Механизмы образования и антигенсвязывающие свойства бифункциональных моноклональных антител

Дмитриев, Александр Дмитриевич

Диссертации по медицине → Аллергология и иммулология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Механизмы образования и антигенсвязывающие свойства бифункциональных моноклональных антител

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Дмитриев, Александр Дмитриевич Москва 2003 г.

Ученая степень: доктора биологических наук

ВАК РФ: 14.00.36

Автореферат диссертации по медицине на тему Механизмы образования и антигенсвязывающие свойства бифункциональных моноклональных антител

На правах рукописи

Дмитриев Александр Дмитриевич

МЕХАНИЗМЫ ОБРАЗОВАНИЯ И АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ СВОЙСТВА БИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Специальность - аллергология и иммунология (14.00.36)

Москва, 2003 г.

Работа выполнена в ГУ Научном центре психического здоровья Российской академии медицинских наук

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор A.A. Михайлова доктор биологических наук, профессор В.А. Исаченков доктор медицинских наук, профессор A.A. Ярилин

Ведущая организация: ГУ Научно-исследовательский институт

вирусологии им. Д.И. Ивановского Российской академии медицинских наук

Защита состоится 14 ноября 2003 г. в 11 часов на заседании специализированного совета Д 001.007.01 при ГУ Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН по адресу: 123098 Москва, ул. Гамалеи, 18

Автореферат разослан " $ " октября 2003 г.

Ученый секретарь специализированного ученого совета доктор медицинских наук, профессор

ff^

Е.В. Русакова

L>oo?-ft

I. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Наряду с обычными моноклональными антителами (МКА)1 гибридомная технология позволяет получать биспецифические антитела (БИАТ), несущие места связывания двух различных антигенов [Milstein С., Cuello А.С., 1983]. Для получения клонов-продуцентов БИАТ (квадром, тетрадом или триом) сливают две гибридомы (или, в другом варианте, гибридомы и иммунные лимфоциты), которые секретируют различные МКА. В гибридных гибридомах синтезируются легкие (L) и тяжелые (Н) цепи родительских АТ и происходит их рекомбинация, в результате чего может образовываться до десяти видов АТ, включая БИАТ (рис. 1, А). Несмотря на кажущуюся простоту описанного механизма, многие аспекты процесса образования АТ в квадромах остаются неизученными. Прежде всего, это касается факторов, определяющих качественный и количественный состав АТ, секретируемых гибридными гибридомами. Исследования по изучению связывания Н и L цепей in vitro [De Preval С., Fougereau M., 1976; Hamel Р. A. et al., 1986; Hamel Р. A. et al., 1987] свидетельствуют, что легкие цепи от двух разных антител могут конкурировать за связывание с одной тяжелой цепью, причем аффинности при связывании могут отличаться более чем на порядок. Таким образом, связывание легких цепей с тяжелыми может быть как случайным (при одинаковой аффинности легких цепей в отношении тяжелой), так и предпочтительным (если одна из легких цепей демонстрирует более высокую аффинность в отношении тяжелой цепи). Подобные механизмы ассоциации легких и тяжелых цепей могут иметь место и в гибридных гибридомах [Milstein С., Cuello А.С., 1984]. Важнейшим фактором, влияющим на состав АТ (и долю БИАТ), является, по-видимому, способ ассоциации L и Н цепей в гибридных клетках. При случайной рекомбинации должно образовываться много гетерологичных H-L пар, в которых L и Н цепи происходят от разных родительских АТ (см. рис. 1, А; варианты VIII-X). Как правило, плечо АТ,

--. .-ÜC. НАЦИОНАЛЬНАЯ

Список использованных сокращений приводится на стН. 50. БНБЛ ИОТЕКА I

¿"•»f I

А. СЛУЧАЙНАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ ЛЕГКИХ И ТЯЖЕЛЫХ ЦЕПЕЙ

Бифункциональные антитела // ^

II Ш IV

Антитела к антигену 1

V VI VII

Антитела к антигену 2

• \ // (/ % //

VIII IX X

Неактивные антитела

Б. ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНАЯ АССОЦИАЦИЯ ГОМОЛОГИЧНЫХ Ь-Н ЦЕПЕЙ

( У

Анти-АГ.

БИАТ

Анти-АГг

В. ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНАЯ АССОЦИЦИЯ Н-Ь ЦЕПЕЙ У АНТИТЕЛ К АНТИГЕНУ I

Анти-АГ1 БИАТ Неактивные АТ Анти-АГ2

Рисунок 1. Изоформы антител, образуемых гибридными гибридомами при различных типах ассоциации легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов

образованное сочетанием гетерологичных H-L цепей, не обладает АГ-связывающей активностью. В противоположность этому, предпочтительная ассоциация гомологичных L и Н цепей (то есть, цепей, происходящих от одного родительского МКА), теоретически, должна способствовать более высокому выходу БИАТ. Изучение взаимодействия L и Н цепей в квадромных клетках и продуктов этого взаимодействия - квадромных АТ, осложняется недостаточной разработкой методов анализа иммуноглобулинов, образуемых гибридными гибридомами. Секретируемые антитела представляют собой смесь близких по молекулярному весу и физико-химическим свойствам молекул, поэтому их анализ оказывается достаточно сложной задачей. В особенности это относится к количественным аспектам популяций квадромных АТ, которые практически не анализировались. Вместе с тем, вопрос о том, какой тип ассоциации цепей превалирует в квадромах, и как это отражается на составе секретируемых АТ, представляет большой теоретический и практический интерес. В теоретическом плане этот вопрос тесно связан с проблемой разнообразия АТ. Известно, что одним из факторов, определяющих разнообразие антител, является характер ассоциации L и Н цепей. Сформулирована гипотеза о том, что предпочтительная ассоциация гомологичных L и Н цепей может быть следствием процессов, направленных на отбор высокоаффинных H-L пар во время созревания В-клеток "in vivo" [De Preval С., Fougereau M., 1976]. Существование такого механизма предполагает значительное уменьшение числа потенциально возможных "природных" АТ за счет ограничения H-L комбинирования в популяциях лимфоцитов. С практической точки зрения важно то, что предпочтительная ассоциация повышает эффективность квадром как продуцентов БИАТ.

высокоаффинных антигенсвязывающих сайтов [Hamel Р. A. et al., 1986,1987]. Таким образом, если соотнести тип ассоциации Н и L цепей (случайный или предпочтительный) с аффинностью антигенсвязывающих сайтов антител, то можно подтвердить или опровергнуть высказанную гипотезу.

Теоретически, родительские MICA и соответствующее плечо БИАТ имеют одинаковую структуру АГ-связывающих центров (см. рис. 1) и, как следствие, должны проявлять одинаковые АГ-связывающие свойства. Вместе с тем, продемонстрирована возможность сохранения АГ-связывающей активности при сочетании гетерологичных H-L цепей. Образовавшийся при этом АГ-связывающий сайт сохраняет активность AT, от которых происходит Н цепь; правда, аффинность таких AT значительно уменьшается [Hudson N. W. et al., 1987]. Это может приводить к возникновению "аномальных" БИАТ с измененными АГ-связывающими центрами. Кроме того, в рекомбинантных AT могут наблюдаться нарушения гликозилирования иммуноглобулиновых цепей и конформационные изменения, влияющие на связывание с АГ. Таким образом, встает вопрос: в какой мере АГ-связывающие центры БИАТ, получаемых с помощью биологического метода, сохраняют аффинность родительских AT. Сведения об этом весьма ограничены: подробное исследование АГ-связывающих свойств БИАТ, полученных с помощью гибридизации клеток, было проведено в единственной работе [Allard W. J. et al., 1992].

Антитело Антиген

Бифункциональное

Рисунок 2. Связывание моноклональных (монофункциональных) и бифункциональных антител с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе.

а - моновалентное связывание антител с иммобилизованным антигеном; б - бивалентное связывание антител с иммобилизованным антигеном; в - связывание бифункциональных антител с иммобилизованным антигеном (может быть только моновалентным).

любом варианте связывания с иммобилизованным антигеном обычные МКА должны быть результативнее БИАТ. Однако большой массив публикаций свидетельствует о высокой эффективности БИАТ в иммуногистохимии, иммуноблоттинге и при взаимодействии со злокачественными клетками. Вместе с тем, отсутствуют теоретические работы, в которых бы корректно сравнивались свойства моновалентных (т.е. БИАТ) и бивалентных антител (обычных МКА) при связывании с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе. Следовательно, утверждения о высокой эффективности БИАТ в сравнении с обычными МКА представляются весьма спорными. На наш взгляд, для окончательного вывода требуется сравнительный анализ эффективности связывания МКА и БИАТ, несущих тождественные сайты связывания с АГ, с иммобилизованным антигеном. Кроме того, необходим сравнительный анализ эффективности детектирующих моноклональных АТ (конъюгатов) и БИАТ, несущих сайт связывания с ферментом, в твердофазном ИФА.

Итак, актуальным является анализ механизмов образования АТ в гибридных гибридомах и изучение АГ-связывающих свойств БИАТ как в растворе, так и при взаимодействии с иммобилизованными антигенами. В

настоящей работе предпринята попытка исследовать некоторые из этих вопросов, используя панель тетрадом, продуцирующих антитела к антигенам, которые значительно отличаются по структуре и молекулярному весу. Анализируемые МКА и БИАТ несли сайты связывания со следующими АГ: эндорфином (Мг»1600), миоглобином (14*18600), пероксидазой хрена (М,а40000) и человека (М^160000).

Целя и задачи исследования. Цель настоящей работы - анализ взаимодействия БИАТ с антигенами (как в растворе, так и при иммобилизации АГ на твердой фазе), а также разработка экспериментальных подходов, позволяющих проводить количественный и качественный анализ продуктов секреции гибридных гибридом и расшифровывать способ ассоциации Ь и Н цепей в гибридных клетках.

В задачи работы входило:

I. Проанализировать характер ассоциации легких и тяжелых цепей антител (случайный или предпочтительный), синтезируемых гибридными гибридомами. Для определения типа ассоциации легких и тяжелых цепей:

1) Разработать теоретические модели рекомбинации Ь и Н цепей в гибридных гибридомах, позволяющие предсказывать типы антител, образуемых квадромой, в зависимости от способа ассоциации (случайного или предпочтительного) легких и тяжелых цепей.

2) Количественно проанализировать продукты секреции квадромы, (бифункциональные антитела, антитела к каждому из антигенов и неактивные антитела (рис. 1, А)), разработав методы фракционирования антител и их количественного анализа.

3) Определить цепьевой состав антител, продуцируемых квадромами (легкие и тяжелые цепи антител), с помощью двумерного электрофореза.

4) Путем сопоставления экспериментальных и теоретических распределений антител и результатов электрофоретического анализа цепьевого состава антител определить способ ассоциации Ь и II цепей в квадромных клонах.

П. Соотнести истинную аффинность родительских антител и аффинность тождественных антигенсвязывающих сайтов бифункциональных антител:

1) Определить истинную аффинность (равновесную константу ассоциации в растворе) при взаимодействие бифункциональных антител с антигенами различного молекулярного веса в растворе. Сравнить аффинность родительских антител с аффинностью тождественного антигенсвязывающего сайта биспецифических антител.

2) Определить, каким образом избыток одного из антигенов влияет на связывание бифункциональных антител со вторым антигеном в растворе и, таким образом, сделать вывод о наличии (или отсутствии) кооперативного эффекта при взаимодействии антител с антигенами.

3) Соотнести тип ассоциации Н и Ь цепей (случайный или предпочтительный) в антигенсвязывающих сайтах антител с аффинностью этих антигенсвязывающих сайтов и подтвердить (или опровергнуть) гипотезу о том, что предпочтительная ассоциация гомологичных Н и Ь цепей приводит к образованию высокоаффинных антигенсвязывающих сайтов.

Ш. Для определения типа взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентное или бивалентное) апробировать новую модель: соотнести параметры связывания родительских антител и тождественного антигенсвязывающего сайта бифункциональных антител. Для анализа характера взаимодействия использовать антитела к антигенам различного молекулярного веса и структуры: миоглобину (М^18600), пероксидазе хрена (М,«40000) и человека (М^ 160000). Для определения характера

взаимодействия антител с сорбированным антигеном использовать как традиционные методы (радиоиммунологический и твердофазный ИФА), так и анализ с помощью оптического биосенсора ТАэуБ. Соотнести результаты, полученные обоими методами.

детектирующих молекул в твердофазных тестах (твердофазный иммуноферментный анализ и сэндвич-метод).

Научная новизна и научно-практическая значимость исследования.

В результате проведенного исследования были впервые количественно проанализированы популяции антител, синтезируемых квадромой. Также впервые проведен анализ H-L состава квадромных антител с помощью двумерного электрофореза в полиакриламидном геле. Для БИАТ со специфичностью анти-ЭНД/ПХ убедительно доказано наличие гомологичного предпочтения в одной из H-L пар и случайную рекомбинацию в другой. Разработанные в настоящей работе оригинальные экспериментальные подходы и теоретические модели расширяют возможности анализа квадромных антител и механизмов, управляющих образованием этих антител в квадромных клетках. Кроме того, анализ аффинности БИАТ, образованных квадромой, показал, что истинная аффинность любого антигенсвязывающего сайта БИАТ нашей панели тождественна истинной аффинности соответствующих антигенсвязывакмцих сайтов родительских антител. Продемонстрировано отсутствие кооперативного эффекта при связывании БИАТ с антигенами. На панели бифункциональных антител показано, что избыток одного из антигенов не влияет на связывание (аффинность) БИАТ со вторым антигеном. Впервые продемонстрировано in vivo (на уровне тетрадом, синтезирующих антитела), что предпочтительная ассоциация гомологичных H-L цепей АТ не приводит к образованию высокоаффинных антигенсвязывающих сайтов.

как классическими методами (радиоиммунологическим и твердофазным ИФА), так и с помощью оптического биосенсора ТАяуэ. Показано, что оба метода дают идентичные результаты. Сделан вывод о перспективности биосенсорных систем для оценки взаимодействия антител с антигеном.

Впервые проведен сравнительный анализ эффективности двух типов меченых молекул антител: антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (традиционного конъюгата) и бифункциональных антител, несущих тождественный сайт связывания с тестируемым антигеном и пероксидазой хрена (БИАТ, как меченые молекулы часто называют конъюгатами нового поколения). Сделан вывод об относительной неэффективности БИАТ, как меченых молекул в твердофазных тестах. Доказано, что наиболее корректной моделью для оценки наличия (или отсутствия) бивалентного связывания МКА с иммобилизованным антигеном является сравнительный анализ ассоциации родительских МКА и соответствующего АГ-связывающего сайта БИАТ. Сделан вывод об относительной неэффективности БИАТ, как меченых молекул в твердофазных тестах. Полученные результаты могут представлять интерес для возможного использования этого нового класса биомолекул.

Апробация работы. Основные положения работы были дважды доложены на конференции лаборатории иммунохимии Онкологического научного центра РАМН (руководитель лаборатории академик РАН, профессор Абелев Г.И.)

По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ: тезисы, семнадцать статей в рецензируемых журналах и одна статья в сборнике.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 176 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, методы исследования, результаты, обсуждение результатов, список литературы (120 источников) и выводы. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами, и двадцатью тремя рисунками.

П. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПЛ. Клеточные линии, использованные в исследовании

В качестве источников моноспецифических и биспецифических АТ

использовали панель гибридом и тетрадом, полученных в лаборатории нейроиммунологии НЦПЗ РАМН под руководством Ю.С. Массино. Специфичность продуцируемых АТ и их изотипы приведены в таблице 1.

Таблица 1. Характеристика антител использованных в работе

Клеточная линия Изотип антител Специфичность антител

Гибридомы родители

40Е9 36Б9 7505 1306 14Б6 18Н2 ДОа 1801 1£С1 1801 Антиэндорфин (ЭНД) Антипероксидаза (ПХ) Анти-^в человека (И^в) Антимиоглобин (Мб) Антимиоглобин (Мб) Антимиоглобин (Мб)

ТЕТРАДОМЫ

40Е9х36Р9 7505х36Р9 14В6х36Б9 1ё01ЛёС1 Анти-ЭНД/анти-ПХ Aнти-hIgG/aнти-ПX Анти-Мб/анти-ПХ

П.2. Ассоциация легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов в квадромных клетках

Известно, что в гибридных гибридомах гомологичные (принадлежащие одному родительскому АТ) Ь и Н цепи антител могут ассоциироваться как предпочтительным, так и случайным образом. Таким образом, тип ассоциации Ь и Н цепей во время сборки молекул иммуноглобулинов является важнейшим фактором, который определяет спектр антител, образуемых квадромами. Как правило, функционально активные АГ-связывающие сайты антител образуются при ассоциации гомологичных легких и тяжелых цепей; плечо, образованное сочетанием гетерологичных Н-Ь цепей обычно неактивно. Таким образом, если в квадромах гомологичные Н-Ь цепи ассоциируются предпочтительным образом, то можно ожидать более высокого выхода БИАТ, чем при случайной рекомбинации Н и Ь цепей. В последнем случае большинство молекул антител будет иметь одно или два неактивных плеча (рис. 1, А; варианты III, IV, \Т-Х). Рассмотрим модели, которые позволяют предсказать выход

различных типов антител с учетом способа ассоциации цепей и относительной скорости синтеза Н и Ь цепей в тетрадоме.

Модель I. Случайная рекомбинация легких и тяжелых цепей. Такие квадромы образуют десять изоформ АТ, показанных на рисунке 1, А. Доля каждого вида антител в общем пуле молекул может быть определена произведением долей соответствующих Н-Н и Н-Ь комбинаций, которые приводят к образованию данного типа антител. Если сочетание гетерологичных Н-Ь пар не приводит к формированию активного антигенсвязывающего сайта, эти изоформы могут быть разделены на четыре группы, которые отличаются специфичностью антител: БИАТ, анти-АГ1, анти-АГ2 и неактивные антитела (АГ1 и АГ2 - обозначение антигенов к которым образуются родительские АТ). Доли упомянутых типов АТ могут быть рассчитаны с помощью следующих формул (вывод формул подробно описан в диссертации):

i Р(биат) у 1 =2Ы:[(1 +И)2х(1 +|)2] Ь=[Н2]:[Н1]

и Р(анти-АГ1) у2=(1+2Ь+21):[(1+Н)2х(1+|)2] 1=[12]:[И]

Ш Р(анти-АГ2) уЗ=(11212+21"121+2Ы2):[(1+|1)2х(1+|)2]

IV р^ивныя^с) у4=(И+1)2:[(1 +И)2х(1 +|)2]

V Суммарный 1§С у1+у2+уЗ+у4=1

Модель II. Тяжелые цепи проявляют абсолютную

предпочтительность по отношению к гомологичным ЬиН цепям. В этом случае квадромы образуют только три вида антител: БИАТ, анти-АГ1 и анти-АГ2 (рис. 1, Б). При условии, что Н-Н пары образуются случайным образом, а ЬиН цепи синтезируются в эквимолярных количествах, распределение АТ может быть выражено следующим образом:

I Р(БИАТ) у1=2хр(н1Л.1)хр(н2^2)=2хр(н1)хр(н2)=2Ь:(1+И)2 Ь=[Н2]:[Н1]

II Р(анти-АГ1) У2=Р(Н1/11)ХР(Н1/и)=Р<Н1)хР(Н1)=1-'(1+Ь)2

III Р(аиги-АГ2) УЗ=Р(Н2/12)ХР(Н2/12)=Р(Н2)ХР(Н2)=Ь2:(1+Ь)2

IV Суммарный у1+у2+уЗ=1 1&0

Модель III. Гомологичное предпочтение в одной Н-Ь паре. В этом случае Н цепи одного родительского АТ проявляют абсолютное предпочтение к гомологичным Ь цепям, в то время как Н цепи другого родительского АТ могут ассоциироваться как с гомологичными, так и с гетерологичными Ь цепями. Такие квадромы образуют шесть изоформ АТ (рис. 1, В) при условии абсолютно предпочтительной ассоциации Н и Ь цепей антител к антигену 1. Для простоты модели допустим избыточный синтез Ь цепей: в этом случае образование Н-Ь пар не изменяет существенным образом относительные доли Ь1 и Ь2 цепей во внутриклеточном пуле легких цепей. Доли антител различной специфичности в общем пуле молекул Гцв, образованных квадромной клеткой, будут описываться следующими выражениями (избыточные легкие цепи не учитываются): I Р(биат) у1 =2Ь:[(1 +Ь)2х(1 +!)] Ь=[Н2]:[Н1]

и Р(аиги-АГ1) у2=[1+21]:[(1+Ь)2х(1+|)2] 1=[1-2]:[1_1]

III р(анти-АГ2) уЗ=[1"|(21+Ь+М)]:[(1+1п)2х(1 +1)]

IV р(неакт. антитела) у4=|2|[(1+И)2х(1+|)2]

V Суммарный ДО у1+у2+уЗ=1

В таблице 2 представлены примеры теоретически возможных количественных распределений антител для описанных моделей. Очевидно, что кроме рассмотренных крайних случаев полной свободы Н-Ь рекомбинирования и полного его ограничения в реальных квадромах возможны также различные промежуточные ситуации относительного предпочтения. Из описанных моделей следует, что при случайной рекомбинации Ь и Н цепей выход БИАТ не может превышать 1/7 общего квадромного 1§в (табл. 2; этот максимум достигается при равном синтезе родительских цепей: [Н]=[Ь]=1). Кроме того, в условиях свободного рекомбинирования Н и Ь-цепей отношение БИАТ/неактивных АТ не может превышать 0,5 (табл. 2, вариант 1). Предпочтительная ассоциация гомологичных Ь и Н цепей должна приводить к более высокому выходу БИАТ (примеры 3-6 в табл. 2). Для оценки типа рекомбинации цепей АТ,

Таблица 2. Расчетные количества ^О, продуцируемого гипотетическими квадромами с различным типом ассоциации Ни Ь цепей в процессе сборки молекул иммуноглобулинов в клетках квадромы

Гипотетические квадромы (№) Квадрома 1 Квадрома 2 Квадрома 3 Квадрома 4 Квадрома 1 Квадрома 5 | 6

Вид Н-Ь Случайная ассоциация Н и L цепейг Предпочтительная ассоциация Н и Ь Предпочтительная ассоциация Н и Ь цепей в одной гомологичной Н-Ь пареж

ассоциации цепей в обеих Н-Ь парах"

Продукция цепей Эквива- Неэквива- Эквива- Неэквива- Эквива- Неэквива-

родительских лентная лентная лентная лентная лентная лентная

1!а 1 2,5 1 4 1 1,5

I9 1 2,5 1 4 1 1,5

Состав IgG квадромы (%):

I БИАТ 12,5 8,3 50,0 32,0 25,0 19,2

II Анти-АП6 31,25 7,3 25,0 4,0 18,75 юа

III Анти-АГ2й 31,25 67,7 25,0 64,0 50,0 64,8

IV Неактивные AT" 25,0 16,7 0 0 6,25 5,8

V Общий IgG (i+n+m+iv) 100 100 100 100 100 100

Отношения:

анш-АП ¡анга-АГг 1:1 1:10 1:1 1:16 1:2,7 1:6

БИАТ: (сумма других АТ)Ж 1:7 1:11 1:1 1:2 1:3 1:4

БИАТ: неактивные АТ 1:2 1:2 50:0 32:0 4:1 3:1

а Отношения внутриклеточных концентраций Н цепей от разных родителей. Ь = [Н2] / [Н1], где [Н2]>[Н1]. 1 - то же для Ь цепей. 1 =[Ь2] / [Ы], где [Ь2]>[Ь1]. 6 Специфичность МКА, продуцируемых родительскими гибридомами.

