Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Метаболическая и генетическая паспортизация человека для ранней диагностики и индивидуализированной фармакотерапии псориаза

ОБЯЗАТЕЛЬНЫЙ БЕСПЛАТНЫЙ ЭКЗЕМПЛЯР

На правах рукописи

Пирузян Анастас Левонович

МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ПАСПОРТИЗАЦИЯ ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ И ИНДИВИДУАЛИЗИРОВАННОЙ ФАРМАКОТЕРАПИИ ПСОРИАЗА

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология 14.00.11 - кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ

на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН

НАУЧНЫЕ КОНСУЛЬТАНТЫ:

доктор биологических наук доктор медицинских наук

И.В. Голденкова И.М. Корсунская

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук, профессор

И. А. Комиссарова В.Н. Мордовцев Н.К. Янковский

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Московский Государственный Медико-стоматологический Университет Минздрава России

Защита диссертации состоится "9" сентября 2005 года в 11.00 на заседании Диссертационного совета Д002.252.01 при Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН по адресу: 119991 ГСП-1, Москва, ул. Косыгина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН

Автореферат разослан "5" августа 2005 года

Ученый секретарь Диссертационного совета

Доктор биологических наук Л.А. Радкевич

± ¿Ы ЪСЬО

V ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертационной работы. Заболевания с наследственной предрасположенностью делят на две группы: моногенные и полигенные. Моногенные заболевания развиваются вследствие изменений лишь в одном гене, которые приводят к возникновению патологического процесса. Как правило, ген, вовлеченный в патогенез моногенных заболеваний, достаточно легко идентифицируется и для успешного лечения таких болезней одно и тоже лекарство можно применять для всех индивидуумов. Однако такой подход не применим для лечения сложных, называемых также мультифакториальными, патологий, в развитии которых участвует целый ряд генов, полиморфные варианты которых определяют риск и тяжесть заболевания. Изучение этиологии, патогенеза, а также генетический анализ мультифакториальных заболеваний -трудные задачи.

Ввиду того, что такие патологии обусловлены сочетанным влиянием многих аллеломорфов разных локусов, клиницисты наблюдают широкий полиморфизм патологических состояний, т.е. наблюдается непрерывный спектр переходов от субклинических форм к формам с ярко выраженными клиническими симптомами. Истинная тяжесть заболевания определяется индивидуальной клинической картиной пациента, которая обусловлена уникальностью процессов метаболизма каждого индивидуума, определяемой его генетическим статусом. Следовательно, для эффективного лечения необходим индивидуальный подход к каждому пациенту с мультифакториальной патологией.

Известно, что существует генетическая дифференциация популяций различных национальностей по частотам и спектру генов наследственных заболеваний. Следует отметить, что во многих популяциях проявляется значительная степень генетической гетерогенности, которая затрудняет проведение генетического анализа, поэтому при изучении наследственных заболеваний необходимы широкие эпидемиологические исследования, в которые должны быть включены большие выборки индивидуумов со схожим этническим фундаментом, территориальной и культурной изоляцией. Адекватный выбор модельной популяции является залогом успеха при поиске и анализе генов-кандидатов и генетических маркеров в пределах групп с мультифакториальной патологией. Модельная популяция должна характеризоваться низкой гетерогенностью, схожим этническим фундаментом, наличием «ядерных» крупных семей с большим числом потомков и знанием генеалогии.

Поиски генетических маркеров, наличие которых в организме обусловливает восприимчивость организма человека к определенно^ р^^од^^по^ ^ ведутся на

БИБЛИОТЕКА СЯетср 99

протяжении не одного десятка лет и имеют большее значение. Это объясняется тем, что только генетический подход позволяет приблизиться к пониманию биологической сущности заболеваний, а получаемые при таком подходе данные дают возможность выделять группы риска развития исследуемой патологии. При этом следует принимать во внимание и индивидуальный полиморфизм генов, продукты которых могут и не иметь прямого отношения к данной патологии. А именно, индивидуальные генетические особенности организма, определяющие кинетику метаболических превращений лекарственных препаратов, и, следовательно, гетерогенность в ответах пациентов на лечение, а также в отношении побочных эффектов лекарственных препаратов. Факторы индивидуального ответа пациента на применение лекарственных препаратов, как и факторы индивидуальной предрасположенности человека к различным заболеваниям, требуют разработки научных основ для определения критериев соответствующей лекарственной терапии для каждого отдельного пациента, с учетом этнической принадлежности.

В наших исследованиях в качестве модельной мультифакториальной патологии выступает одно из основных по распространенности заболеваний - псориаз. Псориаз имеет все атрибуты мультифакториальной патологии - запускается триггерами внешней среды у индивидуумов с генетической предрасположенностью.

В настоящее время в России в основе диагностике псориаза лежат традиционные общеклинические методы обследования. Такие методы, не утратившие своей диагностической ценности и сегодня, позволяют четко определять форму и стадию развития псориаза, а также степень распространения патологического процесса. Однако, только эти критерии не могут являться основанием для выбора тактики лечения, так как истинная клиническая картина индивидуума определяется прежде всего его генетическим и метаболическим статусом. Вероятно, индивидуальные псориатические локусы могут иметь различную степень выраженности для пациентов с псориазом, имеющих различный клинический фенотип и/или этническую принадлежность. Для того чтобы определить фенотип-специфичные гены заболевания, необходимо применять генетический анализ к различным клиническим подгруппам больных, при этом клинический фенотип каждого пациента должен быть охарактеризован досконально. В связи с этим, требуется подключение новых экспериментальных подходов, целью которых является молекулярно-биологическое и физиолого-биохимическое описание патологии на уровне метаболизма конкретного индивидуума. Эти исследования должны быть первоначально направлены на поиск метаболических маркеров внутри группы пациентов со схожей клинической картиной, что позволит проводить быструю классификацию принадлежности

индивидуумов к той или иной группе. Дальнейшие исследования должны быть связаны с поиском индивидуальных метаболических маркеров внутри каждой группы, что позволит выявить «горячие точки» метаболической сети патологии, в целом, меняющие режим ее «нормального» функционирования (разрыв в сети, переключение путей и т.д.) для каждого индивидуума. Тщательная корректная характеристика клинического фенотипа пациента важна и необходима для того, чтобы минимизировать вклад в гетерогенность заболевания, поскольку псориаз, как мультифакториальная патология, характеризуется разнообразными клиническими картинами и при этой патологии выделяют различные подтипы заболевания. Анализ данных литературы и собственных данных убедительно продемонстрировал необходимость разработки новых критериев для оценки клинической картины и метаболического статуса пациентов с псориазом, что важно для дальнейшего генетического анализа этой патологии.

Современные терапии псориаза либо относительно неэффективны, либо обладают неприемлемыми побочными эффектами, что ограничивает их использование. В связи с этим имеется острая необходимость разработки новых терапий псориаза, что возможно только за счет лучшего понимания механизма возникновения этого заболевания.

В целом, несмотря на достаточно большое количество публикаций, в России практически полностью отсутствуют эпидемиологические исследования распространенности псориаза по регионам. Более того, при изучении патогенеза псориаза практически полностью игнорируется этническая предрасположенность индивидуума, страдающего этим заболеванием. Сведения о популяционной частоте псориаза в мире также противоречивы, что может быть обусловлено применением в разных странах различных методов оценки.

Учитывая отмеченные выше трудности в исследовании мультифакториальных заболеваний, и, в частности, псориаза, необходимыми являются разработка и применение инструмента для получения унифицированных данных, которые можно легко формализовать, и создавать на основе этих данных стандартизированные (унифицированные) базы данных о различных мультифакториальных патологиях. Для устранения противоречий необходимо стандартизировать методы оценки распространенности заболевания. В связи с этим, как для изучения патологического процесса, так и для диагностики и эффективного лечения, необходимо скоординировать клинические, генетические и физиолого-биохимические исследования у индивидуумов с той или иной сложной патологией (в том числе псориазом) с целью унификации подходов и построения единой информационно-практической сети данной патологии.

Цель диссертационной работы: Разработать и предложить интегральный подход для генетической и метаболической паспортизации индивидуумов с целью ранней диагностики и индивидуализированной фармакотерапии мультифакториальной патологии, на примере псориаза.

Для выполнения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Провести широкомасштабный поиск и анализ данных литературы и собственных наблюдений в клинике с целью определения методических подходов, которые используются для оценки клинической картины пациентов с псориазом.

2. Разработать новые критерии для оценки клинической картины и метаболического статуса пациентов с псориазом, а также для генетического анализа этой патологии. Новые критерии должны:

- более адекватно отражать клиническую картину и, следовательно, метаболический статус каждого пациента с псориазом;

- позволять проводить генетический анализ исследуемой патологии, в целом, и

родословных семей, в частности;

- учитывать этническую принадлежность пациента;

- учитывать факторы окружающей среды, которые могут быть триггерами

патологии;

- проводить описание всех систем организма с учетом тех систем, вклад которых в

патологию нелегко предсказать и/или идентифицировать;

- учитывать индивидуальный ответ пациента на применение лекарственных

препаратов;

- позволять получать унифицированные данные, которые можно легко формализовать, и создавать на их основе стандартизированные (унифицированные) базы данных о мультифакториальной патологии.

3. Разработать Индивидуальные Информационные Карты (ИИК) индивидуумов на основе новых предложенных критериев как инструмент для сбора информационного материала о пациентах с мультифакториальной патологией.

4. На основе данных литературы выбрать удобную и адекватную модельную популяцию для проведения генетико-эпидемиологического исследования с целью изучения роли этнической компоненты и наследственности в этиологии и патогенезе мультифакториальных заболеваний, таких как псориаз. Апробировать предложенные новые критерии ИИК для сбора и статистического анализа информационного материала у пациентов с псориазом из различных популяционных выборок.

5. Определить особенности распространения классических генетических маркеров (ABO, Rhesus, MN, Kell, P, Lewis, HP, TF, C'3, GC, GLO, ESD, 6PGD, ACP) у практически здорового населения и больных псориазом с учетом этнической принадлежности.

6. Изучить эффективность проводимой терапии больных псориазом в зависимости от ряда параметров (Тип I и Тип П псориаза, возраст и пол пациента, форма псориаза, биохимические показатели).

7. Разработать основу для создания микрочипов быстрого скрининга генотипа и установления фенотипа ацетилирования с целью индивидуального подбора лекарственных препаратов в клинике. Для этого:

- провести сбор информационного и клинического материала у здоровых и пациентов с псориазом;

- определить фенотип ацетилирования и особенности распределения фенотипа ацетилирования в группах здоровых и пациентов с псориазом;

- выявить мутации NAT2 гена, приводящие к изменению фенотипа ацетилирования и характерные для населения различных регионов России;

- определить наличие взаимосвязи фенотипа и генотипа ацетилирования с проявлением псориаза, а также эффектом используемой фармакотерапии.

8. Разработать основу интегрального подхода для генетической и метаболической паспортизации пациентов с псориазом, которая позволит:

- выявить изменения в метаболизме при псориазе, которые характерны для данных заболеваний в целом, а также для различных групп больных и отдельных пациентов;

- выявить общие, групповые и индивидуальные генетические детерминанты псориаза;

- выяснить закономерности между клинической картиной, метаболическим статусом и генетическими детерминантами пациентов с псориазом;

выявить закономерности между используемой фармакотерапией и метаболическим и генетическим статусом пациентов с псориазом. Научная новизна работы. Разработан и предложен интегральный подход для генетической и метаболической паспортизации индивидуумов с целью диагностики и индивидуализированной фармакотерапии псориаза. В качестве инструмента для сбора информационного материала о пациентах с мультифакториальной патологией разработаны ИИК с новыми критериями оценки.

С целью определения роли этнической компоненты в развитии псориаза учтена этническая принадлежность пациентов в Российской популяции. В качестве удобной и адекватной модельной популяции для проведения гепетико-эпидемиологического исследования и определения этнического фактора и наследственности в этиологии и патогенезе псориаза предложена популяция Республики Дагестан, состоящая из более чем 10 этнически обособленных групп. На основании результатов проведенного исследования заболеваемости псориазом в Дагестане удалось показать существенные различия в проявлении этой патологии между различными этносами, населяющими этот регион России. При определении особенности распространения классических генетических маркеров крови у практически здорового населения и у больных псориазом с учетом их этнической принадлежности показано, что в суммарной группе больных псориазом в Дагестане частота фенотипа Le (аЪ") группы крови Lewis достоверно выше, чем в контрольной группе.

