Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Механизмы регуляции системы крови при воспалении

ЁЯ' П <5 Я 2

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

СИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

КЛИМЕНКО Николай Алексеевич

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ СИСТЕМЫ КРОВИ ПРИ ВОСПАЛЕНИИ

14.00.16. - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

На правах рукописи

Томск - 1992

Работа выполнена на кафедре патофизиологии Харьковского медицинского института МЗ Украины, в научно-исследовательском институте фармакологии ТНЦ РАМН и на кафедре патофизиологии Сибирского Государственного медицинского университета

Научные консультанты: академик РАМН Е. Д. Гольдберг, доктор медицинских наук, профессор Р. У. Липшиц, доктор медицинских наук, профессор А. М. Дыгай.

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Г. С. Якобсон, доктор медицинских наук, профессор 10, Б. Лишманов,

доктор медицинских наук, профессор Ю. В. Федоров.

Ведущая организация - научно-исследовательский институт обшей патологии и патологической физиологии РАМЕ

Защита состоится "_" _1992г. в_

_часов на заседании специализированного совета

Д. 084.28.02 Сибирского Государственного медицинского университет?. /634050,г. Томск, Московский тракт,2/.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского Государственного медицинского университета /пр. Ленина, 107/.

Автореферат разослан "_"_1992г.

Ученый секретарь специализированного совета профессор

Т. С. Федорова

iiVeii KEMi I!;:' O'L":^

v -,r\ej) юсертаций

Обшдя характеристика работы

Актуальность проблемы. Воспаление как типический патологический процесс, составляющий основу большинства болезней человека, является центральной проблемой патологии на протяжении всей истории учения о болезни. Разрешение большей части практических вопросов медицины обусловлено прогрессом в исследовании воспаления (Альперн Д. Е. ,1959).

Несмотря на трудности исчерпывающего определения сущности этого процесса, очевидно, что воспаление является результатом реакций на воздействие флогогена со стороны соединительной ткани, микроциркуляции и крови (Чернух A. U., 1979) и что последней принадлежит решающее значение в реализации воспалительного процесса, поскольку именно лейкоциты служат основными эффекторами воспаления (Klebanoff, Clark, 1978; Weissmann et al. ,1978; Пигаревский E E., 1978; Nathan et al. ,1980; Маянский А. E .Маянский Д.Н. ,1983,1989; Coldit2,1985; №vat,1985; Seijelid,1987; Пауков E С. ,Кауфман 0. iL ,1988; Boxer et al. ,1990). Соответственно исследование системы крови является одним из важных направлений изучения проблемы воспаления.

Последние два - три десятилетия в связи с обнаружением секреторной функции лейкоцитов, рецепторов на их клеточной мембране и другими открытиями характеризуются новым интересом к "периферическому" звену системы крови, так что исследование "клеток воспаления" выделилось в самостоятельное (разрабатываемое, правда, главным образом in vitro) направление. В то же время бурный прогресс, переживаемый в настоящее время гематологией в связи с появлением и развитием клональных методов выявления в кроветворной ткани родона-чальных клеток крови, позволяет вновь обратиться и к "центральному" звену системы крови - гемопоэзу - при воспалении, что чрезвычайно важно, поскольку на сегодняшний день знания относительно кроветворения при воспалении ограничиваются главным образом общей феноменологией усиления лейкопоэза. Известно,что высвобождение или образование при поступлении флогогена различных хематтрактантов запускает цепь филогенетически детерминированных последовательных и хорошо координируемых событий в системе крови, включающих эмиграцию

лейкоцитов крови в очаг, перераспределение в связи с этим их в крови в сторону увеличения маргинального пула, усиленный выход лейкоцитов из костномозгового резерва в кровь и стимуляцию кроветворения, обеспечивающих развитие лейкоцитоза и направленных на поддержание лейкоцитарной инфильтрации очага (Альперн Д. Е. ,1959; Чернух А. М. ,1965,1979; Zweifach et al. ,1973; Ryan, Majno.1977; Movat.1985). Вместе с тем механизмы регуляции системы крови при воспалении изучены мало, фактически известно о возрастании содержания в периферической крови при воспалении лейкопозтинов(колониес-тимулирущих факторов; КСФ), наличии КСФ в экссудатах очагов острого воспаления, выработке стимулированными моноцитами и макрофагами таких потенциальных регуляторов кроветворения как интерлейкины и другие цитокины, о значении в активации гранулоцитопоэза при воспалении продуктов жизнедеятельности и распада нейтрофилов,которые, возможно, оказывают опосредованный эффект, стимулируя выработку поли-морфноядериыми лейкоцитами антикейлона (Долгина З.Ы. 1970, 1973; Долгина 3.11, Кахетелидзе М. Г., 1972; Кахетелидзе М. Г., Долгина 3. М., 1972; Буеверова Э. И., Братина Е. В., 1979; Алмазов RA. и др., 1979; Adolphe et al., 1980; Бала Ю.М. и др., 1988; Revel, 1989; Cavaillon, 1990; Ястребов А. Е , Осипенко А. В., 1990).

По современным представлениям, решающую роль в реализации различных регуляторных влияний организма на кроветворение играет гемопоэзиндуцирующее микроокружение (ГИМ) как объединяющее все локальные (костномозговые) механизмы регуляции кроветворения и непосредственно индуцирующее клетки-предшественники к их пролиферации и дифференцировке (Trentin, 1976; Фриденштейн А. Я., Лурия Е. А., 1980; Weiss, 1981, 1986; Чертков И. JL , Гуревич О. А., 1984; Piersma et al., 1985). Доказана важная роль и вскрыты закономерности и механизмы функционирования клеточных элементов, составляющих ГШ (Т-лимфоцитов, макрофагов, стромальных механоци-тов), в регуляции пролиферации и дифференцировкм клеток-предшественников миелопоэза при действии на организм 'экстремальных факторов (Гольдберг Е. Д. и др. ,1983,1988;

ДыгайАМ., Шахов В. IL , 1989; Дыгай А.М. и др. ,1990). Значение же ГИМ в активации гемопоэза при воспалении не исследовано. В то же время выяснение роли ГИМ в стимуляции кроветворения при воспалении, процессе, сущность которого интимно связана с системой крови, что, несомненно, придает своеобразную окраску реакциям системы крови и.их регулятор-ным механизмам, представляется особо важным.

Среди дистантных механизмов регуляции гемопоэза при воспалении особый интерес вызывают возможные влияния, исходящие из очага воспаления. Так, для воспаления характерна . уникальная категория регуляторов - медиаторов и модуляторов воспаления, которые путем непосредственного воздействия на костный мозг и (или) опосредованно через модуляцию функций лейкоцитов очага и периферической крови, в том числе и предполагаемую выработку ими гемопоэтических факторов , могут иметь значение в регуляции кроветворения. Учитывая, что медиагорная регуляция, по-видимому, является также главным звеном патогенеза воспаления, координирующим взаимодействие множества клеток-эффекторов воспаления и, соответственно, последовательность и выраженность событий в очаге, смену клеточных фаз, переход от развертывания воспалительной реакции к ее разрешению,выявление роли медиаторов в регуляции гемопоэза представляется чрезвычайно важным. Среди медиаторов воспаления существенный интерес вызывает большой комплекс биологически активных веществ тучных клеток (ТК), способных,- как установлено к настоящему времени, модулировать, с одной стороны, пролиферацию и дифференцировку гемопоэтических клеток в культуре ткани (Nakaya, Tasaka,1988; Du Xun -Xiang et al. ,1989), а с другой, - функции различных лейкоцитов in vitro (Bourne et al. ,1971; Diaz et al. ,1979; Spisani.1982; Masini et al. ,1982,1985; Pincus et al. ,1982; Seligmann et al. ,1983; Fantozzi et al. ,1984,1985; Casale et al. ,1985; Muirhead et aT. ,1985; Van Epps et al. ,1987; Mannaioni et al. ,1988). Кроме того, как основным медиаторам начальной фазы острого воспаления им принадлежит важная роль в цепной реакции продукции и активации, других медиаторов (Will oughby, 1973; Ferreira, 1979; Серов ЕЕ, 1983;

Kalter, 1984; Wasserman,1987; Camussi et al. ,1990), во взаимодействии медиаторов (Альперн Д. Е., Липшиц Р. У. ,1963; Липшиц Р. У. ,1964, 1972; Липшиц Р. У., Клименко Н. А. , 1977; Липшиц Р. У. и др. ,1989,1991), и таким образом в реализации возможного интегративного регулирующего влияния медиаторной системы на геыопозз. В то же время значение биологически активных веществ ТК, как и других медиаторов, в лейкоцитарной реакции in vivo и в регуляции системы крови в целом при воспалении не изучено. Исходя из этого, значительный интерес представляет исследование взаимосвязи ТК с лейкоцитами, роли ТК в регуляции гемопоэза при воспалении и значения в этом возможной связи ТК с ГИМ.