в Полагаем, что гетерологичные Н-Ь пары (Н1-Ь2 и Н2-Ы) не образуют активных антигенсвязывающих сайтов.

г В квадромах № 1 и № 2 две родительские тяжелые цепи (Н1 и Н2) рекомбинируют случайным образом с легкими цепями (Ь1 и Ь2). Н-Н соединение также случайно (рис.1, А).

д В квадромах № 3 и № 4 Н1 цепи ассоциируют только с Ы цепями и Н2-только с Ь2 . Иллюстрация на рис.1, Б. Н-Н связывание случайно. Ы и Ь2 цепи, согласно допущению, синтезируются в избытке над Н1 и Н2,соответственно, или в примерно эквимолярном им количестве.

е В квадромах № 5 и № 6 Н2 цепи ассоциируют случайно с Ы и Ь2 цепями, но Н1 ассоциирует только с Ы (рис.1, В). Н-Н связывание случайно. Ы и Ь2 цепи, согласно допущению, синтезируются в избытке над Н| и Н2 цепями, соответственно.

ж Сумма анти-АГ1, анти-АГ2 и неактивных АТ (П+ПШУ).

Таблица 3. Количественный состав антител, образуемых квадромными клонами, продуцирующими бифункциональные антитела со специфичностью антиэндорфин/антипероксидаза___

Фракция антител 1 Клон 56А9 Клон 56Е8 Khoh57F9

мкг2 °/0 мкг3 %2 мкг2 %J

I Бифункциональные антитела 83,2±7,0 34,2 67,0+6,3 28,9 34,7±0,9 19,0

II Антиэндорфиновые антитела 16,1±2,8 6,6 10,2±0,5 4,4 13,1+0,7 7,2

III Антипероксидазные антитела 132,8±1,1 54,6 147,2±8,1 63,3 128,2±6,8 70,3

IV Неактивные антитела 11,2±0,1 4,6 7,9±0,6 3,4 6,5±0,7 3,5

Суммарный IgG i+n+ni+iv 243,3 100 232,2 100 182,3 100

Суммарный IgG определяемый экспериментально 243,5+36,1 217,5±34,5 не определяли

Отношения субфракций антител

Отношение: анти-ЭНД/анти-ПХ II/III 1:8 1:14 1:10

Отношение: БИАТ/(сумма других AT) BHAT/(II+ni+IV) 1:2 1:2,5 1:4

Отношение: БИАТ/Неактивные AT MV 7:1 8,5:1 5:1

Квадромные супернатанты разделяли с помощью аффинной хроматографии" на 4 фракции: бифункциональные антитела (I), антиэндорфиновые антитела (II), антипероксидазные антитела (1П) и неактивные антитела (IV). Концентрации AT в полученных фракциях и в нефракционированных супернатантах были определены радиоиммунологическим методом.

2 Концентрации антител даны в расчете на 1 мл культурального супернатанта квадром; мкг, М±т, п=3.

3 процентное содержани AT относительно общего IgG (I+II+III+IV).

продуцируемых квадромой 40Е9х36Р9 (анти-ЭНД/ПХ) нами были количественно определены фракции квадромных антител трех квадромных клонов. В результате фракционирования культуральных супернатантов на ЭНД-сефарозе и ПХ-сефарозе были получены фракции БИАТ,

антиэндорфиновых АТ, антипероксидазных АТ и неактивных АТ. Содержание каждой из субфракций определялось радиоиммунологическим методом. Результаты количественного определения приведены в таблице 3. Все три квадромных клона секретируют относительно высокие количества антипероксидазных АТ: 54,6% - 70,3% от общего количества Доля антиэндорфиновых АТ была на порядок меньше: 4,4% - 7,2%. Концентрация БИАТ в культуральной среде варьировала от 34,7 до 83,2 мкг/мл, что составляло 19% - 34% суммарного Неактивные АТ составляли 3,4% -4,6% суммарного ^О квадромы. Если полученные экспериментальные распределения антител соотнести с теоретически ожидаемыми, то можно видеть, что выход БИАТ в изученных нами клонах (19 - 34%) в 1,5 - 2,7 раза выше максимального теоретически возможного значения (12,5%) для модели случайной рекомбинации Ь и Н цепей. Это отклонение особенно велико в клонах 56А9 и 56Е8. Таким образом, возможность случайной ассоциации Н-Ь цепей в изученных клонах представляется крайне маловероятной (р<0,001 согласно критерию %2). Экспериментально полученные распределения антител не соответствуют гипотезе о случайном характере Н-Ь ассоциации и по другому параметру - отношению БИАТ и неактивных АТ (табл. 2, пример 1). Экспериментальное значение этого параметра варьировало от 5 до 8, что на порядок выше теоретического максимума для данной модели, который равняется 0,5. Полученные нами экспериментальные распределения АТ возможны как при предпочтительной ассоциации гомологичных Ь и Н цепей в гибридных гибридомах (табл. 2 , модель II, примеры 3, 4), так и при гомологичном предпочтении в одной Н-Ь паре (табл. 2, модель III, примеры 5,6).

Для уточнения характера ассоциации Н и Ь цепей в квадромах мы проанализировали фракции квадромных антител с помощью двумерного электрофореза в ПААГ (рис. 3). Этот метод позволил однозначно различить Ь цепи обоих родительских АТ: каждая цепь образует по два четких изоэлектрических варианта (рис. 3, а, б). Во фракции БИАТ обнаруживаются Ь цепи обоих родительских АТ (рис. 3, в). Наряду с этим Ь цепи обоих

■шг*

L, . *

, 4» Н

гг

'К,

" .«г

----—

г Рисунок 3. Анализ легких и тяжелых цепей антител, продуцируемых родительскими гибридомами и полученной из них тетрадомой с помощью двумерного электрофореза.

а - родительские антиэндорфиновые антитела; б - родительские Д- антипероксидазные антитела; в - биспецифические антитела • антиэндорфин/антипероксидаза, ' продуцируемые тетрадомой; • 1 г - антиэндорфиновая фракция квадромных антител;

д - антипероксидазная фракция квадромных антител.

Щелочная область

Кислая область

родительских AT обнаруживаются и в антипероксидазной фракции квадромных AT (рис. 3, д). В антиэндорфиновой фракции квадромных AT обнаруживаются только пятна, соответствующие L цепи антиэндорфиновых AT (рис. 3, г). На наш взгляд, полученные результаты свидетельствуют в пользу предпочтительной ассоциации Н и L цепей антиэндорфиновых AT. Тяжелые цепи антипероксидазных AT, по-видимому, свободно ассоциируются как с гомологичными, так и с гетерологичными L цепями. Таким образом, в анализируемой нами квадроме анти-ЭНД/ПХ имеет место распределение AT, соответствующее теоретической модели III (гомологичное предпочтение в одной H-L паре). Это заключение основано на предположении, что сочетание гетерологичных Н и L цепей не образуют активного антигенсвязывающего сайта.

Таким образом, на примере проанализированного нами распределения антител в квадроме анти-ЭНД/ПХ, наглядно вдцно, что как предпочтительный, так и случайный характер ассоциации Н и Ь цепей может иметь место в гибридных гибридомах.

11.3. Антигенсвязывающие свойства бифункциональных антител Теоретически, родительские МКА и соответствующее плечо БИАТ имеют одинаковую структуру АГ-связывающих центров (см. рис. 1) и, как следствие, должны проявлять одинаковые АГ-связывающие свойства. Однако продемонстрирована возможность сохранения АГ-связывающей активности при сочетании гетерологичных Н-Ь цепей. Таким образом, встает вопрос: в какой мере АГ-связывающие центры БИАТ, получаемых с помощью биологического метода, сохраняют аффинность родительских АТ. Вместе с тем, молекула АТ несет два АГ-связывающих сайта и может связываться с антигеном, адсорбированным на твердой фазе, как одним АГ-связывающим сайтом (моновалентно), так и двумя АГ-связывающими сайтами одновременно (бивалентно). В противоположность этому, молекула БИАТ может связываться с адсорбированным АГ только моновалентно. Очевидно, что бивалентное связывание с антигенами существенно эффективнее, чем моновалентное. Мы рассмотрим теоретические основы анализа антигенсвязывающих свойств АТ в растворе и при связывании с иммобилизованным АГ.

П.3.1. Теоретические основы анализа связывания антител с антигеном 11.3.1.1. Анализ равновесного связывания антител с антигеном в растворе

В растворе равновесная константа ассоциации (Ка5Ч) взаимодействия антитело-антиген (когда употребляют термин аффинность подразумевают именно этот параметр) описывается следующим образом:

К =-- (М"1) (1),

355 ([АЬ]0-[В])([Аё]0-[В])"

где [АЬ]0 - общая концентрация антител, (М); [В] - концентрация связанных

антител, (М); [А§]0 - общая концентрация антигена, (М). При этом обычно не учитывается то обстоятельство, что молекула антитела (изотипов ^в) несет два антигенсвязывающих сайта. Однако истинной аффинностью связывания считается равновесная константа ассоциации одного антигенсвязывающего сайта антитела и антигена.

Различные преобразования уравнения (1) используют в часто применяемых математических формах анализа данных по взаимодействию антитело-антиген. Наиболее известен метод Скэтчарда [БсаиЛагс! в., 1949] (координаты [В]/[Т] от [В]), в котором для представления экспериментальных данных используют уравнение:

^| = Ка8ЛАЕ]0-Ка8ЛВ], (2),

[Р]

где [Б] - концентрация свободных антител, иногда обозначаемая [АЬ], (М), [Р]=[АЬ]=[АЬ]0-[В]. Иногда данные представляют в более простой форме - в виде кривых связывания, в координатах [В] от [АЬ]0. При низких значениях [В] (следовательно [А§]0»[В]) уравнение 1 может быть преобразовано:

И^Г^А [АЬ]0 (3)

П.3.2. Анализ равновесного связывания антител с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе

Молекула бивалентна и при определенных условиях способна связываться одновременно с двумя антигенами, иммобилизованными на твердой фазе. Однако для количественной характеристики взаимодействия МКА с иммобилизованным антигеном используется упрощенная модель. В этой модели взаимодействие антитело-антиген рассматривается как гомогенный, равновесный, одноступенчатый процесс с однородной валентностью связывания. При этих допущениях применяется уравнение 1. Координаты [В] от[АЬ]0 (уравнение 3) часто используют в твердофазном ИФА, причем концентрацию связанных антител ([В]) представляют не в концентрационных единицах молярности, а в пропорциональных им оптических единицах. При этом величина тангенса угла наклона кривой

связывания пропорциональна коэффициенту Каз5[А§]о/(1+Ка55[А§]о).

П.3.2.1. Модель бивалентного связывания антител с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе

В реальности, на поверхности твердой фазы может существовать смесь бивалентно и моновалентно связанных молекул МКА. В этом случае твердофазные методы оценивают авидность (кажущуюся аффинность) МКА при данных условиях эксперимента, а не истинную аффинность отдельно взятого антигенсвязывающего сайта антитела к данному эпитопу антигена. Схематически взаимодействие антитела с антигеном изображено на рис. 4. Процесс моновалентного связывания характеризуется равновесной константой (К^:

к-1 2[АЬ][А§]з

где к! - кинетическая константа ассоциации между антигенсвязывающим сайтом антитела и антигеном (М"'с-1); к_1 - кинетическая константа диссоциации моновалентного комплекса (с"!). Процесс превращения бивалентного комплекса в моновалентный характеризуется равновесной константой К2 (уравнение 5):

К2 = — = 2[АЬАе2]5 , (см2/моль) (5),

к-2 [АЕ]з[АЬА&]5

где к2 - кинетическая константа превращения моновалентного комплекса в бивалентный (см2моль"'с"'); к.2 - кинетическая константа диссоциации между бивалентным и моновалентным состоянием антител (с'1). Статистический фактор два возникает из-за того, что на первой стадии может связываться с антигеном любым своим плечом, в то время как диссоциировать только одним; на второй стадии верно обратное утверждение. Для БИАТ вторая стадия реакции, представленной на рис. 4, невозможна, и статистический фактор равен единице, так как к данному антигену у них есть только один сайт связывания.

Теперь совместим модель бивалентного связывания (уравнения 4 и 5) с

Антитело

Антиген 4

/Твердая фаза

Рисунок 4. Схема моновалентного и бивалентного связывания молекул антител с иммобилизованным антигеном.

моделью уравнения 1, в которой взаимодействие антиген-антитело рассматривается как равновесный, одноступенчатый процесс с однородной валентностью связывания. Тогда выражение для наблюдаемой равновесной константы ассоциации (К0ьз) будет иметь следующий вид:

где к^ - наблюдаемая кинетическая константа ассоциации (М"'с''); kdlss -наблюдаемая кинетическая константа диссоциации (с"1).

Значение истинной равновесной константы ассоциации (Ki) в твердофазных методах можно измерить с помощью моновалентных БИАТ (или их аналогов - Fab фрагментов). На основании сравнения параметров калибровочных кривых и графиков Скэтчарда, полученных с бивалентными МКА и моновалентными БИАТ, можно, как будет показано ниже, обнаружить наличие бивалентного связывания родительских МКА с иммобилизованным антигеном и количественно оценить долю молекул AT, связанных с АГ бивалентно и моновалентно.

II.3.2.2. Использование бивалентной модели для предсказания теоретически ожидаемых изменений Kobs в координатах Скэтчарда K(,bS может быть определена по тангенсу угла наклона кривой при представлении данных в координатах Скэтчарда (уравнение 2). Если бивалентное связывание МКА по каким-либо причинам невозможно и AT

Kobs =

kass _ [AbAg2]s + [AbAg]s kdiss [Ab][Ag]s

= Ki(2 + K2[Ag]s), (M-1)

(6),

связываются только моновалентно (то есть в уравнении 6 К2=0), то Kobs для родительских МКА будет равна 2Kj (см. уравнение 6). K0bS для БИАТ, у которых к данному антигену только одно плечо, в координатах Скэтчарда будет равна К[. Таким образом, если бивалентное связывание невозможно, Kobs родительских антител (2Ki) будет в два раза больше, чем Kobs биспецифических (Kj). Если бивалентное связывание МКА возможно, то значение K^s, как следует из уравнения 6, будет значительно больше 2Ki

(Kobs^K,).

II.3.2.3. Количественное определение антител связанных с иммобилизованным антигеном бивалентно и моновалентно

При наличии бивалентного связывания родительских MICA с иммобилизованным антигеном можно вычислить соотношение бивалентно и моновалентно связанных антител. Из уравнения 5 это соотношение можно выразить как:

[AbAg2]s/[AbAg]s=K2[Ag]s/2 (7)

Величину K2[Ag]s в литературе принято называть усиливающим фактором (enhancement factor). Как можно видеть из уравнения 7, эта величина равна удвоенному соотношению бивалентно и моновалентно связанных антител. Соотношение бивалентно и моновалентно связанных антител можно вычислить из уравнения 6, зная значение Kobs БИАТ, равное К], и значение Kobs родительских МКА.

П.3.2.4.Теоретически ожидаемое изменение наблюдаемых кинетических параметров связывания антител с иммобилизованным антигеном

Вышеприведенные уравнения позволяют также сравнить кинетические параметры связывания родительских МКА и БИАТ. Наблюдаемая кинетическая константа ассоциации (к^) биспецифических антител равна к] из уравнения 4. Для родительских МКА величина kass в большинстве случаев не зависит от наличия или отсутствия бивалентного связывания и равна 2kj. Наблюдаемая кинетическая константа диссоциации (kdlss) для БИАТ равна k_i. Значение kdlSs для родительских антител выводится из уравнения 6:

b""iG[Agy2+i (8)

Таким образом, диссоциация родительских МКА, которые могут бивалентно связываться с иммобилизованным антигеном, существенно меньше, чем диссоциация БИАТ. Если бивалентное связывание МКА с иммобилизованным антигеном по каким-либо причинам невозможно, то диссоциация родительских МКА и БИАТ будет одинакова.

II.3.3. Изучение истинных антигенсвязывающих свойств бифункциональных антител В настоящем исследовании мы изучали важный в теоретическом и практическом плане вопрос, в какой мере АГ-связывающие центры БИАТ, получаемых с помощью биологического метода, сохраняют аффинность родительских антител. С этой целью анализировались АГ-связывающие свойства МКА (бивалентных АТ) и соответствующего АГ-связывающего сайта БИАТ (моновалентных АТ) в условиях, когда антиген находится в растворе. При этом определяется истинная аффинность, характеризующая степень сродства отдельно взятого АГ-связывающего сайта АТ к данному эпитопу антигена, так как количество сайтов связывания с антигеном никак не влияет на тестируемую равновесную константу ассоциации Ка.

II.3.3.1. Определение равновесной константы ассоциации моноспецифических и биспецифических антител Равновесную константу ассоциации (Ка) родительских моноклональных АТ (анти-ЭНД и анти-hIgG) и тех же АГ-связывающих сайтов БИАТ определяли методом Скэтчарда с использованием ш1-меченого ЭНД. Моноклональные антитела связывают антиген с единственной константой аффинности Ка. При этом график Скэтчарда, если антиген однороден, имеет форму прямой линии. На рис. 5 приведены кривые Скэтчарда, характеризующие связывание ЭНД с моноспецифическими антителами и ЭНД-связывающим сайтом БИАТ анти-ЭНД/ПХ. Можно видеть, что графики Скэтчарда представляют собой прямую линию, причем наклон прямых к оси абсцисс одинаков во всех рассматриваемых случаях. Таким образом, можно

■ Анти-ЭНД О БИАТ анти-ЭНД/ПХ • БИАТ анти-ЭНД/ПХ+ПХ

100 200 300

Связанные АТ, нМхЮ

Рисунок 5. Связывание аншэндорфинеюых антител и бифункциональных антител антиэндорфин/антипероксидаза с 1251-эндорфином в координатах Скэтчарда. Сайты связывания с эндорфином тождественны у бифункциональных и монофункциональных антител.

И—■ Моноклональные (монофункциональные) антиэндорфиновые антитела;

о—о бифункциональные антитела антиэндорфин/антипероксидаза;

•—• бифункциональные антитела антиэндорфин/антипероксидаза в присутствие избытка пероксидазы.

