Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Метод твердофазного иммуноферментного анализа для определения антител к антигенам гистосовместимости класса I при аллотрансплантации

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ Р Г Б ОД ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ И ИСКУССТВЕННЫХ ОРГАНОВ-» -гп«

I В ОН! 13;

На правах рукописи УДК 57.083.324:616-089.843

БОРОЗДЕНКОВА СВЕТЛАНА ДМИТРИЕВНА

МЕТОД ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К АНТИГЕНАМ ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ КЛАССА I ПРИ АЛЛОГРАНСПЛАНТАЦИИ

14.00.41 - Трансплантология и искусственные органы

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1996

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИПСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОМ ИНСТИТУТЕ ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ И ИСКУССТВЕННЫХ ОРГАНОВ МИНЗДРАВМЕДПРОМА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор медицинских наук Я.Г.Мойсюк

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

кандидат медицинских наук

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор член-корреспондент РАЕН доктор медицинских наук, профессор

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Научный центр хирургии РАМН.

ЗАЩИТА СОСТОИТСЯ 30 СЕНТЯБРЯ 1996 ГОДА В 14 ЧАСОВ ПА ЗАСЕДАНИИ ДИССЕРТАЦИОННОГО СОВЕТА Д.074.34.01 ПРИ НАУЧНО-

ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОМ ИНСТИТУТЕ ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ ИСКУССТВЕННЫХ ОРГАНОВ МИНЗДРАВМЕДПРОМА РФ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ ИИ трансплантологии и искусственных органов Минздравмедпрома РФ.

Автореферат диссертации разослан 30.08.1995 г.

ВЛО. Абрамов

Ю.М. Зарецкая Н.А. Оншценко

Ученый секретарь совета, кандидат медицинских наук

Е.А. Селезнева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

В последние годы становится все более очевидным, что роль антител, направленных против антигенов HLA класса I (анти-IILA AT), не ограничивается их участием в развитии сверхострого отторжения аллотрансплантатов. Все большее число исследователей склонны считать, что образование анти-HLA AT в посттрансплантационный период приводит к развитию ускоренного острого, острого или хронического отторжения.

Так, Sucui-Foca et al(1991) из Колумбийского университета Нью-Йорка показали, что выживаемость почечного аллотрансплантата в течение четырех лет без анти-HLA AT составляет 73,8%, в то время как выживаемость трансплантата с анти-HLA AT -46,7 %. Для аллотрансплантата сердца четырехлетняя выживаемость трансплантата составляет 90% без анти-HLA AT и 38% с анти-HLA AT. Möller et al (1993,1994) из Шведиии получили высокую степень корреляции между присутствием донор-специфических airm-HLA AT и развитием раннего острого отторжешм.

AI-Hussein et al (1994, Великобритания) показали, что донор-специфические IgG анти-HLA AT имели все больные с тяжелой формой отторжения. Более того, авторы считают, что выявление анти-HLA AT может иметь прогностическое значение, т.к. они обнаруживаются до появления клинических признаков отторжения.

Показано (Тешак! е1 а1, 1993), что класс анта-НЬА АТ имеет большое значение для выживания трансплантата. Выживаемость трансплантата в течение года у больных с 1цА анти-НЬА АТ была значительно выше (91%), чем у больных без lgA анти-НЬА АТ (58%). Интересны недавно опубликованные данные Ье(1егег й а1 (1996) о том, что 50% больных с ранней дисфункцией трансплантата имели предсуществующие АТ к антигенам НЬА класса II.

Для лучшего понимания роли анги-11ЬА АТ в выживании трансплантата необходима более подробная информация о свойствах антител (класс, подкласс, аффинность и т.д.). Следовательно, нужны новые чувствительные и специфичные методы для их определения. Основным методом, используемым для определения анти-НЬА АТ является лимфоцитотоксический тест (ЛЦТ). Несмотря на появление различных его модификаций с целью повышения чувствительности, метод имеет существенные недостапш: обладает низкой чуствительностью, не определяет нефиксирующие комплемент АТ, для постановки метода требуются живые клетки. Кроме того, он может давать ложно-положительные результаты за счет определения не-НЬА АТ. В 1983 г. Оагоуоу е1 а1 предложили использовать метод проточной цитофлуориметрии для определения анти-НЬА АТ. Метод является более чувствительным, чем ЛЦТ, позволяет определять нефиксирующие комплемент АТ, а также классы и подклассы АТ. Однако этот метод сохраняет один из основных недостатков ЛЦТ - для его постановки требуются живые клетки. Высокая стоимость оборудования также является недостатком этого метода.