Исследование закономерностей реагирования системы крови на воспаление, вскрытие локальных и дистантных механизмов регуляции гемопоэза и их взаимосвязи имеет большое значение для расширения существующих представлений о патогенезе воспаления по одному из кардинальных направлений учения о воспалении, какое представляют реакции системы крови, а также для выявления общих закономерностей и механизмов функционирования кроветворной ткани при различных патологических процессах. В то же время подобные исследования представляют и непосредственный интерес для практической медицины. Реакции различных звеньев системы крови, являющиеся важнейшими показателями реактивности органивма, его адаптационных возможностей, интенсивности воспаления, могут служить (и известной степени служат) для диагностики, оценки характера течения и эфективности терапии, а также для прогнозирования исходов воспалительных процессов. Расширение знаний об их содержании и механизмах является одной из основ совершенствования патогенетической противовоспалительной терапии. Выявление общих закономерностей и механизмов регуляции гемопоэза при различной патологии представляет несомненный интерес и для клинической гематологии, так как может способствовать выяснению механизмов заболеваний крови и разработке новых патогенетических методов их терапии.

Цель исследования. Изучить закономерности реакций сис-

темы крови при воспалении и их механизмы - локальные (образующие ГИМ) и дистантные (медиаторы, продуцируемые ТК), роль ГШ в реализации регулирующего влияния ТК на гемопоэз, взаимосвязь и взаимодействие ТК с лейкоцитами в патогенезе воспаления.

Основные задачи исследования.

1. Изучить" закономерности реакций различных звеньев системы крови - лейкоцитов очага, периферической крови, костномозговых клеток - в динамике острого инфекционного воспаления.

2. Исследовать состояние пула коммитированных клеток-предшественников эритро- и грануломоноцигопоэза в ходе воспаления.

3. Выявить закономерности функционирования и некоторые клеточные и гуморальные механизмы участия ГИМ в регуляции кроветворения при воспалении.

4. Определить вклад Т-лимфоцитов в регуляцию процессов пролиферации и дифференцировки клеток-предшественников мие-лопоэза при воспалении.

5. Установить закономерности морфофункциональных изменений ТК в очаге острого инфекционного воспаления и роль ТК в клеточных реакциях очага воспаления, периферической крови и костного мозга

6. Исследовать влияние ТК на динамику клеток-предшественников зритро- и гранудомоноцитопоэза при воспалении.

7. Изучить роль ГШ в реализации регулирующего влияния ТК на гемопоэз при воспалении.

8. Исследовать механизмы влияния ТК, связанные с эффектами основных их биологически активных продуктов, на лейкоциты при воспалении,роль лейкоцитов в реакции ТК, взаимодействие ТК с лейкоцитами в повышении сосудистой проницаемости.

Положения, выносимые на защиту:

1. Реакция грануломоноцитарного ростка костного мозга при воспалении носит фазный характер. В ее основе лежат перераспределительные реакции, усиление пролиферации и дифференцировки гемопоэтических клеток-предшественников типа КОЕ

- б -

-ГМ, приводящее к гиперплазии костного мозга

2. Воспаление характеризуется усилением костномозгового зритропоэза, в основе которого лежит стимуляция пролиферации и дифференцировки эритроидных . клеток-предшественников (КОЕ-Э).

3. В усилении пролиферации и дифференцировки миелоидных прекурсоров имеет значение активация ГШ, повышенная продукция его элементами короткодистантных гуморальных стимуляторов гемопоэза - колониестимулирующих (КСА) и зритропоз-тических (ЭПА) активностей, интерлейкина - 1 (ИЛ-1), макрофагактивирующэго фактора (МАФ), - хоминг в костный мозг Т-лимфоцитов, оказывающих как прямой эффект, так и опосредованный через макрофаги ГШ.

4. В регуляции кроветворения при воспалении играют роль биологически активные вещества-медиаторы, высвобождаемые ТК. Воздействие ТК на гемопозв осуществляется при участии ГИМ. ТК лимитируют функциональную активность как прилипающих, так и неприлилаюпщ миелокариоцитов, Т-лимфоцитов -регуляторов кроветворения.

5. Регулирующее влияние ТК на гемопоэз при воспалении реализуется во многом через лейкоциты очага и крови. ТК координируют лейкоцитарную реакцию, стимулируя функциональную активность моноцитов и ограничивая - нейтрофилов. Воздействие ТК на лейкоциты осуществляется, главным образом, через Н2 - рецепторы на нейтрофилах и Н1 - рецепторы на моноцитах.

6. В патогенезе воспаления имеет место взаимосвязь ТК с лейкоцитами. Лейкоциты оказывают на ТК комбинированйый -защитный по отношению к литическому действию микроорганизмов и активирующий - эффект, регулируя, таким образом, высвобождение медиаторов-модуляторов. Взаимно модулируя функциональную активность друг друга, ТК и лейкоциты взаимодействуют в медиации воспалительных явлений, в частности, повышения проницаемости сосудов.

Научная новизна Впервые вскрыты закономерности реакций системы крови на уровне клеток-предшественников гемопоэза при воспалении и некоторые их механизмы - локальные (обра-

зующие ГШ) и дистантные (медиаторы воспаления, высвобождаемые ГК). Показано, что воспаление характеризуется усилением не только грануломоноцитопоэза, но и эритропоэза. В основе .стимуляции гемопозза при воспалении лежит активация процессов пролиферации и дифференцировки клеток-предшественников типа КОЕ-ГМ и КОЕ-Э. В усилении процессов пролиферации и дифференцировки миелоидных прекурсоров имеют значение активация ГШ, повышенная продукция его элементами коротко-дистантных гуморальных стимуляторов гемопозза - КСА, ЭПА, ИЛ-1, ЫАФ,- хоминг в костный мозг Т-лимфоцитов, оказывающих как прямой эффект, так и в кооперации с макрофагами ГИМ. Установлено, что в регуляции гемопоэва при воспалении играют роль медиаторы начальной фазы острого воспаления, продуцируемые ТК Воздействие ТК на гемопоэз осуществляется при участии ГИМ. ТК лимитируют функциональную активность как прилипающих, так и неприлипающх миелокариоцитов, Т-лимфоцитов - регуляторов кроветворения. Регулирующее влияние ТК на гемопоэз реализуется во многом через лейкоциты очага и крови. ТК координируют лейкоцитарную реакцию, стимулируя функциональную активность моноцитов и ограничивая - нейтро-филов. Воздействие ТК на лейкоциты осуществляется при участии гистамина, серотонша и гепарина; при этом гистамин оказывает эффект главным образом через Н2 - рецепторы на нейтрофилах и Н1 - рецепторы на моноцитах. Обнаружено, что иммигрировавшие лейкоциты также оказывают на ТК регулирующее влияние. ТК взаимодействуют с лейкоцитами в медиации воспалительных явлений, в частности, повышения сосудистой проницаемости.

Теоретическое и практическое значение работы Проведенные исследования позволили доказать важную роль' в регуляции системы крови при воспалении ГШ и биологически активных продуктов ГК. Полученные данные расширяют существующие представления о реакциях системы крови при воспалении и их механизмах. Результаты исследований и данные литературы легли в основу схемы, отражающей взаимосвязь ТК с лейкоцитами и некоторые механизмы регуляции гемопозза при воспалении, и представления о медиаторной регуляции (модуляции)

кроветворения при воспалении, заключающегося в том, что различные медиаторы, в том числе, видимо, и эффекторы высших регуляторных систем - нейропептиды, лимфокины, а таклае гормоны,- путем непосредственной или опосредованной модуляции функций лейкоцитов очага воспаления и периферической крови и (при участии ГШ) костномозговых элементов играют существенную роль в регуляции гемопоэза Они также указывают на возможное значение биологически активных продуктов ТК в регуляции системы крови в норме и при патологических процессах невоспалительного характера.

Результаты работы могут иметь значение для совершенствования патогенетической противовоспалительной терапии. Они указывают также на целесообразность испытания при различных по течению воспалительных процессах соответствующих комплексов Н1- либо Н2 - агонисгов или антагонистов,гепарина либо гепариннейтрализуюшях препаратов.

При выполнении диссертации разработан ряд методов исследования: методика морфологического изучения и подсчета ТК смывов серозных полостей; морфологические критерии интенсивности дегранудяции ТК в зависимости от ее типа; метод изучения проницаемости сосудов очага воспаления путем колориметрического определения концентрации внутривенно введенного витального красителя в серозных смывах.

Материалы диссертации обобщены в монографии "Воспаление и гемопоэз" (Томск: Изд-во Томского гос. ун-та,1992; в соавторстве с А. М. Дыгаем).

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на 4-м Всесоюзном съезде патофизиологов ( Кишинев, 1989), Всесоюзном симпозиуме с международным участием " Система мононуклеарных фагоцитов в норме и при патологии ( Новосибирск,1990), Учредительном Конгрессе Международного Общества по патофизиологии (Москва,1991), Всесоюзном симпозиуме с международным участием "Патогенез хронического воспаления" (Новосибирск,1991), научно-практической конференции "Структурно-функциональные единицы и их компоненты в органах висцеральных систем" (Харьков,1991), научной сессии Харьковского медицинского института (1991), заседании Харь-

ковского областного общества патофизиологов (1992).

Публикации. ГЬ теме диссертации опубликовано 20 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 382 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных наблюдений, заключения, выводов, списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 35 рисунками и 68 таблицами. Библиографический указатель включает 744 источника, из них 147 отечественных и 597 иностранных.

Материалы и методы исследования.