Таблица 4. Равновесные константы ассоциации (К„) при связывании моноспецифических и биспецифических антител с антигенами в растворе

Клеточная линия Тестируемые антитела Тестируемая активность антител Ка

Гибридома 40Е9 Анти-ЭНД Антиэндорфиновая (1,93±0,06)х10"7

Тетрадома 40Е9х36Р9 БИАТ Анти-ЭНД/ПХ Антиэндорфиновая (2,34±0,15)х10"7

Тетрадома 40Е9х36Р9 БИАТ Анти-ЭНД/ПХ Антиэндорфиновая (в присутствие избытка пероксидазы ) (2,22±0,05)х10"7

Гибридома 7505 Анти-Ы§0 Антикв человека (3,76±0,69)х10"9

Тетрадома 7505х36Р9 БИАТ Анти-ЬДО/ПХ Анти-^в человека (3,65±0,43)х10"9

Тетрадома 7505х36Р9 БИАТ Анти-Ь^О/ПХ Анги- ^и человека (в присутствие избытка пероксидазы ) (3,74±0,36)х10"9

Гибридома 36¥9 Анти-ПХ Антипероксидазная (0,90+0,12)х Ю-9

Тетрадома 40Е9х36Р9 БИАТ Анти-ЭНД/ПХ Антипероксидазная (0,63+0,22)х10'9

Тетрадома 40Е9х36Р9 БИАТ Анти-ЭНД/ПХ Антипероксидазная (в присутствие избытка эндорфина ) (0,64±0,28)х10"9

Тетрадома 7505х36Р9 БИАТ Анти-Ь^С/ПХ Антипероксидазная (0,72+0,44)х10'9

Тетрадома 7505х36Р9 БИАТ Анти-Ы§0/ПХ Антипероксидазная (в присутствие избытка человека3) (0,71±0,48)х10'9

Антиген присутствовал в инкубационной смеси в следующих концентрациях: (1) - 1,25х10"7 М; (2) - 1,15x10"' М; (3) - 6х10"8 М. Сайты связывания с указанным антигеном идентичны у моноспецифических и биспецифических антител.

утверждать, что моноспецифические АТ к ЭНД и ЭНД-связывающий сайт БИАТ связывают меченый эндорфин одинаковым образом. Подобный анализ проводился нами для моноспецифических АТ к Ы§0 и Ь^О-связывающего сайта БИАТ анти-Ь^в/ПХ. Значения полученных равновесных констант ассоциации представлены в табл.4. Можно видеть, что не наблюдается достоверных различий Ка для моноспецифических и биспецифических антител при их связывании с ЭНД. Также не выявляется достоверных различий в аффинности (Ка), при связывании родительских моноспецифических АТ к Ы^в и Ы§в-связывающего сайта БИАТ анти-Ы§С/ПХ с меченым Ь^в.

Аффинность родительских антипероксидазных АТ 36Р9 и ПХ-связывающих сайтов двух БИАТ - 40Е9х36Р9 и 75С5х36Р9, определяли твердофазным иммуноферментным методом. На твердую фазу сорбировались кроличьи антимышиные антитела, затем планшеты инкубировали с избытком тестируемых антител, аффинность которых определялась путем добавления в лунки иммунных планшетов ПХ и последующей регистрации ферментативной активности. Полученные значения Ка представлены в табл. 4. Из данных, представленных в таблице, следует, что для ПХ-связывающих сайтов двух изученных нами БИАТ не было обнаружено достоверного изменения аффинности в сравнении с родительскими антипероксидазными АТ. Во всех случаях Ка антипероксидазных антител практически идентична Ка всех проанализированных ПХ-связывающих сайтов БИАТ.

П.3.3.2. Влияние избытка одного из антигенов на связывание бифункциональных антител со вторым антигеном

БИАТ представляются весьма удобной моделью для выяснения вопроса о том, влияет ли связывание антигена с одним из АГ-связывающих сайтов АТ на АГ-связывающую способность второго плеча. Этот вопрос исследовался нами на примере двух БИАТ - анти-Ь^С/ПХ (7505x3 6Р9) и анти-ЭНД/ПХ (40Е9х36Р9), имеющих различный изотипический состав тяжелых цепей: и соответственно. Для получения этих антител

использовали одну и ту же анти-ПХ гибридому (36F9), таким образом, эти БИАТ, предположительно, должны иметь одинаковую структуру ПХ-связывающих сайтов. Данные, представленные на рис. 5 и в таблице 4 свидетельствуют о том, что более чем тысячекратный (в сравнении с концентрацией АТ) молярный избыток одного из АГ в инкубационной смеси не влияет на аффинность БИАТ в отношении второго АГ. Избыток ПХ не влиял на связывание (характер кривых Скэтчарда) БИАТ анти-ЭНД/ПХ с меченым ЭНД (рис. 5, табл. 4). Не наблюдалось также достоверного изменения Ка при связывании hIgG-связывающего сайта и эндорфинсвязываюих сайтов БИАТ с антигенами в присутствие избытка ПХ (табл. 4). Сходным образом, избыток ЭНД достоверно не влиял на Ка при связывании БИАТ анти-ЭНД/ПХ с пероксидазой (табл. 4). Таким образом, в наших опытах не наблюдалось кооперативного эффекта при связывании антигенсвязываюгцих центров БИАТ с антигенами.

II.3.4. Анализ характера связывания антител с антигенами, иммобилизованными на твердой фазе II.3.4.1. Определение параметров связывания антител с иммобилизованным антигеном радиоиммунологическим методом В нашей работе было проведено количественное сравнение связывания бивалентных МКА и БИАТ с антигенами, адсорбированными на твердой фазе. Анализируемая панель включала следующие антитела: антимиоглобиновые АТ и БИАТ, которые несли тождественный сайт связывания с Мб; антипероксидазные МКА и БИАТ, которые несли сайт связывания с ПХ; МКА к hlgG и БИАТ анти-hIgG/nX, которые несли тождественный hIgG-связывающий сайт (табл. 1). Анализ проводился двумя методами: радиоиммунологическим и с использованием оптического биосенсора IAsys. Для определения параметров связывания традиционным (радиоиммунологическим) методом БИАТ и МКА метили 1251. Данные по связыванию представляли в виде кривых в координатах Скэтчарда. Кривые связывания в координатах Скэтчарда, представленные на рисунке 6 а, показывают, что имеет место существенная разница в связывании с ПХ

О Анти-Ыдв • Анти-ПХ/Мдв

0,2 0,4 0,6 0,8 Связанные антитела, нМ

-1-1-

1 2 3

Связанные антитела, нМ

родительских моноклональных и

Рисунок 6. Связывание биспецифических моноклональных антител с антигенами, адсорбированным на твердой фазе в координатах Скэтчарда

а - связывание антипероксидазных антител и бифункциональных антител со специфичностью антипероксидаза/антимиоглобин и антипероксидаза/анти-1§0 с иммобилизованной пероксидазой; сайты связывания с пероксидазой у тестируемых антител идентичны;

б-связывание антител к человека и бифункциональных антител со специфичностью анти-^О/антипероксидаза с иммобилизованным 1§01 человека; сайты связывания с 1§01 у тестируемых антител идентичны.

Таблица 5. Наблюдаемые равновесные константы ассоциации (К^) родительских моноклональных и биспецифических моноклональных антител с антигеном, адсорбированным на твердой фазе__

Клеточная линия Тестируемые антитела Тестируемая активность антител К0ьз,М-!

Гибридома 7505 Анти-Ы§0 Анти-1§0 человека (сорбирован Ь^О 1) (5,9±0,6)Х108

Тетрадома 75С5х36Р9 БИАТ Анти-Ь^О/Анти-ПХ Анти-^в человека (сорбирован (2,6±0,2)Х108

Гибридома 36Р9 Антипероксидаза Антипероксидазная (сорбирована ПХ) (2,0±0,1)Х108

Тетрадома 7505х36Р9 БИАТ Анти-Ь^С/Анги-ПХ Антипероксидазная (сорбирована ПХ) (5,3+0,5)х10б

Тетрадома 1406х36Р9 БИАТ Анти-Мб/Анти-ПХ Антипероксидазная (сорбирована ПХ) (9,6±0,8)х10б

моноклональных антипероксидазных АТ и БИАТ, несущих тождественный сайт связывания с ПХ. Значительно менее выражена разница в связывании с Ь^в между МКА к Ь^в и БИАТ, которые несут аналогичный сайт связывания с М^в (рис. 6, б). Метод Скэтчарда позволяет определить наблюдаемую равновесную константу ассоциации (К^) по тангенсу угла наклона кривой связывания. Значения КоЬ5 приведены в таблице 5. Как можно видеть из таблицы 5, Ко1)3 родительских антипероксидазных АТ в 38 раз превышает К^ антипероксидазного сайта БИАТ анти-ПХ/И^О, и в 21 раз превышает КоЬ5 антипероксидазного сайта БИАТ анти-ПХ/Мб. Следует обратить внимание, что КоЬз антипероксидазного сайта БИАТ специфичных к ПХ и Мб в 1,8 раз превышает К^ антипероксидазного сайта БИАТ со специфичностью к ПХ и Ь^в, что лежит в пределах погрешности определения КоЬ5 твердофазным радиоиммунологическим методом.

В случае адсорбированного на твердой фазе (рис. 6, б) разница в

связывании между МКА к Ь^О и И^в-связывающим сайтом БИАТ значительно менее выражена. К^ родительских МКА в 2,3 раза выше, чем Коь5 анти-Ыдв сайта БИАТ (табл. 5).

Теория связывания АТ с АГ, иммобилизованными на твердой фазе, позволяет не только сделать заключение о наличии или отсутствии бивалентного связывания данных антител с иммобилизованным антигеном, но и рассчитать долю антител, связанных с антигенами бивалентно. Из представленных данных следует, что К0ь5 родительских антипероксидазных антител в 38 раз превышает К^ антипероксидазного сайта БИАТ с двойной специфичностью - анти-ПХ/Ы§0, и в 21 раз превышает КоЬ5 антипероксидазного сайта БИАТ специфичных к ПХ и Мб. Зная соотношение констант, из уравнений 6 и 7 (разделы П.3.2.1 и П.3.2.3) для родительских МКА можно рассчитать соотношение бивалентно и моновалентно связанных антител [AbAg2]s/[AbAg]s. Это соотношение составляет 9 и 18, в зависимости от того, значение КоЬ$ каких БИАТ (анти-ПХ/Мб или анти-ПХ/Ь^О), считать истинной аффинностью антипероксидазного сайта АТ. Следовательно, при данной плотности антигена и в данном диапазоне начальных концентраций

антител около 90-95% от общего числа связавшихся родительских МКА ассоциировано бивалентно и только около 5-10% моновалентно.

Если на твердой фазе адсорбирован hlgGl, K^s родительских МКА в 2,3 раза выше, чем K0bs связывающего hlgG сайта БИАТ анти-hIgG/IlX (табл. 5). Теоретически, при отсутствии бивалентного связывания K0bs родительских МКА должна быть в 2 раза больше, чем Коь5 БИАТ (раздел II.3.2). Таким образом, различие между теоретической и экспериментальной величинами Kobs лежит в пределах погрешности определения наблюдаемой равновесной константы ассоциации твердофазным методом. Следует заключить, что МКА к hlgG при данной плотности антигена и в данном диапазоне начальных концентраций антител связываются с иммобилизованным hlgGl преимущественно моновалентно. Данные по связыванию AT с иммобилизованным Мб в координатах Скэтчарда не приводятся, так как корректных кривых для антимиоглобиновых МКА и Мб-связывающего сайта БИАТ получить не удалось в трех независимых экспериментах (кривые имели слишком большой разброс точек).

II.3.4.2. Определение параметров связывания антител с иммобилизованным антигеном с помощью оптического биосенсора IAsys

Для анализа взаимодействия антител с иммобилизованными антигенами мы, наряду с традиционными методами, к каковым относятся радиоиммунологический метод и метод твердофазного ИФА, использовали оптический биосенсор IAsys. Биосенсоры - это приборы нового поколения, для регистрации белок-белковых взаимодействий. Уже сейчас эти приборы позволяют весьма корректно оценить характер взаимодействия антиген-антитело, причем это взаимодействие регистрируется в режиме реального времени (то есть в тот момент, когда взаимодействие происходит).

Кинетические параметры связывания БИАТ и родительских МКА с иммобилизованными hlgGl и ПХ сравнивались с помощью оптического биосенсора IAsys. На рис. 1 ami б приведены кривые связывания антител с иммобилизованными ПХ и IgGl человека, полученные на оптическом биосенсоре. Аналитическая кювета с иммобилизованным антигеном

200

i Анти-HRP

200

+ Анти-HRP/hIgG

Анти-hIgG

200

600

500

1000

Время, с

Рисунок 7. Кривые связывания родительских моноклональных и биспецифических моноклональных антител с иммобилизованной пероксидазой хрена (HRP) и IgGl человека, полученные на оптическом биосенсоре IAsys.

а) кривые, показывающие ассоциацию и диссоциацию биспецифических моноклональных антител со специфичностью анти-HRP/IgG (клон 36F9/75G5), и родительских антипероксидазных моноклональных антител (клон 36F9) с иммобилизованной пероксидазой хрена (HRP);

б) кривые, показывающие ассоциацию и диссоциацию родительских моноклональных антител к IgG человека (клон 75G5), и биспецифических моноклональных антител со специфичностью анти-HRP/IgG (клон 36F9/75G5) с иммобилизованным IgGl человека

(1) - в кювету добавлялись антитела, после чего регистрировалась ассоциация;

(2) - раствор антител удалялся из кюветы, и регистрировалась диссоциация комплекса антиген-антитело.

уравновешивалась буфером, после этого в кювету добавлялись антитела, и ассоциация продолжалась около 5 мин. Процесс диссоциации антител регистрировался после удаления раствора с антителами и однократного добавления в кювету буфера. Биосенсор позволяет определить кинетические константы ассоциации и диссоциации и а также наблюдаемую

равновесную константу ассоциации (К<,м) родительских МКА и БИАТ с

Таблица 6. Параметры связывания родительских моноклональных и биспецифических моноклональных антител с антигенами, адсорбированным на твердой фазе, определенные с помощью оптического

Оканфич-носгь антител Иммобилизованный антиген Биосенсор IAsys РИА

kass, M'V kdissi С KQSS ка55/кф339 М"1 М"1

Анти-HRP HRP (1,9±0Д)хЮ4 (4,0+0,1)х10'5 (4,8±0,3)х108 (2,0±0,1)х108

Анти-hlgG/HRP HRP (8,0±1,0)х103 (e.BiO.^xlO"4 (9,6±1,2)-хЮ6 (5,3±0,5)х106

Анти-hlgG hlgGl (1,5±0,2)х105 (2,7+0, l)xl О"4 (5,5±0,7)х108 (5,9+0,6)х108

Анти-hlgG/HRP hlgGl (6,8±0,5)х104 (3,0+0, i)xl о4 (2,3±0,2)хЮ8 (2,6±0,3)х108

Примечание: в крайне правом столбце приведены равновесные константы ассоциации (А"ам), рассчитанные с помощью радиоиммунологического метода (РИА).

иммобилизованным антигеном. Эти кривые позволяют рассчитать кт и kdas с помощью программы (FASTfit software, Fisons, UK). Значение kass, рассчитанное для антипероксидазных МКА в 2,4 раза больше, чем kass антипероксидазного сайта БИАТ (таблица 6, рис. 7 а), а значение kass родительских МКА против hlgG в 2,2 раза больше, чем kass анти-hIgG сайта БИАТ (таблица 6, рис. 7 б). Теоретически kass родительских МКА должна быть в 2 раза больше, чем kass БИАТ (см. раздел И.3.1). Различие между теоретической и экспериментальной величинами к^ не превышает погрешностей определения (таблица 6). Вместе с тем, антипероксидазного сайта БИАТ в 21 раз больше, чем антипероксидазных МКА (таблица 6, рис. 7 а), что позволяет сделать вывод, о том, что антипероксидазные МКА связываются с иммобилизованной ПХ бивалентно (раздел II.3.1). Kass антипероксидазных МКА в 50 раз превышает Kass антипероксидазного сайта БИАТ. Зная соотношение констант МКА и БИАТ, из уравнений 6 и 7 (раздел И.3.1) для родительских МКА можно рассчитать соотношение бивалентно и моновалентно связанных антител. Это соотношение равно 24. Следовательно, при данной плотности антигена и в данном диапазоне концентраций антител 96% от общего числа связавшихся

родительских МКА ассоциировано бивалентно и только 4% моновалентно. С другой стороны, диссоциация родительских МКА против Ы^в и анти-Ь^в сайта БИАТ практически одинакова (таблица 6, рис. 7 б), что позволяет сделать вывод об отсутствии бивалентного связывания родительских МКА с иммобилизованным Ы§С1 (раздел П.3.1). родительских МКА против Ыцв, определяемая с помощью биосенсора, в 2,4 раза превышает К^ анти-Ы^в сайта БИАТ, что близко к теоретически ожидаемому (раздел П.3.1). Сравним параметры связывания антител с иммобилизованными антигенами, которые были получены традиционными методами (радиоиммунологическим и твердофазным ИФА) с параметрами, которые получены с использованием оптического биосенсора ГАвуз (табл. 6). Можно видеть, что оба метода дают практически идентичные результаты как по аффинности тестируемых антител, так и по характеру взаимодействия (моновалентное или бивалентное) с иммобилизованными антигенами. С практической точки зрения важно, что прибор нового поколения - оптический биосенсор ХАбуб позволяет корректно регистрировать взаимодействие антител с иммобилизованными антигенами.

П.4. Изучение эффективности бифункциональных антител, как детектирующих антител в твердофазном ИФА Большой массив публикаций свидетельствует о высокой эффективности БИАТ как "меченых"2 АТ в иммуногистохимии, иммуноблоттинге, в сэндвич-методе, а также при взаимодействии со злокачественными клетками. Во всех упомянутых тестах имеет место взаимодействие БИАТ с антигенами, локализованными на твердой фазе. Вместе с тем, теоретически, утверждения о высокой эффективности БИАТ в сравнении с обычными МКА представляются весьма спорными. Во-первых, при равной концентрации обычные МКА связываются с иммобилизованным антигеном вдвое эффективнее, чем БИАТ даже в отсутствие бивалентного связывания (см. теорию в разделе П.3.1, а также данные по связыванию антител к и БИАТ анти-^О/ПХ с иммобилизованным в разделе П.3.4.1). Во-вторых, в

1 Термин меченые антитела употребляется нами в широком смысле и может предполагать любой характер маркирования (метка изотопом, ферментом, коллоидом и т.п.)

отличие от БИАТ обычные МКА могут связываться с иммобилизованным АГ бивалентно - одновременно двумя АГ-связывающими сайтами (т.е. гораздо более прочно), что в реальных твердофазных тестах может обеспечивать более высокую чувствительность детектирования. В третьих, в твердофазном анализе используются БИАТ, несущие сайт связывания с ферментом и тестируемым АГ. Следовательно, даже при большом избытке фермента молекула БИАТ может быть помечена не более чем одной молекулой фермента. Вместе с тем, существующие методы конъюгации фермента с антителами (например, периодатный метод сшивки пероксидазы с АТ) предполагают метку молекулы АТ более чем одним молем ПХ. Таким образом, в твердофазном ИФА, в расчете на моль антител, БИАТ должны давать меньшее окрашивание, чем обычные меченые антитела, что должно приводить к уменьшению чувствительности определения. Несомненно, БИАТ, несущие сайт связывания с ферментом, могут выполнять роль меченых АТ при идентификации антигена на твердой фазе. Весь вопрос в том, насколько БИАТ более (или менее) эффективны как меченые молекулы. Дня ответа на этот вопрос мы сравнили эффективность меченых пероксидазой антимиоглобиновых АТ и БИАТ анти-Мб/ПХ в двух моделях. В первой модели анализировалось связывание меченых моноклональных и меченых БИАТ с миоглобином, адсорбированным на поверхность иммунных планшетов. Эта система подобна тестированию антигена в иммуноблоттинге и иммуногистохимии. Кроме того, сравнивалась эффективность родительских антимиоглобиновых БИАТ анти-Мб/ПХ как детектирующих антител в сэндвич-методе тестирования Мб. Главное достоинство обоих выбранных систем сравнения состоит в том, что они позволяют не только уравнять концентрации сравниваемых АТ, но и одинаковым образом "пометить" антитела. После ковалентного связывания антимиоглобиновых АТ с ПХ в конъюгатах определяли концентрацию активной ПХ и активных антимиоглобиновых АТ. В настоящем исследовании использовался конъюгат антимиоглобиновых АТ с ПХ, в котором отношение: моль ПХ/моль АТ равнялось 0,92. При тестировании эффективности БИАТ пероксидаза добавлялась в инкубационную смесь в значительном избытке, с таким расчетом, чтобы исходя из значения Ка для антипероксидазных АТ

Антитела, нг/мл Миоглобин, нг/мл

а б

Рисунок 8. Сравнительный анализ эффективности антител к миоглобину (конъюгированных с пероксидазой) и бифункциональных антител антимиоглобин/антипероксидаза (в присутствие пероксидазы) как детектирующих антител в твердофазном ИФА.

Сайты связывания с миоглобином тождественны у монофункциональных и бифункциональных антител.

а - связывание антител с миоглобином, иммобилизованным на твердой фазе; б - калибровочные кривые в сэндвич методе определения миоглобина (детектирующие антитела и БИАТ присутствуют в инкубационной смеси в равных концентрациях).

