Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Механизмы реализации регуляторного влияния интерлейкина-2 на апоптоз лимфоцитов крови

На правах рукописи

Сазонова Елена Викторовна

МЕХАНИЗМЫ РЕАЛИЗАЦИИ РЕГУЛЯТОРНОГО ВЛИЯНИЯ ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 НА АПОПТОЗ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ

СО, (6

14 «ОЗтО^" патологическая физиология ОЗтОЗгМ-- клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 4 йНВ 2010

Кемерово-2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», г. Томск

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Рязанцева Наталья Владимировна Жукова Оксана Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинский наук, профессор

доктор медицинских наук

Лисаченко Геннадий Васильевич

Литвинова Лариса Сергеевна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия Росздрава», г. Омск

Защита состоится ^^¿£¿1^2010 г. в_часов на заседании диссертационного совета Д 208.035.02 при ГОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия Росздрава» (650029, г. Кемерово, ул. Ворошилова, 22а)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия Росздрава»

Автореферат разослан «Ю »у&С&^лЛ 20091

Ученый .секретарь

диссертационного совета, Разумов A.C.

доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. К ключевым системам, обеспечивающим стратегию адаптации макроорганизма к постоянно изменяющимся условиям внутренней и внешней среды, относится система иммунитета. Одним из фундаментальных механизмов регулирования иммунных реакций является апопто-тическая гибель иммунокомпетентных клеток [Потапнев М.П., 2002], необходимая для установления баланса между их эффективным функционированием, с одной стороны, и своевременным и безопасным удалением - с другой.

Регуляция выживания и гибели иммунокомпетентных клеток осуществляется через цитокиновую сеть, представляющую собой систему клеточных медиаторов и их рецепторов, к числу которых относят интерфероны, колоние-стимулирующие факторы, трансформирующие ростовые факторы, хемокины и интерлейкины [Симбирцев А.С., 2004; Prasad T.S. et al., 2009].

Одним из ведущих цитокинов, определяющих жизнедеятельность иммунокомпетентных клеток, является интерлейкин-2 (IL-2), в течение долгого времени известный как ростовой фактор для Т-, В-лимфоцитов, NK-клеток и фагоцитов, обеспечивающий их функциональную активацию [Сенников C.B. и со-авт., 2004; Лебедев JI.P. и соавт., 2007]. К настоящему времени установлено, что модулирующее влияние данного клеточного медиатора на танатогенную программу носит двойственный характер. Для объяснения выбора про- или антиапоптотического пути воздействия IL-2 была предложена теория обратной связи в контроле апоптоза Т-лимфоцитов, согласно которой указанный цитокин вызывает повышение чувствительности Т-лимфоцитов к апоптозу [Потапнев М.П., 2002]. Исход жизни клетки зависит от уровня антигенного и костимули-рующего воздействия. В случае его отсутствия экспрессия IL-2 и его клеточного рецептора угнетается. В результате этого клетки подвергаются апоптозу, связанному с нехваткой цитокина. Данный механизм ограничивает иммунный ответ после устранения патогена. При избытке антигенного воздействия может наступить антигениндуцированный апоптоз Т-клеток, обусловленный связыванием антигена с рецептором и опосредованный воздействием на активированный Т-лимфоцит Fas-лиганда и фактора некроза опухоли a [Walczak H. et al., 1997].

Изменение продукции 1L-2 и связанное с этим нарушение реализации та-натогенной программы является причиной многих патологических процессов. Так, избыточная экспрессия IL-2 и IL-2R обнаруживается у большинства опухолевых клеток, потерявших способность к апоптозу, что дает основания рас-

сматривать данный цитокин в качестве одного из факторов, способствующих малигнизации [Reichert Т.Е. et al., 1998; Eriksen К. et al., 2001]. Высокая интенсивность программированной гибели лимфоцитов, сопровождаемая угнетением продукции IL-2, выявлена при инфекционной патологии. Так, при гепатите С происходит изменение содержания цитозольного Са2+, определяющего активность транскрипционного фактора NFAT и, соответственно, промотора гена IL-2 [Bergqvist A., Rice С.М., 2001; Jerome K.R., 2008]. При коровьей оспе отмечается блокирование TcR-индуцированной активации NFAT/AP 1 элемента промотора гена IL-2 [Alonso A.S. et al., 2003].

Для моделирования дисбаланса системы IL-2-IL-2R используются различные приемы, к числу которых относятся нокаутирование гена IL-2 и его рецептора, конструирование генов ß- и у-субъединиц IL-2R и др. [Fanzo J.C. et al., 2006]. Доступным методом, позволяющим изучать молекулярные механизмы проведения сигнала от данного рецепторного комплекса, является культивирование лимфоцитарных клеток в присутствии рекомбинантного IL-2.

Следует признать, что в настоящее время молекулярные механизмы диз-регуляции системы IL-2-IL-2R изучены недостаточно, а имеющиеся в литературе данные в рамках обсуждаемой проблемы носят весьма неоднозначный характер. В связи с этим важным становится исследование молекулярных механизмов lL-2-опосредованных нарушений апоптоза лимфоцитов для поиска новых патогенетически обоснованных технологий управления гибелью клеток.

Цель исследования: выявить роль и молекулярные механизмы участия интерлейкина-2 в регуляции апоптоза лимфоцитов крови.

Задачи исследования:

1. Установить особенности реализации апоптоза лимфоцитов крови при действии рекомбинантной формы интерлейкина-2 человека in vitro в концентрациях от 0,1 до 1,0 нг/мл.

