Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Изменения синтеза цитоплазматических аминоацил-тРНК-синтетаз при атеросклерозе и возможности их коррекции

На правах рукописи

СУСОВА Мария Игоревна

ИЗМЕНЕНИЯ СИНТЕЗА ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ АМИНОАЦИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗ ПРИ АТЕРОСКЛЕРОЗЕ И ВОЗМОЖНОСТИ ИХ КОРРЕКЦИИ

14. 03. 03 - патологическая физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О НОЯ 2011

МОСКВА-2011

4859234

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования города Москвы «Московский городской педагогический университет»

Научные руководители:

доктор медицинских наук Расулое Максуд Мухамеджанович, кандидат биологических наук Нурбеков Малик Кубанычбекоеич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН Порядин Геннадий Васильевич

Доктор биологических наук, профессор Архипенко Юрий Владимирович

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное реждение высшего профессионального образования «Московский госуд ственный медико-стоматологический университет» Министерства здра охранения и социального развития РФ

Защита состоится «_»_ 2011 г. в 1400 часов на зас

дании диссертационного совета Д 001.051.01 при Учреждении РА1У НИИ общей реаниматологии имени В.А.Неговского РАМН по адрес 107031, г. Москва, ул. Петровка, д.25, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Учрежден РАМН НИИ общей реаниматологии им. В.А.Неговского РАМН (1070: г. Москва, ул. Петровка, д.25, строение 2).

Автореферат разослан «_»_ 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор медицинских наук,

профессор В.И. Решетш

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования

В последние годы проясняются механизмы атерогенеза, связанные с цитокин-ной активностью ряда белковых факторов. Выявлена роль ферментов класса ами-ноацил-тРНК-синтетаз — ключевых для обмена веществ. В частности - тирозил-тРНК-синтетаза (АРСаза), обладает цитокинной активностью и стимулирует ангио-генез, способствуя, тем самым, атерогенезу [Tzima Е. et al, 2003; Wakasugi К., Slike В.М., Hood J., 2002]. Модифицированная путем эндогенного частичного протеолиза триптофанил-тРНК-синтетаза (ТРСаза), наоборот, обладала сильным антиангио-генным и, следовательно, антиатерогенным действием [Ibba М. and Soll D., 2001]. АРСазы являются ключевым звеном в обеспечении точности трансляции генетического кода, катализируя реакцию специфического аминоацилирования тРНК соответствующей аминокислотой. АРСазы обеспечивают реализацию генетического кода, обеспечивая соответствие аминокислот с их гомологичными тРНК. Следовательно, актуальность исследования ферментов внерибосомного этапа белкового синтеза связана и с дополнительными неканоническими функциями АРСаз. В этой связи на передний план выходят вопросы регуляции этих функций фермента и возможность коррекции последней с применением медикаментозных методов.

Факт, что «триаду Селье» составляют изменения в надпочечниках и тимусе (иммунной, эндокринной системах) и желудке. Наряду с этим, бурное развитие иммунологии и кардиофармакологии в последние годы привело и к новому пониманию состояния «стресс», и к новым интерпретациям связи между изменениями в сердечно-сосудистой системе и развитием адаптационного синдрома [Селье Г., 1969, По-рядин Г.В., 2001; 2003]. При этом в последние годы получены данные, послужившие базой для выделения основных принципов патогенетической терапии состояния «стресс»: защита мембраны и коррекция энергетического обеспечения клетки, а также нормализация механизмов трансмембранного переноса и внутриклеточного распределения ионов и жидкости [Dimmeier S., Zeiher A.M., 2004]. Это значит, что эффективность антиатеросклеротических препаратов определяется их способностью защищать сосудистую стенку [Агеев Ф.Е. и соавт., 2001; Намаканов Б.А., Расулов М.М., 2009]. Следовательно, изучение клинической эффективности препаратов, способных влиять непосредственно на метаболические процессы актуально. Одним из таких препаратов является адаптоген широкого спектра действия трекрезан, обладающий антиокислительной активностью, т.е. действующий на одно из звеньев метаболизма липидов [Расулов М.М., Воронков М.Г., 2001]. Однако, несмотря на отме-

ченный интерес, в кардиологической практике препарат ранее не применялся, что и определило главную цель настоящего исследования.

Цель исследования. Выявление механизма нарушений обмена протеолипидов в цитоплазме эндотелиоцитов при развитии атеросклероза и раскрытие новых возможностей его коррекции на практике.

Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи.

Задачи исследования:

1. Освоить способы получения участка гена ТРСазы и геномной ДНК человека, пригодные для дальнейших скрининговых исследований.

2. Определить физико-химические и физиологические характеристики ТРСазы.

3. Выявить изменения характеристик ^РСазы при развитии атеросклероза в эксперименте под влиянием трекрезана.

4. Установить возможности коррекции развития экспериментального атеросклероза с помощью адаптогенного препарата трекрезан.

Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые:

— подобраны и освоены способы получения участка гена ТРСазы и геномной ДНК человека, пригодные для скрининговых исследований;

— изучены характеристики ТРСазы;

— установлено, что трекрезан стимулирует активность ТРСазы;

— установлено, что трекразан обладает противоатеросклеротическим действием;

— предложена новая методика профилактики и коррекции атеросклероза.

Практическое значение работы

1. Подобрана методика выделения участка гена ТРСазы и геномной ДНК человека, пригодные для скрининговых исследований;

2. ТРСаза существует в следующих формах: с молекулярной массой 60 кД, молекулярной массой 51 кД, молекулярной массой 40 кД и молекулярной массой 24+14 кД. При этом, наиболее активно тормозит развитие атерогенеза форма с молекулярной массой 40 кД.

3. Активность ТРСазы под влиянием трекрезана увеличивается на 20-35% в зависимости от дозы и пути введения препарата.

4. Результаты исследования указывают на возможность использования в установленном порядке новой методики профилактики и коррекции атеросклероза в практической медицине.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. ТРСаза является одним из ведущих звеньев в сложной цепи синтеза белка, как в норме, так и при развитии атеросклероза.

2. Активность ТРСазы увеличивается при воздействии трекрезана.

3. Атеросклеротические бляшки служат показателем дезадаптации функции эндотелия крупных сосудов.

4. Применение трекрезана в условиях экспериментального атеросклероза тормозит развитие атеросклеротических бляшек.

Организация и методы исследования. Исследования проводились на базах следующих организаций: МГЛУ хим-биофак, ИрИХ СО РАН.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены:

- на 2-ой всероссийской научно-практической конференции (Волгоград, 2010).

- на IV международной конгресса. «Фитотерапия и народная медицина эпохи Авицены» (Душанбе, 2010).

Публикация работы. По теме диссертаций опубликовано 2 научные работы в изданиях списка ВАК РФ и получено 2 патента на изобретения.

Внедрение результатов работы в практику. Результаты работы внесены в курс чтения лекций по общей и частной патологии ГОУ ВПО МГЛУ.

Объем и структура диссертации. Работа построена по классическому образцу и состоит из следующих разделов: введение (6 страниц), обзор литературы (25 страниц), материалы и методы исследований (9 страниц), результаты собственных исследований (28 страниц), обсуждения результатов (29 страниц), выводов, списка литературы (241 источник, из них 61 отечественных и 180 иностранных). Вся работа занимает 132 страницы машинописного текста, иллюстрирована 12 таблицами, 25 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалы. Приступая к серии опытов, мы получили свыше 50 образцов препаратов ДНК. Образцы материала получали от добровольцев с обязательством не использовать их для любых видов исследования без их согласия. В данной работе представлены результаты анализов электрофоретически разделенной ДНК от 36 человек. Моделирование атеросклероза проводилось на кроликах (п=50).

