Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Механизмы повреждений плазматических мембран лимфоцитов крови у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома

На правах рукописи

Шарыпова Наталья Гаврииловна

Механизмы повреждений плазматических мембран лимфоцитов крови у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома

14.00.16 - патологическая физиология 14.00.45 - наркология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск 2004

Работа выполнена в ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздрава России

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Серебров Владимир Юрьевич

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Балашов Петр Прокопьевич

Официальные оппоненты:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Дыгай Александр Михайлович

кандидат медицинских наук Аболонин Алексей Федорович

Ведущая организация: ГУ НИИ общей патологии и патологической физиологии РАМН (г. Москва)

Защита состоится « 2004 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 208.096.01 при Сибирском государственном медицинском университете по адресу: 634050, г. Томск, Московский тракт 2

С диссертацией можно ознакомиться в научно - медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета (634050, г. Томск, прЛенина, 107)

Автореферат разослан 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета:

Суханова Г.А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Распространенность заболевания наркоманией в нашей стране не имеет тенденции к снижению. Показатель заболеваемости наркоманией уже приближается к показателю заболеваемости сердечнососудистыми заболеваниями [Мандель Л. И. и соавт.,1997]. В настоящее время употребление "чистых" наркотиков встречается чрезвычайно редко. Чаще всего, применяемые наркотические вещества представляют собой кустарно приготовленную смесь из наркотических, балластных, психотропных и часто просто токсических веществ. В процессе приготовления наркотика дополнительно привносятся вещества (органические растворители, ангидриды, окислители), обладающие собственным токсическим действием. Использование такой смеси ведет к общему отравлению. Стало очевидным, что употребление психоактивных веществ ведет не только к развитию личностных и психических аномалий, но и является причиной широкого круга соматических заболеваний [Аболонин А. Ф.,2001].

Опийная наркомания в клиническом отношении, прежде всего, проявляется абстинентным синдромом (состояние отмены), развитие которого связано с целым рядом вегетативных, физиологических и биохимических изменений в организме [Шабанов П. Д., Штакельберг О. Ю., 2000]. По-видимому, в основе развития патологического процесса при абстинентном синдроме лежит дисбаланс клеточного гомеостаза и, как следствие, повреждение и гибель клетки.

В патогенезе опийной наркомании большое значение имеют изменения иммунологического гомеостаза, выражающиеся в большинстве случаев в нарушении клеточного звена иммунитета. Последнее проявляется как угнетением Т-клеточного звена иммунитета, так и повышением уровня циркулирующих иммунных комплексов [Иванец II. Н. и соавт.,1997]. Не вызывает сомнения наличия у больных наркоманиями, прежде всего опийной группы, признаков вторичного иммунодефицита, повышающего риск возникновения у них инфекционных заболеваний и новообразований [Гамалея Н. Б., 1990]. Уровень дискоординации иммунологических процессов отражает тяжесть течения заболевания, позволяя дать прогноз в отношении осложнений и отдаленных последствий [Ледванова Т. Ю и соавт., 1998]. Изучение молекулярных механизмов повреждения клеток, в частности иммунокомпетентных, лежащих в основе развития осложнений опийной наркомании представляет значительный научный и практический интерес.

Сегодня большинство заболеваний рассматривают как состояния, сопряженные с поражением, прежде всего, клеточных мембран, поскольку дестабилизация молекулярной ультраструктуры мембран при патологических процессах приводит к потере их функциональной компетентности, изменению жизнедеятельности клеток в целом и, в конечном счете, к их гибели [Нагорнев В.А.,1996]. Хорошо известно, что липиды клеточных мембран являются не только формой депонирования метаболического топлива и основной структурной компонентой клеточных мембран, но и системой биологических эффекторов, регуляторов и медиаторов, участвующих практически во всех физиологических процессах клетки [Финдлей Дж., Эванс С., 1991]. Особый интерес при этом представляет изучение обмена сфинголипидов. Это связано с тем, что сфингомиелин и продукты его ферментативного гидролиза играют определяющую роль в сигнальной транедукции, регулирующей ведущие клеточные процессы -иммунный ответ, пролиферацию, рост, дифференцировку и апоптоз клеток [Алесенко А. В.,1998].

Многообразие функций сфингомиелина и его производных, прямо или косвенно связанных с важнейшими клеточными событиями в норме и при

патологии, определяет необходимость изучения обмена сфинголипидов в плазматических мембранах лимфоцитов больных опийной наркоманией.

В регуляции состояния мембран клеток принимают участие процессы перекисного окисления липидов, фосфолипазы, ферменты протеолитической системы. Изучение их активности может быть важным диагностическим критерием общего состояния организма, характеристикой адаптивных процессов при неблагоприятных воздействиях, компенсаторных возможностей организма [Владимиров ЮА, 1989; Локшина Л. А., 1994].

Течение и выраженность абстинентного синдрома при наркомании в значительной степени определяет характер лечения и прогноз заболевания. Существует несколько подходов к лечению абстинентного синдрома [Мандель Л. И, Бохан Н. А., 1999]. Но анализ литературных данных позволяет сделать вывод о минимальной эффективности лечебных программ, используемых для терапии наркоманий. Такое положение во многом обусловлено недостаточной разработкой проблемы патогенеза наркотической зависимости, и абстинентного синдрома. Необходимость активного поиска новых подходов к лечению больных наркоманиями представляется в этой ситуации чрезвычайно актуальной задачей. Известно, что опийная абстиненция протекает на фоне адренергического возбуждения [Иванец II. Н. и соавт.,1997]. Избыток катехоламинов в крови может приводить к активации перекисного окисления липидов, активации фосфолипаз, лабилизации мембран лизосом и освобождению из них протеолитических ферментов с последующим повреждением клетки. Блокада адренорецепторов, через которые реализуется эффект катехоламинов, может ограничить повреждение клеток вызванное избытком катехоламинов [Меерсон Ф. 3., 1984]. Соответственно средствами патогенетической терапии могут являться препараты с & адреноблокирующим действием. Исследование влияния ¡3 - адреноблокаторов на липидный спектр плазматических мембран лимфоцитов и механизмы, принимающие участие в его регуляции (перекисное окисление липидов, активность фосфолипаз и активность протеолитических ферментов), безусловно, будут способствовать пониманию патогенеза опийной наркомании, возможности прогнозирования исходов и определения тактики лечения данной патологии. Цель работы:

Изучить механизмы структурных и функциональных нарушений плазматических мембран лимфоцитов крови у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома при использовании стандартной и комплексной схем лечения абстинентного синдрома. Задачи исследования:

1. Установить особенности содержания липидов: фосфолипидов, нейтральных липидов в плазматических мембранах лимфоцитов крови у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома до начала специфической терапии и на фоне стандартной и комплексной схем лечения (в комплексе с р-адреноблокатором).

2. Установить особенности обмена сфинголипидов: активность сфингомиелиназы, содержание сфингомиелина, церамидов в плазматических мембранах лимфоцитов крови у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома до начала специфической терапии и на фоне стандартной и комплексной схем лечения (в комплексе с /5- адреноблокатором).

3. Изучить состояние системы протеолиза в сыворотке и плазме крови (активность протеолитических ферментов и их ингибиторов) у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома до начала специфической терапии и на фоне стандартной и комплексной схем лечения (в комплексе с /3- адреноблокатором).

4. Исследовать активность фосфолипаз, процессы перекисного окисления липидов в плазматических мембранах лимфоцитов и сыворотке крови у больных опийной наркоманией в состоянии, абстинентного синдрома до начала специфической

терапии, на фоне стандартной и комплексной схем лечения (в комплексе с ¡3-адреноблокатором), а также установить их роль в механизмах нарушения липидного спектра плазматических мембранах лимфоцитов. Научная новизна:

Впервые у больных опийной наркоманией, находившихся в состоянии абстиненции и получавших традиционное лечение, изучен липидный спектр и обмен сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов и их взаимоотношение с основными механизмами повреждения липидов клетки. В результате выполненного исследования были получены новые данные фундаментального характера о структурных нарушениях в плазматических мембранах лимфоцитов, вызванных употреблением опия-сырца, обработанного уксусным ангидридом. Выявленные изменения характеризуются увеличением содержания холестерина, лизофосфолипидов, фосфатидилхолина и фосфатидилсерина и уменьшением содержания фосфатидилэтаноламина, нарушением трансмембранной асимметрии распределения фосфатидилэтаноламина и отношения холестерина к фосфолипидам, увеличением активности сфингомиелиназы, содержания сфингомиелина и снижением количества церамидов. Показало, что у больных опийной наркоманией, находившихся в состоянии абстиненции, происходит выраженная активация фосфолипазного и перекисного механизмов повреждения липидов. Впервые у больных опийной наркоманией проведено изучение состояния протеиназно-ингибиторной системы крови. Выявленные изменения, характеризуются увеличением активности

протеолитических ферментов и снижением активности их ингибиторов.

В работе впервые изучена возможность коррекции нарушений липидного спектра и обмена сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов с помощью Р - адреноблокагора обзидапа. Был выявлен положительный эффект включения в стандартную терапию обзидана на липидный спектр и соотношение компонентов обмена сфинголипидов в плазматических мембранах лимфоцитов, а также механизмы, участвующие в их регуляции. Практическая значимость работы:

Полученные новые знания фундаментального характера, касающиеся изменений липидного состава, обмена сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов и механизмов, участвующих в регуляции состояния мембран у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома раскрывают новые аспекты патогенеза опийной наркомании. Результаты исследования могут служить основой для разработки новых способов коррекции метаболических нарушений, возникающих при употреблении наркотических препаратов опийной группы.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Развитие абстинентного синдрома у больных опийной наркоманией сопровождается нарушением в липидном спектре и обмене сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов, в механизме нарушений которых особую роль играют увеличение активности фосфолипаз, процессов перекисного окисления липидов и активизация протеолитических процессов крови.

2. Липидный спектр и обмен сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов у больных опийной наркоманией нормализуется при использовании комплексной схемы лечения абстинентного синдрома путем снижения активности фосфолипаз, угнетения процессов перекисного окисления липидов и восстановления баланса протеиназно-ингибиторной системы.

3. Положительных изменений со стороны липидного спектра, обмена сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов, и механизмов принимающих участие в их нарушении не было выявлено у больных опийной наркоманией при использовании стандартной схемы лечения абстинентного синдрома.

Апробация работы: Основные положения работы были представлены на заседании Томского Областного общества лаборантов (Томск, 2004), на научном семинаре кафедры биохимии и молекулярной биологии, на кафедре психиатрии, наркологии, психотерапии Сибирского государственного медицинского университета, на четвертом и пятом конгрессах молодых ученых и специалистов (Томск 2003,2004)

Публикации: По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 3 статьи в центральной печати.

Объем и структура диссертации: Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 178 страницах, иллюстрирована 22 таблицами и 15 рисунками. Библиография включает 251 литературных источника, из которых 212 отечественных и 39 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу работы положены результаты обследования 100 человек, которые были разделены по четырем группам. Первую группу составили 75 больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома (шифр по МКБ - 10 F 11.30). В первой группе взятие крови осуществляли в первые сутки после поступления в стационар до начала лечения (Группа 1). Вторую группу составили 41 больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома на фоне стандартной схемы лечения (Группа 2), в третью группу были включены 34 больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома на фоне комплексной терапии (стандартная схема лечения в комплексе с применением препарата группы /3-адреноблокаторов (обзидан) в дозе 20 мг/сутки) (Группа 3). Во второй и третьей группе взятие крови осуществляли на 4-5 сутки от последней инъекции наркотика Четвертую группу составили 25 практически здоровых доноров (Группа контроля). Взятие крови осуществляли утром натощак из локтевой вены. Ни у одного из пациентов не был выставлен диагноз ВИЧ. Также в исследование не включались пациенты, инфицированные вирусом гепатита.

