Автореферат и диссертация по медицине (14.00.30) на тему:Метод мультилокусного секвенирования-типирования N. meningitidis и H. influenzae серотипа b в эпидемиологическом надзоре за бактериальными менингитами

На правах рукописи

МИРОНОВ Константин Олегович

МЕТОД МУЛЬТИЛОКУСНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ-ТИПИРОВАНИЯ

КМЕШЖ1ШШ И ШШЬиЕНМЕ СЕРОТИПА Ь В ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОМ НАДЗОРЕ ЗА БАКТЕРИАЛЬНЫМИ МЕНИНГИТАМИ

14.00.30 - Эпидемиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2004 г.

Работа выполнена в ГУ Центральном НИИ эпидемиологии Министерства Здравоохранения РФ

Научные руководители: доктор биологических наук А.Е. ПЛАТОНОВ доктор медицинских наук И.С. КОРОЛЕВА

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор В.ГАКИМКИН доктор медицинских наук,

профессор Н.Н.ФИЛАТОВ

Ведущая организация: НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН

Защита состоится "17" декабря 2004 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д.208.114.01 в ГУ Центральном НИИ эпидемиологии Министерства Здравоохранения РФ (111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, Д.3а)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Центрального НИИ эпидемиологии Министерства Здравоохранения РФ

Автореферат разослан "12" ноября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор А.В.ГОРЕЛОВ

2005-4

zmz

Актуальность проблемы

Бактерии Neisseria meningitidis и Haemophilus influenzae серотипа b (Hib) наряду с Streptococcus pneumoniae являются самыми частыми возбудителями гнойных бактериальных менингитов (ГБМ).

Для эффективного эпидемиологического мониторинга за ГБМ необходимы данные, позволяющие анализировать популяцию возбудителя, циркулирующую на определенной территории. С 1998 г. для решения этой задачи в эпидемиологическую практику активно внедряется метод мультилокусного секвенирования-типирования (МЛСТ). Метод МЛСТ имеет ряд существенных преимуществ перед серологическими и некоторыми молекулярно-биологическими методами типирования. Основным преимуществом МЛСТ является абсолютная сопоставимость результатов, полученных разными исследователями, а также возможность объединения результатов в глобальную базу данных (БД) с помощью интернета, что существенно облегчает работу эпидемиолога. Данные секвенирования, полученные при проведении МЛСТ, могут быть использованы для дополнительного филогенетического анализа.

На сегодняшний день МЛСТ является наиболее подходящим инструментом для характеристики популяции штаммов N.meningitidis, слежения за появлением или исчезновением эпидемически значимых клональных комплексов и проведения глобального эпидемиологического анализа.

Исследование московских штаммов N.meningitidis, изолированных в период с 1969 по 1996 г. (Achtman et al., 2001), продемонстрировало совпадение эпидемического подъема в 1969-1975 гг. и вспышки менингококковой инфекции в 1996 г. с выявлением штаммов N.meningitidis, принадлежащих генетической субгруппе III. На настоящий момент остается актуальным наблюдение за штаммами N.meningitidis серогруппы А и своевременное выявление штаммов, принадлежащих генетической субгруппе III. До настоящего времени не проводилось наблюдение за циркуляцией на территории Москвы гипервирулентных штаммов серогрупп С и Wi1_3.5_. не.-iuna проведена

характеристика популяции штаммов серогруппы В, преобладающих на территории Москвы в течение многих лет наблюдения за менингококковой инфекцией.

Схема МЛСТ для H.influenzae окончательно разработана в апреле 2003 г.; результаты применения МЛСТ для H.influenzae демонстрируют возможность детальной характеристики штаммов, принадлежащих разным серотипам, и эпидемиологическую обоснованность применения данного подхода (Meats et al., 2003).

Проведенное в 1999-2001 гг. исследование "Эпидемиологический, на популяционной основе, надзор за Hib-менингитами у детей до 5-летнего возраста в Москве", впервые позволило достоверно определить заболеваемость Hib-менингитами, которая составила 5,7 случаев в год на 100000 детей до 5 лет. Это ниже, чем в большинстве европейских стран (порядка 10-25 случаев на 100000 в аналогичной популяции) и существенно ниже, чем в странах американского континента (порядка 20-50 случаев на 100000) до введения вакцинопрофилактики. Данная ситуация может объясняться особенностями московской популяции детей, общей эпидемиологической ситуацией на территории или господством на территории других, отличных от европейских, менее вирулентных штаммов Hib. Для прояснения эпидемиологической ситуации и оценки генетической связи московских и зарубежных штаммов целесообразно было провести сравнительную характеристику московских штаммов Hib методом МЛСТ.

Принципиальным является вопрос об антигенной структуре московской популяции штаммов N. meningitidis. Предыдущие исследования субтипов N.memngitidis серологическим методом не позволили в полной мере охарактеризовать антигенную структуру менингококков, распространенных на территории Москвы. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов генома бактерии, кодирующих поверхностные антигенные детерминанты, позволяет избежать сложностей, связанных с типированием серологическим методом. Секвенирование дает возможность однозначно

предсказать аминокислотную последовательность и расширить антигенную характеристику штамма за счет характеристики дополнительного эпитопа. Выявление антигенных свойств белков наружной мембраны менингококков может быть использовано в эпидемиологических целях, а так же при конструировании белковых или белково-полисахаридных вакцин, что особенно актуально для штаммов N.meningitidis серогруппы В.

Цель работы

Молекулярно-эпидемиологическое исследование штаммов N.meningitidis и Hib, циркулирующих на территории Москвы, их генетическая характеристика в сопоставлении с зарубежными штаммами.

Задачи исследования

1. Отработка методик МЛСТ (для N.meningitidis и Hib) и субтипирования (для N.meningitidis) в соответствии с принятыми международными схемами.

2. Характеристика штаммов N.meningitidis и Hib, изолированных от больных ГБМ на территории Москвы с 1984 по 2003 гг. методом МЛСТ.

3. Антигенная характеристика штаммов N.meningitidis на основании секвенирования фрагментов гена рогА; сопоставление результатов генетического субтипирования и МЛСТ.

4. Поиск возможных закономерностей эволюционных изменений московских штаммов N.meningitidis и Hib. Характеристика генетического родства московских штаммов между собой, сравнение их с зарубежными штаммами.

5. Поиск на основании типирования гипервирулентных штаммов (клональных комплексов); оценка эпидемической опасности клональных комплексов N.meningitidis и Hib, распространенных на территории Москвы.

Научная новизна исследования

Впервые проведена генетическая характеристика московской популяции штаммов N.meningitidis и Hib с помощью не используемого ранее метода МЛСТ. Результаты проведенного исследования позволяют достоверно оценить степень

генетического родства российских и зарубежных штаммов, показать филогенетическую связь возбудителей и уровень генетической изменчивости в популяциях. Сопоставление полученных результатов с данными, содержащимися в международной БД, позволили охарактеризовать штаммы (клональные комплексы), циркулирующие на территории Москвы. Продемонстрирована возможность использования МЛСТ для детальной характеристики популяции возбудителей, принадлежащей одной серогруппе (серотипу). Показана эпидемиологическая обоснованность применения метода МЛСТ для выявления гипервирулентных штаммов (клональных комплексов) и наблюдения за появлением новых генотипов.

Впервые на основании секвенирования фрагментов гена рог А проведено полное генетическое субтипирование московской популяции штаммов N.meningitidis по трем вариабельным фрагментам в соответствии с международной номенклатурой. Показаны преимущества данного подхода перед традиционным методом серосубтипирования, возможность детальной и расширенной характеристики антигенной структуры вида N.meningitidis.

Практическая значимость работы

Внедрение в эпидемиологическую практику метода МЛСТ ведет к повышению эффективности эпидемиологического надзора за возбудителями ГБМ. Накопление и интегрирование результатов, полученных методом МЛСТ, обеспечивает углубление и совершенствование знаний о клональной организации, закономерностях циркуляции и эволюции патогенных бактерий. Данные МЛСТ являются основой для разработки новых менее трудоемких и/или более доступных подходов для выявления и отслеживания распространения гипервирулентных штаммов (клональных комплексов) патогенных бактерий, слежения за появлением новых генотипов. Своевременное выявление гипервирулентных штаммов ведет к повышению эффективности эпидемиологического надзора за бактериальными менингитами.

Внедрение

Результаты диссертационной работы были использованы при принятии решений в период обострения эпидемиологической ситуации с мениногококковой инфекции на территории Москвы в первой половине 2003 г. (приказ Департамента здравоохранения г. Москвы и центра Госсанэпиднадзора в г.Москве от 30.09.03 №585/221 "Об организации проведения профилактических прививок против менингококковой инфекции").

Материалы диссертационной работы использованы в лекционном материале для слушателей Российской академии последипломного образования.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на VIII Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 26-28 марта 2002 г.), 13th International Pathogenic Neisseria conference (Осло, 1-6 сентября, 2002), 4-й Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний" (Москва, 22-24 октября 2002 г.), 5-й Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний" (Москва, 19-21 октября 2004 г.), 1-й Российской конференции "Актуальные проблемы менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов" (Москва, 16-18 ноября 2004 г.), а также на семинарах научно-производственной лаборатории по разработке и производству препаратов для диагностики заболеваний человека и животных ГУ ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ (2001-2004 гг.) и ученом совете ГУ ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ (4 ноября 2004 г.). Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, разделов "Результаты" и "Обсуждение результатов", заключения, выводов и библиографического

указателя (18 источников на русском языке и 81 - на английском). Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста, включает 16 таблиц и 7 рисунков.