Работа выполнена на 2660 мышах-самцах линии СБА массой 18-20 г (питомник "Рассвет", г.Томск) и 1656 крысах-самцах линии Вистар массой 180-200 г (питомники "Столбовая", "Белый мох", г. Мэсква). Основные эксперименты проведены в осенне-зимний период, в утренние часы. До начала исследований животных в течение 1-2 недель выдерживали в виварии, после чего производили гематологические исследования для суждения о пригодности к опыту (по методологии Williams, Johnson,1976). Умерщвление животных осуществляли декапита-цией или цервикальной дислокацией позвоночника.

Основной моделью воспаления служил острый инфекционный перитонит, вызываемый внутрибрюшинным введением 1/2 ЛД50 Е. coli штаммов АТСС 25922 и выделенного от больного перитонитом в 0,3 мл и 1 мл изотонического раствора натрия хлорида у мышей и крыс соответственно. В части исследований, касающихся роли лейкоцитов в реакции ТК очага воспаления, в связи с необходимостью исключить прямое повреждающее действие микробных факторов на ТК в качестве модели воспаления использовался острый асептический перитонит у крыс, вызываемый внутрибрюшинным введением 5 мг Л-карагинена в 1 мл изотонического раствора натрия хлорида (Nakanishi, Goto,1976; Шинкаренко R С., 1983; Александров П. К, Сперанская Т. В., 1988).

Экссудат получали промыванием брюшной полости мышей и крыс соответственно 2 и 5 мл изотонического раствора натрия

хлорида или охлавденного раствора Тироде, содержащего 5 Щ/ мл гепарина

Подсчет общего количества лейкоцитов в брюшной полости и крови, кариоцитоз в костном мозге, клеточного состава экссудата, лейкоцитарной формулы и миелограмм осуществляли стандартными методами.

Жизнеспособность клеток при работе с различными их суспензиями определяли с помощью трипанового синего (йримель Г. ,1987).

Маркером функциональной активности нейтрофилов служила миелопероксидаза (К. Ф. 1.11.1.7.), моноцитов-макрофагов - ИЛ -1 либо альфа-нафтилацетат-эстераза, маркером лизосом фагоцитов обоих типов являлась кислая фосфатаза (К. Ф. 3.1.3.2.). Миелопероксидазу и альфа-нафтилацетат-эстеразу в лейкоцитах экссудата и крови определяли цитохимически по методам Грэхема- Кнолля и Леффлера (Меньшиков В. Е и др. ,1987), кислую фосфатазу в супернатантах перитонеального смыва и сыворотке крови - по методу Бессея-Лоури-Брока с помощью наборов реактивов "Лахема" на биохимическом анализаторе FP-901 "Labsystem".

Клонирование клеток -предшественников эритро- и грану-ломоноцитопоэза осуществляли в модифицированной метилцеллю-лозной культуре ткани (Iscove et al. ,1974; Metcalf,1977). Для определения качественного состава выросших колоний цитологические препараты из них окрашивали азурсм П-эозином или проводили цитохимические реакции на гемоглобин, миелопероксидазу, кислую и щелочную фосфатазы (Хейхоу Ф. Г., Квагглино Д., 1983; Шньшиков ЕЕ и др. ,1987).

Выделение гемопоэтических островков (ГО) из костного мозга производили с помощью коллагеназы (Crocker, Gordon,1985) с последующим определением различных их типов (Гольдберг Е. Д. и др. ,1990).

Колониестимулирующие и эритропоэтические активности кондиционных сред прилипающих и неприлипакяцих клеток костного мозга и сыворотки крови оценивали по интенсивности ко-лониеобразования на 10 миелокариоцитов (Metcalf, 1977). Кондиционные среды получали путем культивирования 2 х 10екл/мл

прилипающих либо неприлипавдих миелокариоцитов в полной культуральной среде в присутствии соответственно 10 мкг/мл ЛПС Б. coll штамма 0.111В4 или 5 мкг/мл КонА в течение 24 ч в ГШ-01 при 37'С, 1СШ влажности, в атмосфере, содержащей 5Z двуокиси углерода

Определение продукции ИЛ-1 стимулированными ЛПС прилипающими миелокариоцитами производили по методу Mizel (1980), синтеза МАФ неприлипащими миелокариоцитами - по методике, описанной В И. Селедцовым и др. (1987).

Определение содержания Т-лимфоцитов в костном мозге осуществляли с.помощью цитотоксического теста, который ставили по методу Р. Г. Кеннет и др. (1983) с применением трипа-нового синего. В качестве маркера Т-лимфоцитов использовали моноклональные антитела против Thy-1.2+ - клеток. С целью изучения роли Т-лимфоцитов, накапливающихся в костном мозге, в регуляции пролиферации и дифференцировки костномозговых клеток-предшественников перед клонированием миелокарио-цитов производили элиминацию их Thy-1.2+ - субпопуляции.

Подсчет и морфологическое изучение ГК перитонеальной жидкости производили с помощью камеры Горяейа при окраске нейтральны?.! красным (Клименко Е А., 1977), брыжейки - в пленочных препаратах, окрашенных толуидиновым синим (Mota, da SlIva,1960). Степень дегрануляции ТК определяли на основании предложенных морфологических критериев в зависимости от типа дегрануляции (экзоцитоз или секреторная дегрануляция).

Биохимическим маркером функционального состояния ТК служил их основной биологически активный продукт - гиста-мин, который определяли модифицированным флюориметрическим методом (Фримель Г. ,1987) на спектрофлюориметре "Hitachi". Исследовали содержание свободного и клеточного гистамина в экссудате и брыжейке, а также концентрацию его в крови. Содержание свободного и клеточного гистамина в экссудате определяли путем анализа центрифугата и ресуспендированной осадочной фракции перитонеального смыва Свободный гистамин из брыжейки экстрагировали инкубацией навесок ткани в растворе Тироде при 4еС в течение 24 ч (Srof,l962), клеточный -кипячением тех же навесок в новой порции раствора Тироде в

течение 10 мин (Assem, Schild,1968).

0 проницаемости сосудов (ГО) брюшной полости в динамике воспаления судили на основании колориметрического определения концентрации в перитонеальном смыве внутривенно введенного за Б мин до декапитации трипанового синего (5 мл/кг) (Липшиц Р. У., Клименко Е А. ,1977).

Для устранения ТК брюшной полости внутрибрюшиино вводили 10 мл на 100 г массы тела стерильной дистиллированной воды (Fawcett,1954; Kanakura et al. ,1988). Перитонит воспроизводили спустя 10 сут (Липшиц Р.У., Клименко Е А. ,1977).

С целью выяснения механизмов модулирующего влияния ТК на лейкоцитарную реакцию при воспалении использовали антагонисты основных биологически активных продуктов ТК - димедрол (дифенгидрамин; Ш - антагонист гистамина), цимети-дин (Н2 - ангигистамин), ципрогептадин (антисеротониновый препарат) и протамина сульфат (гепариннейтрализующий агент). Указанные вещества вводили крысам локально в следующих дозах: димедрол - 1 мг, циметидин - 120 мкг (Hirasava, 1987), ципрогептадин - 80 мкг (Dunn, Willoughby,1975). фи изучении гранулоцитарной реакции (через 3 ч после воздействия флогогена) препараты вводили однократно за 20 мин - 1 ч до воспроизведения воспаления, моноцитарной (через 3 сут) - 2 раза в сутки. Протамина сульфат вводили в первом случае в дозе 0,6 мг одновременно с воспалительным агентом и ватем - "через каждые 30 мин (Ульянов A.R и др. ,1989), во втором -кроме указанной схемы еще 2 раза в сутки.

С целью изучения роли лейкоцитов в реакции ТК и повышении ПС очага воспаления вызывали лейкопению путем внутривенного введения крысам винбласгина сульфата в дозе 0,75 мг /кг за 4 суток до воспроизведения перитонита (Lemanske et al. ,1983).

Статистическую обработку результатов исследований осуществляли параметрическими методами с использованием критерия Стьюдента и процедуры Шэффе (S метод) и непараметрическими методами Крускала- Усшшса и ван дер Бардена

Результаты исследований и их обсуждение.

Как и следовало ожидать, развитие острого инфекционного

перитонита сопровождалось всеми характерными для воспаления реакциями со стороны системы крови. Наблюдалась аккумуляция лейкоцитов в очаге воспаления с первоначальным преобладанием нейтрофилов, а затем моноцитов. Отмечались нейтрофильный лейкоцитоз, снижение общего количества миелокариоцитов, зрелых и незрелых гранулоцитов в костном мозге в раннюю фазу воспаления, обусловленные ускоренным выходом клеток из костномозгового резерва в кровь, последующее восстановление общего количества миелокариоцитов и зрелых гранулоцитов, возрастание числа незрелых гранулоцитов и моноцитов, свидетельствующие об активации кроветворения.

