Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Механизмы регуляции и функции интерферон-индуцируемой триптофанил-тРНК-синтетазы человека

На правах рукописи

ЗАБA3 АРНЫХ Михаил Юрьевич

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ И ФУНКЦИИ ИНТЕРФЕРОН-ИНДУЦИРУЕМОЙ ТРИПТОФАНИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗЫ ЧЕЛОВЕКА

14.00.36 - аллергология и иммунология 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2004

Работа выполнена в Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор В.А. Алешкин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А.А. Терентьев

доктор биологических наук, профессор ВЛ. Арион

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Защита диссертации состоитсям_"_2004 г. в часов на

заседаниидиссертационного совета К208.046.01 по адресу: 125212Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского.

Автореферат разослан 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Л.И. Новикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы

Илтерфероны (IFN), главные цитокины врожденного иммунного ответа, играют ключевую роль в регуляции антивирусной и противоопухолевой защиты организма. Врожденный иммунный ответ особенно важен на ранней стадии защиты организма от биологической агрессии, до того как развивается антиген-специфический адаптивный иммунный ответ. Это приводит к формированию защитного состояния в инфицированном организме, позволяя снизить интенсивность инфекционного процесса и давая достаточное время для формирования адаптивного иммунного ответа. IFN организуют этот «первый рубеж» защиты от чужеродных агентов, повышая (или снижая) экспрессию целого ряда генов. Несмотря на то, что роль некоторых из IFN-индицируемых белков в защитных реакциях хорошо известна (таких, например, как компоненты главного комплекса гистосовместимости, протеинкиназа R, олигоаденилат-синтетаза (2-5AS) или РНКаза L), другие IFN-индуцируемые белки требуют более глубокого исследования для понимания широкого спектра эффектов, вызываемых IFN.

Одним из таких белков является трилтофанил-тРНК-синтетаза (WRS, К.Ф. 6.1.1.2) человека. Известно, что WRS вовлечен в различные защитные реакции организма. Помимо индукции различными IFN, экспрессия WRS повышается в ходе кожной реакции гиперчувствительности замедленного типа [Yang et al., 2001] и на последних стадиях созревания мононуклеарных фагоцитов [Krause et al., 1996]. Недавно было обнаружено, что WRS человека обладает выраженной антиангиогенной активностью, являясь, таким образом, цитокином [Wakasugj et al., 2002; Otani et al., 2002], в связи с чем было предложено использовать WRS человека для лечения гипоксических и других пролиферативных ретинопатии. Помимо так называемой «канонической» активности WRS (активация триптофана для последующего его использования в биосинтезе белка путем связывания его со специфической тРНК), которая была подробно охарактеризована, WRS обладает рядом «неканонических» активностей, являясь, таким образом, полифункциональным белком. В частности, ранее нами было показано, что N-домен WRS быка (но не человека)

I БИБЛИОТЕКА I

! ¿гжщ

активностью [Елизаров и соавт., 1997]. Однако, с момента неожиданного открытия !КМ-индуцируемости WRS человека, более десятилетия роль WRS в ответе клетки на IFN остается не до конца понятной и вызывает большой интерес исследователей.

Исследование механизмов действия интерферонов является актуальной для современной иммунологии и биохимии проблемой. Возрастающий интерес исследователей и практических врачей к этой проблеме обусловлен не только высокой эффективностью применения препаратов интерферона при таких патологических состояниях, как вирусные и онкологические заболевания, болезни крови, но и неуклонным ростом числа больных, страдающих вышеперечисленными заболеваниями, что придает исследованию особенную актуальность.

Цель исследования: изучение путей регуляции и механизмов действия IFNy-индуцируемой WRS человека как части IFNy-зависимой защитной системы организма.

Задачи исследования:

- изучение влияния модуляторов активности протеинкиназы С на экспрессию IFNY-индуцируемого гена WRS в культуре клеток человека HeLa и НЕК293;

- изучение влияния IFNy-индуцируемоro WRS человека на активность киназ семейства CDK человека;

- исследование механизмов взаимодействия WRS с CDK в ходе клеточного ответа на IFNy;

- исследование роли IFN-индуцируемого WRS человека в развитии антипролиферативного действия

Научная новизна работы

Показано, что ген WRS индуцируется IFNy в эмбриональной почечной линии клеток человека НЕК293. Показано, что протеинкиназа С положительно регулирует экспрессию гена WRS человека. На основе полученных данных была предложена гипотетическая схема участия протеинкиназы С в согласованной

регуляции ряда IFN-индуцируемых ферментов, связанных с метаболизмом триптофана и 5'5'"-диаденозинтрифосфата (АрзА), и обладающих противовирусной и противоопухолевой активностью.

Установлена ранее неизвестная CDK-ингибирующая активность WRS человека и показана ее роль в антипролиферативном действии IFNy. Продемонстрировано, что рекомбинантный WRS человека ингибирует киназную активность CDK in vitro, и ШЫу-индуцированный WRS человека ингибирует активность CDK в культуре клеток человека. Обнаружено, что индукция WRS в ответ на IFNy вызывает образование комплекса WRS с cdc2 и CDK2 в клетках HeLa, что- сопровождается высвобождением активирующей субъединицы циклина из комплекса с cdc2 и CDK2. Доказано, что WRS непосредственно вовлечен в развитие антипролиферативного действия в культуре клеток

человека. Эти данные демонстрируют ранее неизвестные механизмы воздействия на клетки человека.