Пациенты поступили в стационар областного наркологического диспансера в связи с выраженными проявлениями синдрома отмены, которые развились в результате систематического внутривенного введения опия-сырца, обработанного уксусным ангидридом. Длительность потребления наркотиков составляла от 3 до 7 лет с суточной дозой от 2 до 4 граммов. Пациенты за пределами клинических проявлений синдрома отмены исключались из исследования. Также не включались в исследование пациенты, которые употребляли наркотические препараты эпизодически. Скрининг пациентов проходил с февраля 2002 по июль 2003года. Исследовали лимфоциты, сыворотку и плазму.

Во всех случаях опийной абстиненции отмечалась выраженная клиническая картина, сопровождавшаяся целым рядом биохимических расстройств. По данным историй болезни при поступлении нарушения биохимических и клинических показателей характеризовались: гипербилирубинемией, снижением уровня гемоглобина, лейкоцитозом, протеинурией. С клинической точки зрения при поступлении в стационар у обследованных больных выявлялся болевой синдром, а также анорексия, рвота, диарея, обильная потливость, повышение артериальпого давления, повышение температуры тела, неврологические симптомы в виде расстройств периферической нервной деятельности, вегетативная дисфункция (тремор). Стандартная медикаментозная терапия опийной абстиненции проводилась в соответствии со стандартами лечения наркоманий и включала в себя использование клофелина, нейролептиков, седативных средств.

Метод выделения лимфоцитов периферической крови и получения плазматических мембран Лимфоциты получали по методу [Натвина Д. и соавт.,1980]. Принцип метода основан на разделении клеток крови по плотности в градиенте "HISTOPAQUE" - 1077 (производства "SIGMA DIAGNOSTICS"). Плазматические мембраны лимфоцитов получали по методу [Финдлей Дж.,1991].

Метод разделения липидов плазматических мембран лимфоцитов Разделение основных классов фосфолипидов (ФЛ) и нейтральных липидов проводили с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) по методу [Жухоровой Л. С, 1984]. Получали следующие фракции ФЛ: лизофосфолипиды (ЛФЛ), сфингомиелин (СФМ), фосфатидилинозитол (ФИ), суммарная фракция фосфатидилхолина и фосфатидилсерина (ФХ+ФС), фосфатидилэтаноламин (ФЭА), церамиды. Церамиды разделяли путем двукратной прогонки в разных системах растворителей. Модификацию мембранных ФЛ проводили по методу [Финдлей Дж.,1991] с помощью тринитробензолсульфоновой кислоты.

При разделении нейтральных липидов получали следующие фракции: фосфолипиды (ФЛ), холестерол (ХС) и эфиры холестерина (ЭХ). Разделение проводили на пластинках для ТСХ "SORBFIL"(Pocсия). Хромотограммы проявляли с помощью фосфорномолибденовой кислоты с последующим элюированием каждой фракции и определением неорганического фосфата по методу Боданского [Колб В. Г., 1982].

Методы определения активности липолитических ферментов Активность сфингомиелиназы, фосфолипазы А2(ФЛ А2), фосфолипазы D (ФЛ D) определяли по методу [Брокерхофа Х.,1978]. Активность сфингомиелиназы определяли по уменьшению концентрации сфингомиелина ("ICN BiomedicaP")-Выделение сфиигомиелина проводили методом ТСХ и концентрацию выражали в мМоль фосфора. Активность ФЛ А2 определяли по увеличению содержания ЛФЛ, выделение и анализ которых проводили методом ТСХ. Активность ФЛ D определяли по количеству фосфатидной кислоты, выделение и анализ которой проводили в двухфазной системе ТСХ.

Методы оценки активности процессов перекисного окисления липялов (ПОЛ)

и активности антиокислительных ферментов Определение содержания ТБК - активных продуктов в лимфоцитах и сыворотке крови осуществляли в реакции с тиобарбитуровой кислотой по методу [Каган В. Е., 1986]. Активность каталазы в лимфоцитах и сыворотке крови определяли по методу [Королюк М. А., 1988]. Определение активности супероксиддисмутазы в лимфоцитах и сыворотки крови проводили по методу [Каган В. Е., 1986].

Методы определение активности протеолитических процессов Определение активности трипсина в сыворотке крови проводили по методу [Пасхина Т. С, 1988] с использованием синтетического субстрата БАПНА (N-бензоил^-аргинина-п-нитроанилид) Активность трипсина выражали в МЕ/мл. Определение содержания плазминогена в плазме крови проводили по методу [Баркаган 3. С, 1999]. Содержание растворимых фибринмономерных комплексов (РФМК) в плазме крови определяли по методу [Момот А. П., 1996]. Активность öi -протсиназного ингибитора (СК| - ПИ)и «г - макроглобулина (02 - МГ) в плазме крови определяли унифицированным спектрофотометрическим методом по торможению гидролиза N-бензоил- L-аргинин-этилового эфира (БАЭЭ) и выражали в условных ингибиторных единицах (ИЕ/мл). Активность антитромбина - III (AT - III) в плазме крови определяли по методу [Баркаган 3. С, 1999]. Активность фактора Виллебранда (ФВ) в плазме крови определяли по методу [Баркаган 3. С, 1999] на агрегометре Биола (модель LA 230).

Статистическую обработку результатов исследования проводили на персональном компьютере с использованием пакета прикладных программ

STATGRAPHICS 5.0. Для проверки на нормальность использовался критерий Колмогорова-Смирнова. Поскольку изучаемые выборки не подчинялись нормальному закону распределения и были независимыми, для определения достоверности различий между группами использовался непараметрический двусторонний критерий Манна-Уитни. Для каждого анализируемого показателя вычисляли среднее (X), ошибку среднего среднеквадратичное отклонение. Статистически значимыми считались различия при р<0,05. Корреляционный анализ проводили с помощью вычисления коэффициента ранговой корреляции Спирмена [Лакин Г.Ф., 1980].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение липидного состава плазматических мембранах лимфоцитов больных опийной наркоманией в состоянии абстиненции до проведения лечения, находившихся на стандартном лечении и лечении в комплексе с адреноблокатором

Биологическим мембранам принадлежит ключевая роль в обеспечении и регуляции физиологической активности клеток [Геннис Р., 1997]. В настоящее время большинство известных заболеваний рассматривают как состояния, сопряженные с поражением клеточных мембран, поскольку дестабилизация молекулярной ультраструктуры мембран при патологических процессах приводит к потере их функциональной компетентности, изменению жизнедеятельности клеток в целом и даже их гибели [Владимиров ЮА, 1989]. С этих позиций нами было проведено исследование липидного спектра плазматических мембран (ПМ) лимфоцитов, особенности, изменения которых в определенной степени отражают характер структурной перестройки в иных мембранных системах [Черницкий Е.А., Воробей А.В., 1981]. Результаты изучения липидного состава плазматических мембран (ПМ) лимфоцитов больных опийной наркоманией в состоянии абстиненции до проведения лечения, на стандартном лечении и лечении в комплексе с /}-АБ представлены на рисунке 1.

Проведенный анализ показал, что в ПМ лимфоцитов содержание ХС по сравнению с аналогичным показателем группы контроля было достоверно выше в 2,6 раза (р < 0,05) у больных группы 1 (до начала лечения), в 2,2 раза (р < 0,05) у больных группы 2 (на стандартном лечении) и в 1,6 раза (р < 0,05) у больных группы 3 (на комплексном лечении) соответственно. Было выявлено достоверное различие в содержании ХС у больных опийной наркоманией группы 2 и группы 3.

Содержание ЭХ в ПМ лимфоцитов крови у практически здоровых доноров достоверно превышало в 2,2 раз (р < 0,05) аналогичный показатель у больных группы 1, в 1,7 раз (р < 0,05) у больных группы 2 и в 1,2 раза (р < 0,05) у больных группы 3 соответственно. Было выявлено достоверное различие в содержании ЭХ в ПМ лимфоцитов у больных опийной наркоманией группы 2 и группы 3.

Содержание ФЛ в первой, второй и третьей группах больных достоверно не отличалось от содержания ФЛ в группе контроля. В группе больных опийной наркоманией в состоянии абстиненции до лечения содержание ЛФЛ в ПМ лимфоцитов было достоверно повышено в 19 раз (р < 0,05), в группе больных, находившихся на стандартном лечении, содержание ЛФЛ достоверно повышено в 15 раз (р < 0,05), в третьей группе данный показатель достоверно повышен в 7 раз (р < 0,05) по сравнению с аналогичным показателем группы контроля. Было выявлено достоверное различие в содержании ЛФЛ у больных опийной наркоманией группы 2 и группы 3. Содержание СФМ в ПМ лимфоцитов было достоверно выше у больных группы 1 и группы 2 в 1,2 раза (р < 0,05) по сравнению с аналогичным показателем контрольной группы. В группе 3 содержание СФМ достоверно не отличалось от аналогичного показателя в группе здоровых лиц. Было выявлено достоверное различие в содержании СФМ у больных опийной наркоманией группы 2 и группы 3. Уровень ФИ в первой, второй и третьей группе больных в ПМ лимфоцитов достоверно не отличался от аналогичного показателя в

группе контроля. В группе 1 (до начала лечения) содержание суммарной фракции ФХ+ФС в ПМ лимфоцитов достоверно превысил контрольный уровень в 2,0 раза (р < 0,05), и в 1,6 раза (р < 0,05) в группе 2 (на стандартном лечении). В группе 3 (на комплексном лечении) содержание ФХ+ФС достоверно не отличалось от контроля. Было выявлено достоверное различие в содержании ФХ + ФС у больных опийной наркоманией группы 2 и группы 3.

Содержание ФЭА в ПМ лимфоцитов было достоверно снижено в группе 1 в 1,5 раза (р < 0,05), в группе 2 в 13 раза (р < 0,05) соответственно по сравнению с аналогичный показатель группы контроля. В группе 3 содержание ФЭА достоверно не отличалось от контрольного значения. Было выявлено достоверное различие в содержании ФЭА у больных опийной наркоманией группы 2 и группы 3. Уровень церамидов в ПМ лимфоцитов был достоверно ниже в группе 1 в 3,2 раза (р < 0,05), в группе 2 в 2,8 раза (р < 0,05) соответственно по сравнению с аналогичный показатель группы контроля. В группе 3 содержание церамидов достоверно не отличалось от аналогичного показателя в контрольной группе. Было выявлено достоверное различие в содержании церамидов в ПМ лимфоцитов у больных опийной наркоманией группы 2 (на стандартном лечении) и группы 3 (на комплексном лечении).