(см. табл.4) не менее 90% молекул БИАТ были мечены ПХ. Следовательно,

БИАТ и антимиоглобиновые АТ были мечены пероксидазой одинаковым

образом. Кривые связывания меченых ПХ антимиоглобиновых АТ и БИАТ

анти-Мб/ПХ (в присутствие избытка ПХ) с иммобилизованным миоглобином

представлены на рис. 8 а. По соотношению коэффициентов кривых

связывания (приведены на рисунке) можно определить, что с миоглобином

связывается в 5,4 раза больше антимиоглобиновых АТ, чем БИАТ анти-

Мб/ПХ. Соотношение коэффициентов кривых связывания родительских

МКА и БИАТ больше двух, что позволяет сделать вывод о наличии

бивалентного связывания антимиоглобиновых АТ с иммобилизованным Мб

(см. уравнение 3, раздел И.3.1). Напомним, что даже в отсутствие

бивалентного связывания при равной концентрации,.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ

БИБЛИОТЕКА С Петербург 09 МО «хт

и БИАТ, несущих тождественный сайт связывания с Мб, с иммобилизованным миоглобином может связаться больше родительских МКА, чем БИАТ (раздел П.3.1). Следовательно, как теоретические расчеты, так и эксперименты по связыванию с иммобилизованным антигеном позволяют заключить, что для выявления антигенов на твердой фазе меченые антитела гораздо эффективнее БИАТ.

Для проверки эффективности БИАТ как меченых АТ в сэндвич-методе нами был сконструирован иммуноферментный сэндвич-метод тестирования миоглобина, в котором антитела клонов 1306 и 18Н2 (к разным эпитопам миоглобина) адсорбировались на поверхности иммунных планшетов (улавливающие антитела), а антитела клона 1406, конъюгированные с пероксидазой хрена, использовались в качестве меченых. Эпитопная специфичность клона 1406 отличается от эпитопной специфичности клонов 13С6 и 18Н2, то есть все три клона - к различным эпитопам Мб. Таким образом, в твердофазном ИФА регистрировался сэндвич: [сорбированные АТ — миоглобин — меченые АТ]. Для корректного сравнения калибровочных кривых, получаемых при добавлении конъюгата АТ клона 14Б6 с ПХ или с помощью БИАТ анти-Мб/ПХ, меченые АТ добавлялись в инкубационную смесь в равных концентрациях: до конечной концентрации 2,5 мкг/мл активных АТ конъюгата или БИАТ. Эксперимент проводился таким образом, что в ассоциированной с анти-ПХ сайтом форме находится около 90% молекул БИАТ. Иными словами, моль БИАТ был помечен 0,9 молями ПХ. В антимиоглобиновом конъюгате моль АТ был помечен 0,92 молями фермента.

Калибровочные кривые для обоих вариантов сэндвич-метода представлены на рис. 8 б. Можно видеть (коэффициенты кривых приведены на рисунке), что с мечеными АТ в сэндвич-методе достигается несколько больший наклон калибровочной кривой к оси концентраций, чем с БИАТ (коэффициент наклона кривой в 1,32 раза больше). Принимая во внимание погрешность определений можно утверждать, что БИАТ и меченые АТ к миоглобину обеспечивают одинаковую разрешимость сэндвич-метода. Вместе с тем, чувствительность метода (минимальная достоверно определяемая крнцентрация для п=4) в случае меченых АТ клона 14Б6 в 2

раза выше, чем при использовании БИАТ (5 нг/мл и 10 нг/мл соответственно). Таким образом, использование БИАТ в качестве меченых АТ в сэндвич-методе не приводит к увеличению разрешимости и чувствительности анализа.

В целом, представленные в этом разделе экспериментальные данные позволяют заключить, что использование БИАТ в качестве меченых в твердофазных тестах не приводит к качественному улучшению параметров тестирования: не наблюдается увеличения чувствительности анализа и не увеличивается его разрешение (угол наклона калибровочной кривой к оси концентраций).

Ш. ОБСУЖДЕНИЕ 1П.1. Ассоциация легких и тяжелых цепей антител в квадромных клетках

Квадромы - продуценты БИАТ являются удобной моделью, с помощью которой можно in vivo изучать такое явление, как наличие (или отсутствие) предпочтительного связывания гомологичных (принадлежащих одному антителу) L и Н цепей АТ при сборке молекул иммуноглобулина. Нами предложены теоретические модели распределения антител квадромы по их специфичности, которые учитывают характер ассоциации L и Н цепей АТ и относительную скорость синтеза цепей. Наряду с этим, разработан метод количественного анализа продуктов секреции квадром, который основан на аффинной очистке АТ и их количественном определении. Таким образом, экспериментально определенные концентрации АТ различной специфичности, которые продуцируются данной квадромой, можно соотнести с теоретическими моделями распределения и сделать вывод о характере ассоциации (случайном или предпочтительном) L и Н цепей родительских АТ. Мы исследовали спектр АТ, секретируемых тремя субклонами квадромы, продуцирующей АТ со специфичностью анти-ЭНД/ПХ. В культуральных супернатантах определялось количество антипероксидазных АТ, антиэндорфиновых АТ, БИАТ и неактивных АТ. Сравнение экспериментальных данных с теоретическими моделями позволило заключить, что полученные нами экспериментальные распределения АТ возможны как при предпочтительной ассоциации гомологичных L и Н цепей обоих родительских АТ (модель II на рис. 1,

)f Y

а б в

Антиэндорфиновые антитела

Y Y №

г д ж

Антипероксидазные антитела

Рисунок 9. Изоформы антиэндорфиновых и антипероксидазных антител, которые могут секретироваться квадромой 40Е9х36Б9.

Изоформы антител, которые не секретируются квадромой, обведены рамкой.

примеры 3,4 в табл. 2), так и при гомологичном предпочтении в одной H-L паре (модель III на рис. 1; примеры 5,6 в табл. 2). Однако анализ цепьевого состава аффинноочищенных фракций AT методом двумерного ЭФ однозначно свидетельствует, что легкие и тяжелые цепи антиэндорфиновых и антипероксидазных антител могут образовывать единственный неактивный антигенсвязываюгций сайт: сочетание тяжелой цепи антиэндорфиновых антител и легкой цепи антипероксидазных антител (рис. 9, б, д). Неактивный антигенсвязывающий сайт, который образуется при сочетании Н цепи антиэндорфиновых антител и L цепи антипероксидазных антител (на рис. 9, в, ж эти варианты заключены в рамку) квадромой не образуется. Таким образом, проанализированная нами квадрома 40E9x36F9, продуцирующая антитела со специфичностью антиэндорфин/антипероксидаза оказалась весьма удачной моделью для анализа характера ассоциации цепей. Убедительно доказано, что в одной квадроме легкие и тяжелые цепи одних антител (антиэндорфиновых) ассоциируются друг с другом предпочтительным образом, в то время как тяжелая цепь других антител (антипероксидазных) может одинаково эффективно ассоциироваться как с гомологичной (антипероксидазной), так и с гетерологичной (антиэндорфиновой) цепью.

С практической точки зрения важно, что предпочтительная ассоциация повышает эффективность квадром как продуцентов БИАТ. На наш взгляд, предложенный нами метод оценки цепьевого состава БИАТ методом двумерного электрофореза, позволяет наглядно и эффективно определить

характер ассоциации Н и L цепей антител в гибридных гибридомах. Очевидно, что L и Н цепи АТ антипероксидазного клона обладают низкой аффинностью при ассоциации друг с другом. Именно поэтому для получения эффективных квадром, например, в случае БИАТ анти-Мб/ПХ, активный клон-продуцент БИАТ удалось получить только при слиянии с одним из четырех клонов-продуцентов антимиоглобиновых АТ. В квадромах, полученных с тремя другими антимиоглобиновыми клонами, БИАТ обнаруживались в очень низкой концентрации. Низкий выход БИАТ в этих клонах можно объяснить случайным типом ассоциации L и Н цепей в обоих родительских АТ - анти-ПХ и анти-Мб и неравным синтезом L и Н цепей родительских АТ (модель I на рис. 1). Характерно, что эффективный клон-продуцент БИАТ, у которого один из родителей антипероксидазная гибридома 36F9, удавалось получить лишь в случае приблизительно каждого третьего клона к данному АГ («33%), независимо специфичности продуцируемых им АТ. Низкий выход БИАТ, на наш взгляд, был связан с тем, что в большинстве случаев в образовавшихся квадромах имел место случайный тип ассоциации Н и L цепей в обоих родительских АТ. Таким образом, наше исследование позволяет сделать важный в практическом отношении вывод о том, что для получения эффективного клона-продуцента БИАТ необходимо, чтобы хотя бы в одном из родительских АТ Н и L цепи ассоциировались друг с другом с высокой аффинностью.

Вопрос о том, какой тип ассоциации цепей превалирует в квадромах, важен не только в практическом плане; эта проблема представляет большой теоретический интерес. Сформулирована гипотеза, что существуют внутриклеточные механизмы, которые предопределяют отбор высокоаффинных H-L пар во время созревания В-клеток "in vivo" [De Preval С., Fougereau M., 1976]. То есть во всех антителах, которые секретируются В клетками, Н и L-цепи ассоциируются с высокой аффинностью. Этот вопрос тесно связан с проблемой разнообразия АТ. Один из факторов, определяющих разнообразие антител - характер сочетания Н и L цепей при образовании активного АГ-связывающего сайта. Например, если имеется 10" различных легких цепей и 10" различных тяжелых, то возможно появление Ю2" молекул антител различной специфичности при условии, что

образование активного АГ-связывающего сайта не зависит от характера сочетания Н и L цепей. Однако если во всех антителах, продуцируемых В клетками, Н и L цепи характеризуются высокой аффинностью при сочетании друг с другом, то, как показывают расчеты, гипотетическое разнообразие АТ на один-два порядка меньше. Наши данные, а также данные других исследователей [De Lau W. В. М. et al, 1991] свидетельствуют о том, что лишь в относительно небольшом числе случаев (»25% у Де Jlay с соавторами и «33% в наших экспериментах) может иметь место предпочтительная ассоциация L и Н цепей родительских АТ. В своей совокупности эти данные позволяют сделать вывод о том, что не существует механизмов, направленных на отбор высокоаффинных H-L пар во время созревания В-клеток "in vivo". Следовательно, по крайней мере в этом плане, нет ограничений гипотетическому разнообразию АТ, которое связано с характером сочетания Н и L цепей.

Высказывалось предположение, что предпочтительная ассоциация гомологичных H-L цепей приводит к образованию высокоаффинных антигенсвязывающих сайтов [Hamel Р. A. et al., 1986, 1987]. Наше исследование, наряду с большим числом работ in vitro, посвященных анализу корреляции между типом ассоциации H-L цепей и аффинностью, не подтверждает этой гипотезы. Так, АТ к ЭНД почти в 100 раз менее аффинны, чем АТ к ПХ (табл. 4). Вместе с тем, в тетрадоме, продуцирующей БИАТ анти-ЭНД/ПХ (40E9x36F9) L и Н цепи антиэндорфиновых антител ассоциируются предпочтительным образом, в то время как L и Н цепи антипероксидазных антител ассоциируются случайно. Отметим, что in vivo этот феномен продемонстрирован впервые. Следовательно, образование высокоаффинных антигенсвязывающих сайтов никак не связано с типом ассоциации H-L цепей родительских АТ.

III.2. Антигенсвязывающие свойства бифункциональных антител

Принято считать, что функционально активные АГ-связывающие сайты тетрадомных антител образованы путем ассоциации гомологичных L-H цепей, т.е. цепей, происходящих от одного родительского МКА. Гетерологичные H-L-пары, в которых L и Н цепи происходят от разных МКА, как правило, образуют неактивные АГ-связывающие сайты. Таким образом,

БИАТ и родительские МКА имеют одинаковую структуру АГ-связывающих центров и, как следствие, должны проявлять одинаковые АГ-связывающие свойства. Однако в некоторых работах показана возможность сохранения в

I гетерологичных H-L-napax активности тяжелой цепи [Graciano R.F. et al.,

1995, Somasundaram С. et al., 1993]. Теоретически это может приводить к возникновению БИАТ с измененными АГ-связывающими свойствами. Кроме того, в рекомбинантных антителах могут наблюдаться изменения гликозилирования иммуноглобулиновых цепей [Ip Y. et al., 1993]. Как показано на примере некоторых МКА, изменения гликозилирования в области активных центров могут отражаться на связывании с антигенами [Morelli D. et al., 1994]. Таким образом, встает вопрос, важный в теоретическом и практическом плане: в какой мере молекула БИАТ сохраняет АГ-связывающие свойства родительских МКА. Нами было изучено два типа БИАТ, продуктов секреции мышиных тетрадом: в БИАТ со специфичностью анти-ПХ/hIgG обе родительские Н цепи относились к одному субклассу IgG (IgGl); в БИАТ со специфичностью анти-ПХ/ЭНД тяжелые цепи имели разный изотип (IgGl/IgG2a). Наши данные свидетельствуют, что родительские МКА и соответствующий Al "-связывающий сайт БИАТ при связывании с тестируемым АГ имеют одинаковые равновесные константы ассоциации (табл. 4). Тождественность констант имела место и в том случае, когда Н цепи родительских антител относились к разным субклассам IgG (БИАТ, специфичные к ЭНД/ПХ, IgG2a/IgGl).

Наряду с этим нами показано, что молекулы БИАТ обладают достаточной гибкостью, чтобы обеспечить независимое взаимодействие двух АГ-связывающих сайтов с соответствующими антигенами. Это имело место независимо от того, являлись ли оба антигена крупными белками, молекулярная масса которых сравнима с молекулярной массой антител, как в случае БИАТ, специфичных к IgG и ПХ, или один из антигенов представлял собой низкомолекулярный пептид (БИАТ, специфичные к ЭНД и ПХ). Так, связывание БИАТ анти-ЭНД/ПХ) с избытком ПХ (Мг«40000) не влияло на аффинность БИАТ в отношении ЭНД (Мг«1600). Сходным образом: связывание этих БИАТ с избытком ЭНД не влияло на аффинность антител в отношении ПХ. Тот же эффект наблюдался в случае БИАТ со

специфичностью анти-hIgG/ITX: избыток ПХ не влиял на связывание БИАТ с hlgG (Mr«160000), а избыток liIgG не влиял на связывание БИАТ с ПХ. В целом, наши данные согласуются с данными, полученными Аллардом с соавторами [Allard W. J. et al., 1992] при изучении БИАТ, специфичных к двум сравнительно крупным антигенам: Р-галактозидазе 40000) и фоллитропину (Мг»42000). Авторы также не обнаружили изменения аффинности БИАТ по сравнению с родительскими МКА даже в том случае, когда Н цепи принадлежали к разным субклассам IgG мыши. Избыток одного из антигенов не влиял на связывание БИАТ со вторым АГ. Наряду с этим, подтверждаются ранние наблюдения, свидетельствующие об отсутствии кооперативного эффекта при взаимодействии антител с антигенами.

Ш.З. Связывание антител с иммобилизованным антигеном Связывание антител с иммобилизованными антигенами изучалось ранее путем сравнения ассоциации нативных молекул иммуноглобулинов и их Fab фрагментов [Kaufman Е. N., Jain R. К., 1992]. Показано, что способность молекулы IgG связываться с иммобилизованным антигеном моновалентно или бивалентно зависит от концентрации антител в растворе, поверхностной концентрации антигена и стерических факторов. Следует отметить, что упомянутая модель не является достаточно полноценной. Недостаток подобного сравнения заключается в том, что структура Fab фрагментов отлична от структуры нативных молекул антител - это всего лишь половинка молекулы иммуноглобулина, лишенная Fc фрагмента. В то же время, имеются данные, что Fc участок может иметь значение для АГ-связывающей способности AT (например, он может влиять на гибкость молекулы) [McCloskey N. et al., 1997]. На наш взгляд, идеальной моделью для изучения связывания AT с иммобилизованным АГ являются БИАТ. Структура молекулы БИАТ тождественна структуре молекулы нативного иммуноглобулина (по крайней мере, в том случае, когда обе "полумолекулы" БИАТ относятся к одному субклассу IgG). БИАТ несут два АГ-связывающих сайта к различным антигенам и, таким образом, могут связываться с адсорбированным АГ только моновалентно (см. рис. 2). В то время как нативная молекула AT может связываться с иммобилизованным АГ как моновалентно, так и бивалентно (рис. 2). Тождественность структур молекул

родительских МКА и БИАТ и тождественность соответствующих АГ-связывающих сайтов позволяет корректно определить наличие (или отсутствие) бивалентного связывания.

Для оценки характера взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном мы использовали как традиционный (радиоиммунологический) метод, так и оптический биосенсор IAsys. Обоими методами были получены близкие результаты (табл. 6). На основе модели бивалентного связывания (раздел Ш) можно заключить, что МКА со специфичностью анти-ПХ связываются с адсорбированными антигенами (ПХ и Мб соответственно) бивалентно. Вместе с тем, не наблюдалось бивалентного связывания МКА к hlgG с адсорбированным hlgGl. Отсутствие бивалентного связывания с hlgGl можно объяснить относительно большими размерами молекулы hlgG (Мг hlgG в четыре раза больше чем Мг пероксидазы). Кроме того, молекула пероксидазы имеет глобулярную структуру, а молекула hlgG имеет "цепочечную" структуру, что также может сказываться на характере связывания. Способность МКА бивалентно связываться с иммобилизованным антигеном во многом зависит от стерического взаимодействия антигенсвязывающего сайта МКА с соответствующим эпитопом антигена. Так, в работе Доувера с соавторами [Dower S. К. et al., 1984] показано, что различные МКА, специфичные к одному антигену, могут показывать различный характер связывания, и бивалентный, и моновалентный. Следовательно, наличие или отсутствие бивалентного связывания антител с иммобилизованным антигеном необходимо доказывать не только для каждого антигена, но и для каждого клона-продуцента МКА к данному антигену.

В целом, нами убедительно продемонстрировано, что моноклональные БИАТ являются весьма подходящей (идеальной) моделью для изучения взаимодействия антител с иммобилизованными антигенами.

П1.4. Эффективность бифункциональных антител, как детектирующих антител в твердофазном иммуноферментном методе

В ряде работ БИАТ, включающие сайт связывания с ферментом, рассматриваются как эффективные меченые антитела (конъюгаты) [см. обзор Cao Y., Suresh M.R., 1998]. Весьма важно при сравнении БИАТ и меченых

i 41

(

Адсорбированное Меченое Пероксндаза Бифункциональное

/У / / //У / /У///У/ /У///

Твердая фаза

а б в г

Рисунок 10. Комплексы, которые образуются в сэндвич-методе тестирования антигена при использовании детектирующих антител, конъюгированных с пероксидазой (конъюгатов) [а, б, в], и бифункциональных антител, несущих сайт связывания с пероксидазой (г).

МКА уравнять их концентрации в инкубационной смеси и одинаково пометить (т.е. обеспечить одинаковое молярное отношение: фермент/маркируемые антитела). К сожалению, ни в одной из опубликованных работ этого сделано не было. В нашем исследовании мы сравнивали эффективность АТ к миоглобину, конъюгированных с пероксидазой, и БИАТ анти-Мб/ПХ, как детектирующих АТ в твердофазном ИФА. Конъюгированные АТ к миоглобину и БИАТ были одинаково мечены ПХ (молярное отношение ПХ/АТ около 1). Наблюдалось, что при связывании с миоглобином, адсорбированным на поверхность иммунных планшетов, конъюгированные с ПХ антимиоглобиновые АТ связывались с антигеном в 7 раз эффективнее, чем БИАТ. Это свидетельствует, о наличии бивалентного связывания антимиоглобиновых антител с иммобилизованным Мб (см. раздел 11.3.1). Вместе с тем, в сэндвич-методе определения Мб эффективность меченых АТ всего в 1,3 раза выше, чем эффективность меченых БИАТ, что находится в пределах погрешности метода. Теоретически, в сэндвич-методе определения АГ с мечеными МКА могут образовываться комплексы трех типов (рис. 10). Два типа комплекса предполагают наличие бивалентного связывания между ловящими и мечеными антителами (рис. 10, б, в). Возможно также моновалентное связывания меченых АТ с АГ (рис. 10, а). При этом может образовываться комплекс: [адсорбированное антитело—

антиген—меченое антитело—антиген]. В этом случае связывание АГ со вторым антигенсвязывающим сайтом меченых AT не приводит к увеличению количества меченых AT в сэндвиче и, следовательно, интенсивность регистрируемого сигнала не меняется. БИАТ несут только один сайт связывания с АГ, и, таким образом, концентрация миоглобина, "работающая" на образование сэндвича, увеличивается вдвое. Допустим, в нашем сэндвич-методе тестирования Мб меченые AT связываются с Мб только моновалентно, тогда, (см. раздел II.3.1) при одинаковой концентрации антимиоглобиновых AT и БИАТ анти-Мб/ПХ с миоглобином свяжется больше антител к миоглобину, чем БИАТ. Однако, поскольку инкубация одностадийная, то в случае БИАТ эффективная концентрация миоглобина, "работающая" на образование сэндвича, вдвое выше, чем при использовании меченых антимиоглобиновых AT. На наш взгляд, в сэндвич-методе тестирования Мб меченые AT связываются с АГ преимущественно моновалентно, и лишь некоторая их часть связывается с Мб бивалентно, т.е. практически необратимо, образуя комплексы, изображенные на рис 10, б, в. Таким образом, выигрыш, связанный с наличием у БИАТ только одного сайта связывания с Мб полностью нивелируется способностью меченых МКА связываться с АГ бивалентно. Отметим, что сравнение БИАТ и меченых антимиоглобиновых AT проводилось в условиях, при которых эффективность меченых AT была искусственно занижена (широко используемый способ конъюгирования пероксидазы с AT предполагает метку молекулы AT двумя молекулами ПХ). В модели, которую мы использовали, моль AT конъюгирован с молем ПХ. Таким образом, БИАТ, несущие сайт связывания с ферментом, не дают (и не могут дать) выигрыша в чувствительности в сравнении с мечеными родительскими AT.

