Методы исследования морфина и трамадола в судебно-химическом анализе

Заикин, Кирилл Сергеевич

Диссертации по медицине → Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Методы исследования морфина и трамадола в судебно-химическом анализе

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Заикин, Кирилл Сергеевич Москва 2010 г.

Ученая степень: кандидата фармацевтических наук

ВАК РФ: 14.04.02

Автореферат диссертации по медицине на тему Методы исследования морфина и трамадола в судебно-химическом анализе

На правах рукописи

Заикин Кирилл Сергеевич

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МОРФИНА И ТРАМАДОЛА В СУДЕБНО-ХИМИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

2 О МАМ 2010

Москва - 2010

004604603

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская Медицинская Академия имени И.М.Сеченова

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук, профессор, академик РАМН

доктор фармацевтических наук, профессор

Арзамасцев Александр Павлович

Раменская Галина Владиславовна

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, профессор

Белобородое Владимир Леонидович

Кандидат фармацевтических наук Герникова Евгения Петровна

Ведущая организация:

Федеральное Государственное Учреждение «Российский центр судебно-медицинской экспертизы Росздрава»

Защита состоится «24» мая 2010 г. в 14.00 часов на заседании Диссертационного Совета Д.208.040.09 при Московской Медицинской Академии имени И.М.Сеченова по адресу: 119019, Москва, Никитский бульвар, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной Научной Медицинской Библиотеке ММА имени И.М.Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, 49.

Автореферат разослан « ¿1_» 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор фармацевтических наук, профессор / Садчпкова Натальи Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

В настоящее время препараты из группы агонистов опиоидных рецепторов, такие как морфин и трамадол, широко применяются как лекарственные средства. Их применение с немедицинскими целями, а также применение героина, одним из метаболитов которого является морфин, распространено у людей с наркотической зависимостью [Galichet, 2004; Веселовская, 2002]. Часто эти вещества являются причиной передозировок и летальных исходов [Baselt, 1995; Веселовская, 2000].

По отчётным данным 2009 года Государственного Учреждения Здравоохранения Московской области Бюро Судебно-Медицинской Экспертизы Министерства Здравоохранения Московской Области (ГУЗ МО Бюро СМЭ МЗ МО) второе место по результатам исследований биоматериала от живых лиц занимают наркотические вещества, из них подавляющее количество составляют опиаты (3627 положительных из 12539 случаев). По результатам исследования аутопсийного материала наркотические вещества занимают третье место. Среди наркотических веществ преобладают опиаты (1068 положительных из 8037 случаев).

В судебно-химическом анализе для определения агонистов опиоидных рецепторов применяются: высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) [Matthew Н. Slawson, 2007]; газожидкостная хроматография (ГЖХ) [Изотов, 2000]; иммунные методы [Sam Niedbala, 2001]. В настоящее время развитие газовой хроматографии с масс-селективным детектором (ГХ-МС) делает этот метод наиболее предпочтительным и перспективным. Метод обладает высокой селективностью, а требуемый предел количественного определения (0,01 мг/л) может быть достигнут при изменении условий хроматографирования.

В связи с тем, что в отечественной литературе отсутствуют валидированные методики определения морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором, учитывающие последние разработки в этой области, актуальной задачей является разработка метода количественного определения морфина и трамадола, который позволит определять эти вещества в крови на уровне терапевтических концентраций.

Сложность в анализе этих препаратов в крови в рамках химико-токсикологических и судебно-химических исследований обусловлена их низкой

дозировкой, низкой терапевтической концентрацией, а также сложной биологической матрицей.

Всё вышеизложенное определило цели и задачи исследования.

Цель исследования.

Разработка высокочувствительной, воспроизводимой методики количественного определения морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором, и апробирование данной методики в практике судебно-химических исследований.

Задачи исследования.

1. Изучить влияние различных экстрагентов на эффективность экстракции морфина и трамадола.

2. Изучить влияние реакции среды на выход морфина и трамадола.

3. Разработать методику извлечения с учётом изученных параметров.

4. Изучить влияние ферментативного гидролиза на выход морфина и трамадола.

5. Изучить хроматографические свойства морфина и трамадола, на основе которых подобрать оптимальные условия хроматографирования.

6. Разработать методику количественного определения морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором.

7. Провести валидацию метода количественного определения морфина и трамадола.

8. Апробация разработанной методики в судебно-химическом отделении при проведении химико-токсикологического анализа.

Научная новизна.

Впервые была разработана валидированная методика, позволяющая достоверно определять морфин и трамадол в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором на уровне предела определения - 0,01 мг/л. Практическое применение.

По результатам серии экспериментов было показано, что проведение ферментативного гидролиза й-глюкуронидазой Helix Pomatia значительно

увеличивает выход морфина и трамадола при анализе исследуемых биообъектов. Для создания рН среды может быть рекомендовано использование трис-буфера, так как это позволяет добиться максимального выхода морфина и трамадола и получать наиболее стабильные результаты исследований. Разработанная методика определения морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором позволяют определять данные вещества на уровне предела определения.

Положения, выносимые на защиту.

1. Хроматографическое поведение морфина и трамадола под влиянием различных факторов (экстрагеит, рН среды, ферментативный гидролиз).

2. Разработанная методика количественного определения морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором.

3. Апробация данной методики в практике судебно-химического и химико-токсикологического анализа.

Внедрение результатов в практику.

Разработанная методика количественного определения морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором может использоваться при проведении судебно-химического и химико-токсикологического анализа. Данная методика внедрена и применяется в ГУЗ МО Бюро СМЭ МЗ МО при проведении исследований аутопсийной крови и сыворотки крови живых лиц.

Апробация работы.

Апробация работы проведена на научно-практическом заседании кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета ММА им. И.М. Сеченова 19 января 2010 года.

Основные теоретические положения и практические результаты работы доложены на XIII конгрессе молодых ученых и специалистов «Наука о человеке» (Томск, 2007 г.), IX итоговой научной студенческой конференции с международным участием «Татьянин день», посвященной 250-летию Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (Москва 2007г.).

Связь задач исследования с проблемным планом.

Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры

фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета ММА им. И.М. Сеченова «Совершенствование контроля качества лекарственных средств (фармацевтические и экологические аспекты)» (№ государственной регистрации 01.2.006 06352). Публикации.

По результатам диссертационного исследования опубликовано 4 печатные работы, в том числе две статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ. Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, глав: «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Разработка методики количественного определения морфина и трамадола в крови», выводов и списка литературы из 112 источников (94 из которых зарубежные). Работа иллюстрирована 21 рисунком и 22 таблицами.

Результаты экспериментов обработаны статистически, обобщены в таблицах,

Пр011ЛЛ1ССТрlipv/uuiim рПС\ шшши,

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальная часть исследования проводилась на базе судебно-химического отделения ГУЗ МО Бюро СМЭ МЗ МО (заведующая - Крупина Наталья Анатольевна).

При определении морфина нои трамадола ^

газохроматографическим методом в качестве объекта исследования использовалась

кровь или сыворотка крови живых лиц и кровь аутопсийного материала. В Бюро СМЭ

объекты поступали по направлениям врачей судебно-медицинских экспертов

судебно-медицинских отделений Бюро и врачей лечебно-профилактических

учреждений (больницы, наркологические диспансеры).

Пробу отбирали в помещениях, приспособленных для сбора, упаковки,

нанесения информации на контейнер. Кровь для проведения постмортальных

судебно-химических исследований отбирали из периферических венозных сосудов (бедренной, плечевой вен), так как она свободна от постлетальной диффузии.

Кровь для проведения исследований на состояние опьянения наркотическими средствами отбирали из локтевых вен. Контейнер с кровью в период доставки перед проведением анализа хранили в вертикальном положении при температуре 0 - 7°С в течении 1-7 дней. После проведения исследования образец крови хранили в морозильнике при температуре -18°С.