Выделение образцов ДНК. Выделение ДНК из смывов ротовой полости проводили в соответствии с рекомендациями [Yap A.S., Crampton M.S., Hardin J., 2007].

Выделение препаратов ДНК из соскоба ротовой полости (зондирование). Нами были отработаны условия для выделения ДНК методов соскоба слизистой ротовой полости и методом смыва в физрастворе, так как именно эти методы отвечают задачам скрининга на генетический полиморфизм, и обладающих следующими преимуществами: относительно просты, недороги и позволяют получать ДНК со стандартными свойствами для последующего анализа.

Исследование качества выделенных препаратов ДНК методом ПЦР (поли-меразной цепной реакции). Пригодность полученных препаратов ДНК для последующих молекулярно-генетических анализов аликвоты образцов (0,1мкг ДНК) анализировали методом ПЦР. Для амплификации использовали ПЦР-амплификатор «Терцик». В качестве реактивов для амплификации использовали набор реактивов фирмы «Силекс М» со стандартным приложением для тестирования ДНК путем амплификации гена глобина по прописи фирмы «Силекс М».

Электрофорез образцов ДНК в агарозе. После выделения, препараты ДНК, полученные с помощью различных методов разделяли электрофорезом в горизонтальном агарозном геле. В качестве прибора использовали камеру фирмы «ДНК-технологии» и источник постоянного тока (200 мА). Использовали 0,7%-ную или 2%-ную агарозу в 1 х ТАЕ буфере. После проведения процедуры разделения гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали под УФ освещением с применением оранжевого светофильтра. Целостность полученных образцов ДНК и их молекулярную массу определяли по электрофоретической подвижности в сравнении с полосами маркерной ДНК бактериофага, обработанной рестриктазой Hind III.

Определение пригодности выделенной ДНК. Образцы геномной ДНК анализировали по электрофоретической подвижности в сравнении с полосами маркерной ДНК бактериофага, обработанной рестриктазой Hind III (Сибэнзим) с последующим проведением процедур полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Генотипирование полученной неинвазивными методами панели образцов геномной ДНК. Для проведения процедур ПЦР анализа выделенных образцов ДНК использовали многоканальный амплификатор Терцик (ДНК-технология, РФ).

Генотипирование гена МАО-А. Реакционная смесь в суммарном объеме 25 мкл содержала 50 нг геномной ДНК, 1.5 мМ MgCl2, ,10 пикомолей каждой затравки, 0.33 мМ dNTPs, и 2-3 единиц фермента Taq-полимеразы (Сибэнзим). Условия ПЦР были следующими. Предварительные 5 мин денатурации ДНК при 95°С, с после-

дующими 35 циклами денатурации при 94°С - 1 мин, отжига при 54°С - 1 мин и амплификации при 72°С в течение 1 мин, после окончания последнего цикла проводили процедуру достраивания цепей при 72 °С в течение 10 мин. Подобранные затравки были следующими:

5'-ACAGCCTGACCGTGGAGAAG-3' прямая и 5'-GAACGGACGCTCCATtCGGA- 3' обратная.

Электрофорез проводили в 2,5%-ном геле агарозы в стандартном ТАЕ буфере рН 8,0. В результате генотипирования наблюдался весь спектр ожидаемых полиморфных фрагментов, размером в 290, 320, 335 и 380 пар нуклеотидов, соответствующих аллелям с 2, 3, 3.5, 4 и 5 повторами, соответственно.

Генотипирование гена АСЕ. Для амплификации гена АСЕ использовались следующие затрваки:

5'-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT -3' прямая и 5' -GATGTGGCC АТС AC ATTCGTC AGAT -3' обратная. Условия проведения реакции и состав буферов в соответствии со стандартной методикой [Mustafa A. S. D., Zhang S. and Qing-Yang Н., 2008].

Клонирование фрагментов. Для клонирования полученных фрагментов проводили реакцию амплификации в препаративных количествах. Затем наносили образец амплификата на подготовленный гель и разделяли фрагменты, затем элюировали нужные фрагменты из геля с использованием стандартных наборов («Силекс М»). Препараты плазмидной ДНК и фрагмент обрабатывали одним набором рестриктаз для получения одинаковых по типу расщепления концевых фрагментов. Подготовленные фрагменты ДНК и плазмидной ДНК смешивали в соотношении 5:1 или 10:1 и подвергали реакции сшивания лигазами с последующей трансформацией компетентных клеток E.coli [МаниатисТ., Фрич Э., Сэмбрук Дж., 1984].

Спектры кругового дихроизма (КД) в дальней ультрафиолетовой области регистрировали в интервале 198-252 нм на дихрографе Mark V, используя кюветы с длиной оптического пути 0,05 см. Спектры регистрировали 8-10 раз, усредняли и вычитали спектр буфера. Спектры КД в близкой ультрафиолетовой (у.-ф.) области в интервале 252-325 нм регистрировали на том же дихрографе в кюветах с длиной оптического пути - 1 см, при концентрации Е - 1,5-1,7 мг/мл [Kim М. J., 2003].

Подбор условий амплификации выбранных участков гена ТРСазы с последующими попытками клонирования и экспрессии белковых продуктов гена. Разработанные затравки были синтезированы на фирме «Синтол» и очищены методом ВЭЖХ. Далее был проведен подбор оптимальных условий для размножения регуля-

торных участков гена ТРСазы. Концентрации компонентов реакционной смеси для проведения реакции ПЦР соответствовали рекомендациям фирмы поставщика ПЦР-наборов для амплификации.

Получение частично активной формы ТРСазы. После инкубации в течение 7,5 мин реакцию останавливали добавлением раствора ингибитора протеаз ПМСФ и инкубационную смесь подвергали разделению методом гель фильтрации на колонке с сефадексом G-100.

Изучение активности трекрезана проводилось на кроликах массой 2,5 — 3 кг. В соответствии с рекомендациями МЗ РФ атеросклероз моделировался по H.H. Аничкову и С.С. Халатову. Через месяц после начала кормления в крови животных определяли уровень холестерина, общих липидов, триглицеридов и ß- липопротеи-дов. После этого формировались группы опыте в и контроля. Все животные продолжали получать холестерин. Кроликам опытных групп вводили трекрезан, а контрольным животным — физраствор, "гл определения дозовых эффектов и зависимости действия препарата от пути введения были сформированы'5 групп животных.

В первой серии опытов кроликам ежедневно вводили внутримышечно свежеприготовленный водный раствор трекрезана в дозе 5 мг/кг в течение 2 мес. Во второй серии опытов — в дозе 25 мг/кг. В третьей серии экспериментов трекрезан добавляли в пищевой рацион животных из расчета 50 мг/кг в сутки в течение 2 мес. В четвертой серии опытов животные получали с пищей трекрезан в дозе 150 мг/кг в сутки. В пятой серии кроликам вводили раствор трекрезана в дозе 5 мг/кг внутримышечно с первого дня эксперимента с холестерином.

Эксперименты продолжались в течение 3 мес. После этого животные забивались воздушной эмболией. В конце экспериментов в сыворотке венозной крови животных определяли стандартными методами уровень холестерина, общих липидов, триглицеридов и ß-липопротеидов; кроме этого определяли уровень холестерина и триглицеридов в печени, а также содержание липидов и холестерина в грудном отделе аорты и оценивали индекс ее пораженности атеросклеротическими бляшками.