Альтернативным методом, лишенным этих недостатков, но обладающим высокой чувствительностью и специфичностью является метод иммуноферментного анализа (ИФА).

Метод основан на использовании очищенных донорских молекул HLA, выделенных из лимфоцитов. До последнего времени этот метод использовался в ограниченном тшсле лабораторий, т.к. выделение HLA антигенов из клеток донора является довольно сложной методической задачей, которая практически невыполнима в клинических условиях. В 1989 году Mueller-Eckhardt et al для определения анти-HLA AT разработали MALLA (monoclonal antibody immobilization of leucocyte antigen) метод. MAILA метод основан на том, что клетки (лимфоциты, тромбоциты) инкубируются одновременно с моноклональными AT к общей детерминанте HLA молекулы (W6/32) и исследуемой сывороткой. Затем клетки промываются и согаобилизируются. После центрифугирования лизат переносится на планшет, покрытый противовидовыми антителами. Вслед за иммобилизацией комплексов МоАТ/АГ, анти-HLA AT выявляются при добавлении меченных ферментом козьих антител против IgG человека. Основным' недостатком зтого метода является использование живых клеток, что делает невозможным пост-трансплатациопный мониторинг больных.

В данной работе представлен метод, который является модификацией MAILA метода.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Целью настоящей работы является создание высокочувствительной и специфичной тест-системы на основе твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА) для определения антител к антигенам гистосовместимости класса I в сыворотке человека и оценке возможности его использования в клинической практике.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

• изучить условия выделения и хранения антигена НЬА класса I из клеток периферической крови или спленоцитов донора без потери антигенной активности, используя отечественные моноклональные антитела ИКО-53 к мономорфной детерминанте молекулы НЬА класса I;

• оптимизировать условия проведения тИФА ( определить рабочие разведения антигенов, антител, коньюгатов, блокировать неспецифическое связывание);

• разработать протокол постановки твердофазного иммунноферментного анализа;

• изучить специфичность разработанной тест-системы;

• произвести сравнительный анализ результатов, полученных стандартным комщгементзависимьш лимфоцитотоксическим методом, методом проточной флуориметрии и твердофазным иммуноферментным анализом;

• апробировать метод твердофазного иммунноферментного анализа в клинике для определения уровня предсуществующих антител, динамики уровня анти-ША антител класса I при проведении сеансов плазмафереза и мониторинга донор-специфических анти-НЬА АТ класса I в пост-трансплантационный период.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Впервые в отечественной клинической практике создан метод твердофазного иммуноферментного анализа для определения уровня и классов анти-НЬА АТ в различных клинических ситуациях. Метод обладает более высокой чувствительностью и специфичностью, чем стандартный комплементзависимый яимфоцитотоксический " тест, поскольку позволяет определять низкие уровни анти-НЬА антител, и нефиксирующие комплемент анти-НЬА антитела, неопределяемые лимфоцитотоксическим методом.

Установлено, что при длительном хранении комплекса лимфоцит/ моноклональные антитела ИКО-53 к общей детерминанте молекулы НЬА (18-20 месяцев, 1=-40рС) сохраняются антигенные свойства молекулы НЬА.

Показано, что для фиксации антигена НЬА на твердой фазе может быть применена биоспецифическая иммобилизация антигена с помощью биотинилированных ИКО-53.

Доказано, что инакгивированная (20 мин. при 60вС) кроличья сыворотка и 0,5% раствор гидролизата казеина снижают "фоновый" сигнал реакции лучше других блокирующих агентов. Установлено, что применение моноклональных анти-^О-Рс-спсцифичсских антител, копьюгированных с пероксидазой хрена, позволяет максимально снизить неспецифические реакции при выявлении 1|>,(л анти-НЬА антител в анализируемых сыворотках.