Практическая значимость работы

Полученные новые данные о механизмах действия на клетки человека важны дня понимания патогенеза вирусных и онкологических заболеваний и могут послужить для прогнозирования течения этих заболеваний и разработки новых подходов их лечения. Кроме того, эти данные могут помочь более эффективно использовать для лечения онкологических и инфекционных заболеваний.

Положения, выносимые на защиту

1. Протеинкиназа С активирует экспрессию гена WRS в клетках человека HeLa и НЕК293.

2. WRS человека специфически ингибирует активность cdc2 и CDK2 человека in vitro.

3. В ходе ответа клетки на IFNy WRS человека образует комплекс с cdc2 и CDK2 в клетках человека, что сопровождается высвобождением активирующей субъединицы циклина из комплекса с cdc2 и CDK2.

4.WRS непосредственно вовлечен в развитие антяпролиферативного действия IFNy в клетках НЕК293 и HeLa.

Апробация работы

Материалы работы были представлены на международной конференции The cell cycle and its checkpoints Jacques Monod Conference CNRS (Roscof£ France, 2002).

Публикации-

По материалам диссертации опубликовано 2 печатных работы, 1 работа подана в печать.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 117 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы (224 наименования). Диссертация содержит 19 рисунков и 3 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали культуры клеток человека HeLa (рак шейки матки) и НЕК293 (эмбриональной почки трансформированные ДНК аденовируса типа 5), полученные из коллекции культур АТСС (США). Культуры клеток человека поддерживали в виде монослоя среде DMEM («Gibco BRL», США) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки («Gibco BRL») и антибиотиков (100 едУмл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) при 37°С в атмосфере 5% Для исследования механизмов действия IFNy на клетки человека, культуры клеток обрабатывали 100 Ш/мл рекомбинантного IFNy человека, а также активаторами и ингибиторами протеинкиназы С.

Содержание различных белков в клетках после соответствующих обработок клеток анализировали методом иммуноблоттинга клеточных экстрактов.

Содержание мРНК WRS в клетках человека после соответствующих обработок клеток анализировали совместно с Д.Ю. Литвиновым (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН) методом Нозерн-гибридизации.

Иммунопреципитацию различных белков из клеточных экстрактов, полученных после различных обработок клеток, проводили с использованием протеин А-сефарозы («Amersham Pharmacia Biotech») и антител соответствующей специфичности.

В работе использовались кроличьи антисыворотки против WRS и других аминоацил-тРНК-синтетаз, любезно предоставленные сотрудниками Center for ARS Network, Южная Корея, а также коммерческие антитела против различных CDK, циклинов и тубулина («Oncogene», «Santa-Cruz» и «Becton-Dickinson», США). Поликлональные антитела (пАТ) против WRS человека очищали из антисыворотки кролика с использованием колоночной хроматографии на протеин А-сефарозе, («Bio-Rad», США).

Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд [Bradford, 1976] и спектрофотометрически при длине волны 280 нм.

Электрофорез различных белковых препаратов в денатурирующих условиях проводили по методу Лэммли [Laemmli, 1970].

Фосфорилирование белков in vitro проводили как. было описано ранее [Елизаров и соавт., 1997]. Ингибирование активности протеинкииаз исследовали, инкубируя протеинкиназы в присутствии рекомбинантного WRS человека, после чего определяли киназную активность с использованием специфических белковых субстратов.

Конструкция, представляющая собой полноразмерную кодирующую последовательность WRS человека с б-His на С-конце, клонированную в экспрессирующий вектор рЕТ28 («Novagen», США), была любезно предоставлена J. Kim (Center for ARS Network, Южная Корея). Для получения рекомбинантного WRS человека вектор трансформировали в экспрессирующий штамм Е. coli BL21(DE3). Рекомбинантный белок выделяли на смоле Ni-NTA с последующей очисткой хроматографией на колонке Mono Q HR 5/5 с

использованием системы FPLC («Pharmacia», Швеция) до очевидной гомогенности (>99%), добавляли глицерин до 20% (об.) и хранили при -20°С.

На основе вектора pcDNA3.1 TOPO («Invitrogen», США) была сконструирована плазмида AS-WRS, эспрессирующая антисмысловую РНК WRS. Для выяснения роли IFNy-индуцируемого WRS в действии IFNy на клетки человека, IFNy-индуцируемую экспрессию гена WRS подавляли с помощью трансфекции культивируемых клеток человека вектором AS-WRS. Конструкция антисмысловой WRS и трансфекция клеток человека проводились совместно с лабораторией S-H. Kim (Center for ARS Network, Южная Корея).

Пролиферативную активность в культурах клеток человека оценивали по скорости синтеза ДНК в этих клетках. Для этого клетки пульс-метили в присутствии [Щгимидина (1 мкКи) в течение 3 ч и определяли включение трития с помощью сцинцилляционного счетчика («Wallac», США). Скорость синтеза ДНК определялась совместно с лабораторией S-H. Kim (Center for ARS Network, Южная Корея).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние модуляторов активности протеинкиназ на экспрессию гена WRS в клетках человека

Форбол-12-миристат-13-ацетат (РМА) известен как специфический активатор протеинкиназы С (РКС) и широко используется для изучения путей передачи сигнала с участием РКС. Известно, что РКС является посредником передачи сигнала многочисленных реакций клеток, в том числе иммунологических. Ранее было показано, что РМА повышает индукцию интерфероном противовирусного белка 2'-5'ч>лигоаденилат-синтетазы (2-5AS) и увеличивает концентрацию 5',5т-диаденозинтрифосфата (АрзА) в культурах клеток [Vartanian et al., 1997]. Поскольку известно, что WRS непосредственно вовлечен в синтез АрзА [Merkulova et al., 1994], а АрзА может активировать 2-5AS, можно предположить, что содержание WRS может быть каким-то образом связано с активностью РКС.