Активность ТРСазы и ее кинетические характеристики в частично очищенных экстрактах измеряли модифицированным методом. Для этого в специальной серии экспериментов с гиперхолестеринемией у кроликов в сроки 1,5 месяца (п=10) и 2,5 месяца (п=10) брали образцы аорты. Образцы аорты массой от 5 до 8 граммов измельчали при t=5°C и растирали под жидким азотом до порошкового состояния. Смесь экстрагировали в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl pH 7.5, 1 мМ ß-меркаптоэтанол, 5 мМ ЭДТА, 1мМ фенилметилсульфанилфторид (PMSF), 0.1 М

KCl. После перемешивания при t=5°C в течение 30 мин, клеточный дебрис осаждали центрифугированием в течение 20 мин при 20 ООО g. К супернатанту добавляли, перемешивая, мелко измельченный сульфат аммония до 40% насыщения. После формирования в течение 1 - 2 часов при t=5°C осадка, его удаляли центрифугированием при 20 000 g в течение 20 мин. Осадок удаляли. К супернатанту добавляли таким же способом сульфат аммония до 60% насыщения. Осадок оставляли на ночь при t=5°C. Перед опытом осадок центрифугировали при 20 000 g в течение 20 мин. Осадок для удаления соли диализовали против указанного выше буфера без KCl. В реакционную смесь объемом 60 мкл содержащую 20 мМ трис-HCl pH 7.5, 5 мМ MgC12, 0.05 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 0,1 мМ [С14], L-триптофан (54 mCi/моль, Amersham), -50мМ KCl, 1,0 мМ ЭДТА, 2.5 мМ АТФ, 7 мг/мл суммарной дрожжевой тРНК. При использовании частично очищенных препаратов транспортной РНК, специфичной к триптофану (тРНКТрп), их концентрация в смеси составляла 0.2 мкМ. Добавляли 20 мкг частично очищенного препарата, нормализованного по белку. Смесь инкубировали при 25°С. По 9 мкл аликвот отбирались, помещались на Whatman GFC диски и промывались 5% трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Связанную радиоактивность определяли с помощью толуольного сцинтиллятора. В контроле использовали соответствующие количества суммарного белка плазмы. Для измерения специфического эффекта трекрезана использовали время инкубации на линейном участке зависимости радиоактивности от времени инкубации и от концентрации экстракта [Seshaiah P., Andrew D.J., 1999].

Индекс пораженности аорты (ИПА). Определяли путем вычисления соотношения площади атеросклеротической бляшки к площади общего просвета сосуда.

Статистическая обработка данных проводилась с применением общепринятых методов математической статистики. Часть результатов обрабатывали на PC с использованием стандартного пакета программ "Quattro Pro" и "Statistix".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В первой серии экспериментов изучался вопрос о соответствии количества и качества выделяемых нами из слюны препаратов ДНК критериям, предъявляемых к препаратам ДНК с точки зрения их пригодности для совершения генно-инженерных процедур. Для решения этого вопроса, после предварительных экспериментов по оптимизации методик отбора хранения и выделения препаратов ДНК, мы приступили к серии опытов, приведенных в диссертации. Мы получали образцы биологического материала в виде смывов и соскобов с ротовой полос-

ти получали от свыше 50 добровольцев. В данной работе представлены результаты электрофоретического анализа ДНК от 36 человек. В результате проведенных опытов установлено, что выделение ДНК с применением магнитных частиц приводит к получению образцов ДНК с более низкой молекулярной массой, однако при контроле их чистоты существенных различий по сравнению с эталонной контрольной ДНК не обнаружено.

В начальном опыте по анализу выделенных препаратов был взят один образец для отладки методики ПЦР анализа изучаемого локуса гена МАО-А и достижения воспроизводимости результатов анализа (рис. 1).

Рисунок 1. ПЦР образца ДНК человека, выделенных методом смыва ротовой полости слабосолевым раствором с последующей обработкой протеина-зой К V очисткой фенольным методом. M - маркерная ДК С; 1 - контроль; 2 - образец геномной ДНК (№ 4 из выделенной панели).

На рисунке 1 видно, что молекулярная масса получаемого фрагмента гена МАО-А составила 4 аллели 339 п.н., что соответствует литературным данным [Lin Y.M., Davamani F., 2008]. Выявлена четкая единичная полоса, как в контрольном эксперименте, так и в опыте.

Нам удалось получать чистые образцы ДНК по данным электрофоретического анализа с молекулярной массой более 23 тыс.п.н. (в сравнении с маркерными последовательностями - маркер X ДНК рестрицированная по Hind III) (рис. 2).

, Д Рисунок 2. Результа-

- I ты электрофореза выде-I ленных из образцов слю-I ны препаратов ДНК. 1-12 < ' I - образцы ДНК; M - мар-щ кер размеров фрагментов I 9 ДНК - ДНК фага X рас-

№ « , А щепленная рестриктазой

J J Hind III.

Выделенная нами ДНК оказалась пригодной для большинства генноинженер-ных процедур, включая рестрикцию EcoRl и процедуры ПЦР, причем молекулярные массы препаратов и амплификатов строго соответствовали ожидаемым при

сравнении с маркерными образцами ДНК фирмы «Сибэнзим» (рис. 2, рис. 3).

Для проверки качества препарата проведен амплификационный эксперимент по выявлению регуляторной части гена АСЕ. В результате определен полиморфизм длин амплифицированных фрагментов в области 16 интрона на 17 хромосоме, что находится в соответствии с литературными данными. Наблюдаются четкие единичные полосы ожидаемой молекулярной массы (490 п.н. - аллель I, содержащая вставку и 190 п.н. - аллель Э, соответствующая делеции) (рис. 3).

Рисунок 3. ПЦР образцов ДНК человека, выделенных методом смыва ротовой полости слабо-солевым рас-твором с последующей обработкой протеи-назой К и очисткой фенолом. М - маркерная ДНК; 1-9 - образцы амплификата регуляторной области гена АСЕ; 10 — контроль.

В ходе оптимизации условий проведения реакции ПЦР нами был проведен подбор состава реакционной смеси (концентрации Mg2+, температура отжига). Результаты экспериментов по ПЦР амплификации выбранных для исследований участков гена ТРСазы иллюстрирует рисунок 4.

Рисунок 4. Результат размножения фрагментов гена ТРСазы методом ПЦР. А. Фрагмент длиной 320 п.н. Б. Фрагмент длиной 590 п.н.

Из рисунка 4 видно, что качество получаемых фрагментов отражается в наличии единичных полос даже при значительной «нагрузке» дорожки в геле. Это значит, что нами разработана эффективная неинвазивная методика получения образцов

ДНК человека. Качество и количество полученных препаратов ДНК удовлетворяет критериям, предъявляемым к препаратам при совершении генно-инженерных процедур.

Вторая задача решалась следующим образом. На первом этапе мы определили структуру тРНК-синтетазы. ТРСаза является одним из ключевых ферментов белкового синтеза, катализирующей высокоспецифическую реакцию аминоацили-рования тРНКТрп. Катализируемая реакция следующая:

тРНКтРп + Трп + АТф -».хрнкТрп - Трп + АМФ + ФФн

где: АТФ - аденозинтрифосфат;

АМФ - аденозинмонофосфат;

ФФН - пирофосфат.

Реакция протекает в два этапа - на первом этапе образуется аминоацила-денилат - ферментный комплекс с высвобождением пирофосфата и АМФ, затем активированная аминокислота переносится на тРНК. Из работ ряда авторов и наших исследований следует, что фермент имеет доменную структуру и подвергается ограниченному протеолизу по схеме 60(±2) —» 51(±2) —» 40(±2) кД.

С целью изучения влияния ограниченного протеолиза на вторичную и третичную структуру ТРСазы мы провели серию экспериментов по получению и изучению методом кругового дихроизма различных форм фермента. Известно, что взаимодействие поляризованных лучей света с белком, имеющим в своем составе спиральные структуры приводит к сдвигу плоскости поляризации проходящих лучей пропорционально содержанию элементов вторичной структуры белков (а-спиралей и ^-структур), а система скрещенных поляризационных фильтров прибора пропускает только отклоненные по кругу лучи, измеряя при этом степень вращения плоскости поляризации. Причем наибольший эффект наблюдается в дальней ультрафиолетовой области спектра. В качестве объектов использовались следующие формы ТРСазы - нативная димерная ТРСаза (Е6о) и 2 ее протеолизированных форм: димера, 2x40 кило-дальтон (Е40), который был получен при действии эластазы, и "псевдодимера" 2 х (24+14) килодальтон (Е24+14)» являющегося .юнечным продуктом ограниченного протеолиза при действии трипсина (табл. 1).

