Автореферат и диссертация по медицине (14.01.04) на тему:Методы этиологической диагностики внебольничной пневмонии и особенности иммунореактивности в зависимости от этиологического фактора

На правах рукописи УДК: 616.24-002-07-02: 612.017.1.

Пустовалов Алексей Алексеевич

МЕТОДЫ ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ВНЕБОЛЬНИЧНОЙ ПНЕВМОНИИ И ОСОБЕННОСТИ ИММУНОРЕАКТИВНОСТИ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ЭТИОЛОГИЧЕСКОГО ФАКТОРА

14.01.04 - внутренние болезни (мед. науки) 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология (мед. науки)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России)

Научные руководители:

академик РАМН, профессор доктор медицинских наук

Соколов Евгений Иванович Зыков Кирилл Алексеевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Теблоев Константин Иналович Латышева Татьяна Васильевна

Ведущая организация:

ГУ Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского

41* Ок_

_2012 года в

Л

ч

Защита состоится «/ 7"» С/ V_2012 года в -^Зчасов на заседании

диссертационного совета Д208.041.01 ГБОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России (127473, Москва, ул. Делегатская, д.20/1/

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России (127206, Москва, ул. Вучетича, д. 10а).

Автореферат разослан «/С» О _2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Е.Н.Ющук

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ

БИБЛИОТЕКА _2012_

Актуальность проблемы

Внебольничные пневмонии (ВП) относятся к числу наиболее распространенных острых инфекционных заболеваний. Так в США ежегодно выявляется 5,6 млн. случаев ВП, из которых 1,7 млн. госпитализируются, при этом от 10 до 20% госпитализированных пациентов нуждаются в интенсивной терапии (File Т.М., Marrie T.J., 2010), а в странах Европейского Союза более 3 млн. В России по данным Центрального научно-исследовательского института организации и информатизации здравоохранения, в 2006 г. было зарегистрировано 591493 случаев заболевания ВП. Однако по оценкам специалистов эти цифры не отражают реальную картину заболеваемости, которая по расчетам составляет более 1,5 млн случаев ВП в год. Таким образом, большинство пациентов остаются неучтенными (Чучалин А.Г., 2010).

По данным National Center for Health Statistics, с возрастом более чем в 10 раз увеличивается частота госпитализаций и летальность среди больных старше 60 лет по сравнению с другими возрастными группами (Яковлев C.B., 2006; Синопальников А.И., 2003). Так у лиц молодого и среднего возраста заболеваемость составляет до 11,6%о, а у лиц старших возрастных групп до 44%о (Чучалин А.Г., 2010; Синопальников А.И., 2003).

В развитых странах ВП занимает 4-6 место среди всех причин смертности и 1 место среди инфекционных заболеваний. В США в 2006 году от ВП умерло более 60000 человек (File T.M., Marrie Т.J., 2010). По данным Минздравсоцразвития России в 2006 г. в нашей стране от ВП умерли 38970 человек, что составляет 27,3 случая на 100 000 населения (Чучалин А.Г., 2010).

Необходимо также отметить, что ВП представляет собой и экономическую проблему. Так было показано, что в Европе в 2002 году на лечение пациентов с ВП было потрачено 10,1 миллиарда евро, из них 5,7 миллиарда на госпитализированных пациентов (Polverino Е., Torres М.А.), а в США более 17 миллиардов долларов (File T.M., Marrie T.J., 2010).

К сожалению, несмотря на большое количество различных методов лабораторной диагностики в 50-70% случаев не удается установить

этиологический фактор (Козлов P.C., Синопальников А.И., 2005), что в ряде случаев приводит к назначению неадекватной терапии. Как правило, пациенты с ВП получают эмпирическую терапию антибиотиками широкого спектра действия в качестве стартовой терапии, которая в идеальном варианте должна быть заменена на антибиотики узкого спектра после установления этиологического фактора.

В настоящее время активно обсуждается возможность иммунотропной терапии респираторных заболеваний, при этом в ряде работ было показано влияние этиологического фактора на особенности течения воспалительного процесса, однако эти данные не были систематизированы у пациентов с ВП.

Все вышеизложенное определило цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования

Целью работы являлось сравнение различных методов этиологической диагностики и определение особенностей иммунореактивности организма у пациентов с нетяжелой внебольничной пневмонией.

Задачи исследования

1. Определить частоту встречаемости различных возбудителей у пациентов с нетяжелой ВП;

2. Сравнить ценность различных методов выявления возбудителей (культуральный, серологический и ПЦР-методы) у пациентов с нетяжелой ВП;

3. Исследовать особенности клеточного (лимфоциты, нейтрофилы, моноциты) и гуморального (иммуноглобулины) звеньев иммунитета у пациентов с нетяжелой ВП в зависимости от выявленного возбудителя;

4. Исследовать особенности цитокинового статуса у пациентов с нетяжелой ВП в зависимости от выявленного возбудителя;

Научная новизна

1. Впервые, комплексно в одной работе проведена оценка значимости различных методов этиологической диагностики ВП в реальной клинической практике.

