Автореферат и диссертация по медицине (14.00.13) на тему:Метаболизм глутамата в крови больных рассеянным склерозом (клинико-биохимическое исследование)

На правах рукописи

5" ; ; *

1 » —• г •

7 п > з

.'. /- Н I ! I

Демакова Екатерина Витальевна

МЕТАБОЛИЗМ ГЛУТАМЛТА В КРОВИ БОЛЬНЫХ РАССЕЯННЫМ СКЛЕРОЗОМ (клинико-биохимическое исследование)

14.00.13 - нервные болезни

Автореферат диссертации на соискание учёной степени

кандидата медицинских наук

Пермь-2002

Работа выполнена в ГОУ ВПО "Пермская государственная медицинская академия МЗ РФ", лаборатории биохимии развития микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

Научные руководители:

- доктор медицинских наук, профессор А.А. Шутов

- кандидат медицинских наук, доцент В.П. Коробов

Официальные оппоненты:

- доктор медицинских наук, профессор В.В. Шестаков

- доктор биологических наук О.Н. Октябрьский

Ведущая организация:

Башкирский государственный медицинский университет

Защита состоится «3 » ОЛШЯ 2002 г. _часов на заседании

диссертационного совета Д 208.057.01 в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Пермская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской Федерации" (614000, г.Пермь, ул. Куйбышева, 39).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при ГОУ ВПО "ПГМА Минздрава России" (г. Пермь, ул. Коммунистическая, 26).

Автореферат разослан «gl~f~ »ф£Щ)0иЩ2002 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Л.Е. Леонова

/>¿2X Ю-Zá Ъ д

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Настоящая-работа представляет клтпппсо-биохимическое исследование рассеянного склероза (PC), актуальность которого определяется быстрым ростом и достаточно широким распространением заболевания [И.А. Завалишин с соавт., 2001; H.J. Baucer, 1987]. В настоящее время в мире насчитывается около 2,5 миллионов больных PC, в том числе в России -не менее 150 тыс. человек [И.А. Завалишин, A.B. Переседова, 2001]. Фундаментальные исследования в облаете нейробиохимии, молекулярной биологии, генетики и иммунологии позволили достигнуть значительного прогресса в понимании механизмов развития PC. На сегодняшний день доказано, что PC является мультифакторным аутоиммунным заболеванием [А.Н. Бойко, 1995; T.JI. Демина, Е.И. Гусев, 1997; И.А. Завалишин с соавт., 1996; M.Storch, 1997; C.S. Raine, 1991], хотя до сих пор не решен вопрос о первичности поражения нервной и иммунной систем [В.П. Бархатова с соавт., 2001; М. Storch, 1997]. С одной стороны, эти системы имеют высокую степень автономности, а с другой - характеризуются тесными и сложными двусторонними взаимодействиями, в основе которых находятся биохимические процессы [В.П. Бархатова с соавт.,1998, 2001]. Установлено, что при PC имеет место патология нейрональной трансмиссии, обусловленная, главным образом, глутаматом и его нейроакгив-ными метаболитами, с развитием эксайтотоксических механизмов повреждения нейрональных структур, реакций окислительного стресса, индукцией активаторов патологического апоптоза и клеточной гибели [И.А. Завалишин, 1996; М.Н. Захарова, 1997; P. Dowling, 1997]. Возможно, что эти процессы, участвуя в разрушении миелина и аксональной дегенерации [MF. Beal, 1996], способствуют прогрессированию демиелинизирующего процесса, определяют тип течения болезни и формирование неврологического дефицита. Комплексное исследование метаболических превращений глутамата при рассеянном склерозе позволит расширить представления о патогенезе, улучшить диагностику заболевания, особенно на ранних стадиях его развития, а также обосновать патогенетические принципы комплексной нейрометаболической терапии.

Целью настоящей работы явилось изучение патогенетической и клинической значимости метаболических превращений возбуждающего нейротранс-миттера глутамата в сыворотке крови больных рассеянным склерозом. Для ее достижения поставлены следующие основные задачи:

1. Исследовать содержание аминокислот - глутаминовой кислоты, ГАМК и глутамина в сыворотке крови больных РС.

2. Изучить активность ферментов путей метаболизма глутамата — глутамат-дегидрогеназы, глутаматдекарбоксилазы и глутаминсинтетазы в сыворотке крови больных РС.

3. Дате анализ клинико-биохимических взаимоотношений изученных показателей со стадией, клинической формой, типом течения и другими характеристиками демиелинизирующего заболевания.

4. Представить патогенетическое обоснование нейрометаболической терапии рассеянного склероза.

Научная новизна исследования. Впервые проведено комплексное исследование содержания нейротрансмиггерных аминокислот и активности ферментов цикла глутаминовой кислоты в сыворотке крови больных РС, способствующее получению более полной информации о метаболических изменениях, происходящих при развитии демиелинизирующего процесса. Выявлены существенные изменения обмена глутамата в виде повышения уровня глутамина и снижения концентрации ГАМК, а также снижения активности ферментов -глутаматдегидрогеназы и глутаматдекарбоксилазы в сыворотке крови больных РС. Установлено, что характер биохимических нарушений коррелирует со стадией РС, типом течения патологического процесса и степенью выраженности неврологического дефицита. Нарушения обмена глутамата отмечаются уже в дебюте заболевания и остаются неизменными на всем протяжении болезни, в том числе, и в стадии ремиссии.