Результаты изучения отношения ХС/ФЛ в ПМ лимфоцитов представлены на рисунке 2. Отношение ХС/ФЛ в группе здоровых лиц было достоверно ниже аналогичного показателя в группе 1 в 2,8 раза (р < 0,05), в группе 2 в 2,5 раза (р < 0,05). В группе 3 отношение ХС/ФЛ достоверно превышало аналогичный показатель в контрольной группе в 1,7 раза (р < 0,05). Было выявлено достоверное различие показателя ХС/ФЛ в ПМ лимфоцитов у больных опийной наркоманией группы 2 и группы 3.

Результаты изучения показателя трансмембранной асимметрии (отношение мФЭА/оФЭА) ПМ лимфоцитов крови представлены на рисунке 2. У пациентов группы 1 (до лечения) данный показатель был достоверно снижен в 2,3 раза по сравнению с аналогичным показателем группы контроля (р < 0,05), у пациентов группы 2 (на стандартном лечении) данный показатель был достоверно снижен в 1,8 раза по сравнению с группой здоровых доноров (р < 0,05). В группе 3 (на комплексном лечении) отношение мФЭА/оФЭА достоверно не отличалось от аналогичного показателя в контрольной группе. Было выявлено достоверное различие показателя мФЭА/оФЭА в ПМ лимфоцитов у больных опийной наркоманией группы 2 и группы 3.

Накопление ХС чревато увеличением микровязкости бислоя, изменением латеральной диффузии рецепторов, нарушением ионного транспорта, что делает мембрану лимфоцитов менее приспособленной к выполнению своих функций [Каплан О.В., 1995]. Выявленное обогащение мембран лимфоцитов ХС может явиться следствием активации перекисного окисления липидов, поскольку свободный. ХС, выступая в роли антиоксиданта, способен ингибировать пероксидацию структурированных липидов [Зуева О.М. и соавт., 1989]. Повышение отношения ХС/ФЛ в лимфоцитах крови больных опийной наркоманией в состоянии абстиненции связано с накоплением ХС в мембранах клеток и указывает на ограничение подвижности лимфоцитов крови.

Являясь важным структурным компонентом плазматических мембран, ФЛ регулируют активный и пассивный трансмембранный транспорт веществ, определяют чувствительность клеток к действию лигандов, детерминируют активность мембраносвязанных ферментных систем, участвуют в процессах свертывания крови [Агеева Т.С., 1994]. В связи с этим, поддержание соотношения между фракциями фосфолипидов на физиологическом уровне является непременным условием нормального функционирования клеток.

Проведенный нами анализ фосфолипидного спектра плазматических мембран лимфоцитов у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного

синдрома до лечения и на стандартном лечении, показал отчетливое снижение уровня легкоокисляемой фракции ФЭА, что может привести к нарушению внутриклеточного ионного гомеостаза. Кроме того, закономерным результатом уменьшения уровня ФЭА, богатого полиненасыщенными жирными кислотами, является снижение антиокислительной активности липидов мембран лимфоцитов, что приводит к нарушению стационарного уровня перекисного окисления липидов. Повышенное содержание ФХ увеличивает поступление Са2+ в клетки, что приводит к активации ФЛ А2 и освобождению арахидоновой кислоты из ФХ.

Рис. 1. Отдельные фракции липидов в плазматических мембранах лимфоцитов больных опийной наркоманией в состояния абстиненции до лечения (группа I), на стандартном лечении (группа 2) и лечении в комплексе с обзиданом (группа 3) (в % к контролю)

- 279%250%170% ---

100%

ХС/ФЛ

мФЭАЛзФЭА

□ Группа контроля Ш Группа 1 □ Группа 2 □ Группа з]

Рис.2. Отношение холестерина к фосфолинидам (ХС/ФЛ) и показатель трансмембранной асимметрии (мФЭА/оФЭА) в плазматических мембранах лимфоцитов больных опийной наркоманией в состоянии абстиненции до лечения (группа 1), на стандартном лечении (группа 2) и лечении в комплексе с обзиданом (группа 3) (в % к контролю)

Отмеченное нами накопление ЛФЛ в ПМ лимфоцитов больных всех трех групп чревато переходом липидного бислоя в монослой, активацией проницаемости мембраны для №+ и К+, солюбилизацией ферментов [Зелинский Б.А., Паламарчук А.В., 1994].

Биологические мембраны обладают функциональной асимметрией. В настоящее время установлено, что асимметрия отражается в различном распределении липидов и других компонентов мембраны между двумя поверхностями двойного липидного слоя. Показатель трансмембранной асимметрии (ТМА) ПМ является важной величиной, определяющей структурную организацию мембраны и, следовательно, функционалыгую способность клетки. Изменения ТМА, которое мы выявили в ПМ лимфоцитов больных первой и второй группы, проявляющиеся, в уменьшении соотношении мФЭА/оФЭА напрямую связаны с нарушениями в липидном обмене в целом и с нарушением распределения липидов в мембране в частности.

В результате выше изложенных нарушений мембрана клеток становится ригидной, нарушается ее текучесть, селективная проницаемость. Изменяется содержание и соотношение основных катионов в клетке. Нарушается активность ферментов, фиксированных на мембране, снижается способность мембраны блокировать на самых ранних этапах перекисное окисление липидов. Нарастание интенсивности перекисного окисления липидов сопровождается инактивацией большинства ферментов, фиксированных на биомембранах, а высокая ригидность мембран блокирует эффекты «флип-флоп». Следствием является снижение чувствительности мембран к действию физиологических и фармакологических регуляторов [Нелаева А.А., Кашуба. Ю. И., 1990].

Положительное влияние АБ обзидана на липидный спектр плазматических мембран лимфоцитов больных третьей группы вероятно можно объяснить его стабилизирующим действием на плазматические мембраны лимфоцитов [Сысолятина Н. А., 1992].

Изучение активности сфингомиелиназы, содержания сфингомиелина и иерамидов в плазматических мембранах лимфоцитов больных опийной наркоманией в состоянии абстиненции до лечения, на стандартном лечении и лечении в комплексе с адреноблокатором

Полученные в ходе исследования данные об изменении активности сфингомиелиназы, а также содержания СФМ и церамидов в ПМ лимфоцитов больных опийной наркоманией в состоянии абстиненции до лечения, на стандартном лечении и лечении в комплексе с 13- АБ представлены на рис. 3.

Проведенный анализ показал, что в ПМ лимфоцитов в группе больных опийной наркоманией до лечения (группа 1) обнаружено значительное увеличение активности сфингомиелиназы, ей активность возросла в 2,5 раза (р < 0,05) по сравнению с контрольной группой, на стандартном лечении (группа 2) обнаружено увеличение активности сфингомиелиназы в 2,4 раза (р < 0,05) по сравнению с группой здоровых доноров. В группе больных на комплексном лечении (группа 3) обнаружено менее значительное увеличение активности сфингомиелиназы, её активность возросла в 1,7 раза (р < 0,05) по сравнению с контрольной группой. Было выявлено достоверное различие в активности сфингомиелиназы в ПМ лимфоцитов у больных опийной наркоманией группы 2 и группы 3.

В наших исследованиях изучалась активность нейтральной сфингомиелиназы, мембраносвязанного и Mg2+, Mn2+ зависимого фермента. Эту изоформу сфингомиелиназы содержат плазматическая и ядерная мембрана [Брокерхоф X., 1978]. Известно, что именно нейтральная Mg2+, Мп+ - зависимая сфингомиелиназа воздействует на особый "сигнальный" транедукционный пул сфингомислина [Neitcheva Т., 1995], включенный в процессы регулирования жизненной программы

клетки (избирательная активность генетического аппарата клетки, пролиферация и дифференцировка, апоптоз) [Neil Kaplowitz., 2000J. В ходе исследования было выявлено увеличение активности сфингомиелиназы в группе больных до лечения и в группе больных, находившихся на стандартном лечении, так и менее значительное увеличение в группе больных, находившихся на комплексном лечении (рис. 3).

Среди факторов, определяющих изменение активности сфингомиелиназы, является концентрация субстрата катализируемой реакции — сфингомиелина. С другой стороны, при увеличении активности фермента концентрация субстрата должна снижаться. Уровень сфингомиелина — это динамическая величина, которая определяется скоростью его синтеза de novo и скоростью его деградации под действием сфингомиелиназы. Сфингомиелин в клетке может синтезироваться двумя путями: 1) при взаимодействии церамида с цитидиндифосфат-холином (CDP-холин); 2) при взаимодействии церамида с фофсфатидилхолином и переносом холина на сфингомиелин [Ленинджер А., 1985]. Таким образом, концентрация сфингомиелина может оставаться повышенной при увеличенной активности сфингомиелиназы, если синтез сфингомиелина de novo преобладает над его деградацией под действием фермента К факторам, косвенно свидетельствующим о преобладании синтеза сфингомиелина над его гидролизом, относятся снижение уровня церамидов (рис. 3), которые являются субстратом для синтеза сфингомиелина de novo.

Рис. 3. Активность сфингомиелиназы, содержание сфингомиелина и церамидов в плазматических мембранах лимфоцитов больных опийной наркоманией в состоянии абстиненции до лечения (группа 1), на стандартном лечении (группа 2) и лечении в комплексе с обзиданом (группа 3) (в % к контролю)

В нашем исследовании уровень церамидов и сфингомиелина изменяется разнонаправлено. Такой характер изменений уровней данных липидов можно объяснить либо ускоренным синтезом сфингомиелина из церамидов, либо выраженным процессом последующей деградации церамида под действием церамидазы с образованием сфингенина, сфинганина и сфингозин-1-фосфата (из сфингенина под действием сфингозин - киназы).

Сфингомиелин и церамиды обладают разнонаправленным влиянием на различные клеточные процессы, а в регуляции митогенной активности, пролиферации, дифференцировки клеток и апоптозе даже являются антагонистами. Церамиды непосредствешю изменяют транскрипционную активность ДНК [Жданов Р. И., 1999], вызывают ингибирование протеинкиназы С [Ткачук В. А., 1998] и экспрессии Ьс1-2 [Меджитов Р. М., 1991]. Также церамиды вызывают выход кальция [Шиши ^,1996] и активацию нуклеаз, снижают активность ФЛ D и модулируют активность других фосфолипаз [№йсИсуа Т., 1995] и др. Данные эффекты лежат в основе антипролиферативного, противоопухолевого и других влияний церамидов [Дятловицкая Э. В.,1998]. В отличие от церамида сфингомиелин обладает противоположным эффектом на перечисленные внутриклеточные процессы. Выявленное повышение содержания сфингомиелина может приводить к активации ФЛ D, протеинкиназы С, ингибированию нуклеаз. В отличие от больных первой и второй группы у больных, находившихся на стандартной терапии в комплексе с /} - АБ, не обнаружено нарушений в содержании сфингомиелина и церамидов.

Таким образом, обнаруженные изменения в обмене сфинголипидов у больных опийной наркоманией в период абстиненции могут привести к "активному" дисбалансу в липидном обмене лимфоцитов. Все эти изменения могут способствовать появлению лимфоцитов с измененным поверхностным фенотипом, что приводит к нарушению иммунологического гомеостаза, выражающегося в нарушении клеточного звена иммунитета Это является одним из основных факторов снижающих функциональную активность лимфоцитов, обуславливающих формирование иммунодефицита и как следствие присоединение инфекционных заболеваний [Нелаева А.А.,1990].