Материалы и методы

Исследованные штаммы. В работе типировано 47 штаммов Hib, изолированных от больных с диагнозом гнойный Hib-менингит и 2 штамма, изолированные от здоровых носителей. Все штаммы Hib, за одним исключением, были получены от детей в возрасте до 5 лет. Большинство исследуемых штаммов (34) было получено в 2000-2001 гг. из инфекционных больниц г.Москвы. Исследовано 2 образца спинно-мозговой жидкости (СМЖ) от больных Hib-менингитом, любезно предоставленные к.м.н. Л.ПБорониной (ОДКБ №1 г. Екатеринбург); а также один штамм, изолированный в Киргизии. Для проведения ретроспективного анализа, использовано 6 штаммов Hib из коллекции лаборатории эпидемиологии менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов ГУ ЦНИИ эпидемиологии, выделенные в 1984 году.

Все изученные штаммы бактерий вида N.meningitidis, за одним исключением, изолированы из СМЖ больных генерализованной формой менингококковой инфекцией, госпитализированных в ИКБ№2 г.Москвы. Распределение изучаемых штаммов по серогруппам и времени выделения следующее: серогруппа А - 28 штаммов (выделены в период 1997-2003 гг.), В -16 (1995-2001 гг.), С - 14 (1997-2002 гг.) и W-135 - 2 (1999 и 2000 г.). Принадлежность штаммов менингококков к серогруппам А, В и С была определена в реакции латекс-агглютинации ("Slidex meningite-Kit 5" BioMerieux, Франция), а также подтверждена ПЦР-исследованием с использованием тест-системы "АмплиСенс Neisseria meningitidis серогрупп А, В, С" (производство ГУ ЦНИИЭ, Россия). Принадлежность штаммов к серогруппе W-135 была показана в реакции агглютинации со специфической агглютинирующей сывороткой. Часть изученных штаммов была протестирована с помощью моноклональных антител для определения серосубтипа.

Лабораторные методики и оборудование. Высев клинического материала проводился на шоколадный агар с добавлением смеси ростовых факторов PolyViteX (BioMerieux, Франция). Инкубация длилась в течение 24 часов, рост культур проходил при 37°С в обогащенной 5% СО2 атмосфере.

Выделение ДНК проводилось из ликвора или бактериальной культуры. Для выделения ДНК и очистки продуктов амплификации использовались наборы "ДНК-сорб-А" и "ДНК-сорб-В" производства ГУ ЦНИИЭ (АмплиСенс, Россия), все действия проводились согласно инструкции изготовителя с незначительными модификациями.

ПЦР ставилась по методике "горячего старта" на амплификаторах Терцик (ДНК-технология, Россия) или Tl (Biometra, Германия). Все реактивы (за исключением праймеров), использованные при постановке ПЦР, произведены в ГУ ЦНИИЭ (АмплиСенс, Россия). Продукты амплификации выявляли и дифференцировали методом электрофореза в 1,7% агарозном геле, содержащим бромистый этидий.

Секвенирование проводилась с использованием набора ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosistems, США) на амплификаторе GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer, США), согласно инструкции изготовителя. Детекция результатов секвенирования осуществлялась в автоматическом режиме методом капиллярного электрофореза на приборах ABI Prism 310 Genetic Analyzer и ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США).

Программное обеспечение для филогенетичекого анализа и необходимые интернет-ресурсы. Анализ сиквенс-типов (СТ) и построение филогенетических деревьев по принципу МЛСТ сделаны с помощью программы START 0.9.0 по алгоритму UPGMA. Филогенетический анализ на основании анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводился с помощью программы Mega 2.1, построение сплит-графов -программой SplitsTree 3.1. В работе использован алгоритм обработки данных

МЛСТ BURST и его on-line версия eBURST, доступная через инетернет-сайт http://eburst.mlst.net/loci.asp.

Общая информация о принципах МЛСТ, методиках обработки данных и часть программного обеспечения были взяты с интернет-сайта http://www.mlst.net/. Присвоение номеров аллелей полученным нуклеотидным последовательностям, определение СТ и клональных комплексов (для N.meningitidis), сравнение полученных данных с уже имеющимися, было реализовано через интернет-ресурсы http://haemophilus.mlst.net/ и http://pubmlst.org/neisseria/ для Hib и N.meningitidis, соответственно. Для характеристики изучаемых штаммов в данной работе использовались только те данные, которые были доступны на завершающем этапе исследования (февраль-апрель 2004 г.). БД для H.influenzae содержала 163 штамма, из них 57 штаммов принадлежали серотипу Ь, этому количеству соответствовало 14 вариантов СТ. БД для Neisseria содержала 4905 штаммов, которым соответствовало 3462 СТ; из них 4663 штамма принадлежали бактериям вида N.meningitidis (3222 СТ).

Идентификация и присвоение номеров вариабельным участкам VR1 и VR2 белка PorA N.meningitidis проводилась согласно общепринятой номенклатуре через интернет-сайт http://neisseiia.org/nm/typing/pora/. Идентификация и обозначение эпитопа VR3 была сделана в соответствии с опубликованной Clarke и соавт. (Clarke et al., 2003) номенклатурой, представленной на интернет-сайте http://www.show.scot.nhs.uk/smprl/pora.html.

Результаты и обсуждение

Проведение МЛСТ N.meningitidis и H.influenzae основано на секвенировании семи генных фрагментов, строго определенных для каждого бактериального вида. Каждая уникальная последовательность является аллелем локуса (обозначается цифрой). Набор аллелей исследуемых локусов образует аллельный профиль (последовательность из цифр, соответствующих аллелям), который определяет СТ штамма. Номера аллелям и СТ присваиваются согласно международной номенклатуре через соответствующие нтернет-ресурсы. Взаимосвязи СТ и генетическое расстояние между ними оцениваются с

помощью методов кластерного анализа, реализуемых посредством специализированного компьютерного обеспечения, в том числе через интернет в режиме on-line.

МЛСТ штаммов Hib. При выполнении работы была отработана схема применения МЛСТ и проведено типирование московских штаммов Hib. Результаты секвенирования показывают, что каждый из исследованных генных фрагментов представлен как минимум двумя аллелями, максимальное количество аллелей (5) наблюдается у фрагмента mdh. У каждого генного фрагмента можно выделить наиболее типичный для изученной выборки штаммов аллель, присутствующий у подавляющего большинства штаммов: от 79,6% до 95,9%. У исследованных штаммов обнаруженные аллели формируют 10 вариантов аллельных профилей. Из десяти наблюдаемых СТ только один (СТ-6) выявлен в предыдущих исследованиях, остальные СТ описаны впервые. Сиквенс-типы 78, 94 и 110 являются комбинацией аллелей, известных (секвенированных) ранее. Остальные СТ включают аллели, секвенированные впервые в данной работе. Частота наблюдаемых СТ у исследуемых штаммов, а также частота СТ с учетом выборки представлена в Таблице 1.

Таблица 1. Аллельные профили и частота СТ московских штаммов Hib

Аллельный профиль (adk, atpG, frdB, fucK, mdh, pgi, recA) CT 1* 2** 3**

Частота Частота,»/. Частота Частота,*/. Частота Частота,%

10,14,4,5,4,7,8 6 22 44,9 22 47,8 22 55

10,14,4,5,4,7,28 92 8 16,3 8 17,4 8 20

10,14,4,5,22,7,8 78 4 8,2 4 8,7 4 10

10,14,5,25,4,7,8 79 4 8,2 4 8,7 1 2,5

31,14,4,5,4,7,8 95 4 8,2 3 6,5 2 5

6,30,23, 1,33,29,7 93 2 4,1 2 4,3 1 2,5

10,14,5,7,43,7,8 80 2 4,1 1 2,2 1 2,5

10,14,21,5,4,7,8 94 1 2 1 2,2 1 2,5

10,14,23,5,22,7,8 110 1 2 1 2,2 - -

10,14,4,5,44,7,8 81 1 2 - - - -

* - все типированные штаммы (49); ** - только московские штаммы (46);

*** - московские штаммы, выделенные в период с 1997 по 2002 гг. (40).

На основании полученных аллельных профилей были оценены генетические взаимоотношения типированных штаммов ШК Выяснилось, что подавляющее большинство исследованных штаммов входят в один клональный комплекс (клональный комплекс СТ-6), который объединяет 47 (96%) штаммов, распределенных по девяти СТ (рис. 1). Остальные штаммы (2, 4%) отличаются от штаммов клонального комплекса СТ-6 как минимум по 6 локусам. Результаты МЛСТ штаммов, изолированных в 1984 году, не позволили с уверенностью выделить преобладающий СТ, но поскольку большинство штаммов принадлежали тому же клональному комплексу (клональному комплексу СТ-6), было сделано предположение о том, что штаммы, циркулирующие на территории Москвы, с 1984 года не претерпели существенных генетических изменений. Отсутствие в 1984 году штаммов с СТ-6 и принадлежность трех (из шести) штаммов к СТ-79, позволяют предположить тенденцию к смене доминирующих СТ внутри одного клонального комплекса, у штаммов, изолированных в разные периоды времени на одной территории.

ч - отличия по одному локусу

ч /

—--" ---отличия по двум локусам

Рис. 1. Взаимоотношения штаммов клонального комплекса СТ-6

Анализ филогенетического родства типированных штаммов, проведенный на основании полученных нуклеотидных последовательностей и анализ по аминокислотной последовательности, в целом демонстрирует согласованность с

результатами кластеризации данных МЛСТ и позволяет предположить, что штамм с СТ-95 является наиболее вероятным предком для штаммов с СТ-6, который в свою очередь является наиболее вероятным предшественником большинства остальных СТ клонального комплекса СТ-6. Филогенетический анализ указывает на то, что скорее всего большинство наблюдаемых СТ являются результатом дивергенции СТ-6, который возможно возник в результате рекомбинационного процесса от СТ-95.