Показана принципиальная возможность использования разработанной тест-системы для определения предсуществующих антител, донор-специфических анти-НЬА антител и оценки эффективности сеансов плазмафереза. Установлено, что в первые два месяца после пересадки аллотрансплантата почки появление донор-специфических анти-НЬА антител класса I коррелирует с эпизодами отторжения, причем у реципиентов повторного трансплантата антитела появляются чаще, чем у реципиентов первичного трансплантата.

ПУБЛИКАЦИИ.

По теме диссертации опубликовано 5 работ в отечестветгой и зарубежной печати.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены:

1. В лаборатории типирования, Guy' s Hospital, Лондон, 1995г.

2. В лаборатории трансплантационной иммунологии и типирования, Oxford Transplant Centre, 1995г.

3. На объединенной научной конференции отделений НИИ Трансплантологии и Искусственных органов, 1996г.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ.

Диссертация изложена на _ листах машинописного

текста, состоит из_введения,_обзора литературы, _глав

исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована

_рисунками и _таблицами. Список литературы

содержит отечественных и зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Материалы и методы исследований.

В исследование было включено 68 больных до и после трансплантации почки. Сыворотки хранили при t=- 20 С. Пул отрицательных сывороток (К-) готовили используя ABO сыворотку от 5 здоровых мужчин. Пул положительных сывороток (К+) готовили из сывороток 5 высокосенсилизированных больных, PRA 80-100%. В работе использовали также моноспецифические типирующие сыворотки ("Behring"), биотинилированные моноклональные антитела ИКО-53 ("Медбиоспектр", Москва), направленные к мономорфной детерминанте молекулы HLA класса; моноклональные aHTH-IgG-Fc-специфические антитела (AT), козьи и кроличьи AT, коньюгировашше с пероксидазой хрена (Кардиоцентр РАМН). Бычий сывороточный альбумин (БСА), " SERVA", сывороточный альбумин человека (ЧСА), "SERVA", субстрат пероксидазы (ПХ) хрена ортофенилендиамин (о-фда), "SIGMA". Для постановки реакции ИФА использовали планшеты Titertek из поливиншшюрида. Величину оптической плотности измеряли на Multiscan Titertek Plus при длине волны 492нм. Лимфоциты из периферической крови и селезенки выделяли в день трансплантации на градиенте плотности Histopaque-Ficoll-1077 но методу Boyum А., 1968.

Для определения анти-HLA AT в сыворотке больных применяли стандартный комплементзависимый

тшфоцитотоксический метод (ЛЦТ), предложенный

Национальным Институтом здоровья в Бетезде (NIH-метод), метод проточной цитоспектрофлуориметрии (Garovoy F., 1983), используя технику двойного окрашивания: моноклональные анти-IgG AT, меченные флуоресцеинизотиоцианатом и кроличьи анти-CD3, меченные родамином (DAKO). Измерения проводились на FACScan проточном цитометре (Becton Dickinson). Панель для ЛЦТ теста была составлена из лимфоцитов 20 типированных доноров. Мишенями для связывания igG AT в FACS методе служили пулированные клетки от 20 В-клеточных линий, трансформированных вирусом Эпштейна-Барр. Эта часть работы выполнялась совместно с лабораторий трансплантационной иммунологии и типирования, Oxford.

Для статистической обработки результатов применялась программа "Statgrafics",v.3 иЕхсе1,у.5.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

При создании тест-системы для определения анти-HLA AT класса 1 мы разработали несколько вариантов непрямого тИФА.

Первоначально мы разработали тИФА для определения анти-HLA AT на основе использования частичноочищенных антигенов HLA, полученных в результате гель-фильтрации лизата мембран лимфоцитов на Ultrogel Ас34. Фракции, содержащие бета-2-микроглобулин, определяли с помощью радиоиммунологического анализа.