С целью установления корреляции заболевания псориазом с NAT2 фенотипом проведено фенотипирование и генотипирование больных и создан на основе полученного материала гелевый биологический микрочип, который даст возможность в дальнейшем продолжить исследования без фенотипирования, на основе генетического полиморфизма по данному генетическому маркеру.

Показано, что препарат Глутоксим оказывает положительный эффект только в группе пациентов с ранним типом возникновения псориаза.

Практическая значимость работы. Разработаны критерии оценки индивидуального риска заболевания псориазом, необходимые для осуществления дифференцированного подхода к профилактике и лечению этой сложной патологии и ее осложнений в зависимости от наследственной предрасположенности. В комплексную терапию псориаза включен отечественный препарат Глутоксим (патентное изобретение № 2218172). Разработанная и предложенная ИИК может быть использована для исследования других хронических воспалительных патологий аутоиммунной природы с целью превентивной терапии на этапе бессимптомного проявления таких патологий.

Основные положения, выдвигаемые на защиту.

1. Для генетической и метаболической паспортизации индивидуумов с целью ранней диагностики и индивидуализированной фармакотерапии псориаза как мультифакториальной патологии, необходимо введение новых критериев для оценки клинической картины и метаболического статуса пациентов с псориазом.

2. Новые критерии для оценки клинической картины и метаболического статуса пациентов с псориазом позволяют выявлять более полную клиническую картину

патогенеза псориаза для каждого индивидуального пациента с учетом его этнической принадлежности, а также являются важными для генетического анализа этой патологии.

3. Индивидуальная Информационная Карта (ИИК) является эффективным инструментом для сбора информации о пациентах с мультифакториальной патологией.

4. Популяция Республики Дагестан является удобной и адекватной модельной популяцией для исследования мультифакториальных заболеваний, таких как псориаз, и может быть включена для исследования роли наследственности в этиологии и патогенезе этого заболевания, а также и других мультифакториальных заболеваний.

5. Классические генетические маркеры могут использоваться для дифференциации пациентов с псориазом с учетом их этнической принадлежности и с целью ранней диагностики и индивидуализации лечения.

6. Экспериментальный образец гелевого биочипа для скрининга полиморфизма гена NAT2 позволяет четко дискриминировать однонуклеотидные замены, приводящие к изменению фенотипа ацетилирования, и выявлять взаимосвязь между фенотипом, генотипом КАТ2 гена и предрасположенностью к заболеваниям, а также индивидуальным ответом пациента на действие лекарственных препаратов.

7. Разработанный интегральный подход к генетической и метаболической паспортизации пациентов с псориазом позволяет:

- выявлять изменения в метаболизме при псориазе, которые характерны для мультифакториальных заболеваний в целом, а также для различных групп больных и отдельных пациентов;

- выявлять общие, групповые и индивидуальные генетические детерминанты псориаза;

- выяснять закономерности между клинической картиной, метаболическим статусом и генетическими детерминантами пациентов с псориазом;

- выявлять закономерности между используемой фармакотерапией и метаболическим и генетическим статусом пациентов с псориазом.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на Международном Конгрессе по псориазу в Лондоне (1999); на Конференции по клинической дерматологии в Вене (2000); на Международном симпозиуме пластических хирургов и онкологов в Одессе (2000); на Европейском Конгрессе по псориазу в Париже (2004); на Ш Съезде ВОГиС в Москве (2004); на Международной научной конференции по молекулярной генетике, геномике и биотехнологии в Минске (2004); на

Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, 2005).

Публикации. По результатам исследования, изложенным в диссертации, опубликовано 42 работы.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 9

Глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на ...... страницах

машинописного текста, включая 29 таблиц, 46 рисунков, 11 фотографий, и список из .......цитируемых работ.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ГЛАВА 1. Фармакогеиомика - путь к индивидуализированной терапии. Приводятся литературные данные по результатам секвенирования генома человека и изучению генетического полиморфизма, обсуждается терминология и задачи фармакогенетики и фармакогеномики, а также основные достижения фармакогеномики как основы новой стратегии поиска и создания лекарственных препаратов и как пути к индивидуализированной терапии.

ГЛАВА 2. Генетический полиморфизм и вопросы этнической фармакологии.

Обсуждается полиморфизм ДНК и лекарственных ответов, а также полиморфизм ДНК и вопросы индивидуальной предрасположенности к болезням. Рассматриваются этнические аспекты фармакогенетики.

ГЛАВА 3. Псориаз: характеристика заболевания и генетика патологии. В данной главе приведена клиническая характеристика псориаза и генетика псориаза, обсуждается модель наследования, ассоциация этого заболевания с НЪА и взаимосвязь псориаза с Р801?5 локусами. В Главе приведена эпидемиология псориаза, подробно рассматриваются предполагаемые механизмы патогенеза и роль триггеров внешней среды. Приводится рабочая модель иммунопатогенеза псориаза. ГЛАВА 4. Материалы и методы исследования. Объекты исследования

Популяционные выборки из московских клиник. Исследования больных псориазом и индивидуумов контрольной группы с использованием ИИК проводили в клинических больницах г. Москвы и в Научном Центре спортивной медицины РАМН, г. Москва. Обследованная выборка включала 261 человек больных псориазом и 149 человек из контрольной группы.

Популяционные выборки Республики Дагестан. Исследования больных псориазом с использованием ИИК проводили в различных этнотерриториальных группах

Дагестана. В наше исследование были включены 10 наиболее многочисленных этнических групп Дагестана: аварцы, даргинцы, кумыки, лезгины, русские, лакцы, табасаранцы, азербайджанцы, ногайцы, агулы, на долю которых приходится 91,9 % населения. Обследованная выборка включала 1194 больных псориазом, что составляет 25% от всех зарегистрированных в Дагестане больных псориазом, и 983 индивидуума из контрольной группы.

В трех самых многочисленных этнических группах (аварцы, даргинцы и кумыки -56,4% от всего населения) населения Республики Дагестан проведено исследование клинического материала 49 больных псориазом и 357 человек, у которых данное заболевание отсутствовало.

Выборка больных при лечении Глутоксимом. Под наблюдением в условиях стационарного лечения ГКБ №14 им. В.Г. Короленко находилось 100 больных псориазом в возрасте от 18 до 76 лет.

Биохимические методы исследования. Биохимические исследования выполнялись на калиброванном автоматическом анализаторе производства Cobas Mira (Япония) в биохимической лаборатории ГКБ №14 им. В.Г. Короленко. Пробы крови брали натощак из локтевой вены, сыворотку крови получали обычным методом после образования сгустка. Для оценки состояния липидного обмена у пациентов с псориазом было проведено исследование липидного спектра сыворотки крови у пациентов всех групп. Содержание ХС, ТГ (в сыворотке крови) и ХС ЛВП (в супернатанте после преципитации других классов липопротеидов смесью фосфовольфрамовой кислоты и хлористого магния), определяли ферментативным способом на биохимическом автоанализаторе "EXPRESS Plus" фирмы "CHIRON/Diagnostics" (Великобритания). Значения липидов выражали в ммоль/л. Содержание ХС ЛНП рассчитывали по формуле Фридвальда: ХС ЛНП (ммоль/л) = Общий ХС - (ХС ЛВП + ТГ/2,2), где ТГ/2,2 = ХС ЛОНП. Определение ano A-I и ano В проводили методом иммунотурбодимитрии, используя наборы и стандартные образцы фирмы "Boehringer Mannheim" (Германия); полученные данные выражали в г/л. Контроль качества при выполнении исследования осуществляли, используя контрольную сыворотку "Precinorm L" производства фирмы "Boehringer Mannheim" (Германия).

Определение уровня мочевой кислоты производили урокиназным методом, используя наборы и стандартные образцы фирмы "Diasys" (Германия) на биохимическом автоанализаторе "EXPRESS Plus" фирмы "CHIRON/Diagnostics" (Великобритания).

Для оценки безопасности и побочных эффектов препаратов определяли активность ACT, АЛТ, КК, щелочной фосфатазы, уровень общего билирубина, креатинина на

биохимическом автоанализаторе "EXPRESS Plus" фирмы "CHIRON/Diagnostics" (Великобритания), при использовании реактивов и контрольных сывороток фирмы "Diasys" (Германия).

Геиотипироваиие клинического материала. Исследовали полиморфизм групп крови ABO, Rhesus, Kell, Р, Lewis, а также белков и ферментов - гаптоглобин (HP), трансферрин (TF), третий компонент комплемента (С'З), группоспецифический компонент (GC), глиоксалаза (GLOl), эстераза-D (ESD), 6-фосфатдегидрогеназа (6PGD), кислая фосфатаза АСР. Определение антигенной специфичности групп крови систем ABO, Rhesus, Р, Lewis, Kell-Chellano проводили стандартными методами реакции агглютинации [Иммуносерология (нормативные документы), 1998]. Определение фенотипов сывороточных белков - HP, GC, С'З, TF, и эритроцитарных ферментов - 6PGD, GL01, ESD, АСР выполнялось при помощи электрофореза в крахмальном и полиакриламидном гелях [Peackok et al., 1965; Harris, Hopkinson, 1976; Kuhnl et al., 1977]. Выбор названных маркеров определялся в первую очередь тем, что в случае обнаружения среди них фактора риска развития (появления) псориаза у человека подобное исследование может быть выполнено не только в специализированных учреждениях, но и в небольших клиниках (амбулаториях).

Для оценки достоверности различий по частотам фенотипов между двумя группами обследованных использовали стандартные статистические методы [Ван дер Варден, 1960; Плохинский, 1970].

Определение фенотипа ацетилирования проводили по модифицированному методу Bratton & Marshall. Пациенты и индивидуумы контрольной группы натощак принимали 0,5 г сульфадимезина. Клинический материал (кровь и моча) собирали через 6 часов после приема лекарственного препарата. Определяли уровень свободного и общего сульфадимезина методом спеюгрофотометрни при длине волны 400 нм. Уровень ацетилированного сульфадимезина определяли по формуле: АЦС = ОБО - СВС, где АЦС - ацетилированный сульфадимезин, ОБС - общий сульфадимезин, СВС - свободный сульфадимезин.

Фенотип ацетилирования определяется как скорость ацетилирования сульфадимезина и рассчитывается как соотношение АЦС к ОБС.

Выделение геномной ДНК проводили из лимфоцитов крови согласно [Sambrook, Russell, 2001]. К образцу крови объемом 1 мл добавляют 100 мкл 50 мМ ЭДТА в качестве антикоагулянта. Гемолиз проводят добавлением 5 мл 0,8% NH4CI. Клетки осаждают при 4000g 20 мин. Осадок лейкоцитов промывают 2 мл 0,9% NaCl. Далее осадок ресуспендируют в 300 мкл лизирующего буфера (100 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl, pH 8.0,

25 мМ ЭДТА, рН 8.0, 0.5% SDS, 0.1 мг/мл протеиназа К) и инкубируют при 50°С в течение 2ч. После инкубации смесь экстрагируют насыщенным фенолом в объеме, равном объему образца, тщательно перемешивают до образования гомогенной эмульсии, после чего центрифугируют 10 мин при 5000g. Водную фазу переносят в чистую пробирку. Затем экстрагируют смесью хлороформ:фенол (1:5). Центрифугируют 10 мин при 5000g. Добавляют 150 мкл 7,5М ацетата аммония и 600 мкл 96% этанола. Смесь центрифугируют 10 мин при 10000g. Образовавшийся осадок промывают 70% этанолом и высушивают. Растворяют сухой остаток в 100 мкл ТЕ буфера (10 мМ Трис-HCl, 1мМ ЭДТА, рН 8.0).