Используя все имеющиеся на момент исследования данные о типированных штаммах H.Influenzae, содержащиеся в интернет-БД, было проведено сравнение исследованных штаммов с зарубежными. Выяснилось, что распределение российских штаммов Hib по клональным комплексам повторяет структуру клональных комплексов Hib, показанную при типировании выборки большего объема зарубежными коллегами (Meats et al., 2003). Выделенному нами с помощью алгоритма BURST клональному комплексу СТ-6 соответствует отмеченный иностранными авторами клональный комплексы А1/А2, 2 штаммам, не входящим в клональный комплекс СТ-6, соответствует клональный комплекс Bib. Клональные комплексы А1/А2 и B1b объединяют штаммы, принадлежащие только Hib, они заметно отделены от штаммов других серотипов и бескапсульных штаммов. Несмотря на типичную для штаммов Hib клональную организацию, 9 из 10 СТ, выявленных у российских штаммов уникальны (не встречались ранее), что говорит о генетических особенностях штаммов Hib, циркулирующих в нашей стране, а также демонстрирует высокую дискриминирующую способность метода МЛСТ.

На основании сравнения московских штаммов с зарубежными можно заключить, что клональная структура штаммов Hib на протяжении последних десятилетий не изменяется. Более низкую заболеваемость Hib-менингитами в Москве вряд ли можно объяснить циркуляцией на территории Москвы отличных от европейских и американских, менее вирулентных штаммов Hib, поскольку большинство (48%) московских штаммов принадлежат СТ-6, также обнаруженному у штаммов, изолированных в Европе и США. Невысокая

заболеваемость Hib-менингитами на территории Москвы скорее всего, связана с социально-биологическими и иммунологическими особенностями московской популяции детей.

МЛСТ и субтипирование штаммов N.meningitidis. При выполнении работы были выбраны оригинальные праймеры и проведено типирование московских штаммов N.meningitidis двумя методами. Результаты МЛСТ и субтипирования штаммов N.meningitidis представлены в Таблице 2.

На основании результатов запроса в интернет-БД был определен СТ у большинства штаммов N.meningitidis серогруппы А (18), в то время как большинство штаммов серогрупп В, С и W-135 имели не описанный ранее СТ. Тем не менее, для большинства штаммов всех исследованных серогрупп, за исключением штаммов серогруппы W-135, удалось определить принадлежность к известным клональным комплексам. В виду повышенного эпидемиологического интереса к штаммам N.meningitidis серогруппы А, а также на основании детального изучения клональной организации штаммов этой серогруппы ранее, в данной работе клональные комплексы обозначались согласно M.Achtman и соавт. (Achtman et al., 2001).

Было выяснено, что на территории Москвы после 1997 г. штаммы эпидемически значимой генетической субгруппы III до 2003 г. не встречались. Отсутствие штаммов генетической субгруппы III после 1997 г. согласуется с невысокими показателями заболеваемости, зафиксированными до конца 2002 гг. В межэпидемический период преимущественно изолировались штаммы, принадлежащие генетическим субгруппам VI и X. Появление штамма генетической субгруппы III в начале 2003 г., скорее всего, является исключением, на что указывает источник штамма (штамм изолирован от гражданина Узбекистана). Напряженная эпидемическая ситуация с менингококковой инфекцией на территории Москвы в первой половине 2003 г. (увеличение заболеваемости в 1,7 раза по сравнению с аналогичным периодом 2002 г. преимущественно за счет штаммов серогруппы А) может быть связана со сменой преобладающей генетической субгруппы в 2002-2003 гг. В указанный

период наблюдалось появление новых не описанных в интернет-БД СТ, преимущественно внутри генетической субгруппы X, и увеличение частоты их выделения, что является свидетельством эволюционных изменений штаммов серогруппы А. Не исключено, что подъем заболеваемости был обусловлен измененными штаммами генетической субгруппы X.

Среди исследованных штаммов N.meningitidis серогруппы В описанный в предыдущих исследованиях СТ был найден только у 4 штаммов, все они принадлежали СТ-18. До настоящего исследования, СТ-18 были обнаружены у трех штаммов, один из которых был выделен в России (1989 г.). Московская популяция штаммов N.meningitidis серогруппы В распределена по трем клональным комплексам, большинство штаммов (12,75%) входят в клональный комплекс СТ-18 (ST-18 complex). Для двух штаммов клональный комплекс не определен.

Московские штаммы N.meningitidis серогруппы С распределены по 2 клональным комплексам: 6 (43%) штаммов входят в клональный комплекс СТ-41/44 (ST-41/44 complex/Lineage 3) и 2 (7%) штамма входят в клональный комплекс СТ-18. Все исследованные штаммы этой серогруппы имели СТ, не выявленные ранее.

По результатам МЛСТ московских штаммов N.meningitidis можно судить о динамике московской популяции штаммов серогруппы В, изолированных на протяжении 1995-2002 гг.: практически все штаммы, изолированные до 2001 г., принадлежат клональному комплексу СТ-18; начиная с 2001 г. только 1 штамм из четырех входит в этот клональный комплекс. Два московских штамма N.meningitidis серогруппы В, изолированные в 1988 и 1989 гг., так же входят в клональный комплекс СТ-18. Появление штаммов, принадлежащих клональным комплексам СТ-11 (ST-11 complex/ET-37 complex) и СТ-41/44 говорит о наблюдаемой смене доминирующего клонального комплекса в московской популяции штаммов N.meningitidis серогруппы В.

Таблица 2. Результаты типирования штаммов N.meningitidis

Шпмм* СГ ст Кмшишя комплекс MJICT-локусы PorA

ucZ Adk ■roE fumC Gdh pdhC Ptm VR1 VR2 VR3

М216/97 А 2 revi 1 3 4 7 1 1 3 7-1 4-1 37-1

М305/97 А 7 ГСШ 1 1 2 1 3 2 19 20 9 35-1

М810/97 Л 7 ГСШ 1 1 2 1 3 2 19 20 9 35-1

М461/98 А 2 revi 1 3 4 7 1 1 3 5-2 10 37-1

М486/98 А 3337 revi 1 3 9 7 1 21 3 5-2 10 37-1

М495/98 А 33% неопределен 2 3 25 1 21 1 17 5-2 10 37-1

М586/98 А 73 revi 1 3 4 7 1 21 3 5-2 10 37-1

М585/99 А 73 revi 1 3 4 7 1 21 3 5-2 10 37-1

М91/00 А 75 ГСХ 2 3 25 1 1 1 3 5-2 10 37-1

М143/1X1 А 2 revi 1 3 4 7 1 1 3 5-2 10 37-1

М150/00 А 75 ГСХ 2 3 25 1 1 1 3 5 10 37-1

М151/00 А 2 revi 1 3 4 7 1 1 3 5-2 10 37-1

М168/00 А 3336 неоцкделен 2 3 25 1 21 1 17 5-2 10 37-1

MI86/01 А 2 revi 1 3 4 7 1 1 3 22 14 37-1

М193/01 А 73 revi 1 3 4 7 1 21 3 5-2 10 37-1

М212/01 А 2 revi 1 3 4 7 1 1 3 5-2 10 37-1

М215/01 А 68 не определен 1 3 4 7 21 1 17 5 10-30 37-1

М233/01 А 2 revi 1 3 4 7 1 1 3 5-2 10 37-1

М32/02 А 3349 ГСХ 2 3 282 1 1 1 3 5-2 10 37-1

М468/02 А 3338 ГСХ 2 3 25 17 21 1 17 5-2 10 37-1

М490/02 А 68 не определен 1 3 4 7 21 1 17 5 10 37-1

М412/03 А 3349 ГСХ 2 3 212 1 1 1 3 5-2 10 37-1

М447/0Э А 3349 ГСХ 2 3 212 1 1 1 3 5-2 10 37-1

М517/03 А 7 ГСШ 1 1 2 1 3 19 20 9 35-1

М678/03 А 3349 ГСХ 2 3 212 1 1 1 3 12-1 14 36

М871Л13 А 68 неоцкделен 1 3 4 7 21 1 17 5 10 37-1

М1204/03 А 3349 ГСХ 2 3 282 1 1 1 3 5-2 10 37-1

М1264/03 А ЭМ» ГСХ 2 3 282 1 1 1 3 5-2 10 37-1

М330/95 В 3357 СТ-18 253 8 10 19 10 21 2 . . .