2. Впервые проведено комплексное исследование включающее в себя оценку изменений, как маркеров системного воспалительного ответа, так и различных звеньев иммунной системы у пациентов с нетяжелой ВП, в зависимости от этиологического фактора.

Практическая значимость

1. Полученные результаты позволяют внести изменения в алгоритмы этиологической диагностики ВП в зависимости от ценности различных методов для определения этиологического фактора.

2. Результаты работы указывают на необходимость учитывать различие фенотипов воспалительного процесса в зависимости от особенностей патогена при решении вопроса об иммунокорригирующей терапии.

Основные положения выносимые на защиту

С целью наиболее эффективной этиологической диагностики ВП в алгоритме лабораторного обследования целесообразно комбинирование различных методов (микробиологических, молекулярно-генетических, серологических), так как чувствительность и специфичность данных методов зависит от типа возбудителя.

В условиях современной клинической практики основным этиологическим фактором ВП по-прежнему - является S. pneumonia.

У пациентов с ВП системный иммунный ответ не имеет выраженных различий, зависящих от этиологического фактора, но наблюдается тенденция к изменению уровня цитокинов в исследуемых группах.

Внедрение

Результаты исследования внедрены в клиническую практику МНЦ «Лечу», в учебный процесс кафедры факультетской терапии и профессиональных болезней МГМСУ на базе ГКБ №70.

Апробация диссертации состоялась 16 ноября 2011 г. на совместном заседания кафедры факультетской терапии и профессиональных болезней МГМСУ, лаборатории пульмонологии отдела клинической медицины НИМСИ МГМСУ, сотрудников лаборатории иммунопатологии РКНПК.

Личное участие автора в получении научных результатов В ходе проведения работы соискателем были освоены методы этиологической диагностики внебольничной пневмонии. Автором лично были выполнены молекулярно-генетические и серологические исследования. Освоены современные методы статистического анализа, лично проведен статистический анализ полученных данных и их интерпретация.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ, из них 2 опубликованы в журналах рекомендованных ВАК Минобрнауки России.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 96 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, заключения, практических рекомендаций и выводов. Работа иллюстрирована 14 рисунками, 24 таблицами. В диссертации приведены ссылки на работы отечественных и зарубежных авторов. Библиографический указатель содержит 80 источников.

Содержание работы Общая характеристика больных, материалы и методы исследования На этапе скрининга было обследовано 380 пациентов с внебольничной пневмонией. В работу было включено 30 пациентов (20 мужчин и 10 женщин) с диагнозом внебольничной пневмонии нетяжелого течения с нормальным воспалительным ответом и не имеющих сопутствующей патологии влияющей на иммунный ответ. Возрастной диапазон пациентов составлял от 21 до 75 лет (50,5±3,4).

Критериями включения в исследование являлись:

• наличие у пациента определенного диагноза внебольничной пневмонии нетяжелого течения (2 и 3 группы) в соответствии с «Практическими рекомендациями по диагностике, лечению и профилактике внебольничной пневмонии у взрослых, 2003»;

• рентгенологическое подтверждение очаговой инфильтрации;

• наличие не менее двух из перечисленных признаков: острая лихорадка 10 тела >38,0°С, кашель с мокротой, физикальные признаки, лейкоцитоз (>10х109/л) или палочкоядерный сдвиг (>10%);

• возраст от 20 до 80 лет включительно

• наличие информированного согласия пациента.

Критерии исключения были следующие:

• отказ больного от участия в исследовании;

• участие в другом исследовании;

• любые иные, помимо ВП, острые и хронические (в стадии обострения) заболевания воспалительного характера;

• прием антибактериальных препаратов до поступления в стационар;

• онкологические заболевания;

• туберкулез в анамнезе;

• другие сопутствующие заболевания или состояния, которые, по

мнению исследователя, могут нарушить ход исследования.

Возраст\пол Мужчины Женщины Всего

20-30 4 2 6

31-40 1 3 4

41-50 2 - 2

51-60 4 2 6

61-70 5 3 8

71-80 4 - 4

Всего 20 10 30

Таблица I. Распределение больных по полу и возрасту.

Исследование состояло из двух частей:

1. Сравнение методов определения этиологии возбудителя ВП у пациентов, поступивших на стационарное лечение.

2. Определение особенностей иммунного ответа при различных видах возбудителей ВП.

Обследование пациентов и сбор материалов для исследований проводились в 1-й день поступления в стационар, до начала лечения.