2. Оценить внутриклеточный уровень активных форм кислорода и состояние трансмембранного потенциала митохондрий при интерлейкин-2-зависимой гибели лимфоцитов крови.

3. Определить роль белков семейства Вс1-2, транскрипционных факторов NFkB, Р53 и ингибитора циклинзависимых киназ P2I в регуляции апоптоза, опосредованного интерлейкином-2.

4. Провести сравнительную оценку состояния молекулярных механизмов интерлейкин-2-опосредованного апоптоза лимфоцитов при добавлении рекомбинантной формы интерлейкина-2 человека in vitro и при патологическом про-

цессе, сопровождающемся нарушениями в системе интерлейкина-2 (у пациентов с клещевым энцефалитом).

Научная новизна. Получены новые данные фундаментального характера о влиянии интерлейкина-2 на реализацию апоптоза лимфоцитов крови в зависимости от концентрации цитокина и условий культивирования. Впервые определены молекулярные мишени интерлейкин-2-опосредованной регуляции апоптотической гибели. Установлено, что рекомбинантный интерлейкин-2 в конечных концентрациях от 0,1 до 1,0 нг/мл дозозависимо оказывает проапоп-тотическое действие на лимфоциты крови и проявляет протективный эффект в отношении дексаметазониндуцированного апоптоза данных клеток. Показано, что в культуре лимфоцитов у здоровых доноров, инкубированных с 0,1 нг/мл рекомбинантного интерлейкина-2, повышено количество клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий на фоне накопления в них активных форм кислорода, снижения уровня антиапоптотических белков-регуляторов Вс1-2 и Bc1-Xl, активации транскрипционных факторов NFkB и Р53.

Впервые выявлено, что индукция апоптоза иммунокомпетентных клеток крови при остром клещевом энцефалите, сопровождающемся повышенной продукцией и сниженной рецепцией лимфоцитами интерлейкина-2, обусловлена участием NFkB, Р53 и митохондриальных факторов (увеличение числа клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий, повышение внутриклеточного уровня активных форм кислорода, дисбаланс белков семейства Bcl-2).

Показана унификация молекулярных механизмов апоптоза иммунокомпетентных клеток как при дисбалансе системы интерлейкина-2 в условиях in vitro, так и при инфекционном процессе (клещевой энцефалит).

Теоретическая и практическая значимость. Результаты проведенного исследования расширяют фундаментальные знания о характере изменения программированной гибели клеток под действием рекомбинантной формы интер-лейкина-2 человека в зависимости от его концентрации и состояния клеточного микроокружения. Полученные фактические данные раскрывают молекулярные механизмы интерлейкин-2-опосредованной регуляции апоптотической гибели лимфоцитов, связанные с активацией митохондриального пути и обусловленные участием транскрипционных факторов (NFkB и Р53) и белков семейства Bcl-2. Основные положения исследования могут служить основой для создания

молекулярных технологий управления функциями иммунокомпетентных клеток с использованием цитокинов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Рекомбинантный интерлейкин-2 человека оказывает дозозависимые эффекты на реализацию апоптоза иммунокомпетентных клеток: количество апопто-тических клеток в культуре лимфоцитов изменяется однонаправленно с концентрацией цитокина в диапазоне 0,1-1,0 нг/мл и обратнопропорционапьно его дозе на фоне действия дексаметазона.

2. Дисбаланс системы интерлейкина-2 при культивировании лимфоцитов крови здоровых доноров с рекомбинантной формой данного цитокина и при клещевом энцефалите сопровождается модуляцией апоптотической гибели лимфот цитов крови, реализующейся при участии митохондриальных факторов, активных форм кислорода, NFkB, Р53 и обусловленной смещением баланса Вс1-2-белков в сторону проапоптотических.

Апробация материалов диссертации. Результаты исследования были доложены и обсуждены на VIII и X Конгрессах молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2007, 2009), XIII и XV Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2007, 2009), IV Объединенном иммунофоруме (Санкт-Петербург, 2008), X Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009), ХШ Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009), VII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009).

Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедр патофизиологии (разделы «Патофизиология клетки», «Патофизиология иммунной системы», «Воспаление»), фундаментальных основ клинической медицины (разделы «Патофизиология клетки», «Типовые патологические процессы», «Роль апоптоза клетки в патологии»), кафедры морфологии и общей патологии (раздел «Инфекция и иммунитет») ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.

Работа выполнена в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» по темам «Работа по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем с участием научных организаций Японии» (ГК № 02.512.11.2285), «Проведение научных исследований коллективами на-

учно-образовательных центров в области фундаментальной медицины и физиологии» (ГК № 02.740.11.0311), а также при финансировании РФФИ «Разработка способов направленной коррекции дизрегуляции пролиферации и апоптоза нормальных и патологически измененных клеток с помощью регуляторных молекул» (№ 09.04.99025) и Совета по грантам при Президенте РФ по государственной поддержке научных исследований молодых российских ученых-докторов наук по теме «Молекулярные механизмы цитокинопосредованной дизрегуляции апоптоза лимфоцитов при поляризации иммунного ответа по ТЫ - или ТЬ2-пути» (МД-3842.2009.7) и ведущих научных школ РФ по теме «Роль генетически детерминированной реакции системы крови в патоморфозе инфекционных заболеваний» (НШ-2334.2008.7).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе б - в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена па 141 странице машинописного текста и состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 280 источников, из которых 226 - иностранных авторов. Работа иллюстрирована 4 таблицами и 24 рисунками.