Для того чтоб проверить это предположение мы исследовали действие активаторов и ингибиторов РКС на экспрессию гена WRS в клетках человека:

эпителиальных HeLa и эмбриональных почечных НЕК293. РМЛ в отсутствие IFNy увеличивал экспрессию WRS в HeLa и НЕК293 соответственно в 2 и 1,6 раз и усиливал индукцию WRS под действием- IFNy в этих клеточных линиях соответственно в 2 и в 2,6 раза, не вызывая достоверных изменений содержания других аминоацил-тРНК-синтетаз, включая EPRS, MRS и QRS (Рис. 1).

Рис 1. Влияние IFNy и модуляторов активности РКС на содержание WRS в клетках человека. Содержание белков WRS, EPRS, MRS и QRS анализировали с помощью иммуноблоттинга в клетках HeLa (А) и WRS - в клетках НЕК293 (Б) после обработки 0,1 мкМ РМА, 100 Ш/мл IFNy и стауроспорином (St) в различных комбинациях в течение 16 ч. В — Гистограмма содержания белков после указанных обработок. Пятна на рентгеновских пленках, соответствующие белкам, количественно определяли с помощью денситометра, и относительные плотности нормализовали относительно плотностей белков в необработанных клетках.

Обработка клеток 100 Ш/мл IFNy сопровождалась 5,5-кратным повышением содержания WRS в клетках HeLa по сравнению с необработанными клетками (Рис. 1, А и В), в то время как содержание EPRS, MRS и QRS оставалось неизменным. IFNy вызвал 2,9-кратное увеличение содержания WRS в клетках НЕК293 (Рис. 1, Б и В). Не все клеточные линии демонстрируют

индукцию WRS под действием IFNy [Fleckner et al., 1995]. Таким образом, в нашей работе показан ранее неизвестный факт что DFNy индуцирует WRS в эмбриональной культуре клеток почек человека НЕК293 (Рис. 1, Б и В), а также подтверждены данные о том, что IFNy индуцирует WRS в клетках HeLa.

Рис 2. Экспрессия мРНК WRS в клетках HeLa. после обработки 0,1 мкМ РМА. Суммарную РНК выделяли, и содержание мРНК WRS анализировали с помощью

гибридизации с 32Р-меченой пробой кДНК. После экспонирования фильтр отмывали и' повторно гибридизовали для измерения уровня мРНК GAPDH. Количества мРНК WRS нормализовали относительно уровня мРНК GAPDH. Каждая экспериментальная точка отражает среднее значение двух определений.

Нозерн блот-анализ суммарной РНК, выделенной из клеток HeLa после обработки клеток РМА в течение различных интервалов времени, проводившийся совместно с Д.Ю. Литвиновым (Институт молекулярной биологии им. В А. Энгельгардта РАН), показал, что изменения содержания белка WRS отражают соответствующие изменения уровня мРНК WRS (Рис. 2). Уровень мРНК WRS достигал максимума после 4 - 8 ч обработки (после 8 ч обработки - в 16 раз выше, чем в необработанных клетках) и возвращался к норме после 16 ч обработки. Таким образом, РМА активирует транскрипцию гена WRS. Уровень индукции мРНК WRS заметно превышает уровень индукции белка WRS в ответ на РМА.

Рис. 3. Влияние ингибиторов РКС на базальную» и IFNy-ивдуцированную

экспрессию WRS в. клетках HeLa. Клетки обрабатывали 100 Ш/мл IFNy, 0,1 мкМ РМА и стауроспорином (St) (А) или РМА и 5 мкМ GF109203X (GF) (Б) в различных комбинациях в течение 21 ч. Содержание WRS, EPRS и MRS и QRS в клеточных лизатах определяли с помощью иммуноблоттинга.

Мы исследовали действие известного ингибитора протеинкиназ стауроспорина на уровень экспрессии WRS, индуцированной и не индуцированной IFNy. Стауроспорин в эффективно ингибирующих РКС концентрациях 10 и 100 нМ не оказывал заметного влияния ни на базальный, ни на IFNy-индуцированный уровень WRS в клетках HeLa (Рис. ЗА). В более высокой концентрации (500 нМ) стауроспорин полностью устранял индукцию WRS под действием IFNy (Рис. ЗА). Мы наблюдали этот эффект также в клетках НЕК293 (Рис. 1, Б и В). Поскольку в этой концентрации стауроспорин способен ингибировать множество других протеинкиназ, можно утверждать, что этот эффект не связан с ингибированием РКС. Напротив, стауроспорин в концентрации 500 нМ действует посредством РКС-независмого механизма.

Содержание в клетках всех исследованных аминоацил-тРНК-синтетаз, включая WRS не индуцированную IFNy, понижалось после обработки стауроспорином в концентрации 500 нМ (Рис. 1 и ЗА). Данное явление, означающее общее подавление первого этапа биосинтеза белка (аминоацилирования тРНК различной специфичности) этим ингибитором, не было ранее известно и обнаружено нами впервые.

Поскольку GF109203X, высоко специфический ингибитор РКС, полностью блокирует активирующее действие РМА на экспрессию гена WRS (Рис. ЗБ), мы можем утверждать, что РКС активирует экспрессию гена WRS. То, что ингибирование РКС не блокирует индукцию WRS в ответ на IFNy, означает, что РКС не является обязательным фактором индукции WRS под действием IFNy. РКС может влиять на экспрессию гена WRS только посредством пути, отличного от пути, регулируемого IFNy.

