Автореферат и диссертация по медицине (14.00.32) на тему:Структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов человека и животных при воздействии факторов космического полета и модельных экспериментов

¡~ I о о л

2 4 МАР 1997

на правах рукописи

ЯРЛЫКОВ А ЮЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА

Структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов человека и животных при воздействии факторов

космического полета и модельных экспериментов

14.00.32. — авиационная, космическая и морская медицина

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Москва, 1997

Работа выполнена в Государсггенном Научном Центре РФ- Институте медико-биологических проблем.

Научный руководитель -кандидат биологических наук, С.М. Иванова.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Е.Г.Козинец кандидат медицинских наук Л.Б. Буравкоза.

Ведущая организация - Российский Государственный научно-исследовательский испытательный Центр подготовки космонавтов имени Ю.А. Гагарина

Зашита состоится "_" _ 1997 г. в_часов на заседании

диссертационного совета К 074.31.01. по присуждению ученой степени кандидата наук в Государственном Научном Центре РФ- Институте медико-биологических проблем ( 123007, Москва, Хорошевское шоссе, 76а ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ- Института медико-биологических проблем.

Автореферат разослан "_"_ 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Пономарева И.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Имеющиеся данные об изменении эндокринно-метаболических взаимоотношений у человека в условиях космического полета и в период реадаптации к земной гравитации (Леон Г.А. и др. 1979, Коваленко Е.А., 1980, Швец В.И. и др., 1984; Тигранян P.A., 1985; Газенко О.Г., ГригорьевА;И., и др. 1986; Ушаков A.C. и др., 1986) свидетельствуют о необходимости изучения клеточных молекулярных механизмов адаптации, в основе которых лежит изменение метаболизма и физико-химических свойств мембран, играющих активную роль в передаче сигналов межклеточного взаимодействия, обеспечении ионного гомеостаза, поддержании иммунного статуса организма.

Форменные элементы крови, в том числе эритроциты, благодаря корреляционному единству с клеточными структурами других органов и тканей, являются удобной моделью для исследования сдвигов на мембранном уровне, выявлению механизмов клеточной адаптации к экстремальным воздействиям и разработки на этой основе средств, повышающих адаптационные возможности организма.

В настоящее время получены немногочисленные данные о влиянии факторов космического полета на эритроциты. Исследования Leach С. и Johnson Р., 1989, показали снижение количества эритроцитов и увеличение числа измененных форм эритроцитов у членов экипажа "Skylab". Dintenfass Е., 1989, выявил увеличение агрегации суспензии эритроцитов в космическом полете. Исследования на животных, экспонированных на биоспутниках "Космос - 782" и "Космос - 936" ( Леон Г.А. и др. 1978; Серова Л.В. и др. 1982) выявили увеличение степени гемолиза эритроцитов. В исследованиях Ивановой С.М. с соавт. ( 1981, 1985, 1990, 1992) показано, что адаптация организма к условиям космического полета и последующему возвращению на Землю приводит к сдвигам в энергетическом обмене эритроцитов и 'возможному нарушению мембранных структур, о чем свидетельствуют изменения функциональной активности клетки.

В литературе имеются экспериментальные данные о влиянии на интегральную целостность и функциональную активность клеток отдельных факторов космического полета и модельных экспериментов - гипокинезии (Ушаков A.C. и др., 1986; Иванова С.М. , Соминский В.Н. и др., 1990),

замкнутого пространства с повышенным содержанием аммиака (Мухамедиева Л.В. И др. 1981)

Известно, что форма клеток и их функциональное состояние в значительной мере определяются физико-химическими свойствами клеточной мембраны, которые, в свою очередь, зависят от липидной композиции мембраны. Липидный, фосфолипидный и жирнокислотный состав определяет фазовое состояние мембраны, ее проницаемость ( Бурлакова Е.Б. 1977), взаимодействие белковых и липидных компонентов ( Ворохов Х.А., 1979) активность ферментов ( БЫпкгку М. ег. а1., 1978, 1979).

По мере увеличения длительности космических полетов выяснение причин снижения эритроцитарной массы и изменения функциональной активности клеточной мембраны приобретают все большее значение.

Принимая во внимание вышеизложенное, а также возможность использования эритроцитов в качестве удобной клеточной модели, становится ■ понятным целесообразность исследования структурно-функционального состояния мембран эритроцитов, которое позволит не только оценить функциональное состояние красной крови, но и выявить возможные механизмы клеточной адаптации к влиянию факторов космического полета, степень дестабилизации мембран, что может стать основой для рекомендаций адекватных профилактических мероприятий.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение структурно-функционального состояния мембран эритроцитов человека и животных при действии факторов космического полета и модельных экспериментов.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Определить границы физиологической нормы для липидногр и фосфолипшшого состава мембран эритроцитов для категории людей, проходящих подготовку к космическому полету, и сравнить эти величины со 'среднестатистической клинической нормой .

2. Изучить изменение параметров липидного и фосфолипидного состава эритроцитарных мембран космонавтов в ходе космического полета.

3. Исследовать показатели структурно-функционального состояния мембран эритроцитов космонавтов после завершения длительных космических полетов.