Оценку клинической характеристики пациентов проводили с учетом жалоб пациентов, а также данных физикального и рентгенологического исследования. Лабораторные методы исследования состояли из общеклинических (клинический и биохимический анализ крови, общий анализ мочи) и специальных.

Специальные исследования:

• культуральное исследование мокроты - материал высевали на твердые питательные среды (кровяной агар, Эндо, шоколадный агар, среда Сабуро) и культивировали в течение 18-24 часов при температуре 36-37°С.

• ПЦР-диагностика мокроты и крови - с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле (амплификатор «Терцик» -ООО «ДНК-технология», камеры SE-2 - «Хеликон»),

• серологическая диагностика бактериальных (Chi. pneumoniae и М. pneumoniae) и вирусных (простой герпес 1 и 2 типа) инфекций методом иммуноферментного анализа (ИФА), тест системами Savyon Diagnostics (Израиль) и НПО «Диагностические системы» (Россия, Нижний Новгород) на микропланшетном ридере Anthos-2020 (Австрия).

• определение вчСРБ и иммуноглобулинов А, М, G на анализаторе белков крови «Беринг Нефелометр» BN ProSpec (Dade-Behring Marburg GmbH, Германия).

• определение уровня цитокинов ИЛ-lß, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10 и ИФН-у в сыворотке крови методом ИФА, тест системами «Цитокин» Санкт-Петербург, Bender MedSystems и Biosoruce (Бельгия) на микропланшетном ридере TECAN SUNRISE (Австрия).

• иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови - на проточном цитофлуориметре Cytomics FC 500 с использованием моноклональных антител с двойной меткой - флюоресцеин-5-изотиоцианат/фикоэритрин (Bekcman Coulter, США). Определяли: CD3+ (зрелые Т-лимфоциты), CD3+/CD4+ (Т-хелперы/индукторы), CD3+/CD8+ (Т-цитотоксические), CD3-/CD( 16+56) (NK-клетки); CD19 (В-лимфоциты), CD3+/CD25+ (активированные Т-лимфоциты), HLA-DR+ (активированные лимфоциты), CD50+ (лимфоциты, с молекулу межклеточной адгезии), CD3+CD95+ (Т-лимфоциты, несущие Fas-рецептор-проводник апоптотического сигнала внутрь клетки), иммунорегуляторный индекс (отношение CD4/ CD8).

• Функциональная активность нейтрофилов оценивалась по их способности поглощать частицы латекса в базапьных и стимулированных (зимозан) условиях. Определяли: фагоцитарную активность, фагоцитарное число, резервную возможность.

Описание массивов данных проводилось с использованием параметрических - среднее, стандартная ошибка среднего и непараметрических - медиана, 25-й и 75-й процентили критериев. Для статистического анализа использовали параметричесие - Т-критерий Стьюдента, критерий Дункана, коэффициент корреляции Пирсона и не парметрические - критерий Манна и Уитни и коэффициент корреляции Спирмена критерии. Статистическую обработку полученных результатов выполняли с помощью компьютерной программ SPSS 13,0.

Результаты исследования и их обсуждение

По данным рентгенологического исследования органов грудной клетки у 100% пациентов выявлены инфильтративные изменения в легких различной

локализации. У всех пациентов поражение легочной ткани было ограничено

одной долей (таб. 2).

Локализация поражения Количество пациентов % пациентов

нижнедолевая правосторонняя 21 70

нижнедолевая левосторонняя 6 20

среднедолевая правосторонняя 2 6,7

верхнедолевая левосторонняя 1 3,3

Таблица 2. Локализация поражения

Всем пациентам для установления этиологического фактора было проведено микробиологическое, молекулярно-генетическое и серологическое исследование.

Наличие патогенной флоры было выявлено у 23 пациентов (76,7%) из 30, и лишь у 7 пациентов (23,3%) патогенная флора не определялась. При этом необходимо отметить, что среди возбудителей преобладал Streptococcus pneumoniae, который был выявлен у 53,3% пациентов, что совпадает с данными зарубежной литературы (Cilloniz С., Ewig S., Polverino Е., 2011).

Сравнение результатов микробиологического и молекулярно-генетического (ПЦР) исследований показало, что данные микробиологического исследования не отражают полную этиологическую картину, так как у всех пациентов была выявлена лишь монобактериальная флора, в то время как при ПЦР было показано наличие у данных пациентов бактериальных и вирусно-бактериальные микстов (таб. 3).

Показатель ПЦР крови (кол-во пациентов) ПЦР мокроты (кол-во пациентов) Микробиология (кол-во пациентов)

Выявлены возбудители 2 (6,7%) 19(63,3%) 19(63,3%)

Монобактериальная этиология 0 10(33,3%) 19(63,3%)

Бактериальные миксты 0 5 (16,7%) 0

Вирусно- бактериапьные миксты 2 (6,7%) 4(13,3%) -

Таблица 3. Сравнение данных ПЦР- и микробиологической диагностики.