Показанное в нашей работе накопление мРНК WRS в ответ на РМА происходило значительно раньше (мРНК WRS достигало максимального уровня после 4-8 ч обработки), чем описанное ранее [Eilers et al., 1994] связывание STAT1 и STAT5 с проксимальным элементом GAS промотора WRS в ответ на РМА (после 18, 24 и 48 ч обработки клеточного лизата). Более того, связывание белков STAT с элементами GAS недостаточно для транскрипционной активации гена WRS, по крайней мере, в ответ на IFNy [Fleckner et al., 1995; Tolstrup et al., 1995]. Тем не менее, связывание STAT с проксимальным элементом GAS промотора WRS может участвовать в активации транскрипции WRS в ответ на РМА.

Можно полагать, что показанное ранее повышение уровня в культуре клеток человека в ответ на РМА [Vartanian et al., 1997] происходит вследствие повышения экспрессии WRS, способного к синтезу Тот факт, что

содержание других аминоацил-тРНК-синтетаз, которые ответственны главным образом за синтез не претерпевало заметных изменений в ответ на РМА

(Рис. 1), позволяет предположить, что РМА увеличивает также внутриклеточное соотношение АрзА/Ар4А.

Активирующее действие РМА на экспрессию WRS отличает WRS от рада IFN-индуцируемых белков, экспрессия которых подавляется РМА и его эффектором РКС. Так, было показано, что РКС подавляет IFNy-индуцированную экспрессию активатора апоптоза Fas и компонента главного комплекса гистосовместимости HLA-DR и индукцию ISG54, ISG15, 9-27 и IFN-2 в ответ на IFNa. Вместе с тем, обнаруженный эффект сближает WRS с такими IFN-индуцибельными белками, как индоламин-2,3-диоксигеназа (IDO) и 2-SAS. Известно, что WRS и ПХ) — ключевой фермент деградации триптофана — индуцируются IFNy и IFNa, совместно в одних и тех же клеточных линиях. Известно, что РКС усиливает индукцию IDO в ответ на IFNy и индукцию 2-5AS в ответ на в клетках человека. Таким образом, РКС активирует экспрессию WRS и, одновременно, как ранее было показано, 2-5AS и ПЮ (Рис. 4). Биохимический смысл этой совместной активации не вполне ясен, однако тот очевидный факт, что WRS и IDO используют триптофан в качестве субстрата (а WRS и в качестве кофактора), а WRS и 2-5AS по-видимому связаны с метаболизмом предполагает наличие функциональной взаимосвязи между

этими ферментами. Таким образом, можно утверждать, что РКС может координировано- активировать EFN-индуцируемые ферменты, связанные с метаболизмом триптофана и

На Рис. 4 представлена предложенная нами схема взаимодействия и взаимной регуляции этих ферментов. Ранее была предложена схема, согласно которой ApjA, синтезируемый IFN-индуцируемой WRS, может служить праймером для 2-SAS и активировать таким образом IFN-индуцированную систему 2'-5'-олигоаденилата (2-5А), членом которой 2-5AS является [Turpaev et al., 1999]. Было также показано, что РМА вызывает посттранскрипционную активацию другого члена системы 2-5А, IFN-индуцируемой 2-5А-зависимой латентной рибонуклеазы L (РНКаза L): кратковременная обработка РМА полностью удаляет РНКазу L из неактивной и нерастворимой формы, связанной с белками цитоскелета в клетках HeLa. Таким образом, РКС коактивирует WRS и ферменты системы 2-5А, что может обеспечивать в живой клетке полный путь активации системы 2-5А (Рис. 4). Важно отметить, что белок ингибитор РКС

(PKCI) гомологичен специфической АрзА-гидролазе FHTT (Рис. 4) и является членом общего с ним белкового семейства HIT, что еще раз показывает наличие взаимосвязи между системой метаболизма АрзА и РКС (Рис. 4).

Рис 4. Схема координированной.регуляции.РКС- и IFN-регулируемыех белков. Представлены известные и гипотетические регуляторные и метаболические пути. Белки обозначены овалами. IFNa И IFNy индуцируют WRS, IDO, 2-5AS и РНКазу L. 2-5AS и РНКаза L - белки системы 2-5А, IFN-индуцируемого пути расщепления РНК, который обеспечивает защиту от вирусных инфекций и обладает противоопухолевой активностью. Биологическое действие системы 2-5А, возможно активируемой АрзА, опосредовано 2-5А-зависимой РНКазой L. РКС повышает экспрессию WRS, ПЮ и 2-5AS, а ее активатор РМА также постгранскрипционно активирует РНКазу L. АрзА-гидролаза FHTT структурно близка белку ингибитору РКС (PKCI), который противодействует активирующему действию РКС. Подробнее см. в тексте.

Клеточный арест Подавление опухолей АпоптоЗ'

апоптотическая и противоопухолевая активности

2. Исследование механизмов взаимодействия WRS с CDK ходе клеточного ответа на IFNy

IFN-индуцируемый WRS человека привлекает повышенное внимание исследователей, поскольку причина индукции этого белка IFN и роль этого белка в клеточном ответе на IFN остается недостаточно выясненной. Поскольку ранее нами было показано, что WRS быка (но не человека) обладает протеинкиназной активностью [Elizarov et al., 1997], мы предположили, что роль WRS человека в клеточном ответе на IFN тоже может быть как-то связана с фосфорилированием белков. Тот факт, что IFNy оказывает на клетки антипролиферативное действие, привели нас к предположению, что WRS, как IFN-индуцируемый фермент, может иметь негативное влияние на киназы семейства CDK, которые являются ключевыми регуляторами клеточного цикла.