М336/95 В 3358 СТ-18 25 8 10 19 10 252 2 18-1 3 38

М1011/96 В 3359 СТ-18 3 8 6 19 10 21 2 22 26 36-2

М13/96 В 3360 неопределен 12 5 53 39 9 22 8 5-1 10-1 36-2

М592/97 В 3350 СТ-18 7 16 10 19 10 1 8 19 15 36

М668/97 В 3354 СТ-18 7 8 10 19 10 254 2 12-1 14 36

M444/9I В 3351 СТ-18 7 5 10 19 10 253 2 22 14-6 36-2

М481/98 В 33S6 СТ-18 254 8 10 19 10 1 2 5-1 2-2 36-2

М555/99 В 18 СТ-18 7 8 10 19 10 1 2 21 4 37

M60S/99 В 18 СТ-18 7 8 10 19 10 1 2 22 14 36

М121/00 В 18 СТ-18 7 8 10 19 10 1 2 5-1 2-2 36-2

М175/00 В 3355 СТ-18 251 8 15 19 10 1 2 5-1 2-2 36-2

М194/01 В 3361 СТ-11 252 3 4 256 8 5-1 10-1 36-2

М271/01 В 3352 нео!феделен 12 7 4 266 5 21 16 21-2 28 37

М292/02 В 18 СТ-18 7 8 10 19 10 1 2 18-1 3 38

МЭ04/02 В 3346 СТ-41/44 9 6 9 9 249 6 17 16-4 36

М201/У7 С 3339 неоцхдежн 6 5 34 13 1 24 17 5-1 2-2 36-2

М409/97 С 3340 (СОщкдежн 46 2 4 7 58 20 16 20 9 35-1

М458/98 С 3348 СТ-18 7 5 10 19 10 253 5-3 2-16 36-2

М537/98 С 3271 СТ-41/44 9 6 9 1 8 6 18-1 34 38

М637/98 с 3353 не определен 2 7 35 40 26 18 1 18-1 34 38

М2/99 с 3341 СТ-18 7 5 10 19 10 8 2 12-1 13-1 35-1

М8/99 с 3271 СТ-41/44 9 6 9 1 8 6 9 18-1 34 38

М29/99 с 3347 неоцклелен 4 18 281 39 29 63 258 5-1 10-8 36-2

M3I/99 с 3345 СТ-41/44 9 6 37 9 249 6 9 17 16-4 36

М102/00 с 3346 СТ-41/44 9 6 9 9 249 6 9 17 16-4 36

М171/00 с 3342 к определен 8 5 6 17 8 31 8 19 15 36

М195/01 с 334« СТ-41/44 9 6 9 9 249 6 9 17 16-4 36

М214/01 с 3346 СТ-41/44 9 6 9 9 249 6 9 17 16-4 36

М105/02 с 3143 не определен 6 5 7 17 21 6 17 7 16 37-1

M2I/99 W-135 2977 неочкделен 6 148 15 17 5 24 17 22 26 35-1

М88ЛЮ W-135 3344 неодеделен 12 5 6 17 8 24 8 7-2 13-1 35-1

Две последние цифры в названии - год выделения штамма. СГ -

серогруппа штамма; ГС - генетическая субгруппа. Жирным шрифтом выделены аллели и СТ, обнаруженные впервые.

Присутствие в московской популяции штаммов серогруппы В штамма, входящего в клональный комплекс СТ-11, который содержит штаммы преимущественно серогруппы С, а также присутствие в московской популяции штаммов серогруппы С штаммов, входящих в клональный комплекс СТ-18 (1 штамм) и клональный комплекс СТ-41/44 (6 штаммов), которые содержат штаммы преимущественно серогруппы В, может рассматриваться как свидетельство горизонтального переноса генетической информации между представителями двух серогрупп. Также нельзя исключить, что эволюционные изменения московских штаммов серогрупп В и С связаны с рекомбинационными процессами между "московской" популяцией штаммов и штаммов, занесенных с других территорий.

На основании кластеризации аллельных профилей исследованных штаммов N.meningitidis серогрупп В и С методом BURST, было показано, что клональная структура московских штаммов серогрупп В и С различна. Среди 16 штаммов серогруппы В существует 5 групп штаммов (трем соответствуют известные клональные комплексы, для двух клональный комплекс не определен), 14 штаммов серогруппы С образуют 8 групп штаммов (2 и 6, соответственно). Можно сделать вывод о большей интенсивности рекомбинационных процессов в популяции штаммов серогруппы С, приводящих к более быстрому "размыванию" клональной структуры.

Ограниченность выборки штаммов серогруппы W-135 не позволяет с уверенностью говорить о динамике и уровне рекомбинационных процессов в популяции этих штаммов. Один из исследованных штаммов принадлежал СТ, выявленному ранее (США, 1994 г.), СТ другого штамма обнаружен впервые. Оба штамма не удается включить в какой-либо клональный комплекс.

Наличие в московских популяциях серогрупп В, С и W-135 штаммов с не определенным клональным комплексом может свидетельствовать с одной стороны, об особенностях московских штаммов по сравнению с зарубежными (в эпидемиологическом аспекте), с другой - об интенсивных рекомбинационных

процессах, проходящих внутри одной серогруппы и между штаммами разных серогрупп (в биологическом аспекте).

На особенности московской популяции штаммов серогрупп В и С указывает значительное количество впервые описанных СТ, не обнаруженных ранее на других территориях, в частности - Европе. Об уникальности московских штаммов говорит еще и тот факт, что у многих штаммов, встречаются ранее не выявленные аллели МЛСТ-локусов (Таблица 2). Говоря об "уникальности" московской популяции штаммов, следует учитывать, что информация, представленная в интернет-БД, может быть неполной (данные о штаммах, циркулирующих в странах Восточной Европы и Средней Азии ограничены).

При типировании московских штаммов не было обнаружено представителей многих клональных комплексов, распространенных в странах Европы и Америки. В частности показано, что на территории Москвы не циркулируют штаммы, принадлежащие гипервирулентным клональным комплексам СТ-8 (ST-8 complex/Cluster А4) и СТ-32 (ST-32 complex/ET-5 complex), только один московский штамм серогруппы В принадлежит клональному комплексу СТ-11. Среди штаммов серогруппы W-135, не было обнаружено представителей гипервирулентного клонального комплекса СТ-11, обеспечившего после паломничества мусульман (хаджа) в 2000 и 2001 гг. эпидемический подъем заболеваемости в странах Африки и экспорт инфекции на территорию Европы и Азии.

Для всех охарактеризованных методом МЛСТ московских штаммов N.meningitidis было проведено субтипирование на основании секвенирования фрагментов гена ротА. Применение секвенирования фрагментов гена рогА показало, что у изученной выборки московских штаммов N.meningitidis встречается 15 вариантов фрагмента VR1,19 - фрагмента VR2 и 6 - фрагмента VR3. У одного штамма субтип определить не удалось, что, на наш взгляд, связано с отсутствием у этого штамма гена рог А.

Большинство штаммов серогруппы А (18, 64%) имеют субтип Р1.5-2,10,37-1. Штаммы с субтипом Р1.5-2,10,37-1 изолировались в Москве с 1998 в течение всего времени исследования, они распределены равномерно между генетическими субгруппами VI и X. Субтип Р1.5,10,37-1 обнаружен у 3 (17%) штаммов; два штамма принадлежат СТ-68 (генетическая субгруппа VI), один -СТ-75 (генетическая субгруппа X). Все исследованные штаммы N.meningitidis серогруппы А, принадлежащие генетической субгруппе III, имели субтип P1.20,9,35-1.

При сопоставлении результатов генетического субтипирования с данными серосубтипирования московских штаммов, изолированных в 1983-1997 гг., был сделан вывод о том, что антигенная структура штаммов N.meningitidis серогруппы А, циркулирующих на территории Москвы, не претерпела принципиальных изменений.

Популяции штаммов N.meningitidis серогрупп В и С отличаются широким полиморфизмом антигенной структуры, генетическое субтипирование штаммов данных серогрупп не позволяет выделить преобладающий субтип. Субтипы штаммов N.meningitidis серогруппы В, встречающиеся неоднократно, распределены следующим образом: субтип Р 1.5-1,2-2,36-2 обнаружен у 3 (19%) штаммов, субтип Р1.18-1,3,38 - у 2 (12,5%); все штаммы входят в клональный комплекс СТ-18. У 2 (12,5%) штаммов, не входящих в клональный комплекс СТ-18, также наблюдается субтип Р1.5-1,10-1,36-2. Исследованные штаммы N.meningitidis серогруппы С распределены по субтипам похожим образом. Максимальное количество штаммов одного субтипа (4 штамма, 28,5%) имели субтип Р1.17,16-4,36 и принадлежали клональному комплексу СТ-41/44; субтип Р 1.18-1,34,38 найден у 3 (21%) штаммов, 2 из которых входят в клональный комплекс СТ-41/44, а для одного штамма клональный комплекс не определен.

Сопоставление результатов настоящего исследования с результатам серосубтипирования московских штаммов серогрупп В и С, изолированных в 1983-1997 гг. показывает, что охарактеризованные популяции штаммов этих серогрупп имеют такую же гетерогенную структуру. Распределение субтипов у

штаммов серогрупп В и С свидетельствует о высоком уровне рекомбинационных процессов в этих популяциях, приводящих к большему фенотипическому разнообразию по сравнению с популяцией штаммов серогруппы А.

Для всех исследованных штаммов, за исключением штаммов генетической субгруппы III, не представляется возможным обозначить какую-либо связь субтипа и клонального комплекса.

Результаты субтипирования демонстрируют выраженную гомогенность штаммов N.meningitidis серогруппы А: из 28 штаммов N.meningitidis серогруппы А только 4 (14%) штамма имеют однократно встречающийся субтип, в то время, как у штаммов серогрупп В и С, исследованных в меньшем количестве, однократно встречающиеся субтипы присутствуют более чем у половины штаммов: 7 (67%) и 8 (57%), соответственно. Основанная на субтиповой характеристике клональная структура популяций штаммов N.meningitidis трех серогрупп согласуется с результатами распределения наблюдаемых СТ, которые также демонстрируют гомогенность московской популяции штаммов N.meningitidis серогруппы А и гетерогенность популяций штаммов серогрупп В и С, в которых большинство штаммов имеют неповторимый СТ.

Результаты применения двух альтернативных методов типирования в полной мере позволили охарактеризовать московскую популяцию возбудителей ГБМ. На примере типирования N.meningitidis и Hib показано, что метод МЛСТ пригоден для характеристики бактериальных популяций и выявления эпидемически значимых штаммов (клональных комплексов). Также следует отметить, что проведение данной работы позволило дополнить и расширить представления о генетическом разнообразии и эволюционном потенциале популяций бактерий видов N.meningitidis и H.influenzae. Все результаты типирования и дополнительные данные о штаммах занесены в соответствующие интернет-БД и доступны для будущих исследований. Особенно следует отметить вклад в недавно созданную интернет-БД для H.influenzae, поскольку

наши результаты существенно дополнили имеющиеся на момент исследования данные о штаммах, принадлежащих серотипу b.