При микробиологическом исследовании позволяющем выявлять бактериальные патогенны, было получено 19 положительных результатов, а при ПЦР исследовании мокроты, которое позволяет, по-мимо, бактериальных выявлять также вирусы и атипичные возбудители был получен 31 положительный результат (учитывая миксты) (рис. 1)

30 -

25 "

20 "

15 "

10 "

ПЦР крови ПЦР мокроты микробиология мокроты Рисунок 1. Сравнение данных ПЦР и микробиологической диагностики (количество положительных результатов).

В зависимости от используемого метода различался и спектр выявляемых возбудителей. При микробиологическом исследовании наиболее часто выявлялся S. pneumoniae (46,6%), что совпадает с ПЦР диагностикой (46,6%). Сопоставимо было не только количество положительных результатов, но и пациенты у которых данный возбудитель определялся (таб. 4).

Показатель ПЦР крови (кол-во пациентов) ПЦР мокроты (кол-во пациентов) Микробиология (кол-во пациентов)

Mycoplasma pneumoniae - 2 (6,7%) -

Streptococcus pneumoniae 1 (3,3%) 14(46,6%) 14(46,7%)

Klebsiella pneumoniae 2 (6,7%) 4(13,3%) 2 (6,7%)

Haemophilus influenzae 0 8 (26,7%) 3 (10,0%)

Adenovirus 2 (6,7%) 4(13,3%) -

Таблица 4. Сравнение данных ПЦР и микробиологической диагностики (спектр выявляемых возбудителей).

Учитывая полученные данные, совпадение результатов микробиологического и ПЦР исследования при бактериальных возбудителях, мы можем говорить о необходимости комбинации данных методов. При этом, ПЦР исследование может служить в качестве скринингового метода для ранней этиологической диагностики, а микробиологическое для определения чувствительности возбудителей к антибиотикам, что позволит выбрать наиболее оптимальный препарат при необходимости смены стартовой терапии.

Также необходимо отметить, что ПЦР исследование крови у пациентов с нетяжелой ВП не имеет смысла, учитывая низкий процент положительных результатов.

Полученные нами данные о роли ПЦР для этиологической диагностики поддерживают и другие авторы, которые показали, что Real-time ПЦР, позволяет, не только быстро (в течение нескольких часов) определить наличие возбудителя и его количество, но и генетические основы устойчивости патогена к антибактериальной терапии. Наиболее перспективным является мультиплексная ПЦР в режиме реального времени, позволяющая проводить количественную оценку различных возбудителей в одной пробе (Thurman К.А., Warner А.К., Cowart К.С, 2011).

По нашим данным диагноз атипичной пневмонии был выставлен 10 пациентам. У 6 пациентов была микоплазменная пневмония и у 4 хламидийная. При ПЦР исследовании мокроты Mycoplasma pneumoniae была выявлена у 2-х пациентов, в то время как при серологическом исследования сыворотки крови антитела класса IgM к Mycoplasma pneumoniae, свидетельствующие об остроте процесса и позволяющие поставить этиологический диагноз, были выявлены у 6 пациентов включая тех, у кого возбудитель был обнаружен при ПЦР.

У всех 4 пациентов с хламидийной пневмонией диагноз был установлен на основании серологической диагностики (увеличение титра антител класса IgM к Chlamydophila pneumoniae), при ПЦР исследовании возбудитель не выявлен.

Антитела класса IgG к Mycoplasma pneumoniae и Chlamydophila pneumoniae были выявлены у 10 и 21 пациента соответственно. Преобладание IgG у данных пациентов может свидетельствовать о наличии хронического процесса, носительстве или о том, что от начала заболевания прошел определенный период времени.

Показатель ПЦР мокроты (кол-во пациентов) ИФА (кол-во пациентов)

Ш IgG

Mycoplasma pneumoniae 2 (6,7%) 6 (20,0%) 10 (33,3%)

Clamydophila pneumoniae 0 4(13,3%) 21 (70,0%)

Таблица 5. Сравнение результатов ПЦР и серологической диагностики.

Таким образом, при атипичных возбудителях, для которых микробиологическая диагностика представляет собой чрезвычайно трудоемкий и длительный процесс, так как микроорганизмы растут крайне медленно, и требуют специальных сред (Loens К., Van Heirstraeten L., 2009), серологическая диагностика с определением уровня антител класса IgM к Mycoplasma pneumoniae и Chlamydophila pneumoniae является высокочувствительным методом этиологической диагностики при ВП и может использоваться для раннего выявления данных патогенов. Диагностика же атипичных инфекций по изменению титров IgG может быть использована для эпидемиологических исследований, но не в реальной клинической практике, так как диагностическое значение имеет четырехкратное нарастание титров IgG в парных сыворотках. Однако этот процесс требует времени, не меньше чем микробиология, так как интервал между забором проб составляет от 7 до 14 дней.