Личный вклад автора. Анализ литературных данных по теме диссертации, планирование исследования, выделение и культивировпние лимфоцитов крови, оценка продукции лимфоцитов крови и его рецепторов, апоптоза лимфоцитов крови, количества клеток со сниженным уровнем потенциала мито-хондриапьной мембраны, содержания активных форм кислорода, факторов транскрипции и белков регуляторов апоптоза в лимфоцитах крови, статистический анализ результатов, написание диссертации выполнены лично автором.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

В основу работы положены результаты комплексного клинико-лабораторного обследования 65 человек (30 мужчин и 35 женщин в возрасте от 18 до 50 лет), включая 45 пациентов с клещевым энцефалитом и 20 здоровых доноров.

Критериями исключения из программы исследования являлись возраст моложе 18 и старше 50 лет; период обострения хронических воспалительных

заболеваний; аутоиммунные, наследственные и психические болезни, алкогольная и наркотическая зависимости.

Пациенты находились на диспансерном учете или стационарном лечении в терапевтическом отделении МЛПУ МСЧ «Строитель» (главный врач -И.Н.Бартфельд, зав. отделением - О.В. Буров), инфекционном отделении госпитальных клиник ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (главный врач - Заслуженный врач РФ, канд. мед. наук В.М. Шевелёв, зав. отделением - канд. мед. наук Н.С. Бужак) и инфекционном отделении МЛПУ ГБ №3 (главный врач - М.А. Лука-шов, зав. отделением - Г.В. Запаздаева).

Материалом для исследования служила венозная кровь, взятая утром натощак из локтевой вены в количестве 10 мл и стабилизированная гепарином (25 Ед/мл).

Исследование проводилось на базе Научно-образовательного центра молекулярной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (руководитель - канд. мед. наук O.E. Чечина) и лаборатории клинической иммунологии ФГУЗ Клиническая больница № 81 ФМБА России (зав. лабораторией - канд. мед. наук Т.Т. Радзивил).

В соответствии с поставленными целью и задачами исследования работа была разделена на два последовательных этапа. На первом этапе проводилась оценка эффекта rIL-2 на реализацию клеточной гибели в зависимости от его дозы. В работе было использовано инкубирование клеток здоровых доноров с различными концентрациями рекомбинантной формы IL-2 (rIL-2) человека. Для анализа антиапоптотического действия IL-2 лимфоциты крови инкубировали в полной среде, содержащей дексаметазон, выступавший в качестве ии-дуктора апоптоза, и rIL-2.

Второй этап исследования был посвящен изучению механизмов проапоп-тотического действия 1L-2 на экспериментальной модели lL-2-опосредованного апоптоза лимфоцитарных клеток крови, полученных у здоровых доноров и у пациентов с клещевой нейроинфекцией. Распределение здоровых доноров и пациентов с клещевым энцефалитом в соответствии с использованными методами исследования представлено в таблице 1.

Лимфоциты выделяли из крови путем центрифугирования на градиенте плотности Ficoll-Paque (р=1,077 г/см3) («Pharmacia», Швеция). Выделенные клетки инкубировали в течение 18 ч при температуре 37°С в полной питательной среде, в среде с добавлением rIL-2 в диапазоне концентраций 0,015-1,000 нг/мл, а также в полной среде при одновременном внесении 10'" моль/мл дек-саметазона и rlL-2 в дозах 0,025-0,050 нг/мл. Продукцию лимфоцитами IL-2

Таблица 1 - Распределение обследованных лиц в соответствии с методами исследования лимфоцитов крови (п=65)

Методы исследования Лимфоциты здоровых доноров Лимфоциты, инкубированные с 0,1 нг/мл rIL-2 Лимфоциты, инкубированные с 0,1 нг/мл rIL-2 и 10'4 M дексамета-зона Лимфоциты пациентов с острым клещевым энцефалитом Лимфоциты пациентов с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита

Исследование содержания IL-2 в су-пернатантах культур лимфоцитов методом иммуноферментного анализа 16 - - 17 15

Оценка количества IL-2R-презентирутощих лимфоцитарных клеток методом проточной цитофлюориметрии 16 - - 17 15

Определение количества апогттотиче-ски измененных лимфоцитов в аннек-синовом тесте методом проточной цитофлюориметрии 20 20 20 20 20

Определение числа лимфоцитов со сниженным уровнем трансмембранного потенциала митохондрий методом проточной цитофлюориметрии 20 10 10 16 17

Оценка содержания в клетке АФК методом проточной цитофлюориметрии 20 10 10 22 17

Исследование содержания факторов транскрипции (Р53 и NFkB), Р21 и белков-регуляторов апоптоза (Bad, В ах, Bcl-2, Bcl-XO методом иммуноблоттинга 12 12 12 12 12

оценивали методом иммуноферментного анализа по инструкции, предлагаемой фирмой-производителем («Протеиновый контур», Санкт-Петербург).