Метод МЛСТ является удобным инструментом для осуществления всестороннего эпидемиологического надзора и наблюдения за эволюцией патогенных бактерий. Благодаря использованию методики секвенирования, существует возможность для прямой оценки генетических и филогенетических взаимосвязей между штаммами и проведения сравнения с штаммами, типированными другими исследователями. Применение секвенирования для определения субтипов бактерий вида N.meningitidis позволило охарактеризовать все исследованные штаммы, что далеко не всегда можно осуществить серологическим методом. Секвенирование дает возможность дифференцировать эпитопы, принадлежащие одному семейству и позволяет проводить расширенную антигенную характеристику штамма за счет описания дополнительного эпитопа (VR3). Использование методов, основанных на секвенировании, позволяет проводить быстрый и удобный анализ результатов и объединять данные всех лабораторий, проводящих аналогичные исследования.

Применение метода МЛСТ и антигенной характеристики на основании секвенирования позволяет следить за эволюцией популяции возбудителя, своевременно выявлять наиболее опасные штаммы (клональные комплексы) и отслеживать закономерности их циркуляции, что необходимо для более полного и всестороннего эпидемиологического надзора за патогенными бактериями, циркулирующими на территории России.

Выводы

1. Отработаны методика проведения МЛСТ бактерий видов N.meningitidis и Hib, и схема субтипирования N.meningitidis. Проведено типирование московской популяции этих микроорганизмов.

2. Клональная структура московской популяции штаммов Hib аналогична структуре популяции штаммов Hib, циркулирующих за рубежом. Штаммы Hib, циркулирующие на территории Москвы с 1984 г. не претерпели существенных генетических изменений. Более низкая заболеваемость Hib-менингитом в

Москве, по сравнению с странами Европы и Америки (до введения программ по вакцинопрофилактики), не связана с особенностями популяции возбудителя, циркулирующей на территории.

3. Штаммы N.memngitidis генетической субгруппы III в период 1997-2002 г. в Москве на встречались, что согласуется с данными о невысоком показателе заболеваемости в эти годы. Подъем заболеваемости в начале 2003 г., сопровождавшийся увеличением доли выделяемых штаммов N.memngitidis серогруппы А возможно связан с измененными штаммами генетической субгруппы X.

4. Популяции московских штаммов N.memngitidis серогрупп В и С отличаются от зарубежных. Имеет место интенсивный рекомбинационный процесс, приводящий к изменению в популяциях штаммов N.memngitidis серогрупп В и С; большинство эволюционных изменений происходит в пределах известных клональных комплексов (клонального комплекса СТ-18 и клонального комплекса СТ-41/44).

5. На территории Москвы не обнаружено штаммов, принадлежащих некоторым гипервирулентным клональным комплексам, выявленным за рубежом (клональные комплексы СТ-8 и СТ-32). Московские штаммы серогруппы W-135 не принадлежат эпидемически значимому клональному комплексу СТ-11.

6. Субтипирование штаммов N.memngitidis с помощью секвенирования имеет ряд существенных преимуществ перед серологическим методом, основными из которых являются: возможность типирования практически любого штамма и расширение представлений об антигенном разнообразии бактериальной популяции путем классификации субтипов внутри семейств и типирования вариабельного фрагмента VR3.

7. Методы характеристики бактериальных популяций с помощью МЛСТ и субтипирования обеспечивают проведение всестороннего наблюдения за эпидемическим процессом и позволяют расширить представления об эволюции патогенных бактерий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Платонов А.Е., Миронов К.О., Яцышина СБ., Королева И.С., Платонова ОБ., Гущин А.Е., Шипулин ГА. Характеристика московских штаммов Haemophilus influenzae типа b методом мультилокусного секвенирования-типирования. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2003; № 2. С.21-25.

2. Платонов А.Е., Королева И.С., Миронов К.О. Эпидемиология менингококковой инфекции в России и мире на современном этапе. // Вакцинация. 2004; № 1: С.6-7.

3. Королева И.С., Демина А.А., Платонов А.Е., Белошицкий Г.В., Грачева

A.М, Спирихина Л.В., Закроева И.М., Миронов К.О., Быкова Р.Н. Эпидемиологический надзор за гнойными бактериальными менингитами: материалы 20-летних наблюдений. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2003; 5 (12): С.10-13.

4. Platonov A.E., Mironov K.O., Koroleva I.S., Chystyakova G.G. Disappearance of epidemic serogroup A subgroup III meningococci in Moscow 19982001 after the outbreak in 1996. // Abstracts of the 13th International Pathogenic Neisseria conference. Oslo. September 1-6,2002. D.A.Caugant, E.Wedege, eds. Oslo, Nordbeig Aksidenstrykkeri AS, 2002. P.389.

5. Платонов А.Е., Королева И.С., Платонова О.В., Самсонова И.М., Грачева A.M., Спирихина Л.В., Горелов А.В., Демина А.А., Семенова Л.И., Миронов К.О., Тютюнник Е.Н., Шипулин ГА, Чистякова Г.Г., Крючкова Г.В., Свистунова Т.С, Заикин В.Л., Соловьева Л.Я., Кувшинова М.И., Державина Г.И., Цешковский И.С., Тимина В.П., Кац Т.Г., Калинина М.В., Галеева Е.В., Курчавое В.А., Покровский В.И. Популяционное изучение заболеваемости, вызываемой Haemophilus influenzae типа b у детей до 5-летнего возраста в Москве. // Материалы VIII Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва, РОСИНЭКС, 2002; T.I, C.88-89.

6. Платонов А.Е., Миронов К.О., Яцышина СБ., Королева И.С, Платонова О.В., Гущин А.Е., Шипулин ГА, Feil E. Характеристика московских изолятов Haemophilus influenzae типа b методом мультилокусного секвенирования-типирования. // Материалы VIII Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва, РОСИНЭКС, 2002; Т.З,С312-313.

7. Платонов А.Е., Шипулин ГА, Карань Л.С, Миронов К.О., Королева И.С, Костюкова Н.Н., Платонова О.В., Тялина Ю.Ю., Яцышина СБ., Якименко

B.В., Краснова Е.М., Feil E., van der Ende A., Achtman M. Современные методы генотипирования как инструмент исследования реальных эпидемиологических проблем. // Российско-американский семинар "Экология инфекционных заболеваний". Новосибирск, ГНЦ ВБ "Вектор", 2002; С.31-32.

24 Р218 80

РНБ Русский фонд

2005-4 21738

ча о

в >-

8. Платонов А.Е., Миронов О.В., Тялина Ю.Ю., Гущин А.Е секвенирования-типирования для . Haemophilus influenzae типа b. практической конференции "Ген< Москва, 2002; С.234-236.

9. Миронов К.О., Шипулин 1 а Ю.Ю., Платонов А.Е. Характерист 2 1 /3 О х штаммов Neisseria meningitidis, из ы

Всероссийской научно-практичен.^,. __________,___________________.ка

инфекционных заболеваний" Москва, 2002; С.224-225.

10.Миронов К.О., Королева И.С., Шипулин Г.А., Платонов А.Е. Метод мультилокусного секвенирования-типирования для характеристики московской популяции бактерий вида Haemophilus influenzae типа b. // 5-я Всероссийская научно-практическая конференция "Генодиагностика инфекционных заболеваний". Москва, 2004; Т.Н. С.66-68.

11.Миронов К.О., Платонов А.Е., Королева И.С., Шипулин Г .А Применение секвенирования для характеристики субтипов московских штаммов бактерий вида N.meningitidis. // 5-я Всероссийская научно-практическая конференция "Генодиагностика инфекционных заболеваний". Москва, 2004; Т.Н. С.69-72.

12.Миронов К.О., Шипулин ГА., Родионова Е.Н., Мязин А.Е., Королева И.С., Шипулина О.Ю., Платонов А.Е. Применение гетеродуплексного анализа для субтипирования бактерий вида N.meningitidis. // 5-я Всероссийская научно-практическая конференция "Генодиагностика инфекционных заболеваний". Москва, 2004; Т.Н. С.72-74.

13.Миронов К.О., Королева И.С., Шипулин Г.А., Платонов А.Е. Характеристика московских штаммов бактерий вида N.meningitidis методом мультилокусного секвенирования-типирования. // 5-я Всероссийская научно-практическая конференция "Генодиагностика инфекционных заболеваний". Москва, 2004; Т.П. С.74-77.

14.Миронов К.О., Шипулин Г.А., Королева И.С., Платонов А.Е. Метод мультилокусного секвенирования-типирования и генетическое субтипирование для характеристики московских штаммов N.meningitidis. // 1-я Российская конференция "Актуальные проблемы менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов". Москва, 2004; С.34.

ГУ ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ, т. 100,2004 г.

