раза) и увеличением числа Р-гликопротеин положительных клеток (с 30% до 85% от всей популяции опухолевых клеток).

5. Введение комплекса цитостатиков животным без опухоли сопровождается развитием деструктивных изменений в печени, которые занимают до 50% от всей паренхимы, при этом регенераторная активность печени не снижается. Проведение полихимиотерапии на фоне роста перевитой лимфосаркомы RLS40 в мышцах бедра и метастазирования данной опухоли в печень характеризуется нарастанием суммарных деструктивных изменений, занимающих более 80% паренхимы печени, а также снижением в ней процессов регенерации.

6. Нарастание лекарственной устойчивости пассированной опухоли в результате воздействия на нее четырех курсов химиотерапии сопровождается повышением токсической нагрузки на печень, подвергавшейся одному курсу химиотерапии, что приводит к нарастанию объемной плотности некрозов паренхимы печени в 1,4 раза и снижению численной плотности двуядерных гепатоцитов в 1,8 раза.

7. При многократном воздействии комплекса цитостатиков происходит увеличение экспрессии Р-гликопротеина на мембране гепатоцитов у интактных (безопухолевых) животных, и более значительное - у животных-опухоленосителей. Нарастание лекарственной резистентности опухоли сопровождается более выраженной активацией Р-гликопротеина в печени под действием полихимиотерапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Противоопухолевая терапия гемоблаетозов за последние десятилетия увенчалась значительными успехами, что всецело связано с усовершенствованием методов диагностики данной группы опухолевых заболеваний, а также с использованием эффективных полихимиотерапевтических программ (Поспелова Т.Н. и др., 2004; Переводчикова Н.И., 2005). Однако, имеется ряд проблем, сдерживающих полноценное и максимально эффективное использование программной ПХТ: во-первых, выраженная токсичность многокурсовой химиотерапии (Sanderson Н. et al., 2004), во-вторых, формирование множественной лекарственной устойчивости в клетках опухоли (Ставровская А.А., 2000; Блохин Д.Ю., 2009). Эти две проблемы могут усугублять друг друга и значительно снижать эффективность противоопухолевого лечения.

В литературе имеются обширные экспериментальные данные, касающиеся вопросов морфофункциональных изменений в органах и тканях при использовании цитостатиков в монорежиме при отсутствии факторов, усугубляющих токсичность химиотерапии, например, при наличии агрессивного опухолевого процесса. Все это определяет актуальность исследования патоморфологических изменений в органах и тканях при проведении многокурсовой ПХТ животным-опухоленосителям в условиях нарастания агрессивных свойств опухоли и снижения ее чувствительности к стандартным схемам химиотерапии.

Цитостатическое поражение печени при гемобластозах занимает в этом аспекте особое место, поскольку печень является основным органом, участвующем в метаболизме цитостатических препаратов и занимает ключевые позиции в поддержании гомеостаза организма, что определяет высокую частоту поражения данного органа при естественном течении опухолевого процесса и при его лечении цитостатиками (Гольдберг Е.Д. и др., 1998; Лосева М.И. и др., 2005).

Множественная лекарственная устойчивость опухоли оказывает значительное влияние на эффективность и токсичность химиотерапии в результате изменения метаболизма и распределения цитостатиков как в самой опухоли, так и в тканях, что может значительно повысить концентрацию противоопухолевых препаратов в системном кровотоке. Поэтому развитие или усугубление лекарственной резистентности опухоли может изменять реальную цитостатическую нагрузку на органы и ткани, в том числе и на гепатоциты. С этих позиций данная экспериментальная работа является попыткой раскрыть новые общие патоморфологические особенности влияния многокурсовой ПХТ на организм при наличии опухолевого процесса с нарастающей лекарственной резистентностью.

Изучение процессов прогрессирования множественной лекарственной устойчивости опухоли и морфофункциональных изменений в печени проводили в условиях экспериментально созданного опухолевого процесса, изначально проявляющего МЛУ-фенотип. Это является важным моментом, поскольку первичная рефрактерность к стандартной химиотерапии при лимфомах встречается в 20-30% случаев (Кочемасов В.В. и др., 2007), что предполагает изначальную низкую эффективность и более высокую токсичность стандартной ПХТ. Также наличие самого опухолевого процесса оказывает самостоятельное негативное воздействие на органы и ткани, и патоморфологические изменения в печени при проведении многокурсовой ПХТ на этом неблагоприятном фоне могут значительно отличаться от таковых у интактных (безопухолевых) животных (Diamond J.R. et al., 2009).

Исследование процессов прогрессирования и модификации МЛУ в опухоли после проведения нескольких курсов ПХТ основано на исследовании с помощью МТТ-теста чувствительности опухолевых клеток к ряду цитостатиков и определении методом ОТ-ПЦР уровней экспрессии генов, участвующих в формировании лекарственной устойчивости в данной опухоли. Патоморфологическую оценку структурных изменений в печени и ткани опухоли при проведении многокурсовой ПХТ в условиях нарастания лекарственной резистентности опухоли проводили с помощью морфометрического исследования. Такой подход позволил комплексно оценить ряд общих структурных закономерностей реагирования органов и тканей на многокурсовую цитостатическую терапию в условиях лекарственно-резистентного опухолевого процесса.