4. Исследовать динамику липидного, фосфолипидного и жирнокислотного состава мембран эритроцитов и кислотную резистентность клеток в экспериментах моделирующих действие факторов космического полета (антаортостатическая 120-ти суточная гипокинезия с участием женщин-испытателей с оценкой эффективности применения комплекса профилактических мероприятий по изучаемым показателям; операторская деятельность мужчин-испытателей . в условиях длительной, изоляции в замкнутом гермообъеме).

5. Провести сравнительный анализ липидного и фосфрлипидного состав мембран эритроцитов у человека и животных в норме, после 14-ти суточного космического полета (крысы) и 14-ти суточной антиортостатической гипокинезии (обезьяны )

Научная новизна работы. В результате клинико-физиологического обследования космонавтов впервые получены границы нормальных значений показателей липидного и фосфолипидного состава мембран эритроцитов для данной группы обследуемых. Установлено, что липидный состав мембран эритроцитов космонавтоз характеризуется меньшим содержанием холестерина и повышенным уровнем триглицеридов, эфиров холестерина и фосфатидной кислоты по сравнению со среднестатистической нормой.

Впервые проведено изучение структурно-функционального состояния мембран эритроцитов у космонавтов после завершения длительных космических полетоз продолжительностью 125-438 суток. Выявлена зависимость обнаруженных сдвигов в состоянии мембран эритроцитов от продолжительности космических полетоз. После космического полета продолжительностью 4-5 месяцев в мембранах эритроцитов у космонавтов отмечали снижение относительного содержания холестерина на фоне повышенного уровня фосфолипидов. Напротив, после завершения более длительных полетов 5-7 месяцев относительное содержание холестерина в мембране было достоверно повышено, доля фосфолипидов - снижена по сравнению с фоновыми значениями. Активность транспортных АТФ-аз снижалась после полетов продолжительностью менее 5 и более 7 месяцев и наоборот увеличивалась после космических экспедиций продолжительностью 5-7 месяцев.

Проведено изучение липидной композиции мембран эритроцитов у космонавтов в ходе космического полета. Обнаружено, что сдвиги в

содержании липидных и фосфолипндных фракций у космонавтов в полете не имели одинаковой направленности с изменениями, выяаленными в послеполетных обследованиях и выражались в снижении уровня холестерина и накоплении эфиров холестерина при неизменном уровне фосфолипидов.

Впервые исследована динамика показателей структурно-функционального состояния эритроцитарных мембран у женщин в ходе 120-ти суточной антиортостатической гипокинезии и в периоде восстановления.

Установлено, что длительное ограничение подвижности с антиортостатическим положением тела приводит к увеличению относительного содержания фосфолипидов и снижению холестерина в условиях эксперимента и возрастанию доли холестерина, триглииеридов и неэстерифицированных жирных кислот в периоде восстановления. На основании полученных данных показан корригирующий эффект применения комплекса профилактических мероприятий ( специальных физических упражнений и комплекса пищевых добавок ), выраженный в некотором снижении относительного содержания эфиров холестерина и триглицеридов в мембранах эритроцитов у испытателей в ходе эксперимента.

Изучение состояния мембран эритроцитов человека в ходе 135-ти суточной изоляции в макете орбитальной станции "Мир" позволило выявить коррелятивную связь между выраженностью изменений изучаемых параметров и развитием стресс-реакций при моделировании внештатных ситуаций

Практическая и научная значимость работы. Метод хроматографического определения липидного и фосфолипидного состава мембран эритроцитов был использован для оценки структурно-функционального состояния клеток крови у космонавтов в ходе полетов на орбитальной станции "Мир" и в модельных экспериментах. В настоящее время оценка липидной композиции проводится в комплексе с другими показателями состояния мембраны в рамках программы медико-биологического обеспечения пилотируемых орбитальных полетов.

Расчет физиологической' нормы для показателей липидного и фосфолипидного состава мембран эритроцитов космонавтов имеет практическое значение при проведении клинико-физиологического обследования и оценки структурно-функционального состояния мембраны в период подготовки и после завершения космических полетов.

Выявленные особенности динамики липидного и фосфолипидного состава мембран эритроцитов у женшин в условиях 120-ти суточной антиортостатической гипокинезии свидетельствуют о корригирующем эффекте профилактических мероприятий, направленных на поддержание гомеостаза и функциональной активности клеток.

Основные положения, выносимые на зашиту.

1. Факторы длительных космических полетов и модельных экспериментов приводят к дестабилизации эритроцитарной мембраны, выражающейся в изменении липидного и фосфолипидного состава, активности мембраносвязанных ферментов, гемолитической стойкости клеток.

2. Комплекс физических тренировок и пищевых корригирующих добавок, применявшихся в одной группе испытателей в ходе 120-ти суточной антиортостатической гипокинезии, обладает мембранопротективным эффектом.

3. Изменения з липидной композиции мембраны связаны с изменениями гормонального статуса организма при стресс-реакциях, развивающихся в условиях экстремальных ситуаций, что нашло подтверждение в исследованиях по изучению операторской деятельности человека во время 135-ти суточной изоляции в макете орбитальной станции "Мир".

4. Обнаруженные сдвиги в показателях , характеризующих состояние мембран эритроцита при воздействии факторов реального космического полета и в условиях модельных экспериментов отражают компенсаторно-приспособительные реакций хлетки, выраженность которых может зависеть от длительности воздействия изучаемых факторов, индивидуальных особенностей, глубины метаболических сдвигов з организме.