2.1. Актуальность проблемы Бактерии Neisseria meningitidis и Haemophilus influenzae серотипа b (Hib) наряду с Streptococcus pneumoniae являются самыми частыми возбудителями гнойных бактериальных менингитов (ГБМ). Результаты наблюдения за этиологической структурой ГБМ с 1981 по 2002 г. в Москве показывают, что наиболее часто ГБМ вызываются бактериями вида N.meningitidis (64,5%), S.pneumoniae (21,6%) и Hib (8,3%), реже остальными возбудителями (5,6%) [4]. Качественная этиологическая структура возбудителей ГБМ на территории Москвы в последние годы не изменяется, в то время как количественное соотношение изолированных штаммов, принадлежащих разным возбудителям, может варьировать в зависимости от эпидемической ситуации с менингококковой инфекцией. Для эффективного эпидемиологического мониторинга ГБМ необходимы данные, позволяющие анализировать популяцию возбудителя [12]. С целью характеристики патогенных штаммов, принадлежащих одному виду (серотипу, серогруппе), применяется широкий спектр микробиологических, биохимических, серологических и молекулярнобиологических методов типирования. Для полноценного и всестороннего наблюдения позволяющий за эпидемическим процессом необходим штаммы в инструмент, популяциях выявлять гипервирулентные патогенных бактерий, отслеживать их распространение и закономерности эволюции. Данные об эволюции и закономерностях распространения патогенных бактерий наиболее информативны, если они получены с помощью методов, позволяющих напрямую измерять генетическую связь между штаммами и оценивать степень филогенетического родства возбудителей, изолированных от разных источников. Охарактеризовать генетические и филогенетические взаимоотношения между штаммами можно с помощью молекулярно-биологических подходов, объектом которых является геном бактерии. Адекватная оценка эволюционных изменений и взаимосвязей в популяции бактерий может быть осуществлена только методами, в основе которых лежит определение нуклеотидной последовательности бактериальной ДНК. Наиболее впечатляющие результаты по идентификации гипервирулентных штаммов (клональных комплексов) N.meningitidis и выявлению закономерностей их циркуляции были достигнуты с помощью метода мультилокусного секвенирования-типирования (МЛСТ) [64]. Метод МЛСТ был впервые применен в 1998 г. На протяжении последних лет МЛСТ активно внедряется в эпидемиологическую практику для типирования многих видов патогенных бактерий. Применение МЛСТ демонстрирует исключительную дискриминирующую способность, результаты МЛСТ часто согласуются с результатами типирования другими методами. МЛСТ имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с серологическими и некоторыми молекулярно-биологическими методами. Основным преимуществом МЛСТ является абсолютная сопоставимость результатов, полученных разными исследователями, а также возможность объединения результатов в глобальную базу данных (БД) с помощью интернета, что существенно облегчает работу эпидемиолога. Метод МЛСТ позволил значительно расширить представления о клональной структуре бактерий видов N.meningitidis и H.influenzae, сформулированные на основании результатов методами. Применение МЛСТ для N.meningitidis успешно зарекомендовало себя в ряде работ по характеристике и анализу локальных вспышек, эпидемий и пандемий менингококковой инфекции. Было выявлено типирования другими несколько гипервирулентных клональных комплексов и прослежены закономерности их распространения [19]. На сегодняшний день МЛСТ является популяции наиболее подходящим инструментом для характеристики за появлением штаммов N. Meningitidis, слежения (исчезновением) эпидемически значимых клональных комплексов и проведения глобального эпидемиологического анализа. Сотрудниками ГУ ЦНИИЭ, Института молекулярной генетики (Берлин), и университета Амстердама методом МЛСТ были проанализированы 103 штамма менингококков серогруппы А, выделенных в Москве в 1969-1996 гг., и показано совпадение эпидемического подъема в 1969-1975 гг. и вспышки менингококковой инфекции в 1996 г. с выявлением штаммов N.meningitidis, принадлежащих генетической субгруппе III [21]. На настоящий момент остается актуальным наблюдение за штаммами N.meningitidis серогруппы А и своевременное выявление штаммов, принадлежащих генетической субгруппе III. До настоящего времени не проводилось наблюдение за циркуляцией на территории Москвы гипервирулентных штаммов серогрупп С и W-135, не была проведена характеристика популяции штаммов серогруппы В, которые ответственны за большинство случаев менингококковой инфекции на территории Москвы. Схема МЛСТ для H.influenzae разработано недавно, результаты применения МЛСТ для H.influenzae демонстрируют возможность детальной характеристики штаммов, принадлежащих разным серотипам, и эпидемиологическую обоснованность применения данного подхода [66]. На сегодняшний день существует возможность сравнительной характеристики российских и зарубежных штаммов Hib. Проведенное в 1999-2001 гг. исследование "Эпидемиологический, на популяционной основе, надзор за Hib-менингитами у детей до 5-летнего возраста в Москве", впервые позволило достоверно определить заболеваемость Hib- менингитами, которая составила 5,7 случаев в год на 100000 детей до 5 лет [9]. Это ниже, чем в большинстве европейских стран (порядка 10-25 случаев на 100000 в аналогичной популяции) и существенно ниже, чем в странах американского континента (порядка 20-50 случаев на 100000) до введения вакцинопрофилактики особенностями [26, 81]. Данная ситуация может общей объясняться московской популяции, эпидемиологической ситуацией на территории или с господством на территории других, отличных штаммов Hib. Отсюда от европейских, менее необходимость вирулентных прояснения вытекает эпидемиологической ситуации с эпидемиологическими особенностями Hib-инфекции в Москве. Для ответа на вопрос о генетической связи российских и зарубежных штаммов целесообразно провести характеристику штаммов Hib методом МЛСТ. Принципиальным московской исследования является вопрос об антигенной структуре популяции субтипов штаммов N.meningitidis N.Meningitidis. серологическим Предыдущие методом не позволили в полной мере охарактеризовать антигенную структуру менингококков, распространенных на территории Москвы [3], по причине отсутствия у исследователей полного набора моноклональных антител и невозможности дифференцировать эпитопы одного семейства с помощью серосубтипирования. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов генома бактерии, кодирующих поверхностные антигенные детерминанты, позволяет избежать сложностей, связанных с типированием серологическим методом. Секвенирование дает возможность однозначно предсказать антигенную аминокислотную характеристику последовательность штамма за счет и расширить характеристики дополнительного эпитопа. Изучение антигенных свойств белков наружной мембраны менингококков может быть использовано в

9. Выводы

1. Отработаны методика проведения MJICT бактерий видов N.meningitidis и Hib, и схема субтипирования N.meningitidis. Проведено типирование московской популяции этих микроорганизмов.

2. Клональная структура московской популяции штаммов Hib аналогична структуре популяции штаммов Hib, циркулирующих за рубежом. Штаммы Hib, циркулирующие на территории Москвы с 1984 г. не претерпели существенных генетических изменений. Более низкая заболеваемость Hib-менингитом в Москве, по сравнению с странами Европы и Америки (до введения программ по вакцинопрофилактики), не связана с особенностями популяции возбудителя, циркулирующей на территории.

3. Штаммы N.meningitidis генетической субгруппы III в период 1997-2002 г. в Москве на встречались, что согласуется с данными о невысоком показателе заболеваемости в эти годы. Подъем заболеваемости в начале 2003 г., сопровождавшийся увеличением доли выделяемых штаммов N.meningitidis серогруппы А возможно связан с измененными штаммами генетической субгруппы X.

4. Популяции московских штаммов N.meningitidis серогрупп В и С отличаются от зарубежных. Имеет место интенсивный рекомбинационный процесс, приводящий к изменению в популяциях штаммов N.meningitidis серогрупп В и С; большинство эволюционных изменений происходит в пределах известных клональных комплексов (клонального комплекса СТ-18 и клонального комплекса СТ-41/44).

5. На территории Москвы не обнаружено штаммов, принадлежащих некоторым гипервирулентным клональным комплексам, выявленным за рубежом (клональные комплексы СТ-8 и СТ-32). Московские штаммы серогруппы W-135 не принадлежат эпидемически значимому клональному комплексу СТ-11.

6. Субтипирование штаммов N.meningitidis с помощью секвенирования имеет ряд существенных преимуществ перед серологическим методом, основными из которых являются: возможность типирования практически любого штамма и расширение представлений об антигенном разнообразии бактериальной популяции путем классификации субтипов внутри семейств и типирования вариабельного фрагмента VR3.

7. Методы характеристики бактериальных популяций с помощью MJ1CT и субтипирования обеспечивают проведение всестороннего наблюдения за эпидемическим процессом и позволяют расширить представления об эволюции патогенных бактерий.

8. Заключение

Среди всего разнообразия методов типирования бактерий на протяжении последних лет в мировую эпидемиологическую практику активно внедряется метод МЛСТ. На сегодняшний день метод МЛСТ является простым и удобным эпидемиологическим инструментом для характеристики бактериальных популяций. Благодаря многочисленным исследованиям некоторых видов патогенных бактерий было показано, что дискриминирующая способность метода МЛСТ обеспечивает проведение детальной характеристики штаммов внутри видоа (серотипа, серогруппы), которая позволяет понять особенности клональной структуры популяции возбудителя, идентифицировать эпидемически значимые штаммы (клональные комплексы) и выявить закономерности их эволюции и распространения. В то время как другие методы типирования могут быть недоступны из-за повышенных лабораторных требований или не обеспечивать стабильной межлабораторной воспроизводимости результатов, исследование методом МЛСТ может быть проведено во многих молекулярно-биологических лабораториях. Поскольку стоимость проведения МЛСТ постоянно снижается, можно надеяться на то, что он войдет в широкую эпидемиологическую практику.

В основе применения метода МЛСТ лежит секвенирование определенных фрагментов бактериального генома, кодирующих метаболические ферменты. Использование методики секвенирования обеспечивает ряд существенных преимуществ метода МЛСТ перед серологическими методами и некоторыми молекулярно-биологическими методами. Основными преимуществами метода МЛСТ являются абсолютная межлабораторная сопоставимость результатов и возможность объединения данных в общедоступные интернет-БД, что дает возможность для проведения эпидемиологического анализа на любой территории.

Нуклеотидные последовательности, полученные при проведении MJICT, могут быть использованы в дальнейшем для создания менее трудоемких методов скрининга популяций патогенных бактерий с целью выявления гипервирулентных штаммов.

Альтернативным подходом для типирования популяции патогенных бактерий является антигенная характеристика штаммов - субтипирование бактерий вида N.meningitidis. В то время как проведение MJICT направлено на выявление "внутренних" эволюционных закономерностей и характеристику клональной структуры вида (серотипа, серогруппы) бактерии, с целью наблюдения за эпидемически значимыми штаммами (клональными комплексами), субтипирование является дополнительным эпидемиологическим инструментом, позволяющим предсказывать иммунный ответ и выявлять особенности иммунитета разных групп населения. Проведенная на основании секвенирования антигенная характеристика популяции возбудителя обеспечивает необходимые данные при создании серологических и молекулярно-биологических тест-систем для характеристики штаммов, циркулирующих на конкретных территориях, а так же для разработки белковых и белково-полисахаридных вакцин.