Изучение активности фосфолипаз и процессов перекисного окисление липидов плазматических мембран лимфоцитов и сыворотки крови больных опийной наркоманией в состоянии абстиненции до лечения, на стандартном лечении и лечении в комплексе с - адреноблокатором

Исследование активности фосфолипаз в органах и тканях человека представляет интерес с позиций изучения их физиологической роли, а также с точки зрения выяснения патогенетического значения этих ферментов при различных заболеваниях [Губергриц Н. Б., Лукашевич Г. М.,2000]. Фосфолипазы являются инструментом, регулирующим быстрое изменение состава фосфолипидов. Известно, что фосфолипазы типа А играют важную роль в формировании уникального набора жирных кислот ФЛ мембран. Фосфолипаза А2 (ФЛ А2) является мишенью в клетках действия целого ряда гормонов. Большая часть биологических эффектов, развивающихся при этом, связана с высвобождением полиненасыщенных жирных кислот из фосфолипидов, которые в свою очередь являются предшественниками разнообразной группы физиологически активных метаболитов - простагландинов, тромбоксанов и лейкотриенов [Бабенко Н. А., Кавок Н. С, 1994]. В том числе активация фосфолипаз может влиять на состав и количество жирных кислот, которые входят в состав биоэффекторных молекул сфинголипидов [Проказова Н. В., 1999]. Продукты действия фосфолипаз А, и D оказывают прямое действие на ключевой фермент сфингомиелинового цикла -сфингомиелиназу [ КеНсИеуа Т., 1995].

Изучение активности фосфолипаз показало (рис. 4), что в группе 1 (до начала лечения) обнаружено значительное увеличение активности ФЛ А2, её активность возросла в 2,2 раза (р < 0,05) по сравнению с аналогичным показателем группы контроля. В группе больных опийной наркоманией на стандартном лечении (группа 2) обнаружено также значительное увеличение активности ФЛ А2, её активность возросла в 1,8 раза (р < 0,05). В группе больных на комплексном лечении (группа 3) обнаружено менее значительное увеличение активности ФЛ А2 в 1,4 раза (р < 0,05)

по сравнению с аналогичным показателем группы контроля. Аналогичные изменения мы обнаружили и при исследовании активности ФЛ D. В первой группе больных происходит увеличение активность ФЛ D в 4,6 раза (р < 0,05), во второй в 3,8 раза (р < 0,05), в третьей группе увеличение активности ФЛ D составило в 3, 1 раза (р < 0,05), по сравнению с аналогичным показателем группы здоровых доноров.

Было выявлено достоверное различие в активности ФЛ А, и ФЛ D в ПМ лимфоцитов у больных опийной наркоманией группы 2 и группы 3.

Активация фосфолипаз при опийной наркомании в состоянии абстиненции может реализоваться тремя путями. Во-первых, катехоламины, выход которых в кровь возрастает при абстинентном синдроме [Шабанов П. Д., Штакельберг О. Ю., 2000], активируют систему кинин-каллекреина и вызывают ряд явлений: фактор Хагемана -» кининоген брадикинин -» активация фосфолипазы А.

Во-вторых, увеличите концентрации Са 2+ в саркоплазме, обусловленное АТФ-дефицитным торможением Са-насоса, активизирует вхождение фосфолипаз в липидный бислой, где они приобретают специфическую активность. В-третьих, активация ПОЛ может вызвать лабилизацию лизосом и способствовать высвобождению большей части популяции фосфолипаз [Меерсон Ф. 3.,1984].

Причиной увеличения активности фосфолипаз может служить действие ФНО-а, основного цитокина, который вырабатывается при воспалении и обладает эффектом активации фосфолипаз. При связывании ФИО-а с рецептором ФНО-а происходит активация не только сфингомиелиназы [Жижина Г. П., 1994], но и активация фосфолипаз А,, С и D [Сала А., 1998]. Повышение активности фосфолипазы А2 приводит к удалению токсичных переокисленных жирнокислотных остатков фосфолипидов из тканей. Продуктом гидролиза фосфолипидов ФЛ А2 являются лизофосфолипиды - чрезвычайно цитотоксичные вещества [Губергриц Н. Б.,2000].

Как было показано выше (рис. 1), было выявлено значительное увеличение содержания ЛФЛ во всех трех группах больных. Включение ЛФЛ в липидный бислой меняет липидное окружение, а как следствие, активность ферментов, рецепторов и каналов ионной проводимости. Механизм повреждающих эффектов ЛФЛ связан с их способностью, разрывать структуру биологических мембран, создавая, таким образом, предпосылку для накопления в клетке Са2+ [Меерсон Ф. 3,1984].

Вторым продуктом действия ФЛ А2 является арахидоновая кислота (АК) [Губергриц Н. Б.,2000]. АК обладает ингибирующим влиянием на ФЛА2 и оказывает стимулирующее действие на сфингомиелииазу [Брокерхоф X., 1978]. Однако, в наших исследованиях мы обнаружили повышенную активность ФЛА2. Это может быть связано с усилением процессов перекисного окисления липидов, приводящего к уменьшению количества длинноцепочечных ненасыщенных жирных кислот, одной из которых является арахидоновая, и происходит увеличение моноеновых ЖК. В отсутствии арахидоновой кислоты как основного ингибитора фосфолипазы А,, активность её остаётся повышенной. Обнаруженное нами увеличение активности фосфолипазы D может служить причиной повышенной активности сфингомиелиназы, так как продукт действия фосфолипазы D -фосфатидная кислота является активатором сфингомиелиназы [Брокерхоф Х.,1978]. Активная ФЛ А2 тесно взаимодействует с перекисным окислением липидов (ПОЛ). Это обусловлено тем, что продукты ПОЛ активируют ФЛ А2 Активация ФЛ А2 является мощным усилителем влияния ПОЛ на биологические мембраны [Губергриц Н. Б., 2000].

Рис. 4. Активность фосфолипазы А, и фосфолипазы D в плазматических мембранах лимфоцитов больных опийной наркоманией в состоянии абстиненции до лечения (группа 1), на стандартном лечении (группа 2) и в комплексе с обзиданом (группа 3) (в% к контролю)

В связи с этим, в нашей работе мы определили количество конечных продуктов ПОЛ: ТБК - активные продукты (ТБК - ап), а так же активность ферментов антиоксидантной защиты: каталазы и супероксидисмутазы (СОД) в плазматических мембранах лимфоцитов и сыворотке крови больных опийной наркоманией в состоянии абстиненции до лечения, на стандартном лечении и лечении в комплексе с /?-АБ Результаты представлены на рис 5

В группе больных до лечения (группа 1) содержание ТБК - ап в ПМ лимфоцитов превышало аналогичный показатель в группе контроля в 9,1 раз (р<0,05), в сыворотке увеличение составило в 1,9 раза (р<0,05) В группе больных, находившихся на стандартном лечении (группа 2), содержание ТБК - ап в ПМ лимфоцитов превышало аналогичный показатель в контрольной группе в 7,3 раза (р<0,05), в сыворотке увеличение составило в 1,4 раза (р<0,05). В группе больных, находившихся на комплексном лечении (группа 3), было выявлено увеличение содержание ТБК - ап в ПМ лимфоцитов в 3,1 раза (р<0,05) по сравнению с группой контроля, в сыворотке изменение содержания ТБК - ап было недостоверно Было выявлено достоверное различие в содержании ТБК - ап в ПМ лимфоцитов и сыворотке у больных опийной наркоманией группы 2 и группы 3.

В группе больных опийной наркоманией до начала лечения активность каталазы в лимфоцитах была ниже аналогичного показателя в группе контроля в 1,96 раза (р<0,05), в сыворотке снижение составило в 2,4 раза (р<0,05) В группе больных, находившихся на стандартном лечении, активность каталазы в лимфоцитах была ниже аналогичного показателя в группе контроля в 1,4 раза (р<0,05), в сыворотке снижение составило в 1,8 раза (р<0,05). В группе больных, находившихся на комплексном лечении, изменение активности каталазы в лимфоцитах и сыворотке по сравнению с группой контроля было недостоверно Было выявлено достоверное различие в активности каталазы в лимфоцитах и сыворотке у больных опийной наркоманией группы 2 и группы 3.

Активность СОД так же претерпевала аналогичные изменения. В группе больных опийной наркоманией до начала лечения было выявлено снижение активности СОД в лимфоцитах в 2,9 раза (р<0,05) по сравнению с аналогичным показателем контрольной группы, в сыворотке снижение составило в 2,7 раза (р<0,05) В группе больных, находившихся на стандартном лечении, было выявлено снижение активности СОД в лимфоцитах в 2,4 раза (р<0,05), в сыворотке снижение

составило в 1,8 раза (р<0,05) по сравнению с аналогичным показателем группы контроля. В группе больных, находившихся на комплексном лечении, изменение активности СОД в лимфоцитах и сыворотке было недостоверно но сравнению с группой контроля. Было выявлено достоверное различие в активности СОД в лимфоцитах у больных опийной наркоманией группы 2 и группы 3.

В организме человека ПОЛ имеет большое значение для обновления липидов мембран клеток и посредством этого поддержания структурного гомеостаза. Известно, что степень выраженности процессов перекисного окисления липидов определяется соотношением функциональной активности прооксидантных и антиоксидантных метаболических механизмов [Чекман И. С, 1996]. Исходя из этого, интенсификация ПОЛ может быть обусловлена увеличением активности прооксидантных систем, антиоксидантной недостаточностью и сочетанием этих двух факторов.

Полученные результаты позволяют сделать утверждение, что в условиях абстинентного синдрома при опийной наркомании разбалансированность процессов оксидации - антиоксидации и активация ПОЛ наблюдается как в лимфоцитах, так и в сыворотке крови. Однако первично и наиболее выражено, ПОЛ инициируется на клеточном уровне, в мембранах лимфоцитов. Увеличение продуктов ПОЛ в мембранах лимфоцитов предполагает существенный их выброс в кровоток (вследствие деструкции мембран лизофосфолипидами) [Сайфутдинов Р.И.,КоцА.И.,1990].

Рис. 5. Содержание ТБК - активных продуктов, активность каталазы и супероксиддисмутазы в плазматических мембранах лимфоцитов и сыворотке крови больных опийной наркоманией в состоянии абстиненции до лечения (группа 1), на стандартном лечении (группа 2) и лечении в комплексе с обзиданом (группа 3) (в % к контролю)

Уменьшение активности каталазы и СОД может происходить из-за длительного действия активных форм кислорода на клетку и как следствие истощения данных ферментов. В группе больных, находившихся на стандартном лечении в комплексе с (3-АБ, изменения активности ПОЛ менее выражены, а активность антиоксидантных ферментов достоверно не изменяется по сравнению с группой контроля. Это может быть обусловлено тем, что обзидан предотвращает активацию ПОЛ действуя по механизму, принципиально отличающемуся от механизма действия антиоксидантов, т. е. скорее всего ингибированием аденилатциклазной

системы или уменьшением вхождения Са2+ в клетки [Меерсон Ф. 3..1984]. Ингибирование ПОЛ приводит к снижению активности фосфолипазы А2 и ФЛ Б [Меерсон Ф. 3.,1984], которое мы наблюдали в группе больных, находившихся на комплексном лечении.

Изучение протеиназно-ингибиторной системы плазмы крови больных опийной наркоманией в состоянии абстиненции до лечения, на стандартном лечении и лечении в комплексе с /}-адреноблокатором

Особое значение в процессе адаптации и защиты организма, а также при определенных условиях в патогенезе различных заболеваний принадлежит протсолитическим системам тканей и плазмы крови [Яровая Г. А., 1994].