Для проверки этого предположения мы инкубировали протеинкиназы в присутствии рекомбинантного WRS человека, после чего определяли киназную активность с использованием специфических белковых субстратов. Для исследования активности CDK в присутствии WRS in vitro, мы экспрессировали WRS человека в К coli как HlSt-TarOBblü фьюжн-белок. Рекомбинантный WRS был очищен до очевидной гомогенности и идентичность белка была проверена.

Рекомбинантный WRS человека ингибировал гистон HI-киназную активность циклин B-cdc2 дозо-зависимым образом (Рис. 5А). Полумаксимальное ингибирование циклин B-cdc2 наблюдалось при ~ 0,5 мкМ WRS. WRS (20 нМ) также заметно подавлял Rb-киназную активность CDK2, иммуиопреципитированного из лизатов клеток HeLa (Рис. 5Б). В то же время, WRS не ингибировал гистон HI-киназную активность протеинкиназы А (Рис. 5В), что подтверждает специфичность ингибирующего действия WRS на CDK и свидетельствует об отсутствии неспецифических эффектов, например, АТРазной и протеинфосфатазной активности. Последнее подтверждается тем, что инкубация [32Р]фосфо-гистона HI с WRS не приводила к его дефосфорилированию (Рис. 5Г). АТРазная активность WRS не снижала исходную концентрацию АТР с 0,1 мМ более чем на 0,25%, что не могло влиять на активность циклин B-cdc2 киназы. Поскольку в системе in vitro в присутствии

Рис 5. WRS человека обладает специфической CDK-ингибнрующей активностью in vitro. A - WRS ингибирует гастон Hl-киназную активность циклин B-cdc2 in vitro. Рекомбинантный циклин B-cdc2 человека (0,25 пмоль/мин) инкубировали 15 мин при 30°С с указанными концентрациями рекомбинантного WRS человека, после чего проводили измерение гистон Н1-киназной активности. Включение 32Р в гистон HI определяли с помощью фосфоимеджера и значения нормализовали относительно активности одной циклин B-cdc2 (100%). Полная активность соответствовала 0,225 пмоль фосфата в мин. Б - WRS ингибирует Rb-киназную активность CDK2. CDK2, иммунопреципитированный из лизатов клеток HeLa, инкубировали 15 мин при 30°С с указанными концентрациями рекомбинантного WRS человека, после чего проводили измерение Rb-киназной активности. В - WRS не ингибирует протеинкиназу А (РКА). Гистон Hl-киназную активность РКА измерялась после 15-мин инкубации при 30°С в присутствии или отсутствии 2 мкМ рекомбинантного WRS человека. Полная активность соответствовала 11000 имп/мин. Г - WRS не обладает протеинфосфатазной активностью. Гистон HI фосфорилировали циклин B-cdc2 в присутствии [y-3JP]ATP, реакцию останавливали добавлением ЭДТА до 25 мМ. Фосфорилирование гистона определяли после инкубации с и без 2 мкМ рекомбинантного WRS человека в течение 15 мин при 30°С.

WRS человека снижается протеинкиназная активность cdc2 и CDK2 (Рис. 5, А и Б), и этот эффект носит специфический (Рис. 5, В и Г) и дозо-зависимый характер (Рис. 5, А и Б), мы можем заключить, что WRS человека ш vitro специфически ингибирует активность киназ семейства CDK.

Мы предположили, что WRS человека ингибирует CDK, образуя с ними белок-белковый комплекс. Как показала иммунопреципитация различных CDK из экстрактов клеток HeLa после обработки клеток IFNy, WRS не обнаруживается в иммунопреципитате против cdc2, CDK2 и CDK4 в интактных клетках. Однако WRS образует комплексы с cdc2 и CDK2 (но не CDK4) после 12 — 24 ч обработки клеток IFNy (Рис. 6). Таким образом, в ходе клеточного ответа на IFNY WRS образует комплексы с cdc2 и CDK2.

Рис 6. ^^-зависимое взаимодействие- WRS с СБ К. Клетки ЫеЬа инкубировали с или без 1КМу (100 Ш/мл). Каждый из СБК иммунопрещиштировали (ИП) из клеточных лизатов, и коиммунопрецитштированный WRS определяли с помощью иммуноблотгинга.

Как известно, СБК активируются путем ассоциации с соответствующими циклинами и неактивны в отсутствие связанных с ними циклинов. Мы исследовали механизм СБК-ингибирующей активности WRS, предположив, что связывание WRS с СБК может оказать негативное влияние на связывание СБК с активирующей субъединицей циклина. Для этого иммунопреципитировали

cdc2, CDK2 и CDK4 из лизатов клеток HeLa через различные интервалы времени после обработки П^у, после чего исследовали содержание CDK-ассоциированных белков WRS и соответствующих циклинов В и А в иммунопреципитатах методом иммуноблоттинга (Рис. 7, А и Б).