Образцы крови отбирали в объеме 10 мл.

Для пробоподготовки и хроматографического анализа применялись следующие реактивы: ß-глюкуронидаза Helix pomatia НР-2 131700 ед./мл; хч: хлористый метилен; аммиак 25% раствор; сульфат натрия безводный; уксуснокислый натрий CH3COONa*

ЗН20;трис(гидроксиметил)аминометан;БСТФА+1%ТМХС(бистриметилсилилтрифто рацетамид) + 1 % тримегилхлорсилана FLUKA; концентрированная уксусная кислота; изо-бутиловый спирт; вода дистиллированная.

Приборы: хроматограф Agilent Technologies 6890 N Network GC System; масс-селективный детектор Agilent Technologies 5973 N Network; инжектор фирмы Agilent Technologies 7683 Series; автосемплер Agilent Technologies 7683; термостат фирмы Binder серии FD (диапазон температур +50С - +300°С); встряхиватель IKA HS501 (300 колеб./мин); минишейкер IKA MSI. Колонка капиллярная Agilent 19091S-101 HP-5MS 0.20мм* 12м*0,33мкм.

Условия ГХ-МС анализа.

Сканирование проводили в режиме селективного мониторинга индивидуальных ионов (с 6,0 мин по 6,9 мин: 335, 320, 245,216; с 8,05 по 8,4 мин: 429, 414,401; с 8,4 по 8,65 мин: 399, 340,287; с 11,0 по 18,3 мин: 450,482, 506,539). Начальная температура колонки - 70°С. Время выдержки при начальной температуре - 1 минута. Подъем температуры в диапазоне 70-280°С - 20°С/мин. Время выдержки при 280°С-15 мин. Скорость газа носителя (гелий)-1,0 мл/мин. Температуры инжектора, масс-селективного источника и интерфейса -280иС, 290иС и 180 С соответственно. Режим - без сброса (splitless). Объем вводимой пробы - 1 мкл. Программное обеспечение: ChemStation software (Rev.A.10.01).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Выбор оптимальных условий жидкость-жидкостной экстракции (ЖЖЭ) морфина и трамадола. Выбор экстрагента.

В качестве экстрагснтов для морфина и трамадола при проведении ЖЖЭ из крови были изучены смеси для экстракции опиатов из биожидкостей: хлористый метилен - изобутанол (9:1); н-гексан - хлористый метилен - изопропанол (60:40:2).

Для оценки эффективности экстракции морфина и трамадола различными растворителями при проведении ЖЖЭ использовали тестовые контрольные образцы сывороток, содержащие 0,4 мг/л морфина и 0,5 мг/л трамадола. При сравнении результатов серии исследований, полученных методом ГХ-МС было выявлено, что эффективность экстракции в образцах, с использованием смеси хлористый метилен -изобутанол (9:1) приблизительно в 3 раза выше, чем при использовании смеси н-гексан - хлористый метилен - изопропанол (60:40:2). Результаты представлены на рисунках 1 и 2.

Рисунок 1. Сравнение результатов исследований тестовых проб сыворотки с концентрацией морфина 0,4 мг/л с использованием различных экстрагентов (среднее значение 10 измерений).

степень экстракции,%

□ н-гексан: хлористым метилен:изолропанол (60:40:2)

□ хлористый метилен: изобутанол(9:1)

Рисунок 2. Сравнение результатов исследований тестовых проб сыворотки с концентрацией трамадола 0,5 мг/л с использованием различных экстрагентов (среднее значение 10 измерений).

Выбор реакции среды.

Учитывая литературные данные о рКа морфина и трамадола, для оптимизации процедуры экстракции было изучено использование

грис(гидроксиметил)аминометана (трис-буфера) (1М) и концентрированного раствора аммиака (25%). Перед нами стояла задача создания оптимального значения рН среды 8,5 - 9,0 для последующего использования процедуры ЖЖЭ смесью хлористый метилен - изобутанол (9:1).

Наиболее высокие и стабильные результаты для создания необходимого рН были получены при использовании трис-буфера. Результаты представлены на рисунках 3 и 4.

100 90 80

Степень 70 экстракции, % 60

50 40 30 20 10 0

экстра тент

□Аммиак (25%) ОТрис-буфер

Рисунок 3. Сравнение результатов исследований тестовых проб сыворотки с концентрацией морфина 0,4 мг/л после пробоподготовки с использованием аммиака (25% концентрированный раствор) или трис-буфера для создания рН (среднее значение ] О измерении).

Степень эксгракции,%

ОАммиак (25%) о Три с-буфер

Рисунок 4. Сравнение результатов исследований тестовых проб сыворотки с концентрацией трамадола 0,5 мг/л после пробоподготовки с использованием аммиака (25% концентрированный раствор) или трис-буфера для создания рН (среднее значение 10 измерений).

Выбор внутреннего стандарта.

Количественное определение морфина и трамадола в крови осуществляли методом градуировочного графика с использованием внутреннего стандарта. Для использования в качестве внутреннего стандарта нами был выбран бупренорфин.

НО \ 'СН;

«»&, Преимуществом использования бупренорфина как внутреннего стандарта являются его хроматографические свойства, условия экстракции и дериватизации, подобные таковым у определяемых веществ, стабильность полученных результатов, и его доступность для закупки на территории РФ. В зарубежных литературных данных в качестве внутреннего стандарта используют дейтерированные аналоги исследуемых веществ. В связи с дороговизной и невозможностью закупки дейтерированных аналогов нами был выбран бупренорфин.

2. Количественное определение морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором.

В таблице 1 представлены хромато-масс-спекгрометрические характеристики ТМС производных морфина, трамадола и бупренорфина.

Таблица 1

Хромато-масс-спектрометрические характеристики ТМС производных морфина, трамадола и бупренорфина

Соединение Время удерживания, мин т/г

Базовый (100%)

Морфин 2ТМС 8,1 73 429,, 414,о 401, 23 62,

Трамадол ТМС 6,4 58 3354 320, 2253 73п

Бупренорфин ТМС 12,7 450 4823„ 506,, 5394 5549

Стандартные и калибровочные растворы.

Для калибровки готовили стандартные (1 мг/мл) растворы морфина (Ам), трамадола (Ат), бупренорфина (Аб) (внутренний стандарт) весовым методом из стандартных веществ: морфин гидрохлорида, трамадола и бупренорфин гидрохлорида.

Образцы плазмы для построения калибровочных графиков и контролей отрицательных результатов получены в центре переливания крови.

Рабочий раствор бупренорфина (внутренний стандарт) с концентрацией 0,04 мг/мл готовили из стандартного раствора бупренорфина (1 мл раствора Аб помещали в градуированную колбу вместимостью 25 мл и доводили до 25 мл метанолом). Хранили в морозильной камере (-40°С, в течение 3 месяцев).

Калибровочные растворы, содержащие бупренорфин, используемый в качестве внутреннего стандарта, в концентрации 0,8 мг/л крови и морфин в концентрациях: 0,02 мг/л, 0,04 мг/л, 0,2 мг/л, 0,4 мг/л, 2 мг/л, 4 мг/л крови (растворы I-VI соответственно) готовили из растворов морфина с концентрацией 0,2 мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,02 мг/мл, 0,01 мг/мл и из раствора бупренорфина с концентрацией 0,4 мг/мл.

При проведении процедуры калибровки к 1 мл сыворотки добавляли по 20 мкл калибровочных растворов (I-VI).

Калибровочные растворы, содержащие бупренорфин, используемый в качестве внутреннего стандарта в концентрации 0,8 мг/л крови и трамадол в концентрациях 0,02 мг/л, 0,05 мг/л, 0,1 мг/л, 0,5мг/л, 1 мг/л, 2 мг/л крови (растворы I-VI соответственно) готовили из раствора трамадола с концентрацией 1,0 мг/мл (раствор Ат) и из раствора бупренорфина с концентрацией 1,0 мг/мл.