В нашей работе мы изучали активность трипсина и содержание плазминогена. Данные об активности трипсина и содержании плазминогена в плазме крови больных опийной наркоманией в состоянии абстиненции до лечения, на стандартном лечении и лечении в комплексе с /5-АБ представлены на рис.6.

В группе больных опийной наркоманией до лечения обнаружено значительное увеличение активности трипсина в 3,1 раза (р < 0,05) по сравнению с аналогичным показателем группы здоровых доноров. В группе больных опийной наркоманией на стандартном лечении также выявлено значительное увеличение активности трипсина в 2,3 раза (р < 0,05). В группе больных на комплексном лечении обнаружено менее значительное увеличение активности трипсина в 1,4 раза (р < 0,05) по сравнению с аналогичным показателем группы контроля. Было выявлено достоверное различие в активности трипсина у больных опийной наркоманией группы 2 и группы 3.

В группе больных опийной наркоманией до начала лечения (группа 1) и на стандартном лечении (группа 2) обнаружено снижение содержания плазминогена в 1,3 раза (р < 0,05) по сравнению с аналогичным показателем группы контроля. В группе больных на комплексном лечении (группа 3) содержание плазминогена также было снижено в 1,2 раза (р < 0,05) по сравнению с группой здоровых доноров. Было выявлено достоверное различие в' содержании плазминогена у больных опийной наркоманией группы 2 и группы 3.

Трипсин является общим активатором протеолитических систем крови. В норме трипсин в плазме крови существует в неактивном состоянии из-за образования комплекса с ингибиторами. Предшествующее воздействие на мембраны клеток протелитических ферментов - трипсина и др. приводит к активации фосфолипаз, что вызывает полное разрушение холинсодержащих фосфолипидов Увеличение активности трипсина запускающего протеиназы кининовой, фибринолитической и свертывающей систем, комплемента, очевидно, имеет решающее значение в развитии необратимых катаболических реакций организма. Превращение плазминогена в плазмин возможно под действием активаторов, которые высвобождаются из эндотелия под действием многочисленных эндогенных и экзогенных стимулов: ацидоза и гипоксии, некоторых вазоактивных медиаторов - гистамина, серотонина, брадикинина, катехоламина. Как уже упоминалось выше, в период абстинентного синдрома при опийной наркомании имеет место ускоренный синтез катехоламинов [Анохина И. П.,1995], что может приводить к высвобождению из эндотелия активатора плазминогена. Следовательно, снижение концентрации плазминогена у больных опийной наркоманией может означать не только активацию системы фибринолиза, но и гиперактивацию в кровотоке других протеолитических систем.

К протеолитическим ферментам относится и тромбин - ключевой фермент свертывающей системы крови, который участвует в регуляции многих физиологических процессов. Показателем наличия активного тромбина в плазме является наличие растворимых фибринмономерных комплексов (РФМК). Факт обнаружения РФМК имеет диагностическое значение, так как они являются маркерами тромбинемии и внутрисосудистого свертывания крови, и их наличие

свидетельствует о появлении активного тромбина в крови и о развитии гиперкоагуляции [Иванов Е. П.,1991]. Данные о содержании РФМК в плазме крови больных опийной наркоманией в состоянии абстиненции до лечения, на стандартном лечении и лечении в комплексе с £-ЛБ представлены на рис. 6. В группе больных опийной наркоманией до начала лечения (группа 1) ив группе больных опийной наркоманией, находившихся на стандартном лечении (группа 2), обнаружено значительное увеличение содержания РФМК в 2,9 раза (р < 0,05) по сравнению с аналогичным показателем группы сравнения. В группе больных на комплексном лечении (группа 3) обнаружено менее значительное увеличение содержания РФМК в 2,4 раза (р < 0,05) по сравнению с группой здоровых доноров, но при этом не было достоверных отличий от содержания РФМК в группе больных, находившихся на стандартной схеме лечения.

При активации протеолиза большое значение имеет состояние ингибиторного звена плазмы крови. Контроль каскадных протеолитических систем осуществляется благодаря мощной системе ингибиторов, которые полностью или частично лишают ферменты каталитической активности.

Протекторный эффект действия ингибиторов протеиназ на клеточном уровне при патологии проявляется прежде всего в уменьшении степени дегрануляции и разрушения клеток, в предупреждении лавинообразного поступления протеолитических ферментов из лизосом в цитоплазму, а затем и за пределы клетки в ткани и кровеносное русло [Процснко В. А., Шпак С. И., 1988].

В нашей работе мы определяли активность таких ингибиторов протеолитических ферментов как СЦ - протеиназный ингибитор (0!|-ПИ). Cti ~ макроглобулин (о^ -МГ). антитромбин - III (ATIII). Данные об их активности в плазме крови больных опийной наркоманией в состоянии абстиненции до лечения, на стандартном лечении и лечении в комплексе с /J-АБ представлены на рис.6.

Проведенный анализ показал, что в группе больных опийной наркоманией до проведения лечения (группа 1) было выявлено снижение активности ßi —ПИ в 1,8 раза (р < 0,05) по сравнению с группой контроля. В группе больных опийной наркоманией на стандартном лечении (группа 2) обнаружено снижение активности сц - ПИ в 1,5 раза (р < 0,05) по сравнению с аналогичным показателем группы контроля. В группе больных на комплексном лечении (группа 3) активность а( - ПИ достоверно не отличалась от аналогичного показателя в группе здоровых доноров. Было выявлено достоверное различие в активности ßi - ПИ у больных опийной наркоманией группы 2 и группы 3.

Активность аг- МГ в плазме крови практически здоровых доноров превышало аналогичный показатель в группе больных опийной наркоманией до проведения лечения (группа 1) в 2,9 раза (р < 0,05), и в 2,2 раза (р < 0,05) у больных, находившихся на стандартном лечении (группа 2). Активность Cli — МГ в плазме крови больных, находившихся на комплексном лечении (группа 3), достоверно не отличалось от аналогичного показателя в группе здоровых доноров. Было выявлено достоверное различие в активности - МГ у больных опийной наркоманией группы 2 и группы 3.

В группе больных опийной наркоманией до проведения лечения (группа 1) и, находившихся на стандартном лечении (группа 2), активность AT III была снижена в 1,8 раза (р < 0,05). Снижение в группе больных, находившихся на комплексном лечении (группа 3), составило в 1,2 раза (р < 0,05) по сравнению с группой практически здоровых доноров и достоверно отличалось от аналогичного показателя в группе 2.

AT III относят к ингибиторам тромбина и слабым ингибитором плазмина; аi -ПИ, снижает активность тромбина, трипсина иплазмина; Oi- МГ слабый ингибитор тромбина, плазмина, калликреина и трипсина. Так как частично AT III синтезируется в эндотелии, то повреждение эндотелия при длительном воспалении может привести к нарушению синтеза AT III. Одним из маркеров повреждения

эндотелия является повышение активности фактора Виллебранда (ФВ) в плазме крови. Данные об активности ФВ в плазме крови больных опийной наркоманией в состоянии абстиненции до лечения, на стандартном лечении и лечении в комплексе с Д-АБ представлены в таблице 1. Проведенный анализ показал, что в группе больных до проведения терапии (группа 1) и, находившихся на стандартном лечении (группа 2), активность ФВ была достоверно повышена в 1,7 раза (р < 0,05) и в 1,6 раза (р < 0,05) в группе больных, находившихся на комплексном лечении, по сравнению с аналогичным показателем группы контроля. При этом не было выявлено достоверного отличия между группой 2 и группой 3.

Таблица 1

Активность фактора. Внллебранда (%) плазмы крови больных опийной наркоманией в состоянии абстиненции до лечения (группа 1), на стандартном

Наименование показателя Группа контроля п=25 Группа 1 п=75 Группа 2 п=41 Группа 3 п=34

Фактор Виллебранда 78,7 ± 3,7 136,7 ±6,8* 132,7 ± 4,0* 128,4 ± 6,6*

Примечание: n - количество обследованных. * - достоверное изменение по сравнению с контролем (р < 0.05)

При системном повреждении и активации эндотелия (системные васкулиты, гиперпродукция и системное распространение активирующих эндотелий цитокинов и медиаторов, таких как ФИО и катехоламинов) происходит снижение антитромботической резистентности сосудов, и сосудистая стенка становится тромбогенной. Это может стать причиной развития ДВС-синдрома. Фибринолитическая система может активироваться до такой степени, что содержание ингибиторов плазмина может исчерпываться. Содержание AT III, afc -МГ снижается при потреблении этих факторов в результате увеличения активности протеолитических ферментов. При появлении в крови активного тромбина и растворимого фибрина активируется AT- III, количество которого быстро падает из-за необходимости нейтрализации тромбина [Иванов Е. П., 1991].

Таким образом, снижение AT III и Qfc - МГ в плазме крови больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома обусловлено увеличением активности протеолитических ферментов, и появления в крови активного тромбина. Снижение активности - ПИ может быть в результате действия на фермент пероксидных и супероксидных анионов, образующихся в результате активации процессов ПОЛ, превращая активный од - ПИ в неактивную форму.

В группе больных, находившихся на стандартном лечении в комплексе с ß-АБ, изменения активности протеолитических ферментов и их ингибиторов по сравнению с группой больных, находившихся на стандартном лечении, менее выражены. Установлено, что /S-адренергические препараты влияют на лизосомы, что проявляется в изменении активности лизосомальных ферментов и перераспределении активности между связанной с органеллами и свободной фракциями (по перераспределению можно судить об изменениях стабильности лизосомальных мембран). Фармакологическое выключение /5-адренорецепторов является препятствием к появлению характерного для /3-адреностимуляции влияния на активность лизосомальных ферментов и стабильность лизосомальных мембран [Сысолятина Н. А., 1992]. Комплексообразование /3-адренергических средств с ß-адренрецепторами (в том числе и на лизосомах) препятствует действию избытка катехоламинов, свойственного абстинентному синдрому при опийной наркомании.

311%229%142% — 295%280%237%

Трипсин Плаз-ген РФМК ПИ МГ АТ-Ш

(□Группа контроля И Группа 1 В Группа 2 В Группа 3

Рис.6. Активность трипсина, 04 -протеиназного ингибитора, сь -макроглобулина, антитромбина-Ш, содержание плазминогена, растворимых фибринмономерных комплексов в сыворотке и плазме крови больных опийной наркоманией в состоянии абстиненции до лечения (группа 1), на стандартном лечении (группа 2) и в комплексе с обзиданом (группа 3) (в% к контролю)

Таким образом, у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома наступает ряд изменений в липидном составе мембран лимфоцитов крови, проявляющиеся в увеличении содержания холестерина, лизофосфолипидов, фосфатидилхолина и фосфатидилсерина и уменьшении содержания фосфатидилэтаноламина, эфиров холестерина; нарушении обмена сфинголипидов (которые проявляются в увеличении содержания сфингомиелина, в увеличении активности сфингомиелиназы и уменьшении содержания церамидов); изменением трансмембранной асимметрии распределения фосфатидилэтаноламина и отношения холестерина к фосфолипидам. Все это может привести к дисбалансу в липидном обмене мембран лимфоцитов, и как следствие к нарушению функционирования липидзависимых ферментов, рецепторов и каналов ионной проницаемости. В механизмах повреждения мембран у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома активное участие принимают изменение активности протеолитических ферментов и их ингибиторов, фосфолипаз (А D) и процесса ПОЛ.