В последнее время большое внимание уделяется исследованиям по получению так называемых одноцепочечных фрагментов антител (с помощью генно-инженерных методов) [Pluckthum A., Pack Р., 1997; Hudson N. W. et al., 1999], в том числе и эффективных бивалентных фрагментов [Coloma M.J., Morrison S.L., 1997]. Однако пока эту возможность не удалось реализовать: несмотря на бивалентность, тетрацепочечные биспецифические фрагменты связывались с антигенами намного хуже исходных МКА, вариабельная

область которых была воспроизведена в одноцепочечных молекулах. Тем не менее, дальнейшие исследования по созданию поливалентных генно-инженерных антител являются перспективным путем для увеличения авидности БИАТ.

В заключение, хотелось бы подчеркнуть, что, на наш взгляд, нецелесообразно использовать в неконкурентных твердофазных системах тестирования антигенов, в качестве меченых антител, биспецифические антитела, получаемые гибридомным способом (БИАТ). Процесс получения клонов-продуцентов антител весьма трудоемок и требует высокой квалификации, определенные проблемы могут возникнуть и при очистке БИАТ. Вместе с тем, улучшение параметров аналитической системы вряд ли может иметь место.

IV. ВЫВОДЫ

I. Для изучения характера ассоциации легких и тяжелых цепей антител (случайного или предпочтительного) использована гибридная гибридома (квадрома), в которой кодоминантно экспрессируются легкие и тяжелые цепи антител к эндорфину и пероксидазе хрена.

1) Разработаны теоретические модели рекомбинации Ь и Н цепей в гибридных гибридомах, позволяющие предсказывать типы антител, образуемых квадромой, в зависимости от способа ассоциации (случайного или предпочтительного) легких и тяжелых цепей.

2) Разработаны методы количественного определения типов антител, образуемых гибридными гибридомами. Для определения цепьевого состава антител впервые предложен метод двумерного электрофореза.

3) Доказано, что в квадроме 40Е9х36Р9, продуцирующей бифункциональные антитела со специфичностью антиэндорфин/антипероксидаза, Н и Ь цепи антиэндорфиновых антител ассоциируются предпочтительным образом, в то время как Н цепи антипероксидазных антител одинаково эффективно ассоциируются с Ь цепями как антиэндорфиновых, так и антипероксидазных антител. Таким образом, оба типа ассоциации НиЬ цепей - случайный и предпочтительный имеют место в данной квадроме.

4) Показано, что предпочтительная ассоциации Н и L цепей в гибридных гибридомах не является обязательной для образования активного антигенсвязывающего сайта. Таким образом, разнообразие антител не ограничено, существованием такого механизма.

5) Предложены практические рекомендации по получению квадром -эффективных продуцентов бифункциональных моноклональных антител.

II. Показано, что уровень секреции антител родительскими гибридомами (антиэндорфиновой - 40Е9 и антипероксидазной 36F9) не обязательно наследуется тетрадомой (40E9x36F9, специфичность антиэндорфин/антипероксидаза).

Ш. Сравнительный анализ истинной аффинности родительских антител и аффинности тождественных антигенсвязывающих сайтов бифункциональных антител позволил доказать:

1) Истинная аффинность (равновесная константа ассоциации, определяемая при связывании антител с антигеном в растворе) родительских антител равна аффинности тождественных антигенсвязывающих сайтов бифункциональных антител (на панели антител к антигенам различного молекулярного веса и структуры - эндорфину (М,«1700), пероксидазе хрена (Мг«40000) и IgG человека (М,»160000).

2) Для бифункциональных антител со специфичностью антиэндорфин/антипероксидаза и анти-Ь^О/антипероксидаза продемонстрировано, что избыток одного из антигенов не влияет на аффинность бифункциональных антител в отношении второго антигена. Таким образом, кооперативный эффект при связывании бифункциональных антител с антигенами (с Mt«¡1700, М^ОООО и М^160000) отсутствует.

3) Впервые продемонстрировано in vivo (на клеточном уровне), что тип ассоциации L и Н цепей (случайный или предпочтительный) никак не связан с аффинностью антигенсвязывающего сайта. Низкоаффинный антигенсвязывающий сайт (например, сайт связывания с эндорфином у антител 40Е9) может быть образован в результате предпочтительной ассоциации L и Н цепей.

IV. Для определения типа взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентное или бивалентное) впервые предложена новая

модель: сравнительный анализ параметров связывания родительских антител и тождественного антигенсвязывающего сайта бифункциональных антител. Проанализировано взаимодействие антител с иммобилизованными антигенами различного молекулярного веса и структуры: миоглобином (Мг» 18600), пероксидазой хрена (М>40000) и 1§0 человека (Мг«160000). Анализ проведен двумя независимыми методами: радиоиммунологическим и с помощью оптического биосенсора ХАвув.

1) Доказано, что радиоиммунологический метод и метод с использованием оптического биосенсора ГАбуб дают тождественные параметры связывания антител с иммобилизованным антигеном.

2) Доказано, что антимиоглобиновые и антипероксидазные антитела связываются с антигеном, иммобилизованным на поверхности иммунных планшетов, преимущественно двумя антигенсвязывающими сайтами одновременно (бивалентно). Вместе с тем, антитела к человека связываются с иммобилизованным антигеном только одним антигенсвязывающим сайтом (моновалентно).

3) Доказано, что бифункциональные антитела взаимодействуют с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе, существенно менее эффективно, чем родительские монофункциональные.

V. Исследована эффективность бифункциональных антител, несущих сайт связывания с тестируемым антигеном и пероксидазой хрена, как детектирующих молекул в твердофазных тестах (твердофазный иммуноферментный анализ и сэндвич-метод).

1) Доказано, что бифункциональные антитела, несущие сайт связывания с миоглобином и пероксидазой хрена, взаимодействуют с миоглобином, иммобилизованным на твердой фазе, существенно менее эффективно, чем антимиоглобиновые антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена.

2) Доказано, что при тестировании миоглобина сэндвич-методом бифункциональные антитела, несущие сайт связывания с миоглобином и пероксидазой хрена, не дают выигрыша в чувствительности в сравнении с антимиоглобиновыми антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена.

VL СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ НАУЧНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Massino Y.S., Tsibezov V.V., Dmitriev A.D., Vostrikov V.M., Soldatova I.A., KolyaskinaG.I. (1987) Preparation and characterization of monoclonal antibodies against a-endorphin. Abstract book of the eighth European immunology meeting, Zagreb, p. 97.

2. Massino, Y.S., Kizim, E.A., Dergunova, N.N., Vostrikov,V.M. Dmitriev, A.D. (1992) Construction of a quadromato a-endorphin/horseradish peroxidase using an actinomycin D resistant mouse myeloma cell line. Immunol. Lett., vol. 33, №3, p. 217-222.

3. Massino Y.S., Dergunova N.N., Kizim E.A., Smirnova M.B., Tereshkina E.B., Kolyaskina G.I., Dmitriev A.D. (1997) Quantitative analysis of the products of IgG chain recombination in hybrid hybridomas based on affinity chromatography and radioimmunoassay. J. Immunol. Methods, vol. 201, p. 5766.

4. Nikulina V.A., Kizim E.A., Massino Y.S., Segal O. L., Smirnova M.B., Avilov V.V., Saprigin D.B., Smotrov S.P., Tichtchenko V.A., Kolyaskina G.I., Dmitriev A.D. (2000) The synergistic effects in antigen capture ELISA using three monoclonal antibodies directed at different epitopes of the same antigen. Clin. Chim. Acta, vol. 299, p. 25-44.

5. Dmitriev D.A., Massino Y.S., Segal O.L., Smirnova M.B., Kolyaskina G.I., Pavlova E.V., Osipov A.P., Egorov A.M., Dmitriev A.D. (2001) The comparison of the ability of monoclonal antibodies directed to different proteins (human IgG, human myoglobin and HRP) and bispecific antibodies derived thereof to bind antigens immobilized on a surface of a solid phase. Clin Chim Acta, vol. 309, p. 57-71.

6. Dmitriev D.A., Massino Y.S., Segal O.L., Smirnova M.B., Pavlova E.V., Gurevich K.G., Gnedenko O.V., Ivanov Y.D., Kolyaskina G.I., Archakov A.I., Osipov A.P., Dmitriev A.D., Egorov A.M. (2002) Analysis of the binding of bispecific monoclonal antibodies with immobilized antigens (human IgG and horseradish peroxidase) using a resonant mirror biosensor. J. Immunol. Methods, vol. 261, p. 103-118.

7. Массино Ю.С., Цибезов B.B., Дмитриев А.Д., Коляскина Г.И. (1987)

Получение и характеристика моноклональных антител к а-эндоррфину человека. Биотехнология, т. 3, № 6, с. 730-734.

8. Массино Ю.С.. Цибезов В.В., Дмитриев А.Д.. Востриков В.М.. Солдатова И.А.. Коляскина Г.И. (1988) Моноклональные антитела к а-эндорфину, эффективные в иммуногистохимии и иммуноблоттинге. Бгол. Эксп. Биол. Мед., т. 109, № 11, с. 578-581.

9. Массино Ю.С., Кизим Е.А., Дмитриев А.Д. (1991) Новый подход к конструированию гибридных гибридом, основанный на использовании актиномицин-О-резистентной линии миеломы мыши. Бюл. Эксп. Биол. Мед., т. 112, №11, с. 511-514.

Ю.Дергунова H.H., Массино Ю.С., Кизим Е.А., Дмитриев А.Д. (1993) Изучение взаимодействия бифункциональных моноклональных антител с антигенами радиоиммунологическим методом. Бюл. Эксп. Биол. Мед., т. 114, №9, с. 299-301.

П.Дмитриев А.Д., Массино Ю.С.. Дергунова H.H., Кизим Е.А., Сегал О.Л., Смирнова М.Б., Востриков В.М., Коляскина Г.И. (1995) Получение и свойства бифункциональных моноклональных антител к а-эндорфину и пероксидазе хрена в сб.: "Моноклональные антитела в нейробиологии" под ред. Штарка М.Б. и Старостиной М.В., Новосибирск, с. 144-159.

12.Массино Ю.С., Суханова Л.Л., Кизим Е.А., Сегал О.Л., Смирнова М.Б., Монахов В.В., Коляскина Г.И., Дмитриев А.Д. (1994) Получение бифункциональных антител к IgG человека и пероксидазе хрена и их использование для тестирования антител к ВИЧ. Бюлл. Эксп. Биол. Медиц. т. 117, №3, с. 291-293.

13.Дмитриев А.Д., Массино Ю.С., Дергунова H.H., Кизим Е.А., Сегал О.Л., Смирнова М..Б., Востриков В.М., Коляскина Г.И. (1996) Моноклональные биспецифические антитела: получение и изучение антигенсвязывающих свойств. Вестник РАМН, т. 4, с. 46-51.

М.Смирнова М.Б., Дергунова H.H., Кизим Е.А., Массино Ю.С., Никулина В.А., Сегал О.Л., Терешкина Е.Б., Коляскина Г.И., Дмитриев А.Д. (1997) Изучение антигенсвязывающих свойств биспецифических моноклональных антител. Биохимия, т. 62, вып. 1, с. 51-59.

15.Смирнова М.Б., Никулина В.А., Сегал О.Л., Кизим Е.А., Массино Ю.С.,

Рязанская H.H., Коляскина Г.И., Дмитриев А.Д. (1999) Одностадийный твердофазный иммуноферментный сэндвич-метод определения миоглобина с использованием бифункциональных моноклональных антител. Биохимия, т. 64, вып. 6, с. 767-776.

16.Никулина В.А., Кизим Е.А., Массино Ю.С., Сегал O.JL, Смирнова М.Б., Авилов В.В., Сапрыгин Д.Б., Смотров С.П., Коляскина Г.И., Дмитриев А.Д. (1999) Одностадийный твердофазный иммуноферментный сэндвич-метод определения миоглобина в сыворотке крови с использованием трех моноклональных антител к различным эпитопам. Бюл. Эксп. Биол. Мед., т. 127, № 5, с. 597-600.

17.Никулина В.А., Кизим Е.А., Массино Ю.С., Сегал О.Л., Смирнова М.Б., Авилов В.В., Сапрыгин Д.Б., Смотров С.П., Коляскина Г.И., Дмитриев А.Д. (1999) Трехсайтный сэндвич-метод определения миоглобина может быть более эффективным, чем двухсайтный. Биохимия, т. 64, вып. 10,

18.Дмитриев Д.А., Массино Ю.С., Смирнова М.Б., Сегал О.Л., Павлова Е.В., Коляскина Г.И., Осипов А.П., Егоров A.M., Дмитриев А.Д. Связывание биспецифических моноклональных антител с антигенами, адсорбированными на твердой фазе. Биоорганическая химия, (2001), т. 27, №4, с. 265-274.

19.Дмитриев Д.А., Массино Ю.С., Сегал О.Л., Смирнова М.Б., Павлова Е.В., Коляскина Г.И., Гуревич К.Г., Гнеденко О.В., Иванов Ю.Д., Арчаков А.И., Осипов А.П., Дмитриев А.Д., Егоров A.M. (2002) Анализ связывания биспецифических моноклональных антител с иммобилизованным антигеном с помощью оптического биосенсора. Биохимия, т. 67, вып. 12, 1643-1654.

с. 52-60.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АГ - антиген;

Анти-Мб - моноклональные антитела к миоглобину человека; Анти-ЭНД - моноклональные антитела к эндорфину человека; Анти-Мб/ПХ - бифункциональные моноклональные антитела, несущие сайты связывания с миоглобином и пероксидазой хрена;

Анти-ЭНД/ПХ - бифункциональные моноклональные антитела, несущие сайты связывания с эндорфином и пероксидазой хрена; Анти-Ь^О - моноклональные антитела к человека; Анти-ЫцО/ПХ - бифункциональные моноклональные антитела, несущие сайты связывания с человека и пероксидазой хрена; АТ - антитела;

БИАТ - бифункциональные (биспецифические) моноклональные антитела;

ИФА - иммуноферментный метод; Мб - миоглобин;

МКА - моноклональные антитела; ОФД - ортофенилендиамин; ПААГ - полиакриламидный гель; ПХ - пероксидаза хрена; РИА - радиоиммунологический метод; ЭФ - электрофорез;

Ь цепь - легкая цепь молекулы антител; Н цепь - тяжелая цепь молекулы антител; Ы§0 - иммуноглобулин в человека; ББЗ - додецилсульфат натрия.

Отпечатано в типографии ООО «Копиринг» Тираж 100 экз., Заказ 167, 02.10.2003 г.

'^Vjf

Ш 16 179

Оглавление диссертации Дмитриев, Александр Дмитриевич :: 2003 :: Москва

Список использованных сокращений

11 I ВВЕДЕНИЕ II ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 История создания бифункциональных антител и области их применения

2 Способы получения бифункциональных моноклональных антител

3 Тестирование бифункциональных моноклональных антител

4 Рекомбинация легких и тяжелых цепей антител в гибридных гибридомах

5 Антигенсвязывающие свойства бифункциональных моноклональных антител

5.1 Теоретические основы анализа связывания антител с антигеном

5.1.1 Анализ равновесного связывания антител с антигеном в растворе

5.1.2 Модель бивалентного связывания антител с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе

5.1.3 Использование бивалентной модели для предсказания теоретически ожидаемых изменений наблюдаемой равновесной константы ассоциации (Kass) в зависимости от преимущественного характера связывания антител с иммобилизованным антигеном

5.1.4 Использование бивалентной модели для предсказания теоретически ожидаемых изменений параметров кривых связывания в зависимости от преимущественного характера связывания антител с иммобилизованным антигеном

5.1.5 Определение соотношения антител связанных с антигеном моновалентно и бивалентно

5.1.6 Кинетический анализ связывания антител с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе

5.1.7 Преобразование кинетических кривых, получаемых с помощью оптического биосенсора

5.1.8 Использование бивалентной модели для предсказания теоретически ожидаемых изменений наблюдаемых кинетических констант в зависимости от преимущественного характера связывания антител с иммобилизованным антигеном

6 Антигенсвязывающие свойства бифункциональных моноклональных антител

7 Применение бифункциональных антител в иммуногистохимии, иммуноблоттинге и твердофазном иммуноферментном методе

Введение диссертации по теме "Аллергология и иммулология", Дмитриев, Александр Дмитриевич, автореферат

Актуальность проблемы. Наряду с обычными моноклональными антителами (МКА) гибридомная технология позволяет получать биспецифические антитела (БИАТ), несущие места связывания двух различных антигенов [Milstein and Cuello, 1983]. Для получения клонов-продуцентов БИАТ (квадром, тетрадом или триом) сливают две гибридомы (или, в другом варианте, гибридомы и иммунные лимфоциты), которые секретируют различные МКА. В гибридных гибридомах синтезируются легкие (L) и тяжелые (Н) цепи родительских AT и происходит их рекомбинация, в результате чего может образовываться до десяти видов AT, включая БИАТ (рис. 1, А). Несмотря на кажущуюся простоту описанного механизма, многие аспекты процесса образования AT в квадромах остаются неизученными. Прежде всего, это касается факторов, определяющих качественный и количественный состав AT, секретируемых гибридными гибридомами. Исследования по изучению связывания Н и L цепей in vitro [De Preval and Fougereau, 1976; Hamel et al., 1986; Hamel et al., 1987] свидетельствуют, что легкие цепи от двух разных антител могут конкурировать за связывание с одной тяжелой цепью, причем аффинности при связывании могут отличаться более чем на порядок. Таким образом, связывание легких цепей с тяжелыми может быть как случайным (при одинаковой аффинности легких цепей в отношении тяжелой), так и предпочтительным (если одна из легких цепей демонстрирует более высокую аффинность в отношении тяжелой цепи). Подобные механизмы ассоциации легких и тяжелых цепей могут иметь место и в гибридных гибридомах [Milstein and Cuello, 1984]. Важнейшим фактором, влияющим на состав AT (и долю БИАТ), является, по-видимому, способ ассоциации L и Н цепей в гибридных клетках. При случайной рекомбинации должно образовываться много гетерологичных H-L пар, в которых L и Н цепи происходят от-разных родительских AT (см. рис. 1, А; варианты VIII-X). Как правило, плечо AT, образованное сочетанием гетерологичных H-L цепей не обладает АГ-связывающей активностью. В противоположность этому, предпочтительная ассоциация гомологичных L и Н цепей (то есть, цепей, происходящих от одного родительского МКА), теоретически должна способствовать более высокому выходу БИАТ. Изучение взаимодействия L и Н цепей в квадромных клетках и продуктов этого взаимодействия - квадромных AT, осложняется недостаточной разработкой методов анализа иммуноглобулинов, образуемых гибридными гибридомами. Секретируемые антитела представляют собой смесь близких по молекулярному весу и физико-химическим свойствам молекул, поэтому их анализ оказывается достаточно сложной задачей. В особенности это относится к количественным аспектам популяций квадромных AT, которые практически не анализировались. Вместе с тем, вопрос о том, какой тип ассоциации цепей превалирует в квадромах, и как это отражается на составе секретируемых AT, представляет большой теоретический и практический интерес. В теоретическом плане этот вопрос тесно связан с проблемой разнообразия AT. Известно, что одним из факторов, определяющих разнообразие антител, является характер ассоциации L и Н цепей. Сформулирована гипотеза о том, что предпочтительная ассоциация гомологичных L и Н цепей может быть следствием процессов, направленных на отбор высокоаффинных H-L пар во время созревания В-клеток "in vivo" [Preval and Fougereau, 1976]. Существование такого механизма предполагает значительное уменьшение числа потенциально возможных "природных" AT за счет ограничения H-L комбинирования в популяциях лимфоцитов. С практической точки зрения важно то, что предпочтительная ассоциация

А. СЛУЧАЙНАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ ЛЕГКИХ И ТЯЖЕЛЫХ ЦЕПЕЙ Y ^ • y

Бифункциональные антитела

•V А : / ^

II III IV

Антитела к антигену 1

YYY

V VI VII

Антитела к антигену 2

•' Ч-;

VIII IX X

Неактивные антитела

Б. ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНАЯ АССОЦИАЦИЯ ГОМОЛОГИЧНЫХ L-H ЦЕПЕЙ

Y Y

Анти-АГ]

БИАТ

Анти-АГ2

В. ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНАЯ АССОЦИАЦИЯ H-L ЦЕПЕЙ У АНТИТЕЛ К АНТИГЕНУ 1

Анти-АГ j БИАТ Неактивные AT Анти-АГ2

Рисунок 1. Изоформы антител, образуемых гибридными гибридомами при различных типах ассоциации легких и тяжелых цепей повышает эффективность квадром как продуцентов БИАТ.