Основной проблемой, с которой мы столкнулись, было высокое неспецифнческое связывание. Это определялось, по-видимому, наличием примесей других белков в препаратах антигена. Использование аффинной хроматографии на сорбентах с ковалептно связанными МоАТ к общей детерминанте молекулы НЬА позволило снизить фон, однако этот метод многостадийный, трудоемкий и существует опасность потери активности антигена при элюции. Поэтому такой способ получения препарата антигена непригоден для работы в клинике. В дальнейшем мы модифицировали стандартный метод МАЛА, основанный на иммобилизации антигена НЬА на твердой фазе с помощью моноклональных антител к общей детерминанте молекулы НЬА. Для проведения анализа мы предложили следующую схему (схема 1):

1

О К»

3

4

ОЬЭ ^

ПК* X

пк* -V"

д -стрептавидин Ш -хромоген

сг хл АТШ1 . -анти-НЬААТ

-комплекс биотин-МоАТШЬА )

— -анти^О меченные ПХ Схема 1. Схема твердофазпого иммунофермеитиого анализа

1. Обработка лимфоцитов биотинилированными МоАТ к мономорфной детерминанте молекулы НЬА; лизис клеток с последующим центрифугированием для отделения комплекса МоАТ/НЬА АГ от ядер и клеточного дебриса.

2. Биоспецифическая иммобилизация комплекса биотшгалированные МоАТ/ША АГ на твердой фазе с использованием системы стрептавидииа/биотин.

3. Связывание анти-НЬА АТ из исследуемой сыворотки с НЬА АГ.

4. Выявление связавшихся анти-НЬА АТ с помощью антител против иммуноглобулина человека, меченных пероксидазой. Лимфоциты периферической крови и селезенки, выделенные по методу Воуиш А.(1968), инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре с биотинилированными МоАТ к общей детерминанте молекулы НЬА (Юмлн клеток/Юмкг АТ/1мл ЯРМЗ 1640). Отмывали трижды средой Ы>М1 1640 и лизировали специальным буфером (50мМ Трис, 150мМ ЫаС1, ЗмМ ЭДТА, 0,5% ЫР-40, 50мМ РМБР, рН 7,2) в течение часа на льду. После центрифугирования при 4000g, 15 мин., супернатант отделяли и использовали для постановки тИФА. Планшеты предварительно обрабатывали стрептавпдином.

Были изучены различные условия хранения НЬА-АГ и найдены условия стабилизации его свойств. Мы показали, что комплекс лимфоцит/МоАТ при замораживании может храниться длительное время (18-20 месяцев, -40°С) без потери антигенной активности;

Использование биоспецифической иммобилизации через систему сгрептавидкн-биотин (константа аффинности К)'^ М') позволило значительно повысить сорбционную емкость планшетов, осуществить ориентированную посадку НЬЛ-АГ и, таким образом, повысить чувствительность определения. Фактором, влияющим на эффективность связывания белка с поверхностью носителя, является концентрация белка в растворе, контактирующем с носителем. При слишком высоком содержшши белка эффективность адсорбции снижается и в результате большее количество белка подвергается десорбции на последующих этапах анализа. Мы исследовали условия адсорбции стрептавидина на планшет в разных концентрациях (40, 20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.63, 0.32 мкг/мл), в различных буферных системах, при разных температурных и временных режимах (рис.1 и рис.2).

т-ИФА от концентрации стрептавидина (п=7).

Рис. 2. Зависимость величины оптической плотности в тИФА от температуры и времени сорбции стрептавидипа (п-5).

Оптимальные результаты были получены при использовании

о

PBS, рН 7,4, в течение 16 часов при 4 С. При этом концентрация стрептавидина составила 1,25 мкг/мл.

Выбор концентрации антигена в пашей системе определяется разведением лизата клеток. Супернатант лизата лимфоцитов, содержащий комплекс биотинилированные MoAT/HLA AT, разводили в PBS 1:10, 1.20, 1:40, 1:80. Полученные данные свидетельствовали о том, что максимальное различие между отрицательным и положительным контролем сохраняется при разведении 1:40, при концентрации стрептавидина 1,25 мкг/мл.

Одной из важнейших проблем при разработке методов ИФА является проблема снижения уровня фонового сигнала. Мы провели скрининг различных блокирующих агентов, снижающих уровень неспецифического связывания: бычий сывороточный

альбумин, сывороточный альбумин человека, гидролизат казеина, инактивированная кроличья сыворотка. Как видно из рис.3 0,5% казеин и кроличья сыворотка эффективнее других блокирующих агентов снижают фон реакции (Р<0.05).