Приготовленные растворы хранили в морозильной камере (-40°С, в течение 3 месяцев).

При проведении процедуры калибровки к 1 мл сыворотки добавляли по 50 мкл калибровочных растворов (I-VI).

Пробоподготовка.

1 мл крови вносили в пробирку (15 мл), добавляли 1мл ацетатного буфера рН 4,8 и 25 мкл 6-глюкуронидазы Helix Pomatia, герметично закрывали и выдерживали в течение 18 ч при 37°С. К гидролизату добавляли 20 мкл раствора бупренорфина (внутренний стандарт) 0,04 мг/мл, встряхивали на шейкере IKA MS1 10 сек и добавляли 0,3 мл трис-буфера (1М). Образец экстрагировали 4 мл смеси хлористый метилен - изобутанол (9:1) интенсивно встряхивая 10 минут на шейкере IKA HS501 (300 колеб./мин). Центрифугировали 5 минут при 4000об/мин. 3 мл органической фазы переносили в виалу. Экстракт упаривали под током азота в концентраторе экстрактов. Во флакон с сухим остатком с помощью шприца вносили 100 мкл реактива бис(триметилсилил)трифторацетамид (БСТФА) + 1% триметилхлорсилана (ТМС), флакон герметично закрывали, тщательно встряхивали, нагревали в

термостате 20 минут при 50°С и проводили исследование методом хромато-масс-спекгрометрии.

Параллельно, при вышеуказанных условиях проводили:

- экстракцию крови, не содержащей морфина, трамадола и бупренорфина;

- контрольных проб, содержащих морфин и трамадол в концентрациях в пределах от 0,02 до 4 мг/л и от 0,02 до 2 мг/л соответственно.

Нами было изучено влияние ферментативного гидролиза с использованием В-глюкуронидазы Helix Pomatia. Исследование проводили с реальным образцом крови. В результате анализа данного образца по вышеописанной методике были найдены морфин (в концентрации 1,22 мг/л) и трамадол (в концентрации 0,97 мг/л). В последующем данный образец исследовали 10 раз: в 5 случаях пробоподготовка проходила без проведения ферментативного гидролиза В-глюкуронидазой Helix Pomatia и в 5 случаях согласно приведённой методике. % выхода для морфина без проведения гидролиза составил 21 %, а для трамадола 77 % (данные количественного определения представлены на рисунках 5 и 6).

Рисунок 5. Сравнение результатов количественного определения крови на наличие морфина с проведением гидролизаfi-глюкуронидазой Helix Pomatia и без него.

Рисунок 6. Сравнение результатов количественного определения крови на наличие трамадола с проведением гидролизаfi-глюкуронидазой Helix Pomatia и без него.

Таким образом, проведение ферментативного гидролиза крови более чем в 5 раз увеличивает выход морфина ив 1,5 раза увеличивает выход трамадола.

Валидация метода.

Валидацию метода осуществляли по показателям: линейность, аналитическая область методики, предел количественного определения, специфичность, правильность, прецизионность.

Контроль «отрицательный» - извлечение из бланковой сыворотки (контрольная хроматограмма образца, не содержащего морфина, трамадола и бупренорфина).

Нами была проведена статистическая обработка.

Для определения линейности и аналитической области калибровочные графики (рисунки 7 и 8) были построены по 6 калибровочным точкам (по 5 каждой концентрации). Калибровочные образцы содержали следующие концентрации морфина: 0,02 мг/л, 0,04 мг/л, 0,2 мг/л, 0,4 мг/л, 2 мг/л, 4 мг/л сыворотки крови, и трамадол в концентрациях 0,02 мг/л, 0,05 мг/л, 0,1 мг/л, 0,5мг/л, 1 мг/л, 2 мг/л сыворотки крови. Для построения графика и определения концентрации морфина и трамадола в крови использовался метод линейного регрессионного анализа СЬеп^айоп на основании отношения высот пиков молекулярных ионов морфин 2 ТМС производного (429) к базовому иону бупренорфин ТМС производного (450) и трамадол ТМС производного (335) к базовому иону бупренорфин ТМС производного (450). Коэффициент корреляции: для морфина - 0,999, для трамадола - 0,993. Свободный член линейного уравнения: для морфина - 0,0351, для трамадола - 0,0292. Наклон регрессионной прямой: для морфина - 0,4425, для трамадола - 0,2126.

Значения отношений концентраций и интенсивностей пиков морфина и трамадола к концентрациям и пикам бупренорфина приведены в таблицах 2 и 3 соответственно.

Таблица 2

Значения отношений концентраций и интенсивностей пиков морфина к концентрациям и _пикам бупренорфина_

Концентрац ия морфина, мг/мл Концентрац и* бупренорфи на, мг/мл Отношение концентраци й Интенсивност ь пика иона морфина (429) Интенсивность пика иона бупренорфина (450) Отношение интенсивностей

0,02 0,8 0,0250 1065 47334 0,0224

0,04 0,8 0,0500 1857 50488 0,0367

ОД 0,8 0,2500 6720 45394 0,1480

0,4 0,8 0,5000 14838 52739 0,2813

2,0 0,8 2,5000 57204 48480 1,1799

4,0 0,8 5,0000 103897 46673 2,2260

Таблица 3

Значения отношений концентраций и интенсивностей пиков трамадола к концентрациям и ___пикам бупренорфина__

Концентрац ия трамадола, мг/мл Концентрац ая бупренорфи на. мг/мл Отношение концентраци й Интенсивност ьлика иона трамадола m е\ V-'-V Интенсивность пика иона бупренорфина (450) Отношение интенсивностей

0,02 0,8 0,0250 1240 89949 0,0137

0,05 0,8 0,0625 2149 80160 0,0268

0,1 0,8 0,1250 4843 89365 0,0541

0,5 0,8 0,6250 16975 87499 0,1940

1,0 0,8 1,2500 27477 85182 0,3225

2,0 0,8 2,5000 45855 84942 0,5398

Morphine

Response Ratio

Amount Ratio

Resp Ratio=4,52e-001 *Amt; Coef of det (r2)=0.999; Curve fit: Linear/(0,0) Рисунок 7. Калибровочный график, построенный на ГХ-МС для морфина.

Tramadol

Response Ratio

Amount Ratio

Resp Ratio=2,18e-001 *Amt; Coef of det (r2)=0.993; Curve fit: Linear/(0,0)

Puc)4iokS. Калибровочный график, построенный на ГХ-МС для трамадола.

Для определения концентрации морфина и трамадола использовали метод обработки MM_DD_YY_M.

Пределы обнаружения и определения морфина и трамадола (таблица 4) были рассчитаны для молекулярных ионов 429 (для морфин 2 ТМС) и 335 (для трамадол ТМС) при соблюдении соотношения сигнал/шум 1:3 и 1:10 соответственно.

Выход морфина и трамадола (таблица 4) был оценен следующим образом: была произведена процедура пробоподготовки с добавлением внутреннего стандарта 4-х образцов бланковой сыворотки, содержащей морфин в концентрации 0,2 мг/л, трамадол в концентрации 0,1 мг/л 4-х образцов бланковой сыворотки, содержащей морфин в концентрациях 0,4 мг/л, а трамадол в концентрации 0,5 мг/л и 4-х образцов бланковой сыворотки, не содержащей морфин, трамадол и бупренорфин.