Практическая значимость работы. Выявлены существенные изменения метаболизма возбуждающего нейротрансмитгера глутамата в сыворотке крови больных РС уже на ранних этапах заболевания. Показано, что характер этих

изменений обусловлен стадией, клинической формой и продолжительностью

рассеянного склероза. Констатация характера нарушения метаболизма глутама-________

..та способствует более объективной оценке тяжести заболевания и может оказаться полезной в прогнозировании типа его течения. Результаты настоящего комплексного исследования обосновывают целесообразность включения в терапевтический комплекс больных РС препаратов, обладающих антиоксидант-ным, антиапоптотическим и нейротрофическим действиями, позитивно влияющих на основополагающие звенья патобиохимических нарушений в развитии демиелинизирующего заболевания.

Внедрение результатов. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ. Основные положения диссертации внедрены в практическую работу клиники неврологии Пермской областной клинической больницы и неврологического отделения клинической МСЧ №4 г. Перми. Теоретические положения работы используются в лекционных курсах и практических занятиях, проводимых на кафедре неврологии лечебного факультета ГОУ ВПО "11ГМА Минздрава России" со студентами, врачами-интернами и клиническими ординаторами, и кафедре неврологии факультета постдипломного образования ГОУ ВПО "ПГМА Минздрава России".

Положения, выносимые на защиту:

1. Нарушения обмена возбуждающего нейротрансмиттера глутамата являются одним из основных звеньев патогенеза демиелинизирующего процесса при РС.

2. У больных РС наблюдаются разнонаправленные изменения содержания нейроактивных аминокислот в сыворотке крови - глутамина и у-аминомас-ляной кислоты, а также ферментов цикла глутамата - глутаматдегидроге-назы и глутаматдекарбоксилазы, глубина которых сопряжена с тяжестью заболевания и является маркером клинической формы, характера течения и прогрессирования демиелинизирующего процесса.

3. Патогенетически обосновано использование препаратов нейрометаболи-ческой направленности в комплексе лечебных мероприятий РС.

Структура н объем диссертации. Диссертация изложена на 151 страницах машинописного текста и состоит из введения, глав обзора литературы, материалов и методов исследования, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Библиография содержит 117 работ отечественных и 168 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 27 рисунками, 17 таблицами и 12 клиническими наблюдениями.

Апробация. Основные положения диссертации отражены в докладах на заседаниях неврологической секции в рамках научной сессии ГОУ ВПО "ПГМА МЗ РФ" (2000, 2001); научной конференции молодых ученых, студентов и аспирантов «Молодежная наука Прикамья - 2000» (Пермь, 2000); Пятой областной научно-практической конференции «Молодые ученые 2000 - Пермскому здравоохранению» (2000); областной научно-практической конференции «Молодые ученые Западного Урала - здравоохранению 2002» (Пермь, 2002); научно-практической конференции неврологов (Пермь, 2002); совместном заседании кафедр неврологии лечебного и педиатрического факультетов, кафедры неврологии постдапломного образования ГОУ ВПО "ПГМА МЗ РФ" (2002).

Исследование выполнялось на базе кафедры и клиники неврологии (заведующий кафедрой - доктор медицинских наук, профессор А.А. Шутов) ГОУ ВПО "Пермская государственная медицинская академия МЗ РФ" (ректор - академик РАЕН, профессор В.А. Черкасов) и лаборатории биохимии развития микроорганизмов (заведующий лабораторией - кандидат медицинских наук, доцент В.П. Коробов) Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (директор - академик РАН, профессор В. А. Черешнев).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика собственных наблюдений. Основная группа наблюдений представлена 51 больным с клинически достоверным диагнозом РС. Во всех случаях диагноз был установлен на основании клинических характеристик заболевания и детализирован клиническими диагностическими критериями О.МасА1рте [1972]. У части больных он подтвержден данными магнитно-резо-

нансной томографии и иммупофармакологаческими тестами на РС. Возраст

больных РС варьировал от 18 до 57 лет и составил в среднем 35,6 лет. Возраст----------

ная группа до 25 лет состояла из 11 (22%) человек, в возрасте от 26 до 45 лет было 27 (53%) и старше 46 лет — 13 (25%) больных. По половому составу преобладали женщины, их было 34 (67%), мужчин - 17 (33%). У 35 (69%) больных имела место церебро-сгогаальная форма заболевания, у 13 (25%) - церебральная и у 3 (6%) - спинальная. В дебюте заболевания (в период первой экзацербации) обследовано 6 (12%) человек, в стадии ремиссии, в том числе, относительной или неполной - 9 (18%), в стадии клинической экзацербации - 18 (35%) больных.

Среди 27 больных с ремиттирующим течением РС у 2 (7%) отмечалось одно обострение в 3 года, у 7 (26%) - одна экзацербация в год и у 18 (67%) больных - более двух обострений в год. Прогрессирующее течение заболевания наблюдалось у 18 (35%) больных, 15 из них имели вторично-прогредиентный тип течения болезни. У 3 (6%) человек заболевание с самого начала неуклонно прогрессировало (первично-прогрессирующее течение). При прогрессировании патологического процесса у 11 (61%) из 18 больных клиническое ухудшение уже на фоне стойкого неврологического дефицита происходило 2 и более раз в год, продолжаясь от 3-4 недель до 4 месяцев. Выраженность неврологического дефицита (по шкалам РБ .Г.Кийгке) варьировала от 1 до 19 баллов и равнялась 13,2±0,43 балла. Степень тяжести состояния больных РС оценивалась от 1 до 9,5 баллов (4,6±0,23). При этом 9 (18%) больных имели легкую степень тяжести заболевания (при ремитгаругощем течении); 11 (21%) - умеренную (из них - 4 больных с вторично-прогрессирующим течением) и 31 (61%) - тяжелую степень (из них 11-е вторично-прогрессирующим течением РС). Период заболевания к моменту обследования составил от 3 недель до 21 (в среднем -7,6) года.