В данной работе впервые в отечественной эпидемиологической практике применен метод MJICT. Показана эпидемиологическая обоснованность применения MJICT для характеристики московских штаммов и сравнения их с зарубежными на примере возбудителей ГБМ N.meningitidis и Hib. Проведена антигенная характеристика московских штаммов N.meningitidis на основании секвенировании фрагментов гена рог А, соответствующих поверхностным вариабельным петлям белка наружной мембраны 1 класса.

Интерес к типированию Hib обусловлен скудными и противоречивыми данными о распространенности и эпидемиологической значимости этой бактерии. После того, как в ходе выполнения исследования "Эпидемиологический, на популяционной основе, надзор за Hib-менингитами у детей до 5-летнего возраста в Москве" (1999-2001 гг.; ГУ ЦНИИЭ), впервые была достоверно определена заболеваемость Hib-менингитами [9], возникла необходимость прояснения эпидемиологической ситуации, поскольку, согласно результатам исследования, заболеваемость Hib-менингитами у детей до 5-летнего возраста в Москве оказалась ниже, чем в большинстве европейских и американских стран до введения вакцинопрофилактики.

До настоящей работы в мире была опубликована всего одна работа по характеристике бактерий вида Н. influenzae с помощью современной схемы MJ1CT [66], создана общедоступная интернет-БД по типированным штаммам. Интернет-БД для H.influenzae на завершающем этапе исследования (февраль 2004 г.) содержала 163 иностранных штамма, из них 57 штаммов принадлежали Hib, которым соответствовало 14 вариантов СТ.

При выполнении работы была отработана технология применения MJICT и проведено типирование штаммов Hib на материале, полученном от московских больных. Основная часть исследованных штаммов выделена от больных гнойным Hib-менингитом во время проведения популяционного исследования по оценке заболеваемости (1999-2001 гг.), также в работу было включено 2 изолята от больных из Екатеринбурга. С целью проведения ретроспективного анализа было исследовано 6 штаммов, изолированных на территории Москвы в 1984 г.

Результаты MJICT Hib показали, что все исследованные штаммы распределены по 10 СТ. Из десяти наблюдаемых СТ только один (СТ-6) выявлен ранее, остальные СТ описаны впервые. Большинство московских штаммов принадлежат СТ-6 (22, 45%), другие СТ наблюдаются значительно реже. При изучении взаимоотношений штаммов методом кластеризации BURST выяснилось, что подавляющее большинство исследованных штаммов входят в один клональный комплекс (клональный комплекс СТ-6), который объединяет 47 (96%) штаммов, распределенных по девяти СТ. Остальные штаммы (2, 4%) отличаются от штаммов клонального комплекса СТ-6 как минимум по 6 локусам. Результаты MJICT штаммов, изолированных в 1984 году, не позволили с уверенностью выделить преобладающий СТ, но поскольку большинство штаммов принадлежали тому же клональному комплексу (клональному комплексу СТ-6), было сделано предположение о том, что штаммы, циркулирующие на территории Москвы, с 1984 года не претерпели существенных генетических изменений. Отсутствие в 1984 году штаммов с СТ-6 и принадлежность трех (из шести) штаммов к СТ-79, позволяют предположить тенденцию к смене доминирующих СТ внутри одного клонального комплекса, у штаммов, изолированных в разные периоды времени на одной территории.

Анализ филогенетического родства типированных штаммов, проведенный на основании полученных нуклеотидных последовательностей и анализ по аминокислотной последовательности, в целом демонстрирует согласованность с результатами кластеризации данных MJICT и позволяет предположить, что штамм с СТ-95 является наиболее вероятным предком для штаммов с СТ-6, который в свою очередь является наиболее вероятным предшественником большинства остальных СТ клонального комплекса СТ-6. Филогенетический анализ указывает на то, что скорее всего большинство наблюдаемых СТ являются результатом дивергенции СТ-6, который возможно возник в результате рекомбинационного процесса от СТ-95.

Используя все имеющиеся на момент исследования данные о типированных штаммах H.influenzae, содержащиеся в интернет-БД, было проведено сравнение исследованных штаммов с зарубежными.

Выяснилось, что распределение российских штаммов Hib по клональным комплексам повторяет структуру клональных комплексов Hib, показанную при типировании выборки большего объема зарубежными коллегами [66]. Выделенному нами с помощью алгоритма BURST клональныму комплексу СТ-6 соответствует отмеченный иностранными авторами клональный комплексы А1/А2, 2 штаммам, не входящим в клональный комплекс СТ-6, соответствует клональный комплекс Bib. Клональные комплексы А1/А2 и Bib объединяют штаммы, принадлежащие только Hib, они заметно отделены от штаммов других серогрупп и бескапсульных штаммов. Несмотря на типичную для штаммов Hib клональную организацию, 9 из 10 СТ, выявленных у российских штаммов уникальны (не встречались ранее), что говорит об эпидемиологических особенностях штаммов Hib, циркулирующих в нашей стране, а также демонстрирует высокую дискриминирующую способность метода MJICT.

На основании сравнения московских штаммов с зарубежными можно заключить, что клональная структура штаммов Hib на протяжении последних десятилетий не изменяется. Более низкую заболеваемость Hib-менингитами в Москве вряд ли можно объяснить циркуляцией на территории Москвы отличных от европейских и американских, менее вирулентных штаммов Hib, поскольку большинство (48%) московских штаммов принадлежат СТ-6, так же обнаруженному у штаммов, изолированных в Европе и США. Невысокая заболеваемость Hib-менингитами на территории Москвы скорее всего, связана с социально-биологическими и эпидемиологическими особенностями московской популяции.

Преложенная в 1998 г. схема MJICT для N.meningitidis, на сегодняшний день является основным методом типирования для менингококков, а также используется для характеристики некоторых других представителей рода Neisseria. Интенсивное изучение менингококковой инфекции зарубежными исследователями позволило выделить несколько гипервирулентных клональных комплексов в популяции бактерий вида N.meningitidis и проследить закономерности их распространения. Объединение результатов типирования в общедоступную интернет-БД позволяет существенно облегчить работу по характеристике популяции штаммов, циркулирующих на отдельных территориях, и своевременно обнаружить присутствие неизвестных или уже описанных гипервирулентных штаммов. Использованная в данном исследовании интернет-БД на момент окончания исследования (февраль 2004 г.) содержала информацию о 4663 типированных изолятах бактерий вида N.meningitidis, которым соответствовало 3222 варианта СТ и среди которых было обозначено 25 клональных комплексов.

Наибольший эпидемиологический интерес представляет наблюдение за штаммами N.meningitidis серогруппы А, которые были причиной многих случаев эпидемического неблагополучия на территории России во второй половине XX века. Популяция московских штаммов N.meningitidis серогруппы А была исследована ранее зарубежными исследователями методом MJICT [21]. Исследование M.Achtman и соавт. продемонстрировало совпадение эпидемического подъема в 1969-1975 гг. и вспышки менингококковой инфекции в 1996 г. с выделением штаммов N.meningitidis, принадлежащих генетической субгруппе III. До настоящего исследования вопрос о циркуляции на территории Москвы штаммов этой генетической субгруппы после 1996 г. был открыт, MJICT московских штаммов других серогрупп так же не проводилось.

При выполнении работы нами исследовано 60 штаммов бактерий вида N.meningitidis, принадлежащих серогруппам А (28 штаммов), В (16), С (14) и W-135 (2). Результаты типирования методом MJICT позволили охарактеризовать московские штаммы и выделить особенности клональной организации в популяциях менингококков разных серогрупп.

На основании результатов запроса в интернет-БД был определен СТ у большинства штаммов N.meningitidis серогруппы А (18), в то время как большинство штаммов серогрупп В, С и W-135 имели не описанный ранее СТ. Тем не менее, для большинства штаммов всех исследованных серогрупп, за исключением штаммов серогруппы W-135, удалось определить принадлежность к известным клональным комплексам.

Виду повышенного эпидемиологического интереса к штаммам N.meningitidis серогруппы А, а также на основании детального изучения клональной организации штаммов этой серогруппы ранее, в данной работе клональные комплексы обозначались согласно M.Achtman и соавт. [21]. Было выяснено, что на территории Москвы после 1997 г. штаммы эпидемически значимой генетической субгруппы III до 2003 г. не встречались. Отсутствие штаммов генетической субгруппы III после 1997 г. согласуется с умеренными показателями заболеваемости, зафиксированными до конца 2002 гг. В межэпидемический период преимущественно изолировались штаммы, принадлежащие генетическим субгруппам VI и X. Появление штамма генетической субгруппы III в начале 2003 г. скорее всего является исключением, на что указывает источник штамма (штамм изолирован от гражданина Узбекистана). Напряженная эпидемическая ситуация с менингококковой инфекцией на территории Москвы в первой половине 2003 г. может быть связана со сменой преобладающей генетической субгруппы в 2002-2003 гг. В указанный период наблюдалось появление новых не описанных в интернет-БД СТ, преимущественно внутри генетической субгруппы X, и увеличение частоты их выделения, что является свидетельством эволюционных изменений штаммов серогруппы А. Не исключено, что подъем заболеваемости был обусловлен измененными штаммами генетической субгруппы X.

Среди исследованых штаммов N.meningitidis серогруппы В описанный в предыдущих исследованиях СТ был найден только у 4 штаммов, все они принадлежали СТ-18. До настоящего исследования, СТ-18 были обнаружены у трех штаммов, один из которых был выделен в России (1989 г.). Московская популяция штаммов N.meningitidis серогруппы В распределена по трем клональным комплексам, большинство штаммов (12, 75%) входят в клональный комплекс СТ-18. Для двух штаммов клональный комплекс не определен.