Вероятно, целенаправленная коррекция выше названных изменений может изменить течение абстинентного синдрома при опийной наркомании.

Обусловленная избытком катехоламинов, ускоренный синтез которых происходит в состоянии абстиненции, активация липаз, фосфолипаз, ПОЛ, достигая чрезмерного уровня, приводит к повреждению липидного бислоя мембран и, как следствие, к нарушению функционирования рецепторов и каналов ионной проницаемости, липидзависимых ферментов [Меерсон Ф. З.Д984]. Эти изменения можно в значительной степени предупредить введением /3 - адрсноблокаторов. Соединение катехоламинов с адренорецепторами приводит к увеличенному образованию цАМФ и этот "второй передатчик" активирует протеинкиназы -ферменты, фосфорилирующие белки, и прежде всего белки медленного канала

транспорта Са2+ . При значительном и длительном избытке эндогенных катехоламинов механизмы самоограничения адреноргического эффекта могут быть сорваны [Меерсон Ф. 3.,1984].

Для решения этой задачи у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома к схеме стандартного лечения (клофелин, нейролептики, седативные препараты) был добавлен 0 - АБ обзидан (пропранолол) в дозе 20 мг/сутки. В результате было выявлено, что включение обзидана в стандартную схему лечения абстинентного синдрома у больных опийной наркоманией нормализует липидный спектр и обмен сфинголипидов плазматических мембранах лимфоцитов.

В основе положительного влияния обзидана на липидный спектр и обмен сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов больных опийной наркоманией, находившихся в состоянии абстинентного синдрома, лежит снижение активности фосфолипаз, угнетение процессов перекисного окисления липидов и восстановление баланса протеиназно-ингибиторной системы.

Выводы

1. У больных опийной наркоманией, находившихся в состоянии абстинентного синдрома, в плазматических мембранах лимфоцитов регистрируются нарушения липидного спектра, которые проявляются в увеличении содержания холестерина, лизофосфолипидов, фосфатидилхолина и фосфатидилсерина и уменьшении содержания фосфатидилэтаноламина, эфиров холестерина, а также в изменении трансмембранной асимметрии распределения фосфатидилэтаноламина и отношения холестерина к фосфолипидам.

Кроме того, наблюдается нарушение обмена сфинголипидов, проявляющееся в увеличении содержания сфингомиелина, повышении активности сфингомиелиназы, уменьшении содержания церамидов.

2. В механизме нарушения липидного спектра и обмена сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов больных опийной наркоманией, находившихся в состоянии абстинентного синдрома, особую роль играют увеличение активности фосфолипазы А2, фосфолипазы D, усиление процессов перекисного окисления липидов и активация протеолитических систем крови.

3. При использовании стандартной схемы лечения абстинентного синдрома у больных опийной наркоманией не было выявлено положительных изменений со стороны липидного спектра, обмена сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов.

4. Включение обзидана в стандартную схему лечения абстинентного синдрома у больных опийной наркоманией нормализует липидный спектр и обмен сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов.

5. Механизм положительного влияния обзидана на липидный спектр и обмен сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов у больных опийной наркоманией, находившихся в состоянии абстинентного синдрома, связан со снижением активности фосфолипаз, угнетением процессов перекисного окисления липидов и восстановлением баланса протеиназно-ингибиторной систем крови.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Активность фосфолипаз плазматических мембран лимфоцитов у больных опийной наркоманией в состоянии абстиненции // Сборник статей молодых ученых и специалистов "Четвертый конгресс молодых ученых и специалистов" (Томск,

2003 г.)-С. 186.;

2. Изучение состава липидов плазматических мембран лимфоцитов у больных опийной наркоманией в состоянии абстиненции // Актуальные проблемы медицины и биологии. - 2003. - №2. - С 41-42. (в соавт. с Ссребровым В. Ю., Балашовым П. П.);

3. Компоненты сфингомиелинового цикла в плазматических мембранах лимфоцитов при абстинентном синдроме у больных опийной наркоманией // Сибирский вестник психиатрии и наркологии. - 2004. - № 1. — С. 12-13. (в соавт. с Серебровым В. Ю., Балашовым П. П.);

4. Перекисное окисление и спектр липидов плазматических мембран лимфоцитов при абстинентном синдроме у больных опийной наркоманией // Сибирский вестник психиатрии и наркологии. - 2004. - № 2. - С. 43-45. (в соавт. с Серебровым В. Ю., Балашовым П. П.);

5. Исследование активности фосфолипаз плазматических мембран лимфоцитов при абстинентном синдроме у больных опийной наркоманией // Актуальные проблемы медицины и биологии. - 2004. - Т. 3. - №1. - С. 89. (в соавт. с Серебровым В. Ю., Балашовым П. П.);

6. Характеристика перекисного окисления липидов плазматических мембран лимфоцитов при абстинентном синдроме у больных опийной наркоманией // Актуальные проблемы медицины и биологии. - 2004. - Т. 3. - №1. - С. 90. (в соавт. с Серебровым В. Ю., Балашовым П. П.);

7. Влияние состояния абстиненции на соотношение компонентов сфингомиелинового цикла в плазматических мембранах лимфоцитов у больных опийной наркоманией // Актуальные проблемы медицины и биологии. - 2004. - Т. 3. - №1. - С. 91. (в соавт. с Серебровым В. Ю., Балашовым П. П.);

8. Спектр липидов плазматических мембран лимфоцитов при абстинентном синдроме у больных опийной наркоманией // Клиническая лабораторная диагностика. - 2004. - №4. - С. 10 - 12. (в соавт. с Серебровым В. Ю., Балашовым П. П.);

9. Дисбаланс протеиназно - ингибиторной системы у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома // Сборник статей молодых ученых и специалистов "Пятый конгресс молодых ученых и специалистов" (Томск,

2004 г.)-С. 201-202.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

0| — ИИ -0(| — протеиназный ингибитор

о^- МГ - а.г- макроглобулин

/8 - А Б - (3 - адреноблокаторы

АТ -III - антитромбин Ш

ЛФЛ - лизофосфолипиды

ПМ - плазматические мембраны

ПОЛ - перекисное окисление липидов

РФМК - растворимые фибринмономерные комплексы

СОД - супероксиддисмутаза

СФМ - сфингомиелин

ТБК-ап- ТБК - активные продукты

ТМА - трансмембранная асимметрия

ТСХ - тонкослойная хроматография

ФВ - фактор Виллебранда

ФИ - фосфатидилинозитол

ФЛ - фосфолипиды

ФЛА2 - фосфолипаза А2

ФЛБ - фосфолипаза Б

ФНО - фактор некроза опухоли

ФС - фосфатидилсерин

ФХ - фосфатидилхолин

ФЭА — фосфатидилэтаноламин

мФЭА - модифицированный фосфатидилэтаноламин

оФЭА - общий фосфатидилэтаноламин

ХС - холестерин

ЭХ - эфиры холестерина

#10804

Тираж 100. Заказ 626. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники пр. Ленина, 40

Акуальность. Распространенность заболевания наркоманией в нашей стране не имеет тенденции к снижению. Показатель заболеваемости наркоманией уже приближается к показателю заболеваемости сердечнососудистыми заболеваниями [1, 172]. В настоящее время употребление "чистых" наркотиков встречается чрезвычайно редко. Чаще всего, применяемые наркотические вещества представляют собой кустарно приготовленную смесь из наркотических средств, балластных, психотропных и часто просто токсических веществ. В процессе кустарного приготовления наркотика в смесь дополнительно привносятся вещества (органические растворители, ангидриды, окислители), обладающие собственным токсическим действием. Использование такой смеси ведет к общему отравлению организма. Стало очевидным, что употребление психоактивных веществ ведет не только к развитию личностных и психических аномалий, но и является причиной широкого круга соматических заболеваний [1, 146, 157].

Опийная наркомания в клиническом отношении, прежде всего, проявляется абстинентным синдромом (состояние отмены), развитие которого связано с целым рядом вегетативных, физиологических и биохимических изменений в организме [209]. Это создает благоприятные условия для накопления во всех органах и тканях продуктов клеточного метаболизма и токсинов. По-видимому, в основе развития патологического процесса при абстинентном синдроме лежит дисбаланс клеточного гомеостаза и, как следствие, повреждение и гибель клетки.

В патогенезе опийной наркомании большое значение имеют изменения иммунологического гомеостаза, выражающиеся в большинстве случаев в нарушении клеточного звена иммунитета. Последнее проявляется как угнетением Т-клеточного звена иммунитета, так и повышением уровня циркулирующих иммунных комплексов [82, 155]. Не вызывает сомнения наличие у больных наркоманиями (прежде всего опийной группы) признаков вторичного иммунодефицита, повышающего риск возникновения у них инфекционных заболеваний и новообразований [51]. Уровень дискоординации иммунологических процессов отражает тяжесть течения заболевания, позволяя дать прогноз в отношении осложнений и отдаленных последствий. Иммунопатогенез опийной наркомании характеризуется выраженными изменениями популяционной и субпопуляционной гетерогенности и функциональной активности иммунокомпетентных клеток [117]. Изучение молекулярных механизмов повреждения клеток, в частности иммунокомпетентных, лежащих в основе развития осложнений опийной наркомании представляет значительный научный и практический интерес.

Сегодня большинство заболеваний рассматривают как состояния, сопряженные с поражением, прежде всего, клеточных мембран, поскольку дестабилизация молекулярной ультраструктуры мембран при патологических процессах приводит к потере их функциональной компетентности, изменению жизнедеятельности клеток в целом и, в конечном счете, к их гибели [52, 143].

Биологическим мембранам принадлежит ключевая роль в обеспечении и регуляции физиологической активности клетки. Хорошо известно, что липиды клеточных мембран являются не только формой депонирования метаболического топлива и основной компонентой клеточных структур, но и системой биологических эффекторов, регуляторов и медиаторов, участвующих практически во всех физиологических процессах клетки [15, 20, 199]. Особый интерес при этом представляет изучение обмена сфинголипидов. Это связано с тем, что сфингомиелин и продукты его ферментативного гидролиза играют определяющую роль в сигнальной трансдукции, регулирующей ведущие клеточные процессы - иммунный ответ, пролиферацию, рост, дифференцировку и апоптоз клеток [4, 69, 169].

Многообразие функций сфингомииелина и его производных, прямо или косвенно связанных с важнейшими клеточными событиями в норме и при патологии, определяет необходимость изучения обмена сфинголипидов в плазматических мембранах лимфоцитов больных опийной наркоманией. У

В регуляции состояния мембран клеток принимают участие процессы перекисного окисления липидов, фосфолипазы, ферменты протеолитической системы. Изучение их активности может быть важным диагностическим критерием общего состояния организма, характеристикой адаптивных процессов при неблагоприятных воздействиях, компенсаторных возможностей организма [38,39, 121, 167].