К сухим остаткам извлечений из 2-х образцов сыворотки, не содержащей морфин и трамадол, добавляли по 20 мкл калибровочного раствора морфина (III) (концентрация морфина 0,2 мг/л крови) и по 50 мкл калибровочного раствора (III) (концентрация трамадола 0,1 мг/л крови). К сухим остаткам извлечений из 2-х образцов сыворотки, не содержащей морфин и. трамадол, добавляли по 20 мкл калибровочного раствора морфина (IV) (концентрация морфина 0,4 мг/л крови) и 50 мкл калибровочного раствора (IV) (концентрация трамадола 0,5 мг/л крови).

Содержимое всех виал выпаривали досуха. К полученным сухим остаткам добавляли 100 мкл реактива БСТФА +1%ТМХС (силилирующий реагент), флакон герметично закрывали, тщательно встряхивали, нагревали в термостате 20 минут при 50°С и проводили исследование методом хромато-масс-спектрометрии.

В таблице 4 представлены процентный выход, пределы обнаружения и определения морфина и трамадола.

Таблица 4

Процентный выход, пределы обнаружения и определения морфина и трамадола

Вещество Выход, % Предел обнаружения, мг/л Предел определения, мг/л

морфин 78 0,005 0,01

трамадол 86 0,005 0,01

Оценка специфичности: в исследуемых пробах (калибровочные образцы крови и исследуемые образцы) идентифицировали хроматографические пики по времени удерживания и масс-спектрам, совпадающие с хроматографическими пиками морфин 2 ТМС производного и трамадол ТМС производного стандартных растворов.

Перед анализом проб проверили отсутствие на хроматограмме бланковой крови пиков, соответствующих морфину в виде морфин 2ТМС производного, трамадолу в виде трамадол ТМС производного, бупренорфину в виде бупренорфин ТМС производного.

Оценка правильности методики и ее прецизионность представлены в таблицах

5 и 6.

Таблица 5

Статистическая обработка результатов исследований определения (результат 10

измерений) морфина

XI, мг/мл Средняя концентрация, (мг/мл) X Стандартное отклонение Б Относительное стандартное отклонение ЯБО (%) Доверительный интервал ДХ при Р=0.9 Х±ДХ

0,0200 0,0220 0,0045 20,4545 0,0056 0,0220± 0,0056

0,0400 0,0420 0,0045 10,7142 0,0056 0,0420± 0,0056

0,2000 0,2080 0,0084 4,0384 0,0104 0,2080± 0,0104

0,4000 0,4140 0,0134 3,2367 0,0167 0,4140± 0,0167

2,0000 2,0400 0,0274 1,3431 0,0340 2,0400± 0,0340

4,0000 4,0600 0,0412 0,3478 0,0512 4,0600± 0,0512

Таблица б

Статистическая обработка результатов исследований определения (результат 10 __ измерений) трамадола __

XI, мг/мл Средняя концентрация, (мг/мл) X Стандартное отклонение Б Относительное стандартное отклонение (%) Доверительный интервал ДХ при Р=0.9 Х±ДХ

0,0200 0,0240 0,0055 22,9167 0,0068 0,0240± 0,0068

0,0500 0,0520 0,0045 8,6538 0,0056 0,0520± 0,0056

0,1000 0,1060 0,0089 8,3962 0,0111 0,1060± 0.0111

0,5000 0,5140 0,0167 3,2490 0,0208 0,5140± 0,0208

1,0000 1,0280 0,0164 1,5953 0,0204 1,0280± 0.0204

2,0000 2,0360 0,0241 1,1836 0,0299 2,0360± 0,0299

Статистические данные результатов исследований представлены в таблице 7.

Таблица 7

Статистическая обработка результатов исследований определения (результат 10

XI, мг/мл Морфин XI, мг/мл Трамадол

Дисперсия Ошибка Дисперсия Ошибка

0,0200 0 25,2284 0,0200 0 28,3235

0,0400 0 13,2149 0,0500 0 10,6735

0,2000 0,0001 4,9921 0,1000 0,0001 10,4722

0,4000 0,0002 4,0219 0,5000 0,0003 4,0403

2,0000 0,0008 1,6661 1,0000 0,0003 1,9837

4,0000 0,0017 1,2604 2,0000 0,0006 1,4680

В исследуемых пробах необходимо было идентифицировать пик по времени удерживания и масс спектру, совпадающий с временем удерживания пика морфин 2 ТМС производного и пик по времени удерживания и масс спектру, совпадающий с временем удерживания пика трамадол ТМС производного, пик по времени удерживания, совпадающий с временем удерживания пика бупренорфин ТМС производного.

В контрольной пробе - идентифицировали пик по времени удерживания и масс-спектру, совпадающий с временем удерживания и масс-спектром пика морфин 2 ТМС производного и пик по времени удерживания и масс-спектру, совпадающий с временем удерживания и масс-спектром пика трамадол ТМС производного (рисунки 9-17). Концентрация морфина и трамадола в контрольных пробах должна быть в

пределах 8% истинного значения для морфина и 9% истинного значения для трамадола. Если величина концентрации находится за этим пределом необходимо провести новую калибровку.

Примеры хроматограмм извлечений из образцов крови и масс-спектры ТМС производных морфина, трамадола и бупренорфина, полученные в различных режимах, представлены на рисунках 9-17.

Abundanсе

зосю

2500 2000 1 500

tor» 429.00 (428.70 to 429.70): 11 353Ы .OXdata.ms 8.Й17 Ion 414.00 (413.70 to 414.70): 1 1353Ы DSdata.ms Jon 401.00 (400.70 to 401.70): 113F.3b1,D\data,m» Ion 450.00 (449.70 to 450.70): 11353b1.D\data.ms

h|jne Z TIVIS 1 7

9.323

aT\

oAW-^e^iSaJ ¿-ЗЭЕ

9.Ю 6.20 а.ЗО 8.4D B.50 Э.бО 8.70 в.SO в.ЭО в.ОО 9.1Q 9.20 Э.ЗО

Рисунок 9. Фрагмент хроматограммы извлечения из образца сыворотка, с пиком 2 ТМС производного морфина с экстракцией по характеристическим ионам в режиме SCAN.

зооо ZOOO

В1Э (8.217 ГП1П): 11363В1 .D\date.ma (-в 1 в) (-)

JiZiZ

гво 2вО ЗОО 32Q ЗДО 30О 380

Л S®

400 420 <4-40 4вО

4вО SOO

Abundn

бООО SO О О 4000 ЗООО 2000

2ВО ЗОО 320 3-«»0 ЗвО ЗвО 400 420 4ДО 4вО 4ВО 500

Рисунок 10. Масс-спектр морфин 2 ТМС производного (извлечение из крови и библиотечный) в режиме SCAN,

Abundance

Ion 335.00 (334.70 to 335.70) Ion 320.00 (319.70 to 320.70) Ion 245.00 <244.70 to 245.70) Ion 216.00 (215.70 to 216.70)

Ion 450.00 (449.70 to 450.70)

11751Ы .D\data.ms 11751M .DXdata.ms 11751b1.D\data.ms 11751 b1. DNdata.ms

11751Ы .DWata.ms

7.630 ,

6.006.106.206.306.406.506.606.706.806.907.007.107.207.307.407.507.60

Time-->

Рисунок И. Фрагмент хроматограммы извлечения из образца сыворотки, с пиком ТМС производного трамадола с экстракцией по характеристическим ионам в режиме SCAN.

9ÛOO «ООО "Г ООО

4000 »ООО 2000 1 ООО

Scan 409 (в.бй7 m(ri): 117S1b1.D\de

90Q0

7000 eooo

6QOO 4000 зооо 2000 1 ООО

дДц;

ЮО ISO 200 2SO ЗОО 350

»•«ЗО-»; Тгвтяйо! ТМ£

4во еоо sso еоо eso

1 -to 1 &S»

SO ЮО 1 SO ZOO SSO ЗОО 350 400 4БО soo sso еоо €>бО

Рисунок 12. Масс-спектр трамадол ТМС производного (извлечение из крови и библиотечный) в режиме SCAN.