Для статистической обработки информационной карты использовали метод дескриптивных статистик для группированных данных. Изначально были вычислены дескриптивные статистики для всего массива данных. С целью дальнейшей конкретизации и выявления зависимостей данные были разнесены по группам (сгруппированы). Были выделены три основные группы (группировка по возрасту), каждая из которых, в свою очередь, состоит из двух подгрупп (разделение по половому признаку). После такой группировки в пределах конечных групп данные удалось нормализовать и представить в виде гистограмм со стандартной ошибкой не более 30%. После окончания сбора материала все наблюдения были объединены в электронную таблицу. Результаты исследований обрабатывались на компьютере с использованием пакета прикладных программ для научно-технических расчетов StatView 6.0. Достоверность различий параметров количественных переменных определялись по t-критерию Стьюдента. Достоверность различий качественных признаков в двух группах определялась при помощи z-теста. Для оценки связи количественных признаков использовались методы линейной регрессии и корреляции (коэффициент корреляции Пирсона).

ГЛАВА 5. Новые подходы к оценке метаболического и генетического статуса больных псориазом.

5.1. Диагностические критерии для псориаза (анализ данных литературы и собственных наблюдений в клинике). На основании имеющегося материала по литературе, а также на основе собственных наблюдений в клинике, обсуждаются различные диагностические критерии для псориаза. Особое внимание уделено индексу PASL

5.2. Разработка новых критериев для оценки клинической картины и метаболического статуса пациентов с псориазом, а также для генетического анализа этой патологии. Обосновывается необходимость разработки новых критериев для оценки клинической картины псориаза у пациентов. Обсуждаются критерии для сбора

информации о метаболическом и генетическом статусе пациентов, а также критерии для сбора информации о наследственной предрасположенности к заболеванию. Обсуждаются критерии для сбора информации о факторах окружающей среды и образе жизни пациента. Следует особо подчеркнуть, что, по нашему мнению, использование совокупности унифицированных критериев для описания пациента с псориазом позволит проводить сравнительный анализ экспериментальных данных, получаемых различными исследователями, как в области изучения патогенеза и генетики псориаза, так и в области индивидуального ответа пациента на применение лекарственных препаратов.

5.3. Индивидуальная Информационная Карта как новый инструмент для сбора информационного материала о пациентах с мультифакториальиой патологией, на примере псориаза: характеристика и апробирование. Приводится Индивидуальная Информационная Карта, включающая 54 критерия, а также результаты апробирования Индивидуальной Информационной Карты (ИИК) на пациентах Московской выборки: по возрастным и гендерным распределениям больных псориазом, по распределению больных по типам (Тип I и Тип II) псориаза, в зависимости от пола больного, по определению индекса РАБ1, гендерному распределению пациентов в зависимости от индекса РА81, распределению больных с псориазом, в зависимости от длительности заболевания. Приводятся динамические изменения индекса РАБ1 в различных группах пациентов.

ГЛАВА 6. Определение роли этнической компоненты при мультифакториальньгх заболеваниях на модели популяции Дагестана. Индивидуальные генетические локусы наследственной патологии могут иметь разную степень важности в различных этнических грушах из-за несхожести в частоте аллелей. Следует отметить, что во многих популяциях проявляется значительная степень генетической гетерогенности, которая затрудняет проведение генетического анализа, поэтому при изучении наследственных заболеваний необходимы широкие эпидемиологические исследования, в которые должны быть включены большие выборки индивидуумов со схожим этническим фундаментом, территориальной и культурной изоляцией. При поиске и анализе генов-кандидатов и генетических маркеров в пределах групп с мультифакториальиой патологией залогом успеха является выбор адекватной модельной популяции. Модельная популяция должна характеризоваться низкой гетерогенностью, схожим этническим фундаментом, наличием «ядерных» крупных семей с большим числом потомков и знанием генеалогии. В качестве такой модельной популяции была выбрана Республика Дагестан. Дагестан представляет один из сложных, уникальных в популяционно-генетическом, этническом, лингвистическом и природно-территориальном отношениях регионов России.

6.1. Общая характеристика Республики Дагестан и этнический состав ее популяции. Приводится этнический состав популяции Республики Дагестан.

6.2. Характеристики больных псориазом в различных этнических группах Дагестанской популяции. Исследования больных псориазом с использованием ИИК проводили в различных этнотерриториальных группах Дагестана В наше исследование были включены 10 наиболее многочисленных этнических групп Дагестана: аварцы, даргинцы, кумыки, лезгины, русские, лакцы, табасаранцы, азербайджанцы, ногайцы, агулы, на долю которых приходится 91,9 % населения. Обследованная выборка включала 537200 человек, среди них - 1194 больных псориазом, что составляет 25% от всех зарегистрированных больных. Анализ генетической структуры дагестанской выборки по данным ИИК и родословных семей показал высокую обособленность этнических групп, что является результатом ограниченного числа межэтнических браков. Следствием этого является более высокая степень эндогамии, которая приводит к увеличению степени гомозиготности в популяции. Кроме этого, изученные родословные включают достаточное число многодетных семей для того, чтобы проследить за родственной структурой отдельной семьи (3-4 поколения). Так, у аварцев, даргинцев, лезпшов, лакцев, азербайджанцев и ногайцев среднее число детей в семьях составляет 3 ребенка, у кумыков, табасаранцев и агулов - 4, а в семьях русских - 1. Важно также отметить, что несколько поколений большинства семей проживают в территориальной близости, и, следовательно, находятся в одних и тех же условиях внешней среды.

Распространенность больных псориазом в Дагестане представлена на рисунке 1 В нашем исследовании мы показали, что если для общей выборки тендерных различий в проявлении псориаза не выявлено, то в некоторых этнических группах они имеются. Согласно полученным данным, псориаз преимущественно отмечается у мужчин в этнических группах кумыков, лезгин, лакцев, табасаранцев, азербайджанцев, а у женщин -в этнической группе ногайцев (табл. 1.).

Анализ базы данных позволил нам установить наличие тендерных различий в течении псориаза, а именно, нами отмечено, что площадь пораженной поверхности тела у мужчин достоверно выше, чем у женщин (рис. 2.)

Проведенные исследования показали, что в обследованной выборке, в целом, примерно одна треть больных псориазом имеют осложнения, при этом тендерное распределение больных с осложнениями демонстрирует незначительное превышение таковых у мужчин. В некоторых этнических группах отмечается значительное увеличение больных псориазом с осложнениями (ногайцы и агулы), отмечаются также изменения в гендерном распределении таких больных.

0,8

0,7 0,6

х

§0,5 к

|о,4 о

^ 0,3

0,2 0,1 0

123456789 10 | Этнические группы

Рис. 1. Распространенность псориаза в этнических группах Дагестана. 1 - аварцы, 2 -даргинцы, 3 - кумыки, 4 - лезгины, 5 - русские, 6 - лакцы, 7 - табасаранцы, 8 -азербайджанцы, 9 - ногайцы, 10 - лакцы.

Более подробно были проанализированы семейные случаи псориаза в пяти самых крупных этнических группах: аварцев, даргинцев, кумыков, табасаранцев и лезгин. Мы отмечали различную частоту семейных форм псориаза в обследованных этнических группах: более 50% - для даргинцев и табасаранцев, и менее 20% - для лезгин. При этом выявлены тендерные различия в наследовании патологии. Достоверно более часто патология наследуется мужчинами, чем женщинами (за исключением кумыков, где наследование патологии отмечено в равной степени для женщин и мужчин).

Анализ базы данных больных псориазом в исследованных этнических группах показал, что: наследование по отцовской линии отмечено до 70% от всех семейных случаев у аварцев и даргинцев, до 100% - у табасаранцев и лезгин, и лишь 30% - у кумыков, наследование по материнской линии отмечено только у даргинцев (20% от всех семейных случаев); наследование по двум линиям отмечено у аварцев (25%), даргинцев (20%) и кумыков (70%).

' Л!

; ■

К 1 t г чй Щ \Л у.

Км Т' - - 5 - * *

- . -1

Г -) - 4 ''Л !

Таблица 1. Сравнительная характеристика больных псориазом в различных этнических группах Дагестана

Этнические группы Тендерное распределение в этнических группах (М : Ж, в %) Процент больных в этнических группах Тендерное распределение больных псориазом (М: Ж, в %) Распределение больных по Типу (I: П, в %)

Общая популяция 52:48 0,4 56:44 70:30

Аварцы 50:50 0,4 50:50 72:28

Даргинцы 62:38 0,7 59:41 68:32

Кумыки 38:62 0,5 65:35 75:25

Лезгины 51 :49 0,4 68:32 72:28

Русские 53:47 0,3 47:53 68:32

Лакцы 58:42 0,3 70:30 75:25

Табасаранцы 51 :49 0,3 79:21 68:32

Азербайджанцы 52:48 0,3 68:32 60:40

Ногайцы 57:43 0,5 25:75 80:20

Агулы 54:46 0,4 64:36 82:18

Примечание: обозначение М и Ж - пол, Тип I и ТипП - ранний и поздний Тип псориаза

500,00 250,00

75,00 50,00

25,00

7,50 5,00

2,50

0,75 0,50

0,25

Вок ПМ (0вд03_р»ог 28»*52с)

о №йвг □ 25%-75% Т №п-Ои№г Папде

О 0|йеп

БЛгагтвв

Рис. 2. Тендерные отличия в площади пораженных участков тела у больных псориазом (Г - женщины, ш - мужчины).

Проведенные с использованием ИИК исследования показали также, что наличие осложнений и длительность заболевания псориазом различны в этнических группах Дагестана и зависят от Типа псориаза (Тип I и Тип II) (табл. 2).

Этнические группы Больные I типа с осложнениями (в%) Больные П типа с осложнениями (в%) Больные I типа с осложнениями и длительностью заболевания до 5 лет (в %) Больные I типа с осложнениями и длительностью заболевания после 5 лет (в %) Больные II типа с осложнениями и длительностью заболевания до 5 лет (в %) Больные П типа с осложнениями и длительностью заболевания после 5 лет (в %)

Общая популяция 32 35 38 62 42 58

Аварцы 38 36 42 58 70 30

Даргинцы 30 25 29 71 40 60

Кумыки 30 32 42 58 25 75

Лезгины 71 10 38 62 50 50

Русские 30 58 38 62 38 62

Лакцы 20 28 0 100 50 50

Табасаранцы 20 22 17 83 50 50

Азербайджанцы 10 40 100 0 100 0

Ногайцы 40 82 17 83 20 80

Агулы 81 100 80 20 0 100

Таблица 2. Наличие осложнений и длительность заболевания в зависимости от Типа псориаза (I или II) в различных этнических группах Дагестана

Таким образом, полученные данные показали важную роль этнической компоненты в наследуемости такой мультифакториальной патологии, как псориаз, а также продемонстрировали возможность использования ИИК и модельной популяции Дагестана для изучения типа наследования при псориазе с учетом этнической компоненты Безусловно, что для выявления типа наследования необходимо проведение дополнительного эпидемиологического исследования, в котором будут учтены все больные псориазом, включая больных со скрытыми формами псориаза.

6Л. Генетические маркеры и псориаз в этнических группах Дагестана

Цель данного раздела работы - выяснить, имеются ли различия в особенностях распространения классических генетических маркеров у практически здорового населения и больных псориазом с учетом этнической принадлежности (табл. 3).

Таблица 3. Численность обследованных с учетом их этнической принадлежности и национальности.

Этническая группа Больные Здоровые ВСЕГО

псориазом (Н) (К)

(Н)

Даргинцы 34 194 228

Аварцы и кумыки 15 163 178

ВСЕГО 49 357 408

Частота больных псориазом в изученной выборке составила 12%, при этом достоверно чаще (Р<0,05) больные псориазом встречаются среди даргинцев (14,9%), чем среди аварцев и кумыков (8,4%). Большая доля больных псориазом среди обследованных объясняется специальным целенаправленным отбором лиц с данной патологией.

Исходя из результатов проведенного анализа, можно предположить, что для объединенной группы аварцев и кумыков наличие у индивидуума рецессивной гомозиготы ПН ее и фенотипа Ье(а-Ь-), который представляет гомозиготу по рецессивному аллелю 1е, является фактором риска появления псориаза, однако следует отметить, что вклад этих факторов в развитие болезни, хотя и достоверен, но составляет лишь 2,4±0,6% для фенотипа Ье(а-Ь-) и 3,0±0,б% для фенотипа ЯНее

ГЛАВА 7. Различные подходы к лечению псориаза (собственные исследования).