Содержание лимфоцитов, презентирующих на своей поверхности мембранную форму рецептора к 1L-2, определяли методом проточной лазерной ци-тометрии с использованием стандартных моноклональных антител к lL-2Ra (CD25), меченных фикоэритрином (CD25-PE) («R&D Systems», США). Оценку реализации программированной гибели лимфоцитов проводили с использованием FITC-меченного аннексина V и пропидиум йодида (PI) («Beckman Coulter», США) [Van Engeland M., 1998] методом проточной лазерной цитометрии на цитометре Epics XL («Beckman Coulter», США). Количество клеток со сниженным уровнем потенциала митохондриальных мембран (Д\|/) регистрировали с помощью набора реагентов «MitoScreen» («BD Pharmigen», США), ключевым реагентом которого является флюорохром 5,5',6,6'-тетрахлоро-1,Г,3,3'-тетраэтилбензимидазолилкарбоцианин йодид (JC-1). Окрашенные JC-1-лимфоциты анализировали на проточном цитометре Epics XL («Beckman Coulter», США), определяя процентное содержание клеток в гейтах неапоптотических (FL-1 и FL-2) и апоптотических клеток (FL-1-свечение). Для оценки уровня активных форм кислорода в клетках применяли краситель с заблокированной флюоресценцией дихлорфлюоресцеин диацетат («Sigma», США). После 20-минутной инкубации с данным препаратом реакцию останавливали 200 мкл лизирующего раствора. Затем оценивали параметры зеленой флюоресценции в гейте лимфоцитарных клеток, выявленных на FL 1-канале с помощью проточного цитометра Epics XL («Beckman Coulter», США) [Дамбае-ва C.B. и соавт., 2001].

Для исследования содержания белков-регуляторов апоптоза (Bcl-2, Bcl-XL, Вах, Bad), а также транскрипционных факторов (NFkB, Р53, Р21) был использован иммуноблоттинг. Белки разделяли по молекулярной массе под действием электрического поля (10 В/см пути). Использовали белковые маркеры молекулярного веса (14,3 - 220,0 kDa, «Fermentas», EU). Для последующего исследования белки электрофоретически переносили на нитроцеллюлозную мембрану («Bio-Rad», США) в течение 80-90 мин при силе тока 50-60 мА. В работе были использованы антитела к Bcl-2, BcI-XL, Вах, Bad, Р53, NFkB, Р21 («Biosource», США) в разведении 1:200. В качестве стандарта и внутреннего контроля использовали глицеро-3-фосфат-дегидрогеназу («Chemicon», США).

Оценку полученных данных проводили методами статистического описания и проверки статистических гипотез [Кремср Н.Ш., 2004]. Проверку нормальности распределения количественных показателей проводили с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. Для каждой выборки вычисляли медиану (Ме), первый и третий квартили ((^1 и СЬ). Сравнение изученных показателей проводили с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни для двух независимых групп и непараметрического критерия Краскела-Уоллиса для нескольких независимых групп. Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05 [Кремер Н.Ш., 2004].

Результаты исследования и их обсуждение

Культивирование лимфоцитов, полученных у здоровых доноров, в присутствии рекомбинантной формы 1Ь-2 (г1Ь-2) показало, что данный цитокин начинал проявлять своё проапоптотическое действие в отношении лимфоци-тарных клеток, когда его концентрация в среде культивирования составляла 0,100 нг/мл. При последующем увеличении дозы медиатора отмечалось повышение числа фосфатидилсеринэкспрессирующих лимфоцитов, пропорциональное дозе циткина (рис. 1).

%

* - р<0,05 по сравнению с аналогичными значениями в культуре клеток, инкубированных в безцитокиновой среде,

Рисунок 1 - Изменение количества апоптотических лимфоцитов в зависимости от концентрации г!Ь-2 в культуралыюй среде

Следует отметить, что в литературе на сегодняшний день не описан дозо-зависимый характер проапоптотического действия 1Ь-2. В настоящем исследо-

вании было впервые обнаружено, что для реализации апоптозиндуцирующего эффекта rIL-2 на лимфоциты крови в условиях in vitro необходим определенный порог концентрации цитокина. Наличие подобного «барьера» действия IL-2 может быть объяснено строением его рецептора и работой внутриклеточных сигнальных путей [Boytim M.L. et al., 2ООО; Lindemann MJ., 2003; Stauber D.J. et ai., 2006].

На модели глюкокортикоидиндуцированного апоптоза лимфоцитов, вызванного добавлением 10"4 М дексаметазона, установлено протективное действие rtL-2 (рис. 2). Существует множество причин отмены апоптоза данным ци-токином. Одна из них - способность данного цитокина запускать пролифера-тивный каскад по JAK./STAT-, PI3K- или МАРК-сигнапьным путям, сходящимся на регуляции экспрессии гена bcl-2, результатом повышения которой

является клеточное выживание и пролиферация [Fridman J.S., Lowe S.W., 2003]. %

60 50 40 30 20 10 0

0,000 0,025 0,050 0,100 нг/,мл

* - р<0,05 - по сравнению с аналогичными значениями в культуре клеток, инкубированных с 0,1 ммоль/л дексаметазона

Рисунок 2- Количество апоптотически измененных лимфоцитов в условиях культивирования в среде, содержащей дексаметазон и rIL-2 в различных концентрациях

Дозозависимый характер этого явления может быть объяснен увеличением количества активированных IL-2R с повышением дозы цитокина и усилением интенсивности антиапоптотических сигнальных путей в клетке [Lindemann M.J. et al., 2003].

Установлено, что течение острого клещевого энцефалита характеризуется повышением уровня продукции 1L-2, снижением содержания IL-2R-положительных клеток и усилением вовлечения лимфоцитов в процесс апопто-

за (рис. 3). Усиление секреции IL-2, на наш взгляд, является проявлением адекватной реакции иммунной системы, направленной на элиминацию возбудителя. Как известно, инициация противовирусного иммунитета путем включения специфического иммунного ответа осуществляется за счет взаимодействия Т-лимфоцита с антигенпредставляющей клеткой [Хаитов P.M., 2001]. Сочетание сигналов, поступающих на Т-хелпер через комплекс TCR-CD3 и CD28, приводит к активации клетки, т.е. выходу ее из фазы покоя G0 в фазу клеточного цикла G,. Основной результат этого состоит в индукции экспрессии генов ростовых факторов, в частности IL-2, что подготавливает клетку к пролиферации, лежащую в основе любых форм проявления активности лимфоцитов [Хаитов P.M., 2001; Кашкин К.П., 2004].