■з

•s.

>c >5 ío ^

a»

ats

M 04 ^ . J S Ä Sî

& * о S й

4 J ¿ s-f

e §

I I

О Ä

О/ Q

» Л

О ^

° S

Ox S

Ä ;

■s- :

1 i

ïo ^

S .Si о a

0 M о 0 о о о о

A 01 В ООО ООО Og о о

ьььь ¿¿¿s

S «

Abund^inco

1 -I ООО

1 osoo 1 OOOO 9500 9 ООО 8500

eooo

7500 7000 6500

eooo ssoo

£5 ООО 4500 4QOO 3SOO ЭООО 2500 2000 I soo -»ООО soo

Scan 878 (12.743 mln): 117S1 bs.DVdata.ma

44044545045546046547047548048549019550060551 OS1 552052553C635540S4S

Лгсунок 75. Масс-спектр ТЫС-производного бупренорфипа в режиме SIM.

Abundance

Time—>•

Рисунок 16. Фрагмент хроматограмиы извлечения из образца сыворотки с пиком ТЫС производного траиадола с жстракциеи по характеристическим ионам в режиме SIM.

АЬигк(ян1со

22000 20000 1вООО 16000 14000 12000 ЮООО 8000 еооо

4000

Эсап 43 (6.411 ним) 11751 bs.D4data.ms

210 220 230 24 О 250 260 270 2вО 2ЭО ЗОО 310 320 ЗЗО 340

т/л—

Рисунок 17. Масс-спектр ТМС производного трамадола в режиме $1М.

Разработанная мешдика была апробирована в ГУЗ МО Бюро СМЭ МЗ МО при исследовании образцов аутопсийной крови и крови живых лиц. В результате по разработанной методике морфин был обнаружен в интервале концентраций 0,01-30,0 мг/мл, трамадол - 0,01-9,0 мг/мл.

Были проанализированы 1318 образцов аутопсийной крови, среди них:

- в результате количественного определения (674-х положительных образцов крови на наличие морфина) в 30 % случаев концентрация морфина была летальной, в 50 % - токсической, а в 20% - терапевтической;

- в результате количественного определения (178-х положительных образцов крови на наличие трамадола) в 4 % случаев концентрация трамадола была летальной, в 21 % - токсической, а в 75% - терапевтической.

И 257 образцов сыворотки крови живых лиц, среди них:

- в результате количественного определения (114-ти положительных образцов крови на наличие морфина) в 2 % случаев концентрация морфина была летальной, в 55 % - токсической, а в 43% - терапевтической;

- в результате количественного определения (54-х положительных образцов крови на наличие трамадола) в 0 % случаев концентрация трамадола была летальной, в 7 % - токсической, а в 93% - терапевтической.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Использование смеси хлористый метилен - изобутанол (9:1) для проведения процедуры жидкость-жидкостной экстракции позволяет получить высокие и стабильные значения интенсивностей хромато графических пиков молекулярных ионов сшгальных производных морфина и трамадола.

2. Использование трис-буфера для создания рН среды при проведении жидкость-жидкостной экстракции позволяет получить высокие и стабильные значения интенсивностей хроматографических пиков молекулярных ионов силильных производных морфина и трамадола.

3. Использование силилирования в качестве дериватизирующей процедуры увеличивает чувствительность газохроматографического определения и позволяет детектировать низкие концентрации морфина и трамадола в крови.

4. При проведении процедуры жидкость-жидкостной экстракции, использование ферментативного гидролиза, значительно увеличивает выход морфина и трамадола.

5. В качестве внутреннего стандарта был выбран бупренорфин вследствие его хороших хроматографических свойств, одинаковых условий экстракции и дериватизации, стабильности полученных результатов, схожести в химических структурах, возможности проведения анализа в тех же условиях и доступности его для закупки на территории РФ.

6. Разработана методика количественного определения морфина и трамадола методом газовой хроматографии с масс-селекгивным детектором (ГХ-МС) в крови с использованием процедуры жидкость-жидкостной экстракции.

7. Разработанная методика обладает необходимой правильностью, прецизионностью, специфичностью, линейностью. Предел количественного определения для морфина и трамадола составляет 0,010 мг/л.

8. Предложенная методика количественного определения морфина и трамадола методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором была применена в судебно-химическом отделе ГУЗ МО Бюро судебно-медицинской экспертизы при проведении химико-токсикологических исследований.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Заикин К.С. Количественный анализ морфина и некоторых его аналогов в крови //Материалы итоговой научной студенческой конференции с международным участием «Татьянин день», посвященной 250-летию Московской медицинской академии им.И.М. Сеченова. - Москва ФГОУ «ВУНМЦ Росздрава», 2007. - С. 5-6.

2. Заикин К.С. Количественный анализ морфина и некоторых его аналогов в крови. //Материалы VIII конгресса «Науки о человеке» молодых ученых и специалистов. - Томск, 2007. - С. 227-228.

3. Заикин К.С., Крупина H.A. Определение морфина в крови. Обзор данных ГУ Бюро Судебно-медицинской экспертизы Министерства Здравоохранения московской области //Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. Научно-практический журнал. - Москва, 2008. - №6. - С. 24-26.

4. Заикин К.С., Раменская Г.В., Арзамасцев А.П. Фармакокинетика, фармакодинамика и анализ морфина и трамадола //Химико-фармацевтический журнал. - Москва, 2010. - Т. 44. - №2. - С. 3-7.

Заикин Кирилл Сергеевич

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МОРФИНА И ТРАМАДОЛА В

СУДЕБНО-ХИМИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ

14.04.02. - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

Москва-2010

Усл.п. л. - 1.5 Заказ №01541 Тираж: ЮОэкз.

Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.ru

Оглавление диссертации Заикин, Кирилл Сергеевич :: 2010 :: Москва

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Сравнительная характеристика наркотических веществ опийной группы

1.1.1. Лекарственные препараты, в состав которых входят морфин и трамадол.

1.1.2. Особенности строения наркотических анальгетиков морфина и трамадола.

1.1.3. Особенности применения лекарственных препаратов, содержащих морфин и трамадол.

1.1.4. Героин. Виды. Особенности агрегатного состояния и состава.

1.2. Фармакокинетические особенности морфина.

1.3. Фармакокинетические особенности трамадола.

1.4. Специфика проведения химико-токсикологического анализа биологических образцов, содержащих наркотические вещества опийной группы - морфин и трамадол.,

1.4.1. Зависимость концентрации вещества в крови от места отбора пробы.

1.4.2. Дифференцирование лекарственного потребления кодеина от нелегального приёма опиатов.

1.4.3. Особенности стабильности опиатов в образцах при различных условиях хранения проб.

1.4.4. Развитие толерантности и зависимости при употреблении опиатов

1.5. Методы исследования морфина и трамадола, применяемые в судебно-химическом анализе.

1.5.1. Иммунные методы.

1.5.2. Хроматографические методы.

Выводы

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Обнаружение опиатов в моче человека методом иммуноферментно-го анализа с помощью набора реагентов «Дианарк 0».

2.2. Анализ морфина и трамадола методом ГХ-МС.

Глава 3. Разработка методик количественного определения морфина и трамадола в крови.

3.1. ИФА как предварительный метод анализа мочи, на наличие наркотических веществ группы опия, в том числе морфина.

3.1.1. Проведение анализа.

3.1.2. Учёт результатов.

3.2. Газовая хроматография с масс-селективным детектором как подтверждающий метод анализа морфина и трамадола в крови.

3.2.1. Выбор оптимальных условий ЖЖЭ морфина и трамадола.

3.2.2. Количественное определение морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором.

3.2.3. Практическое применение метода ГХ-МС для количественного определения морфина и кодеина в крови.