В дебюте РС было обследовано 6 (12%) больных; с продолжительностью заболевания до 5 лет - 18 (35%), от 6 до 10 лет - 9 (18%). Продолжительность заболевания 11-20 лет имела место у 14 (27%) и более 20 лет - у 4 (8%) обсле-

дованных. Период от начала заболевания до установления настоящего диагноза был в пределах от 2 недель до 15 (в среднем 3,1) лет.

Группу лабораторного контроля составил 21 практически здоровый человек - 11 (52%) женщин и 10 (48%) мужчин. Среди них было 6 (29%) человек в возрасте до 25 лет, 11 (52%) - 26г45 лет и 4 (19%) - старше 46 лет (средний возраст-32,6 года).

Настоящая работа представляет собой клинико-биохимическое исследование. Основная научная информация получена с применением биохимических методов.

Биохимические исследования включали определение концентраций аминокислот - глутамата (Глу), глутамина (Глн) и ГАМК, а также активности ферментов - глутаматдешдрогеназы (ГлуДГ), глутаматдекарбоксилазы (ГлуДК) и глутаминсинтетазы (ГлнС-зы) в сыворотке крови у 51 больного PC и 21 здорового человека (группа контроля).

Использовали методы спектрофотометрического определения содержания аминокислот, а также активностей глутаминсинтетазы, глутаматдегидрогеназы и глутаматдекарбоксилазы [В. Nathan, G. Bao, 1994] в одном образце сыворотки крови с применением тонкослойной восходящей хроматографии для выделения продуктов ферментативных реакций. Так, определение глутамата и глутамина в сыворотке крови проводилось спектрофотометрическим методом с глутамина-зой и глутаматдегидрогеназой с помощью набора реактивов - Glutamate/ Glutamine détermination kit (SIGMA-ALDRICH, Germany) [H.U. Bergmeyer, 1989]. Для количественного определения ГАМК использовали метод восходящей тонкослойной хроматографии на пластинах "Sorbfil" (ООО "Машиностроитель", г. Краснодар). Сыворотку крови обрабатывали по методу Т.С. Пас-хиной, 1964. Исследования выполнялись самостоятельно под контролем старшего научного сотрудника, кандидата медицинских наук Л.М. Лемкиной.

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с помощью программ "Microsoft Excel -1997" и "Statistica v. 5.5А" методом непараметрической статистики по критериям Wald-Wolfowitz (WW), Mann-Whitney (MW)

и КоЬпс^огоу-Зпшпоу (КБ). Для анализа различий между двумя группами по качественным показателям применяли дисперсионный анализ с расчетом точного критерия Фишера (Б). Все статистические тесты интерпретировались в 5% интервале значений.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При обследовании установлено, что содержание глутамата в сыворотке крови здоровых лиц составило 38,4±2,90 м к моль/л, соответственно, активность фермента глутаматдегидрогеназы равнялась 2,4±0,27 МЕ. Концентрация глута-мшш составила 83,б±4,66 мкмоль/л, активность глутаминсинтетазы -0,1±0,01 мкмоль/мг-мин. Содержание ГАМК - 436,3±19,70 мкмоль/л, ферментативная активность глутаматдекарбоксилазы - 0,6±0,06 мкмоль/мг-мин. Полученные значения в целом сопоставимы с результатами, имеющимися в литературе [З.Н. Алиев, 2000; А.В. Коваленко, 1999; Т.В. Мишунина, 1990], и использовались в нашем исследовании в качестве показателей нормы.

Установлено, что концентрация глутамата в сыворотке крови больных РС составляла 39,2±1,75 мкмоль/л, активность глутаматдегидрогеназы равнялась 1,7±0,20 МЕ. Содержание глутамина в сыворотке крови больных определялось в пределах 148,2±5,27 мкмоль/л, активность глутаминсинтетазы равнялась 0,1±0,01 мкмоль/мг-мин. Концентрация ГАМК составила 239,9±11,27 мкмоль/л, активность глутаматдекарбоксилазы - 0,3±0,02 мкмоль/мг-мин.

Сравнительный анализ показателей обмена глутамата в сыворотке крови группы больных РС и контрольной группы (табл. 1) выявил существенно (рк5<0,001) более высокий уровень глутамина в сыворотке крови больных (148,1±5,27 мкмоль/л) по сравнению с соответствующим показателем у здоровых лиц (83,6±4,66 мкмоль/л). В то же время, активность глутаминсинтетазы в группе больных, равная 0,1±0,01 мкмоль/мг-мин, не отличалась (р>0,05) от контроля (0,1±0,01 мкмоль/мг-мин) и не изменялась в зависимости от клинических проявлений РС. Содержание ГАМК в сыворотке крови больных РС равнялось 239,9±11,27 мкмоль/л и было достоверно (рь<0,001) ниже данных контрольной

группы - 436,3±19,70 мкмоль/л. Также наблюдалось значительное ^<0,001) снижение ферментативной активности глугаматдекарбоксилазы у больных РС (0,3±0,02 мкмоль/мгмин) по сравнению со значением здоровых лиц (0,6±0,06 мкмоль/мгмин). Уровень глутамата в сьшоротке крови больных (39,2±1,75 мкмоль/л) не отличался (р>0,05) от содержания медиатора у здоровых лиц (3 8,4±2,90 мкмоль/л), однако, активность глутаматдегидрогеназы у больных РС (1,7±0,20 МЕ) была статистически ниже (ркз<0,05) активности фермента в фуппе контроля - 2,4±0,27 МЕ.