Апробация диссертации и публикации.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на XXI Гагаринских чтениях, на секции "Проблемы авиационной и космической медицины и психологии" ( Москва, 1990); на научной конференции, посвященной 90-летию со дня рождения академика Ц.В.Парина ( Москва, 1993); на симпозиуме стран СНГ "Клинические и экспериментальные аспекты клеточной сигнализации" ( Москва, 1993); На X конференции по космической биологии

и авиакосмической медицине ( Москва, 1994); На 30-м международном симпозиуме СОБРАЛ ( Гамбург, 1994).

По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, полученных результатов, их обсуждения, выводов. Библиографический указатель включает в себя 206 источников литературы, в том числе 129 зарубежных. Работа изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 30 рисунков. Цифровой материал приведен на 8 таблицах в приложении.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы н методы исследований. Материалом для исследования служили эритроциты, полученные из венозной крови человека и животных, стабилизированной раствором ЭДТА.

Оценку структурно-функционального состояния мембран эритроцитов проводили по липидному и фосфолипидному спектру мембран, активности транспортных АТФ-аз, стойкости эритроцитов к кислотному гемолизу, составу жирных кислот мембран эритроцитов.

Экстракцию липндов осуществляли из гемолизата эритроцитов смесью метанол-хлороформ в соответствии с методом, описанным Folch J. et al. (1957) и Blier E. and Dyer W.(I959). Разделение липидов и фосфолипидов на фракции осуществляли методом одномерной восходящей тонкослойной хроматографии на пластинах Silufol UV-254 (ЧССР) с последующим сканированием окрашенных пятен на денситометре "Beckman CDS-200" (США) в отраженном свете с длиной волны падающего спета 600 нм.

Содержание фракций общих липидов ( фосфолипиды-ФЛ, холестерик-ХС, неэтерифицированные жирные кислоты-НЭЖК, триглицериды-ТГ, эфиры холестерина-ЭХС)и фосфолипидов ( лизофосфатидилхолин-ЛФХ, сфингомиелин-СМ, фосфатидилхолин-ФХ, фосфатидилэтаноламин-ФЭА, фосфатидная кислота) рассчитывали в относительных процентах.

Резистентность эритроцитов к кислотному гемолизу изучали с помощью фотоэлектрической регистрации кинетики гемолиза (Терскова И.А., Гительзон И.И., 1972). После построения кислотной эритрограммы рассчитывали

параметры, характеризующие кислотный гемолиз: Тг,м.- время полного гемолиза всех клеток в опытной кюиете (мин.); Tmlx- время, соответствующее пику кислотной эритрограммы (мин.); ^„-величина пика кислотной эритрограммы в % .

Анализ метиловых эфиров жирных кислот липидов эритроиитарных мембран проводили методом газожидкостной хроматографии на газовом хроматографе " Varian-3600 STAR. Сх", оборудованном пламенным ионизационным детектором. Идентификацию различных классов жирных кислот осуществляли, используя внешние стандарты метиловых эфиров жирных кислот фирмы Serva. Содержание каждого класса жирных кислот рассчитывали в относительных %.

Об активности транспортных АТФ-аз судили по содержанию неорганического фосфата при дефосфорнлировании АТФ в специальной инкубационной среде (Якушева Н.И., 1970).

Значимость изменений, обнаруженных в результате исследований рассчитывали, используя метод одномерной вариационной статистики (t-тест). Результаты выражали в виде М ± т.

Исследования проводили с участием космонавтов, совершивших космические полеты (КП) на орбитальной станции "Мир" длительностью 125438 суток. На этапе предварительной подготовки к полету обследование проводили за 30 суток до начала КП; после завершения полета - на +1, +7, + 14 и +60-е сутки.

Изучение липидного и фосфолипидного состава мембран эритроцитов было проведено так же в образцах крови, взятых у 6-ти космонавтов в ходе космического полета на 112-е сутки полета ( два космонавта, КП продолжительностью 127 суток), 158-е сутки полета ( два космонавта, КП -170 суток), 168-с сутки ( один космонавт, 176-ти суточный КП) и 4-е, !70-е, 287-е, 430-е сутки ( один космонавт, КП - 438 суток).

Исследовали состояние мембргн эритроцитов в условиях 120-суточной антиортостатичсской гипокинезии с участием 8 женщин-добровольцев в возрасте 25-36 лет. Изучаемые показатели определяли на 28, 60 и 114-е сутки эксперимента и на 1, 6 и 30-е сутки после его завершения. При этом одна группа обследуемых (группа А) на протяжении всего эксперимента, а другая (группа В) - только в период реадаптации получали пищевые корригирующие добавки, включавшие мембранопротекторы (витамин Е и комплекс

полиненасыщенных жирных кислот Омега 3) в сочетании со специальными физическими упражнениями.

Проведено изучение структурно-функционального состояния мембран эритроцитов в условиях 135-суточной изоляции человека в макете орбитальной станции "Мир". В эксперименте принимали участие трое мужчин-добровольцев в возрасте 30-35 лет. Исследования проводили на 9, 22, 36, 85 и И 3-е сутки эксперимента и 1, 6, 14-е сутки периода реалаптеции.

В отдельной серии проведено исследование липидного и фосфолипидного состава мембран эритроцитов у крыс-самцов линии Спрейг-Доули, экспонированных на борту космической медико-биологической лаборатории «SLS-2» в течении 14-ти суток. Исследования проводили через 4 часа после приземления( группа F+0. 5 крыс) и на 14-е сутки после полета ( группа F+14, 5 крыс). Пять крыс использовали в качестве виварного контроля.