В данной главе приводятся результаты собственных исследований по изучению эффективности лечения наблюдаемых нами больных. Распределение больных по возрасту и полу, а также по возрасту начала заболевания представлено в таблице 4 и 5.

Таблица 4. Распределение больных псориазом по полу и возрасту

Возраст Число женщин % Число мужчин % Всего %

19-25 5 5 6 6 11 И

26-30 4 4 2 2 6 6

31-40 1 1 7 7 8 8

41-50 10 10 16 16 26 26

51-60 8 8 19 19 27 27

61-70 8 8 И 11 19 19

>70 0 0 3 3 3 3

Таблица 5. Распределение больных по возрасту дебюта заболевания

Возраст Число женщин % Число мужчин % Всего %

10-20 15 15 15 15 30 30

21-30 9 9 20 20 29 29

31-40 6 6 16 16 22 22

41-50 2 2 6 6 8 8

51-60 2 2 6 6 8 8

61-70 2 2 1 1 3 3

Все пациенты основной и контрольной групп находились под постоянным динамическим наблюдением В соответствии с графиком всем больным проводилось иммунологическое исследование крови, брался клинический анализ крови и общий анализ мочи, вычислялся индекс РАЭ1 и определялся индекс качества жизни (30 больных основной группы и 25 больных группы контроля). Биохимический анализ крови проводился при поступлении в стационар до назначения препарата Глутоксим и через 10 дней терапии. Оценка темпов обратного развития клинических симптомов проводилась по следующим показателям: инфильтрация, эритема, отёчность, шелушение, зуд, экскариации.

У всех пациентов основной группы на фоне лечения Глутоксимом значительно уменьшился зуд. У 18 человек инфильтрация к концу лечения была минимальной, шелушение полностью отсутствовало, в местах высыпаний оставались в основном пятна вторичной гиперпигментации. Пациенты с артропатическим псориазом отмечали уменьшение интенсивности артралгий, что позволило обойтись без назначения обезболивающих препаратов.

Через 10 дней терапии инфильтрация уменьшилась на 45%, а через 15 дней - на 50%. Шелушение через 10 дней терапии уменьшилось более, чем на 60%, а через 15 дней -на 83%. Отёчность через 10 дней терапии уменьшилась на 40%, а через 15 дней - на 73%. Все пациенты отмечали значительное улучшение качества жизни за счет быстрого уменьшения зуда и шелушения кожи.

Анализ времени пребывания в стационаре больных по приведенным выше схемам терапии показал следующее: при применении препарата Глутоксим время пребывания в стационаре короче в среднем на 10 дней по сравнению с контрольной группой, также более короткое время пребывания наблюдалось при получении глюкокортикостероидов, тогда как при применении ПУВА-терапии время пребывания остается таким же, как и при стандартной терапии, включающей только дезинтоксикационные препараты.

Все вышеизложенное подтверждает необходимость разработки индивидуальных схем терапии с учетом метаболических и клинических параметров, и необходимость исследования новых лекарственных средств для эффективной терапии псориаза. ГЛАВА 8. Генетический полиморфизм реакции ацетилирования у больных псориазом.

8.1 Полиморфизм гена NAT2. Обсуждается полиморфизм гена NAT2, кодирующего один из основных ферментов П фазы биодеградации ксенобиотиков - N-ацетилтрансферазу 2. Корреляция псориаза с фенотипом ацетилирования у больных псориазом не изучалась. Этому вопросу посвящены наши исследования, которые проводятся с учетом этнической принадлежности пациентов. В данном разделе главы приводится перечень известных к настоящему времени NAT2 аллелей у человека.

8.2. Определение фенотипа ацетилирования у здоровых индивидуумов и больных псориазом в московской выборке. Следует отметить, в целом данные по фенотипу ацетилирования для населения России отсутствуют. Есть одиночные сведения по некоторым регионам, например, Башкирия и Удмуртия, по определению генотипа NAT2. В связи с вышеизложенным, необходимо расширить исследования по этому показателю, что позволит сделать прогноз заболеваемости различными патологиями с учетом этнических особенностей.

В наши исследование были включены две случайные выборки: индивидуумы контрольной группы (60 человек) и пациента с псориазом (60 человек). Распределение «быстрых» и «медленных» ацетиляторов в выборке представлено на рисунке 3.

здоровые заболевания кожи

Рис. 3. Распределение быстрых и медленных ацетиляторов в контрольной (здоровые) группе и в группе пациентов с псориазом.

Показано, что в группе пациентов с псориазом достоверно выше число индивидуумов с быстрым фенотипом ацетилирования.

Далее мы провели распределение как пациентов с псориазом, так и индивидуумов контрольной группы по скорости ацетилирования (рис. 4.).

Полученные результаты позволяют сделать предварительный вывод о существовании корреляции между заболеванием псориаза и фенотипом КАТ2, однако для достоверного заключения о наличии такой корреляции требуются дополнительные эпидемиологические исследования в разных регионах России, поскольку Россия представлена различными этническими популяциями, в которых фенотип ацетилирования, также как и генотип, может существенно отличаться.

«ми

[в здоровы« ■ иВолмаиия кожи |

Рис. 4. Распределение пациентов с псориазом и индивидуумов контрольной группы по скорости ацетилирования.

8.3. Разработка микрочипа быстрого скрининга генотипа и установления фенотипа ацетилирования у больных псориазом. Проведение широкомасштабных популяционных исследований, диагностика генетической предрасположенности к целому комплексу многофакторных заболеваний, скрининг полиморфных локусов, ассоциированных с индивидуальной чувствительностью к фармацевтическим препаратам, нуждаются в эффективных, точных и быстрых методах идентификации множества мутаций. Один из наиболее перспективных методов для решения таких задач - метод гибридизации на олигонуклеотидной матрице (биочипе). Мы полагаем, что такой биочип представляет собой удобный инструмент для проведения фармакогенетических исследований.

Разработанный биочип позволяет определять 9 участков полиморфизма гена ЫАТ2-й191А, С282Т, Т341С, С481Т, 0590А, А803С, 0857А, Т859С и 859ёе1.

Пример гибридизационной карты представлен на рисунке 5.

Примеры определения генотипов даны в таблице б.

Г N ^ О И О»

№ <0 ч а $ о л ю СЧ <"> П И> СО 00 со

Рисунок 5. Пример гибридизационной картины. Анализируемый образец имеет генотип ШТ*5ВЛЧАТ*5В.

Таблица 6. Примеры определения генотипов

№ образца №ИИК Генотип Фенотип Ацегилирующая способность, %

0010 135 ШТ2*5А/*5В медленный 46

0011 145 МТ2*6В/*7 медленный 49

0013 85 ШТ2*4/*5А быстрый 89

12 95 1УАТ2*6В/*6В медленный 58

0018 132 ШТ2*4/*6В быстрый 99

0020 130 ШТ2*4/*6В быстрый 81

0021 141 ШТ2*4/*5А быстрый 77

Предложенный подход, заключающийся в установлении взаимосвязи между фенотипом (быстрый, средний, медленный) и генотипом (наличие той или иной мутации в гене НАТ2) ацетилирования, позволит выявить мутации ИАТ2 гена, приводящие к изменению фенотипа ацетштрования и характерные для населения различных регионов России.

ГЛАВА 9. Интегральный подход к изучению сложных мультифакториальных заболеваний на примере псориаза.

9.1. Система исследования псориаза как мультифакториального заболевания.

Предлагаемый нами системный интегральный подход к изучению сложных патологий основан на описании патологии на уровне всех задействованных систем организма, представленных иерархично, что требует междисциплинарных взаимодействий многих групп специалистов.

Предлагаемый нами интегральный подход к исследованиям представлен на рисунке 6.

9.2. Псориаз и другие аутоиммунные воспалительные заболевания. В данном разделе псориаз рассматривается в ассоциации с другими воспалительными аутоиммунными заболеваниями. Приводится список цитокин-опосредованных хронических воспалительных аутоиммунных патологий. Приводятся сигнальные пути иммунологического синапса и связанные с этими путями аутоиммунные болезни.

9.3. Обоснование необходимости перехода к изучению генных и метаболических сетей, контролирующих патогенез псориаза. Интегральный подход к изучению патологии на индивидуальном уровне должен включать общеклиническую информацию, а также информацию на уровне метаболизма и на генетическом уровне (рис 6) Для адекватного моделирования процесса патогенеза необходимо рассмотрение и включение в модель всех вовлеченных систем и процессов организма человека, в том числе и таких систем, вклад которых в формирование патологии в настоящее время трудно предсказать и/или идентифицировать. С целью упрощения модели предлагается иерархическое представление систем и процессов организма, и рассмотрение их в конкретной сложной системе отдельно, как в пределах одного иерархического уровня, так и в пределах каждой отдельной подсистемы каждого из иерархических уровней.

Общий процесс построения Модели патологического процесса мультифакториального заболевания представлен нами на рисунке 7.

Рис. б. Интегральный подход для индивидуальной характеристики патогенеза и выбора эффективной тактики лечения каждого индивидуума.

Рисунок 7. Общий процесс построения модели патологического процесса мультифакториального заболевания.

Изучение информации на основе Индивидуальных Информационных Карт о сопутствующих заболеваниях у больных псориазом, с учетом ряда других параметров, а также изучение генетического полиморфизма, позволят в будущем выйти на генные сети, детерминирующие псориаз и взаимосвязанные заболевания. Исследования отдельных систем патогенеза позволят выявить не только генные сети, но и определить сетевые взаимодействия при сложных мультифакториальных заболеваниях.

Заключение

На основании данных литературы и собственных наблюдений в клинике продемонстрирована необходимость введения унифицированных критериев для оценки клинической картины, метаболического статуса пациента и для проведения генетического анализа мультифакториальных патологий. Показано, что разработанные и предложенные новые критерии для индивидуального описания пациента с псориазом как мультифакториальной патологией обеспечивают необходимой информацией, как о патологическом процессе, так и о метаболическом статусе конкретных индивидуумов. Помимо этого новые критерии позволяют: учитывать наследственную предрасположенность к заболеванию, факторы окружающей среды и образ жизни индивидуума; получать унифицированные данные, которые можно легко формализовать, и создавать на их основе стандартизированные (унифицированные) базы данных о мультифакториальной патологии.

На основании теоретических разработок, подтвержденных экспериментальными данными, показана возможность предложенной ИИК для создания унифицированной базы данных о пациентах с мультифакториальной патологией на примере псориаза, а также возможность предложенной ИИК для выявления общих, групповых и индивидуальных особенностей исследуемой патологии. Пополняя и используя базу данных, полученную с помощью унифицированных критериев ИИК, в дальнейшем возможно разработать общий алгоритм для точного описания клинических форм псориаза и метаболического статуса пациента. Кроме этого, ИИК с унифицированными критериями является корректным инструментом для эпидемиологических исследований и генетического анализа патологии. Следует особо подчеркнуть, что использование совокупности унифитртрованных критериев для описания пациента с мультифакториальной патологией позволит проводить сравнительный анализ экспериментальных данных, получаемых различными исследователями, как в области изучения патогенеза и генетики патологии, так и в области индивидуального ответа пациента на применение лекарственных препаратов.

Полученные данные показали важную роль этнической компоненты в наследуемости такой мультифакториальной патологии, как псориаз. Проведенные нами исследования позволяют заключить следующее: популяция Республики Дагестан является удобной и адеквагаой модельной популяцией для исследования мультифакториальных заболеваний, таких как псориаз, и может быть включена для исследования роли наследственности в этиологии и патогенезе этого заболевания, а также и других мультифакториальных заболеваний. Эти выводы базируются на следующих данных:

низкая гетерогенность популяции в отдельных этнических группах, схожий этнический фундамент (браки, в основном, заключаются внутри этнических групп), наличие «ядерных» крупных •семей с большим числом потомков и знанием генеалогии (есть возможность проведения клинико-гениалогических исследований и анализа сибсов) Разработанная и апробированная нами ИИК дает возможность выявить аккумулирование повторных случаев аналогичного заболевания среди родственников изученных семей при сопоставлении с их распространенностью в популяционном контроле из той же самой этнотерриториальной группы.