Выводы.

Введение диссертации по теме "Фармацевтическая химия, фармакогнозия", Заикин, Кирилл Сергеевич, автореферат

Актуальность темы.

В настоящее время препараты из группы агонистов опиоидных рецепторов, такие как морфин и трамадол, широко применяются как лекарственные средства. Их применение с немедицинскими целями, а также применение героина, одним из метаболитов которого является морфин, распространено у людей с наркотической зависимостью. Часто эти вещества являются причиной передозировок и летальных исходов [2-3,27].

В судебно-химическом анализе для определения агонистов опиоидных рецепторов применяются: высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ); газожидкостная хроматография (ГЖХ); иммунные методы. В настоящее время развитие газовой хроматографии с масс-селективным детектором (ГХ-МС) делает этот метод наиболее предпочтительным и перспективным. Метод обладает высокой селективностью, а требуемый предел количественного определения (0,01 мг/л) может быть достигнут при изменении условий хроматографирования.

В связи с тем, что в отечественной литературе отсутствуют валидиро-ванные методики определения морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором, учитывающие последние разработки в этой области, актуальной задачей является разработка метода количественного определения морфина и трамадола, который позволит определять эти вещества в крови на уровне терапевтических концентраций.

Сложность в анализе этих препаратов в крови в рамках химико-токсикологических и судебно-химических исследований обусловлена их низкой дозировкой, низкой терапевтической концентрацией, а также сложной биологической матрицей.

Всё вышеизложенное определило цели и задачи исследования.

Цель исследования.

Задачи исследования.

1. Изучить влияние различных экстрагентов на эффективность экстракции морфина и трамадола.

2. Изучить влияние реакции среды на выход морфина и трамадола.

3. Разработать методику извлечения с учётом изученных параметров.

4. Изучить влияние ферментативного гидролиза на выход морфина и трамадола.

5. Изучить хроматографические свойства морфина и трамадола, на основе которых подобрать оптимальные условия хроматографирова-ния.

6. Разработать методику количественного определения морфина и тра-мадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором.

7. Провести валидацию метода количественного определения морфина и трамадола.

Научная новизна.

Внедрение результатов исследования.

Практическая значимость.

По результатам серии экспериментов было показано, что проведение ферментативного гидролиза В-глюкуронидазой Helix Pomatia значительно увеличивает выход морфина и трамадола при анализе исследуемых биообъектов. Для создания рН среды может быть рекомендовано использование трис-буфера, так как это позволяет добиться максимального выхода морфина и трамадола и получать наиболее стабильные результаты исследований. Разработанная методика определения морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором позволяют определять данные вещества на уровне предела определения.

Личный вклад соискателя.

Заключение диссертационного исследования на тему "Методы исследования морфина и трамадола в судебно-химическом анализе"

Выводы

1. Использование смеси хлористый метилен — изобутанол (9:1) для проведения процедуры жидкость-жидкостной экстракции позволяет получить высокие и стабильные значения интенсивностей хромато-графических пиков молекулярных ионов силильных производных морфина и трамадола.

6. Разработана методика количественного определения морфина и трамадола методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором (ГХ-МС) в крови с использованием процедуры жидкость-жидкостной экстракции.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Заикин, Кирилл Сергеевич

1. Баффингтон Р., Уилсон М. Детекторы для газовой хроматографии. -М.: Мир, 1993.- 79 с.

2. Веселовская Н.В., Изотов Б.Н. Анализ опиатов в моче.- М.: ММА им. И.М. Сеченова,2002.- 110с.

3. Веселовская Н.В., Коваленко А.Е. Наркотики: свойства, действие, фармакокинетика, метаболизм: Пособие. М.: Триада, 2000.- 205 с.

4. Герасимов А.Н. Медицинская статистика. М.: Медицинское информационное агенство, 2007. - 475 с.

5. Дерффель К. Статистика в аналитической химии. М.: Мир, 1994. -267 с.

6. Еремин С.К., Изотов Б.Н., Веселовская Н.В. Анализ наркотических средств. М.: Мысль, 1993. - 265 с.

7. Заикин К.С., Раменская Г.В., Арзамасцев А.П. Фармакокинетика. фармакодинамика и анализ морфина и трамадола // Химико-фармацевтический журнал. Москва, 2010. - т. 44. - №2. - С. 3-7.

8. Ю.Исакова М.Е., Павлова З.В., Брюзгин В.В. Опиоидный анальгетик центрального действия трамадола гидрохлорид (трамадол) при лечении хронической боли у онкологических больных. //Современная онкология. Клиническая онкология.- 2005.- №7.- С. 12-19.

9. П.Карасек Ф., Клемент Р. Введение в хромато-масс-спектрометрию. — М.: Мир, 1993.-236 с.

10. Краснова P.P., Мельник В.П. Фармако и токсико-кинетические параметры лекарственных, наркотических и других токсических веществ. - М.: Мир, 2000.- 20 с.

11. Мищихин В.А., Панов В.А., Смирнов В.М. Современные проблемы химико-токсикологического анализа наркотических средств: Материалы Всероссийской научно-практической конференции 23-24 сентября 1999. Санкт-Петербург. - 1999. - С. 20-36.

12. Обнаружение морфина, кодеина и диацетилморфина (героина) при судебно-химическом исследовании трупной крови./ Е.М. Салома-тин, Н.А.Горбачева, Б.М. Золотарев, Т.В. Лобачева, А.М.Орлова,-М.: 2005. -24 с.

13. Регистр лекарственных средств (PJIC) России. М., 2008. - вып. 16. 1456 с. 1

14. Регистр лекарственных средств (РЛС) России. М., 2005. - вып. 12.-1440 с.

15. Сакодынский К.И., Бражников В.В., Волков С.А. Аналитическая хроматография и др. М.: Химия, 1993.- 464 с.

16. Симонов Е.А., Найденова Л.Ф., Ворнаков С.А. Наркотические средства и психотропные вещества, контролируемые на территории РФ.-М. :Interlab, 2003.- 412 с.

17. Ahmed I. Al-Asmari and Robert A. Anderson. Method for Quantification of Opioids and their Metabolites in Autopsy Blood by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. // Journal of Analytical Toxicology. 2007. -Ж31.-Р.394-408.

18. Allan J. Barnes, Insook Kim, et. Sensitivity, Specificity, and Efficiency in Detecting Opiates in Oral Fluid with the Cozart® Opiate Microplate EIA and

19. GC-MS Following Controlled Codeine Administration. // Journal of Analytical Toxicology. -2003. №.27. -P.402-406.

20. Amanda J. Jenkins, and Edward J. Cone. Letter to the Editor: Time of Heroin Use. // Journal of Analytical Toxicology. 2008. - №.32. - P.454-456.

21. Amanda J. Jenkins, Robert M. Keenan, and Edward J. Cone. Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Smoked Heroin. // Journal of Analytical Toxicology. 1994. - №.18. - P.317-330. 1

22. Anna Koski. Interpretation of postmortem toxicology results.- Helsinki, 2005.- 347 p.

23. Bai Hsiun Chen, E. Howard Taylor, and Alex A. Pappas. Comparison of Derivatives for Determination of Codeine and Morphine by Gas Chromatogra-phy/Mass Spectrometry. // Journal of Analytical Toxicology. 1990. -№.14. —P.12-17.

24. Baselt R.C., Cravey R.H. Disposition of Toxic Drugs and Chemicals in Man, 4th ed. California, 1995.- 734 p.

25. Burt M.J., KIoss J., and Apple F. Postmortem blood free and total morphine concentrations in medical examiner cases. // Journal of Forensic Sciences. -2001.- №.46.-P.l 138-1142.