% от нормы

250 1 * □ Здоровые доноры

□ Больные острым

клещевым энцефалитом

□ Пациенты с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита

Содержание Количество Количество

Н.-2, пг/мл 1Ь-2Я+лимфоцитов, % лимфоцитов в

апоптозе, %

* - р<0,05 по сравнению с аналогичными значениями у здоровых доноров

Рисунок 3 - Продукция 1Ь-2 лимфоцитами, содержание 1Ь-2Я-презентирующих клеток и количество лимфоцитов в апоптозе у пациентов с клещевым энцефалитом

При взаимодействии 1Ь-2 с 1Ь-2Я сигнал передается на внутриклеточный протеинкиназный комплекс, каскадная активация которого проявляется в апоп-тогенном или митогенном влиянии цитокина на клетку. В ходе настоящего исследования было установлено, что у лиц с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита отмечено снижение доли 1Ь-2К-пре:)ентируюших и увеличение количества апоптотически измененных лимфоцитов на фоне неизменной цитокинпродуцирующей способности (рис. 3). Этот факт, возможно, объясняется недостаточной реактивностью макроорганизма, которая, в свою очередь, обусловливает неэффективность иммунной защиты в ответ на действие

200 150

100 50

инфекта [Хаитов P.M., 2001], становясь одним из механизмов, ведущих к хро- ! низании инфекционного процесса [Рязанцева Н.В. и соавт., 2006]. |

Таким образом, результаты настоящей работы позволили выявить факт | модификации программированной гибели лимфоцитов в условиях экспериментальной модели интерлейкин-2-зависимого апоптоза и у пациентов с клещевой j нейроинфекцией, сопровождающейся изменением состояния системы интер-лейкина-2 и его рецептора. Это явилось основанием для проведения этапа ис- j следования, направленного на выявление молекулярных мишеней апоптотиче-ского каскада, запускаемого при участии IL-2.

Известно, что функциональное состояние клетки зависит от уровня содержания в ней активных форм кислорода (АФК) [Buzek J. et al., 2002; Pastori G.M. et al., 2002], которые используются как посредники при передаче сигнала , от мембранных рецепторов на внутриклеточные системы протеинкиназ [Pastori G.M. et al., 2002]. Эксперимент, проведенный с рекомбинантным IL-2 в условиях in vitro, продемонстрировал повышение уровня АФК в клетке и их участие в | реализации проапоптотического эффекта цитокина (рис. 4а).

усл.ед. %

т

о

4

1 - интактные лимфоциты здоровых доноров, 2 - лимфоциты здоровых доноров, инкубированные с 0,100 нг/мл г!Ь-2; 3 - лимфоциты, полученные у больных острым клещевым энцефалитом; 4 - лимфоциты, полученные у пациентов с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита; АЧ' - трансмембранный потенциал митохондрий

Рисунок 4 - Содержание активных форм кислорода в лимфоцитах крови (а), численность лимфоцитов со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий (б)

14

□

12

10 8

Медиана 6

25%-75% 4

Min-Max 2

0

При оценке внутриклеточной продукции АФК лимфоцитами крови у пациентов с клещевой нейроинфекцией выявлено, что величина данного парамет-

pa возрастает, при этом более выраженные изменения исследуемого показателя отмечаются у пациентов с острым клещевым энцефалитом (рис. 4а).

Рассматривая механизмы АФК-опосредованного апоптоза клетки, особое внимание следует уделить митохондриям, которые, образуя сложную систему взаимовлияний, являются как мишенями, так и продуцентами кислородных радикалов [Зенков Н.К. и соавт., 2001; Бра М., 2005; Черняк Б.В., 2005; Меньшикова Б.Б. и соавт., 2006]. В проведенном нами исследовании было зафиксировано повышение количества лимфоцитов со сниженным значением AVP в лимфо-цитарных клетках, полученных у здоровых доноров и подвергнутых воздействию rIL-2 в концентрации 0,1 нг/мл, и у пациентов с клещевой нейроинфекцией (рис. 46), что дало возможность предположить заинтересованность митохонд-риального пути апоптоза в реализации проапоптотического действия IL-2.

Контроль над выходом из межмембранного пространства митохондрий в цитозоль регуляторов апоптоза обеспечивают белки семейства Вс1-2, динамическое равновесие которых определяет выбор клетки между жизнью и смертью [Fridman J.S., Lowe S.W.,2003]. Исследование, выполненное методом иммуноб-лоттинга, показало, что при действии 0,1 нг/мл rIL-2 происходило значительное снижение внутрилимфоцитарного содержания белков Bcl-2'и Bcl-Xi.no сравнению с величиной данных показателей в интактных клетках. Аналогичные изменения были зарегистрированы у пациентов с клещевой нейроинфекцие (рис. 5а, б).

Анализ содержания белка Вах в лимфоцитах, культивированных с rlL-2 в дозе 0,1 нг/мл, показал, что уровень данного проапоптотического белка был вдвое ниже величины аналогичного показателя в интактных клетках. Можно заметить, что у больных острым клещевым энцефалитом и у антигеноносителей данного возбудителя уровень Вах в лимфоцитах практически не изменялся (рис. 5в).