С типом взаимодействия L и Н цепей тесно связан и вопрос об антигенсвязывающих свойствах как обычных МКА, так и наиболее интересного (с точки зрения биотехнологии) продукта секреции гибридных гибридом - БИАТ. Высказывалось предположение, что предпочтительная ассоциация гомологичных H-L цепей приводит к образованию высокоаффинных антигенсвязывающих сайтов [Hamel et al., 1986, 1987]. Таким образом, если соотнести тип ассоциации Н и L цепей (случайный или предпочтительный) с аффинностью антигенсвязывающих сайтов антител, то можно подтвердить или опровергнуть высказанную гипотезу.

Теоретически, родительские МКА и соответствующее плечо БИАТ имеют одинаковую структуру АГ-связывающих центров (см. рис. 1) и, как следствие, должны проявлять одинаковые АГ-связывающие свойства. Вместе с тем, продемонстрирована возможность сохранения АГ-связывающей активности при сочетании гетерологичных H-L цепей. Образовавшийся при этом АГ-связывающий сайт сохраняет активность AT, от которых происходит Н цепь; правда, аффинность таких AT значительно уменьшается [Hudson et al., 1987]. Это может приводить к возникновению "аномальных" БИАТ с измененными АГ-связывающими центрами. Кроме того, в рекомбинантных AT могут наблюдаться нарушения гликозилирования иммуноглобулиновых цепей и конформационные изменения, влияющие на связывание с АГ. Таким образом, встает вопрос: в какой мере АГ-связывающие центры БИАТ, получаемых с помощью биологического метода, сохраняют аффинность родительских AT. Сведения об этом весьма ограничены: подробное исследование АГ-связывающих свойств БИАТ, полученных с помощью гибридизации клеток, было проведено в единственной работе [Allard et al., 1992].

Антитело Антиген Бифункциональное

Рисунок 2. Связывание моноклональных (монофункциональных) и бифункциональных антител с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе. а - моновалентное связывание антител с иммобилизованным антигеном; б - бивалентное связывание антител с иммобилизованным антигеном; в - связывание бифункциональных антител с иммобилизованным антигеном (может быть только моновалентным).

Весьма важным как с практической, так и с теоретической точки зрения является проблема взаимодействия БИАТ с антигенами, адсорбированными на твердой фазе. Молекула иммуноглобулина класса IgG, несет два АГ-связывающих сайта и может связываться с антигеном, адсорбированным на твердой фазе, как одним АГ-связывающим сайтом (моновалентно, см. рис. 2, а), так и двумя АГ-связывающими сайтами одновременно (бивалентно, см. рис 2, б). БИАТ несут два АГ-связывающих сайта к различным антигенам и, таким образом, могут связываться с адсорбированным АГ только моновалентно (см. рис. 2, в). Очевидно, что бивалентное связывание с антигенами существенно прочнее, чем моновалентное, таким образом, в любом варианте связывания с иммобилизованным антигеном обычные МКА должны быть результативнее БИАТ. Однако большой массив публикаций свидетельствует о высокой эффективности БИАТ в иммуногистохимии, иммуноблоттинге и при взаимодействии со злокачественными клетками. Вместе с тем, отсутствуют теоретические работы, в которых бы корректно сравнивались свойства моновалентных (т.е. БИАТ) и бивалентных антител (обычных МКА) при связывании с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе. Следовательно, утверждения о высокой эффективности БИАТ в сравнении с обычными МКА представляются весьма спорными. На наш взгляд, для окончательного вывода требуется сравнительный анализ эффективности связывания МКА и БИАТ, несущих тождественные сайты связывания с АГ, с иммобилизованным антигеном. Кроме того, необходим сравнительный анализ эффективности детектирующих моноклональных AT (конъюгатов) и БИАТ, несущих сайт связывания с ферментом, в твердофазном ИФА.

Итак, актуальным является анализ механизмов образования AT в гибридных гибридомах и изучение АГ-связывающих свойств БИАТ как в растворе, так и при взаимодействии с иммобилизованными антигенами. В настоящей работе предпринята попытка исследовать некоторые из этих вопросов, используя панель тетрадом, продуцирующих антитела к антигенам, которые значительно отличаются по структуре и молекулярному весу. Анализируемые МКА и БИАТ несли сайты связывания со следующими АГ: эндорфином (М^бОО), миоглобином (Мг« 18600), пероксидазой хрена (Мг«40000) и IgG человека (Мг» 160000).

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы - анализ взаимодействия БИАТ с антигенами (как в растворе, так и при иммобилизации АГ на твердой фазе), а также разработка экспериментальных подходов, позволяющих проводить количественный и качественный анализ продуктов секреции гибридных гибридом и расшифровывать способ ассоциации L и Н цепей в гибридных клетках.

В задачи работы входило:

1) Разработать теоретические модели рекомбинации L и Н цепей в гибридных гибридомах, позволяющие предсказывать типы антител, образуемых квадромой, в зависимости от способа ассоциации (случайного или предпочтительного) легких и тяжелых цепей.

4) Путем сопоставления экспериментальных и теоретических распределений антител и результатов электрофоретического анализа цепьевого состава антител определить способ ассоциации L и Н цепей в квадромных клонах.

И. Соотнести истинную аффинность родительских антител и аффинность тождественных антигенсвязывающих сайтов бифункциональных антител:

3) Соотнести тип ассоциации Н и L цепей (случайный или предпочтительный) в антигенсвязывающих сайтах антител с аффинностью этих антигенсвязывающих сайтов и подтвердить (или опровергнуть) гипотезу о том, что предпочтительная ассоциация гомологичных Н и L цепей приводит к образованию высокоаффинных антигенсвязывающих сайтов.

III. Для определения типа взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентное или бивалентное) апробировать новую модель: соотнести параметры связывания родительских антител и тождественного антигенсвязывающего сайта бифункциональных антител. Для анализа характера взаимодействия использовать антитела к антигенам различного молекулярного веса и структуры: миоглобину (Мг«18600), пероксидазе хрена (Мг«40000) и IgG человека (Мг»160000). Для определения характера взаимодействия антител с сорбированным антигеном использовать как традиционные методы (радиоиммунологический и твердофазный ИФА), так и анализ с помощью оптического биосенсора IAsys. Соотнести результаты, полученные обоими методами.

IV. Проанализировать относительную эффективность бифункциональных антител, несущих сайт связывания с тестируемым антигеном и пероксидазой в сравнении с традиционными конъюгатами антител с пероксидазой, как детектирующих молекул в твердофазных тестах (твердофазный иммуноферментный анализ и сэндвич-метод).

Научная новизна и научно-практическая значимость исследования. В результате проведенного исследования были впервые количественно проанализированы популяции антител, синтезируемых квадромой. Также впервые проведен анализ H-L состава квадромных антител с помощью двумерного электрофореза в полиакриламидном геле. Для БИАТ со специфичностью анти-ЭНД/ПХ убедительно доказано наличие гомологичного предпочтения в одной из H-L пар и случайную рекомбинацию в другой. Разработанные в настоящей работе оригинальные экспериментальные подходы и теоретические модели расширяют возможности анализа квадромных антител и механизмов, управляющих образованием этих антител в квадромных клетках. Кроме того, анализ аффинности БИАТ, образованных квадромой, показал, что истинная аффинность любого антигенсвязывающего сайта БИАТ нашей панели тождественна истинной аффинности соответствующих антигенсвязывающих сайтов родительских антител.

Продемонстрировано отсутствие кооперативного эффекта при связывании БИАТ с антигенами. На панели бифункциональных антител показано, что избыток одного из антигенов не влияет на связывание (аффинность) БИАТ со вторым антигеном. Впервые продемонстрировано in vivo (на уровне тетрадом, синтезирующих антитела), что предпочтительная ассоциация гомологичных H-L цепей AT не приводит к образованию высокоаффинных антигенсвязывающих сайтов.

Впервые для оценки характера взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном использована модель, которая предполагает сравнительный анализ параметров связывания родительских моноклональных антител (могут связываться с иммобилизованным антигеном моновалентно и бивалентно) и бифункциональных моноклональных антител, несущих тождественный сайт связывания с антигеном (могут связываться с иммобилизованным антигеном только моновалентно). Характер взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном проанализирован как классическими методами (радиоиммунологическим и твердофазным ИФА), так и с помощью оптического биосенсора IAsys. Показано, что оба метода дают идентичные результаты. Сделан вывод о перспективности биосенсорных систем для оценки взаимодействия антиген-антитело.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В настоящем обзоре мы кратко опишем историю создания БИАТ и области их применения, отсылая, в основном, к обзорным статьям, опубликованным за последние 10 лет. Относительно полно будут освещены только проблемы, которые составляют предмет наших исследований. Акцент будет сделан на моноклональных бифункциональных антителах, получаемых с использованием гибридомной технологии. Мы опишем методы получения клонов-продуцентов БИАТ, механизмы ассоциации L и Н цепей в гибридных гибридомах, механизмы взаимодействия антител с антигенами (включая антигены, иммобилизованные на твердой фазе) и применение БИАТ в качестве меченых антител в твердофазном ИФА.

Заключение диссертационного исследования на тему "Механизмы образования и антигенсвязывающие свойства бифункциональных моноклональных антител"

VI. выводы

1) Разработаны теоретические модели рекомбинации L и Н цепей в гибридных гибридомах, позволяющие предсказывать типы антител, образуемых квадромой, в зависимости от способа ассоциации (случайного или предпочтительного) легких и тяжелых цепей.

3) Доказано, что в квадроме 40E9x36F9, продуцирующей бифункциональные антитела со специфичностью антиэндорфин/антипероксидаза, Н и L цепи антиэндорфиновых антител ассоциируются предпочтительным образом, в то время как Н цепи антипероксидазных антител одинаково эффективно ассоциируются с L цепями как антиэндорфиновых, так и антипероксидазных антител. Таким образом, оба типа ассоциации Н и L цепей - случайный и предпочтительный имеют место в данной квадроме.

5) Предложены практические рекомендации по получению квадром - эффективных продуцентов бифункциональных моноклональных антител.

II. Показано, что уровень секреции антител родительскими гибридомами (антиэндорфиновой - 40Е9 и антипероксидазной 36F9) не обязательно наследуется тетрад омой (40E9x36F9, специфичность -антиэндорфин/антипероксидаза).

III. Сравнительный анализ истинной аффинности родительских антител и аффинности тождественных антигенсвязывающих сайтов бифункциональных антител позволил доказать:

1) Истинная аффинность (равновесная константа ассоциации, определяемая при связывании антител с антигеном в растворе) родительских антител равна аффинности тождественных антигенсвязывающих сайтов бифункциональных антител (на панели антител к антигенам различного молекулярного веса и структуры -эндорфину (Мг«1700), пероксидазе хрена (Мг«40000) и IgG человека (Мг«160000).

2) Для бифункциональных антител со специфичностью антиэндорфин/антипероксидаза и анти-Ь^О/антипероксидаза продемонстрировано, что избыток одного из антигенов не влияет на аффинность бифункциональных антител в отношении второго антигена. Таким образом, кооперативный эффект при связывании бифункциональных антител с антигенами (с Mr«1700, Mr«40000 и Мг»160000) отсутствует.

IV. Для определения типа взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентное или бивалентное) впервые предложена новая модель: сравнительный анализ параметров связывания родительских антител и тождественного антигенсвязывающего сайта бифункциональных антител. Проанализировано взаимодействие антител с иммобилизованными антигенами различного молекулярного веса и структуры: миоглобином (М,л*18600), пероксидазой хрена (Мг«40000) и IgG человека (Мг«160000). Анализ проведен двумя независимыми методами: радиоиммунологическим и с помощью оптического биосенсора IAsys.

1) Доказано, что радиоиммунологический метод и метод с использованием оптического биосенсора IAsys дают тождественные параметры связывания антител с иммобилизованным антигеном.

2) Доказано, что антимиоглобиновые и антипероксидазные антитела связываются с антигеном, иммобилизованным на поверхности иммунных планшетов, преимущественно двумя антигенсвязывающими сайтами одновременно (бивалентно). Вместе с тем, антитела к IgG человека связываются с иммобилизованным антигеном только одним антигенсвязывающим сайтом (моновалентно).

II.8. Заключение

Выход БИАТ и их антигенсвязывающие свойства могут определяться механизмом рекомбинацией Н и L цепей антител в гибридных гибридомах. Предпочтительная рекомбинация гомологичных Н и L цепей способствует увеличению выхода БИАТ относительно других продуктов секреции квадромы и приводит к образованию антигенсвязывающих сайтов БИАТ, которые идентичны таковым родительских МКА. В этой связи весьма важным является вопрос о том, насколько часто рекомбинация Н и L цепей происходит случайным или предпочтительным образом. Не менее важным как с практической, так и с теоретической точек зрения является и проблема идентичности антигенсвязывающих свойств БИАТ таковым родительских антител. В исследовании этих проблем существенным является корректный анализ антител, продуцируемых каждой квадромой. Пока существуют только единичные работы, посвященные исследованию этих вопросов [De Lau et al., 1991; Allard at al., 1992; Auriol et al., 1994]. Аффинность БИАТ может зависеть от конформационных изменений структуры молекулы, связанных с сочетанием гетерологичных (относящихся к разным субклассам IgG) Н цепей и наличия или отсутствия кооперативного эффекта при связывании антител с антигенами. При анализе антигенсвязывающих свойств МКА актуальны следующие вопросы. Во-первых, - наличии или отсутствии кооперативного эффекта при связывании антител с антигенами. Во-вторых, определение истинной аффинности антител в растворе (аффинности отдельно взятого антигенсвязывающего сайта). В третьих, исследование характера связывания антител с иммобилизованным антигеном (моновалентное или бивалентное). При решении этих вопросов до сих пор, за немногими исключениями, сравнивались параметры связывания нативных AT и их F(ab) фрагментов. Подобное сравнение нельзя признать достаточно корректным, так как нативная молекула IgG в сравнении F(ab) фрагментами является гораздо более жесткой структурой. Моноклональные БИАТ являются более удобной моделью для исследования этих вопросов, так как, во-первых, сравниваются АГ-связывающие свойства одного из плеч БИАТ с таковыми родительских МКА, и, во-вторых, о наличии кооперативного эффекта можно судить, оценивая параметры связывания одного из антигенов в присутствии избытка второго. Пока опубликована только одна работа, посвященная данной проблеме [Allard at al., 1992]. Кроме того, БИАТ, структура которых (исключая структуру вариабельной части молекулы одного из антигенсвязывающих сайтов) тождественна структуре молекул родительских AT, являются идеальной моделью для изучения связывания антител с иммобилизованным антигеном; в том числе и вопроса о наличии бивалентного связывания. Весьма актуален и вопрос о сравнительной эффективности БИАТ, несущих сайт связывания с тестируемым антигеном и ферментом, как меченых антител в твердофазных тестах. Решению этих проблем посвящено настоящее исследование.

III. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

III.I. Получение клонов-продуцентов моноклональных антител.

При выполнении настоящего исследования были получены клоны-продуценты моноклональных антител к следующим антигенам: пероксидазе хрена, IgG человека, эндорфину человека и миоглобину человека. Мышей линии Balb/c иммунизировали либо одним из упомянутых антигенов (15-20 мкг/мышь), либо, в случае эндорфина человека, антигеном, который был ковалентно связан (конъюгирован) с белком-носителем - бычьим сывороточным альбумином. Раствор антигена в 0,15 М NaCl эмульгировали с полным (первая иммунизация) или неполным (последующие иммунизации) адъювантом Фрейнда. При иммунизации эмульгированный антиген вводили в 6-8 точек подкожно. Общее число иммунизаций варьировало от 4 до 6. За четыре дня до слияния мышь с наибольшим титром антител к антигену в крови (определяли с помощью иммуноферментного метода) получала ежедневные инъекции 100 - 200 мкг антигена в 0,15 М NaCl (внутрибрюшинно). Гибридомы получали по методу Келлера и Милыптейна [Kohler and Milstein, 1975], путем гибридизации спленоцитов иммунной мыши с клетками миеломы мыши Х-63о

Ag.8.653. К осадку клеток, содержащему 10 лимфоцитов селезенки и 107 миеломных клеток добавляли по каплям в течение 45 секунд 1,5 мл 45%-ного раствора полиэтиленгликоля (Мг«1500) в буфере состава: 0,8% NaCl, 0,04% КС1, 0,177 % NaH2P04.H20, 0,2% глюкозы, 0,01% фенолового красного и 10% диметилсульфоксида. В течение последующих 90 секунд объем смеси доводили тем же буфером до 50 мл. Далее суспензию клеток инкубировали 10 минут при комнатной температуре и переносили клетки на селективную среду HAT содержащую 10"4 М гипоксантина, 1,6x10"5 М тимидина и 4х10"5М аминоптерина и высевали в 96 луночные планшеты по 1,2x105 клеток в лунку. Клоны тестировали на наличие антител к антигену с помощью твердофазного иммуноферментного метода (ИФА) (см. ниже). Для получения асцитной жидкости клетки клонированных (не менее трех раз) гибридом прививали в брюшную полость мышей линии BALB/c.

III.2. Очистка моноклональных антител с помощью ионообменной хроматографии. Антитела очищали с помощью ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефарозе. Асцитную жидкость (5-10 мл) центрифугировали (2000xg, 20 мин, 0°), супернатант разводили в 5 раз 0,025 М Ыа-фосфатным буфером с 0,15 М NaCl (ФС-буфер) и высаливали антитела добавлением сульфата аммония - 0,4 г/мл. Антитела осаждали центрифугированием (2000xg, 20 мин, 0°) и растворяли в 0,025 М Tris-HCl буфере, рН 9. Раствор диализовали против того же буфера в течение ночи и наносили на колонку с ДЕАЕ-сефарозой-4В размером 1,6x20 см, уравновешенную 0,025 М Tris-HCl-буфером, рН 9. На колонку наносили от 100 до 500 мг белка. Элюцию проводили градиентом NaCl: 0-0,3 М в том же буфере; объем градиента - 500 мл, скорость элюции 30 мл/час. Фракции пиков пулировали и определяли антигенсвязывающую активность антител (см. ниже).

III.3. Определение антипероксидазной активности антител. Антипероксидазную активность антител определяли двумя методами. Полоски иммунных планшетов (Госниимедполимер, Россия) насыщали ПХ (Calbiochem, Rz>3,0) в течение ночи при комнатной температуре (10 мкг/мл в 0,05 М карбонатном буфере, рН 9,5; 100 мкл раствора на лунку). Готовили разведения антител в концентрациях: 1, 2, ., 4096 нг/мл. Антитела растворяли в буфере состава: 0,025 М Na-фосфатный буфер рН 7,4 с 0,15 М NaCl, 0,2% БСА и 0,05% твином 20 (ИФА-буфер). После четырех - пяти отмывок дистиллированной водой планшеты последовательно инкубировали при 37°С с разведениями антител (3 часа, 100 мкл на лунку), антимышиными овечьими антителами, мечеными биотином (Sigma, 0,7 мкг/мл в ИФА-буфере, 100 мкл на лунку, 1 час) и авидином, конъюгированным со щелочной фосфатазой (Sigma, 0,5 мкг/мл в ИФА-буфере, 100 мкл на лунку, 1 час). Цветную реакцию проводили с гексагидратом /?-нитрофенилфосфата натрия (PNPP). PNPP (1 мг/мл) растворяли в 9,7% диэтаноламиновом буфере, с 0,01% MgCl2, рН 9,8. Буфер доводили до рН 9,8 с помощью 1 N НС1. Инкубация (100 мкл на лунку) продолжалась 30 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 2N NaOH (50 мкл на лунку). Поглощение регистрировали на плашечном сканере Labsystems при 405 нм.

Второй метод тестирования антипероксидазной активности антител основан на том, что связывание с антителами клона 36F9 не влияет на активность фермента. Полоски иммунных планшетов насыщали аффинно-очищенными AT кролика к IgG мыши (10 мкг/мл в 0,1 М карбонатном буфере рН 9,5; 100 мкл на лунку) в течение ночи при комнатной температуре. Далее планшеты инкубировали 2,5 часа с антипероксидазными антителами (0,1 - 1 мкг/мл, 100 мкл на лунку) в присутствии пероксидазы хрена (5 мкг/мл). Антитела и пероксидазу растворяли в ИФА-буфере). После каждой инкубации планшеты споласкивали 4-5 раз дистиллированной водой. Ферментативную реакцию проводили 20-30 минут при комнатной температуре, используя в качестве субстрата о-фенилендиамин (ОФД), 1 мг/мл в 0,05 М цитратно-фосфатном буфере (ЦФБ) рН 5, в присутствии 0,03% Н202, (100 мкл раствора на лунку). Реакцию останавливали добавления в лунки 50 мкл 1,5 М H2SC>4. Планшеты сканировали на плашечном спектрофотометре фирмы Labsystems при длине волны 472 нм.

III.4 Определение антигеисвязывающей активности антител.