Московские штаммы N. meningitidis серогруппы С распределены по 2 клональным комплексам: 6 (43%) штаммов входят в клональный комплекс СТ-41/44 и 2 (7%) штамма входят в клональный комплекс СТ-18. Все исследованные штаммы этой серогруппы имели СТ, не выявленные ранее.

По результатам MJICT московских штаммов N.meningitidis, Можно судить о динамике московской популяции штаммов серогруппы В, изолированных на протяжении 1995-2002 гг.: практически все штаммы, изолированные до 2001 г. принадлежат клональному комплексу СТ-18, начиная с 2001 г. только 1 штамм из четырех входит в этот клональный комплекс. Два московских штамма N.meningitidis серогруппы В, изолированные в 1988 и 1989 гг., так же входят в клональный комплекс СТ-18. Появление штаммов, принадлежащих клональным комплексам СТ-11 и СТ-41/44 говорит о наблюдаемой смене доминирующего клонального комплекса в московской популяции штаммов N.meningitidis серогруппы В.

Присутствие в московской популяции штаммов серогруппы В штамма, входящего в клональный комплекс СТ-11, который содержит штаммы преимущественно серогруппы С, а также присутствие в московской популяции штаммов серогруппы С штаммов, входящих в клональный комплекс СТ-18 (1 штамм) и клональный комплекс СТ-41/44 (6 штаммов), которые содержат штаммы преимущественно серогруппы В, может рассматриваться как свидетельство горизонтального переноса генетической информации между представителями двух серогрупп. Также нельзя исключить, что эволюционные изменения московских штаммов серогрупп В и С связаны с рекомбинационными процессами между "московской" популяцией штаммов и штаммов, занесенных с других территорий.

На основании кластеризации аллельных профилей исследованных штаммов N.meningitidis серогрупп В и С методом BURST, было показано, что клональная структура московских штаммов серогрупп В и С различна. Среди 16 штаммов серогруппы В существует 5 групп штаммов (трем соответствуют известные клональные комплексы, для двух клональный комплекс не определен), 14 штаммов серогруппы С образуют 8 групп штаммов (2 и 6, соответственно). Можно сделать вывод о большей интенсивности рекомбинационных процессов в популяции штаммов серогруппы С, приводящих к более быстрому "размыванию" клональной структуры.

Скудность выборки штаммов серогруппы W-135 не позволяет с уверенностью говорить о динамике и уровне рекомбинационных процессов в популяции этих штаммов. Один из исследованных штаммов принадлежал СТ, выявленному ранее (США, 1994 г.), СТ другого штамма обнаружен впервые. Оба штамма не удается включить в какой-либо клональный комплекс.

Наличие в московских популяциях серогрупп В, С и W-135 штаммов с не определенным клональным комплексом может свидетельствовать с одной стороны, об особенностях московских штаммов по сравнению с зарубежными (в эпидемиологическом аспекте), с другой - об интенсивных рекомбинационных процессах, проходящих внутри одной серогруппы и между штаммами разных серогрупп (в биологическом аспекте).

На особенности московской популяции штаммов серогрупп В и С, указывает значительное количество впервые описанных СТ, не обнаруженных ранее на других территориях, в частности - Европе. Об уникальности московских штаммов говорит еще и тот факт, что у многих штаммов, встречаются ранее не выявленные аллели MJICT-локусов. Говоря об "уникальности" московской популяции штаммов, следует учитывать, что информация, представленная в интернет-БД, может быть неполной (данные о штаммах, циркулирующих в странах Восточной Европы и Средней Азии ограничены).

При типировании московских штаммов не было обнаружено представителей многих клональных комплексов, распространенных в странах Европы и Америки. В частности показано, что на территории Москвы не циркулируют штаммы принадлежащие гипервирулентным клональным комплексам СТ-8 (ST-8 complex/Cluster А4) и СТ-32 (ST-32 complex/ET-5 complex), только один московский штамм серогруппы В принадлежит клональному комплексу СТ-11. Среди штаммов серогруппы W-135, не было обнаружено представителей гипервирулентного клонального комплекса СТ-11, обеспечившего после хаджа мусульманских паломников в 2000 и 2001 гг. эпидемический подъем заболеваемости в странах Африки и экспорт инфекции на территорию Европы и Азии.

Для всех охарактеризованных методом МЛСТ московских штаммов N.meningitidis было проведено субтипирование на основании секвенирования фрагментов гена рог А. Применение секвенирования фрагментов гена рогА показало, что у изученной выборки московских штаммов N.meningitidis встречается 15 вариантов фрагмента VR1, 19 — фрагмента VR2 и 6 - фрагмента VR3. У одного штамма субтип определить не удалось, что, на наш взгляд, связано с отсутствием у этого штамма гена рог А.

Большинство штаммов серогруппы А (18, 64%) имеют субтип Р1.5-2,10,37-1. Штаммы с субтипом Р1.5-2,10,37-1 изолировались в Москве с 1998 в течение всего времени исследования, они распределены равномерно между генетическими субгруппами VI и X. Субтип Р 1.5,10,37-1 обнаружен у 3 (17%) штаммов; два штамма принадлежат СТ-68 (генетическая субгруппа VI), один - СТ-75 (генетическая субгруппа X). Все исследованные штаммы N.meningitidis серогруппы А, принадлежащие генетической субгруппе III, имели субтип Р 1.20,9,35-1

При сопоставлении результатов субтипирования с данными серотипирования московских штаммов, изолированных в 1983-1997 гг., был сделан вывод о том, что антигенная структура штаммов N.meningitidis серогруппы А, циркулирующих на территории Москвы не претерпела принципиальных изменений.

Популяции штаммов N.meningitidis серогрупп В и С отличаются широким полиморфизмом антигенной структуры, субтипирование штаммов данных серогрупп не позволяет выделить преобладающий субтип. Субтипы штаммов N.meningitidis серогруппы В, встречающиеся неоднократно, распределены следующим образом: субтип Р 1.5-1,2-2,36-2 обнаружен у 3 (19%) штаммов, субтип Р 1.18-1,3,38 - у 2 (12,5%); все штаммы входят в клональный комплекс СТ-18. У 2 (12,5%) штаммов, не входящих в клональный комплекс СТ-18, также наблюдается субтип Р1.5-1,10-1,36-2. Исследованные штаммы N.meningitidis серогруппы С распределены по субтипам похожим образом. Максимальное количество штаммов одного субтипа (4 штамма, 28,5%) имели субтип Р1.17,16-4,36 и принадлежали клональному комплексу СТ-41/44; субтип Р 1.18-1,34,38 найден у 3 (21%) штаммов, 2 из которых входят в клональный комплекс СТ-41/44, а для одного штамма клональный комплекс не определен.

Сопоставление результатов настоящего исследования с результатам серосубтипирования московских штаммов серогрупп В и С, изолированных в 1983-1997 гг. показывает, что охарактеризованные популяции штаммов этих серогрупп имеют такую же гетерогенную структуру. Распределение субтипов у штаммов серогрупп В и С свидетельствует о высоком уровне рекомбинационных процессов в этих популяциях, приводящих к большему фенотипическому разнообразию по сравнению с популяцией штаммов серогруппы А.

Для всех исследованных штаммов, за исключением штаммов генетической субгруппы III, не представляется возможным обозначить какую-либо связь субтипа и клонального комплекса.

Результаты субтипирования демонстрируют выраженную гомогенность штаммов N.meningitidis серогруппы А: из 28 штаммов N.meningitidis серогруппы А только 4 (14%) штамма имеют однократно встречающийся субтип, в то время как у штаммов серогрупп В и С, исследованных в меньшем количестве, однократно встречающиеся субтипы присутствуют более чем у половины штаммов: 7 (67%) и 8 (57%), соответственно. Основанная на субтиповой характеристике клональная структура популяций штаммов N. meningitidis трех серогрупп согласуется с результатами распределения наблюдаемых СТ, которые также демонстрируют гомогенность московской популяции штаммов N.meningitidis серогруппы А и гетерогенность популяций штаммов серогрупп В и С, в которых большинство штаммов имеют неповторимый СТ.

Результаты применения двух альтернативных методов типирования в полной мере позволили охарактеризовать московскую популяцию возбудителей ГБМ. На примере типирования N.meningitidis и Hib показано, что метод MJICT пригоден для характеристики бактериальных популяций и выявления эпидемически значимых штаммов (клональных комплексов). Также следует отметить, что проведение данной работы позволило дополнить и расширить представления о генетическом разнообразии и эволюционном потенциале популяций бактерий видов N.meningitidis и H.influenzae. Все результаты типирования и дополнительные данные о штаммах занесены в соответствующие интернет-БД и доступны для будущих исследований. Особенно следует отметить вклад в недавно созданную интернет-БД для H.influenzae, поскольку наши результаты существенно дополнили имеющиеся на момент исследования данные о штаммах, принадлежащих серотипу Ь.

Применение метода MJICT является удобным инструментом для осуществления всестороннего эпидемиологического надзора и наблюдения за эволюцией патогенных бактерий. Благодаря использованию методики секвенирования, существует возможность для прямой оценки генетических и филогенетических взаимосвязей между штаммами и проводить сравнение с штаммами, типированными другими исследователями. Применение секвенирования для субтипирования бактерий вида N.meningitidis продемонстрировало ряд существенных преимуществ перед серотипированием и позволило расширить представления об антигенной структуре московских штаммов N.meningitidis. Использование методов, основанных на секвенировании, позволяет проводить быстрый и удобный анализ результатов и объединять данные всех лабораторий, проводящих аналогичные исследования.

Применение метода MJICT и антигенной характеристики на основании секвенирования позволяет следить за эволюцией популяции возбудителя, своевременно выявлять наиболее опасные штаммы (клональные комплексы) и отслеживать закономерности их циркуляции, что необходимо для более полного и всестороннего эпидемиологического надзора за патогенными бактериями, циркулирующими на территории России.