Рас.З. Сравнение эффективности использования различных блокирующих агентов для снижения неспецифического связывания (п=8).

БСА - бычий сывороточный альбумин, 1%;

ЧСА - сывороточный альбумин человека, 1%;

КАЗЕИН - гидролизат казеина, 0,5%;

КРОЛИК - нормальная кроличья сыворотка.

Важным моментом в постановке тИФА является выбор рабочего разведения исследуемой сыворотки. Для определения оптимального разведения сывороток было проведено титрование сывороток нескольких высокосенсибилизированных больных (рис.4).

ОП 492, им

Рис.4. Определение рабочего раведешы анализируемых сывороток (п=8).

Для большинства сывороток оптимальным было разведение 1:2, для одной сыворотки 1:4. Время инкубации составило 2 часа при 37°С, т.к. известно, что более продолжительное время инкубации может привести к денатурации НЬА АГ. С другой стороны, сокращение времени инкубации может привести к недооткрытию АТ с низкой аффинностью.

Фактором, оказывающим большое влияние па

чувствительность анализа, является выбор антител, меченых ферментом-коньюгата. Мы изучили возможность использования поликлональных АТ(козьи -1, кроличьи-2) и моноклональных АТ против иммуноглобулина человека, коныогированных с пероксидазой хрена (ПХ). МоАТ коньюгировали с ПХ двумя способами: методом периодатного окисления (коньюгат 3) и методом с использованием глутарового альдегида(коиыогат 4).

ОГ1,;492 нм 2 1

1,5

\......

1т-

0,5

— О — Коньюгат 1г

— - -Х - - - (Ьньюпгтг,1 --КоньюгагЭ,

— — КоньюгатЗ

козьи АТ кроличьи АТ МоАТ МоАТ

1:250 1:500 1:1000 1:2000

Разведения .каньюгата

Рис. 5. Сравните активное™ меченых ПХ

поликлональных и моноклональных АТ против [£Ст человека (п=7).

Как видно из рис.5 только при использовании коньюгата 4 достигались высокие значения оптической плотности.

Правильный выбор концентрации коньюгата имеет большое значение для постановки реакции. При слишком высокой концентрации коньюгата может происходить его избыточное неспецифическое связывание с носителем. Это сопровождается некоторым ростом фона, что препятствует повышению чувствительности в области низких концентраций определяемых АТ. При слишком низкой концентрации коньюгата также может заметно снижаться чувствительность анализа. Величина ОП реакции при разведении коньюгата 4 1:250 значительно превышала ОП реакции при разведении 1:500.(Р=0,032).

Положительный и отрицательный контроль включали в каждый опыт. Реакция считалась положительной, если величина оптической плотности (ОП) рабочего разведения анализируемой

сыворотки превышала ОП отрицательного контрольной сыворотки в два раза. Коэффициент вариации не превышал 8%.

СПЕЦИФИЧНОСТЬ МЕТОДА-

Для доказательства специфичности метода мы использовали моноспецифические анти-НТА типирующие сыворотки. Результаты демонстрируют высокую специфичность метода. Значения оптической плотности для неспецифических реакций не превышала 0.223+0.12, в то время как оптическая плотность специфических реакций достигала 1.82±0.16.

Другим доказательством специфичности метода была абсорбция анти-НЬА АТ положительных сывороток тромбоцитами. Пул тромбоцитов от 35 здоровых доноров крови использовали для истощения сывороток (п=5). Обработка контрольной положительной сыворотки тромбоцитами приводит к снижению оптической плотности положительной реакции на 70% (Р=0,029 )(рис,6).

ОП, 492 НМ

1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

Рис.6. Результаты обработки положительной контрольной сыворотки пулом тромбоцитов (п=5).

- ' ( 4

П гп

К(+) К(+) после К (-)

истощения

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ МЕТОДА-

Для определения чувствительности метода мы изучали реактивность сывороток параллельно в лимфоцитотоксическом методе и в тИФА. В качестве мишеней в том и другом методе использовали одни и те же лимфоциты периферической крови от 6 здоровых доноров. Сыворотки двух высокосенснбилизированных больных (РИА 80-100%) исследовали при разных разведениях.