Апробированы различные подходы к лечению псориаза. На основании полученных данных показано, что при применении препарата Глутоксим время пребывания пациента в стационаре короче в среднем на 10 дней, по сравнению с контрольной группой. Отдаленные результаты наблюдения показали следующее: у пациентов с Типом I псориаза после лечения препаратом Глутоксим ремиссия была значительно длиннее, и последующие рецидивы были менее активны.

Полученные данные по лечению больных псориазом продемонстрировали необходимость разработки индивидуальных схем терапии с учетом метаболических и клинических параметров и необходимость исследования новых лекарственных средств для эффективной терапии псориаза.

Проведенный анализ клинического материала здоровых индивидуумов и пациентов с псориазом по классическому генетическому маркеру (NAT2) позволяет сделать предварительный вывод о корреляции заболевания псориазом с NAT2 фенотипом. Выявлена взаимосвязь между фенотипом (быстрый, средний, медленный) и генотипом (наличие той или иной мутации в гене NAT2) ацетилирования. Установлены мутации в гене NAT2, которые строго характеризуют соответствующий фенотип ацетилирования. Созданный на основе полученного материала гелевый микрочип дает возможность продолжить исследования без фенотипирования по генетическому полиморфизму NAT2 пациентов с целью установления корреляции предрасположения к заболеванию псориазом с генотипом. Предложенный подход, заключающийся в установлении взаимосвязи между фенотипом (быстрый, средний, медленный) и генотипом (наличие той или иной мутации в гене NAT2) ацетилирования позволит выявить мутации NAT2 гена, приводящие к изменению фенотипа ацетилирования и характерные для населения различных регионов России.

Разработан и предложен интегральный подход для генетической и метаболической паспортизации индивидуумов с целью диагностики и индивидуализированной фармакотерапии псориаза. Изучение информации на основе Индивидуальных

Информационных Карт о сопутствующих заболеваниях у больных псориазом, с учетом ряда других параметров, а также изучение генетического полиморфизма, позволят в будущем выйти на генные сети, детерминирующие псориаз и взаимосвязанные заболевания. Исследования отдельных систем патогенеза позволят выявить не только генные сети, но и определить сетевые взаимодействия при сложных мультифакториальных заболеваниях.

Выводы

1. В ходе проведенного исследования разработаны новые подходы к оценке метаболического и генетического статуса больных псориазом. Впервые разработанная Индивидуальная Информационная Карта (ИИК), включающая более 50 параметров, в том числе и ряд новых критериев, позволяет выявлять более полную клиническую картину патогенеза псориаза для каждого индивидуального пациента с учетом его этнической принадлежности.

2. Впервые на основании результатов проведенного исследования заболеваемости псориазом в Дагестане удалось показать существенные различия в проявлении псориаза между различными этносами, населяющими Дагестан, что расширило спектр проявлений данной патологии и привнесло ряд существенных дополнительных параметров при анализе псориаза.

3. Впервые проведенное изучение полиморфизма по группам крови у больных псориазом трех различных этнических групп Дагестана свидетельствует о необходимости поиска новых генетических маркеров с целью выявления предрасположенности индивидуумов к псориазу.

4. На примере псориаза показано, что для исследования мультифакториальных заболеваний с целью выявления генетических корреляций и роли наследственности в этиологии и патогенезе Республика Дагестан является удобной и адекватной модельной популяцией. В основе такой модели лежат такие факторы, как наличие более 10 различных обособленных этнических групп, отсутствие (или малое количество) межэтнических браков, доступность информации и легко прослеживаемые родословные.

5. Выявлена корреляция между клиническим эффектом и типом возникновения псориаза (ранний или поздний). Показано, что препарат Глутоксим оказывал положительный эффект только в группе пациентов с ранним типом возникновения псориаза.

6. Впервые проведенный анализ клинического материала здоровых индивидуумов и пациентов с псориазом по генетическому маркеру (NAT2) позволяет сделать предварительный вывод о корреляции заболевания псориазом с NAT2 фенотипом и генетическим полиморфизмом. Созданный па основе полученного материала гелевый микрочип дает возможность продолжить исследования без фенотипирования по генетическому полиморфизму пациентов с целью установления корреляции предрасположенности к заболеванию псориазом с генотипом.

7. Впервые разработанный и предлагаемый нами интегральный подход к изучению псориаза, как мультифакториального заболевания, и Индивидуальная Информационная Карта больного, как неотъемлемый инструмент такого подхода, показали свою эффективность и информативность при исследовании псориаза, как в Московской выборке (гетерогенной), так и в Дагестанской популяции. Разработанная нами Индивидуальная Информационная Карта позволяет:

- выявить изменения в метаболизме при псориазе, которые характерны для мультифакториальных заболеваний в целом, а также для различных групп больных и отдельных пациентов;

- выяснить закономерности между клинической картиной, метаболическим статусом и генетическими детерминантами пациентов с псориазом;

- выявить закономерности между используемой фармакотерапией и метаболическим и генетическим статусом пациентов с псориазом;

- легко формализовать данные о различных вовлеченных системах и процессах, и представлять их в виде, доступном для моделирования;

- строить и уточнять модели без их существенных перестроек и проводить верификацию моделей.

8. Изучение информации на основе Индивидуальных Информационных Карт о сопутствующих заболеваниях у больных псориазом, с учетом ряда других параметров, позволит в будущем выйти на генные сети, детерминирующие псориаз и взаимосвязанные заболевания. Такой предварительный анализ сделан на основе генов системы иммунитета. Дальнейшие исследования отдельных систем патогенеза позволят выявить генные сети, определить сетевые взаимодействия при сложных мультифакториальных заболеваниях.

9. Разработанные в ходе исследования новые подходы к изучению псориаза как мультигенного мультифакториального заболевания, могут бьггь рекомендованы для исследования других хронических воспалительных патологий аутоиммунной природы.

Список публикаций

1. Милич М.В., Скрипкин Ю.К., Беднова В.Н., Пирузян АЛ., Федорова Д.Л., Милонова Т.И. Некоторые результаты молекулярно-генетических исследований культуральных и патогенного штаммов бледных трепонем // Вести. Дерматол. Венерол. - 1987. - № 12. - С. 19-23.

2. Милич М.В., Беднова В.Н., Пирузян АЛ., Федорова Д.Л., Милонова Т.И. Исследования культуральных бледных трепонем на молекулярно-генетическом уровне // Тез. докл. VIII науч.-практ. Конф. дермато-венерол. - Рязань, 1987. - С. 36-37.

3. Топоровский Л.М., Шапаренко М.В. Пирузян АЛ.Специфический гепатит у больного вторичным рецидивным сифилисом, симулирующий болезнь Боткина // Тез. докл. VTH науч.-практ. Конф. дермато-венерол. - Рязань, 1987. - С. 45.

4. Милич М.В., Скрипкин Ю.К., Федорова ДЛ., Топчиев Д.А., Беднова В.Н., Пирузян АЛ. Изучение капсулярной мозаичносш и особенностей адсорбционного взаимодействия бледных трепонем in vitro II Вестн. Дерматол. Венерол. - 1987. - № 9.-С. 28-33.

5. Милич М.В., Скрипкин Ю.К., Федорова Д.Л., Милонова Т.И. Пирузян АЛ. Модификация методики исследования биологии бледной трепонемы // Тез. докл. Пленума Всесоюзн. Научн. Общества дермато-венерол. - Ташкент, 1987. - С. 32.

6 Милич М.В., Скрипкин Ю.К., Федорова Д.Л., Пирузян А.Л., Милонова Т.И., Топчиев Д.А. Особенности воздействия синтетических полиамфолитов на капсулы патогенных и культуральных бледных трепонем // Вестн. Дерматол. Венерол. -1988,-№5.-С. 25-32.

7. Милич М.В., Пирузян АЛ. Электронно-микроскопическое исследование плазмидной ДНК различных штаммов бледной трепонемы // Молекулярная генетика, микробиолошя и вирусология. -1989. - Jfs 11. - С. 28-31.

8. Пирузян А.Л. Изучение плазмидного состава различных штаммов бледной трепонемы и их электронно-микроскопическое исследование // Аннотир Программа Научно-практич. Конф.: Актуальные вопросы дермато-венерологии. Запорожье, 1989.-С. 13.

9. Милич М.В., Федорова Д.Л., Скрипкин Ю.К., Антонов A.B., Пирузян АЛ. Влияние микрополей магнитоупорядоченных средств на бледную трепонему // Вестн. Дерматол. Венерол. - 198.1 .Na? - Г ?Л-?Я

РОС НАЦИОНАЛЬ<(/*>< БИБЛИОТЕКА С Петербург I

09 ПО мт

................. 4

10. Антоньев A.A., Пирузян АЛ. Изучение плазмидного состава различных штаммов бледной трепонемы и их электронно-микроскопическое исследование // Аннотир. Программа Научно-практич Конф.: Современные проблемы научной и практической дермато-венеролопш. - Днепропетровск, 1990. - С. 15.

11. Пирузян А.Л. Изучение плазмидного состава различных штаммов бледной трепонемы // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1990 - № 8. -С. 37-42.

12. Панова О.С., Пирузян АЛ., Медведева C.B., Бритун Ю.А., Савченко C.B., Суламанидзе М.А., Санчес Е.А. Лазеры нового поколения в эстетической дерматологии и пластической хирургии // Вестн. последипл. мед. образ. - 1998. -С. 33.

13. Панова О.С., Пирузян АЛ., Медведева C.B., Санчес Е.А. Лазеры нового поколения в хирургической дерматологии // Тез. докл. научно-практич. Конф.: Передовые технологии в эстетической дерматологии и пластической хирургии. -М., 1998.-С. 14-16.

14. Панова О.С., Бритун Ю.А., Савченко C.B., Суламанидзе М.А., Пирузян АЛ., Медведева C.B., Санчес Е.А., Скрипкин Ю.В. Трансконьюктивальная блефаропластика нижних век СО-2 лазером в сочетании с лазерной коррекцией кожи // Тез. докл. научно-практич. Конф.: Передовые технологии в эстетической дерматологии и пластической хирургии. - М., 1998. - С. 21-23.

15. Панова О.С., Пирузян А.Л., Медведева C.B., Санчес Е.А. Трансконьюктивальная блефаропластика нижних век в сочетании с лазерной коррекцией кожи // Анналы пластической, реконструктивной и эстетической хирургии. - 1998. - № 4. - С. 9-15.

16. Панова О.С., Пирузян А.Л., Медведева C.B., Санчес Е.А. Лазеры нового поколения в дерматохирургии // Тр.: Актуальные вопросы пластической, эстетической хирургии и дерматокосметологии. - 1998. - С. 137-142.

17. Панова О.С., Пирузян А.Л., Бритун Ю.А., Савченко C.B., Суламанидзе М.А., Медведева C.B., Санчес Е.А., Скрипкин Ю.В, Трансконьюктивальная блефаропластика нижних век в сочетании с лазерной коррекцией кожи // Тез. докл. конф.: The Baltic Symposium of Aesthetic Plastic and Reconstructive Surgery Int. Organists. - Таллин (Эстония), 1999. - С. 31.

18. Пирузян Л.А., Михайловский Е.М., Пирузян АЛ. Концепция лазерной гистохимической хирургии, как нетрадиционные направления в медицине // Физиология человека. - 1999. - Т. 25. - № 4. - С. 130-135.

19. Пирузян Л.А, Михайловский Е.М., Пирузян АЛ. Направления испытаний гистохимических красителей как потенциальных средств лазерной гистохимической хирургии // Физиология человека. - 1999. - Т. 25. - № 6. - С 105117.

20. Korsunskaya I.M., Piruzian A.L., Stelmakh D.K., Medvedeva S V., Ohanian Y.R. Two cases of psoriasis with different outcome in patients under prolonged UV-treatment and PUVA-therapy // Abst. П Int. Congress: Psoriasis From Gene to Clinic. - London (UK), 1999.-P. 995.

21.Batkaev EA., Korsunskaya I.M., Piruzian A.L., Medvedeva S.V., Stelmakh D.K., Ohanian Y.R. Mycoses in patients with psoriasis // Abst. П Int. Congress: Psoriasis From Gene to Clinic. - London (UK), 1999. - P. 116.

22 Panova O.S., Piruzian A.L., Medvedeva S.V., Korsounskaia I.M., Sanches Y.A., Ohanian Y.R., Stelmarkh D.K. The experience of using the botulinum toxin and natiral biological substance in patients that undergo laser facial skin resurfacing // Abst. Clin. Dermatol. 2000. - Vienna (Austria Center), 2000. - P. 88.