Таблица 1

Содержание аминокислот и активность ферментов цикла глутаминовой кислоты в сыворотке крови больных РС и здоровых лиц

Группы П Глу мкмоль/л ГлуДГ МЕ Глн мкмоль/л ГлнС-за мкмоль/мгмин ГАМК мкмоль/л ГлуДК мкмоль/мгмин

Больные 51 39,2±1,75 1,7±0,20 148,2±5,27 0,1±0,01 239,Ш1,27 0,3±0,02

Здоровые 21 38,4±2,90 2,4±0,27 83,б±4,66 0,1±0,01 436,3± 19,70 0,6±0,06

Pww Pmw Pits >0,05 <0,05 <0,05 <0,001 <0,001 <0,001 >0,05 <0,001 <0,001 <0,001 < 0,001 <0,001 <0,001

Примечание: р«™ - достоверность различий содержания аминокислот и активности ферментов по критерию Wald-Wolfowitz Prow - по критерию Mann-Whitney pks - по критерию Kolmogorov-Smimov

Исследование метаболических превращений основного возбуждающего нейротрансмиттера в крови больных РС позволяет лишь косвенно судить о нарушениях церебрального метаболизма нейротрансмиттеров и механизмах повреждения нейрональных систем при демиелшшзирующем процессе. Тем не менее, они могут отражать характер изменений метаболических процессов в мозге, свидетельствуя о степени нарушений синтеза, транспорта, утилизации нейротрансмиггерных аминокислот, состояния энергетического обмена и гема-то-энцефалического барьера при различных клинических проявлениях заболе-

вания. Необходимо отметить, что у обследованных больных РС (по данным историй болезни) активность аминотрансфераз сыворотки крови./ такж>Гучаст-вукицих в обмене глутамата, существенно не отличалась от их активности \ здоровых лиц.

Изменений биохимических показателей в зависимости от половозрастных признаков больных РС не выявлено (р>0.05). они полностью определялись клиническими характеристиками заболевания.

С позиций оценки содержания изучаемых аминокислот и активности ферментов у больных в зависимости от стадии РС наиболее показательным является изменение содержания глутамина в сыворотке крови больных. Концентрации глутамата, а также ГАМК и метаболическая активность глутаматдегидро-геназы и глутаматдекарбоксилазы в различные стадии заболевания достоверно не изменялись (р > 0,05), но во всех стадиях болезни существенно отличались от показателей группы контроля (рис. 1 и 2).

Уже в дебюте заболевания содержание глутамина в сыворотке крови больных (114.3i4.97 мкмоль/л) существенно (ркч<0.01) отличалось в сторону повышения от уровня здоровых лиц (83,6±4,66 мкмоль/л). Концентрация глуимина в сыворотке крови больных, обследованных в стадии ремиссии (130,5±13,83 мкмоль/л), оставалась на его уровне в дебюте заболевания, что определяет демиелинизацию как перманентный процесс. В стадии обострения о<-мечен самый высокий уровень глутамина (157,6±6,71 мкмоль/л).

Концентрация глутамата в стадии дебюта (34,8±5,02 мкмоль/л) и окзацер-бации заболевания (40,3±3,60 мкмоль/л) оставалась на уровне показателей контроля (р>0,05). И только у больных в стадии ремиссии РС содержание этого нейротрансмиттера (32,2±2,90 мкмоль/л) было снижено (рт<0,05) по сравнению с контрольным значением (38,4±2,90 мкмоль/л).

Содержание ГАМК в сыворотке крови больных, обследованных как в дебюте заболевания (218,4±42,17 мкмоль/л; рк5<0,01), гак и в периодах ремиссии (223,8±23,85 мкмоль/л; рь<0,001) и экзацербации демиелинизирующего процесса (246,9± 19,09 мкмоль/л; рь<0,001), было значительно ниже концентрации ГАМК в сыворотке крови здоровых лиц (436,3±19,70 мкмоль/л), и в течение заболевания уровень ее не подвергался существенным изменениям.

мкмоль/л

Контроль Дебют Ремиссия Экзацербация

С - Глу _ © Гян__В ГАМК

Рис. I Содержание глутамата, глутамина и ГАМК в сыворотке крови больных в разные клинические периоды РС * - достоверность различий величин (на данном и других рисунках)

мкмоль/мг-мин

3,---------

МЕ

з

Контроль Дебют Ремиссия Экзацербация

ГлнС-за В ГлуДК

ГлуДГ

Рис. 2 Активность глутаматдегидрогеназы, глутаматдекарбо-ксилазы и глутаминсинтетазы в сыворотке крови больных в разные клинические периоды РС

Активность глутаматдегидрогеназы у больных РС была сопоставимо ниже (Рк5<0,05) показателя активности в группе контроля (2,4±0,27 МЕ) только в стадии ремиссии заболевания (1,6±0,39 МЕ) и в течение заболевания, в том числе, и в периоде экзацербации, существенно не изменялась (р>0,05).

Активность глутаматдекарбоксилазы у больных РС во всех клинических стадиях болезни была также ниже (рк5<0,001), чем показатель активности фермента в сыворотке крови здоровых лиц (0,6±0,06 мкмоль/мгмин).