Из таблицы 1 видно, что во всех случаях наблюдалась только антипарал- ' лельная [} - структура. Также отметим, что во всех -случаях мы наблюдали чет-

кое и воспроизводимое изменение спектров, отражающих изменения вторичной и третичной структур модифицированных форм.

Таблица 1

Вторичная структура различных форм ТРСазы

Форма фермента Тип а- структуры в молярных долях АК-остатков* Число АК-остатков на полипептидную цепь (4)

А ß** ß- изгиб нерегулярная

Ебо 0,3 7± 0,015 0,09± 0,01 0,12+ 0,005 0,42+0,03 481

Еад 0,37 ± 0,02 0,09± 0,01 0,14 + 0,01 0,40 + 0,02 359

Е24+14 0,31 ±0,01 0,09±0,02 0,14+0,00 0,46+ 0,02 -

* Приведены средние значения из 3—5 определений.

Видно, что графики спектров КД в изучаемой области существенно разнятся для различных форм фермента. Величины значений измеряемых параметров связаны с характеристиками вторичной структуры в соответствии со сложными непрямыми зависимостями, что подтверждается данными литературы [Greenfield N.J., 2006].

Третичную структуру исследуемых белков изучали по спектрам КД i близкой у.-ф. области (250—350 нм) (рпс. 5, 6). Наблюдаемые полосы в спектрах КД обусловлены оптически активными переходами в хромофорных группах остатков триптофана и тирозина. Спектр КД соответствует исходному ферменту, который содержит 5 остатков триптофана и 17 - тирозина на субъединицу (рис. 6).

Рисунок 6. Спектры КД в близкой у.-ф. области - спектры исходногс фермента 1 - нулевая линия, 2 - Е60, с = 1,61 мг/мл, - 1 см.

Выявлено, что при отщепление около 20 кД от исходной ТРСазы содержание этих ароматических остатков почти не меняется (в Е40 их остается 5 и 14 соответственно). Спектр КД в близкой у.-ф. области Е40 практически не отличается от спектра исходного фермента. Вероятно, при переходе Е60 —► Е4С) сохраняется основное гидрофобное ядро молекулы, в которое входят ароматические АК-остатки, их асимметрическое окружение и доступность растворителю. Это соответствует сделанным ранее наблюдениям, что Е40 сохраняет неизменными участки связывания всех субстратов [Бете^ К., Раэю1о Р., 2001].

Динамику процессов изменения третичной структуры нативного и модифицированного ферментов иллюстрирует рисунок 7, из которого видно, что расщепление фермента до формы Е24+14 изменяет спектр КД вблизкой у.-ф. области во времени. Вначале он близок к спектрам Е60 и Е40, а затем изменяется: с одной стороны, его искажает возникающая опалесценция, с другой — полосы КД уменьшаются со временем и исчезают, что свидетельствует о дестабилизации конформации каждой из субъединиц при переходе Е40 —> Е24+14 сказывающейся как на стабильности их третичной структуры, так и на степени упорядоченности вторичной структуры (табл. 1).

Рисунок 7. Спектры КД в близкой у.-ф. области - изменение спектров Е24+н со временем и температурой, 1 - нулевая линия, 2 -Е60, с = 1.61 мг/мл, - 1 см; 2 - начальный спектр (холодный раствор 4° С), 3 - через 20 мин, 4 - через 40 мин, 5 - конечный спектр через 50 мин при 25°С, с - 1.73 мг/мл, Ь =1 см.

Подобные изменения нативной конформации, по-видимому, вызываются разрывом молекулы при действии трипсина. С этой точки зрения логичен эффект дестабилизации модифицированных форм фермента при переходе от частично активной формы Е40 в форму Е24+14- Эти данные согласуются с установленной неканонической функции у «усеченной» формы ТРСазы в контроле ангиогенеза.

Действие эластазы на ТРСазу. Одним из эффективных методов исследования доменности структурной организации белков является электрофорез в денатурирующих условиях. На рисунке 8 видна динамика протеолиза исходной ТРСазы с м.м. бОкД (форма А). На рисунках 9,10 приведены результаты денситометрического исследования гелей электрофоретического разделения в денатурирующих условиях продуктов ограниченного протеолиза препарата ТРСазы эластазой. При этом наблюдается последующее уменьшение доли полипептидных цепей с м.м. 51 кД (форма В) и накопление полипептидных,цепей с м.м. 40 кД (форма С). Видна динамика протеолиза и выявляются основные присущие ферменту образующиеся фрагменты его субъединиц. Видно тпкже устойчивое к эластазе ядро, так как длительная инкубация с эластазой до 18 мин не приводила к дальнейшему распаду формы С.

В экспериментах по частичному гидролизу фермент-субстратных комплексов ТРСазы с последующими гельфильтрационными и электрофоретическими анализами, установлено наличие формы в 51 кД (рис. 11).

£5 3

Ь |§2

I' I 1

А А б,2

0,6 2 0.6 0.62 0.63 0,62 08/ \пй 6,65 о,63 0.7

2.5,

Расстояние 01 начат геля, си

С Л 5

в ,5

.....................15......

А 15

= * 0,4 0,4 05 0,5 0.55 ]................................................

3,5

Расстояние отнята »еля-см

Рисунок 8. Образование продуктов ограниченного протеолиза ТРСазы эластазой, тестируемая с помощью электрофореза в полиак-риламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия. Денси-тограмма гелей: 0 мин.

Рисунок 9. Образование продуктов ограниченного протеолиза ТРСазы эластазой, тестируемая с помощью электрофореза в полиак-риламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Денсито-грамма гелей: 4 мин.

Рисунок 10. Образование продуктов ограниченного протеолиза ТРСазы эластазой, тестируемая с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Денсито-грамма гелей: 18 мин.

6 с 1 с \

8 ь I 1 И' г ? I 1 ' а 5 I 1 I -

0.9

0.5 0,4 0.4 / \ °'И « 0.«

О 0.4 О.Б 0.5 0.5 0.6 о.5 0 ъ.ь

0,5 1

Подвижность 6&.1Н06 по отношению к подвижности субъеднницы гемоглобина

Рисунок 11. Определение молекулярной массы продуктов ограниченного гидролиза эла-стазой по подвижности маркерных белков. Стрелки — положения нативной субъединицы сннтетазы (А) и продуктов ее ограниченного гидролиза эластазой (В и С).

Маркеры: 1 - фосфорилаза В - мол. масса 97 кД; 2 - бычий сывороточный альбумин -мол. масса 66 кД; 3 - овальбумин - 44 кД; 4 -карбоангидраза - 29 кД; 5 - гемоглобин - 16,5 кД; 6 - цитохром С — 13 кД.

Протеолиз проходит через промежуточную форму В [\^ака8и§1 К., 8Пке В.М., 2002]. Полученные данные подтверждают доменность структуры ТРСазы, причем форма С, обладающая антиангиогенной функцией структурно устойчива к дальнейшему протеолизу в силу ее цитокинных функций и нахождению в межклеточном пространстве в ходе секреции из эндотелиоцитов.