23. Korsounskaia I.M., Pirnziaii A.L., Medvedeva S.V. Terbinafine treatment in areas of the scalp and smooth skin // Abst. Clin. Dermatol. 2000. - Vienna (Austria Center), 2000. -P. 99.

24. Панова O.C., Бритун Ю.А, Санчес Е.А., Пирузян А.Л., Медведева С.В. Сравнительная оценка эффективности различных методов коррекции кожи // Тр. Международный симпозиум пластических хирургов и онкологов. - Одесса, 2000. -С. 121-124.

25. Панова О.С., Бритун Ю.А., Санчес Е.А., Пирузян АЛ., Медведева С.В., Савченко С.В., Петров И.А. Опыт лечения возрастных изменений лица методами пластической и лазерной хирургии в сочетании с инъекционными имплантантами // Тез. И Международного Конгресса по Пластической, Реконструктивной и Эстетической хирургии и Международной Научной Конференции по Эстетической Дерматологии. - М., 2001. - С. 105-106.

26 Панова О.С., Бритун Ю.А., Санчес Е.А , Пирузян АЛ., Медведева С.В., Савченко С В., Петров И.А Применение токсина ботулизма типа А в эстетической хирургии и клинической дерматологии // Анналы пластической, реконструктивной и эстетической хирургии. - 2001. - № 2. - С. 80-93.

27. Панова О.С., Пирузян АЛ., Бритун Ю.А., Санчес Е.А., Савченко С.В., Медведева С.В., Петров И.А., Скрипкин Ю.В. Опыт системного подхода к сочетанию классических оперативных вмешательств с применением инъекционных имплантов

и препаратов токсина ботулизма для лечепия возрастных изменений мягких тканей лица // Abstr. IV Int. Congress of Plastic and Reconstructive Surgery and Oncology, 1416 June. - Tallinn (Эстония), 2001. - P. 31.

28. Панова O.C., Пирузян Ah.JI., Бритун Ю.А., Санчес Б.А., Медведева C.B., Савченко C.B., Петров И.А., Скрипкин Ю.В. Эстетические аспекты комплексного лечения Рубцовых поражений кожи // Тез. Ш Международного конгресса по пластической реконструктивной и эстетической хирургии. - М., 2002. - С. 114.

29. Панова О.С., Петров И.А., Бритун Ю.А., Пирузян AJI. Опыт применения аутолипофилинга при инволюционных изменениях лица и других дефектах кожи // Анналы пластической, реконструктивной и эстетической хирургии. - 2002. - № 4. -С. 90-91.

30. Панова О.С., Пирузян А.Л., Бритун Ю.А., Санчес Е.А., Медведева C.B., Савченко С.В, Щербина Е.Ф., Петров И.А., Скрипкин Ю.В. Механическая дермабразия. Глубокий пилинг. Лазерная дермабразия. Показания и осложнения // Тез. докл. II Международного конгресса по косметологии и эстетической медицине KOSMETK-International. - M., 2003. - С. 57.

31. Панова О.С., Бритун Ю.А., Санчес Е.А., Пирузян А.Л., Медведева C.B., Савченко C.B., Щербина Е.Ф., Петров И.А., Скрипкин Ю.В. Роль дерматохирургических методов в дерматокосметологии // Актуальные вопросы пластической хирургии и дерматокосметологии. Тр. Международного Форума по пластической хирургии и дерматокосметологии. - М., 2003. - С. 26-27.

32. Панова О.С., Савченко C.B., Бритун Ю.А., Пирузян А.Л., Медведева C.B., Санчес Е.А., Скрипкин Ю.В., Петров И.А. Наш шестилетний опыт применения лазерной трансконьюнктивальной блефаропластики // Тез. докл. IV конгресса по пластической реконструктивпой и эстетической хирургии с международным участием: Пластическая Хирургия и Эстетическая Дерматология. - Ярославль, 2003.-С. 25.

33. Панова О.С., Бритун Ю.А., Медведева C.B., Санчес Е.А., Пирузян А.Л., Петров И.А. Оценка методов хирургической дерматологии для устранения врожденных и приобретенных дефектов кожи // Тез. докл. IV конгресса по пластической реконструктивной и эстетической хирургии с международным участием: Пластическая Хирургия и Эстетическая Дерматология. - Ярославль, 2003. - С. 115.

34. Piruzyan L.A., Mikhailovskiy Ye.M., Pînizyan A.L. Address substrates as promising targets for the laser histochemical surgery as a non-traditional line in medicine // Proc. of SPŒ: Laser Use in Oncology П. - Washington (USA), 2000. - P. 170-178.

35. Piruzyan L.A., Mikhailovskiy Ye.M., Piruzyan A.L. Histochemical strains as promising means for the laser histochemical surgery of a number of pathologies // Proc of SPIE: Laser Use in Oncology П. - Washington (USA), 2000. - P. 179-190.

36. Goldenkova I.V., Piruzyan A.L., Korsunskaya I.M., Saricisova M K., Komakhin R A., Schneider Yu.V, Radjabov M.O. Study of psoriasis patients in two different regions of Russia // Abst. European Congress on Psoriasis. -Paris (France), 2004. - P. 107.

37. Голденкова И.В., Пирузян Ah.JI., Саркисова М.К., Брускин С.А., Абдеев P.M., Махулаева А., Корсунская И.М. Метаболическая и генетическая паспортизация человека для ранней диагностики и индивидуальной фармакотерапии кожных заболеваний на примере витилиго и псориаза // Тез.докл. ГП Съезда ВОГиС: Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития - М., 2004. -С. 63.

38. Брускин С.А., Саркисова М.К., Пирузян АнЛ. Метаболическая и генетическая паспортизация человека для ранней диагностики и индивидуальной фармакотерапии // Тр. Междун. науч. конф.: Молекулярная генетика, геномика и биотехнология. - Минск, 2004. - С. 219-220.

39. Пирузян Ан.Л. Фармакогеномика: путь к индивидуализированной терапии // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2005. - Т. 10.

40. Пирузян Ан JL, Абдеев P.M. Молекулярная генетика псориаза // Вестник РАМН. -2005.-Т. 10.

41. Пирузян Л.А., Пирузян АнЛ., Голденкова И.В., Абдеев P.M., Корсунская И.М., Наседкина Т.В., Глотов А.С., Радкевич Л.А., Брускин С.А., Раджабов М.О. Метаболическая и генетическая паспортизация человека: унификация подходов и построение единой информационно-практической сети // Докл. РАН. - 2005.

42. Голденкова И.В., Пирузян АнЛ., Абдеев P.M., Хрипач Л.В, Раджабов М.О., Пирузян Л А О необходимости учета этнической компоненты при генетической и метаболической паспортизации человека (на модели популяции Дагестана) // Докл. РАН.-2005.

43. Пирузян АнЛ, Голденкова И.В., Абдеев P.M., Корсунская И.М., Сарвилина И.В., Горшкова Ю.В., Шин Е.Ф., Пирузян Л.А. Интегральный подход к генетической и метаболической паспортизации человека // Докл. РАН. - 2005.

44. Пирузян Л.А., Голденкова И.В., Корсунская И.М., Пирузян АЛ., Абдеев P.M., Матишов Д.Г., Сарвилина И.В., Горшкова Ю.В., Шин Е.Ф. Экогенетические аспекты при создании лекарственной части протоколов ведения пациентов с псориазом // Проблемы стандартизации в здравоохранении. - 2005.

45. Пирузян АнЛ., Абдеев Р.М. Генетический анализ больных псориазом с учетом этнической принадлежности // Тр. Междун. конф. и дискуссионного научного клуба: Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. - Ялта-Гурзуф, 2005. - С 34-36.

46. Пирузян Ан.Л , Голденкова И.В., Корсунская И.М., Хрипач Л.В., Радкевич Л.А., Раджабов М.О., Наседкина Т.В, Глотов А.С. Метаболическая и генетическая паспортизация человека для ранней диагностики и индивидуализированной терапии на примере псориаза // Тр. Междун. конф. и дискуссионного научного клуба: Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. - Ялта-Гурзуф, 2005. - С. 36-38.

47. Pirnzian A., Korsunskaya I., Goldenkova I., Hertsen A., Sarkisova M., Egorenkova L. Laser for the treatment of psoriasis // Proc. of SPIE: Laser use ta Oncology. -Washington (USA), 2005. - Vol. 4060. - P. 329-335.

48. Пирузян AhJI., Абдеев P.M., Саркисова M.K. Роль фармакогенетики и фармакогеномики в дерматологии // Клиническая дерматология и венерология. -2005.-№ 3-С. 7-14.

49. Жукова О.В., Шнейдер Ю.В., Морозова И.Ю., Шильникова И.Н., Семиков А.В., Голденкова И.В., Саркисова М.К., Раджабов М., Маркарова Е.В., Пирузян АнЛ. Генетические маркеры и псориаз в трех этнических группах Дагестана // Генетика. -2005.-Т. 12.

50. Корсунская И.М., Пирузян АнЛ., Пушнцев А.Ю. Лечение тяжелых форм псориаза (учебное пособие). - 2005 (в печати).

51.Путинцев А.Ю., Корсунская И.М., Пирузян АЛ., Суворова К.Н. Патент на изобретение № 2218172. Способ лечения псориаза. 10 декабря 2003.

52 Григорьев С M , Демиденко Г.И., Пирузян АЛ. Патент на изобретение № 2237499. Способ устранения косметических недостатков и дефектов кожи, омоложения кожи лица и шеи, лечения дерматологических заболеваний и устройство для его осуществления. 10 октября 2004.

БЛАГОДАРНОСТИ

Данная работа выполнена в докторантуре Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН и на базе Лаборатории функциональной геномики Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. Автор выражает глубокую благодарность руководителям и сотрудникам этих коллективов за предоставленную возможность проведения теоретических и экспериментальных исследований, ставших основой данной диссертации.

Автор выражает искреннюю и глубокую признательность своим научным консультантам - доктору биологических наук Ирине Васильевне Голденковой и доктору медицинских наук Ирине Марковне Корсунской за ценные научные консультации, за внимание, неоценимую помощь и всемерную поддержку.

Автор выражает искреннюю благодарность доктору медицинских наук, профессору Ольге Сергеевне Пановой, под руководством которой стало возможным освоение работы с лазерами и благодаря которой осуществлялось мое становление как специалиста в области дерматологии и эстетической хирургии.

Автор благодарен руководству Министерства здравоохранения Республики Дагестан и руководителям РКВД г. Махачкалы и больниц районных центров за неоценимую помощь в проведении эпидемиологических исследований в рамках Договора о научном сотрудничестве.

Автор выражает искреннюю благодарность кандидату биологических наук Татьяне Васильевне Наседкиной за возможность принять участие в разработке микрочипа на базе Центра биологических микрочипов Института молекулярной биологии РАН, а также доктору биологических наук Людмиле Александровне Радкевич, Неле Эмировне Пынько и Сергею Александровичу Брускину за возможность фенотшшрования и генотипирования по КАТ2 гену. Глубокая благодарность кандидату биологических наук Рустаму Муратовичу Авдееву за ценные консультации и помощь в области биоинформатики, доктору биологических наук Людмиле Васильевне Хрипач за помощь в обработке и обсуждении результатов работы, кандидату биологических наук Ольге Владимировне Жуковой за помощь в определении полиморфизма крови

Спасибо коллегам и моим друзьям к.б.н. Ларисе Васильевне Волковой, к.б.н. Роману Александровичу Комахииу, к.б.н. Наталье Юрьевне Ковальской, Марине Саркисовой, Софье Бигвава, Алексею Путинцеву за поддержку, помощь и дружеское отношение.