Вместе с тем показано, что реакции системы крови при воспалении носят фазный характер. Так, накопление лейкоцитов в очаге характеризовалось двумя пиками - к 3-м и 7-м сут (когда содержание лейкоцитов превышало исходное соответственно 4,9 и 3,8 раза), что, в свою очередь, было связано с фазными изменениями в содержании нейтрофилов и моноцитов. Нейтрофиды преобладали в очаге воспаления до 2-х сут с пиками к 6-ти ч и 2-м сут, а последующая динамика облиго количества лейкоцитов в очаге зависела преимущественно от моноцитов, содержание которых достигало максимальных величин на 3-й и 7-е сут. Вторая фаза накопления лейкоцитов в очаге обусловлена, таким образом, усиленным приливом моноцитов.

Наблюдаемые в периферической крови нейтрофилез и моноцитов также характеризовались двухфааностью. При этом наибольшее количество нейтрофильных гранулоцитов было зафиксировано на 1-е и 6-е (в 10 и 10,8 раза превышающее.исходное соответствено), моноцитов - на 2-е и 6-е (в 3,3 и 4,6 раза) сут.

Изучение картины костномозгового кроветворения позволило прийти к выводу, что отмеченные со стороны лейкоцитов периферической крови и очага фазные изменения обусловлены уровнем, пролиферации соответствующих форм костномозговых элементов, отражающим не только активацию кроветворения, но и развитие гиперплазии костного мозга. Так, увеличение числа незрелых нейтрофильных гранулоцитов отмечено не только

на 3-й (в 2 раза), но и на в-е-В-е (в 1,6 - 2.2 рава) сут, а моноцитов - на 2-е-7-е сут с максимумами на 2-е и 6-е (в 2,4 и 2,9 раза соответственно). Содержание зрелых грануло-цитов возрастало на 5-е-7-е сут с максимумом на 6-е (в 1,6 раза). К этому же времени увеличивалось общее число миело-кариоцитов и количество недифференцированных бластов (в 1,8 и 1,9 раза соответственно).

Таким образом, если в основе первой фазы лейкоцитоза лежит прежде всего поступление лейкоцитов из костномозгового резерва, а также усиление грануломоноцитопоэза, то второй - гиперплазия костного мозга Усиленный инфлюкс моноцитов в очаг на 7-е сут является отражением гиперплазии костного ыоэга и второй фазы лейкоцитоза и; "вероятно, обусловлен остаточным градиентом концентрации хемотактических веществ в очаге.

Развитие гиперплазии костного мозга стояло в связи со стимуляцией процессов пролиферации и дифференцировки комми-тированных клеток-предшественников типа ГМ-КОЕк. Их количество в костном мозге возрастало на 3-й сут воспаления (в 2,3 раза), затем снижалось и 6-е сут вновь значительно увеличивалось (в 3,4 раза), фи этом наблюдалась стимуляция выхода из костного мозга трех типов колониеобразуюцих единиц - гранулощгго-макрофагальных, гранулоцитарных и моноци-то- макрофагальных.

Об активации процессов пролиферации и дифференцировки гранулошгаарных прекурсоров при воспалении свидетельствует и факт увеличения в костном мозге числа ГО - структурно-функциональных ассоциаций, состоящих, как правило, из центрально расположенного макрофага либо фибробласта, окруженных гемопоэтическими клетками различной степени зрелости. Считается, что в составе ГО происходит пролиферация и дифференцяровка кроветворных элементов от коммитированных до зрелых форм (Сгосег, Gordon,1985). Повышение количества ГО наблюдалось на 1-е -3-й, 5-е-7-е и Q-e сут с максимумами на 1-е- и 5-е (соответственно в 2,4 и 1,9 раза). Примечательно, что преимущественно возрастало содержание макрофаг-негативных ГО, представленных большей частью гранулоцитар-

ными островками.

Уже сам факт увеличения в костном мозге числа ГО свидетельствует об активации при воспалении функции ГШ. При этом клеточные элементы, формирующие ГИМ, начинают усиленно продуцировать короткодистантные гуморальные факторы, стимулирующие процессы пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток. Так, уровень ИЛ-1 в кондиционной среде от адге-зирующих нуклеаров волнообразно возрастал, достигая максимальных значений на 1-е, 4-е и 7-е сут (в 2,8, 2,5 и 3,2 раза превышающих исходное). В супернатантах от неприли-пающих миелокариоцитов на 1-е, 2-е и 8-е сут обнаруживалось повышенное содержание МАФ (в 2,7, 2,6, 2,3 раза). Значительно увеличивалась и продукция как прилипающими, так и неприлипаюшими костномозговыми элементами КСА, то есть по существу факторов, ответственных за пролиферацию и созревание гранулоцитов и моноцитов (Metealf,1977,1986,1989; Nicola et al. ,1983; Cerretti et al. ,1988; Williams et al. ,1988). При этом КСА адгезирующих клеток повышалась на 3 -и - 4-е (в 3,4 и 2,3 раза) и на б-е (в 3,8 раза) сут; КСА неадгезирующих через 6 ч - 1 сут (с максимумом на 1-е сут -в 3,5 раза) и на 5-е сут (в 2,7 раза).

Как и следовало ожидать, воспаление сопровождалось значительным возрастанием КСА периферической крови, что свидетельствует о роли колониестимулиругащих факторов, в том числе, вероятно, продуцируемых лейкоцитами очага, в регуляции костномозгового грануломоноцигопоэза и формировании системного ответа кроветворной ткани при воспалении. Повышение КСА крови обнаружено через б ч - 3 сут с пиком на 1-е сут, превышающим исходное значение в 4,4 раза

Увеличение в костном мозге ГО,усиление выработки костномозговыми нуклеарами ИЛ-1, МАФ,КСА, являющихся показателями функции костномозговых макрофагов, лимфоцитов и иных элементов ГШ, свидетельствуют о том, ■ что стимуляция кроветворения при воспалении во многом обусловлена усилением функциональной активности ГШ, которое является двухфазным и наблюдается в период активации гемопоэза как до возникновения гиперплазии костного мозга, так и в фазу ее развития.

-16 -.

Обнаружено также,что воспаление сопровождается достаточно выраженной стимуляцией зритропоэза В частности, на 6 -е-9-е сут воспаления в костном мовге значительно увеличивалось содержание эритроидньи элементов (в 2,5 раза на 8- е сут), что указывает на развитие гиперплазии красного ростка. В ее основе находилось усиление пролиферации и диффе-ренцировки эритроидных предшественников, в польэу которого говорит предшествующее (на 5-е - 7-е сут) увеличение в костном мозге числа КОЕ-Э (в 4,8 раза на 6-е сут). В стимуляции зритропоэза также существенная роль принадлежит возрастанию функциональной активности ГШ, показателем чего является увеличение количества эритроидных ГО и продукции ЭПА адгезирующими и неприлипаюпдами миелокариоцитами. Так, содержание в костном мозге макрофагпозитивных ГО, представленных, главным образом, эритроидными островками,возрастало на 1-е сут (в 2 раза) и 6-е - 9-е сут (с максимумом на 7-е сут, в 1,6 раза превышающим исходное). ЭПА прилипающих клеток была повышена через 6 ч и на 5-е сут (в 2,8 раза в обоих случаях), а ЭПА неадгезирующих - через 12 ч - 2 сут и на 4-е - б-е сут с пиками на 1-е и 5-е сут, превышающими контроль в 3 и 3,5 раза соответственно. Наблвдалось также увеличение ЭПА крови на З-и-4-е и 6-е сут (в 2,4 и' 4,3 раза).

В соответствии с современными представлениями возрастание ЭПА крови, скорее всего, является результатом повышенной продукции зритропоэтина (Г1пп,1989; Бутил,1989). Вместе с тем при воспалении в повышении ЭПА крови и активации костномозгового зритропоэза существенное значение принадлежит, по-видимому, эритропоэтиноподобным веществам, высвобождаемым активированными лейкоцитами очага и периферической крови (Ыаянский А. Е , Маянский Д. Е ,1989).

Одним из важных механизмов стимуляции кроветворения при воспалении может быть активация костномозговых лимфоидных элементов, которые также могут быть отнесены к ГИМ. Уже сам факт усиленной продукции непршшпающими миелокариоцитами МАФ свидетельствует о возрастании функциональной активности костномозговых лимфоцитов. Обнаружено также, что воспаление, как и ряд других патологических процессов, в частное-

ти, экстремальные состояния (Горизонтов П. Д. и др. ,1983; Гольдберг Б. Д. и др., 1983; Дыгай А. М., Шахов В. П., 1989), характеризуется выраженным накоплением в костном мозге Т-лимфоцитов-регуляторов гемопоэза, Так, на 4-е и 5-е сут количество лимфоцитов с Thy-1.2+ -фенотипом в костном мозге возрастало в 2,4 раза. Предварительная обработка миелокари-оцитов aHTH-Thy-1.2+ -антителами приводила к отмене второго (на 6-е сут) пика образования КОЕ-ГЫ (которому аккумуляция в костном мозге Т-лимфоцитов предшествовала), феномена усиления продукции КСА прилипающими клетками на б-е сут, к значительному угнетению выработки КСА неадгезируюшими элементами на 5-е - б-е сут.

Во многом сходные данные были получены и при изучении влияния Thy-1.2+ -клеток на процессы костномозгового эрит-ропозза Элиминация Thy-1.2+ -лимфоцитов из костного мозга сопровождалась существенным снижением выхода (на 4-е - б-е сут) эритроиднйх предшественников (КОЕ-Э), продукции ЭПА прилипающими клетками на 4-е и 5-е сут, уровня ЭПА суперна-тантов неприлипающей фракции клеток костного мозга на 12 ч, 1-е и 6-е сут.