Установлено, что концентрация глутамина в сыворотке крови достоверно повышена (относительно контроля) при всех клинических формах РС (рис.3). При этом наименьшее повышение глутамина имело место у больных с церебральной формой заболевания - 122,2±9,70 мкмоль/л. Оно было ниже его содержания у больных как церебро-спинальной (154,4 ± 5,49 мкмоль/л; р„т, < 0,01), так и спинальной (188,4±29,29 мкмоль/л; рч„<0,05) формами РС. Высокие концентрации глутамина в сыворотке крови больных церебро-спинальной и спинальной формами РС достоверно не отличались (р>0,05).

Глутамин (мкмоль/л) 200 160 120 80 40 0

Церебральная

Церебро-спинальная

гг

*

Сшшальная

*

0 100 200 300 400 500 ГАМК (мкмоль/л)

Г, Контроль

О Больные

Рис. 3 Уровни глутамина и у-аминомасляной кислоты в сыворотке крови больных при разных клинических формах РС

Содержание ГАМК (рис. 3) и активность глутаматдекарбоксилазы (рис. 4) были существенно ниже концентрации этого тормозного медиатора и активности фермента в группе контроля также при всех клинических формах РС и достоверно не изменялись (р>0,05) в зависимости от формы заболевания. Уровень тормозной аминокислоты в сыворотке крови больных спинальной формой РС хотя и был наивысшим (295,9±52,20 мкмоль/л), но также был значимо (рмл<0,05) ниже контрольного показателя. Активность глутаматдекарбоксилазы у больных церебральной формой была наиболее снижена, составила 0,2±0,03 мкмоль/мг-мин и отличалась (рмчч<0,05) от показателя активности фермента при церебро-спинальной (0,3±0,03 мкмоль/мгмин) и спинальной (0,3±0,07 мкмоль/мг-мин) формах заболевания.

Церебральная 1

Спинальная *-^ Церебро-спнпальная

ГлуДК (мкмоль/мг-мин)

0 Контроль □ Формы РС

Рис. 4 Активность глутаматдекарбоксилазы в сыворотке крови больных при разных клинических формах РС

Уровень глутамата в сыворотке крови больных с различными клиническими формами РС достоверно не отличался (р>0,05) от концентрации нейроме-диатора в контроле (38,4±2,90 мкмоль/л), хотя у больных с церебральной формой (33,1±3,02 мкмоль/л) он был ниже (рши<0,05) соответствующего показателя при церебро-спинальной форме заболевания (42,0±2,11 мкмоль/л).

Ферментативная активность глутаматдегидрогеназы (рис. 5) также достоверно не изменялась (р>0,05) в зависимости от клинической формы демиелини-зируюшего заболевания, но активность фермента у больных церебральном (1,8±0,32 МЕ) и церебро-спинальной (1,7±0,25 МЕ) формами достоверно отличалась (рк5 < 0,05) от показателя здоровых лиц (2,4±0,27 МЕ).

Церебральная

Рис. 5 Активность глутаматдегидрогеназы в сыворотке крови больных при разных клинических формах РС

Как показали наши исследования, показатели метаболизма глутамата изменялись в зависимости от продолжительности заболевания. Установлена тенденция к повышению концентрации глутамина у длительно (более 10 лет) болеющих (159,9±8,62 мкмоль/л), однако, уже у больных с малой (дебют РС) продолжительностью болезни содержание глутамина (114,3±4,97мкмоль/л) существенно отличалось (рь<0,01) от уровня этой аминокислоты у здоровых лиц. Содержание глутамина у больных, страдающих РС более 20 лет, не имело жесткой зависимости от продолжительности демиелинизируюшего процесса, хотя и отличалось (рга„<0,05) от показателя в группе контроля.

Уровень ГАМК в зависимости от продолжительности РС достоверно не изменялся (р>0,05), но был существенно снижен (рк5<0,01) относительно пока-

зателя здоровых лиц.

Активность глутаматдекарбоксилазы в сыворотке крови больных уже в период первой экзацербации РС (0,2±0,02 мкмоль/мг-мин) была ниже (рк5<0,01) активности фермента у здоровых лиц (0,6±0,06 мкмоль/мг-мин) и не изменялась при дальнейшем прогрессировании заболевания (р>0,05).

Достоверных изменений активности глутаматдегидрогеназы в зависимости от длительности процесса не установлено (р>0,05), однако, наблюдается снижение активности фермента у больных с продолжительностью заболевания от 2 до 5 лет (1,5±0,25 МЕ; рт„<0,05) и от 6 до 10 лет (1,2±0,25 МЕ; рт„<0,05) по сравнению со здоровыми лицами (2,4±0,27 МЕ).

Уровень глутаминовой кислоты в сыворотке крови больных РС в зависимости от длительности заболевания достоверно не изменялся (р>0,05).

Анализ полученных данных у больных с различной степенью тяжести РС, основанной на выраженности неврологического дефицита по шкалам ИСиПгке, выявил разнонаправленные изменения содержания возбуждающей аминокислоты глутамата в зависимости от тяжести болезни (табл. 2). Так, установлен более низкий (рк5<0,05) уровень концентрации глутамата (28,6±3,03 мкмоль/л) у больных с легкой степенью тяжести заболевания по сравнению с умеренной (41,1 ±1,97 мкмоль/л) и тяжелой (42,7±4,56 мкмоль/л) степенями тяжести рассеянного склероза, а также с показателем здоровых лиц (38,4±2,90 мкмоль/л). Концентрация глутаминовой кислоты у больных с тяжелой степенью заболевания практически не отличалась (р>0,05) от больных с умеренной степенью тяжести, но достоверно превышала (рт,<0,05) показатель здоровых лиц (38,4±2,90 мкмоль/л). Несмотря на то, что статистически значимых различий содержания глутамата у больных с легкой и умеренной степенями тяжести РС, а также умеренной и тяжелой не отмечено (р>0,05), наблюдается определенная тенденция к повышению его уровня с ростом степени неврологического дефицита.