Учитывая, полученные данные мы можем говорить, что при проведении этиологической диагностики ВП необходимо применять сочетание различных методов: микробиологических, молекулярно-генетических и серологических. В тех учреждениях, где есть лаборатории ПЦР, соответствующие всем требованиям, молекулярно-генетические методы диагностики могут быть использованы для ранней и комплексной этиологической диагностики ВП.

В зависимости от результатов этиологической диагностики, все пациенты были разделены на группы:

1. Бактериальная группа (п=12) - пациенты с бактериальными возбудителями без атипии

2. Вирусно-бактериальная группа(п=6) - пациенты, у которых одновременно выявлены бактериальные (включая атипию) и вирусные возбудители

3. Группа атипичных возбудителей (п=5) - пациенты с атипией и другими бактериальными возбудителями

4. Группа без выявленных возбудителей (п=7) - пациенты, у которых возбудитель не выявлен.

Было продемонстрировано, что этиологический фактор оказывает влияние на иммунологические параметры. При исследовании количества лейкоцитов и СОЭ было выявлено увеличение данных показателей (14,2±0,7 и 35,0±0,2 соответственно) относительно нормальных значений.

Также в нашей работе всем больным было проведено исследование вчСРБ. Отмечено его повышение (в среднем 9,2±0,8) по отношению к норме во всех исследуемых группах, что свидетельствует о наличии воспалительного процесса. Достоверных различий между группами не выявлено. При оценке клинических лабораторных общепринятых маркеров системного воспалительного ответа по данным параметрам в исследуемых группах различий не выявлено, что говорит об отсутствии зависимости изменений количества лейкоцитов и СОЭ от этиологического фактора.

Таким образом, системный воспалительный ответ не имеет различий в зависимости от этиологического фактора и не может служить определяющим фактором при назначении патогенетической терапии.

В общем анализе крови необходимо отметить достоверное снижение количества моноцитов (2,7±0,5) в группе пациентов с вирусно-бактериальными возбудителями по сравнению с другими группами. Трактовка данных изменений затруднительна, но так как известно, что для пациентов с длительными вирусными инфекциями характерно снижение количества

моноцитов (Kauth М., Grage-Griebenow Е., Rohde G., 2007), мы можем предположить, что у данных пациентов исходно была вирусная инфекция, а бактериальная выступает в качестве суперинфекции.

Всем 30 больным было проведено исследование системного иммунного ответа - гуморального (определение уровня общих иммуноглобулинов А, М, G и цитокинов) и клеточного (иммунофенотипирование лимфоцитов и исследование фагоцитоза). Существенных изменений и различий между группами по уровню общих иммуноглобулинов и показателей фагоцитоза не наблюдалось.

Показатель общее N=30 1 группа N=12 2 группа N=6 3 группа N=5 4 группа N=7

ил-ip 23,6 (16,2-39,1) п=30 20.1 (13,8-38,7) п=12 28,1 (12,3-64,9) п=6 28,5 (24,2-40,0) п=5 23,0 (16,0-37,9) п=7

ИЛ-5 8,1 (5,6-29,4) п=12 17,8 (5,1-30,6) п=2 13,9 (5,6-22,1) п=2 9,7 (5,6-36,2) п=5 6,1 (5,6-26,0) п=3

ИЛ-6 11,6 (3,1-43,6) п=26 6,2 (3,8-14,2) п=12 19,7 (9,8-69,0) п=6 100,0 (2,1-176,5) п=4 18,1 (5,1-293,0) п=4

ИЛ-8 32,1 (16,4-55,2) п=6 31,5 (14,2-48,8) п=2 45,7 (17,1-74,2) п=2 0 (0-0) п=0 32,1 (31,2-32,9) п=2

ИЛ-10 3,2 (2,2-18,1) п=10 4,1 (2,7-26,8) п=4 12,8 (3,2-42,7) п=3 1,1 (1,0-1,2) п=2 3,0 п=1

ИФН-у 29,3 (20,3-40,1) п=30 34,4 (22,5-46,2) п=12 23,4 (17,4-32,6) п=6 28,7 (23,9-217,1) п=5 33,0 (14,3-35,7) п=7

N - количество пациентов в группе п - количество определяемых значений Таблица 5. Цитокины (пг/мл)

При исследовании уровня цитокинов межклеточного взаимодействия различий между группами в зависимости от этиологического фактора по уровню ИЛ-ф и ИФН-у не выявлено.