Приведенные данные свидетельствуют, что Т-лимфоциты оказывают на процессы пролиферации и дифференцировки миело-идных прекурсоров стимулирующее влияние. Последнее, как видно,является как прямым, так и опосредованным (через макрофаги костного мозга).

Прежде чем перейти к изучению роли ТК в реакции лейкоцитов очага воспаления,периферической крови и костномозговых клеток, был подвергнут уточнению вопрос о причастности ТК к патогенезу инфекционного воспаления,поскольку относительно роли ТК в патогенезе именно инфекционного воспаления данные литературы противоречивы, что, в свою очередь, во многом обусловлено их немногочисленностью (Smith, Miles,1960; Sheldon, Bauer,1960; Paplanus, Sheldon,1963; Ярош А. А. ,1970).

Установлена выраженная фазная дегрануляция ТК перитоне-альной жидкости и брыжейки с уменьшением их численности и высвобождением больших количеств гистамина, развивавшаяся

- вслед за воздействием флогогена и наблюдавшаяся, по меньшей мере, в течение 5-10 сут. При этом содержание свободного гистамина в экссудате было повышенным в течение первых 5-ти ч, а также на 1-е сут, в брыжейке - на протяжении 3-х ч после воздействия воспалительного агента, а также через 12 ч - 5 сут. Концентрация гистамина в экссудате возрастала (максимально) в 7,1 раза (к 30-ти мин), в брыжейке в 8,1 (к 1-му ч) - 10,7 (на 1-е - 2-е сут) раза. Уровень гистамина в крови превышал исходный в течение всего периода наблюдения (10 сут).

Данные о значительном повышении содержания свободного гистамина в экссудате и воспаленной ткани, а также концентрации гистамина в крови относятся к основным, прямым, доказательствам [в соответствии с критериями Dale и последователей (Menkin,1940,1956; Адьперн Д.Е., Липшиц Р. У. ,1966; Vane, 1972; Willoughby, 1973; Чернух А. M. ,1979; Owen, 1987)3 его вероятной медиаторной роди в очаге острого инфекционного воспаления. Она, в свою очередь, подтверждается значением ТК в развитии одного из основных воспалительных феноменов - повышения ПС. Устранение ТК значительно тормозило \ рост ПС в немедленной фазе ее повышения. К 15-ти мин ПС была на 37,7% ниже, чем в естественных условиях воспаления. Кроме того, удаление ТК задерживало окончание экссудации -на 5-е сут ПС оставалась повышенной по сравнению с таковой при обычном течении воспаления (почти в 4 раза).

Полученные результаты однозначно свидетельствуют о вовлечении ТК в патогенез острого инфекционного воспаления.

Предварительное устранение ТК из брюшной полости существенно сказывалось на реакциях при перитоните всех звеньев система крови - лейкоцитов очага, периферической крови, костномозговых клеток.

Повышение обшэго количества лейкоцитов было двухфазным, как и при обычном течении воспаления, однако при этом первая фаза сокращалась с 5-ти до 3-х сут, пик ее смещался к 12-ти ч (с 3-х сут), а число лейкоцитов значительно превышало таковое при естественном течении воспаления (через 6, 12 ч и 1 сут - соответственно в 1,7, 2,6 и 1,7 раза). Вслед

за этим наблюдалось быстрое снижение количества лейкоцитов, и, начиная с 3-х сут, оно устанавливалось на более низком уровне, чем при типичном развитии воспаления. Первая фаза была обусловлена значительно более выраженным, чем в естественных условиях воспаления, накоплением нейтрофилов, пик которых приходился на 12 ч. В то же время аккумуляция моноцитов отставала от таковой при обычном течении воспаления. Пик ее приходился на 3-й сут. Вторая фаза, обусловленная усиленным приливом моноцитов, запаздывала и была менее выражена.

Цри воспалении,вызванном на фоне отсутствия ТК, отмечалось также усиление функциональной активности нейтрофилов и снижение - моноцитов-макрофагов. Об этом свидетельствуют более заметное снижение активности миелопероксидазы в нейт-рофилах, особенно в сроки, соответствующие первому пику нейтрофилов в очаге и максимальному их относительному количеству среди лейкоцитов экссудата (3 и 5 ч - соответственно в 1,5 и 1,7 раза), отставание активности альфа-нафтилацетат -эстеразы в моноцитах-макрофагах, наблюдаемое через 1, 3, 5 и 7 сут (соответственно в 1,9, 1,7, 1,4 и 1,6 раза), и продукции ими ИЛ-1, которое было достоверным на 3-й сут (в 4,1 раза), более выраженное повышение активности кислой фосфа-тазы в супернатантах перитонеального смыва, которое наблюдалось в ранние сроки, соответствующие нейтрофильной реакции ( 2 ч - в 3 раза), и, напротив, снижение ее на 7-е сут, то есть в период гиперпластического прилива моноцитов в очаг (в 3,9 раза).

Устранение ТК приводило также к существенным изменениям в динамике лейкоцитов крови. Отмечено более раннее развитие выраженного нейтрофилеза и моноцитоза Так, первый пик нейтрофилии наблюдался уже к б-ти ч, а моноцитоза - к 12-ти ч,в то время как при естественном течении воспаления - на 1 -е и 2-е сут соответственно. Второй пик нейтрофилеза смещался на 3-й, а моноцитоза - на 2-е сут (с 6-х сут).

Устранение ТК также существенно влияло на функциональную активность лейкоцитов крови. Наблюдались более выраженные снижение активности миелопероксидазы в нейтрофилах (че-

рез 3 ч и 5 сут от начала воспаления - соответственно в 1,6 и 8,4 раза, активности альфа-нафтилацетат-эстеразы в моноцитах (через 5 и 12 ч - в 1,2 и 1,3 раза), повышение активности кислой фосфатазы в сыворотке крови (черев 3 ч - в 2,1, раэа).

фи устранении ТК наблюдалась также более ранняя активация кроветворения. Содержание незрелых и зрелых нейтро-фильных гранулоцитов костного мозга достигало при этом максимальных значений уже на 2-е и 3-й сут соответственно (против 6-х сут), а количество моноцитов на 1-е сут значительно превышало их содержание в этот срок у животных бее удаления ТК (в 1,8 раза).

Полученные при устранении ТК результаты показывают, что в естественных условиях воспаления ТК прямо или опосредованно оказывают модулирующее влияние на лейкоциты очага, периферической крови и костномозговое кроветворение. Оно выражается в угнетении нейтрофилов и активации моноцитов периферической крови и очага,контроле грануломоноцитопоэза

Обнаруженные при удалении ТК изменения кроветворения во многом обусловлены сдвигами со стороны коммитированных клеток-предшественников грануломоноцитопоэза. Так, .более выраженным было как снижение КОЕ-ГМ в ранние сроки (12 ч), так и возрастание их на 3-й сут. Эти данные хорошо согласуются с изменениями морфологически дифференцируемых элементов костного мозга, сдвигами пиков нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов.

Учитывая важную роль в механизмах стимуляции кроветворения при воспалении ГШ, можно было предположить, что наблюдаемая при удалении ТК более ранняя активация гемопоэза находится в связи с соответствующими изменениями в функционировании ГШ С целью выяснения этого вопроса исследовали функциональное состояние ГШ в динамике воспаления, вызванного на фоне устранения ТК. Ери изучении структурно-функциональной организации костного мозга обнаружено,что воспаление в условиях истошэния популяции ТК характеризуется более ранним возрастанием числа ГО, которое наблюдалось уже к 6-ти ч (против 1-х сут). Принципиальное значение имеет тот

факт, что оно обусловлено увеличением преимущественно мак-рофагнегативных островков, большинство из которых являются гранулоцитарными. Отмечена также более ранняя и интенсивная продукция миелокариоцитами гуморальных факторов. В то время как при естественном ходе воспаления увеличение КСА адгеаи-рующих нуклеаров наблюдалось через 3 сут, при удалении ТК -к 12-ти ч. Продукция же КСА неприлипаюдими миелокариоцитами практически не отличалась от таковой при обычном течении воспаления. Если при естественном ходе воспаления синтез ЯП -1 прилипающими миелокариоцитами возрастал через 1 сут, то при устранении ТК - уже к 6-ти ч. Аналогичная закономерность была выявлена и при тестировании МАФ в супернатантах от неприлипающих миелокариоцитов. Его уровень возрастал соответственно на 1-е сут и к 12-ти ч.

Обнаруженные сдвиги в содержании и качественном составе ГО, секреции КСА, ИЛ-1, МАФ миелокариоцитами при устранении ТК свидетельствуют, что в естественных условиях воспаления ТК оказывают выраженное влияние на ГИМ и что реализация модулирующего воздействия ТК на гемопоээ при воспалении во многом опосредована ГИМ. Более ранние и усиленные эффекты при устранении ТК по сравнению с таковыми при обычном ходе воспаления показывают, что в естественных условиях воспаления ТК контролируют функциональнух! активность ГИМ (которое, соответственно, растормаживается при удалении ТК). ТК лимитируют функциональную активность прилипающих миелокариоцитов (выработку ими М-1 и КСА) и неадгезирувдих клеток (секрецию МАФ).