»15124

РНБ Русский фонд

2006-4 12834

1

\

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N00510ot01.12.99 г. Подписано к печати 19.07.2005 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл.2,0.Тираж 100 экз. Заказ 439. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Заболевания с наследственной предрасположенностью делят на две группы: моногенные и полигенные. Моногенные заболевания развиваются вследствие изменений лишь в одном гене, которые приводят к возникновению патологического процесса. Как правило, ген, вовлеченный в патогенез моногенных I заболеваний, достаточно легко идентифицируется и для успешного лечения таких болезней одно и тоже лекарство можно применять для всех индивидуумов. Однако такой подход не применим для лечения сложных, называемых также мультифакториальными, патологий, в развитии которых участвует целый ряд генов, полиморфные варианты которых определяют риск и тяжесть заболевания. Изучение этиологии, патогенеза, а также генетический анализ мультифакториальных заболеваний - трудные задачи.

Ввиду того, что такие патологии обусловлены сочетанным влиянием многих аллеломорфов разных локусов, клиницисты наблюдают широкий полиморфизм патологических состояний, т.е. наблюдается непрерывный спектр переходов от субклинических форм к формам с ярко выраженными клиническими симптомами. Истинная тяжесть заболевания определяется индивидуальной клинической картиной пациента, которая обусловлена уникальностью процессов метаболизма каждого индивидуума, определяемой его генетическим статусом. Следовательно, для эффективного лечения необходим индивидуальный подход к каждому пациенту с мультифакториальной патологией.

Известно, что существует генетическая дифференциация популяций различных национальностей по частотам и спектру генов наследственных заболеваний. Следует отметить, что во многих популяциях проявляется значительная степень генетической гетерогенности, которая затрудняет проведение генетического анализа, поэтому при изучении наследственных заболеваний необходимы широкие эпидемиологические исследования, в которые должны быть включены большие выборки индивидуумов со схожим этническим фундаментом, территориальной и культурной изоляцией. Адекватный выбор модельной популяции является залогом успеха при поиске и анализе генов-кандидатов и генетических маркеров в пределах групп с мультифакториальной патологией. Модельная популяция должна характеризоваться низкой гетерогенностью, схожим этническим фундаментом, наличием «ядерных» крупных семей с большим числом потомков и знанием генеалогии.

Поиски генетических маркеров, наличие которых в организме обусловливает восприимчивость организма человека к определенному заболеванию, ведутся на протяжении не одного десятка лет и имеют большее значение. Это объясняется тем, что только генетический подход позволяет приблизиться к пониманию биологической сущности заболеваний, а получаемые при таком подходе данные дают возможность выделять группы риска развития исследуемой патологии. При этом следует принимать во внимание и индивидуальный полиморфизм генов, продукты которых могут и не иметь прямого отношения к данной патологии. А именно, индивидуальные генетические особенности организма, определяющие кинетику метаболических превращений лекарственных препаратов, и, следовательно, гетерогенность в реакции пациентов на лекарственные препараты, а также в отношении побочных эффектов лекарственных препаратов. Факторы индивидуального ответа пациента на применение лекарственных препаратов, как и факторы индивидуальной предрасположенности человека к различным заболеваниям, требуют разработки научных основ для определения критериев соответствующей лекарственной терапии для каждого отдельного пациента, с учетом этнической принадлежности.

В наших исследованиях в качестве модельной мультифакториальной патологии выступает одно из основных по распространенности заболеваний -псориаз. Псориаз имеет все атрибуты мультифакториальной патологии -запускается триггерами внешней среды у индивидуумов с генетической предрасположенностью.

В настоящее время в России в основе диагностике псориаза лежат традиционные общеклинические методы обследования. Такие методы, не утратившие своей диагностической ценности и сегодня, позволяют четко определять форму и стадию развития псориаза, а также степень распространения патологического процесса. Однако, только эти критерии не могут являться основанием для выбора тактики лечения, так как истинная клиническая картина индивидуума определяется прежде всего его генетическим и метаболическим статусом. Вероятно, индивидуальные псориатические локусы могут иметь различную степень выраженности для пациентов с псориазом, имеющих различный клинический фенотип и/или этническую принадлежность. Для того чтобы определить фенотип-специфичные гены заболевания, необходимо применять генетический анализ к различным клиническим подгруппам больных, при этом клинический фенотип каждого пациента должен быть охарактеризован досконально. В связи с этим, требуется подключение новых экспериментальных подходов, целью которых является молекулярно-биологическое и физиолого-биохимическое описание патологии на уровне метаболизма конкретного индивидуума. Эти исследования должны быть первоначально направлены на поиск метаболических маркеров внутри группы пациентов со схожей клинической картиной, что позволит проводить быструю классификацию принадлежности индивидуумов к той или иной группе. Дальнейшие исследования должны быть связаны с поиском индивидуальных метаболических маркеров внутри каждой группы, что позволит выявить «горячие точки» метаболической сети патологии, в целом, меняющих режим ее «нормального» функционирования (разрыв в сети, переключение путей и т.д.) для каждого индивидуума. Тщательная корректная характеристика клинического фенотипа пациента важна и необходима для того, чтобы минимизировать вклад в гетерогенность заболевания, поскольку псориаз, как мультифакториальная патология, характеризуется разнообразными клиническими картинами и при этой патологии выделяют различные подтипы заболевания. Анализ данных литературы и собственных данных убедительно продемонстрировал необходимость разработки новых критериев для оценки клинической картины и метаболического статуса пациентов с псориазом, что важно для дальнейшего генетического анализа этой патологии.

Современные терапии псориаза либо относительно неэффективны, либо обладают неприемлемыми побочными эффектами, что ограничивает их использование. В связи с этим имеется острая необходимость разработки новых терапий псориаза, что возможно только за счет лучшего понимания механизма возникновения этого заболевания.

В целом, несмотря на достаточно большое количество публикаций, в России практически полностью отсутствуют эпидемиологические исследования распространенности псориаза по регионам. Более того, при изучении патогенеза псориаза практически полностью игнорируется этническая предрасположенность индивидуума, страдающего этим заболеванием. Сведения о популяционной частоте псориаза противоречивы, что может быть обусловлено применением в разных странах различных методов оценки.

Учитывая отмеченные выше трудности в исследовании мультифакториальных заболеваний, и, в частности, псориаза, необходимыми являются разработка и применение инструмента для получения унифицированных данных, которые можно легко формализовать, и создавать на основе этих данных стандартизированные (унифицированные) базы данных о различных мультифакториальных патологиях. Для устранения противоречий необходимо стандартизировать методы оценки распространенности заболевания. В связи с этим, как для изучения патогенеза патологий, так и для диагностики и эффективного лечения, необходимо скоординировать клинические, генетические и физиолого-биохимические исследования у индивидуумов с той или иной сложной патологией (в том числе псориазом) с целью унификации подходов и построения единой информационно-практической сети данной патологии.

Цель диссертационной работы: Разработать и предложить интегральный подход для генетической и метаболической паспортизации индивидуумов с целью ранней диагностики и индивидуализированной фармакотерапии мультифакториальной патологии, на примере псориаза.

Для выполнения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: 1. Провести широкомасштабный поиск и анализ данных литературы и собственных наблюдений в клинике с целью определения методических 11 подходов, которые используются для оценки клинической картины пациентов с псориазом.

2. Разработать новые критерии для оценки клинической картины и метаболического статуса пациентов с псориазом, а также для генетического анализа этой патологии. Новые критерии должны:

- более адекватно отражать клиническую картину и, . следовательно, метаболический статус каждого пациента с псориазом;

- позволять проводить генетический анализ исследуемой патологии, в целом, и родословных семей, в частности;

- учитывать этническую принадлежность пациента;

- учитывать факторы окружающей среды, которые могут быть триггерами I патологии;

- проводить описание всех систем организма с учетом тех систем, вклад которых в патологию нелегко предсказать и/или идентифицировать;

- учитывать индивидуальный ответ пациента на применение лекарственных препаратов;

- позволять получать унифицированные данные, которые можно легко формализовать, и создавать на их основе стандартизированные (унифицированные) базы данных о мультифакгориальной патологии.

3. Разработать Индивидуальные Информационные Карты (ИИК) индивидуумов на основе новых предложенных критериев как инструмент для сбора информационного материала о пациентах с мультифакгориальной патологией.

4. На основе данных литературы выбрать удобную и адекватную модельную популяцию для проведения генетико-эпидемиологического исследования с целью изучения роли этнической компоненты и наследственности в этиологии и патогенезе мультифакториальных заболеваний, таких как псориаз. Апробировать предложенные новые критерии ИИК для сбора и статистического анализа информационного материала у пациентов с псориазом из различных популяционных выборок.

5. Определить особенности распространения классических генетических маркеров (ABO, Rhesus, MN, Kell, P, Lewis, HP, TF, C'3, GC, GLO, ESD, 6PGD, ACP) у практически здорового населения и больных псориазом с учетом этнической принадлежности.

6. Изучить эффективность проводимой терапии больных псориазом в зависимости от ряда параметров (Тип I и Тип II псориаза, возраст и пол пациента, форма псориаза, биохимические показатели).

7. Разработать основу для создания микрочипов быстрого скрининга генотипа и установления фенотипа ацетилирования с целью индивидуального подбора лекарственных препаратов в клинике. Для этого:

- провести сбор информационного и клинического материала у здоровых и пациентов с псориазом;

- определить фенотип ацетилирования и особенности распределения фенотипа ацетилирования в группах здоровых и пациентов с псориазом;

- выявить мутации NAT2 гена, приводящие к изменению фенотипа ацетилирования и характерные для населения различных регионов России;

- определить наличие взаимосвязи фенотипа и генотипа ацетилирования с проявлением псориаза, а также эффектом используемой фармакотерапии.

8. Разработать основу интегрального подхода для генетической и метаболической паспортизации пациентов с псориазом, которая позволит:

- выявить изменения в метаболизме при псориазе, которые характерны для данных заболеваний в целом, а также для различных групп больных и отдельных пациентов;

- выявить общие, групповые и индивидуальные генетические детерминанты псориаза;

- выяснить закономерности между клинической картиной, метаболическим статусом и генетическими детерминантами пациентов с псориазом;

- выявить закономерности между используемой фармакотерапией и метаболическим и генетическим статусом пациентов с псориазом. Научная новизна работы. Разработан и предложен интегральный подход для генетической и метаболической паспортизации индивидуумов с целью диагностики и индивидуализированной фармакотерапии псориаза. В качестве инструмента для сбора информационного материала о пациентах с мультифакториальной патологией разработаны ИИК с новыми критериями оценки.

С целью определения роли этнической компоненты в развитии псориаза учтена этническая принадлежность пациентов в Российской популяции. В качестве удобной и адекватной модельной популяции для проведения генетико-эпидемиологического исследования и определения этнического фактора и наследственности в этиологии и патогенезе псориаза предложена популяция Республики Дагестан, состоящая из более чем 10 этнически обособленных групп.

• - ' 14

На основании результатов проведенного исследования заболеваемости псориазом в Дагестане удалось показать существенные различия в проявлении этой патологии между различными этносами, населяющими этот регион России. При определении особенности распространения классических генетических маркеров крови у практически здорового населения и у больных псориазом с учетом их этнической принадлежности показано, что в суммарной группе больных псориазом в Дагестане частота фенотипа Le (a~b~) группы крови Lewis достоверно выше, чем в контрольной группе.

С целью установления корреляции заболевания псориазом с NAT2 фенотипом проведено фенотипирование и генотипирование больных и создан на основе полученного материала гелевый биологический микрочип, который даст возможность в дальнейшем продолжить исследования без фенотипирования, на основе генетического полиморфизма по данному генетическому маркеру.

Показано, что препарат глутоксим оказывает положительный эффект только в группе пациентов с ранним типом возникновения псориаза.

Практическая значимость работы. Разработаны критерии оценки индивидуального риска заболевания псориазом, необходимые для осуществления дифференцированного подхода к профилактике и лечению этой сложной патологии и ее осложнений в зависимости от наследственной предрасположенности. В комплексную терапию псориаза включен отечественный препарат Глутоксим (патентное изобретение № 2218172). Разработанная и предложенная ИИК может быть использована для исследования других хронических воспалительных патологий аутоиммунной природы с целью превентивной терапии на этапе бессимптомного проявления таких патологий.

Основные положения, выдвигаемые на защиту.

1. Для генетической и метаболической паспортизации индивидуумов с целью ранней диагностики и индивидуализированной фармакотерапии псориаза как мультифакториальной патологии, необходимо введение новых критериев для оценки клинической картины и метаболического статуса пациентов с псориазом.