Изучение липидного и фосфолипидного состава мембран эритроцитов было проведено у четырех самцов Масасса Rhesus в ходе 14-ти суточной антиортостатической гипокинезии. Контрольными служили параметры исследований, проведенных за две недели до начала эксперимента. В ходе эксперимента исследования проводили на 6-е сутки АНОГ и 1,5, 14 и 26-е сутки периода реадаптации.

Объем, структура и основные условия исследования представлены в таблице 1.

Таблица 1. Объем, структура и основные условия исследования

Длительность Обсле- Кол-во Кол-во Всего

Условии воздействия воздействия довано исслед. на показат. на исследований

(сутки) субъектов 1 объект I исслед. на группу

Определение нормы для

спецконтингенп (муж.) - 35 1 10 350

Космические

полеты (o.e. "Мир)" 125-438 25 (34 4-5 15 2096

(муж.) полета)

Гипокинезия

лгтиортостатическал. 120 8 4-7 21 944

(жен.)

Длительная изоляция

"HUBES" (муж.) 135 3 9 13 351

Гипокинезия

аитиортостхткчесасая

( обезьяны, mail 14 4 4-6 10 ISO

Космический полет

(крысы, mail)

14 15 1 10 150

Итого: Общее количество 46 человек, 4071

4 обезьяны, 15 крыс исследование

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. 1. Лнпидный и фосфолипидный состав мембран эритроцитов, активность транспортных Са 2+ и К+,Ма*-АТФ-аз и резистентность клеток к кислотному гемолизу у космонавтов в условиях космических полетов различной продолжительности и после их завершения.

На основе данных дополетных обследований была рассчитана физиологическая норма для показателей липидного и фосфолипидного состава мембран эритроцитов (МЭ) для спецконтингента, которая имеет некоторые отличия от среднестатистической клинической нормы, вероятно связанные с особенностями режима, физических тренировок и питания в ходе выполнения программы подготовки к космическому полету. Мембрана эритроцитов космонавтов характеризуется меньшим содержанием холестерина (на 5%) и более высоким уровнем триглицеридов (на 5%), эфиров холестерина (на 4%) и фосфатидной кислоты. Однако, следует отметить, что эти отличия не означают качественно иной состав МЭ, а указывают на некоторые особенности, а в ряде случаев и более широкий диапазон значений этих параметров для данной группы обследуемых.

Таблица 2. Физиологическая норма липидного и фосфолипидного состава мембран эритроцитов для группы спецконтингента ( в отн. %), п=35.

Показатели

Нормальные физиологические значения (муж.)**

Физиологическая

норма для спецконтингента (муж.)

Общие липиды: ФЛ ХС НЭЖК ТГ ЭХС Фосфолипиды: ЛФХ СФМ ФХ ФЭА Фосф. к-та

35.82 ± 0.23 49.76 ± 0.52 4.14 ±0.91 3.97 ± 1.32 14.22 ± 0.75

1.13 ±0.16 14.76 ± 0.59 33.95 ± 0.29 34.04 ± 0.76 следы

30.78 ± 1.44 36.04 ± 1.07 5.07 ± 0.45 9.73 ± 0.73 18.82 ± 1.18

2.68 ± 0.32 17.19 ± 1.36 39.32 ± 0.89 37.72 ± 2.20 9.86 ± 0.9

** - Туркина Т.И., Проблемы эндокринологии, 1985, № 5, с. 32-36.

Анализ результатов, полученных при изучении липидного состава мембран у космонавтов после завершения космических полетов, выявил зависимость изучаемых параметров от продолжительности полетов, что позволило разделить длительные космические экспедиции на 3 группы : А-125-150 суток. В-150-200 и С-200-438 суток.

• У космонавтов после полетов 125-150 суток в первую неделю реадаптации в мембранах эритроцитов отмечали достоверное увеличение относительного содержания ФЛ ( на 8% и 7.7% в +1-е и +7-е сутки соответственно) при снижении в эти же сроки уровня НЭЖК на 3.7% и 4.5% соответственно. На + 14-е сутки периода восстановления выявлено достоверное увеличение относительного содержания свободного ХС ( на 7.2%) на фоне сокращения доли его этерифицированной формы ( ЭХС) на 8% (рис1).

Обнаруженные изменения липидного состава обусловили сдвиги в фазовом состоянии мембраны, о чем свидетельствует динамика соотношения ХС/ФЛ представленная на рис.2. Снижение значения данного коэффициента указывает на то, что процесс реадаптации сопровождался увеличением "текучести" липидного бислоя.

50.00- .......

ОФон Ш -е сут. после КП

Ш —е сут. после КП И14 — е сут. после КП

Рис.1. ЛипидныЙ состав мембран эритроцитов космонавтов, совершивших КП<150 суток (группа А). *-р<0.05.

Фом

14

• -ХС/ФЛ

—эхс/сх

М/ФХ

, сутки после КП

Рис. 2. Значения коэффициентов ХС/ФЛ, ЭХС/ХС и СМ/ФХ для мембран эритроцитов космонавтов, совершивших КП<150 суток, *-р<0.05

Более длительные КП приводят к увеличению относительного содержания ХС при сниженном уровне ФЛ уже на 1-е сутки периода восстановления. Изменения носили достоверный характер, и на +14-е сутки обследования составили 14% для ХС и 10.8% для ФЛ ( рис. 3). Изменение в соотношении липидных фракций может привести к снижению "текучести", увеличению "жесткости" мембраны ( рис. 4).