Следует также отметить запаздывание в возрастании КСА крови в ранние сроки воспаления, развивающегося на фоне отсутствия ТК. Она повышалась на 1-е и 4-е - 6-е сут, в то время, как при обычном развитии воспаления - через 6 ч -3-е сут. Возможно, что КСА крови зависит главным образом от функционирования мононуклеаров очага и крови, которые в условиях устранения ТК угнетаются. Во всяком случае, в регуляции продукции КСА ТК имеют , как видно, существенное значение.

Устранение ТК также заметно сказывалось на функциониро-

вании ГИМ в отношении эритрона. Наблвдалось сниженное образование на 6-е сут воспаления КОЕ-Э. Этому соответствовал тот факт, что достоверное возрастание числа эритрокариоци-тов отмечалось лишь на 1-е сут, в то время как при типичном развитии воспаления - к 12-ти ч и на 6-е - 9-е сут. В то же время наблюдалось более заметное повышение ЭПА как прилипающих, так и неадгезиругацих миелокариоцитов. Напротив, возрастание ЭПА крови при устранении ТК обнаруживалось лишь на 5-е - 7-е сут, в то время как при естественном течении воспаления - на 3-й и 6-е сут.

Истощение популяции ТК несколько усиливало хоминг Т-лимфоцитов в костный мозг и вызывало более выраженную супрессию продукции КСА прилипающими и неадгезируицими мие-локариоцитами при элиминации из суспензии клеток костного мозга Thy-1.2+ -лимфоцитов, что свидетельствует о еще большем повышении функциональной активности Т-лимфоцитов при воспалении, вызванном на фоне отсутствия ТК. Элиминация Thy -1.2+ -клеток приводила также к более раннему возрастанию продукции ЭПА прилипающими миелокарюцитами и запаздывающей - неадгезирующими.

Удаление ТК не сказывалось существенно на влиянии мо-ноклональных антител на эффективность клонирования КОЕ-ГМ и КОЕ-Э.

В целом же приведенные данные указывают на возможность опосредования Т-лимфоцитами модулирующего влияния ТК на функционирование ГШ. В естественных условиях воспаления ТК, как видно, оказывают на лимфоциты угнетающее влияние.

С целью выяснения механизмов модулирующего влияния ТК на лейкоцитарную реакцию при воспалении, связанных с эффектами их биологически активных веществ, были изучены накопление и функциональная активность нейтрофилов и моноцитов очага и периферической крови в условиях применения специфических блокаторов основных продуктов ТК - гистамина, серо-тонина, гепарина. Установлено, что эффекты, аналогичные по своей направленности устранению ТК, - усиленные инфлюкс нейтрофилов в очаг, нейтрофилия и высвобождение ферментов гранулоцитов - воспроизводят в основном антагонист Н2-ре-

- 23 -

цепторов циметидин и гепариннейтрализуюций агент прота-мин-сулъфат. Н1-антагонист димедрол и антисеротониновый препарат ципрогептадин снижают инфлюкс в очаг моноцитов и активность их маркерного фермента альфа-нафгилацетат-эстё-раэы в лейкоцитах очага и крови - эффекты, тага® характерные для отсутствия ТК. Полученные результаты показывают, что модулирующий эффект ТК на нейтрофильную реакцию при воспалении обусловлен главным образом действием гистамина и гепарина и что влияние гистамина осуществляется при этом через Н2-рецепторы. Применительно к моноцитарной реакции эффект ТК связан предде всего с гистамином, оказывающим свое влияние через m-рецепторы, а также с серотонином. В целом данные относительно влияния устранения ТК и антагонистов их биологически активных продуктов на функциональную активность лейкоцитов очага и крови показывают, что модулирующее влияние ТК на гемопоэз при воспалении во многом может реализовываться через лейкоциты очага и крови.

Полученные результаты согласуются с некоторыми данными относительно влияния биологически активных веществ ТК на функции различных лейкоцитов in vitro. Так, гистамин через HL-рецепторы усиливает, а через Н2-рецепторы угнетает хемо-кинез, хемотаксис, дегрануляцию, образование аниона супероксида активированными нейтрофилами (Spisani,1982; Seligmann et al. ,1983; Van'Epps et al. ,1987; Mannaioni et al. ,1988); через HL-рецепторы повышает секрецию, образование аниона супероксида и хемилюминесценцию моноцитов (Diaz et al. ,1979; Casale et al. ,1985); через Н2-рецепторы угнетает синтез лимфокинов и другие функции Т-клеток (Shearer et al. ,1972; Herrney et al. ,1972; Rocklin,1976; Plaut, Lichtenstöln,1982). Серотонин стимулирует хемотаксис, хемо-кинез и секрецию мононуклеарных клеток (Spisani,1982; Paegelow, Verner,1987; Ameisen et al. ,1989). Показана способность гепарина in vitro вызывать агрегацию полиморфноя-дерных лейкоцитов, угнетать лейкоцитарные протеиназы (Berliner et al., 1988; Redini et al. ,1988). Модулирующее влияние на лейкоциты может быть связано также с другими биологически активными веществами ТК - фактором,активирующим

■тромбоциты, гидроксиэйкозатетраеноевыми кислотами, лейко-триенами (Spada et al. ,1988; Spicer et al. ,1988), а такл© нетучноклеточными медиаторами, в регуляции продукции которых ТК имеют значение, например, простатландинами (Wasserman,1987).

Значительный интерес представляет вопрос о возможной обратной связи в отношении ТК-лейкоцита Современное состояние учения о воспалении позволяет рассматривать патогенеа воспаления как цепь множественных межклеточных взаимодействий, регулируемых медиаторами. Существенное значение имеет выяснение возможной взаимосвязи ТК и лейкоцитов - двух относительно автономных пусковых эффекторных систем воспалительного ответа Исследованиями in vitro или при введении извне показано, что биологически активные продукты различных лейкоцитов - лизосомадьные ферменты и катионные белки, цитокины, активные метаболиты кислорода, димфокины - способны вызывать дегрануляци» ТК и, таким образом, высвобождение содержащихся или вновьобразующихся в них потенциальных медиаторов воспаления (Ranadive, Ruben,1981; Askenase, Loweren, 1983; Stendahl et al. ,1983; Schulman et al. ,1985; Pistelli et.al. ,1988). Однако имеют ли в действительности лейкоциты значение в реакции ТК в очаге воспаления, неизвестно.

С целью выяснения этого вопроса исследовалось морфо-функвдональное состояние ТК в динамике острого инфекционного перитонита, вызванного на фоне лейкопении, у крыс.

Следует указать, что ещэ при естественном развитии воспаления была замечена выраженная обратная зависимость между интенсивностью дегрануляции и снижения количества ТК и аккумуляцией в очаге лейкоцитов. Перитонит, воспроизводимый на фоне лейкопении, сопровождался фазной реакцией ТК, как и при естественном его развитии. В перитонеальной жидкости при этом первая фаза, отмечаемая в течение получаса после воздействия воспалительного агента, характеризовалась более интенсивными дегрануляцией ТК и снижением их количества В период до 5-ти ч процентное содержание дегранулированных ТК при естественном течении воспаления и развитии его на фоне

лейкопении практически не различалось, однако интенсивность дегрануляции в последнем случае была выше - отмечалось заметное преобладание ТК 2-й степени дегрануляции. Через 12 ч - 5 сут у лейкопенических животных преобладало и общее процентное содержание дегранулированных клеток. В брыжейке лейкопенических крыс дегрануляции также была более выраженной, чем при естественном развитии перитонита, на протяжении всего эксперимента (10 сут). Содержание свободного гис-тамина в перитонеальном смыве и брыжейке достигало первого пика уже к 5-ти мин после воздействия флогогена, в то время как при естественном ходе воспаления - к 30-ти мин и 1-му ч соответственно. Как через 5 мин, так и через 2-5 ч концентрации свободного гистамина в брылейке, несмотря на сниженный запас амина в исходном состоянии у лейкопенических животных, превышали таковые в естественных условиях воспаления, что свидетельствует об опережающем высвобождении гистамина в первом случае. Также в крови средние величины гистамина через 15 мин, 3-5 ч и 12 ч были выше наблюдаемых при естественном ходе воспаления.

Описанные изменения в реакции ТК у лейкопенических животных в значительной мере совпадали с модификациями кинетики лейкоцитов в брюшной полости и крови. При воспалении у лейкопенических животных обнаружено первоначальное снижение количества лейкоцитов в брюшной полости с минимальным их содержанием к 5-ти ч, что, по-видимому, отражает явление убыли резидентных клеток при отсутствии надлежащего подкрепления со стороны лейкоцитов крови. В последующем отмечались два скачкообразных прилива лейкоцитов - к 12-ти ч и 2-м сут. При этом первый инфлхкс лейкоцитов был практически полностью обусловлен моноцитами, а второй - отчасти и нейт-рофилами. В крови прилив лейкоцитов также был отмечен только к 12-ти ч и обусловлен возрастанием числа моноцитов и лимфоцитов. Заметное, но незначительное по сравнению с таковым при естественном ходе воспаления, увеличение нейтро-филов наблюдалось лишь спустя 1-2 сут от начала воспаления.