Для выяснения возможного механизма защитного действия субстратов проведены эксперименты по определению характеристик частично протеолизованных форм ТРСазы. Изучено действие протеаз в присутствии различных субстратов и в условиях формирования «аминоациладенилат- ферментного» комплекса (рис. 12,

13). Из рисунков 12, 13 видно, что защитным действием обладает лишь аминоациладенилат. Причем возможное неравноценность в связывании аминоациладенилата с субъединицами фермента (его «одноцентровость», то есть функционирование одного активного центра на димерную молекулу) и способствовало разной скорости гидролиза субъединиц в составе фермент-субстратного комплекса.

При повышении концентрации эластазы возможно было увидеть быстрый гидролиз фермента по одному активному центру и медленный — по-другому. Приведена зависимость активности синтетазы от времени гидролиза комплекса фермента с триптофаниладенилатом при более высокой концентрации эластазы (рис.

14). В этом случае кривая инактивации состоит из двух участков — участка быстрой

инактивации половины активных центров и участка медленной инактивации (по линейному закону) второй половины активных центров.

бремя инкубации, мин

Рисунок 12. Скорость инактивации ТРСазы (0,8 мг/мл) под действием эластазы (0,075 мг/мл) при разных значениях рН. 1 — 0,05 М буфер трис-НС1, рН 8,0; 2 — 0,05 М какодилатный буфер, рН 6,5. Содержание 2-меркаптоэтанола в реакционной смеси (100 мкл) 10"3 М.

Рисунок 13. Скорость инактивации ТРСазы эластазой в присутствии субстратов. Инкубацию вели в какодилатном буфере в условиях, описанных в подписи к рис. 11, и в присутствии 10"2 М MgCl2. 1 — без субстратов; 2 — 5-10"3 М АТР; 3 — 10"4 М триптофан; 4 — 10'4 М и 5 — 10"3 М АТР; 5 — 6-Ю"5 М тРНК.

Подобный характер кривой инактивации наблюдался ранее при модификации ТРСазы аналогом субстрата - аминокислоты триптофана в присутствии предварительного синтеза аминоациладенилата [НППег 2005].

время инактивации, мин

Рисунок 14. Влияние аминоациладенилата на кинетику инактивации ТРСазы эластазой. Рак-ционная смесь (200 мкл) содержала 0,01 М буфер трис-НС1, рН 8,0, 10"3 М 2-меркаптоэтанол, 0,6 мг/мл синтетазы, 10"J М ATP, 10"2 М MgCl2, 2,5-10~4 М триптофан, 0,3 мг/мл эластазы.

Получение частично активной формы ТРСазы. Методами колоночной гельфильтрационной хроматографии нам на различных этапах эндогенного проте-олиза удалось выявить наличие двух форм: а) промежуточной, еще сохраняющей ферментативную активность, б) потерявшей форму. При анализе фракций белка из области пика хроматографического разделения частично гидролизованных форм обнаружено наличие форм субъединиц В и С практически в стехиометрических количествах (рис. 15).

Рисунок 15. Денси-тограмма электрофореза в ПААГ в присутствии до-децилсульфата натрия препарата модифицированного фермента. По оси абсцисс электрофоретиче-ская подвижность.

Рассстояние от начала геля, см

Значительная устойчивость формы С и легкость ее выделения в чистом виде подчеркивает функциональную значимость этой формы как в контроле процессов протеолиза, так и ангиогенеза.

Кинетика реакции АТР-РР1 обмена различных форм фермента и эксперименты по определению молярных соотношений различных субъединиц (по количеству образовавшегося аминоациладенилатного комплекса показали, что полученная модифицированная форма ТРСазы является ферментативно активным димером, состоящим из активной формы В (51 кД) и неактивной формы С (40 кД) (рис. 16, 17). При стандартных условиях видно двукратное превышение скорости реакции катализируемой нативным ферментом в сравнении с одноцентровым.

Рисунок 16. Зависимость образования [j2P] ATP от времени в реакции обмена АТР— [32Р] пи-рофосфат, катализируемой одноцен-тровым (1) и нативным (2) ферментами.

Рисунок 17. Гидролиз [у-32Р] АТР при образовании триптофаниладенилата. Реакционная смесь (100 мкл) содержала 0,05 М буфер трис-HCl, pH 7,5, 0,005 М MgCl2, 0,02 М NaCl, 2-10'5 М триптофан, 4,72-10"6 М АТР, 0,01 ед/мл пирофосфатазы. 1 — контроль (без фермента), 2 — одноцентровой фермент (0,76 х 10"6 М), 3 — нативный фермент (1,14 х 10"6 М).

Также выявлена зависимость образования [32Р] АТР от времени в реакции обмена АТР-[32Р]-пирофосфат интактным и модифицированным ферментами (рис.

16). С учетом того, что для этого фермента молярный коэффициент поглощения света уменьшается на 25%, следует, что фермент имеет активность, равную 0,52 от изначальной (рис. 17).

Свойства модифицированной формы ТРСазы. На нативном и одноцентро-вом ферментах приведены результаты опыта по гидролизу [у-32Р] АТР при образовании аминоациладенилата по методу Фершта и соавт. (рис. 17). Из полученных результатов следует, что в данных условиях инкубации нативный фермент образует 1,33 моль аминоациладенилата на 1 моль фермента. Одноцентровой фермент образует 0,6 моль стабильного аминоациладенилата на 1 моль фермента. Соотношение количества аминоациладенилатов, образованных нативным и одноцентровым ферментами, приблизительно равно 2:1, т. е. если у нативного фермента аминоациладенилат образуют оба активных центра, то у одноцентрового фермента — только один, что соответствует литературным данным [Kim М. J., 2003].

Изучение констант сродства - К„, для АТР, триптофана и пирофосфата в реакции обмена АТР— [32Р] пирофосфат, а также величины К,„ для тРНКТрп в реакции аминоацилирования тРНК для нативного и частично активного ферментов показало, что фермент, имеющий на 25% меньший молекулярный вес, не отличается по величинам К„, от нативного. Это еще раз подтверждает, что частично активный фермент, несмотря на потерю части последовательности с N-конца белка, в основном, сохраняет свои структурно-функциональные характеристики.

Из представленных данных выявляются особенности ТРСазы, которые могут быть перенесены на ферменты этого класса и особенности строения и функций и других ферментов в клетке.

При изучении возможности коррекции развития атеросклероза с помощью адаптогенного препарата трекрезан, установлено следующее (табл. 2).

Высокий уровень ИПА в контрольной группе свидетельствует о развитии атеросклероза. Введение трекрезана в дозе 5 мг/кг в/м в течение 2 месяцев приводит к достоверному снижению уровня триацилглицеринов, p-липопротеинов и общих ли-пидов в сыворотке крови и печени. Препарат в дозе 5 мг/кг в течение 3 месяцев не привел к уменьшению ИПА по сравнению с лечебным воздействием (табл. 2).

В следующей группе, при введении трекрезана в дозе 25 мг/кг в/м выявлено, что показатели липидного обмена в крови и печени снижаются еще больше. Пора-женность аорты - ИПА была существенно меньше, чем у контрольных животных. Проведенные исследования показали, что при введении трекрезана в дозе 25 мг/кг достигается стабильное уменьшение признаков атеросклероза (табл. 2).