Корреляционный анализ показал сильную положительную связь результатов, полученных двумя методами (11=0,9) (табл. 1).

Таблица 1

Сравнение чувствительности лимфоцитотоксического теста

(ЛЦТ) II иммуноферментного анализа (т-ИФА).

Сыво] ютка 1 Сыворотка 2

Клетки Разведение ЛЦТ т-ИФА ЛЦТ т-ИФА

1:2 + 0,989* + 1,984*

1:4 - 0,475* + 1,456*

А2,19; В35,40 1:8 - 0,230 - 0,721*

1:16 - 0,103 - 0,305

1:2 + 0,840* + 1,788*

1:4 - 0,602* + 1,203*

А10Д1; В8,15 1:8 - 0,296 - 0,607*

1:16 - 0,105 - 0.204

1:2 + 0,920* + 1,854*

1:4 - 0,468* + 1,335*

А1,3;В8,16 1:8 - 0,289 - 0,658*

1:16 - 0,098 - 0,195

1:2 + 0,796* + 1,897*

1:4 - 0,415 + 1,312*

А1.28; В5Д4 1:8 - 0,248 - 0,587*

1:16 - 0,110 - 0,215

*) -реакция положительная, оп, 492 нм

КЛИНИЧЕСКАЯ АПРОБАЦИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ. Определение уровня предсуществующих анти-НЬА АТ.

Для определения уровня предсуществующих АТ методом тИФА была создана панель НЬА специфичностей, выделенных из лимфоцитов 40 типированных доноров. В сыворотках 35 потенциальных реципиентов, с известным уровнем предсуществующих антител, определенным в

лимфоцитотоксическом тесте, выявляли анти-НЬА АТ в тИФА.

Результаты исследования представлены на рис.7.

%Р1*А

ОП. Мл

Рис. 7. Корреляция результатов т-ЙФА и

лимфоцитотоксического теста (ЛЦТ).

Три сыворотки были положительными в тИФА и отрицательными в ЛЦТ. Такое различие в результатах исследований можно объяснить тем,что тИФА является более чувствительным методом, чем ЛЦТ , т.е. определяет такие концентрации АТ, которые могут быть недостаточными, чтобы вызвать цитотоксичность. Кроме

того, тИФА определяет нефиксирующие комплемент анти-НЬА АТ, не определяющиеся комплемент-зависимым ЛЦТ, но имеющими клиническое значение. Две сыворотки, положительные в ЛЦТ были отрицательными в тИФА (при выявлении ^О анти-НЬА АТ), что можно объяснить наличием анти-НЬА АТ или не-НЬА Ат. Обе сыворотки были в дальнейшем проверены на присутствие других классов анти-НЬА АТ. В одной из них были обнаружены ^М АТ.

В таблице 2 представлены результаты сравнительного анализа использования трех методов для определения анти-НЬА АТ. Было выбрано 6 высокосенсибилизированных больных с уровнем предсугцествующих антител >50%. Из них только один был отрицательным в тИФА и положительным в ЛЦТ и методе проточной цитофлуориметрии (ПЦТ). Зто можно объяснить наличием у больного анти-НЬА АТ низкой аффинности, которые могут смываться с твердой фазы во время отмывок с детергентами или присутствием антител не к НЬА АГ класса I. Результаты исследования показали положительную корреляцию между результатами, полученными тремя методами (11=0,79).

Сравнение результатов определения аити НЬА антител лимфоцитотоксичсским методом ( ЛЦТ), твердофазным иммуноферментным анализом (т-ИФА) и методом проточной цитофлуориметрии (ПЦФ).

Таблица 2

Больной А. Больной П. Больной Г. Больной М. Больной К. Больной Е.

лцг + + + + + +

т-ИФА + + + + + -

ПЦФ + + + + + +

Мы использовали нашу тест-систему для изучения динамики уровня анти-НЬА АТ при проведении сеансов плазмафереза. Было исследовано 12 больных. Плазмаферез проводили как для подготовки высокосенсибилизированных больных к трансплантации (п~5), так и для лечения кризов отторжения (п=7).