Течение и выраженность абстинентного синдрома при наркомании в значительной степени определяет характер лечения и прогноз заболевания. Существует несколько подходов к лечению абстинентного синдрома. Наряду с применением традиционной терапии, также применяют методы экстракорпоральной детоксикации (УФО, плазмоферез) [124, 128, 151, 161]. Однако, анализ приведенных в литературе данных, позволяет сделать вывод о минимальной эффективности лечебных программ, используемых для терапии наркоманий. Такое положение во многом обусловлено недостаточной разработкой проблемы патогенеза наркотической зависимости, и абстинентного синдрома. Необходимость активного поиска новых подходов к лечению больных наркоманиями представляется в этой ситуации чрезвычайно актуальной задачей. Из гипотез, объясняющих формирование физической зависимости от наркотиков, наиболее патогенетически адекватной признается так называемая "катехоламиновая гипотеза" [5]. Известно, что опийная абстиненция протекает на фоне адренергического возбуждения [82]. Избыток катехоламинов в крови может приводить к активации перекисного окисления липидов, активации фосфолипаз, детергентному действию высоких концентраций лизофосфолипидов в лигшдном бислое мембран, лабилизации мембран лнзосом и освобождение из них протеолитических ферментов с последующим повреждением клетки. Блокада адренорецепторов, через которые реализуется эффект катехоламинов, может ограничить повреждение клеток, вызванное избытком катехоламинов [133]. Соответственно средствами патогенетической терапии могут являться препараты с [5адреноблокирующим действием. Исследование влияния Р адреноблокаторов на липидный спектр плазматических мембран лимфоцитов и механизмы, принимающие участие в его регуляции (перекисное окисление липидов, активность фосфолипаз и активизация процессов протеолиза), безусловно, будут способствовать пониманию патогенеза опийной наркомании, возможности прогнозирования исходов и определения тактики лечения данной патологии. Цель работы:

Изучить механизмы структурных и функциональных нарушений плазматических мембран лимфоцитов крови у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома при использовании стандартной и комплексной схем лечения абстинентного синдрома. Задачи исследования:

1. Установить особенности содержания липидов: фосфолипидов, нейтральных липидов в плазматических мембранах лимфоцитов крови у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома до начала специфической терапии и на фоне стандартной и комплексной схем лечения (в комплексе с Р- адреноблокатором).

2. Установить особенности обмена сфинголипидов: активность сфингомиелиназы, содержание сфингомиелина, церамидов в плазматических мембранах лимфоцитов крови у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома до начала специфической терапии и на фоне стандартной и комплексной схем лечения (в комплексе с р-адреноблокатором).

3. Изучить состояние системы протеолиза в сыворотке и плазме крови (активность протеолитических ферментов и их ингибитров) у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома до начала специфической терапии и на фоне стандартной и комплексной схем лечения (в комплексе с р- адреноблокатором).

4. Исследовать активность фосфолиназ, процессы перекисного окисления липидов в плазматических мембранах лимфоцитов и сыворотке крови у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома до начала специфической терапии, на фоне стандартной и комплексной схем лечения (в комплексе с Р- адреноблокатором), а также установить их роль в механизмах нарушения липидного спектра плазматических мембранах лимфоцитов. Научная новизна:

Впервые у больных опийной наркоманией, находившихся в состоянии абстиненции и получавших традиционное лечение, изучен липидный спектр и обмен сфинголипидов в плазматических мембранах лимфоцитов и их взаимоотношение с основными механизмами фосфолипазного и перекисного повреждения липидов клетки. В результате выполненного исследования были получены новые данные фундаментального характера о метаболических нарушениях в плазматических мембранах лимфоцитов, вызванных употреблением опия-сырца, обработанного уксусным ангидридом. Выявленные изменения характеризуются увеличением содержания холестерина, лизофосфолипидов, фосфатидилхолина и фосфатидилсерина и уменьшением содержания фосфатидилэтаноламина, нарушением трансмембранной асимметрии распределения фосфатидилэтаноламина и отношения холестерина к фосфолипидам, увеличением активности сфингомиелиназы, уеличением содержания сфингомиелина и снижением количества церамидов. Показано, что у больных опийной наркоманией, находившихся в состоянии абстиненции, происходит выраженная активация фосфолипазного и перекисного механизмов повреждения липидов.

Впервые у больных опийной наркоманией проведено изучение состояния протеиназно-ингибиторной системы крови. Выявленные изменения, характеризуются увеличением активности протеолитических ферментов и снижением активности их ингибиторов.

В работе впервые изучена возможность коррекции нарушений липидного спектра и обмена сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов крови с помощью Р - адреноблокатора обзидана.

Был выявлен положительный эффект включения в стандартную терапию обзидана на липидный спектр и соотношение компонентов обмена сфинголипидов в плазматических мембранах лимфоцитов, а также механизмы участвующие в их регуляции.

Практическая значимость работы:

Полученные новые знания фундаментального характера, касающиеся изменений липидного состава, обмена сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов и механизмов, участвующих в регуляции состояния мембран у больных опийной наркоманией раскрывают новые аспекты патогенеза опийной наркомании. Результаты исследования могут служить основой для разработки новых способов коррекции метаболических нарушений, возникающих при употреблении наркотических препаратов опийной группы.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Развитие абстинентного синдрома у больных опийной наркоманией сопровождается нарушением в липидном спектре и обмене сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов, в механизме нарушений которых особую роль играют увеличение активности фосфолипаз, процессов перекисного окисления липидов и активизация протеолитических процессов крови.

2. Липидный спектр и обмен сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов у больных опийной наркоманией нормализуется при использовании комплексной схемы лечения абстинентного синдрома путем снижения активности фосфолипаз, угнетения процессов перекисного окисления липидов и восстановлении баланса протеиназно-ингибиторной системы.

3. Положительных изменений со стороны липидного спектра, обмена сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов и механизмов, принимающих участие в их нарушении, не было выявлено у больных опийной наркоманией при использовании стандартной схемы лечения абстинентного синдрома.

Апробация работы:

Основные положения работы были представлены на заседании Томского Областного общества лаборантов (Томск, 2004), на научном семинаре кафедры биохимии и молекулярной биологии; на кафедре психиатрии, наркологии, психотерапии Сибирского государственного медицинского университета, на четвертом и пятом конгрессах молодых ученых и специалистов (Томск 2003, 2004).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них три в центральной печати.

Объем и структура диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 178 страницах, иллюстрирована 22 таблицами и 15 рисунками. Библиография включает 251 литературных источника, из которых 212 отечественных и 39 иностранных.

152 Выводы

1. У больных опийной наркоманией, находившихся в состоянии абстинентного синдрома, в плазматических мембранах лимфоцитов регистрируются нарушения липидного спектра, которые проявляются в увеличении содержания холестерина, лизофосфолипидов, фосфатидилхолина и фосфатидилсерина и уменьшении содержания фосфатидилэтаноламина, эфиров холестерина, а также в изменении трансмембранной асимметрии распределения фосфатидилэтаноламина и отношения холестерина к фосфолипидам.

Кроме того, наблюдается нарушение обмена сфинголипидов, проявляющееся в увеличении содержания сфингомиелина, повышении активности сфингомиелиназы, уменьшении содержания церамидов.

2. В механизме нарушения липидного спектра и обмена сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов больных опийной наркоманией, находившихся в состоянии абстинентного синдрома, особую роль играют увеличение активности фосфолипазы А2, фосфолипазы D, усиление процессов перекисного окисления липидов и активация протеолитических систем крови.

3.При использовании стандартной схемы лечения абстинентного синдрома у больных опийной наркоманией не было выявлено положительных изменений со стороны липидного спектра, обмена сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов.

4. Включение обзидана в стандартную схему лечения абстинентного синдрома у больных опийной наркоманией нормализует липидный спектр и обмен сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов.

5. Механизм положительного влияния обзидана на липидный спектр и обмен сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов у больных опийной наркоманией, находившихся в состоянии абстинентного синдрома, связан со снижением активности фосфолипаз, угнетением процессов перекисного окисления липидов и восстановлением баланса протеиназно-ингибиторной систем крови.

154

Заключение

Использование наркотических средств, полученных путем кустарной химической обработки опия-сырца, оказывающих помимо наркотического действия также и токсическое действие, отражается на особенностях абстинентного синдрома. Все патологические механизмы, запущенные во время наркотической интоксикации имеют место и при абстиненции, тем более что эта интоксикация усугубляется токсическими метаболитами, полученными при обработке макового сырья органическими растворителями, оказывающими токсическое действие на клеточные мембраны [18].

В патогенезе опийной наркомании большое значение имеют изменения иммунологического гомеостаза, выражающиеся в большинстве случаев в нарушении клеточного звена иммунитета [51]. Функциональная активность лимфоцитов зависит от состояния биологических мембран [143].

Биологическим мембранам принадлежит ключевая роль в обеспечении и регуляции физиологической активности клеток [20, 52, 184]. В настоящее время большинство известных заболеваний рассматривают как состояния, сопряженные с поражением клеточных мембран, поскольку дестабилизация молекулярной ультраструктуры мембран при патологических процессах приводит к потере их функциональной компетентности, изменению жизнедеятельности клеток в целом и даже их гибели [39, 52].

В результате проведенных исследований нами были обнаружены изменения в липидном составе мембран лимфоцитов крови у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома, которые выражались в повышении содержания суммарной фракции ФХ + ФС, фракций СФМ, ЛФЛ и ХС и снижении содержания ФЭА, церамидов и ЭХ. Выявлено нарушение отношений ХС/ФЛ и мФЭА/оФЭА. У больных опийной наркоманией происходит повышение микровязкости мембран лимфоцитов, что связано с увеличением содержания ХС и ростом соотношения ХС/ФЛ. Изменения липидного спектра плазматических мембран лимфоцитов были более выражены у больных до начала лечения и у пациентов, находившихся на стандартной схеме лечения.

Выявленные изменения липидного состава мембран лимфоцитов крови являются одним из основных факторов, снижающих функциональную активность лимфоцитов. Это может стать причиной формирования иммунодефицита и, как следствие, присоединения инфекционных заболеваний.

В последние два десятилетия в результате многочисленных исследований было установлено, что липиды являются не только формой депонирования метаболического топлива и основной структурной компонентой клеточных мембран [4, 26, 169, 175, 200, 201, 211, 213, 226, 227, 228, 241, 246, 248, 250], но и системой биологических эффекторов, регуляторов и медиаторов, участвующих практически во всех физиологических процессах клетки [41, 65, 66, 224]. s

Особый интерес при этом представляет изучение обмена сфинголипидов. Это связано с тем, что сфингомиелин и продукты его ферментативного гидролиза играют определяющую роль в сигнальной трансдукции, регулирующей ведущие клеточные процессы - иммунный ответ, пролиферацию, рост, дифференцировку и апоптоз клеток [4, 67].

К настоящему времени установлено, что при патологических состояниях организма изменяется состав и метаболизм сфинголипидов, что приводит к нарушению структуры и функций клеток [67].

Для выявления нарушения обмена сфинголипидов была изучена активность сфингомиелиназы, содержание сфингомиелина и церамидов в плазматических мембранах лимфоцитов. Как показали наши исследования у больных употребляющих опий-сырец, обработанный уксусным ангидридом, в период абстиненции нами были обнаружены изменения, проявляющиеся в увеличении содержания сфингомиелина, снижении содержания церамидов и повышении активности сфингомиелиназы. Нарушение обмена сфинголипидов в плазматических мембранах лимфоцитов были более выражены у больных до начала лечения и у пациентов находившихся на стандартной схеме лечения.