Изменения показателей липидного обмена при применении

Количество липидов (ммоль/л) Ткань

сыворотка печень аорта

Контроль, ИПА (%) = 54±5

Липиды общие 72.5 ±5,1 1,2 ±0,1 1,8 ±0,2

Холестерол 34.2 ±2,2 0,5 ±0,1 • 0,7 ±0,1

Триацилглицерины 16,3 ±2,4 1,0 ±0,1 0,45 ± 0,05

Р-липопротеины 3,9 ± 0,4 0,2 ± 0,07 0,2 ± 0,05

Опыт -1 (трекрезан в дозе 5 мг/кг в/м 2 месяца), ИПА (%) = 47 ± 4

Липиды общие 54,1 ±4,1* 0,5 ±0,1* 1,6 ±0,2

Холестерол 31,1 ±2,1 0,4 ±0,1 0,6 ±0,1

Триацилглицерины 10,1 ±1,1* 0,45 ± 0,04* 0,4 ± 0,06

Р -липопротеины 2,1 ±0,2* 0,1 ±0,08 0,15 ±0,05

Опыт-2 (трекрезан в дозе 25 мг/кг в/м 2 месяца), ИПА (%) = 35 ± 4*

Липиды общие 46,7 ± 4,0* 0,4 ±0,1* 1,1 ±0,1*

Холестерол 24,8 ±1,9* 0,2 ± 0,05* 0,3 ±0,1*

Триацилглицерины 8,2 ± 0,9* 0,25 ±0,05* 0,2 ± 0,04*

Р -липопротеины 1,7 ±0,2* 0,0 0,0

Опыт-3 (трекрезан в дозе 50 мг/кг per oris, 2 месяца), ИПА (%) = 51,5 ± 5

Липиды общие 68 ± 4,9 1,1 ± 0,1 1,6 ±0,2

Холестерол 32,1 ±2,1 0,4 ±0,1 0,6 ±0,1

Триацилглицерины 15,5 ±2,2 0,9 ±0,1 0,3 ±0,1

Р -липопротеины 3,5 ±0,3 0,2 ± 0,08 0,2 ±0,05

Опыт-4 (трекрезан в дозе 150 мг/кг per oris, 2 месяца), ИПА (%) = 49 ± 4

Липиды общие 57,5 ±5,0* 0,6 ±0,1* 1,5 ± 0,2

Холестерол 32,2 ±2,1 0,4 ±0,1 0,5 ±0,1

Триацилглицерины 10,3 ± 2,2* 0,5 ±0,1* 0,3 ±0,1

Р -липопротеины 2,8 ±0,3* 0,1 ±0,07* 0,2 ± 0,03

Опыт-5 (трекрезан в дозе 5 мг/кг в/м 3 месяца), ИПА (%) = 41 ± 4*

Липиды общие 46,9 ±4,1* 0,6 ±0,1* 1,2 ± 0,1*

Холестерол 25,5 ±1,8* 0,2 ± 0,05* 0,4 ±0,1*

Триацилглицерины 8,3 ±0,95* 0,3 ±0,05* 0,3 ±0,05*

Р -липопротеины 1,8 ±0,2* 0,0 0,0

Примечание: * — р< 0,05 по отношению к контролю.

При введении трекрезана в рацион животных (третья и четвёртая серии опытов), его эффективность значительно снижается. Так, достоверное уменьшение количества общих липидов, р-липопротеинов и триацилглицеринов в сыворотке и в

печени зарегистрировано только в группе животных, получавших трекрезан в дозе 150 мг/кг в сутки (табл. 2).

Наконец, при трехмесячном введении трекрезана в дозе 5 мг/кг с первого дня эксперимента (пятая серия опытов), т.е. в определенной мере профилактически, показатели липидного обмена в крови, в ткани аорты и в печени, достоверно снижаются (табл. 2).

Заключительной задачей было выявление характеристик ТРСазы при развитии атеросклероза и применении трекрезана. Для этого, с использованием частично очищенных препаратов дрожжевой тРНКТрп, были изучены линейные участки зависимостей накопления продуктов специфического ацилирования ТРСазой (рис. 18).

Рисунок 18. Активность ТРСазы в частично очищенных препаратах аорты при воздействии препарата трекрезан в различных дозах и путях введения в условиях развития экспериментального атеросклероза.

А — контроль;

Б — ТК в дозе 150 мг/кг перорально; В — ТК в дозе 25 мг/кг внутримышечно; Г — ТК в дозе 5 мг/кг вместе с холестеролом.

Коэффициенты корреляции между показателями приведены в таблице 3, из которых видно, что отрицательная связь между основными показателями слабая, а между ИПА и активностью АРСазы - средней силы.

Универсальность АРСаз и их центральная роль в обеспечении одного из важнейших биологических процессов в клетке - белкового синтеза, делает их уникальным объектом исследований, позволяющим пролить свет на ранее неизвестные и порой неожиданные аспекты развития заболеваний организмов, в частности - патогенеза атеросклероза.

Связь активности АРСаз с показателями липидного обмена при применении трекрезана (Т) в разных дозах и путях введения (п=10)_

Т в дозе 25 мг/кг Т в дозе 150 мг/кг Т в дозе 5 мг/кг

Показатель в/м, 2 мес. рег опэ, 2 мес. в/м, 3 мес.

Коэффициенты корреляции активности АРСаз (г)

Холестерин, мг% г= -0,55 г= -0,27 г= -0,48

Триглицериды, мг% г= -0,47 г= -0,31 г= -0,41

Индекс пораженности аорты (%) г= -0,61 г= -0,42 г= -0,52

Естественно, мы понимаем «объем» того вклада, который вносят АРСазы в огромный конгломерат реакций, определяющих или формирующих белковые превращения, тем не менее, представляется важным подчеркнуть, что реакции АРСаз, на-наш взгляд, являются ключевыми, характерными для реакции напряжения (стресса, в том числе - эндогенного стресса и его кардиоваскулярного компонента).

Таким образом, полученные нами результаты дают обоснование для патогенетической профилактики и коррекции атеросклеротических поражений во врачебной практике. Это указывает на перспективу и позволяет придти к следующим выводам.

ВЫВОДЫ

1. Освоены стандартно воспроизводимые методики выделения участка гена ТРСазы и геномной ДНК, пригодные для дальнейших скрининговых исследований.

2. ТРСаза при расщеплении из основной исходной формы с молекулярной массой 60 кД вначале образует неустойчиво-активную форму с молекулярной массой 51 кД, а в дальнейшем активную и устойчивую форму с молекулярной массой 40 кД и неустойчивую, склонную к денатурации форму в 24+14 кД.

3. Активность ТРСазы в препаратах аорты в условиях развития экспериментального атеросклероза достоверно повышается на 20-35 % при воздействии препарата трекрезан в различных дозах и путях введения.

4. Развитие экспериментального атеросклероза достоверно (на 30-40 %) угнетается под влиянием нового отечественного адаптогенного препарата трекрезан.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Приведенные результаты позволяют рекомендовать разработанный нами способ определения активности АРСаз для контроля состояния сосудистой системы человека.

2. Полногеномные исследования могут быть использованы для изучения генетических основ факторов риска атеросклероза, инфаркта миокарда, ишемической болезни сердца, диабета 2 типа, гипертонической болезни и дислипидемий и т.д.

3. В целях предупреждения атеросклероза, а также для патогенетического лечения лиц, страдающих от атеросклероза, целесообразно применять в установленном порядке новый отечественный адаптогенный препарат трекрезан.

Список научных работ автора, опубликованных по теме диссертации В изданиях списка ВАК РФ:

1. Расулов М.М., Нурбеков М.К., Буланова В.В., Бобкова С.Н., Антонова Е.С., Сусова М.И.. Воронков М.Г. Гиполипидемическое действие трекрезана и его возможные молекулярные механизмы// Хим-фарм. Ж., 2010, № 6, С.10-14.

2. Воронков М.Г., Нурбеков М.К., Сусова М.И., Антонова Е.С. Антиатероскле-ротические и антикоагулянтные эффекты трекрезана. Докл. РАН. 2010, т 431, №2, с. 261-264.