Кроме того, содержание глутамина (табл. 2) было достоверно выше его

концентрации у здоровых лиц (83,6±4,66 мкмоль/л) как при легкой степени тяжести (рк5<0,01), так и при умеренной и тяжелой (рк5<0,001) степенях выраженности неврологического дефицита.

Таблица 2

Уровень аминокислот и активность ферментов цикла глутаминовой

кислоты в сыворотке крови больных РС в зависимости от тяжести патологического процесса

Степень тяжести 11 Глу МКМОЛЬ'Л ГлуДГ МЕ Глн МКМОЛЬ/Л ГлнС-за мкмоль/мг мин ГАМК мкмоль/л ■ ^ ГлуДК МКМ0.1ь.'М1 мин

Легкая 9 28.6±3.03 2,2+0,48 129,0+14,41 0,1+0,02 239,9+33,67 0,2+0,03

Ры <0,05 <0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05

Умеренная 11 41,1+1,97 1.1±0,09 148,0+11.02 0,09+0,01 206.3+21,52 0,2+0.03

Ркй >0,05 >0,05 >0,05 >0.05 >0.05 >0.05

1 яжелая 42,7+4.56 1.9x0,30 153.8=6.40 0,1+0,01 25i.9t-13.70 о.з^и.и:

РК53 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0.05 ■> 0,05 - о.и5

Контроль 21 38.4+2.90 2.4+0,27 83.6-4.66 0, U0.il 1 436.3х!9.7и 0.ь-| >М'о

Примечание: [\ь - достоверность различий содержания аминокислот и активности ферментов у больных РС по критерию К.о1тоцого\-5ггпгпо\'

ры - легкой и умеренной степенью тяжести;

Рь; - умеренной и тяжелой;

р^з - легкой и тяжелой.

Установлено, что концентрация ГАМК и активность глутаматдекарбокси-лазы (табл.2, рис.6) были существенно снижены (рк5<0,001) относительно группы контроля независимо от степени тяжести РС.

Наибольшее снижение (рк5<0,01) активности глутаматдегидрогеназы в сыворотке крови (рис. 6) наблюдается у больных РС с умеренной степенью выраженности неврологического дефицита (1,1±0,09МЕ) по сравнению с легкой степенью тяжести заболевания (2,2±0,48 МЕ; рк5<0,05) и здоровыми лицами (2,4±0,27 МЕ). .

- -- - I л

Тяжелая ГлнС-за

Рис. 6 Активность глутаматдегидрогеназы, глутаматдекарбоксилазы и глутаминсинтетазы в сыворотке крови больных РС с разными степенями тяжести заболевания

Анализ показателей метаболизма глутамата в зависимости от типа течения РС (табл. 3) выявил, что достоверных различий в изучаемых показателях в делом по группам больных с ремиттирующим и прогредиентным течением болезни не наблюдается (р>0,05).

Таблица 3

Содержание аминокислот и активность ферментов в сыворотке крови больных в зависимости от типа течения РС

Течение п Глу мшоль'л ГлуДГ МЕ Глн мкмоль/л ГлнС-за мкмолк/мгм.ин ГАМК мкмоль/л ГлуДК мкмоль'м! мин

Ремитти-рующее 27 37,9±2,58 1,8±0,29 151.0±7,36 0,1 ±0,01 244,2±15,97 0,3=0,02

Прогрессирующее 18 42,8±2,54 1,5±0,24 155,3±8,84 0,1 ±0,01 240,7± 16,98 0,3±0,03

Контроль 21 38,4±2,90 2,4±0,27 83,6±4,66 0,1±0,01 436,3±19,70 0,6±0,06

При ремиттирующем течении заболевания уровень глутамата (37,9±2,58 мкмоль/л) не отличался (р>0,05) от соответствующего показателя здоровых лиц (38,4±2,90 мкмоль/л). Хотя самая низкая концентрация глутами-

новой кислоты в сыворотке крови наблюдалась в ремиссии (32,2±2,90 мкмоль/л) и достоверно отличалась (рдау<0,01) как от содержания аминокислоты в контрольной группе, так и при прогрсссировании заболевания (42,8±2,54 мкмоль/л; рь<0,05) (табл. 3).

Уровень глутамина при ремиттирующем (150,9±7,36 мкмоль/л) и прогрессирующем (155,3±8,84 мкмоль/л) течениях заболевания превышал (рь<0,001) соответствующий показатель здоровых лиц (83,6±4,66 мкмоль/л).

Концентрации ГАМК и активность глутаматдекарбоксилазы в сыворотке крови больных с ремитгиругощим (соответственно 244,2±15,97 мкмоль/л и 0,3±0,02 мкмоль/мг-мин) и прогредиентным течением РС (240,8±16,98 мкмоль/л и 0,3±0,02 мкмоль/мг-мин) одинаково снижены (рь<0,001) относительно показателей контроля (436,3±19,70 мкмоль/л и 0,61±0,06 мкмоль/мг-мин).