Рис 7. Влияние И^у-индуцированной ассоциации WRS с CDK на образование комплекса циклин B-cdc2 (А) и циклим А - CDK2 (Б) в клетках HeLa. Клетки HeLa обрабатывали Н^Иу (100 Ш/мл) и лизировали через указанные интервалы времени. cdc2 и CDK2 иммунопреципитировали (ИП) из клеточных лизатов, и копреципитированные WRS и циклины (CDK-связанные) определяли иммуноблоттингом. CDK-несвязанные циклины определяли в супернатанте (иммуно-истощенная фракция, ИИ). В: Связывание WRS с cdc2 и CDK2 сопровождается высвобождением активирующих субъединиц циклинов В и А из комплексов с cdc2 и CDK2 соответственно, схема.

В иммунопреципитатах cdc2 и CDK2 в течение 24 ч после обработки ЦЭДу постепенно увеличивалось содержание WRS и одновременно соответственно

снижалось содержание циклинов В и А соответственно (Рис. 7, А и Б). При этом возрастало количество циклинов В и А, несвязанных с CDK2,. в иммуно-истощенной фракции.

Из результатов эксперимента (Рис. 7, А и Б) можно заключить, что IFNy-индуцированное связывание WRS с cdc2 и CDK2 в.клетках человека HeLa сопровождается высвобождением активирующих субъединиц циклинов из комплекса с этими киназами (Рис. 7В). Вероятно, IFNy-индуцированная ассоциация cdc2 и CDK2 с WRS препятствует активирующему связыванию этих CDK с циклином в клетках человека. Есть все основания предполагать, что WRS участвует в IFNy-индуцируемом ингибировании циклин B-cdc2 и циклин А-CDK2 (а также, по всей вероятности, циклин A-cdc2 и циклин E-CDK2) в клетках человека.

3. Исследование роли IFN-индуцируемого WRS человека в« развитии антипролиферативного действия

Полученные данные позволяют предположить что WRS, индуцируемый IFNy, может участвовать в развитии антипролиферативного действия IFNy. Для проверки этого предположения мы подавляли IFNy-индукцию WRS с помощью антисмысловой РНК WRS и оценивали скорость пролиферации клеток НЕК293 и HeLa по включению [3Н]тимидина в ДНК этих клеток (эксперименты проводились совместно с лабораторией S-H. Kim, Center for ARS Network, Южная Корея).

Как видно из врезки на Рис. 8, экспрессия антисмысловой РНК отменяла повышение содержания белка WRS в ответ на IFNy в клетках. Одновремегаго экспрессия антисмысловой РНК WRS отменяла антипролиферативный эффект IFNy в клетках НЕК293 в то время как IFNy подавлял пролиферацию клеток (Рис. 8). Подавление индукции WRS в ответ - на IFNy отменяла антипролиферативное. действие IFNy также в клетках HeLa. Таким образом, WRS непосредственно вовлечен в развитие антипролиферативного действия IFNy.

Следует отметить, что антисмысловая РНК отменяет индукцию WRS в ответ на 1КЫу, но заметно не влияет на уровень белка в контрольных клетках. Аналогично, при отмене индукции WRS в ответ на 1КЫу сохраняется уровень WRS, примерно соответствующий базальному (Рис. 8). Возможно, сохранение нормального уровня WRS в присутствии антисмысловой РНК объясняется большой по сравнению с временем эксперимента длительностью жизни белка WRS за счет его медленной утилизации в клетке. Вероятно, отмена антипролиферативного действия DFNy в данном эксперименте не связана с изменениями аминоацилирующей активности WRS в клетке.

Рис 8. Подавление индукции WRS в клетках, обработанных IFNy, отменяет антипролиферативное действие IFNy.

Клетки. НЕК293 (А) или HeLa (Б) трансфецировали пустым вектором (pcDNA3.1, Invitrogen) или вектором, экспрессирующим антисмысловую WRS (AS-WRS), и инкубировали с или без (100 Ш/мл) в течение 36 ч. Пролиферативную активность клеток оценивали по включению [3Н]тимидина. Содержание WRS в клетках определяли с помощью иммуноблотгинга, в качестве контроля использовали тубулин.

Ранее было показано, что в развитии антипролиферативного эффекта на клетки участвуют такие белковые ингибиторы CDK, как Cipl (р21сф1) и Kipl (р27Кф1) [см. Nakayama & Nakayama, 1998; SangfЫt et э!., 2000]. Для выяснения роли различных ингибиторов CDK в развитии антипролиферативного действия мы исследовали корреляцию скорости пролиферации клеток человека (опухолевых HeLa и нормальных фибробластов) и экспрессии ранее известных

белков-ингибиторов CDK после обработки клеток 1ГОу в течение различных интервалов времени. Содержание белков Cipl, Kipl и WRS определяли в клеточных лизатах методом иммуноблоттинга с помощью соответствующих антител, скорость пролиферации клеток оценивали по включению [3Н]тимидина в ДНК клеток.

Рис 9. Действие на

пролиферативную активность клеток HeLa и фибробластов крайней плоти человека (БББ).

Клетки инкубировали с 100 Ш/мл в течение указанных интервалов времени, и оценивали пролиферацию клеток по включению На врезках: профили экспрессии Cipl, Kipl и WRS после обработки клеток определялись иммуноблоттингом. Тубулин

использовали в качестве контроля.