3. Нурбеков М.К., Буланова В.В., Караулова Л.К., Стамова Л.Г., Сусова М.И.. Воронков М.Г. Средство, повышающее активность суммарной триптофанил — тРНК — синтетазы (патент на изобретение №2407526 от 27 декабря 2010 г)

4. Расулов М.М., Нурбеков М.К., Буланова В.В., Воронков М.Г., Сусова М.И. Лекарственное средство для коррекции развития мышечной системы (патент на изобретение № 2407525 от 27 декабря 2010 г)

В иных изданиях:

1. Нурбеков М. К., Сусова М. И., Соколова А. В., Барановская Е. Н., Расулов М. М. Атеросклероз: генетические исследования и их реализация // В сб.: «Физиология адаптации» материалы 2-ой всероссийской научно-практической конференции. Волгоград, 2010. с. 195-196.

2. Нурбеков М. К., Сусова М. И.. Соколова А. В., Барановская Е. Н., Расулов М. М. Неканонические функции аминоацил-тРНК-синтетаз и их комплексов // В сб.: «Физиология адаптации» материалы II всероссийской научно-практической конференции. Волгоград, 2010. с. 194-195.

3. Расулов М. М., Сусова М. И. Участие аминоацил-тРНК синтетаз в контроле физиологических процессов в норме и патологии. И Материалы IV международной конгресса. «Фитотерапия и народная медицина эпохи Авицены». Душанбе, 2010. с. 314-316.

Список принятых сокращений

АК - аминокислота АМФ - аденозинмонофосфат АРСаза - аминоацил-тРНК-синтетаза АТФ - аденозинтрифосфат

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ДНК - дезоксирибонуклениновая кислота

ИПА - индекс пораженности аорты

КД - круговой дихроизм

МАО-А - ген моноаминооксидазы

П.н. - пар нуклеотидов

ПААГ - полиакриламидный гель

ПМСФ - фенилметилсульфонилфторид

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ТирРСаза - тирозил-тРНК-синтетаза

ТК - трекрезан

тРНК - транспортная рибонуклеиновая кислота Трп - триптофан

ТРСаза - триптофанил-тРНК-синтетазы ТХУ - трихлоруксусная кислота У-ф - ультра-фиолетовой области ФФН - пирофосфат

Подписано в печать:

28.10.2011

Заказ № 6156 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11 -й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Актуальность

Согласно данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), сердечно-сосудистые заболевания являются «проблемой № 1» на планете [235]. Число больных с кардиоваскулярной патологией неуклонно возрастает, но до последнего времени способов достаточно эффективной борьбы с различными заболеваниями этой группы не существует. Особое место в ряду кардиоваску-лярных патологий принадлежит атеросклерозу, патогенез которого в последние годы связывают с патологическими процессами во внутренней мембране сосудов. Поэтому эффективность антиатеросклеротических препаратов определяется, прежде всего, их способностью защищать сосудистую стенку [1,24].

Вместе с тем, в последние годы проясняются механизмы контроля ате-рогенеза, связанных с цитокинной активностью ряда белковых факторов. Выявлена роль ферментов класса аминоацил-тРНК-синтетаз (АРСаз) — ключевых для обмена веществ. В частности - тирозил-тРНК-синтетаза (ТирРСаза), будучи расщепленной, обладает цитокинной активностью и стимулирует ангиогенез, способствуя, тем самым, атерогенезу [218, 225]. Гомолог ТирРСазы - трипто-фанил-тРНК-синтетаза (ТРСаза) в клетках существует в двух формах: 1) основная полноразмерная форма; 2) частично усеченная форма (миниТРСаза), которая лишается N- концевого фрагмента в процессе альтернативного сплайсинга при созревании пре-мРНК [147]. Образование обеих форм фермента может быть резко ускорено у всех млекопитающих при воздействии ряда белковых факторов, в частности, у-интерферона. При этом, ТРСаза, особенно в виде ми-ниТРСазы, в отличие от ТирРСазы, обладает выраженным антиангиогенным и антиатерогенным действием [218]. Естественно, что актуальность исследования ферментов внерибосомного этапа белкового синтеза связана, прежде всего с важной ролью, которую ферменты играют в реализации генетической информации, обеспечивая нужную точность и безошибочность прочтения кода ДНК. При этом следует отметить и нарастающий поток информации о дополнительных неканонических функциях АРСаз. Так, АРСазы обеспечивают реализацию генетического кода, обеспечивая соответствие аминокислот с их гомологичными тРНТС. Когда различия в энергиях связи аминокислоты с АРСазой становятся неадекватными, главным детерминирующим фактором обеспечения селективности фермента становится редактирование. Метаболическое преобразование не входящих в белок аминокислот — гомоцистеина (Hey), а также лейцил-тРНК-синтетаз подчеркивает, что непрерывное редактирование неправильно включенной в белок аминокислоты является неотъемлемой частью нормального аминоацилирования тРНК. Обратимое нитрозилирование аминокислот затрудняет их редактирование тРНК синтетазой и способствует включению аминокислот в белки в положениях, определенных кодонами. Это показывает, каким образом генетический код может быть скорректирован вовлечением в кодирующие метаболические пути аминокислот. Трансляция опосредованных закисью азота и посттрансляционным путям включения аминокислот в белок, обеспечивают вероятные химические механизмы, с помощью которых аминокислоты, будучи в избыточных количествах, могут вносить вклад в сердечнососудистые патологии человека [130].

Интенсивность развития данного направления исследований столь высока, что некоторые ученые характеризуют это явление как ренессанс науки о структуре, функциях и роли в клетке и организме ферментов внерибосомного этапа белкового синтеза, что естественным образом накладывает определенные ограничения на «рамки» исследований для любого человека, решившего работать в этом актуальном направлении. Поэтому представляется целесообразным ограничиться исследованиями небольшой группы АРСаз (в частности ТРСазы и ТирРСазы), в силу их наибольшей изученности, в том числе и с точки зрения дополнительных функций. В этом плане заметим, что особенностью АРСаз является их чрезвычайная гетерогенность, несмотря на то, что они катализируют однотипную реакцию — специфическое присоединение к той или иной транспортной РНК (тРНК) соответствующей гомологичной аминокислоты. Другой особенностью является исходно большое их количество - как минимум 20, соответственно количеству аминокислот в клетке. При этом необходимо помнить, что некоторые аминокислоты кодируются несколькими вариантами «3-х буквенного» кода ДНК, и для них существуют несколько видов тРНК, которые должны узнаваться соответствующей АРСазой. Еще одним своеобразием этих ферментов является их эволюционная древность, так как катализируемая ими реакция должна была появиться одновременно с зарождением протоклетки.

Последующие процессы отбора и эволюции в значительной степени затрагивали этот класс древних ферментов, возможно наделяя их дополнительными функциями. Очевидная важность АРСаз для клетки их несомненная ценность как объект изучения эволюции белкового синтеза привлекали к себе пристальное внимание исследователей длительное время. Кроме того, каждый из представителей этого класса ферментов исследовался отдельными группами ученых. В нашей стране подробно изучались ТРСаза и фенилаланил-тРНК-синтетаза из высших организмов [29, 97,103, 123,125,128].

Одним из основных факторов резко ускоривших исследования дополнительных функций АРСаз (как и других исследований по изучению роли в клетке различных белков, ферментов, и их комплексов) была расшифровка генома человека и создание общедоступных банков данных нуклеотидных последовательностей. Это, в свою очередь, стимулировало работы по выделению нужных генов или/и их фрагментов для исследований их регуляции, а также работы по получению интересуемых белков и ферментов. Поэтому, наш интерес к проблеме закономерен. При этом необходимо ограничиться изучением ТРСазы, поскольку этот фермент катализирует специфическое ацилирование транспортной РНК (тРНК) соответствующими аминокислотами. АРСазы вообще, и ТРСаза в частности, выполняет базовые для жизнедеятельности клетки функции и одновременно определяет развитие целого спектра заболеваний человека.

Базовая роль АРСаз отражается в многообразии клеточных процессов, в которых они принимают участие.