60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00. 0.00

□Фон

нэжк тг

сутки после КП 67 Ш4

Рис.3. Липидный состав мембран эритроцитов космонавтов, совершивших КП 150-200 суток (группа В).*-р<0.05, "-р<0.1.

--Т—-----

•хс/ол •эхс/сх

-СМ/ФХ

60

сутхи после КП

Рис. 4. Значения коэффициентов ХС/ФЛ, ЭХС/ХС и СМ/ФХ для мембран эритроцитов космонавтов поме завершения КП 150-200 суток (группа В).*-р<0.05

У космонавтов после полетов более 200 суток также была прослежена тенденция к увеличению в эритроцитарных мембранах относительного содержания ХС, НЭЖК и ТГ на фоне некоторого снижения ЭХС в ходе реадаптации. При этом изменение фазового состояния мембраны, как н у космонавтов группы В, происходило в сторону увеличения ее "жесткости" и снижения "текучести", на что указывает увеличение соотношения ХС/ФЛ в мембране в период реадаптации (рис.5).

1.40 -

|.

1.20 41.00 •■ 0.80 ■ 0.60 ••

"•Е

------..в...

0.40 -0.200.00

Фон

•«•••ХС/ФЛ • -«- -ЭХС/СХ -*—СМ/ФХ

14 сутки после КП

Рис. 5. Значение коэффициентов ХС/ФЛ, ЭХС/ХС и СМ/ФЛ для мембран эритроцитов космонавтов после завершения КП >200 суток ( группа С).

Сдвиги в соотношении липидных фракций мембраны обусловили изменение ее функционального состояния. Исследования показали, что активность мембраносвязанных ферментов - транспортных Са2+- и К+,№+-АТФ-аз так же зависела от длительности космических полетов и была снижена по сраонению с фоном после полетов продолжительностью 125-150 и 200-438 суток ( в последнем случае - более выражено), и существенно превышала фоновые значения после КП 150-200 суток (рис. 7).

дмкг Рн/НЬ в эритр./час 40т КП 125-150 суток КП 150 — 200 суток

30-20--10-г-

И

КП 200-438 суток

Я«

-ПГ

• 10-■20

• зо-1-

-гН"1

■гг

+1

+ 7

сутки после полета

□ К^а-АТФаза

|Са-АТФаза

Рис. 7. Изменение относительно контроля активности транспортных Са2+ и К+,№+-АТФ-аз в мембранах эритроцитов космонавтов, совершивших космические полеты различной продолжительности.

Изучение липидной композиции мембран эритроцитов было проведено в ходе космического полета у шести космонавтов. На рис.6 графически представлены индивидуальные значения относительного содержания ХС, ФЛ и ЭХС. Несмотря на различия фоновых значений, у всех обследованных космонавтов отмечали снижение относительного содержания ХС в ходе КП, что составило от 4% до 22% в группе. Одновременно с этим у большинства космонавтов относительное содержание ЭХС в полете и после полета было выше фона. Определение содержания других липидных фракций выявило накопление НЭЖК и ТГ в ходе космического полета, что совпадает с результатами послеполетного обследования.

В период реадаптации у шести космонавтов данной группы доля свободного холестерина в мембранах наоборот увеличивалась, а содержание фосфолипидов уменьшалось. Таким образом, изменение соотношения ХС/ФЛ,

10 о -

to

so *40

= а» о

г»

КП 127 cyroi ч

фон

сутки

so - ■ JO

4(1 - \ К5

40

>« в 30 | 1 30 s

S 20 ~ у'Ч-- & 20

176 суто|

♦Oil

сутки

-эхе

К2

КП 127 суток

фон

N.

112

* в -

+1

+9 сутки

К4

КП 170 суток

-I--

фон

IS*

44

сутки

КП 438 суток

179 i«7 4М

—Л— ФЛ - • ХС

Рис. 6. Липидйый состав мембран эритроцитов космонавтов в условиях космического полета.

характеризующее фазовое состояние мембраны, было различным в условиях КП и а период реадаптации. В условиях полета сдвиги в составе лилидов приводят к увеличению "текучести" мембраны, а в период реадаптации - к увеличению ее «жесткости». Последнее коррелирует с данными, полученным» совместно с сотрудниками Гематологического Научного Центра, о появлении трансформированных форм эритроцитов у космонавтов в условиях КП. Так у ряда космонавтов на завершающем этапе полета отмечали увеличение содержания книзоиигов и сфероцитоз, а послеполетные исследования выявили увеличение в кровяном русле количества эхиноцитов, которые обладают более насыщенной холестерином мембраной, чем эритроциты. Кроме того, послеполетные сдвиги в составе липидов могут явиться следствием повышения содержания атерогенных форм холестерина плазмы -холестерина липопротеидов низкой плотности, увеличения концентрации свободных радикалов в плазме вследствие активации перекисного окисления липидов, накопления в плазме свободных жирных кислот.