Как видно из Рис. 9, в фибробластах человека и клетках HeLa наблюдали сходный профиль экспрессии ингибиторов CDK. Максимальный уровень содержания Cipl и Kipl наблюдался после 4 — 8 ч обработки ШКу, WRS - после 24 - 36 ч обработки IFNY, ТО есть максимальное повышение содержания WRS в ходе клеточного ответа на !КМу наблюдается после того, как содержание других ингибиторов CDK возвращалось к нормальному уровню. Важно, что после того,

как уровень Cipl и Kipl снижается, скорость пролиферации клеток не только не восстанавливается, но даже продолжает снижаться как в клетках HeLa, так и в фибробластах человека. Кроме того, степень ингибирования интерфероном пролиферации фибробластов и клеток HeLa коррелирует в большей степени с уровнем белка WRS, чем с уровнем других ингибиторов CDK (Рис.9). По-видимому, Cipl, Kipl и WRS последовательно участвуют в блокировании активности CDK в ходе ответа клетки на и WRS вовлечен в развитие

антипролиферативного действия на поздних стадиях действия этого

цитокина.

Таким образом, было обнаружено, что IFN-индуцируемый WRS человека является существенно важным компонентом механизма антипролиферативного действия IFNy. При этом WRS образует в ходе ответа клеток человека на IFNy комплексы с главными регуляторами клеточного цикла — цикпин-зависимыми киназами cdc2 и CDK2, что сопровождается высвобождением активирующей субъединицы циклина из комплекса с этими киназами. Кроме того, рекомбинантный WRS человека непосредственно ингибирует активность cdc2 и CDK2 в опытах in vitro.

В клинике препараты IFN эффективно применяются для лечения ряда онкологических заболеваний, таких как злокачественная меланома, ассоциированная со СПИДом саркома Калоши, фолликулярная лимфома, волосато-клеточная лейкемия и хроническая миелогенная лейкемия,, но неактивны в отношении целого ряда других опухолей [Jonasch & Haluska, 2001].

Поскольку антипролиферативное действие IFN играет важнейшую роль в противоопухолевой защите организма, дальнейшие исследования антипролиферативного действия WRS человека не только может помочь в дальнейшем понимании механизмов противоопухолевого (и возможно антивирусного) действия IFNH механизмов опухолеобразования, но и может послужить для разработки как новых методов прогноза течения, так и новых подходов в терапии опухолевых заболеваний, что поможет более эффективно использовать EFN для лечения опухолевых заболеваний.

В заключение можно сказать, что WRS человека является важным регуляторным белком, экспрессия которого контролируется разными способами. К известным путям регуляции экспрессии гена WRS мы можем добавить на основании полученных данных ранее неизвестный РКС-индуцируемый. Спектр клеточных линий, в которых. WRS индуцируется IFN, достаточно широк и включает иммортализованные клетки эмбриональной почки человека НЕК293. Особенно интересно то, что IFNy-индуцированный WRS человека непосредственно принимает участие в подавлении пролиферации клеток IFNy, ингибируя киназы семейства CDK, которые являются ключевыми регуляторами клеточного цикла. Попутно можно заметить, что WRS человека активно вовлечен в процессы фосфорилирования белков. При этом WRS выступает не только в качестве объекта регуляции другими киназами, но и в активном качестве, непосредственно ингибируя CDK.

Возможно, приобретение WRS эукариот этой и каких-либо иных ключевых функций обусловлено тем, что ген WRS, существующий в единственной копии в геноме человека, кодирует белок, необходимый для жизни клетки, и его серьезное нарушение в результате, например, случайной мутации приведет к автоматической гибели клетки - носителя мутации. Данный механизм может служить для охраны этих существенных для организма в целом неканонических функций WRS и препятствовать образованию аберрантных по WRS клеток в организме.

ВЫВОДЫ

1. В эмбриональной почечной линии клеток человека НЕК293 ген триптофанил-тРНК-синтетазы индуцируется интерфероном у.

2. Протеинкиназа С активирует экспрессию гена триптофанил-тРНК-синтетазы в клетках человека HeLa и НЕК293.

3. Триптофанил-тРНК-синтетаза человека специфически ингибирует активность cdc2 и CDK2 человека in vitro.

4. В ходе ответа клетки на интерферон у триптофанил-тРНК-синтетаза образует комплекс с cdc2 и CDK2 в клетках человека HeLa, что сопровождается высвобождением активирующей субъединицы циклина из комплекса с cdc2 и CDK2.

5. Триптофанил-тРНК-синтетаза непосредственно вовлечена в развитие антипролиферативной активности интерферона у в клетках человека НЕК293 и HeLa.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Забазарных М.Ю., Литвинов Д.Ю. Форболовый эфир стимулирует экспрессию гена триптофанил-тРНК-синтетазы человека. Биохимия, 2003, Т. 68, № 4, с. 592-597.

2. Zabazaraykh, M., Lee, S-H., Kim, J.Y., Ко, Y-G., Park, В J., and Kim, S. Human tryptophanyl-tRNA synthetase is a novel cell cycle regulator. The Cell Cycle and its Checkpoints, Jacques-Monod Conference - CNRS, Roscoft France, 21-25 September 2002. Abstract book, p. 87.

Отпечатано в копицентре «Учебная полиграфия» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: 2akaz@stprint.ru тел 939-3338 Заказ № 482, тираж 100 экз. Подписано в печать 12.03.2004 г.

ДЛЯ ЗАМЕТОК

* -50J Г

Интерфероны (IFN), главные цитокины врожденного иммунного ответа, играют ключевую роль в регуляции антивирусной и противоопухолевой защиты организма. Врожденный иммунный ответ особенно важен на ранней стадии защиты организма от биологической агрессии, до того как развивается антиген-специфический адаптивный иммунный ответ. Это приводит к формированию защитного состояния в инфицированном организме, позволяя снизить интенсивность инфекционного процесса и давая достаточное время для формирования адаптивного иммунного ответа. IFN организуют этот «первый рубеж» защиты от чужеродных агентов, повышая (или снижая) экспрессию целого ряда генов. Несмотря на то, что роль некоторых из IFN-индицируемых белков в защитных реакциях хорошо известна (таких, например, как компоненты главного комплекса гистосовместимости, протеинкиназа R, 2'-5'-олигоаденилат-синтетаза (2-5AS) или РНКаза L), другие IFN-индуцируемые белки требуют более глубокого исследования для понимания широкого спектра эффектов, вызываемых IFN.