Среди факторов, определяющих изменение активности сфингомиелиназы, является концентрация субстрата катализируемой реакции - сфингомиелина. Уровень сфингомиелина - это динамическая величина, которая определяется скоростью его синтеза de novo и скоростью его деградации под действием сфингомиелиназы. Таким образом, концентрация сфингомиелина может оставаться повышенной при увеличенной активности сфингомиелиназы, если синтез сфингомиелина de novo преобладает над его деградацией под действием фермента. Сфингомиелин и церамиды обладают разнонаправленным влиянием на различные клеточные процессы, а в регуляции митогенной активности, пролиферации, дифференцировки клеток и апоптозе даже являются антагонистами. Церамиды вызывают ингибирование протеинкиназы С и экспрессии bcl-2 (белка блокирующего апоптоз), выход кальция и активацию нуклеаз, снижают активность фосфолипазы D и модулируют активность других фосфолипаз, а также непосредственно изменяют транскрипционную активность ДНК [4, 67] и др. Данные эффекты лежат в основе антипролиферативного, противоопухолевого и других влияний церамидов. Сфингомиелин обладает противоположным эффектом на перечисленные выше внутриклеточные процессы. Накопление сфингомиелина связывают с развитием онкологических заболеваний, в отличие от церамидов, которые обладают антипролиферативным действием за счет индукции апоптоза поврежденных клеток [67].

Нарушения в обмене сфинголипидов могут приводить к дисбалансу в липидном обмене мембран лимфоцитов. Это является одним из основных факторов, обуславливающих нарушение функциональной активности лимфоцитов, формирование иммунодефицита и, как следствие, присоединение инфекционных заболеваний.

Существует 2 механизма повреждения липидов: перекисный и фосфолипазный. Известно, что эти типы повреждения липидов тесно взаимосвязаны. Окисленные фосфолипиды легче подвергаются гидролизу фосфолипазами, а фосфолипазы, в свою очередь, нарушая целостность липидного бислоя мембран, делают липиды более доступными для свободно-радикального окисления. Ведущую роль в фосфолипазном повреждении мембран играет фосфолипаза А2 [22].

В нашей работе мы опередили активность двух типов фосфолипаз: А2 и D. В результате проведенных исследований у больных опийной наркоманией в период абстиненции, нами были обнаружены увеличение активности данных фосфолипаз. Изменения активности фосфолипаз были более выражены у больных до начала лечения и у пациентов, находившихся на стандартной схеме лечения.

Причиной увеличения активности фосфолипаз может служить действие ФНО-а, основного цитокина, который вырабатывается при воспалении и обладает эффектом активации фосфолипаз. Также активация фосфолипаз при опийной наркомании может происходить в результате действия катехоламинов, выход которых в кровь возрастает при абстинентном синдроме [209]. В свою очередь активация ПОЛ может вызвать лабилизацию лизосом и способствовать высвобождению большей части популяции фосфолипаз [133]. Важную роль играет предшествующее воздействие на мембраны клеток протеолитических ферментов - трипсина, проназы, нейраминидазы, что в присутствии экзогенных фосфолипаз вызывает полное разрушение холинсодержащих фосфолипидов [198].

Продуктом гидролиза фосфолипидов фосфолипазой А2 является лизофосфатидилхолин и ненасыщенные жирные кислоты, чаще — арахидоновая [22, 98].

Лизофосфолипиды — чрезвычайно цитотоксичные вещества, способные разрывать структуру биологических мембран [120, 159]. Нами было выявлено увеличение количества лизофосфолипидов в плазматических мембранах лимфоцитов больных опийной наркоманией в состоянии абстиненции. Особенно резкое увеличение содержания лизофосфолипидов было выявлено в группе больных до начала лечения и в группе больных, находившихся на стандартной схеме лечения. Также обнаруженное нами увеличение активности фосфолипазы D может служить причиной повышенной активности сфингомиелиназы, так как продукт действия фосфолипазы D — фосфатидная кислота является активатором сфингомиелиназы [22].

В связи с тем, что процесс ПОЛ может принимать активное участие в механизмах активации фосфолипаз и сфингомиелинового цикла, в нашей работе мы определили количество конечного продукта ПОЛ - ТБК-активных продуктов, а также активность ферментов, участвующих в антиокислительной защите: каталазы и супероксидисмутазы (СОД) в плазматических мембранах лимфоцитов и сыворотке крови больных опийной наркоманией в состоянии абстиненции. В ходе работы было выявлено увеличение содержания ТБК-активных продуктов, как в сыворотке, так и в плазматических мембранах лимфоцитов у больных опийной наркоманией. При этом происходило снижение активности каталазы и СОД. Эти изменения были более выражены в группе больных до начала лечения и в группе больных находившихся на стандартной схеме лечения.

Усиление процессов ПОЛ при опийной наркомании, возможно, происходит в результате активации прооксидантных систем. Длительная активация процессов ПОЛ приводит к истощению антиоксидантных систем организма. Комплексная оценка процессов ПОЛ и сопряженной с ними антиокислительной системы позволяет заключить, что в этиопатогенезе абстинентного синдрома при опийной наркомании важную роль играет развитие окислительного стресса [137,138].

Таким образом, в ПМ лимфоцитов и сыворотке крови больных опийной наркоманией отмечались определенные изменения показателей перекисного окисления липидов. Наблюдаемое нами увеличение содержания ТБК-активных продуктов свидетельствовало об увеличении в лимфоцитах крови больных количества липопероксидов, которые нарушают клеточный гомеостаз, что, может привести к нарушению функций лимфоцитов, сопровождающихся появлением «запрещённых» клонов клеток, увеличением выработки провоспалительных цитокинов, уменьшением срока жизни клеток и т.д.

В регуляции состояния биологических мембран также принимают участие протеолитические ферменты. Уровень протеолитической активности существенно влияет на состояние клеточного метаболизма [166]. В основе деструктивных процессов, развивающихся после действия патологических факторов, лежит активация аутолиза, обусловленная избыточным содержанием лизосомальных ферментов в цитоплазме клетки.

В нашей работе было выявлено, что при опийной наркомании в состоянии абстинентного синдрома нарушается соотношение между протеиназами и ингибиторами в сторону преобладания протеолиза, что проявляется увеличением активности трипсина, снижением содержания плазминогена, появлением активного тромбина в крови и снижением активности ингибиторов протеиназ, таких как aj - ПИ, а2 - МГ и антитромбин III. Эти изменения были более выражены в группе больных до начала лечения и в группе больных, находившихся на стандартной схеме лечения. Активация ПОЛ, о которой говорилось выше, может вызвать лабилизацию лизосом и способствовать высвобождению протеолитических ферментов. Освобождающиеся в увеличенном количестве протеолитические ферменты играют важную роль в повреждении липидного бислоя мембран [133]. Протеолитические ферменты, вызывая увеличение концентрации ФНОа в крови, активируют фосфолипазы и сфингомиелиназу, так как ФНОа обладает активирующим влиянием на данные ферменты.

Выше было продемонстрировано изменение липидного состава мембран лимфоцитов, компонентов обмена сфинголипидов и механизмов, регулирующих состояние биологических мембран (процессов ПОЛ, активность фосфолипаз и протеолитических ферментов) у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома. Вероятно, целенаправленная коррекция этих изменений может изменить течение абстинентного синдрома при опийной наркомании.

Предупреждение необратимого разрушения биомембран клеток — может успешно реализоваться сочетанным или раздельным использованием факторов - ингибиторов фосфолипаз, липаз, блокаторов кальциевого канала и т. д [133]. Известно, что синдром отмены сопровождается увеличением содержания катехоламинов в крови [5]. Соединение катехоламинов с адренорецепторами приводит к увеличенному образованию цАМФ и этот "второй передатчик" активирует протеинкиназы — ферменты, фосфорилирующие белки, и прежде всего белки медленного канала транспорта Са2+ . Большие дозы катехоламинов, действуя опосредованно через аденилатциклазную систему, вызывают увеличенное вхождение в клетки Са2+, избыток которого в сочетании с избытком свободных жирных кислот приводит к разобщению окисления с фосфорилированием в митохондриях и снижению содержания АТФ в клетках. При значительном и длительном избытке эндогенных катехоламинов механизмы самоограничения адренергического эффекта могут быть сорваны. Обусловленная избытком катехоламинов активация липаз, фосфолипаз, ПОЛ, достигая чрезмерного уровня, приводит к повреждению липидного бислоя мембран, и как следствие к нарушению функционирования липидзависимых ферментов, рецепторов и каналов ионной проницаемости [133]. Эти изменения можно в значительной степени предупредить введением Р - адреноблокаторов.

Для решения этой задачи у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома к схеме стандартного лечения (клофелин, нейролептики, седативные препараты) был добавлен р — АБ обзидан (пропранолол) в дозе 20 мг/сутки. В результате было выявлено, что у больных, находившихся на стандартном лечении в комплексе с Р-АБ, нарушения в лнпидном составе мембран лимфоцитов менее выражены, что проявляется меньшим повышением уровня ХС, ЛФЛ и меньшим снижением содержания ЭХ по сравнению с аналогичными показателями группы больных, находившихся на стандартной схеме лечения абстинентного синдрома. Нарушение отношения ХС/ФЛ менее выражено. Не выявлено достоверных нарушений в содержании суммарной фракции ФХ и ФС. Показатель трансмембранной асимметрии (мФЭА/оФЭА) достоверно не изменен. Положительное влияние р-АБ обзидана на липидный спектр плазматических мембран лимфоцитов больных, находившихся на комплексном лечении вероятно можно объяснить его стабилизирующим действием на плазматические мембраны лимфоцитов. [133, 192]. У данной группы пациентов менее выражены нарушения в обмене сфинголипидов, что проявляется недостоверным изменением содержания сфингомиелина и церамидов и менее значительным увеличение активности сфингомиелиназы.

В группе больных, находившихся на стандартном лечении в комплексе с Р-АБ, изменения активности процессов ПОЛ были менее выражены, а активность антиоксидантных ферментов достоверно не изменялась по сравнению с группой контроля. Ингибирование ПОЛ приводит к снижению активности фосфолипазы А2 и фосфолипазы D [133], которое мы наблюдали в группе больных, находившихся на комплексном лечении.

В данной группе больных изменения активности протеолитических ферментов и их ингибиторов, по сравнению с группой больных, находившихся на стандартном лечении, менее выражены. Так было обнаружено менее значительное увеличение активности трипсина и в меньшей степени было снижено содержание плазминогена и антитромбина III, а активность а2 — МГ и aj — ПИ достоверно не отличалась от аналогичных показателей в группе здоровых доноров.

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что применение р-АБ обзидана в дозе 20 мг/сутки в комплексе со стандартной терапией на фоне абстинентного синдрома при опийной наркомании может существенно нормализовать показатели липидного спектра, обмена сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов и механизмов регулирующих состояние биологических мембран (перекисное окисление липидов, активность фосфолипаз и активность протеолитических ферментов крови).

Схема на рис. 15 резюмирует выше изложенные данные о патогенезе повреждения липидного спектра клеточных мембран при абстинентном синдроме у больных опийной наркоманией.

Рис. 15. Схема патогенетической цепи нарушения липидного спектра клеточных мембран при абстинентном синдроме у больных опийной наркоманией. Примечание: выделенные пункты — обнаруженные автором сдвиги.