26. Bynum N.D., J Poklis.L., Gaffney-Kraft M. Posmortem distribution of Tramadol, Amitriptyline, and their metabolites in a suicidal overdose. II Journal of Analytical Toxicology. 2005. - №. 29. - P.401-405.

27. Cameron S. Crandall, Sarah Kerrigan, Roberto L. Aguero. The Influence of Collection Site and Methods on Postmortem Morphine Concentrations in a Porcine Model. // Journal of Analytical Toxicology. 2006. - №.30. -P.651-658.

28. Ceder G., Jones A.W. Concentration ratios of morphine-to-codeine in blood of impaired drivers as evidence of heroin use and not medication with codeine. // Journal of Clinical Chemistry. 2001. - №.47. - P.84-86.

29. Chris W. Chronister, Ansley L. Gund, and Bruce A. Goldberger. Rapid ^Detection of Opioids in Vitreous Humor by Enzyme Immunoassay. // Journal of Analytical Toxicology. 2008. - №.32. -P.601-604.

30. Clarke A.S. Moffat, Galichet « Clarce's Analysis of Drugs and Poisons» 3-th Ed., London: Pharmaceutical press, 2004.- 3 564, 1302, 1655 p.

31. Cone E.J., Holicky B.A., et. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of intranasal "snorted" heroin. // Journal of Analytical Toxicology. 1993. -№.17. -P.37-37.

32. Cynthia Kollias-Bakerl and Richard Sams. Detection of Morphine in Blood and Urine Samples from Horses Administered Poppy Seeds and Morphine Sulfate Orally. // Journal of Analytical Toxicology. 2002. - №.26. -P.81-86.

33. Edward J. Cone, Joe Clarke, Lolita Tsanaclis. Prevalence and Disposition of Drugs of Abuse and Opioid Treatment Drugs in Oral Fluid. // Journal of Analytical Toxicology. 2007. - №.31. - Р424-433Л

34. Edward J. Coned, Howard A. Heit, and Douglas Gourlay. Evidence of Morphine Metabolism to Hydromorphone in Pain Patients Chronically Treated with Morphine. // Journal of Analytical Toxicology. 2006. - №.30. - P.l-5.

35. Edward J. Cone, Mary J. Hillsgrove, et. Sweat Testing for Heroin, Cocaine, and Metabolites. // Journal of Analytical Toxicology. 1994. - №U8. -P.298-305.

36. Edward J. Cone, Yale H. Caplan, Frank Moser. Short Communication: Evidence that Morphine is Metabolized to Hydromorphone But Not to Oxymor-phone. // Journal of Analytical Toxicology. -2008. №.32. -P.319-323.

37. Elisabeth J. Rook, Alwin D.R Huitema, Wim van den Brink. Technical Note: Screening for Illicit Heroin Use in Patients in a Heroin-Assisted Treatment Program. // Journal of Analytical Toxicology. 2006. - №.30. — P.390-394.

38. Forrest A.R. Obtaining samples at post mortem examination for toxico-logical and biochemical analyses. // European Journal of Clinical Pharmacology. 1993. - №.46. - P.6-8.

39. Gerostamoulos J., Drummer O.H. Solid phase extraction of morphine in metabolites from postmortem blood. // Journal of Forensic Sciences. — 1995.-№.77. P.53-63.

40. Gisela Skopp, Beate Ganssmann, and Rolf Aderjan. Plasma Concentrations of Heroin and Morphine-Related Metabolites after Intranasal and Intramuscular Administration. // Journal of Analytical Toxicology. 1997. - №.21. -P. 105-111.

41. Gisela Skopp, Lucia Potsch, and Rainer Mattern. Stability of Morphine, Mor-phine-3-Glucuronide, and Morphine-6-Glucuronide in Fresh Blood and Plasma and Postmortem Blood Samples. // Journal of Analytical Toxicology. -2001. -№.25. -P.2-7.

42. Gisela Skopp, Lucia Potsch, et. A Preliminary Study on the Distribution of Morphine and Its Glucuronides in the Subcompartments of Blood. //Journal of Analytical Toxicology. 1998. - №.22. -P.261-264.

43. Goldberger В.A., Cone E.J. Confirmatory tests for drags in the workplace by gas chromatography-mass spectrometry. // Journal of Chromatography. 1994. - №.41.-P.73-86.

44. Goldberger A., Cone E.J., Grant T.M. Disposition of heroin and its metabolites in heroin-related deaths. // Journal of Analytical Toxicology. -1994. №.18. — P.8-8.

45. Got P., Baud F.J., et. Morphine Disposition in Opiate-Intoxicated Patients: Relevance of Nonspecific Opiate Immunoassays. // Journal of Analytical Toxicology. 1994. - №.18. - P. 189-194.

46. Guillot J.G., Lefebvre M., and Weber J.P. Determination of Heroin, 6-Acetylmorphine, and Morphine in Biological Fluids Using their Propionyl Derivatives with Ion Trap GC-MS. // Journal of Analytical Toxicology. -1997. №.21. - P.127-133.

47. He Y.J., Brockmoller J., Schmidt H. Short Communication: CYP2D6 Ultra-rapid Metabolism and Morphine/Codeine Ratios in Blood: Was it Codeine or Heroin?//Journal of Analytical Toxicology. 2008. - №.32. - P. 178-182.

48. Hee-Ming Lee and Chau-Wing Lee. Determination of Morphine and Codeine in Blood and Bile by Gas Chromatography with a Derivatization Procedure;. // Journal of Analytical Toxicology. 1991. - №.15. -P.182-187.

49. Jasbir Singh, Renee E. Burke, and Linda E. Mertens. Elimination of the Interferences by Keto-Opiates in the GC-MS Analysis of 6-Monoacetylmorphine. // Journal of Analytical Toxicology. 2000. - №.24. - P.27-31.

50. Jenkins A.J., Keenan R.M., Cone E.J. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of smoked heroin. // Journal of Analytical Toxicology. 1994. - №.18. -P.30-32.

51. John Т. Cody, Sandra Valtier, James Kuhlman. Analysis of Morphine and Codeine in Samples Adulterated with Stealth™. // Journal of Analytical Toxicology. -2001.- №.25. -P.572-575.

52. John Wyman and Steve Bultman. Postmortem Distribution of Heroin Metabolites in Femoral Blood, Liver, Cerebrospinal Fluid, and Vitreous Humor. // Journal of Analytical Toxicology. 2004. - №.28. -P.260-263.

53. Jones G.R. Interpretation of postmortem drug levels. In: Karch S, editor. Drug abuse handbook. Boca Raton, CRC Press., 1998. - 85 p.

54. Jones G.R., Pounder D.J. Site dependence of drug concentrations in postmortem blood a case study. // Journal of Analytical Toxicology. — 1987. - №.11. — P.90-91.

55. Joseph Avella, Michael Katz, and Michael Lehrer. Case Report: Assessing Free and Total Morphine following Heroin Overdose when Complicated by the Presence of Toxic Amitriptyline Levels. // Journal of Analytical Toxicology. 2007. - №.31. - P.540-542.

56. Joshua A. Gunn, Cara Shelley, Simon W. Lewis. The Determination of Morphine in the Larvae of Calliphora stygia using Flow Injection Analysis and HPLC with Chemiluminescence Detection. // Journal of Analytical Toxicology. 2006. - №.30. - P.519-523.

57. Kabrena E. Goeringer, Barry K. Logan, and Gary D. Christian. Identification of Tramadol and its Metabolites in Blood from Drug-Related Deaths and Drug-Impaired Drivers. // Journal of Analytical Toxicology. 1997. -№.21.-P.529-537.

58. Kintz P., Mangin P., Lugnier P.P. Toxicological data after heroin overdose. //Journal of Human Toxicology. 1989. - №.8. - P.9-9.