В исследовании было использовано два способа моделирования синдрома МЛУ в эксперименте. Независимо от схемы селекции лекарственно-устойчивых опухолевых клонов введение комплекса цитостатиков достоверно уменьшало размеры опухолевого узла, а также вызывало увеличение продолжительности жизни животных-опухоленосителей, но эффективность ПХТ снижалась по мере нарастания цитостатической нагрузки на опухоль.

При морфометрическом исследовании ткани опухоли было выявлено, что повторные циклы введения цитостатиков снижают способность клеток опухоли подвергаться апоптозу, что может быть связано как с нарушением механизмов апоптоза в самих опухолевых клетках в результате дефектного функционирования гена р53 и/или гиперэкспрессии гена Ьс1-2, так и с неспособностью противоопухолевого препарата запустить программу апоптоза в клетках опухоли в результате недостаточной внутриклеточной концентрации цитостатика, обусловленной активным выведением вещества в межклеточную среду трансмембранным белком Р-гликопротеином -продуктом гена МОЮ.

Для оценки изменения чувствительности опухолевых клеток к цитостатикам после проведения нескольких курсов ПХТ использовали МТТ-тест, с помощью которого можно определить концентрацию препарата, при которой погибает 50% клеток (Ю50). Было выявлено, что независимо от схемы селекции лекарственно-устойчивых опухолевых клонов и продолжительности интервала между курсами ПХТ, после многократного цитостатического воздействия на исходно резистентную опухоль происходит дополнительное снижение чувствительности опухолевых клеток к цитостатикам.

Для ответа на вопрос о причинах выявленных изменений было проведено исследование экспрессии генов методом ОТ-ПЦР в клетках опухоли без лечения и после проведения нескольких курсов ПХТ. Показано, что независимо от схемы клональной селекции лекарственно-устойчивой опухоли проведение многокурсовой ПХТ сопровождается увеличением экспрессии гена тс1г1Ь и нарушением механизмов апоптоза, выражающееся в гиперэкспрессии гена Ьс1-2 и изменении экспрессии гена р53. При проведении иммуногистохимического исследования ткани опухоли было выявлено нарастание экспрессии Р-гликопротеина — белкового продукта гена 1уПЖ1 - в клетках опухоли после многократного цитостатического воздействия при использовании различных экспериментальных моделей прогрессирования МЛУ. Эти данные подтверждают гипотезу о том, что проведение нескольких курсов ПХТ сопровождается нарастанием лекарственной резистентности опухоли, изначально проявляющей МЛУ-фенотип.

Проведенное гистологическое и морфометрическое исследования печени позволило установить, что многократное введение комплекса цитостатиков сопровождается выраженными деструктивными изменениями в паренхиме печени, а наличие опухолевого процесса значительно усугубляет токсичность многокурсовой ПХТ. Также было выявлено, что клональная селекция клеток опухоли с нарастанием их лекарственной устойчивости может обусловливать повышение токсической нагрузки на печень. Это может быть связано с изменением метаболизма цитостатиков в опухоли в результате гиперэкспрессии Р-гликопротеина, отвечающего за выведение цитостатиков из клеток опухоли во внеклеточную среду. Следствием данного процесса может быть повышение реальной концентрации цитостатиков в системном кровотоке, а в итоге - и токсической нагрузки на органы и ткани.

148 s

При исследовании экспрессии Р-гликопротеина в ткани печени методом ИГХ было выявлено, что многократная цитостатическая нагрузка и нарастание лекарственной резистентности опухоли ведет к выраженному нарастанию экспрессии данного белка-транспортера на мембране гепатоцитов. Это свидетельствует о значительном напряжении механизмов защиты и детоксикации в печени (Barnes S.N. et al., 2007), одним из которых является изученный нами Р-гликопротеин. Исследованный механизм защиты является далеко не единственным в печени, а также в других органах, участвующих в метаболизме и выведении токсических агентов, и понятен не до конца, что является предметом отдельного и дополнительного анализа.

При проведении химиотерапии у людей необходимо учитывать множество факторов, влияющих на переносимость и токсичность ПХТ. У каждого больного эффективность одного и то же курса ПХТ может быть разной, что связано с генетически детерминированными индивидуальными особенностями метаболизма лекарственных препаратов, наличием сопутствующей патологии и других факторов, влияющих на детоксикационную функцию печени (Поспелова Т.И., Нечунаева И.Н., 2004). Одним из таких факторов может быть изученная в данном исследовании нарастающая резистентность опухолевого процесса к химиотерапии.

Безусловно, у человека метаболизм лекарственных препаратов является многофакторным процессом, и ответ организма на наличие самого опухолевого процесса, а также на введение лекарственных препаратов индивидуален для каждого больного. Реакции организма лабораторных животных одной генетической линии на воздействие токсических агентов протекают приблизительно по одному механизму. Поэтому проведенные экспериментальные исследования позволяют рассмотреть некую стандартную модель метаболизма цитостатических препаратов, а также дают понимание универсальных механизмов формирования патологии в органах и тканях при проведении многокурсовой ПХТ при нарастании лекарственной устойчивости опухолевого процесса.