Структурно-функциональный анализ ТРСазы с точки зрения ее неканонических функций привлекает пристальное внимание в аспекте мощной антиан-гиогенной функции ее модифицированных форм. Эндотелиальный фактор роста сосудов (Vegf) играет центральную роль в становлении стереотипного паттерна сосудов у позвоночных. Однако то, каким образом формируется и поддерживается сеть кровеносных сосудов при их развитии понятно еще не до конца. Ген, ответственный за Ко 095 кодирует серил-тРНК-синтетазу (Sars) с нонсенс мутацией. Аномальное ветвление межсегментных сосудов у Ко 095 мутантных линий подавлялось внедрением гена дикого типа (Sars) или мутант-ной формой (Т429А), лишенной ферментативной активности, катализирующей аминоацилирование тРНК-серин (каноническая активность). Это предполагает, что аномальное ветвление связано не только с потерей функций Sars, но и ами-ноацилирующей функцией. Временное выключение процедурой «нокдауна» Vegfc или Vegß приводит к восстановлению процессов аномального ветвления у Ко 095 мутантов. Это показывает, что аномальное ветвление межсегментных сосудов у Ко 095 мутантов является следствием пути сигнала активации Vegf, VegfZ и требует, в свою очередь, сигналы Vegfc - Vegf3, т.к. последние необходимы для общего ангиогенеза. Следовательно можно заключить, что неканонические функции SARS вовлечены в формирование и развитие сосудов через модуляцию экспрессии гена Vegfa.

Итак, неканонические функции АРСаз важны для поддержки, развития пространственного паттерна у полосатых рыб. Можно полагать возможность автономной регуляции SARS образования паттерна сосудов. Вне сомнения, таким образом, что Vegfa-Vegflc2 и Vegfk3 сигнальные маршруты необходимы для ангиогенеза [108]. В этой связи на передний план выходят вопросы регуляции этих функций фермента и возможность коррекции последней с применением медикаментозных методов.

Бурное развитие иммунологии и кардиофармакологии в последние годы привело к новым интерпретациям связи между изменениями в сердечнососудистой системе и развитием воспалительных реакций, как признака адаптации [31, 32]. Так, на сегодняшний день окончательно установлена тесная и неразрывная связь между изменениями в сердечно-сосудистой системе и развитием как локального, так и генерализованного адаптационного синдрома [47, 48]. При этом многие специалисты зачастую стали употреблять выражение «кардиоваскулярный компонент стресс синдрома». В состоянии стресс, как указывает Г.Селье, происходит усиленный выброс в кровь ряда стероидных гормонов и катехоламинов, одной из функций которых является мобилизация биоэнергетики. Последняя происходит за счёт выноса в кровь из жировой ткани неэстерифицированных жирных кислот в большей мере, чем гликогена. Соответственно и окислительно-восстановительные реакции, переходят в основном на липидный субстрат. При контакте липидов с кислородом активируется их свободно - радикальное окисление [3, 4]. Гидроперекиси липидов разрушают мембраны клеток и становятся причиной тяжелейшего повреждения. При этом нарушается функционирование систем, регулирующих, например мышечное сокращение [13,14,15].

При этом в последние годы получены данные, послужившие базой для выделения основных принципов патогенетической терапии общепатологических состояний: защита мембраны и коррекция энергетического обеспечения клетки, а также нормализация механизмов трансмембранного переноса и внутриклеточного распределения ионов и жидкости [69, 78, 98, 149,178, 206,207]. Это значит, что эффективность аитиатеросклеротических препаратов определяется их способностью защищать сосудистую стенку. Следовательно, изучение клинической эффективности препаратов, способных влиять непосредственно на метаболические процессы актуально. В этом плане особое внимание привлекают триэтаноламмониевые соли ароксиуксусных кислот, имеющие протатра-новую структуру [52], которые уменьшают пораженность эластических волокон и стабилизируют клеточные мембраны [36]. Одним из таких препаратов является адаптоген широкого спектра действия и иммуномодулятор трекрезан — трис-2 (гидроксиэтил) аммоний 2- метилфеноксиацетат, обладающий антиокислительной активностью, т.е. действующий на одно из звеньев метаболизма липидов.

Цель исследования. Выявление изменений биосинтетической активности ТРСазы при атеросклерозе и раскрытие новых возможностей его коррекции.

Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи. Задачи исследования:

1. Освоить способы получения участка гена ТРСазы и геномной ДНК человека, пригодные для дальнейших скрининговых исследований.

2. Определить физико-химические и физиологические характеристики ТРСазы.

3. Выявить изменения характеристик ТРСазы при развитии атеросклероза в эксперименте под влиянием трекрезана.

4. Установить возможности коррекции развития экспериментального атеросклероза с помощью адаптогенного препарата трекрезан.

Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые: подобраны и освоены способы получения участка гена ТРСазы и геномной ДНК человека, пригодные для скрининговых исследований; изучены характеристики ТРСазы; установлено, что трекрезан стимулирует активность ТРСазы в условиях экспериментального атеросклероза; установлено, что трекразан обладает противоатеросклеротическим действием; выявлена теоретическая возможность использования препарата класса адаптогенов для профилактики и коррекции экспериментального атеросклероза.

Практическое значение работы

1. Подобрана методика выделения участка гена ТРСазы и геномной ДНК человека, пригодные для скрининговых исследований.

2. ТРСаза существует в следующих формах: с молекулярной массой 60 кД, молекулярной массой 51 кД, молекулярной массой 40 кД и молекулярной массой 24+14 кД. При этом, наиболее активно тормозит развитие атерогенеза форма с молекулярной массой 40 кД.

3. Активность ТРСазы под влиянием трекрезана увеличивается на 20-35% в зависимости от дозы и пути введения препарата.

4. Результаты исследования указывают на возможность дальнейшего изучения в установленном МЗ порядке новой методики профилактики и коррекции атеросклероза.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. ТРСаза является одним из ведущих звеньев в сложной цепи синтеза белка, как в норме, так и при развитии атеросклероза.

2. Активность ТРСазы увеличивается при воздействии трекрезана.

3. Атеросклеротические бляшки служат показателем дезадаптации функции эндотелия крупных сосудов.

4. Применение трекрезана в условиях экспериментального атеросклероза тормозит развитие атеросклеротических бляшек.

6. выводы

1. Освоены стандартно воспроизводимые методики выделения участка гена ТРСазы и геномной ДНК, пригодные для дальнейших скрининговых исследований.

2. ТРСаза при расщеплении из основной исходной формы с молекулярной массой 60 кД вначале образует неустойчиво-активную форму с молекулярной массой 51 кД, а в дальнейшем активную и устойчивую форму с молекулярной массой 40 кД и неустойчивую, склонную к денатурации форму в 24+14 кД.

3. Активность ТРСазы в препаратах аорты в условиях развития экспериментального атеросклероза достоверно повышается на 20-35 % при воздействии препарата трекрезан в различных дозах и путях введения.

4. Развитие экспериментального атеросклероза достоверно (на 30-40 %) угнетается под влиянием нового отечественного адаптогенного препарата трек-резан.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Приведенные результаты позволяют рекомендовать разработанный нами способ определения активности АРСаз для контроля изменений патологического состояния сосудистой системы.

2. Полногеномные исследования могут быть использованы для изучения генетических основ факторов риска атеросклероза и его последствий: инфаркта миокарда, ишемической болезни сердца, гипертонической болезни и дислипи-демий.

3. В целях предупреждения атеросклероза, а также для патогенетического лечения лиц, страдающих от атеросклероза, целесообразно провести изучение эффекта трекрезана в клинической практике.

Выражаю глубокую благодарность сотрудникам МГПУ (хим-биофак), МГГУ им. М.А.Шолохова, ВНИИКИМП и лично академику М.Г.Воронкову -создателю трекрезана за помощь в работе над настоящей диссертацией.