Таким образом, полученные данные показали, что воздействие факторов длительных космических полетов приводит к изменениям липидной композиции мембраны эритроцита и ее функционального состояния, которые можно расценивать как дестабилизирующие клеточную мембрану. Установлена зависимость изучаемых параметров у космонавтов от длительности космического полета. Показано, что основные изменения касались фракции свободного холестерина, динамика относительного содержания которого у человека в ходе КП и на начальных этапах модельных экспериментов имела противоположную направленность периоду восстановления.

Выявленные нами изменения отдельных параметров, характеризующих состояние мембраны, привели к изменению свойств мембраны в целом. Об этом свидетельствует увеличение резистентности эритроцитов к кислотному гемолизу, выявленное у всех космонавтов после полетов. Иллюстрацией служат кислотные эритрограммы космонавта, совершившего полет 127 суток. На рис.8 видно, что в 1-е сутки после КП происходит увеличение времени гемолиза ( достоверно для групп А и В), и сдвиг эритрограммы вправо (достоверно для групп А и С), что свидетельствует об увеличении '"жесткости" мембраны после КП.

•р*м* «Л 1.1 15 1.5 4.5 5.5 6.5 7.5 1.5 9.5

минуты

Рис. 8. Кислотные эритрограммы эритроцитов космонавта после завершения космического полета.

2. Лшшдныб, фосфолипидный н жирнокислотный состав мембран эритроцитов и резистентность клеток к кислотному гемолизу у женщин в условиях длительной 120-тн суточной антиортостатической гипокинезии.

Поскольку данные о липидном составе мембран в ходе КП малочисленны и не позволяют судить о достоверности обнаруженных изменений, особое значение приобретают исследования, в которых моделируются отдельные факторы космического полета или их комплекс. К числу таких экспериментов относится антиортостатическая гипокинезия.

Анализ данных, полученных в ходе исследования, свидетельствует о том. что действие антиортостатической гипокинезии на организм женщин привело к изменениям липидного и фосфолипидного состава мембран эритроцитов, отмеченные уже на 28-е сутки эксперимента. Это было выражено в увеличении относительного содержания ФЛ у большинства испытателей, снижении уровня ТГ и ЭХС в группе А, уменьшении содержания ХС в группе Б. В ходе эксперимента, на 60-е и 114-е сутки отмечали изменения, более выраженные в группе Б: снижение процентного содержания общих фосфолипидов и фракций ФХ и ФЭА, повышение доли .ХС, ТГ, а также НЭЖК и ЛФХ. Накопление НЭЖК и ЛФХ в мембране создает предпосылки к дестабилизации мембраны. Являясь амфифилами, свободные жирные кислоты и лизофосфатиды при избыточной их концентрации "разрыхляют" мембрану.

изменяют "текучесть" липидкого бислоя, что влияет на активность интегральных белков.

Динамика соотношения липидных и фосфолипияных фракций у женщин-испытателей в условиях 120-ти суточной АНОГ, представлена на рис. 9,10. Соотношения ХС/ФЛ и СМ/ФХ снижались на начальном этапе эксперимента и возрастали, начиная с 60-х суток (группа А) и 114-х суток (группа Б) АНОГ. Максимальное значение коэффициента ХС/ФЛ в обеих группах испытателей отмечали на 6-е сутки периода реадаптации. Подобные изменения свидетельствуют об увеличение "текучести" мембраны на заключительном этапе эксперимента и снижение этого параметра в ПВ.

2 00 .

Чт - -»--ХС/ФЛ ! СМ/ФХ

Рис. 9. Значения коэффициентов ХС/ФЛ и СМ/ФХ для мембран эритроцитов у испытателей группы А ( с профилактикой) в ходе эксперимента "AHOГ-120 суток", • - р<0.05.

-

о.оо

фон 23 60 114

групп» В сутки

+ 1

- -о- -ХС/ФЛ * СМ/ФХ

+6 +30

Рис. 10. Значения коэффициентов ХС/ФЛ и СМ/ФХ для мембран эритроцитов у испытателей группы Б (без профилактики) в ходе эксперимента "АНОГ-120 суток", *-р<0.05.

Анализ жирнокислотного спектра мембран эритроцитов на 114-е сутки эксперимента подтверждает это предположение. Было обнаружено повышенное процентное содержание линолевой кислоты (18:2), сниженное -стеариновой (18:0), олеиновой (18:1) и арахидоновой кислот (20:4). Содержание насыщенной пальмитиновой кислоты (16:0) в мембранах эритроцитов у испытателей группы А было меньше контроля, а в группе В превышало его. В ходе реадаптации, особенно на 6-е сутки, наблюдали уменьшение доли ненасыщенных кислот в мембранах эритроцитов, в т.ч. арахидоновой, что может свидетельствовать об увеличении синтеза простагландинов на завершающем этапе эксперимента и на ранней стадии реадаптации как адаптивной реакции организма на длительные экстремальные воздействия.

Через месяц после завершения эксперимента наблюдали практически полное восстановление изучаемых параметров. Однако, у испытателей группы Б сохранялся сниженный по сравнению с фоном уровень ФХ, а содержание фосфатидной кислоты достоверно превышало фон.

Положительный эффект профилактических мероприятий (физических тренировок и пищевых корригирующих добавок) выражался в нормализации содержания ТГ и ЭХС в мембранах эритроцитов испытателей в ходе эксперимента. Отмечали также, что у обследуемых из группы с профилактикой содержание ФЛ, ЭХС и ФЭА после завершения эксперимента в большей степени соответствовало физиологической норме, чем до начала эксперимента.