Точный механизм, благодаря которому данные белки регулируют проницаемость мембраны митохондрий, до сих пор неясен. Имеются литературные данные о том, что Bcl-XL способен связываться с уже вышедшим цитохромом с, предотвращая дальнейшую активацию каспаз [Cheng E.H. et al., 2001]. Помимо этого установлено, что Вс1-2 и Bcl-XL могут гетеродимеризоваться с проапоп-тотическим протеином Вах, тем самым ингибируя его каналформирующую способность [Brenner С. et а]., 2000]. В то же время Вах в ответ на смертельный сигнал изменяет свою конформацию и встраивается в мембрану митохондрии с образованием пор.

усл.ед.

усл.ед.

усл.ед.

2 3 4

о Медиана □ 25%-75% I Min-Max

°_ Медиана

I I 25%-75% I Min-Max

усл.ед.

Рисунок 5 - Уровень белков Bcl-2 (a), Bcl-XL (б), Вах (в), Bad (г) в лимфоцитах, полученных у здоровых доноров (1 - интактная культура клеток, 2 ■ - клетки после воздействия 0,1 нг/мл rIL-2) и у пациентов с клещевым энцефалитом (3 - больные острым клещевым энцефалитом, 4 — лица с хронической ан-тигенемией вируса клещевого энцефалита)

Важно подчеркнуть, что в присутствии rIL-2 было зарегистрировано двукратное увеличение количества другого апоптотического индуктора - Bad, в то время как значения данного показателя у пациентов с клещевым энцефалитом сохранялись на неизменном уровне (рис. 5г).

Таким образом, результаты настоящего исследования позволяют заключить, что сдвиг равновесия между содержанием про- и антиапоптотических Bcl-2-белков в сторону проапоптотических лежит в основе апоптозиндуцирующего действия rIL-2.

Регуляция активности белков семейства Вс1-2 осуществляется транскрипционными факторами NFkB и Р53, которые управляют экспрессией генов этих белков [Fridman J.S., Lowe S.W., 2003]. В проведенном нами исследовании было установлено, что культивирование интактных лимфоцитарных клеток здоровых лиц с rIL-2 в проапоптотической дозе, равной 0,1 нг/мл, а также лимфоцитов пациентов с клещевым энцефалитом в безцитокиновой питательной среде сопровождается статистически значимым повышением содержания свободной субъединицы RelA NFkB (рис. 6).

усл.ед.

NFkB (Мг=65 kDa)

GAFDG

1 2 3

=_ Медиана

I i 25%-75% I Min-Max

Рисунок 6 - Уровень NFkB в лимфоцитах, полученных у здоровых доноров (1 - интактная культура клеток, 2 - клетки после воздействия 0,1 нг/мл rIL-2) и у пациентов с клещевым энцефалитом (3 - больные острым клещевым энцефалитом, 4 - лица с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита)

Большинство авторов рассматривает данный транскрипционный фактор в качестве внутриклеточного вторичного мессенджера, опосредующего передачу пролиферативного сигнала от IL-2 с плазматической мембраны к ядру клетки [Yamamoto Y., Gaynor R.B., 2001; Beyaert R., 2004; Gilmore T.D., 2006; Perkins N.D., 2007]. Однако в ряде экспериментальных работ была показана возможность NFkB-опосредованной активации Р53, ведущей к транскрипции генов проапоптотических белков [Kucharczak J. et al., 2003; Prasad T.S. et al., 2009].

В ходе проведенного исследования установлено снижение содержания нефосфорилированной формы белка Р53 в лимфоцитарных клетках здоровых лиц, инкубированных с проапоптотической дозой цитокина, а также в лимфоцитах крови, полученных у пациентов с клещевой нейроинфекцией (рис. 7). Это можно объяснить, по-видимому, переходом данного белка в активное, а именно

усл.ед.

Р53 (Mr-5.1kDa)

=_ Медиана

□ 25%-75% I Min-Max

Рисунок 7 - Уровень Р53 в лимфоцитах, полученных у здоровых доноров (I - интактная культура клеток, 2 - клетки после воздействия 0J нг/мл rlL-2) и у больных острым клещевым энцефалитом (3)

фосфорилированное состояние, поскольку транскрипционный фактор Р53 функционирует только в такой модификации [Burlacu А., 2006]. В качестве одного из возможных механизмов этого процесса можно рассматривать способность 1L-2 активировать МАР-киназу JNK. и белок NFkB, задействованные в фосфорилировании N-терминального домена Р53 [Kucharczak J. et ai., 2003].

Одной из молекулярных мишеней белка Р53 выступает универсальный ингибитор циклинзависимых киназ P2l (Wafl, Cipl, Sdil), способный приводить к остановке клеточного цикла и запуску программы апоптоза в ответ на различные стрессовые стимулы [Rodriguez R., Meuth М, 2006].

С использованием метода иммуноблотгинга было показано, что культивирование лимфоцитов крови, полученных у здоровых доноров, с рекомби-нантным IL-2 приводит к увеличению внутриклеточного содержания Р21 [0,48(0,48-0,72) усл.ед., р=0,032] по сравнению с соответствующим параметром в интактных клетках [0,35(0,35-0,40) усл.ед.]. Повышение уровня Р21 наряду с Р53, вероятно, свидетельствует о блоке клеточного цикла в поздней Gr и S-фазе, что увеличивает чувствительность лимфоцитарных клеток к индукции апоптоза [Cartel A.L., Radhakrishnan S.K., 2005].