При ремиттирующем течении заболевания ферментативная активность глутаматдегидрогепазы составила 1,8±0,29 МЕ и существенно не отличалась (р > 0,05) от активности фермента у здоровых лиц (2,4±0,27 МЕ), хотя в стадии ремиссии активность глутаматдегидрогеназы (1,6±0,34МЕ) была достоверно (рь<0,05) снижена относительно контроля. Зарегистрирована более низкая активность (рт№<0,05) глутаматдегидрогеназы у больных с прогредиентным течением РС (1,5±0,24 МЕ) относительно показателя здоровых лиц (2,4±0,27 МЕ).

Сравнение изучаемых показателей метаболизма глутамата в зависимости от типа прогреесирования заболевания представлено в таблице 4.

Таблица 4

Содержание аминокислот и активность ферментов в сыворотке

крови больных в зависимости от типа прогреесирования РС

Течение п Глу мкмоль/д ГлуДГ МЕ Глн мкмоль/л ГлнС-за мкмоль/мгмин ГАМК мкмоль/л ГлуДК мкмоль/мг-мин

Первично-прогрессирующее 3 26,2±4,64 1,0±0,25 177,8±13,13 0,1 ±0,02 237,5±11,87 0,2±0,04

Вторично-прогрессирующее 15 46,1±2,03 1,6±0,29 150,8±10,01 0,1±0,02 241,3±20,39 0,3±0,04

Рь <0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05

Уровень глутамата при вторично-прогрессирующем течении заболевания (46,1 ±2,03 мкмоль/л) повышен (р^<0,05) относительно первично-прогрессирующего типа его течения (26,2±4,64мкмоль/л) и показателя содержания глута-миновой кислоты (рк8<0,05) в контроле (38,4±2,90 мкмоль/л).

У больных с первичным прогрессированием демиелинизирующего процесса наблюдается резкое повышение (рь<0,05) уровня глутамина в сыворотке крови (177,7±13,13 мкмоль/л) по сравнению с контролем (83,6±4,66 мкмоль/л). При вторичном прогрессировании заболевания содержание глутамина несколько ниже - 150,8±10,01 мкмоль/л, но также достоверно превышает ^<0,01) данный показатель здоровых лиц.

Концентрация ГАМК у больных с первично-прогрессирующим течением (237,5±11,87 мкмоль/л) снижена (рь<0,05) как и при вторичном прогрессировании заболевания (241,3±20,39 мкмоль/л; рк5<0,001) относительно ее содержания в контрольной группе -436,3± 19,70 мкмоль/л.

Активность глутаматдекарбоксилазы у больных как с первичным (0,2±0,04 мкмоль/мг-мин), так и вторичным прогрессированием рассеянного 'склероза (0,3±0,04 мкмоль/мг-мин) также существенно (рь<0,01) ниже активности энзима в сыворотке крови здоровых лиц (0,6±0,06 мкмоль/мг-мин).

При первичном прогрессировании заболевания активность глутаматдегид-рогеназы в сыворотке крови больных составила 1,0±0,25МЕ и была ниже (Ртж<0,05) активности фермента у здоровых обследованных (2,4±0,27 МЕ). В группе больных с вторично-прогредиентным течением РС ферментативная активность глутаматдегидрогеназы (1,б±0,29МЕ) достоверно не отличалась (р>0,05) от соответствующего показателя в группе контроля.

При обострении заболевания у больных с вторично-прогрессирующим РС, которое возникает уже на фоне стойкого неврологического дефицита и проявляется клинически не так ярко, как при завершении ремиссии, степень изменения показателей содержания глутамина, ГАМК и активности глутаматдекарбоксилазы в сравнении с контролем была однозначной. Так, уровни глутамина" в стадии экзацербации у больных с ремиттирующим (157,6±10,01 мкмоль/л) и

вторично-прогрессирующим течением РС (150,8±10,01 мкмоль/л), превышая

(р!а<0,001) показатель содержание этой аминокислоты у здоровых лиц________

(83,6±4,66 мкмоль/л), не имели достоверного отличия.

В то же время, содержание ГАМК и активность глутаматдекарбоксилазы были снижены (246,9±19,09 мкмоль/л и 0,3±0,03 мкмоль/мг-мин) как в экзацер-бации при ремиттирующем течении, так и при вторичном прогрессировании РС (соответственно - 241,3±20,39 мкмоль/л и 0,3±0,04 мкмоль/мг-мин) относительно концентрации данной тормозной аминокислоты (р^<0,001) и активности фермента (^<0,01) в контрольной группе.

Обобщая результаты собственных исследований, можно констатировать, что при РС в сыворотке крови имеют место существенные нарушения метаболизма глутаминовой кислоты, обусловленные изменениями активности ферментов, катализирующих пути ее утилизации.

На участие возбуждающей аминокислоты глутамата в развитии нарушений нейрональной трансмиссии при демиелинизирующем заболевании обратили внимание В.П. Бархатова, И.А. Завалишин (1997, 1998, 2000). Ими, в частности, обнаружено существенное повышение уровня глутамата в спинномозговой жидкости больных РС, зависимое от тяжести и характера течения болезни. Нами не установлено достоверного повышения содержания глутамата в сыворотке крови больных рассеянным склерозом при сравнении со здоровыми лицами, что может быть связано с интенсивным превращением нейромедиатора в его метаболиты - глутамин и а-кстоглутарат. Снижение активности глутаматде-пвдрогеназы в сыворотке крови больных РС свидетельствует о еще более низкой интенсивности реакции прямого восстановительного аминирования в мозге, что, по-видимому, определяется энергетическим дефицитом и, как следствие, низким содержанием НАДТНАДФН, необходимых для работы фермента. Накопление глутамина, возможно, связано с блоком глутаминазы или изменением функционального состояния метаболотропных рецепторов глутамата в ас-троглии. Это приводит к изменению функционирования глутаматных ЫМОА-рецепторов, реализующих эксайтотоксические эффекты глутамата, нарушению