Таким образом, установлено, что 120-ти суточная гипокинезия у женщин приводит к увеличению относительного содержания фосфолипидов , снижению доли холестерина ( группа без профилактики) в условиях АНОГ и возрастанию холестерина, ЛФХ, НЭЖК, ТГ на 60-е и 114-е сутки эксперимента и в период восстаноштения. Сходная направленность сдвигов в липидном составе мембран эритроцитов описана выше у космонавтов во время и после космических полетов.

3. Липшный, фосфолипидиый состав и резистентность мембран эритроцитов к кислотному гемолизу у человека в условиях длительной изоляции.

Космические полеты и модельные эксперименты, являясь для их участников экстремальной ситуацией, сопровождаются развитием стрессовых

реакция. При этом активация гормонального звена может стать предпосылкой к сдвигам на мембранном уровне. Подтверждением этого явилось исследование состояния мембраны в эксперименте по изучению операторской деятельности человека во время 135-ти суточной изоляции в макете орбитальной станции "Мир" ( Эксперимент по программе "HUBES", Abst., The HUBES Symp., Paris, 1995.).

Начиная с 9-х суток эксперимента, в мембране эритроцитов испытателей (как и у космонавтов в ходе космического полета) отмечали повышение относительного содержания ТГ и ДГ, а так же ЭХС, высокий уровень которых сохранялся на протяжении всего эксперимента и достигал наибольшего значения в 1-е сутки после эксперимента. Повышение доли ХС, а также снижение относительного содержания ФЛ за счет сокращения долей ФХ и ФЭА совпало с экстремальной ситуацией, возникшей на 22-е и 113-е сутки эксперимента. Вероятно, стрессом внештатной ситуации можно объяснить увеличение "жесткости" мембраны на 22-е, 113-е сутки, на что указывает возрастание значений коэффициентов ХС/ФЛ и СМ/ФХ ( рис.П). Аналогичные изменения состояния мембраны наблюдали у космонавтов на ранних этапах реадаптации к земной гравитации. Увеличение жесткости мембраны после эксперимента обусловило повышение стойкости эритроцитов х кислотному гемолизу, наибольшей резистентностью обладали клетки на 1-е сутки реадаптации.

1.6

эксперимент реадаптация

- -а- -ХС/ФЛ —л—СМ/ФХ

Рис. II. Значения коэффициентов ХС/ФЛ и СМ/ФХ для мембран эритроцитов испытателей в ходе эксперимента "HUBES", * - р<0.05

Накопление свободного холестерина, как следует из научной литературы, может быть связано с метаболическими перестройками в организме, причиной которых может явиться стресс-реакция (Потапов П.П. и др., 1987, Лобова Т.М., 1979). При этом происходит мобилизация энергетических ресурсов организма, липиды активно вовлекаются в окислительные процессы, в крови накапливаются свободные жирные кислоты. В результате этого неутилизируемые продукты окисления НЭЖК стимулируют синтез холестерина, повышая его концентрацию в крови и тканях.

Полученные в ходе исследования данные выявили коррелятивную связь между изменением изучаемых параметров и стрессом внештатных ситуаций, в условиях эксперимента, что свидетельствует о наличии тесной взаимосвязи между функциональным состоянием мембраны и активностью симпато-адреналовой системы организма.

4. Лнпидный и фосфолипндкый состав мембран эритроцитов после 14-та суточного космического полета у крыс и 14-ти суточной АНОГ у обезьян.

Основываясь на данных об отличии показателей метаболизма в эритроцитах человека и животных ( у обезьян, например, содержание АТФ в клетке ниже, чем у человека, эритроциты обезьян обладают меньшей стойкостью к кислотному гемолизу) ( Иванова С.М. с соавт. ), был проведен сравнительный анализ липидной композиции мембран эритроцитов человека, обезьян и крыс. При этом выявили ряд отличий, выраженных в более высокой доле ХС в мембранах эритроцитов обезьян, а у крыс, наоборот, более низкой, чем у человека, при этом мембрана эритроцитов крыс более насыщена НЭЖК и ТГ.

В ходе исследования установлено, что кратковременное воздействие факторов космического полета и АНОГ привело к снижению относительного содержания ХС в мембранах эритроцитов, выявленное у обезьян сразу поме окончания эксперимента и у крыс к первые часы после приземления. В ходе реадаптации у большинства обследованных животных отмечали увеличение относительной доли этого липида в мембране, а так же увеличение относительного содержания ЭХС. Хотя изменения не являются статистически достоверными, их направленность совпадает со . сдвигами в липидной композиции мембран у человека, обнаруженными на ранних этапах

космического полета и модельных экспериментов, а также в период реадаптации.

1 60 1 40 . 1.20! 1.00 0 80 060 0 40 0 .20 : ООО

Контроль

1-е сутии

... | - -ХС/ФЛ —*—СМ/ФХ

14 е сутки П0сле полета

Рис.12. Значение коэффициентов ХС/ФЛ и СМ/ФХ для мембран эритроцитов у крыс, экспонированных на борту орбитальной медико-биологической лаборатории "51.5-2".

Рис. 13. Значения коэффициентов ХС/ФЛ и СМ/ФХ для мембран эритроцитов обезьян после завершения 14-ти суточной АНОГ.