При определении антигеисвязывающей активности антител иммунные планшеты насыщали антигеном (эндорфином, миоглобином или hlgG) в течение ночи при комнатной температуре (2-10 мкг/мл в 0,05 М Na-карбонатном буфере рН 9,5; 100 мкл раствора на лунку). Далее планшеты инкубировали с тестируемыми антителами в концентрации 0,5-10 мкг/мл (100 мкл/лунку, 2,5 часа, 37°) и, после четырех пятикратной отмывки, - с аффинно-очищенными кроличьими антимышиными AT, конъюгированными с пероксидазой хрена (разведение конъюгата 1:3000, 100 мкл на лунку, 1 час, 37°). Антитела и конъюгат растворяли в ИФА-буфере. Ферментативную реакцию с ОФД проводили как описано выше (см. раздел III.2).

III.5. Определение активности бифункциональных антител иммуноферментным методом с двумя антигенами (doubl antigen ELISA-test). Для определения способности бифункциональных антител связывать одновременно два антигена (один из которых пероксидаза) иммунные планшеты насыщали антигеном (эндорфином, миоглобином или hlgG) как описано выше (см. раздел III.3). После отмывки в лунки планшетов добавляли 50 мкл раствора БИАТ (50-1000 нг/мл) и 50 мкл раствора пероксидазы (1 мкг/мл). Антитела и пероксидазу растворяли в ИФА-буфере. Планшеты инкубировали 2,5 часа при 37° и после отмывки проводили ферментативную реакцию с ОФД как описано выше.

III.6. Приготовление аффинных носителей. Антигены (эндорфин, миоглобин, пероксидазу хрена и IgG человека) ковалентно связывали с BrCN - сефарозой в соответствии с рекомендациями фирмы "Farmacia". Один мг антигена (в случае эндорфина 100 мкг) конъюгировали со 100 мг BrCN - сефарозы. Перед конъюгацией необходимое количество BrCN-сефарозы 4В предварительно промывали 15 мин. раствором НС1 (рН 2-2,5) для удаления стабилизирующих добавок декстрана и лактозы.

Активированную сефарозу промывали большим избытком дистиллированной воды, суспендировали в 5 объемах (по отношению к весу сухой сефарозы) 0,1 М NaHC03 с 0,5 М NaCl и добавляли конъюгируемый белок, растворенный в минимальном объеме того же буфера. Реакции проводили при мягком перемешивании на круговом смесителе (30 об/мин) в течение ночи при 4°С. Содержимое пробирки центрифугировали (5 минут, 1000g, 0°) и определяли в надосадочной жидкости количество не связавшегося лиганда по оптической плотности при 280 нм. Активные группы инактивировали добавлением глицина (35 мг на мл) с последующим перемешиванием на круговом смесителе при комнатной температуре в течение двух часов. Для удаления нековалентно адсорбированного белка проводили холостую хроматографию с полученным сорбентом: вначале пропускали 0,025 М Ыа-фосфатный буфер рН 7,4 с 0,15 М NaCl, затем 0,1 М уксусную кислоту (до рН 2,5 доводили НС1) и затем Ыа-фосфатный буфер. Эффективность конъюгирования белка с сефарозой указанным методом достигала 98%.

III.7. Аффинная очистка моноспецифических антител.

Моноспецифические антитела (анти-ЭНД, анти-ПХ, анти-Мб и анти hlgG) очищали из асцитных жидкостей соответствующих гибридом с помощью одностадийной аффинной хроматографии. Предварительно IgG асцитных жидкостей осаждали (NHt^SC^ (0,5 г/мл). Осадок, полученный после центрифугирования (4000 об/мин., 0°С, 20 мин.), растворяли в 15-30 мл 0,025 М Na-фосфатного буфера рН 7,5 (ФБ) с 0,15 М NaCl и три раза пропускали через колонку с иммуносорбентом. Иммуносорбент промывали тем же буфером до исчезновения поглощения при 280 нм. Антитела элюировали 0,1 М уксусной кислотой рН 2,2 (доводили НС1). Элюат нейтрализовали концентрированным аммиаком.

111.8. Аффинная очистка бифункциональных антител.

Аффинную очистку бифункциональных антител из асцитных жидкостей проводили в две стадии, путем последовательных аффинных хроматографий. Все БИАТ нашей панели несли сайт связывания с пероксидазой. Первый этап очистки БИАТ - аффинная хроматография на ПХ-сефарозе (см. предыдущий раздел). Второй этап очистки -хроматография на соответствующем антиген-сефарозном носителе (так, для антител со специфичностью анти-Мб/анти-IIX второй этап -хроматография на миоглобин-сефарозе). Все процедуры аффинной хроматографии совпадают с описанными в разделе III.7.

111.9. Определение концентрации белка. Концентрацию очищенного раствора миоглобина, очищенных антител и пероксидазы хрена определяли оптическим методом. Полагали, что при концентрации Мб 10 мг/мл и Апонм^^,2 [Faseuau, 1976]; при концентрации очищенных антител 10 мг/мл [Faseuau, 1976]. Для 1%-ного раствора очищенной ПХ ^знм=22'75 и ^шшм =7'3 [Ishikawa et al., 1983].

111.10. Фракционирование продуктов секреции тетрадомы для количественного определения антител. Для количественного определения субфракций антител, которые продуцирует гибридная гибридома 40E9x36F9 (анти-ЭНД/анти-ПХ) к фиксированному объему культурального супернатанта добавляли БСА (до 0,2%) и твин 20 (до 0,05%). Схема фракционирования иллюстрируется рис. 6. Элюэнт (0,1 М уксусная кислота рН2,2) также включал БСА и твин 20 в указанных концентрациях. После фракционирования на ПХ-сефарозе антитела разделяли на две субфракции: связавшиеся с ПХ-сефарозой (антипероксидазные и бифункциональные) и не связавшиеся с ПХ-сефарозой (антиэндорфиновые и неактивные; см. также рис 1). После

Рисунок 6. Схема фракционирования продуктов секреции квадромы 40E9x36F9 (антиэндорфин/антипероксидаза) с помощью аффинной хроматографии. очистки антител, связавшихся с ПХ-сефарозой, на ЭНД-сефарозе выделялись БИАТ (связывались с ЭНД-сефарозой) и антиэндорфиновые AT (не связывались с ЭНД-сефарозой). Антитела, которые на первом этапе очистки не связывались с ПХ-сефарозой, очищали на ЭНД-сефарозе в результате чего выделяли фракцию анти-ЭНД антител и неактивных антител (см. рис. 6). Итогом описанной схемы разделения было получение четырех фракций AT, продуцируемых тетрадомой: бифункциональных, антипероксидазных, антиэндорфиновых и неактивных, которые определялись количественно.

111.11. Приготовление антигенов и антител, меченых 1251.

Эндорфин, миоглобин, hlgG и очищенные антитела иодировали 1 хлораминовым методом (20 мБк I на 1 мкг ЭНД или на 5-10 мкг другого белка). Инкубационная смесь включала: белок или пептид в 10 мкл Н20, 10 мкл 0,5 М ФБ рН 7,5; около 10 мкл раствора ,251 и 10 мкл хлорамина Т (0,5 мг/мл). Реакция продолжалась 30 сек при легком покачивании пробирки. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл ИФА-буфера с 2% меркаптоэтанолом [Greenwood et al., 1963]. Йодированный белок очищали от свободного 1251 путем гель фильтрации на сефадексе G-10, уравновешенном ИФА-буфером или с помощью аффинной хроматографии.

111.12. Определение концентрации меченых I антител после аффинной очистки. Для определения концентрации меченых AT готовили разведения родительских МКА и БИАТ в концентрациях: 1, 2, ., 4096 нг/мл (стандартные кривые связывания). Планшеты, насыщенные антигеном (пероксидазой, hlgG или Мб), последовательно инкубировали со стандартным количеством антител или соответствующими мечеными AT (все пробы в четырех повторах), антимышиными антителами, мечеными биотином и авидином, конъюгированным со щелочной фосфатазой (детали описаны в разделе III.2).

Для определения концентрации БИАТ анти-ПХ/hIgG анализировали их связывание с ПХ и hlgG и рассчитывали среднюю концентрацию. Для определения концентрации БИАТ анти-ПХ/Мб анализировали их связывание с ПХ и Мб и рассчитывали среднюю концентрацию.

111.13. Определение концентрации антител в культуральных супернатантах радиоиммунологическим методом. Для радиоиммунологического определения антител использовалась антисыворотка к суммарным иммуноглобулинам мыши, полученная в

Институте эпидемиологии и микробиологии им. Гамалея РАМН. 1

Инкубационная смесь включала меченные I антитела (30000 ерш), стандартное количество антител или исследуемого образца и антисыворотку, в разведении, которое обеспечивало связывание около 50% иммунореактивного меченого антигена. Концентрацию IgG во фракции неактивных антител определяли с использованием 1-БИАТ в качестве меченого антигена; тот же меченый антиген использовался при определении БИАТ. При определении антител к ПХ инкубационная смесь содержала меченные ,251 антитела к ПХ, при определении антиэндорфиновых антител - меченные I антитела к ЭНД. Все компоненты инкубационной смеси растворяли в РИА буфере (см. раздел 8). Инкубационная смесь объемом 1 мл включала 0,1 мл кроличьей антисыворотки против мышиного IgG (при конечном разведении 5x10"6, 8x10"6 и 1,25x10"6 для меченых антител к ЭНД, ПХ и БИАТ, соответственно), 0,1 мл исследуемого образца или стандарта соответствующих антител (в концентрации 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 и 128 нг в пробе) и 0,7 мл ИФА-буфера. При измерении концентрации иммуноглобулинов во фракции неактивных антител в качестве стандарта использовали БИАТ. Пробы инкубировали при комнатной температуре 16-24 часа, добавляли в каждую пробирку 0,1 мл ослиных антикроличьих антител в разведении 1:5, преинкубированных с 5%-ной о нейтральной сывороткой мыши (1 час при 37 С), и 0,1 мл нейтральной сыворотки кролика в разведении 1:50. Через сутки в пробы добавляли 1,5 мл физиологического раствора, центрифугировали (30 мин., 1000 g, 0°С) и после удаления супернатантов определяли радиоактивность в осадках. Контрольная ростовая среда (DMEM с 10% эмбриональной сыворотки телят) не влияла на связывание меченых антител с антимышиной сывороткой. Общую концентрацию иммуноглобулинов в нефракционированных культуральных супернатантах квадром определяли как было описано выше, используя аффинноочищенные БИАТ для приготовления меченого антигена и стандартов.

111.14. Анализ связывания меченых 1251 антител с антигеном, адсорбированным на твердой фазе. Гибкие иммунные планшеты (Titertek) насыщали антигеном, как описано в разделе 4.5 (50 мкл на лунку) и инкубировали 3 часа при 37°С с растворенными в ИФА-буфере 1251-мечеными антителами (1x103 - 1x107 срт/мл, 50 мкл раствора на лунку). Двукратное увеличение времени инкубации не приводило к достоверному увеличению регистрируемого связывания (данные не приводятся). Планшеты 4-5 раз споласкивали дистиллированной водой, высушивали ночь при комнатной температуре, вырезали лунки и просчитывали на у-счетчике GammaTrac 1191. Для определения общего количества 1251-меченых антител из каждого разведения просчитывалась аликвота объемом 50 мкл.

111.15. Определение равновесной константы ассоциации при связывании антител с антигенами. Параметры связывания антител с антигенами определяли в соответствии с теорией, которая изложена в разделе II.5.1. Равновесные константы ассоциации в растворе (Ка) монофункциональных и бифункциональных антител с ЭНД, hlgG и миоглобином определяли радиоиммунологическим методом. При определении констант делалось допущение, что меченый и "холодный" антиген связываются с антителами одинаковым образом. Кривые вытеснения меченого лиганда "холодным" строили в координатах Скэтчарда [Scatchard, 1949]. Из графика зависимости B/F (отношение доли связанного антигена [В] к свободному [F]) от концентрации связанного [В] определяли равновесную константу ассоциации Ка. При расчетах исходили из того, что в реакции связывания с антителами участвует не весь меченый антиген, а только его "иммунореактивная" часть. Иммунореактивный антиген определялся как та доля меченого антигена, которая связывается с антителами при их относительном избытке. Доля "иммунореактивного" антигена определялась для каждой партии меченого 1251 лиганда. Концентрация свободного (F) и связанного (В) лиганда вычислялась по формулам: В0 (ерш) = 0,5 х Ти; В (нМ) = {Во (cpm) - Bj (ерш)} х к; F (нМ) = С0 (нМ) - В (нМ), где

Ти - суммарное количество ,251-антигена в инкубационной смеси, способного связываться антителами, (иммунореактивный лиганд; определяли из предварительных экспериментов по связыванию);

Во - 1251-антиген, связавшийся с антителами в отсутствие немеченого антигена, ерш; к - коэффициент, переводящий соответствующее количество меченого антигена из ерш в нМ (например, из расчета следует, что 15000 ерш соответствуют 1,5x10"11 М ЭНД);

Bj - меченый антиген, связавшийся с антителами в присутствии данной концентрации немеченого, cpm;

В - концентрация связавшегося с антителами немеченого антигена, нМ.

F - концентрация "свободного", т.е. не связавшегося с антителами немеченого антигена;

Со - общая концентрация немеченого антигена в инкубационной смеси, нМ.

Наклон прямой, построенной в координатах Скэтчарда (по оси абсцисс - В, по оси ординат - B/F), определял Ка.

Сходным образом строили графики Скэтчарда при определении параметров связывания меченых 1251 антител с антигенами, иммобилизованными на твердой фазе. Однако в этом случае полагали, что 100% меченых антител обладают способностью связываться с иммобилизованным антигеном. Это допущение вполне оправдано, так как все антитела очищались с помощью аффинной хроматографии на антиген-сефарозе. При компьютерном построении графиков была использована программа Microsoft Exel.

111.16. Определение равновесной константы ассоциации антипероксидазных антител. Связывание пероксидазы хрена с монофункциональными и бифункциональными антителами, несущими тождественный сайт связывания с ПХ проводили твердофазным ИФА, как описано в разделе Ш.2. После насыщения планшетов антипероксидазными или бифункциональными антителами в планшеты добавляли 100 мкл раствора ПХ в концентрациях от 6,2x10"12 М до 8x10" 10 М. В качестве субстрата ПХ для специфического окрашивания использовали ОФД. Все измерения проводили в трипликатах и концентрацию связанной ПХ определяли из калибровочной прямой с известными концентрациями ПХ. В предварительных экспериментах было показано, что активность ПХ не меняется при связывании с избытком антител. Концентрацию свободной ПХ вычисляли вычитанием связанной концентрации из общей и Ка определяли из наклона графика Скэтчарда (см. раздел III. 14).

111.17. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствие додецилсульфата натрия. Электрофорез в полиакриламидном геле с SDS-Na проводили в вертикальных пластинах толщиной 1 мм по методу Лэммли [Laemmli, 1970]. Разделяющий гель содержал 12,5% акриламида и 0,1% метиленбисакриламида в 0,375 М трис-HCl буфере, рН 8,9. Концентрирующий гель включал акриламид и метиленбисакриламид в концентрации 3% и 0,5% соответственно в 0,125 М трис-HCl, рН 6,8. Оба буфера включали 0,1% SDS-Na и 0,025% тетраметилэтилендиамина. Для инициации полимеризации вносили персульфат аммония в конечной концентрации 0,1%. Высота концентрирующего геля составляла 7-12 мм. Электродный буфер - 0,025 М трис, 0,192 М глицин (трис-глициновый буфер, рН 8,3) с 0,1% SDS-Na. Электрофорез проводили при напряжении 6,25 вольт/см до тех пор, пока краситель бромфеноловый синий не проходил в разделяющем геле 70-80 мм. В качестве маркеров молекулярной массы использовали набор низкомолекулярных стандартов для электрофореза фирмы "Farmacia".

111.18. Двумерный электрофорез. Двумерный электрофорез антител, очищенных из асцитных жидкостей квадромы 40E9x36F9 (БИАТ, анти-ЭНД/ПХ) и родительских AT (анти-ЭНД и анти-ПХ) был выполнен по методу О'Фаррелл [O'Farrel, 1975], с использованием 20 мкг белка на пробу. Окрашивание гелей проводили Кумасси голубым.

111.19. Анализ связывания антител с иммобилизованным антигеном с помощью оптического биосенсора IAsys. В настоящей работе определение параметров связывания антител с иммобилизованным антигеном было выполнено с помощью биосенсора резонансное зеркало, IAsys, фирмы Fisons Applied Sensor Technology, UK, (FAST). Этот прибор позволяет следить за процессами взаимодейст

Оптический биосенсор резонансное зеркало lAsys

Вибромешалка

Раствор антител

Слой с низким индексом преломления

Биослой

Слой с высоким индексом преломления Поляризатор

Детектор

Передвижение лазера (10 )

Резонансный свет

Свет при резонансном угле Н Свет при веек других углах Н Б

Сигнал

Время, с

Рисунок 7. Устройство и принцип действия оптического биосенсора IAsys.

А. Схема оптического биосенсора IAsys.

Б. Иммобилизация пероксидазы на поверхности кюветы (связывание с карбоксиметилированным декстраном). 1 - активация декстрана EDC и NHS; 2 - промывка кюветы PBST; 3 - промывка кюветы 10 тМ натрий ацетатным буфером; 4 - добавление HRP; 5 -деактивация этаноламином. вия антиген-антитело на границе раздела фаз, непосредственно в то время, когда они происходят, без использования меченых реагентов [Cush et al., 1993, Buckle et al., 1993, Davies et al., 1994]. Важным преимуществом подобных биосенсоров при изучении связывания антител с иммобилизованными антигенами является возможность быстрого определения не только наблюдаемой равновесной константы ассоциации (К^), но и наблюдаемых кинетических констант ассоциации и диссоциации (kass и kdiss) [Karlson et al., 1991, Roggenbuck et al., 1994, George et al., 1995, Yeung et al., 1995, Nice et al., 1996, Nieba, 1996, Reinartz et al., 1996]. Принцип действия IAsys (рис. 7) заключается в следующем: поверхность биосенсора освещают лазером, при этом в поверхностном слое возникает быстро исчезающее волновое поле, позволяющее детектировать малейшие изменения индекса преломления и (или) плотности поверхностного слоя биосенсора (резонансного зеркала). Например, при иммунологической реакции антител с иммобилизованным антигеном плотность поверхностного слоя увеличивается, и соответствующим образом увеличивается регистрируемый биосенсором сигнал. Физические основы работы и конструкция используемого прибора более подробно описаны ранее [Davies et al., 1994]. Полученные экспериментальные данные были обработаны и сохранены с помощью программного обеспечения к прибору (IAsys software, FAST). Все измерения были выполнены при 25°С. В биосенсоре IAsys используется система, в которой отдельная передвижная кювета может быть вставлена в измерительную ячейку прибора. Рабочий объем раствора в кювете во всех экспериментах составлял 200 мкл. В биосенсоре IAsys применяется вибрационный тип перемешивания: используется мешалка, которая эффективно перемешивает раствор. Скорость перемешивания раствора в кювете равнялась 7200 оборотов в мин (60 единиц прибора).

111.20. Иммобилизация антигенов (HRP и hlgGl) на поверхность кюветы биосенсора Iasys. Пероксидазу и hlgGl ковалентно привязывались к поверхности аналитической кюветы, покрытой карбоксиметилированным декстраном, с помощью метода подробно описанного ранее [George et al., 1995, Yeung et al., 1995]. Химия метода заключается в присоединении антигена через аминогруппу к карбоксильной группе декстрана. После активации карбоксиметилированного декстрана 1 -этил-З-(З-диметиламинопропил)-карбодиимидом, и N-гидроксисукцинимидом в кювету добавлялись пероксидаза или hlgGl (25 мкг/мл) в 0,01 М ацетатном буфере рН 5,5. Свободные карбоксильные группы декстрана блокировались добавлением 1М этаноламина рН 8,5. Кювету отмывали от нековалентно связавшегося белка двух трехкратным ополаскиванием 0,05 М НС1. Кривые иммобилизации были обработаны и сохранены с помощью программного обеспечения прибора, IAsys software (рис 7-Б).

Зная абсолютную величину сигнала биосенсора, который дает иммобилизованный антиген, при помощи инструкции к IAsys software, поставляемой вместе с биосенсором, можно рассчитать поверхностную концентрацию антигена. Для HRP сигнал составлял 1700 arc second, что эквивалентно поверхностной концентрации HRP равной 10,5 нг/мм или (26±2)х10"14 моль/мм2. Для hlgGl сигнал составлял 5500 arc second, что эквивалентно поверхностной концентрации hlgGl равной 33,5 нг/мм или (21±1)х10"14 моль/мм2.

111.21. Кинетика связывания антител с иммобилизованными HRP и hlgGl. Ассоциация антител с иммобилизованными HRP и hlgGl регистрировалась после добавления значительного избытка антител по отношению к иммобилизованному антигену (диапазон концентраций антител 3-1031 нМ). Аналитическая кювета с иммобилизованным антигеном уравновешивалась 180-195 мкл 0,025 М Na-фосфатного буфера рН 7,4 с 0,15 М NaCl и 0,5 мл/л твина 20 не менее 5 мин. После этого в кювету добавляли 5-20 мкл раствора антител и регистрировали связывание 5-10 мин. Процесс диссоциации антител регистрировался в течение 5-15 мин, после удаления раствора антител и однократного добавления в кювету 200 мкл 0,025 М Na-фосфатного буфера рН 7,4 с 0,15 М NaCl и 0,5 мл/л твина 20. Кювету регенерировали добавлением 0,05 М НС1 в течение 2 мин. Все антитела были проанализированы при 5-8 различных концентрациях. Полученные данные были обработаны и сохранены с помощью программного обеспечения прибора (IAsys software).