Са2+-гомеостаза и снижению синтеза ГАМК. Избыток аммиака вследствие высоких концентраций глутамина приводит к энергетическому и трансмиттерно-му блоку, нарушению осмопроницаемости мембран, астроглиозу, активации микроглии [М.Н. Захарова, 1997; М.Б. Веа1, 1996]. Происходит "всплеск" реакций окислительного стресса, активация выработки провоспалительных цито-кинов и ферментов-индукторов гибели нейронов и олигодендроцитов. В условиях энергетического дефицита при РС снижение уровня ГАМК может наблюдаться за счет активации у-аминобутиратного цикла при шунтировании цикла трикарбоновых кислот [И.. Ва1шт;, 1970].

! Очевидно, что изменения метаболизма глутамата во многом детерминируют, тяжесть заболевания и являются ее маркерами. Выявленная зависимость представленных нами биохимических показателей от стадии, продолжительности, типа течения заболевания, а также степени его тяжести может быть использована в клинической неврологии для объективной оценки этих сторон де-миелинизирующего процесса. Они углубляют представления о механизмах развития демиелинизирующего заболевания, открывают перспективу для изучения возможности включения в комплексную терапию РС патогенетически обоснованной коррекции нарушенного метаболизма глутамата и подтверждают целесообразность использования нейрометаболических препаратов в лечении этого тяжелого заболевания.

ВЫВОДЫ

1. При рассеянном склерозе выявлены существенные нарушения метаболизма возбуждающего нейротрансмитгера глутамата, обусловливающие дисбаланс содержания продуктов его обмена - у-аминомасляной кислоты и глутамина в сыворотке крови.

2. У больных рассеянным склерозом снижена активность ферментных систем (глутаматдегидрогеназы и глутаматдекарбоксилазы), катализирующих основные пути превращения глутамата в сыворотке крови.

3. Изменения метаболизма глутамата у больных рассеянным склерозом на-

блюдаются уже в дебюте заболевания, максимально выражены в стадии экзацербацйи и сохраняются в стадии ремиссии.

4. Нарушения процессов синтеза и утилизации глутамата сопряжены с тяжестью заболевания и выступают в качестве маркера клинической формы, характера течения и прогрессировапия рассеянного склероза.

5. Эмпирическое использование метаболических препаратов в комплексной терапии рассеянного склероза, способствующих коррекции нарушенных процессов обмена глутаминовой кислоты, является патогенетически обоснованным.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В программу обследования больных рассеянным склерозом наряду с общеклиническими, иммунофармакологическими, электрофизиологическими

методами следует включить исследование биохимических показателей метаболизма глутамата.

2. Определение количественного содержания нейротрансмиттерных аминокислот и активности ферментных систем цикла глутаминовой кислоты предоставляют дополнительную объективную информацию о степени тяжести заболевания, стойкости ремиссии и глубине экзацербации рассеянного склероза.

3. Уже для дебюта заболевания характерно повышение концентрации в сыворотке крови глутамина, а также снижение содержания тормозного ней-ромедиатора у-аминомасляной кислоты и ферментативной активности глу-таматдекарбоксилазы. Стадию ремиссии характеризуют высокий уровень глутамина, снижение концентрации ГАМК, а также активности ферментов - глутаматдегидрогеназы и глутаматдекарбоксилазы. В период экзацербации рассеянного склероза происходят наиболее тяжелые метаболические изменения, выражающиеся в резком повышении уровня глутамина, снижении концентрации ГАМК и активности глутаматдекарбоксилазы в сыворотке крови больных.

4. В качестве патогенетически обоснованной терапии больных рассеянным склерозом рекомендуется использование в терапевтическом комплексе препаратов, улучшающих метаболические процессы в мозге (ноотропы и антиоксиданты).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Биохимические аспекты нейрональной гибели при рассеянном склерозе // Актуальные вопросы неврологии и нейрохирургии детского и подросткового возраста: Материалы научно-практической конференции, посвященной 50-летию нейрохирургии Башкортостана. -Уфа, 2000. - С.70-71.

2. Активность глутаматдегидрогеназы и нейрональная гибель у больных рассеянным склерозом // Областная научно-практическая конференция молодых ученых, студентов и аспирантов "Молодежная наука Прикамья-2000": Тез. докл. - Пермь, 2000. - С.31-32.

3. Изменение метаболизма нейротрансмиттеров при рассеянном склерозе//Научная сессия Пермской государственной медицинской академии: Тез. докл. - Пермь 2001. - №169.

4. Изучение уровня нейротрансмиттеров в сыворотке крови у больных рассеянным склерозом // Объединенный научный журнал. - 2001, №20. - С.28-32.

5. Патология нейрональной трансмиссии у больных множественным склерозом // Вятские встречи по актуальным проблемам невропатологии и нейрохирургии: Труды межобластной научно-практической конференции невропатологов, нейрохирургов, детских неврологов и психиатров. - Киров, 2001. - С.34-37.

6. Нарушение метаболизма глутамата у больных рассеянным склерозом // Фундаментальные, науки и прогресс клинической медицины: Материалы П конференции молодых ученых с международным участием. - Москва, 2001, Т.1. - С.370.

7. Эксайтотоксичность, оксидантный стресс и нейрональная гибель при рассеянном склерозе // Молодежная наука Прикамья: Сб. научных трудов. - 2001, вып. 1. — С.174-178. (соавт. А.А. Шутов).