Таким образом, обнаруженные в результате настоящих исследований изменения параметров, характеризующих состояние мембраны эритроцитов при воздействии факторов реального космического полета и модельных экспериментов, отражают компенсаторно-приспособительные реакции клетки, выраженность которых может зависеть от длительности воздействия изучаемых факторов, индивидуальных особенностей, глубины метаболических сдвигов в организме. При этом наблюдаемый положительный эффект используемых пищевых корригирующих добавок позволяет выработать научно-обоснованную

стратегию разработки и использования профилактических средств, направленных на стабилизацию клеточной мембраны при экстремальных воздействиях.

ВЫВОДЫ

1. В период подготовки к полету у космонавтов установлены отличия липидного состава мембран эритроцитов в сравнении с имеющимися литературными данными, характеризующими физиологическую норму: меньшее содержание холестерина и повышенный уровень триглицеридов, эфиров холестерина и фосфатидной кислоты в мембранах эритроцитов космонавтов.

2. Обнаруженные изменения липидного состава мембран эритроцитов у космонавтов после завершения полетов зависит от длительности космических экспедиций. 1

После полетов продолжительностью 4-5 месяцев в мембранах эритроцитов у космонавтов относительное содержание холестерина снижалось, при этом уровень фосфолипидов был повышен. После завершения полетов продолжительностью 5-7 месяцев относительное содержание холестерина в мембране было достоверно повышено, доля фосфолнпвдов - снижена по сравнению с фоновыми значениями.

3. После космических полетов у всех обследованных космонавтов выявлено повышение жесткости мембран, о чем свидетельствует увеличение резистентности эритроцитов к кислотному гемолизу

4. В условиях длительного космического полета обнаружены сдвиги в составе липидов мембран эритроцитов - снижение уровня холестерина, накопление эфиров холестерина при неизменном содержании фосфолипляоз -не имеющие одинаковой направленности с изменениями, выявленными в послеполетных исследованиях.

5. В ходе 120-суточной антиортостатической гипокинезии у женщин происходит увеличение содержания фосфолипидов и снижение доли холестерина в условиях эксперимента и возрастание уровня холестерина, триглицеридов, неэстерифицированных жирных кислот в период восстановления.

6. Профилактические мероприятия ( физические тренировки и комплекс пищевых корригирующих добавок), оказывают положительное влияние на

мембрану эритроцитов, выражающееся в некотором снижении содержания триглицеридов и эфиров холестерина в мембранах эритроцитов у испытателей в ходе 120-ти суточной антнортостатической гипокинезии.

7. Пребывание человека в условиях 135-ти суточной изоляции в макете орбитальной станции "Мир" приводит к накоплению в мембране эритроцитов эфиров холестерина, триглицеридов и диглицеридов уже в начале эксперимента, и к снижению содержания фосфолипмдов, более выраженному на завершающем этапе эксперимента и в ранние сроки реадаптации. Выявлена коррелятивная связь между выраженностью изменений изучаемых параметров и развитием стресс-реакций при моделировании внештатных ситуаций.

8. Выявлены различия в липидном и фосфолипидном составе мембран эритроцитов человека и животных, при этой не обнаружено достоверных изменений липкдного состава мембран эритроцитов в условиях кратковременной 14-ти суточной АНОГ (обезьяны) и 14-ти суточного космического полета ( крысы).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Функциональное состояние эритроцитов и адренореактивность у обезьян после космических полетов и модельных экспериментов.// Тез. докл. межд. симп. "Биоспутники "Космос", Ленинград, 1991, - с.43-45.

2. Липидный и фосфолипидный состав мембран эритроцитов космонавтов при воздействии факторов космического полета //Тез. докл. конф. "Клинические и экспериментальные аспекты клеточной сигнализации," М., 1993.-C.33-34 /Соавт. Иванова СМ./.

3. Метаболизм клеток крови у человека при длительном воздействии факторов космического полета //Тез. докл. X конф. по космич. биол. и авиакосмич. мед.,-М.,1994,-С.353-354 /Соавт. Иванова С.М., Белозерова И.Н., Спицина Н.Е., Лабецкая О.И./.

4. Липидный и фосфолипидный состав мембран эритроцитов космонавтов при воздействии факторов космического полета //Космич. биол. и авиакосмич. мед., 1994, -№6,-С.31-33.

5. Results of studies of the metabolism of cosmonauts after completion of 166-days flight on the board of "Mir" orbital station. //Proceedings of the Special Canada/USSR space life Sc. Symp., Ottawa, 1990,- p. 1-10, /Coauthors S.M.Ivanova, !.A.Popova, A.A.Markin/.

6. Erythrocyte functional status and adrenoreactitity in monkeys after space flight and control experiment.// The Physiologist, -1991,-vol. 35, No. 1, Suppl.-p. 233-234 / Coauthors S.M.Ivanova, R.K.BIuma, I.E.Kalninya/.

7. Metabolic and structural aspeens of cellular homeostasis in external situation// The HUBES Simposium,-Paris,1995,-p.27-28./ Coauthors S.M.Ivanova, Belozerova I.N., Labetskaya 0.1., Spinsina N.E./.

S. State of erythrocyte membrane in man and monkeys after space flight. //Adv Space Res., -1996,-vol.l7, No.6/7,- p.(6/7)179-(6/7)182. /Coauthors S.M.Ivanova/.