Таким образом, оценка молекулярных механизмов IL-2-опосредованного апоптоза показала наличие сложной многокомпонентной реакции клетки в ответ на изменение условий ее жизнедеятельности (рис.8). Было выявлено, что индуцированное данным цитокином усиление наработки активных форм кисло-

f ~ повышение, I - снижение, —| - ингибирование, —» усиление

Рисунок 8 - Молекулярные механизмы про- и антиапоптотического эффекта интерлейкина-2 [по данным J. Kucharczak et al., 2003; A. Matsuzawa et al., 2005; R. Rodriguez, M. Meuth, 2006 и результатам собственных исследований (выделено цветом)]

рода сопровождается активацией транскрипционных факторов, приводящей к изменению профиля экспрессии соответствующих генов. При этом, как показали полученные данные, судьба клетки решается на уровне белков семейства Вс1-2. Последние могут изменять свою активность в результате взаимодействия друг с другом, вышестоящими компонентами сигнальных систем, а также окислительной модификации. Важно подчеркнуть, что молекулярные механизмы реализации апоптотической программы лимфоцитов крови в использованной нами модели in vitro во многом схожи с таковыми при клещевой нейроин-фекции. При этом АФК, вероятно, принадлежит роль вторичных мессенджеров, опосредующих активацию факторов транскрипции. Под действием последних происходит индукция синтеза белков, участвующих, в частности, в усилении митохондриальной проницаемости.

Следует заметить, что устранение апоптозиндуцирующего действия IL-2, наблюдаемое при культивировании лимфоцитов в цитокинсодержащей среде в присутствии индуктора клеточной гибели дексаметазона, подтверждает гипотезу о том, что эффект данного медиатора определяется физиологическим состоянием клеток. Известно, что в организме на лимфоциты, помимо 1L-2, действует множество различных сигнальных молекул, состав которых и интенсивность действия зависит от степени зрелости клеток, их фенотипа и стадии иммунного ответа. При разных физиологических и патологических процессах и состояниях в клетке активируются различные сигнальные пути, и меняется состав белков-регуляторов, благодаря чему 1L-2 способен оказывать противоположные эффекты на апоптоз лимфоцитов (рис. 8). Точные внутриклеточные механизмы двойственности эффектов 1L-2 требуют дальнейшего изучения. Это, в свою очередь, позволит понять процессы, лежащие в основе гомеостаза иммунной системы, что даст возможность для разработки новых методов лечения и диагностики заболеваний, связанных с дизрегуляцией апоптоза иммукомпе-тентных клеток.

ВЫВОДЫ

1. При культивировании лимфоцитов, полученных у здоровых доноров, с рекомбинантным интерлейкином-2 в дозах 0,1-1,0 нг/мл увеличивается содержание апоптотически измененных клеток пропорционально концентрации цитокина. На фоне глюкокортикоидиндуцированного апоптоза (дексаметазон в дозе 10"4 М) рекомбинантный интерлейкин-2 оказывает антиапоптотический эффект на лимфоциты крови, который также носит дозозависимый характер.

2. Механизмы проапоптотического действия на лимфоциты рекомби-нантного интерлейкина-2 в дозе 0,1 нг/мл обусловлены снижением трансмем-

бранного потенциала митохондрий на фоне внутриклеточного накопления активных форм кислорода, дисбалансом белков семейства Вс1-2 с про- и анти-апоптотической функцией (уменьшение уровня Bcl-2, Bcl-XL и Вах, повышение - Bad) н увеличением содержания ингибитора циклинзависимых киназ Р21.

3. Дисбаланс системы интерлейкина-2 при клещевом энцефалите (снижение числа лимфоцитов, презентирующих рецепторы к интерлейкину-2 на фоне повышенной или нормальной продукции цитокина у больных острым клещевым энцефалитом и у пациентов с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита, соответственно) сопровождается индукцией апоптоти-ческой гибели лимфоцитов, повышением количества клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий и высоким внутриклеточным уровнем активных форм кислорода.

4. У пациентов с клещевым энцефалитом апоптоз лимфоцитарных клеток крови опосредован смещением баланса белков семейства Bcl-2 в сторону проапоптотических: снижение содержания Bcl-2 и Bcl-XL на фоне отсутствия изменений уровня Вах и Bad.

5. При нарушении в системе интерлейкина-2 и его рецептора как в условиях in vitro, так и инфекционного процесса (клещевой энцефалит) молекулярные механизмы модуляции апоптотической гибели лимфоцитов являются однотипными и связаны с активацией митохондриалыюго пути апоптоза, а также транскрипционных факторов NFkB и Р53.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Роль р53 и NFkB в реализации IL-2-опосредованного апоптоза лимфоцитов / Е.В. Сазонова, O.E. Чечина, А.К. Биктасова и др. // Медицинская иммунология. -2009.-№4-5.-С. 380.

2. Система TNFa-TNF-Rl и апоптоз лимфоцитов крови при хронической анти-генемии вируса клещевого энцефалита / А.К. Биктасова, О.Б. Жукова, O.E. Чечина, Е.В. Сазонова и др. // Медицинская иммунология. - 2009. - № 4-5. - С. 334.

3. Молекулярные механизмы дизрегуляции апоптоза лимфоцитов при дисбалансе Thl- и ТЬ2-цитокинов / Н.В. Рязанцева, O.E. Чечина, В.В. Новицкий, Е.В. Сазонова и др. // Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2(11), № 2-3.-С. 259.

4. Молекулярные механизмы цитокиновой регуляции апоптоза лимфоцитов / O.E. Чечина, А.К. Биктасова, Е.В. Сазонова и др. // Аллергология и иммунология. - 2009 - Т.10, № 2. - С. 176.

5. Роль цитокинов в редоксзависимой регуляции апоптоза / O.E. Чечина, А.К. Биктасова., Е.В. Сазонова и др. // Бюллетень сибирской медицины. - 2009. -№2.-С. 67-71.