Результаты исследований показали, что лейкопения оказывает существенное влияние на морфофункциональное состояние

ТК очага воспаления. Она приводит к усилению дегрануляции ТК как в период до поступления в очаг заметного количества лейкоцитов (в первые 5 ч после воспроизведения воспаления), так и в ходе массивного инфлюкса лейкоцитов (5-12 ч, 1-2 сут). Усиление дегрануляции ТК в первый период обусловлено, по-видимому, чрезмерным действием бактериальных факторов в связи с отменой ыикробицидного эффекта лейкоцитов, а во второй - влиянием избытка лейкоцитарных продуктов вследствие одновременного поступления большого количества лейкоцитов. В целом реакция ТБ в условиях лейкопении осуществляется опережающими темпами по сравнению с таковой в естественных условиях воспаления.

Следует заметить, что усиленная дегрануляция ТК, наблюдаемая вслед sa воздействием воспалительного агента, может быть обусловлена высокой исходной дегрануляцией ТК у лейко-пенических животных. Вместе с тем повышенная дегрануляция и сниженное количество ТК в исходном состоянии может быть компенсаторной реакцией на отмену циркулирующих лейкоцитарных факторов, с которыми продукты ТК могут взаимодействовать в отношении механизмов регуляции гомеостаэа (например, сосудистой проницаемости) в норме и патологии, в том числе при воспалении. Пэ Vfedrore, Williams (1981), циркулирующим нейтрофилам принадлежит важная роль в контроле сосудистой проницаемости. Уменьшенное исходное количество ТК может быть также обусловлено снижением костномозговой продукции тучноклеточного предшественника, являющегося, по некоторым данным, к тому же общим с гранулоцитарным (Bender et al. ,1988).

Сдвиги в морфофункциональном состоянии ТК при воспалении, вызванном на фоне лейкопении, свидетельствуют, что в естественных условиях воспаления в реакции ТК существенное значение имеют лейкоциты - нейтрофилы и моноциты. Поступая в очаг, они, по-видимому, одновременно оказывают на ТК защитный (от действия патогенных микроорганизмов) и деграну-лирующий эффекты, регулируя, таким образом, реакцию ТК. фи этом дегранулирукяцее воздействие лейкоцитов на ТК также не является, видимо, однозначно логическим (цитотоксическим),

учитывая главным образом нецитотоксический тип дегрануля-ции, а также эффект не только катионных белков, но и возможность модулирующего влияния при воспалении лизосомальных ферментов, цитокинов и активных метаболитов кислорода (Пи-гаревский Е Е., 1975; О^боп, Чещ&, 1980; ВШ1пдЬат,1987; Н1 гзсЬе 1тапп, 1987).

Полученные данные послужили основанием для предположения о том, что при воспалении, не связанном с патогенными микрсорганизмами, реакция ТК у лейкопенических животных, по крайней мере первоначально (до притока в очаг заметного числа лейкоцитов), отстает от таковой в естественных условиях воспаления. Поэтому в отдельной серии исследований было проведено сравнительное изучение реакции ТК при караги-неновом перитоните у крыс в естественных условиях его развития и на фоне лейкопении. Установлено, что при асептическом воспалении, вызванном на фоне'лейкопении, как и в случае инфекционного воспаления у лейкопенических животных, реакция ТК в начальные сроки (до 30-ти мин) была более выраженной, чем в естественных условиях воспаления. Однако к 3-м и 5-ти ч процентное содержание дегранулированных клеток заметно снижалось, а абсолютное количество ТК возрастало по сравнению с предыдущими сроками исследования, в то время как в естественных условиях воспаления дегрануляция продолжала нарастать, а количество ТК - снижаться. Через 12 ч у лейкопенических животных обнаружено повторное увеличение числа дегранулированных клеток, что приводило, в свою очередь, к новому снижению абсолютного числа ТК на 1-е и 2-е сут. Содержание свободного гистамина в перитонеальном смыве и брыжейке, а также концентрация гистамина в крови изменялись волнообразно в соответствии с колебаниями числа ТК и их дегрануляцией. При этом изменения морфофункционального состояния ТК, как и в случае инфекционного воспаления у лейкопенических животных, совпадали с колебаниями числа лейкоцитов в очаге воспаления, находясь с ними в обратной зависимости. Со стороны лейкоцитов экссудата наблюдалось первоначальное снижение их количества с минимумом к 5-ти ч, "а к 12-ти ч, а затем 1-м сут отмечались заметные приливы. В

-28" ,

целом реакция ТК при асептическом воспалении, вызванном на фоне лейкопении,- отставала от таковой при естественном развитии воспаления. Эти данные подтверждают вывод о том, что в реакции ТК очага воспаления существенная роль принадлежит лейкоцитам.

Данные о взаимосвязи ТК и лейкоцитов при воспалении, в свою очередь, послужили основанием для постановки вопроса о взаимодействии ТК с лейкоцитами в медиации воспалительных явлений. Учитывая роль как ТК, так и лейкоцитов в повышении ПС, их возможное взаимодействие изучено в отношении этого феномена. О этой целью исследовали кинетику 1Ю брюшной полости крыс на протяжении экссудагивной фазы острого инфекционного перитонита (в течение 5-ти сут) в естественных условиях воспаления и при развитии его на фоне изолированного и сочетанного устранения ТК и лейкоцитов.

Как уже указывалось, изолированное устранение ТК выражалось главным образом в угнетении степени повышения ПС в немедленной фазе, что свидетельствует о роли ТК в нарушении ПС преимущественно в этот период. Лейкопения также существенно угнетала рост 1Ю в немедленной фазе - ПС была в. 2,6 раза меньше, чем при естественном течении воспаления. Кроме того, лейкопения нарушала ПС и в замедленной фазе. Так, в период своего максимума в этой фазе (5 ч) ПС была на 27,6% ниже, чем при обычном ходе воспаления. В то же время в последующие сроки перитонита она превышала наблюдаемую при типичном развитии воспаления, что, по всей видимости, связано с превышением обычного для воспаления числа лейкоцитов в очаге и значительным возрастанием их количества в крови в этот период, вероятно, вследствие двойной стимуляции гемо-поэза - воспалением и эффектом винбластина, характеризующимся на 6-е сут, что соответствует 2-м сут перитонита, лейкоцитозом. На 5-е сут ПС возвращалась к исходной, однако оставалась повышенной по сравнению с нормой. Приведенные данные свидетельствуют о роди лейкоцитов в повышении ПС на протяжении всей экссудативной фазы воспаления. Сочетанное устранение ТК и лейкоцитов наиболее существенно сказывалось на ПС. Оно не только угнетало степень повышения ПС в тече-

ние всей экссудативной фазы воспаления, но и резко извращало кинетику ГО. Наблюдались два необычных подъема Ш - с максимумами на 2 ч и 12 ч - 3 сут, отражающие вадержку развития немедленной и замедленной-фаз повышения 1Ю. На 5-е сут Ш возвращалась к исходной для данной группы животных, однако оставалась повышенной по сравнению с нормой.

Подученные результаты свидетельствуют о том, что в естественных условиях воспаления имеет место взаимодействие ТК с лейкоцитами в повышении ПС. Принимая во внимание, что оба типа клеток высвобождают биологически активные вещества, способные непосредственно повышать ГО, и в своем эффекте на эндотелий 'не зависят друг от друга (Wedmore, Williams,1981; Movat,1987), можно полагать, что взаимодействие ТК с лейкоцитами основано на взаиморегуляции секреции, их продуктов. Представляется, что тандем ТК-лейкоциты может иметь существенное значение в кооперативной регуляции ПС в норме и выступать как относительно автономное саморегулирующееся звено медиаторной системы при воспалении.

Результаты собственных исследований и данные литературы позволили предложить схему, отражающую взаимосвязь ТК и лейкоцитов и некоторые механизмы регуляции гемопоэза при воспалении (рис.).

В механизмах модулирующего влияния биологически активных продуктов ТК, как, видимо, и других медиаторов, на ге-мопоэз важную роль может играть такие непосредственное воздействие их на костный мозг. Показана способность не только гистамина, но и некоторых других потенциальных медиаторов воспаления (простатландинов, фактора некроза опухоли) стимулировать или угнетать пролиферацию и дифференцировку коммутированных клеток-предшественников в культуре ткани (Xie Ren Fu et al. ,1989; Canntstra et al. ,1990). Биологически активным веществам, выступающим при воспалении в качестве медиаторов, принадлежит,видимо, важная роль в регуляции гемопоэза в норме и при патологических процессах невоспалительного характера.

ВЫВОДЫ

1. Доказана важная роль и вскрыты механизмы регулирую-

Рис. Схема, показывающая взаимосвязь тучных клеток с лейкоцитами и некоторые механизмы регуляции кроветворения при воспалении.

ППС - повышение проницаемости сосудов; ХА - хематтрак-танты; ТК - тучная клетка; Г - гистамин; ПМЯЛ - полиморфно-ядерный лейкоцит; МОИ - моноцит; Щ. и Н2 - соответствующие гистаминовые рецепторы; ЛФ - лизосомальные факторы (ферменты и катионные белки); Ц - цитокины; СР - свободные радикалы кислорода; КСФ - колониестимулируювде факторы; ЮМ -интерлейкин-1; Л - лимфокины; ГИМ - гемопоэзиндуцирующее микроокружение.