В нашей работе было показано, что в группе атипичных возбудителей ИЛ-5 определялся у 100% пациентов, в то время как в вирусно-бактериальной и в бактериальной группах он был ниже предела чувствительности метода в 66,7% и в 83,3% случаев соответственно. При этом необходимо отметить, что

уровень эозинофилов при атипичных возбудителях был достоверно ниже (1,0±0,0) по сравнению с бактериальной группой (1,7±0,1),

Учитывая, полученные данные мы можем предположить, что более низкий уровень эозинофилов в группе атипичных возбудителей при наибольшем количестве определений ИЛ-5 представляет собой сложный механизм требующий дальнейшего изучения.

Также в нашей работе было показано, что наиболее высокий уровень ИЛ-6 (100 пг/мл) был выявлен у пациентов с атипичными возбудителями, в то время как ИЛ-8 у данных больных был ниже предела чувствительности метода в 100% случаев.

ИЛ-6 и ИЛ-8 являются провоспапительными цитокинами и воспалительный процесс играет позитивную роль, способствуя элиминации возбудителя.

Уровень ИЛ-10 был исследован у всех 30 пациентов, но определяемый уровень данного цитокина был лишь у 33,3% пациентов. При этом наиболее высокий уровень (12,8 [3,2-42,7] пг/мл) и количество пациентов (50%) у которых он был выявлен, наблюдалось в группе вирусно-бактериальных возбудителей.

Тенденцию к увеличение уровня ИЛ-10 у пациентов вирусно-бактериальной группы мы можем рассматривать как реакцию организма ограничивающую воспаление.

При исследовании параметров клеточного иммунитета отмечается достоверная диспропорция относительного количества Т-лимфоцитов (43,7±1,4) и субпопуляции Т-хелперов (26,9±1,0) во всех исследуемых группах, а также снижение цитотоксических Т-лимфоцитов у пациентов с бактериальными (15,3±0,9) и невыявленными (15,5±1,1) возбудителями по отношению к норме, что можно рассматривать как транзиторное состояние, которое является физиологической реакцией организма на воспалительный процесс.

л

15.0

X

*

N0

I/")

X

+

« 10.0

5

и

и 5.0

0.0 —■—.................................................—■—..............................

бактериальные вирусно-

бяктепия.пьные

атипичные

без

втбугтителя

* - по сравнению с бактериальной группой и группой с не выявленными возбудителями Рисунок 2. Уровень СИЗ-СЭ16/56+ в исследуемых группах (%)

У пациентов с вирусно-бактериальными и атипичными возбудителями наблюдается достоверное увеличение относительного количества ЫК-клеток (15,4±1,0 и 13,2±1,7 соответственно) по сравнению с бактериальной группой и группой не выявленных возбудителей, что дает возможность предположить активную стимуляцию клеточных механизмов иммунного ответа у пациентов с данными возбудителями (рис.2).

Известно, что С025 (легкая цепь рецептора ИЛ-2) является маркером активации клеток. В соответствии с этим можно сделать заключение, что у пациентов с вирусно-бактериальными и не выявленными возбудителями, наблюдается более высокий активационный статус, так как в данных группах наблюдается тенденция к повышению относительного количества Т-лимфоцитов, несущих СЭ25 (7,0 [5,5-9,0]) и 8,0 [3,3-14,0]), соответственно). Наличие тенденции к увеличение относительного количества С03+С025+ лимфоцитов у пациентов с не выявленными возбудителями по сравнению с другими группами позволяет предположить наличие патогенной флоры, которую мы не можем определить стандартными методами или может быть обусловлено другими факторами. Что требует дальнейшего изучения.

При проведении корреляционного анализа в исследуемых группах был выявлен ряд закономерностей.

В группе пациентов с вирусно-бактериальными возбудителями выявлена прямая зависимость между количеством тромбоцитов и уровнем провоспалительных цитокинов - HJI-ip (г=0,9; р<0,04) и ИЛ-6 (г=1,0; р<0,0001).

Как известно, тромбоциты принимают активное участие в развитии воспаления, секретируя ряд биологически активных веществ, таких как простогландины, лейкотриены, фактор активации тромбоцитов, CD40L, Р-селектин и другие. Таким образом, учитывая вышеизложенные данные о роли провоспалительных цитокинов и тромбоцитов в развитии воспаления, взаимосвязь количества тромбоцитов и уровней ИЛ-ip и ИЛ-6 является закономерной и отражает участие различных звеньев иммунной системы в развитии воспаления.