6. Роль NFkB, р53 и р21 в регуляции ФНО-а-опосредованного апоптоза лимфоцитов / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, О.Б. Жукова, А.К. Биктасова, O.E. Чечина, Е.В. Сазонова// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины -2010. -№1.- С. 56-59.

7. Состояние TNFa-опосредованного пути регуляции апоптоза лимфоцитов периферической крови при длительной антигенемии вируса клещевого энцефалита / А.К. Биктасова, О.Б, Жукова, О.Е.Чечина, Е.В. Сазонова // Материалы VII Конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». — Томск, 2007.-С. 168.

8. TNF-опосредованная регуляция программированной гибели лимфоцитов при антигенемии вируса клещевого энцефалита / А.К. Биктасова, О.Б. Жукова, O.E. Чечина, Е.В. Сазонова и др. // Материалы Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии». - СПб, 2007. -С. 13-14.

9. Клинико-иммунологическая характеристика клещевого энцефалита / И.Н. Удинцева, O.E. Чечина, Н.Г. Жукова, Л.В. Лукашова, Н.В. Рязанцева, A.M. По-понина, Л.А. Малышева, H.H. Бартфельт, З.С. Кемерова, А.К. Биктасова, Е.В. Сазонова // Межрегиональная научно-практическая конференция с международным участием «Актуальные проблемы клещевых нейроинфекций». - Медицина в Кузбассе.-2008,- №5.-С. 152-156.

10.Р53 и NFkB - сигнальные трансдукторы IL-2-опосредованного апоптоза лимфоцитов / Е.В. Сазонова, O.E. Чечина, А.К. Биктасова, О.Б. Жукова // Материалы X Конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». -Томск, 2009.-С. 101-102.

11.Дисбаланс белков семейства Вс1-2 в модуляции апоптоза лимфоцитов / А.Н. Марошкина, O.E. Чечина, О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева, Т.С. Прохоренко, А.К. Биктасова, М.В. Белкина, Е.В. Сазонова и др. // Материалы Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация»: сб. статей молодых ученых. - Пущино, 2009. - С. 457-461.

12.Дозозависимые эффекты IL-2 на программированную гибель лимфоцитар-ных клеток / Е.В. Сазонова, O.E. Чечина, А.К. Биктасова, О.Б. Жукова II Материалы Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии». - СПб, 2009. - С. 96-97.

13.Нарушение TNFa-опосредованного апоптоза лимфоцитов как механизм формирования хронической персистенции вируса клещевого энцефалита / А.К.

Биктасова, O.E. Чечина, E.B. Сазонова, О.Б. Жукова // Материалы Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии». -СПб, 2009.-С. 18-19.

14.Изменение содержания транскрипционных факторов при TNFa-опосредованном апоптозе лимфоцитов крови / А.К. Биктасова, О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, O.E. Чечина, Е.В. Сазонова // Материалы X Международного конгресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». - Казань, 2009.- С. 278.

15.Роль белков семейства Вс1-2 в регуляции IL-2-опосредованного апоптоза лимфоцитов крови / Е.В. Сазонова, А.К. Биктасова, О.Б. Жукова и др. И Материалы X Международного конгресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». - Казань, 2009. - С. 308.

16.У частое транскрипционных факторов и белков семейства Вс1-2 в TNFa-опосредованном апоптозе лимфоцитов / А.К. Биктасова, О.Б. Жукова, O.E. Чечина, Е.В. Сазонова // Материалы X Конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». - Томск, 2009. -С. 71-72.

17.Молекулярные мишени проапоптотического действия ИЛ-2, ИЛ-4 и ФНОа при поляризации иммунного ответа по Thl- и Th-2-пути / Н.В. Рязанцева, O.E. Чечина, В.В. Новицкий, Е.В. Сазонова и др. // Материалы Четвертой Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» - Новосибирск, 2009. - С. 225-226.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода

FITC - флгооресцеинизотиоцианат

Th - Т-хелпер-лимфоцит

Ду -митохондриальныйтрансмембранмый потенциал

NFkB - nuclear factor kB, ядерный фактор kB

Bad - Bcl-2 agonist of cell death, Вс1-2-агонист клеточной смерти

Bax - Bcl-2-associated X protein, Вс1-2-ассоциированный белок X

Bcl-2 - B-cell lymphoma/leukcmia protein 2, белок 2 B-клеточной лимфомы/лейкемии

Bc1-Xl - Bcl-2 related protein, long isoform, Вс1-2-связашый белок, длинная изоформа

GAFDG - глицеральдегидфосфатдегидрогеназа

IL - interleukin, интерлейкин

IL-2R - interleukin-2 receptor, рецептор к интерлейкину-2

MnSOD - магниевая супероксиддисмутаза

rIL-2 - recombinant interleukin-2, рекомбинантный интерлейкин-2

Автор выражает благодарность заведующей лабораторией клинической иммунологии ФГУЗ Клиническая больница № 81 ФМБА России канд. мед. наук Т.Т. Радзивил, зав. кафедрой инфекционных болезней и эпидемиологии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава профессору, д-ру мед. наук A.B. Лепехину, профессору кафедры неврологии и нейрохирургии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава д-ру мед. наук Н.Г. Жуковой за ценные теоретические и методические советы.

Подписано в печать2Л. ¡2. 2003 г. Усл.печ.листов Печать на ризографе. О тпечатано в лаборатории оперативной полиграфии СибГМУ 634050, г. Томск, Московский тракт, 2, тел. 53-04-08 Заказ № >?<?6'__Тираж (00 экземпляров