59. Klaas J. Lusthof and Peter G.M. Zweipfenning. Letter to the Editor: Suicide by Tramadol Overdose. // Journal of Analytical Toxicology. — 1998. -№.22. -P.260-260.

60. Kronstrand R. and Jones A.W. Letter to the Editor: Concentration Ratios of Codeine-to-Morphine in Plasma after a Single Oral Dose (100 mg) of Codeine Phosphate. // Journal of Analytical Toxicology. 2001. - №.25. -P.486-487.

61. Levine В., Pestaner J.P., and Smialek J.E. Palliative pain therapy at the end of life and forensic medicine issues. // American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 2001. - №.22. - P.62-64.

62. Logan B.K., Smirnow D. Postmortem distribution and redistribution of morphine in man. // Journal of Forensic Sciences. 1996. - №.41. - P.37-46.

63. Mariano Cingolani, Rino Froldi, et. Detection and Quantitation of Morphine in Fixed Tissues and Formalin Solutions. // Journal of Analytical Toxicology. 2001. - №.25. - P.31 -34.

64. Marjolein G. Klous, Elisabeth J. Rook, Michel J.X. Hillebrand. Deuterodiacetylmorphine as a Marker for Use of Illicit Heroin by Addicts in a Heroin-Assisted Treatment Program. // Journal of Analytical Toxicology. 2005. - №.29. - P.564-569.

65. Mark M. Kushnir, David K. Crockett, and Francis M. Urry. Comparison of Four Derivatizing Reagents for 6-Acetylmorphine GC-MS Analysis. // Journal of Analytical Toxicology. 1999. - №.23. -P.262-269.

66. Maurer H.H. Systematic toxicological analysis of drugs and their metabolites by gas chromatography-mass spectrometry. // Journal of Chromatography. 1992. - №.34. -P.3-41.

67. McQuay H.J., Carroll D., Faura C.C. Oral morphine in cancer pain: influences on morphine and metabolite concentration. // European Journal of Clinical Pharmacology. 1990. - №.48. -P.236-244.

68. Meatherall R. CC-MS confirmation of codeine, morphine, 6-acetylmorphine, hydrocodone, hydromorphone, oxycodone, and oxy-morphone in blood. // Journal of Analytical Toxicology. 1999. -№.23. -P.177-186.

69. Moriya F., Hashimoto Y. Distribution of free and conjugated morphine in body fluids and tissues in a fatal heroin overdose: is conjugated morphine stable in postmortem specimens. // Journal of Forensic Sciences. 1997. - №.42. - P.40-40.

70. Mueller R.Klaus. Toxicological Analisis.-l-th edition.- Leipzig.: Edition MolinApress, 1995.- 846 p.

71. Pai-Sheng Cheng, Choung-Huei Lee, and Chun-Sheng Chien. Simultaneous Determination of Ketamine, Tramadol, Methadone, and their Metabolites in Urine by Gas Chromatography-Mass Spectrometry. // Journal of Analytical Toxicology. 2008. - №.32. - P.253-259.

72. Peterson,G.M., Randall C.T. Plasma levels of morphine and morphine glucuronides in the treatment of cancer pain: relationship to renal function and route of administration. // European Journal of Clinical Pharmacology. 1990. -№.38. - P. 121-124.

73. Pfleger K., Maurer H.H., Weber A. Mass Spectral and GC Data of Drugs, Poisons, Pesticides, Pollutants and their Metabolites, Second ed.- Wein-heim New York - Basel - Cambridge, 1992. - part 1. -1266 p.

74. Pfleger, Maurer, Weber. Mass Spectral and GC Data of Drugs, Poisons, Pesticides, Pollutants and Their Metabolites. 2-d Ed. - Weinheim.: New York, Totonto, 2000.- 834 p.

75. Philip Kemp, Gary Sneed, and Vina Spiehler. Validation of a Microtiter Plate ELISA for Screening of Postmortem Blood for Opiates and Benzodiazepines. // Journal of Analytical Toxicology. 2002. - №.26. - P.504-512.

76. Phillips S.G. and Allen K.R. Acetylcodeine as a Marker of Illicit Heroin Abuse in Oral Fluid Samples. // Journal of Analytical Toxicology. 2006. -№.30. -P.370-374.

77. PokP. Rop, MoniqueFornaris, Thierry Salmon. Case Report: Concentrations of Heroin, 06-Monoacetylmorphine, and Morphine in a Lethal Case Following an Oral Heroin Overdose. // Journal of Analytical Toxicology.1997. -№.21. -Р.232-235.

78. Pounder D.J., Jones G.R. Post-mortem drug redistribution a toxicologi-cal nightmare. // Journal of Forensic Sciences. - 1990. - №.45. - P.63-64.

79. Raffa RB. Pharmacology of oral combination analgesigs: rational therapy for hain. // Journal of Clinical Pharmacology. 2001. - №.257. - P.64-68.

80. Robert Meatherall. GC-MS Quantitation of Codeine, Morphine, 6-Acetylmorphine, Hydrocodone, Hydromorphone, Oxycodone, and Oxymor-phone in Blood. // Journal of Analytical Toxicology. — 2005. №.29. — P.301-308.

81. Robert W. Romberg and Liewen Lee. Comparison of the Hydrolysis Rates of Morphine-3-Glucuronide and МофЫпе-6-Glucuronide with Acid and P-Glucuronidase. // Journal of Analytical Toxicology. 1995. - №.19. -P.157-162.

82. Rudolf Brenneisen, Felix Hasler, and Daniel Wursch. Acetylcodeine as a Urinary Marker to Differentiate the Use of Street Heroin and Pharmaceutical Heroin. // Journal of Analytical Toxicology. 2002. - №.26. - P.561-566.

83. Sam Niedbala R., Keith Kardos, Joseph Waga. Laboratory Analysis of Remotely Collected Oral Fluid Specimens for Opiates by Immunoassay. // Journal of Analytical Toxicology. -2001. №.25. -P.310-315.

84. Sarah Kerrigan, Donna Honey, and Ginger Baker. Case Report: Postmortem Morphine Concentrations Following Use of a Continuous Infusion Pump. // Journal of Analytical Toxicology. 2004. - №.28. - P.529-532.

85. Sirpa Mykkanen, Janne Seppala, and Pirjo Lillsunde. GCD Quantitation of Opiates as Propionyl Derivatives in Blood. // Journal of Analytical Toxicology. 2000. - №.24. -P.122-126.

86. Staub C., Jeanmonod R., Frye O. Morphine in postmortem blood: its importance for the diagnosis of deaths associated with opiate addiction. // International Journal of Legal Medicine. 1990. - №.104. -P.39-42.

87. Susan B. Gock, Steven H. Wong, and Jeffrey M. Jentzen. Case Report: Self-Intoxication with Morphine Obtained from an Infusion Pump. // Journal of Analytical Toxicology. 1999. - №.23. -P.130-133.

88. Timothy P. Rohrig, Christine Moore. The Determination of Morphine in Urine and Oral Fluid Following Ingestion of Poppy Seeds. // Journal of Analytical Toxicology. 2003. - №.27. - P.449-452.

89. United States Pharmacopea.-29 th End.-p.905.

90. Wagdy W. Wahba and Charles L. Winek, Leon Rozin. Letter to the Editor:

91. Distribution of Morphine in Body Fluids of Heroin Users. // Journal of Analytical Toxicology. 1993. - №.17. - P. 123-124.

92. William E. Wingert, Lisa A. Mundy, Lauren Nelson. Detection of Clenbuterol in Heroin Users in Twelve Postmortem Cases at the Philadelphia Medical. // Journal of Analytical Toxicology. 2008. - №.32. — P.522-528.

93. Yunhua He, Jiuru Lu, and Fei Nie. Determination of Morphine by Molecular Imprinting-Chemiluminescence Method. // Journal of Analytical Toxicology. 2005. - №.29. - P.528-532.