Была выявлена обратная зависимость между количеством тромбоцитов и показателями фагоцитоза - фагоцитарной активностью нейтрофилов (г=-1,0; р<0,02), фагоцитарным числом (г=-1,0; р<0,005) и фагоцитарным резервом (г=-1,0; р<0,005) у пациентов с атипичными возбудителями. Различий по показателям фагоцитоза между исследуемыми группами не было, в то время как уровень тромбоцитов в группе атипичных возбудителей был более высоким по сравнению с другими группами. К сожалению, в настоящее время недостаточно данных для того, чтобы охарактеризовать эту патогенетическую связь. Возможно, это связано с влиянием микоплазмы на процессы фагоцитоза. Marshall A.J., Miles R.J., Richards L. показали, что в первые 12 часов после инфицирования происходит существенное угнетение фагоцитоза с последующей его нормализацией к 24 часам и достижением максимума к 7 дню. Снижение фагоцитоза в первые часы связывают с продукцией супрессорных цитокинов в ответ на суперантиген, а последующее усиление со способностью микоплазмы оказывать хемоатрактантную активность в отношении макрофагов.

При анализе взаимосвязи лейкоцитов и параметров гуморального и клеточного иммунитета у пациентов с атипичными возбудителями была выявлена обратная корреляция между количеством лейкоцитов и уровнем ИФНу (г=-1,0; р<0,0001).

В этой же группе выявлены прямая зависимость общего количества лейкоцитов и относительного содержания лимфоцитов, несущих на своей поверхности маркер активации НЬА-ЭЯ (г=0,9; р<0,04). Учитывая активную роль, лимфоцитов в элиминации микоплазменной и хламидийной инфекции, которые являются внутриклеточными, увеличение количества лейкоцитов, взаимосвязанное с повышением активности лимфоцитов является вполне закономерным.

В группе пациентов с невыявленными возбудителями установлена прямая зависимость уровня вчСРБ (г=0,8; р<0,05) и иммуноглобулинов (г=0,8; р<0,03) с уровнем ИЛ-1Р, что отражает патогенетическую связь данных параметров. Как известно ИЛ-1р, секретируемый в избыточном количестве активированными клетками моноцитарно-макрофагального звена, играет одну из ключевых ролей в развитии воспаления, влияя на продукцию простагландинов, ИЛ-2 и секрецию антител.

Помимо этого у пациентов данной группы выявлена прямая зависимость между уровнем иммуноглобулинов и маркером активации клеток (НЬА-ПЛ) (г=0,9; р<0,02), что отражает взаимосвязь гуморального и клеточного звена иммунитета.

У пациентов с атипичными возбудителями было показано, что уровень экспрессии молекул клеточной адгезии напрямую коррелирует как с уровнем иммуноглобулинов (г=0,9; р<0,05), так и с уровнем ИЛ-1Р (г=0,9; р<0,04).

Синхронное увеличение уровня иммуноглобулинов и маркеров активации клеток (СЭ25 и НЬА-ОЯ) (г=0,9; р<0,04) у пациентов вирусно-бактериальной группы подтверждает участие в иммунном ответе как гуморальных, так и клеточных механизмов.

У пациентов данной группы выявлена обратная зависимость Т-лимфоцитов, Т-хелперов, цитотоксических Т-лимфоцитов и ИФНу (г=-0,9; р<0,04). Корреляция ИФНу со многими параметрами отражает его роль в воспалении. Как известно, ИФНу секретируется Thl-лимфоцитами и принимает активное участие в противовирусном иммунитете.

У пациентов с бактериальными возбудителями выявлена взаимосвязь различных звеньев клеточного иммунитета, что отражено в синхронном увеличении показателей фагоцитоза и маркеров активации лимфоцитов (г=0,7; р<0,02). Также в данной группе уровень ИЛ-ip напрямую коррелирует с уровнем иммуноглобулинов (г=0,9; р<0,0001).

Обобщая все вышеизложенное, мы можем сказать, что воспалительный процесс, вызываемый различными возбудителями, имеет свои особенности и влияет на течение заболевания. При этом, учитывая небольшое количество пациентов включенных в исследование полученные закономерности необходимо подтверждать на большем количестве пациентов.

Заключение

Проведя сравнительный анализ различных методов этиологической диагностики ВП, мы можем сказать, что при бактериальных и вирусных патогенах ПЦР является высокоспецифичным методом диагностики ВП позволяющим проводить идентификацию возбудителя в короткие сроки. Молекулярно-генетические методы диагностики не уступают микробиологическим и могут быть использованы в тех учреждениях, где есть лаборатории ПЦР, соответствующие всем требованиям.

При подозрении же на ВП, вызванную атипичными возбудителями, такими как М. pneumoniae и С. Pneumoniae, наиболее приемлемым методом этиологической диагностики является серологическое исследование с определение уровня специфических IgM к данным возбудителям.

Было показано, что у пациентов с нетяжелой ВП грубых нарушений со стороны системного воспалительного ответа не выявлено, системный

иммунный ответ не имеет выраженных различий в зависимости от возбудителя, но, тем не менее, по нашим данным наблюдаются различные тенденция в иммунологическом ответе на основании чего можно предположить что, для:

1. Бактериальной группы - характерна взаимосвязь различных звеньев как клеточного (параметры фагоцитоза, маркеры активации лимфоцитов), так и гуморального (ИЛ-1, иммуноглобулины) иммунитета.