Результаты исследований продемонстрировали

принципиальную возможность применения тИФА для контроля за уровнем анти-НЬА АТ класса I и явные преимущества этого метода по сравнению с лимфоцитотоксическим методом. Прежде всего это возможность ежедневного проведения анализа с использованием одних и тех же антигенов НЬА, что позволяет правильно скорректировать схему лечения больного.

Выявление доноп-специфпческпх анти-НЬА АТ в посттрансплантационный период.

В исследование было включено 68 реципиентов с трансплантатами почки (табл.3). Донор-специфические анти-НЬА АТ были обнаружены в первые 2-4 недели после пересадки у 22 (32%) реципиентов. Среди реципиентов первичного трансплантата антитела были обнаружены у 7 (16%) , а у реципиентов с повторными трансплантатами - у 15 (60%, Р=0,029) .

Таблица 3

Пост-трансплантационные донор-специфических анти-HLA AT у реципиентов аллотрансплантата почки в первые 2-4 недели после

пересадки

! Реципиенты Постграисплантант a-HLA AT ВСЕГО II

Нет (-) Есть (+)

С первичным трансплантантом 36 (84%) 7 (16%) 43

С повторным трансплантантом 10 (40%) 15 (60%) 25

ВСЕГО 46 (68%) 22 (32%) 68

В первые два месяца из 68 реципиентов почки 15 больных не имели криза отторжения. Только у одного из них были обнаружены донор-специфические анти-HLA AT. Из 53, имевших криз отторжения, у 21 в первые две недели после трансплантации появились донор-специфические анти-HLA AT. Восемнадцать из 22 имели IgG AT, 2 IgG AT и 2 IgG +IgM AT. Из 18 больных, имевших IgG AT, 14 были с повторными трансплантатами. 12/14 имели необратимое отторжение и потеряли трансплантат в течение первых двух месяце после пересадки. 5 больных с IgG AT, 2 больных с IgG+IgM AT и 2 больных с IgM AT имели обратимые кризы отторжения. Один больной с IgG анти-HLA AT не имел клинических признаков отторжения.

Появление донор-специфических анти-HLA AT в первые недели после трансплантации осложняло течение раннего посттрансплантационного периода. 96% больных, имевших анти-HLA AT, имели криз отторжения. Среди них наиболее низкая выживаемость трансплантата наблюдалась у реципиентов повторного трансплантата с IgG анти-HLA AT. Число отторжений

было больше в группе реципиентов с анти-НЬА АТ, чем в группе реципиентов без анти-НЬА АТ (Р=0,039).

Таблица 4

Появление донор-специфических анти-НЬЛ АТ класса I у реципиентов после трансплантации почки и выживаемость аллотрансплантата в первые два месяца после операции.

Трансплантация Донор-специфические анти-НЬА АТ Выживаемость трансплантата, (%)

Первичная, п=7 + 100

Первичная, п=36 - 97

Повторная, п=15 + 20

Повторная, п=10 - 80

Выживаемость трансплантата у реципиентов первичного трансплантата не имела существенного различия между группой больных, имевших анти-НЬА АТ (100%), и группой больных, не имевших анти-НЬА АТ (97%, Р>0,05). В отличие от них, реципиенты повторного трансплантата с анти-НЬА АТ имели более низкую (20%) выживаемость трансплантата, чем реципиенты без анти-НЬА АТ (80%, Р<0,05). Среди реципиентов, имевших ати-НЬА АТ, выживаемость у реципиентов первичного трансплантата (100%) была значительно выше, чем у реципиентов повторного трансплантата (20%, Р<0,05).

Выживаемость трансплантата у больных, не имевших анти-НЬА АТ, была незначительно ниже в группе больных с повторными трансплантатами (80%), чем в группе с первичным трансплантатом (97%, Р>0,05).' -

Все больные : после трансплантации получали трехкомпонентную иммуносупрессию (прсднизолон 0.5 мг/кг/сутки, азатиоприн 22 мг/кг/сутки и циклоспорин А 6 мг/кг/сутки). Кризы отторжения лечили пульс-терапией стероидами, а затем, в случае резистентности, АТГ или ОКТ-3. На основе чувствительности отторжения к пульс-терапии стероидами больные были разделены на группы (Табл.5). ' :

, .. , Таблица 5

Влияние характера отторжения и наличия донор-специфических анти-Ш,А ЛТ на выживаемость трансплантанта

Число' . ... больных Анпи-.' ■ ПЬА АТ Лечение Потеря трансплантата в течение

всего 2-х мес. по иммун.