щего влияния на костномозговое кроветворение при воспалении гемопоэзиндуцирующего микроокружения и медиаторов начальной фазы острого воспаления, продуцируемых тучными клетками.

2. Реакция грануломоноцитарного ростка кроветворной ткани при воспалении носит фазный характер. В ее основе, помимо перераспределительных механизмов, лежит активация кроветворения с развитием гиперплазии костного мозга, которому предшествует возрастание числа в гемопоэтической ткани коммитированных клеток- предшественников грануломоноцитопо-ээа

3. Воспаление характеризуется также усилением костномозгового эритропоэза, наблюдаемым в фазу гиперплазии костного мозга и обусловленным стимуляцией пролиферации и диф-ференцировки эритроидных предшественников.

4. Развитие воспаления сопровождается рядом структурных и функциональных изменений со стороны гемопоэзиндуцирующего микроокружения: увеличением числа гемопоэтических островков, усилением продукции миелокариоцитами колониестимулиру-ющих и эритропоэтических активностей, интерлейкина-1, макрофаг- активирующего фактора

5. Развитию гиперплазии костного мозга предшествует миграция в костный мозг Т-лимфоцитов (ТЬу-1. 2+ -клеток). Предварительная обработка миедокариоцитов анти-ТЬу-1.2+ -антителами приводит к отмене феномена стимуляции кроветворения в период гиперплазии костного мозга на уровне миело-идных предшественников. Т-лимфоциты оказывают стимулирующее влияние на клетки-предшественники эритро- и грануломоноци-гопоэза как прямо, так и опосредовано через макрофаги костного мозга

6. В реакциях системы крови при воспалении играют роль медиаторы, продуцируемые тучными клетками. Предварительное устранение тучных клеток приводит к более ранней стимуляцией грануломоноцитопоээа, развитию лейкоцитоза. Влияние тучных клеток на кроветворение осуществляется при участии гемопоэзиндуцирующего микроокру,тения. При удалении тучных клеток наблюдается более выраженное повышение функциональ-

ной активности гемопоэзиндуцирующего микроокружения, Т-лимфоцитов-регуляторов кроветворения.

7. Регулирующее влияние тучных клеток на гемопоэз при воспалении реализуется во многом через лейкоциты очага и крови. При удалении тучных клеток наблюдается усиление эмиграции и функциональной активности нейтрофилов и снижение - моноцитов. Воздействие тучных клеток на лейкоциты осуществляется при участии гистамина, серотонина и гепарина. Гистамин оказывает эффект главным образом через Н2-ре-' цепторы на нейтрофилах и Н1-рецепторы на моноцитах.

8. Лейкоциты, в свою очередь, оказывают регулирующее влияние на высвобождение тучными клетками медиаторов-модуляторов, осуществляя комбинированный -защитный (по отношению к литическому действию микроорганизмов) и активирующий - эффект. При инфекционном воспалении лейкопения, вызванная винбластином, приводит к усилению дегрануляции тучных клеток как в период до поступления в очаг заметного количества лейкоцитов, так и в ходе их массивного прилива, тогда как при асептическом - к задержке реакции тучных клеток до момента значительного инфлюкса лейкоцитов.

9. В патогенезе воспаления имеет место взаимодействие тучных клеток с лейкоцитами в медиации воспалительных явлений. В то время как изолированное устранение тучных клеток или лейкоцитов сказывается лишь на степени повышения проницаемости сосудов очага воспаления, их сочетанное удаление также кардинально нарушает кинетику ответа, значительно задерживая развитие немедленной и замедленной фаз повышения сосудистой проницаемости.

Перечень работ, опубликованных по теме диссертации.

1. К методу морфологического изучения и подсчета тучных клеток смывов серозных полостей // Физиол. журн. - 1977. - N 5.- С. 705-707.

2. Освобождение гистамина и серотонина и проницаемость сосудов в очаге острого асептического воспаления // Бюл. эксперим. биол. и мед. -1977. - N 12. С. 660-664 (совместно с Липшиц Р. У.).

3. Release of histamine and serotonin and vascular

permeability in early acute inflammation //Int. Congr. Inflammation: Abstr. book. Bologna, 1978. - S. 1.- P. 83, s. a 1988 ( with Lipshits R. U. ).

4. Проницаемость сосудов в очаге острого воспаления на фоне действия антагонистов гистамина и серотонина // Физи-ол. журн. -1980.-N 5.-С.690-692 (совместно с Липшиц Р.У.).

5. Тучные клетки, высвобождение гистамина и серотонина в ранней фазе гиперергического плеврита у белых крыс // Фи-зиол. зкурн.-1985. - N 3.-С. 660-663 (совместно с Липшиц Р. У.).

6. К методу определения сосудистой проницаемости с использованием витального красителя //Науч. -технич. прогресс в медицине и фундаментальные проблемы биологии: Тез. докл. обх науч.-прага. конф.-Харьков,1987.-С. 87 (совместно с Липшиц Р. У. ).

7. Тучные клетки легкого при экспериментальном гиперер-гическом плеврите // Физиол. гяурн. - 1989. -N 3. - С. 102-106 (совместно с Липшиц Р.У.).

8. Медиаторы ранней фазы острого воспаления и их взаимодействие // Нарушение механизмов регуляции и их коррекция: Тез. докл. 4-го Всесоюз. съезда патофизиол. -М.,1989.-С. 446 ( совместно с Липшиц Р. У., Нечитайло Ю. Д., Звягинцевой Т. В.).

9. Холинергические и гистаминергические процессы в патогенезе инфекционного воспаления // Центральная регуляция вегетативных функций: Матер. 8-й науч. конф. ЦНИЛ Тбилисского ин-та усоверш. врачей.-1989.-С. 170 (совместно о Липшиц Р. У. , Нечитайяо Ю. Д. , Звягинцевой Т. В. ).

10. Влияние биологически активных веществ тканевых ба-зофидов на лейкоцитарную реакцию очага воспаления,// Фармакология: состояние и перспективы: Тез. докл. 6-го съезда фармакол. Украинской ССР.-Харьков,1990.-С. 139-140 (совместно с Пышновым Г. Ю. ).

11. The infectious focus of inflammation: Mast cells and their role in exudative-infiltration and proliferation phenomena // Proc. Int. Soc. Pathophysiol. 1. Abstr. Const. Congr. -Moskow,1991. -P. 284, s. a 12.1.09 ( with Pyshnov G. Yu. , Tatarko S.V.).

12. Interaction of mediators in pathogenesis of the early stage of acute inflammation //Proc. Int. Soc. Pathophysiol. 1. Abstr. Const. Congr. -Moscow, 1991. -P. 285, s. a. 12.1.13 (with Lipshits R.U. , Nechitallo Yu.D.).

13. Мэрфофункциональное состояние тучных клеток в очаге инфекционного воспаления // Микробиол., эпидемиох и клиника инфекционных болезней /Харьков, мед. ин-т.-1991.-С. 29-30. (совместно с Липшиц Р.У., Нечитайло К1Д.).

14. Роль гемопоэзиндуцирувдего микроокружения в активации костномозгового кроветворения при воспалении // Структурно-функциональные единицы и их компоненты в органах висцеральных систем: Тез. докл. науч. -практ. конф. -Харьков, 1991. -С. 114.

15. Роль тучных клеток в механизмах персистенции воспаления // Патогенез хронического воспаления: Тез. докл. Все-союз. симпозиума с международ, участием.-Новосибирск,1991.-С. 32-33 (совместно с Дыгаем А. Ы., Пышновым Г. Ю., Татарко С. Е , Гумилевским К Ю., Абрамовой Б. В., Гольдбергом Е. Д.).

16. Реакции системы крови при воспалении и их механизмы // Патогенез хронического воспаления: Тез. докл. Всесоюз. симпозиума с меадународ. участием-Нэвосибирск, 1991.-С. 17-18( совместно с Гольдбергом Е. Д.,Дыгаем А. М. .Гумилевским Б. id).

17. Роль тучных клеток в реакциях системы крови при воспалении // Бюл. эксперим. биол. и мед. -1991. -N 9. -С. 305307 (совместно с Дыгаем A.IL, Абрамовой Е.Е, Симаниной Б. В., Гумилевским Б. Ю., Болдышевым Д. А., Гольдбергом Е. Д.).

18. Реакции системы крови при воспалении и механизмы их развития //Пат. физиол-1991.-N 6.-С. 28-31 (совместно с Дыгаем А. М., Абрамовой Б. Е , Шаховым Е П., Богдашиным И. Е , Захаровой О. Ю., Симаниной Б. Е , Шэрстобоевым Е. Ю., Гумилевским Е 1й , Болдышевым Д. А., Гольдбергом Е. Д.).

19. Тучные клетки в очаге острого инфекционного воспаления // Физиох журн.-1992. -N 1.-С.64-68 (совместно с Татарко С. Е).

20. Роль лейкоцитов в повышении проницаемости сосудов очага инфекционного воспаления //Физиол. журн. -1992. -N 1. -С. 68-72.