2. Вирусно-бактериальной группы - в развитии воспаления принимают участие как клеточные, так и гуморальных механизмы иммунитета, при этом активная роль отводится тромбоцитам и ИФНу.

3. Группы атипичных возбудителей - ведущую роль играют как Thl-лимфоциты, так и ТЬ2-лимфоциты.

4. Группы не выявленных возбудителей - отмечается тенденция к повышению активности лимфоцитов, а также взаимосвязь различных гуморальных факторов (вчСРБ, иммуноглобулинов и ИЛ-1).

Таким образом, значение полученных результатов состоит в том, что они являются предпосылкой к пересмотру рекомендаций по ведению пациентов с не тяжелой ВП, получающих лечение в амбулаторных условиях, так как позволяют определять возбудителя в течении нескольких часов.

Выводы

1. Выявлено, что наиболее частым возбудителем у пациентов с нетяжелой ВП является S. pneumoniae (53,3%), на втором месте атипичные возбудители 36,5% (М. pneumoniae 23,1% и С. pneumonia 13,2%) и далее Н. influenzae 30%.

2. Показано, что микробиологическое исследование является высокоэффективным методом определения бактериальных патогенов, за исключением атипичных возбудителей; молекулярно-генетическое (ПЦР) эффективно - как для бактериальных, так и для вирусных возбудителей, а серологическое - для диагностики атипичных возбудителей. Таким

образом, в реальной клинической практике целесообразно комбинирование различных методов этиологической диагностики.

3. При ВП вызванной бактериальными возбудителями выявлено достоверное снижение относительного количества ЫК-клеток по сравнению с вирусно-бактериальными микстами; при вирусно-бактериальных микстах тенденция к повышению активности Т-лимфоцитов на фоне снижения их количества по сравнению с нормой и достоверное увеличение относительного количества ИК-клеток по сравнению бактериальной группой и группой с не выявленными возбудителями; при атипичных возбудителях тенденция к повышению активности Т-лимфоцитов на фоне снижения Т-хелперов по сравнению с нормой и достоверное увеличение количества ЫК-клеток по сравнению с группой с не выявленными возбудителями.

4. При ВП вызванной бактериальными возбудителями выявлена тенденция к нарастанию уровня ИЛ-5, при вирусно-бактериальных микстах - ИЛ-1Р, ИЛ-8 и ИЛ-10, а при атипичных возбудителях - ИЛ-6.

Практические рекомендации

В современных условиях целесообразна комбинация различных методов этиологической диагностики ВП (микробиологических - для определения бактериальных патогенов, за исключением атипичных возбудителей, а также определения чувствительности к антибиотикам; молекулярно-генетических как для бактериальных, так и для вирусных возбудителей, в том числе у пациентов с не тяжелой пневмонией; серологических для диагностики атипичных возбудителей).

При выборе иммунокоррекции у пациентов с ВП необходимо учитывать различия иммунного ответа на этиологический фактор.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. К. Зыков, А. Рвачева, А.Пустовалов, А. Аверьянов. Пролонгированные курсы кларитромицина у пациентов с частыми обострениями ХОБЛ. Материалы ежегодного конгресса Европейского респираторно общества, 2008,1770.

2. Г. Хаптхаева, А. Пустовалов, Г. Ткачев, Н. Колганова, К. Зыков, А. Чучалин. Роль респираторной инфекции в обострении атопической астмы. Материалы ежегодного конгресса Европейского респираторно общества, 2008,2228.

3. Г. Хаптхаева, А. Пустовалов, К. Зыков, Н. Колганова, А. Чучалин. Определение ценности биомаркеров воспаления при обострении атопической бронхиальной астмы вызванном респираторными инфекциями. Материалы ежегодного конгресса Европейского респираторно общества, 2010, 4633.

4. Хаптхаева Г.Э., Чучалин А.Г., Пустовалов A.A., Зыков К.А., Колганова H.A. Респираторная инфекция и роль сывороточных биомаркеров при обострении атопической бронхиальной астмы. Журнал Пульмонология, 2010. №3, с.46-52.

5. Пустовалов A.A., Рвачева A.B., Чучалин А.Г., Хаптхаева Г., Ткачев Г.А., Зыков К.А., Соколов Е.И. Сравнение этиологических методов диагностики внебольничной пневмонии в клинической практике. Терапевтический архив, №4, 2012.

1 ! .

^ /

1 2 -8 6 3 3

Отпечатано в РИО МГМСУ 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20, стр. 1. Заказ № 957. Тираж 100 экз.

2012093198

2012093198