Одним из таких белков является триптофанил-тРНК-синтетаза (WRS, К.Ф. 6.1.1.2) человека. Известно, что WRS вовлечен в различные защитные реакции организма. Помимо индукции различными IFN, экспрессия WRS повышается в ходе кожной реакции гиперчувствительности замедленного типа [Yang et al., 2001] и на последних стадиях созревания мононуклеарных фагоцитов [Krause et al., 1996]. Недавно было обнаружено, что WRS человека обладает выраженной антиангиогенной активностью, являясь, таким образом, цитокином [Wakasugi et al., 2002; Otani et al., 2002], в связи с чем было предложено использовать WRS человека для лечения гипоксических и других пролиферативных ретинопатий. Помимо так называемой «канонической» активности WRS (активация триптофана для последующего его использования в биосинтезе белка путем связывания его со специфической тРНК), которая была подробно охарактеризована, WRS обладает рядом «неканонических» активностей, являясь, таким образом, полифункциональным белком. В частности, ранее нами было показано, что N-домен WRS быка (но не человека) обладает протеинкиназной активностью

Елизаров и соавт., 1997]. Однако, с момента неожиданного открытия IFN-индуцируемости WRS человека, более десятилетия роль WRS в ответе клетки на IFN остается не до конца понятной и вызывает большой интерес исследователей.

Исследование механизмов действия интерферонов является актуальной для современной иммунологии и биохимии проблемой. Возрастающий интерес исследователей и практических врачей к этой проблеме обусловлен не только высокой эффективностью применения препаратов интерферона при таких патологических состояниях, как вирусные и онкологические заболевания, болезни крови, но и неуклонным ростом числа больных, страдающих вышеперечисленными заболеваниями, что придает исследованию особенную актуальность.

Цель работы: изучение путей регуляции и механизмов действия IFNy-индуцируемой WRS человека как части IFNy-зависимой защитной системы организма.

Задачи исследования:

- изучение влияния модуляторов активности протеинкиназы С на экспрессию IFNy-индуцируемого гена WRS в культуре клеток человека HeLa и НЕК293;

- изучение влияния IFNy-индуцируемого WRS человека на активность киназ семейства CDK человека;

- исследование механизмов взаимодействия WRS с CDK в ходе клеточного ответа на IFNy;

- исследование роли IFN-индуцируемого WRS человека в развитии антипролиферативного действия IFNy.

Научная новизна и практическая ценность работы

Обнаружено, что ген WRS индуцируется IFNy в эмбриональной почечной линии клеток человека НЕК293. Показано, что протеинкиназа С положительно регулирует экспрессию гена WRS человека. На основе полученных данных была предложена гипотетическая схема участия протеинкиназы С в согласованной регуляции ряда IFN-индуцируемых ферментов, связанных с метаболизмом триптофана и 5'5т-диаденозинтрифосфата (Ар3А), и обладающих противовирусной и противоопухолевой активностью.

Обнаружена ранее неизвестная CDK-ингибирующая активность WRS человека и показана ее роль в антипролиферативном действии IFNy. Продемонстрировано, что рекомбинантный WRS человека ингибирует киназную активность CDK in vitro, и IFNy-индуцированный WRS человека ингибирует активность CDK в культуре клеток человека. Обнаружено, что индукция WRS в ответ на IFNy вызывает образование комплекса WRS с cdc2 и CDK2 в клетках HeLa, что сопровождается высвобождением активирующей субъединицы циклина из комплекса с cdc2 и CDK2. Доказано, что WRS непосредственно вовлечен в развитие антипролиферативного действия IFNy в культуре клеток человека. Эти данные демонстрируют ранее неизвестные механизмы воздействия IFNy на клетки человека. Знание механизмов регуляции клеточного цикла в ответ на антипролиферативный сигнал представляет большой интерес для современной науки и медицины.

Полученные новые данные о механизмах действия IFNy на клетки человека важны для понимания патогенеза вирусных и онкологических заболеваний и могут послужить для прогнозирования течения этих заболеваний и разработки новых подходов их лечения. Кроме того, эти данные могут помочь более эффективно использовать IFNy для лечения онкологических и инфекционных заболеваний.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 117 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы (224 наименования). Диссертация содержит 19 рисунков и 3 таблицы.

5. Выводы

1. В эмбриональной почечной линии клеток человека НЕК293 ген триптофанил-тРНК-синтетазы индуцируется интерфероном у.

2. Протеинкиназа С активирует экспрессию гена триптофанил-тРНК-синтетазы в клетках человека HeLa и НЕК293.

3. Триптофанил-тРНК-синтетаза человека специфически ингибирует активность cdc2 и CDK2 человека in vitro.

4. В ходе ответа клетки на интерферон у триптофанил-тРНК-синтетаза образует комплекс с cdc2 и CDK2 в клетках человека HeLa, что сопровождается высвобождением активирующей субъединицы циклина из комплекса с cdc2 и CDK2.

5. Триптофанил-тРНК-синтетаза непосредственно вовлечена в развитие антипролиферативной активности интерферона у в клетках человека НЕК293 и HeLa.