2. Новые критерии для оценки клинической картины и метаболического статуса пациентов с псориазом позволяют выявлять более полную клиническую картину патогенеза псориаза для каждого индивидуального пациента с учетом его этнической принадлежности, а также являются важными для генетического анализа этой патологии.

3. Индивидуальная Информационная Карта (ИИК) является эффективным инструментом для сбора информации о пациентах с мультифакториальной патологией.

4. Популяция Республики Дагестан является удобной и адекватной модельной популяцией для исследования мультифакториальных заболеваний, таких как псориаз, и может быть включена для исследования роли наследственности в этиологии и патогенезе этого заболевания, а также и других мультифакториальных заболеваний.

5. Классические генетические маркеры могут использоваться для дифференциации пациентов с псориазом с учетом их этнической принадлежности и с целью ранней диагностики и индивидуализации лечения.

6. Экспериментальный образец гелевого биочипа для скрининга полиморфизма гена ЫАТ2 позволяет четко дискриминировать однонуклеотидные замены, приводящие к изменению фенотипа ацетилирования, и выявлять взаимосвязь между фенотипом, генотипом КАТ2 гена и предрасположенностью к заболеваниям, а также индивидуальным ответом пациента на действие лекарственных препаратов.

7. Разработанный интегральный подход генетической и метаболической паспортизации пациентов с псориазом позволяет:

- выявлять изменения в метаболизме при псориазе, которые характерны для мультифакториальных заболеваний в целом, а также для различных групп больных и отдельных пациентов;

- выявлять общие, групповые и индивидуальные генетические детерминанты псориаза;

- выяснять закономерности между клинической картиной, метаболическим статусом и генетическими детерминантами пациентов с псориазом;

- выявлять закономерности между используемой фармакотерапией и метаболическим и генетическим статусом пациентов с псориазом.

выводы

1. В ходе проведенного исследования разработаны новые подходы к оценке метаболического и генетического статуса больных псориазом. Впервые разработанная Индивидуальная Информационная Карта (ИИК), включающая более 50 параметров, в том числе и ряд новых критериев, позволяет выявлять более полную клиническую картину патогенеза псориаза для каждого индивидуального пациента с учетом его этнической принадлежности.

2. Впервые на основании результатов проведенного исследования заболеваемости псориазом в Дагестане удалось показать существенные различия в проявлении псориаза между различными этносами, населяющими Дагестан, что расширило спектр проявлений данной патологии и привнесло ряд существенных дополнительных параметров при анализе псориаза.

3. Впервые проведенное изучение полиморфизма по группам крови у больных псориазом трех различных этнических групп Дагестана свидетельствует о необходимости поиска новых генетических маркеров с целью выявления предрасположенности индивидуумов к псориазу.

4. На примере псориаза показано, что для исследования мультифакгориальных заболеваний с целью выявления генетических корреляций и роли наследственности в этиологии и патогенезе Республика Дагестан является удобной и адекватной модельной популяцией. В основе такой модели лежат такие факторы, как наличие более 10 различных обособленных этнических групп, отсутствие (или малое количество) межэтнических браков, доступность информации и легко прослеживаемые родословные.

5. Выявлена корреляция между клиническим эффектом и типом возникновения псориаза (ранний или поздний). Показано, что препарат Глутоксим оказывал положительный эффект только в группе пациентов с ранним типом возникновения псориаза.

6. Впервые проведенный анализ клинического материала здоровых индивидуумов и пациентов с псориазом по генетическому маркеру (МАТ2) позволяет сделать предварительный вывод о корреляции заболевания псориазом с NAT2 фенотипом и генетическим полиморфизмом. Созданный на основе полученного материала гелевый микрочип дает возможность продолжить исследования без фенотипирования по генетическому полиморфизму пациентов с целью установления корреляции предрасположенности к заболеванию псориазом с генотипом.

7. Впервые разработанный и предлагаемый нами интегральный подход к изучению псориаза, как мультифакториального заболевания, и Индивидуальная Информационная Карта больного, как неотъемлемый инструмент такого подхода, показали свою эффективность и информативность при исследовании псориаза, как в Московской выборке (гетерогенной), - так и в Дагестанской популяции. Разработанная нами Индивидуальная Информационная Карта позволяет:

- выявить изменения в метаболизме при псориазе, которые характерны для мультифакториальных заболеваний в целом, а также для различных групп больных и отдельных пациентов;

- выяснить закономерности между клинической картиной, метаболическим статусом и генетическими детерминантами пациентов с псориазом;

- выявить закономерности между используемой фармакотерапией и метаболическим и генетическим статусом пациентов с псориазом;

- легко формализовать данные о различных вовлеченных системах и процессах, и I представлять их в виде, доступном для моделирования;

- строить и уточнять модели без их существенных перестроек и проводить верификацию моделей.

8. Изучение информации на основе Индивидуальных Информационных Карт о сопутствующих заболеваниях у больных псориазом, с учетом ряда других параметров, позволит в будущем выйти на генные сети, детерминирующие псориаз и взаимосвязанные заболевания. Такой предварительный анализ сделан на основе генов системы иммунитета. Дальнейшие исследования отдельных систем патогенеза позволят выявить генные сети, определить сетевые взаимодействия при сложных мультифакториальных заболеваниях.

9. Разработанные в ходе исследования новые подходы к изучению псориаза как мультигенного мультифакгориального заболевания, могут быть рекомендованы для исследования других хронических воспалительных патологий аутоиммунной природы.

БЛАГОДАРНОСТИ

Данная работа выполнена в докторантуре Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН и на базе Лаборатории функциональной геномики Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. Автор выражает глубокую благодарность руководителям и сотрудникам этих коллективов за предоставленную возможность проведения теоретических и экспериментальных исследований, ставших основой данной диссертации.

Автор выражает искреннюю и глубокую признательность своим научным консультантам — доктору биологических наук Ирине Васильевне Голдснковой и доктору медицинских наук Ирине Марковне Корсунской за ценные научные консультации, за внимание, неоценимую помощь и всемерную поддержку.

Автор выражает искреннюю благодарность доктору медицинских наук, профессору Ольге Сергеевне Пановой, под руководством которой стало возможным освоение работы с лазерами и благодаря которой осуществлялось мое становление как специалиста в области дерматологии и эстетической хирургии.

Автор благодарен руководству Министерства здравоохранения Республики Дагестан и руководителям РКВД г. Махачкалы и больниц районных центров за неоценимую помощь в проведении эпидемиологических исследований в рамках Договора о научном сотрудничестве.

Автор выражает искреннюю благодарность кандидату биологических наук Татьяне Васильевне Наседкиной за возможность принять участие в разработке микрочипа на базе Центра биологических микрочипов Института молекулярной биологии РАН, а также доктору биологических наук Людмиле Александровне Радкевнч, Неле Эмнровне Пыиько и Сергею Александровичу Брускпну за возможность фенотипирования и генотипирования по ЫАТ2 гену. Глубокая благодарность кандидату биологических наук Рустаму Муратовнчу Абдееву за ценные консультации и помощь в области биоинформатики, доктору биологических наук Людмиле Васильевне Хрнпач за помощь в обработке и обсуждении результатов работы, кандидату биологических наук Ольге Владимировне Жуковой за помощь в определении полиморфизма крови.

Спасибо коллегам и моим друзьям к.б.н. Ларисе Васильевне Волковой, к.б.н. Роману Александровичу Комахнну, к.б.н. Наталье Юрьевне Ковальской, Марине Саркнсовой, Софье Бигвава, Алексею Путинцсву за поддержку, помощь и дружеское отношение.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании данных литературы и собственных наблюдений в клинике продемонстрирована необходимость введения унифицированных критериев для оценки клинической картины, метаболического статуса пациента и для проведения генетического анализа мультифакториальных патологий. Показано, что разработанные и предложенные новые критерии для индивидуального описания пациента с псориазом как мультифакториальной патологией обеспечивают необходимой информацией, как о патологическом процессе, так и о метаболическом статусе конкретных индивидуумов. Помимо этого новые критерии позволяют: учитывать наследственную предрасположенность к заболеванию, факторы окружающей среды и образ жизни индивидуума; получать унифицированные данные, которые можно легко формализовать, и создавать на их основе стандартизированные (унифицированные) базы данных о мультифакториальной патологии.

На основании теоретических разработок, подтвержденных экспериментальными данными, показана возможность предложенной ИИК для создания унифицированной базы данных о пациентах с мультифакториальной патологией на примере псориаза, а также возможность предложенной ИИК для выявления общих, групповых и индивидуальных особенностей исследуемой патологии. Пополняя и используя базу данных, полученную с помощью унифицированных критериев ИИК, в дальнейшем возможно разработать общий алгоритм для точного описания клинических форм псориаза и метаболического статуса пациента. Кроме этого, ИИК с унифицированными критериями является корректным инструментом для эпидемиологических исследований и генетического анализа патологии. Следует особо подчеркнуть, что использование совокупности унифицированных критериев для описания пациента с мультифакториальной патологией позволит проводить сравнительный анализ экспериментальных данных, получаемых различными исследователями, как в области изучения патогенеза и генетики патологии, так и в области индивидуального ответа пациента на применение лекарственных препаратов.

Полученные данные показали важную роль этнической компоненты в наследуемости такой мультифакториальной патологии, как псориаз. Проведенные нами исследования позволяют заключить следующее: популяция Республики Дагестан является удобной и адекватной модельной популяцией для исследования мультифакториальных заболеваний, таких как псориаз, и может быть включена для исследования роли наследственности в этиологии и патогенезе этого заболевания, а также и других мультифакториальных заболеваний. Эти выводы базируются на следующих данных: низкая гетерогенность популяции в отдельных этнических группах, схожий этнический фундамент (браки, в основном, заключаются внутри этнических групп), наличие «ядерных» крупных семей с большим числом потомков и знанием генеалогии (есть возможность проведения клинико-гениалогических исследований и анализа сибсов). Разработанная и апробированная нами ИИК дает возможность выявить аккумулирование повторных случаев аналогичного заболевания среди родственников изученных семей при сопоставлении с их распространенностью в популяционном контроле из той же самой этнотерриториальной группы.

Апробированы различные подходы к лечению псориаза. На основании полученных данных показано, что при применении препарата Глутоксим время пребывания пациента в стационаре короче в среднем на 10 дней, по сравнению с контрольной группой. Отдаленные результаты наблюдения показали следующее: у пациентов с Типом I псориаза после лечения препаратом Глутоксим ремиссия была значительно длиннее, и последующие рецидивы были менее активны.

Полученные данные по лечению больных псориазом продемонстрировали необходимость разработки индивидуальных схем терапии с учетом метаболических и клинических параметров и необходимость исследования новых лекарственных средств для эффективной терапии псориаза.

Проведенный анализ клинического материала здоровых индивидуумов и пациентов * с псориазом по классическому генетическому маркеру (NAT2) позволяет сделать предварительный вывод о корреляции заболевания псориазом с NAT2 фенотипом. Выявлена взаимосвязь между фенотипом (быстрый, средний, медленный) и генотипом (наличие той или иной мутации в гене NAT2) ацетилирования. Установлены мутации в гене NAT2, которые строго характеризуют соответствующий фенотип ацетилирования. Созданный на основе полученного материала гелевый микрочип дает возможность продолжить исследования без фенотипирования по генетическому полиморфизму NAT2 пациентов с целью установления корреляции предрасположения к заболеванию псориазом с генотипом. Предложенный подход, заключающийся в установлении взаимосвязи между фенотипом (быстрый, средний, медленный) и генотипом (наличие той или иной мутации в гене NAT2) ацетилирования позволит выявить мутации NAT2 гена, приводящие к изменению фенотипа ацетилирования и характерные для населения различных регионов России.

Разработан и предложен интегральный подход для генетической и метаболической паспортизации индивидуумов с целью диагностики и индивидуализированной фармакотерапии псориаза. Изучение информации на основе Индивидуальных Информационных Карт о сопутствующих заболеваниях у больных псориазом, с учетом ряда других параметров, а также изучение генетического полиморфизма, позволят в будущем выйти на генные сети, детерминирующие псориаз и взаимосвязанные заболевания. Исследования отдельных систем патогенеза позволят выявить не только генные сети, но и определить сетевые взаимодействия при сложных мультифакгориальных заболеваниях.