метиппред низолон АТГ/ ОКТ-3 причинам

Без отторжения ! 15 1 0 0 0

Стероидчувстви- 0

тельное отторжение 35 !-5" - 35 -

Стеровдрезис-

тентпое отторжение 18 ' ' 15 18 18 12

Из результатов, приведенных в таблице 5, видно, что наличие донор-специфических анти-НЬА АТ при

стероидчувствительном типе отторжения связано с высокой выживаемостью трансплантата в первые два месяца после пересадки. При стероидрезистентном типе отторжения из 18 реципиентов 15 имели анти-НЬА АТ. 14/18 были повторными трансплантатами. 12/18 (67%) трансплантатов было потеряно в результате необратимого криза отторжения, несмотря на применение анти-лимфоцитарных препаратов (ОКТ-3 и АТГ). Следовательно, наличие анти-НЬА АТ при стероидрезистентном типе отторжения сочетается с плохим прогнозом для выживания трансплантата и снижает эффективность действия лимфоцитарных препаратов.

ВЫВОДЫ.

1. Разработан и внедрен в практику высокочувствительный и специфичный метод твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА) для определения ^С и ^М антител к антигенам НЬА классаЬтИФА обладает более! высокой чувствительностью^ чем лимфоцитотоксический метод, поскольку позволяет определять низкие уровни анти-НЬА антител и комплемешнефиксирующие анти-НЬА антитела, не вызывающие лимфолизиса.

2. Оптимизированы условия проведения тИФА для мониторинга анти-НЬА антител класса I, в том числе для определения предсуществующих АТ, в клинической практике. Показано, что длительное хранение комплекса биотинилированные монокло-

нальньге антитела к мономорфной детерминанте молекулы НЬА/лимфоцит ( в течение 18-20 месяцев при 1-=-40° С) не влияет на проявлегае антигенных свойств молекулы НЬА. Составлен протокол выполнения тИФА.

3. Установлена положительная корреляции (11=0,78) между результатами определения анти-НЬА антител класса I общепринятым лимфоцитотоксическим методом и тИФА.

4. Появление у реципиентов донор-специфических анти-НЬА АТ, выявленных тИФА, коррелирует с эпизодами отторжения аллотрансплантата Почки в первые два месяца после трансплантации (11=0,64).

5. Донор-специфические анти-НЬА антитела в первые два месяца после трансплантации чаще появляются у реципиентов повторного трансплантата (60%), чем у реципиентов первичного трансплантата (16%, Р=0,029). При повторной трансплантации почки, в отличие от первичной, появление донор-специфических ^С анти-НЬА АТ в первые две недели после операции является плохим прогностическим признаком для выживания трансплантата.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ.

1. Borozdenkova S.V., Baranova F.S. ELISA of anti-HLA antibody in human serum. Inter, symposium on transplant monitoring. Yerussalem, 1991.

2. Сахаров И.Ю., Борозденкова С.Д. Иммуноферментный метод определения альфа-трийод-тиронина с использованием актипавидин-биотиновой пары. "Биотехнология", 1994, N2 : с.37-44.

3. Borozdenkova S.D., Baranova F.S. ELISA for tlie identification of donor-reactive HLA antibodies. 7th Congress of European Society for Organ Transplantation, ESOT, 1995, Oct.3-7 : p.163.

4. Борозденкова С.Д., Барышников А.Ю., Палкипа Т.Н., Баранова Ф.С. Определение антител к антигенам I класса методом иммуноферментного анализа. Бюл. экспер. биол. и мед., 1995, N 9: с.315-318.

5. Borozdenkova S., Baranova F., Moisiuk J. Presence of donor-reactive anti-HLA class I antibodies in patients with renal allografts. XVI International Congress of the Transplantation Society, 1996, Barcelona Aug.25-30.