Для обсчета данных, полученных с помощью биосенсора IAsys, использовалась специальная программа FASTfit, позволяющая математически обрабатывать кривые ассоциации и диссоциации, получаемые с помощью биосенсора IAsys. Программа позволяет пользователю выбирать зоны обсчета базовой линии, ассоциации и диссоциации. Кроме того, пользователь может выбирать начальные точки ассоциации и диссоциации. Во всех экспериментах базовая линия обсчитывалась не менее 2 мин перед началом ассоциации. Зона обсчета ассоциации начиналась через 5 с после добавления антител. За это время происходило перемешивание раствора, и прекращался сдвиг сигнала, вызванный изменением буфера после добавления раствора антител. Ассоциация обсчитывалась в течение 300 с после добавления антител. Зона обсчета диссоциации начиналась через 10с после удаления раствора с остатками антител и добавления буфера. Диссоциация обсчитывалась в течение 300 с после добавления буфера.

111.22. Преобразование кинетических кривых, получаемых с помощью оптического биосенсора. В биосенсоре IAsys концентрация комплекса антиген-антитело ([В]) измеряется непосредственно как сигнал (R) измеряемый в arc seconds. Уравнение 9, описывающее ассоциацию антител с иммобилизованным антигеном при псевдопервом порядке реакции, в программе FASTfit (раздел 2.2.7) преобразуется следующим образом: где Ro - сигнал, при t=0 (arc seconds). Эта величина специально вводится, чтобы скорректировать возможный первоначальный сдвиг сигнала, вызванный изменением буфера после добавления раствора антител. Е называется степенью реакции и аналогична [B]r/J в уравнениях 9 и 10 (arc seconds).

Уравнение 13, описывающее необратимую диссоциацию антител от иммобилизованного антигена, в программе FASTfit преобразуется следующим образом: где Rq1SS - сигнал, при t=0 (arc seconds), эта величина аналогична [В]0 в уравнении 13. Программа FASTfit использует повторяющуюся процедуру обработки экспериментальных данных по ассоциации и диссоциации для получения величин уравнений 16 и 17. В настоящей работе ошибки рассчитывались при помощи матричной инверсии [O'Shannessy et al., 1993].

R = R0 +E(l-e~k°nt)

16),

R = R

17),

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2003 года, Дмитриев, Александр Дмитриевич

1. Брондз Б.Д., Рохлин О.В. (1978) Молекулярные и клеточные основы иммунологического распознавания, Наука, Москва.

2. Варфаломеев С.Д., Зайцев С.В., Мевх А.Т. (1985) Физико-химические исследования молекулярных механизмов действия физиологически активных соединений. Рецепция. "Биоорганическая химия" (Итоги науки и техники) ВИНИТИ, Москва, "Мир", т. 3, стр. 51-55.

3. Зозуля А.А., Пшеничкин С.Ф., Щурин М.Р. (1988) Опиоиды в регуляции иммунитета, в сб. "Новое в иммунологии и терапии психических заболеваний", Москва, стр. 7-20.

4. Иммунология, под ред. У. Пола (1989) Москва, "Мир", т. 3, стр. 15.

5. Ленинджер А. (1985) "Основы биохимии", Москва, "Мир", т.2.

6. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. (2000) Иммунология. М., Мир.

7. Тернер М. (1993) "Структура и функции иммуноглобулинов" в сб. "Структура и функции антител" под ред. Глинна Л., Стьюарда М., Москва, "Мир", стр. 31.

8. Чехонин В.П., Рябухин И. А., Морозов Г.В., (1989) Иммуноферментная детекция специфических антигенов мозга как критерий проницаемости гематоэнцефалического барьера крыс после острого у-облучения. Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 107, № 4, 464466.

9. Чехонин В.П., Жирков Ю.А., Дмитриева Т.Б. (1995) Направленный транспорт психотропных средств через гематоэнцефалический барьер. Моноклональные антитела в нейробиологии: Под ред. М.Б. Штарка, М.В. Старостиной.- Новосибирск: АО "Офсет", стр. 171182.

10. Allard W. J., Moran C. A., Nagel E, Collins G., Largen M. T. (1992) Antigen binding properties of highly purified bispecific antibodies. Mol. Immunol., 29, № 10, 1219-1227.

11. Auriol J., Guesdon J.L., Masc J.C., Nato F. (1994) Development of a bispecific monoclonal antibody for use in molecular hybridisation. J. Immunol. Methods, 169, № 1, 123-133.

12. Azimzadeh, A., Pellequer, J.L., and Van Regenmortel, M.H.V. (1992) Operational aspects of antibody affinity constants measured by liquid-phase and solid-phase assays. J Mol Recogn, 5,9-18.

13. Azuma Т., Takada J., Motoyama N., Okada H. (1992) Mol. Immunol., 29, 37-44.

14. Bassiri R.M., Utiger R.D. (1972) The preparation and specificity of antibody to thyrotropin releasing hormone. Endocrinology, 90, 722727.

15. Bohlen H., Manzke O., Patel В., Moldenhauer G., Dorken В., Von Fliedner V., Diehl V., Tesch H. (1993) Cytolysis of leukemic B-cells by T-cells activated via two bispecific antibodies. Cancer Res., 55, № 18, 4310-4314.

16. Bosslet K., Stainstraesser A., Hermentin P., Kuhlmann L., Bruynck A., Magerstaedt M., Seemann G., Schwarz A., Sedlacek H. H. (1991) Generation of bispecific monoclonal antibodies for two phase radioimmunotherapy. Br. J. Cancer, 63, № 5, 681-686.

17. Bugari G., Polesi C., Beretta A., Ghelmi S., Albertini A. (1990) Quantitative immunoenzymatic assay of human lutropin, with use of a bispecific monoclonal antibody. Clin. Chem., 36, № 1, 47-52.

18. Burchiel S.W. and Rhodes B.A. (eds) (1983) Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy Elsevier, New York, 1983.

19. Cao Y., Suresh M.R. (1998). Bispecific antibodies as novel bioconjugates. Bioconjug. Chem., 9, № 6, 635-44.

20. Cao Y., Christian S., Suresh M.R. (1998) Development of a bispecific monoclonal antibody as a universal immunoprobe for detecting biotinylated macromolecules. J. Immunol. Methods. 220, № 1, 85-91.

21. Chervonsky A. V., Faerman A. J., Evdonina L. V., Jazova A. K., Kazarov A. R. and Gussev A. I. (1988) A simple metabolic system for selection of hybrid hybridomas (tetradomas) producing bispecific monoclonal antibodies. Mol. Immunol., 25, 913-915.

22. Cifone M.A. and Fidler I J. (1981) Increasing metastatic potential is associated with increasing genetic instability of clones isolated from murine neoplasms. Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 6949-6952.

23. Coloma M.J., Morrison S.L. (1997) Design and production of novel tetravalent bispecific antibodies. Nat. Biotechnol., 15, № 2, 159-63.

24. Cotton R. G. H., Milstein C. (1973) Fusion of two immunoglobulin-producing myeloma cells. Nature, 244, 42-43.

25. Crothers, D.M. and Metzger, H. (1972) The influence of polyvalency on binding properties of antibodies. Immunochemistry, 9, 341-346.

26. De Lau W. В. M., Van Loon A. E., Heije K., Valerio D. and Bast B. J. E. G. (1989) Production of hybrid hybridoma based on HATS -neomycin1 double mutants. J. Immunol. Methods, 117, 1-8.

27. De Lau W. В. M., Heije K., Neeijes J. J., Oosterwegel M., Rosemuller E. and Bast B. J. C. G. (1991) Absence of preferential homologous H/Lchain association in hybrid hybridomas. J. Immunology, 146, № 3, 906914.

28. Demanet C., Brissink J., Moser M., Leo O., Thielemans K. (1992) Bispecific antibody therapy of two murine B-cell lymphomas. Int. J. Cancer, Suppl., 7, 67-68.

29. Dower, S.K., Ozato, K., and Segal, D.M (1984) The interaction of monoclonal antibodies with MHC class I antigens on mouse spleen cells. I. Analasys of the mechanism of binding. J. Immunol., 132, 751758.

30. De Preval C. and Fougereau M. (1976) Specific interaction between VH and VL regions of human monoclonal immunoglobulins. J. Mol. Biol., 102, 657-678.

31. Eipper B.A. and Mains R.E. (1980) Structure and biosynthesis of pro-adrenocorticitropin/endorphin and related peptides. Endocrinol. Rev., 1, № 1, 1-27.

32. O'Farrel P.H. (1975) High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem., 250, 4007-4021.

33. French R.R., Penney C.A., Browning A.C., Stripe F. Goerge A.J., Glennie M.J. (1995) Delivery of the ribosome-inactivating protein, gelonin, to lymphoma cells via CD22 and CD38 using bicpecific antibodies. Br. J. Cancer, 71, № 5, 986-994.

34. Friguet, В., A.F. Chafotte, L. Djavadt-Ohaniance and M.E. Goldberg (1985) Measurments of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complexes by enzyme-linked immunosorbent assay. J.of Immunol. Meth., 77, № 2, 305-319.

35. Gaut J.R., Hendershot L.M. (1993) Mutations within the nucleotide binding site of immunoglobulin binding protein inhibit ATPase activity and interfere with release of immunoglobulin heavy chain. J. Biol. Chem., 268, № 10, 7248-7255.

36. Gorog G., Gandolfi A., Paradisi G., Rolleri E., Klasen E., Dressi V., Strom R., Celada F. (1989) Use of bispecific hybrid antibodies for the development of a homogeneous enzyme immunoassay. J. Immunol. Methods, 123, № 1, 131-140.

37. Graciano, R.F., Somasundaram, C., and Goldstein, J. (1995) The production of bispecific antibodies, in 'Bispecific antibodies' (Finger, M.W., ed.), Spring Verlag, New York, Berlin, pp. 1-20.

38. Greenwood F.G., Hunter W.M., Glover J.S. (1963) The preparation of « <} 11.labeled human growth hormone of hihg specific activity. Biochem. J., 89, 114-123.

39. Gridley D. S., Stickney D. R., Slater J. M. (1988) Effects of murine bifunctional antibody infusion on leukocyte populations of patients with colon cancer. FASEB J., 2, A695

40. Gruber M., Schodin B.A., Wilson E.R. and Kranz D.M. (1994) Efficient tumor cell lysis mediated by a bispecific single chain antibody expressed in Esherichia coli. J. Immunology, 152, № 11, 5368-5374.

41. Hamel P. A., Klein M. H. and Dorrington K. J. (1986) The role of the VL and VH segments in the preferential reassociation of immunoglobulin subunits. Mol. Immunol., 23, № 5, 503-510.

42. Hamel P. A., Klein M. H., Smith-Gill S. J., Dorrington K. J. (1987) Relative noncovalent association constant between immunoglobulin H and L chains is unrelated to their expression or antigen-binding activity. J. Immunol., 139, 3012-3020.

43. Hammerling U., Aoki Т., DeHarven E., Boyse E. A., Old L. J. (1986) Use of hybrid antibody with anti-G and anti-ferritin specificities in locating cell surface antigens by electron microscopy. J. Exp. Med., 128, 1461-1473.

44. Handbook of biochemistry and molecular biology. Ed. G.O. Faseuau. (1976). V. II. P. 383. 3rd ed. CRC Press.

45. Hendershot L. M., Bole D. G., Kearney J. F. (1987a) The role of immunoglobulin heavy chain binding protein. Immunol. Today, 8, 111115.

46. Hendershot L., Bole D., Koller G., Kearney J.F. (1987b) Assembly and secretion of heavy chains that do not associate posttranslationally with immunoglobulin heavy chain binding protein. J. Cell. Biol., 104, № 3, 761-767.

47. Hendershot L.M. (1990) Immunoglobulin heavy chain and binding protein complexes are dissociate in vivo by light chain addition. J. Cell. Biol., Ill,№3,829-837.

48. Hendershot L.M., Wie J.Y., Gaut J.R., Lawson В., Freiden P.J., Murti K.G. (1995) In vivo expression of the endoplasmic reticulum. Mol. Biol. Cell., 6, № 3, 283-296.

49. Holliger P., Prospero T. and Winter G. (1993) "Diabodies": small bivalent and bispecific antibody fragments. Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 90, 6444-6448.

50. Hudson N. W., Mudgett M., Panka D. J., Margolies M. N. (1987) Immunoglobulin chain recombination among antidigoxin antibodies by hybridoma-hybridoma fusion. J. Immunol., 139, 2715-2723.

51. Ishikawa E., Imagava M., Hashida S., Yoshitake S., Hamaguchi Y., Ueno T.(1983) J Immunoassay, 4, 209-314.

52. Karawajew L., Behrsing O., Kaiser G., Micheel B. (1988) Production and ELISA application of bispecific monoclonal antibodies against fluorescein isothiocyanate (FITC) and horseradish peroxidase (HRP). J. Immunol. Methods, 111, № 1, 95-99.

53. Kaufman, E. N., Jain, R. K. (1992) Effect of bivalent interaction upon apperant antibody affinity: experimantal confirmation of theory usingfluoresence photobleaching and implications for antibody binding assays. Cancer res., 52,4157-4169.

54. King K. L., Gridley D. S., Stickney D. R. (1988) Autoradiographic biodistribution of bifunctional antibody U1ln BLEDTA IV in nude mice bearing human colon tumour. FASEB J., 2, A694

55. Knarr G., Gething M.J., Modrow S. and Bucher J. (1995) BIP binding sequences in antibodies. J. Biol. Chem., 270, № 46, 27589-27594.

56. Koelemij R., Kuppen P.J., Van de Velde C.J., Fleuren G.J., Hagenaars M., Eggermont A.M. (1999) Bispecific antibodies in cancer therapy, from the laboratory to the clinic. J Immunother., 22, № 6, 514-524.

57. Kohler G., Milstein C. (1975) Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature, 256, 495-497.

58. Koolwijk P., Rosemuller E., Kees Stad R., De Lau W. В. M. and Bast B. J. E. G. (1988) Enrichment and selection of hybrid hybridomas by percoll density gradient centrifugation and fluorescent-activated cell sorting. Hybridoma, 7, 217-225.

59. Kranz D.M., Herron J.N. and Voss E.W. (1982) Mechanisms of ligand binding by monoclonal anti-fluorecyl antibodies. J. Biol. Chem., 257, № 12, 6987-6995.

60. Kreutz F.T., Suresh M.R. (1997) Novel bispecific immunoprobe for rapid and sensitive detection of prostate-specific antigen. Clin. Chem. 43, №4, 649-656.

61. Krika L.J. (1994) Selected strategies for improving sensitivity and reliability of immunoassays. Clin. Chem., 40, № 3, 347-357.

62. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 277, 680-685.

63. Langer Т., Lu C., Echols H., Flanagan J., Hayer M.K. and Hartl F.U. (1992) Successive action of DNAK , DNA., and Gro EL along the patheway of chaperone-mediated protein folding. Nature, 356, № 6371, 683-689.

64. Littlefield W. (1964) Selectiion of hybrids from matings of fibroblasts in vitro and their presumed recombinations. Science, 145, 709-710.

65. Mallender W.D. and Voss E.V.J. (1994) Construction, expression and activity of a bivalent bispecific single-chain antibody. J. Biol. Chem., 269 № 1, 199-206.

66. Massino Y.S., Kizim E.A., Dergunova N.N., Vostrikov V.M. and Dmitriev A.D. (1992) Immunology Lett., 33, № 3, 217-222.

67. Margulies D.H., Cieplinski W., Dharmgrongartama В., Gefter M.L., Morrison S.L., Kelly Т., Scharff M.D. (1977) Regulation of immunoglobulin expression in mouse myeloma cells. Cold Spring Harbor Sympos. Quant. Biol., 41 (pt.2): 781-791.

68. Mariani M., Bonelli F., Tarditi L., Calogero R., Camagna M., Spranzi E., Seccamani E., Deleide G. and Scassellati G.A. (1989) BioChromatography, 4, 149-157.

69. Milstein C., Cuello A.C. (1983) Hybrid hybridomas and their use in immunohistochemistry. Nature, 305, № 5934, 537-40.

70. Milstein C., Cuello A. C. (1984) Hybrid hybridomas and the production of bispecific monoclonal antibody. Immunol. Today, 5, 299-304.

71. Morelli L., Plotkin L., Leoni J., Fossati C.A., Margni R.A. (1993) Mol. Immunol., 3, 695-700.

72. Nakane, P.K., Kawaoi, A. (1974) Peroxidase-labelled antibody. A new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem. 22, 1084.

73. Neri D.M., Momo M., Prospero T. and Winter G. (1995) High-affinity antigen binding by chelating recombinant antibodies (CRAbs). J. Mol. Biol., 246, 367-373.

74. Nissonoff A., Rivers M. M. (1961) Recombination of a mixture of univalent antibody fragments of different specificity. Arch. Biochem. Biophys., 93, № 2, 460-462.

75. Nolan, O., and Kennedy, O.R (1990) Biochim. Biophys. Acta, 1040, 111.

76. Nowel A. (1976) The clonal evolution of tumor cell populations. Science, 194,23-28.

77. Pack P. and Plutckthun A. (1992) Miniantibodies: Use of amphipathic helices to produce functional, flexibly linked dimeric Fv fragments with high avidity in Escherichia coli. Biochemistry, 31, 1579-1584.

78. Paya С. V., McKean D. J., Segal D. M., Schoon R. A., Showalter S. D., Leibson P. J. (1989) Heteroconjugate antibodies enhance cell-mediated anti-herpes simplex virus immunity. J. Immunol., 142, № 2, 666-671.

79. Perry G., Friedman R., Kang D.R., Maneto V., Antilio-Gambetti L., Gambetti P. (1987) Antibodies to the neuronal cytoskeleton are elicited by Alzheimer paired helical filament fractions. Brain Res., 420, № 2, 233-242.

80. Pluckthun A., Pack P. (1997) New protein engineering approaches to multivalent and bispecific antibody fragments. Immunotechnology, 3, №2, 83-105.

81. Reading C. L. and Bator J. M. (1988) Proceedings for the 5th Annual Industry Conference and Exhibition, San Francisco, CA.

82. Reardan D.T., Meares C.F., Goodwin D.A., Mc. Tigne T.N., David G.S., Stone M.R., Leung J.P., Bartholomew R.M. and Frincke J.M. (1985) Antibodoes against metal chelates. Nature, 316, № 6025, 265268

83. Scatchard G. (1949) The attractions of protiens for small molecules and ions. Ann. N. Y. Acad. Sci., 51, 660-672.

84. Scott С. F., Blattler W. A., Lambert J. M., Kalish R. S., Mortimoto C., Schlossman S. F. (1988) Requirements for the constraction of antibody heterodimers for the direction of lysis of tumors by human T-cells. J. Clin. Invest., 81, № 5, 1427-1433.

85. Scubitz K.M., O'Hara D.S. and Smith I.W. (1977) Antibody-hapten reaction kinetics: a comparison of hapten interactions with IgG and Fab preparations. J. Immunology, 118, № 6, 1971-1976.

86. Smith-Gill S.J., Hamel P.A., Klein M.H., Rudikoff S. and Dorrington K.J. (1986) Contribution of the Vk4 light chain to antibody specificity for lysozyme and b(l,6) D-galactan. Mol. Immunol., 23, 919-926.

87. Staerz U. D., Bevan M. J. (1986) Hybrid hybridoma producing a bispecific monoclonal antibody that can focus effector T-cell activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 1453-1457.

88. Stickney D.R., Frincke J.M., Slater J.B., Ahlem C.N., Merchant В., Slater J.M. (1988) Effects of perfluorochemical and carbogen on tumor metastases and phagocytic cell populations. FASEB J., 2, A 694.

89. Strateeva-Taneeva P.A., Khaidukov S.V., Kovalenko V.A., Nazimov I.V., Samokhvalova L.V., Nesmeyanov V.A. (1993) Bispecificmonoclonal antibodoes to human Interleukin 2 and horseradish peroxidase. Hybridoma, 12, № 3, 271-284.

90. Suresh M. R., Cuello A. C., Milstein C. (1986) Advantages of bispecific hybridomas in one-step immunocytochemistry and in immunoassays. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 7989-7993.

91. Tada H., Toyoda Y., Iwasa S. (1989) Bispecific antibody-producing hybrid hybridoma and its use in one-step immunoassays for human lymphotoxin. Hybridoma, 8, 73-83.

92. Takahashi M., Fuller S. A. (1988) Production of murine hybrid hybridomas secreting bispecific monoclonal antibodies for use in urease-based immunoassays. Clin. Chem., 34, 1693-1696.

93. Tarditi L., Camagna M., Parisi A., Vassarotto C., De Monte L. В., Letarte M., Malavasi F., Mariani M. (1992) Selective high-performance liquid chromatographic purification of bispecific monoclonal antibodies. J. Chromatogr., 599, № 1-2, 13-20.

94. Thompson, R.J. and Jackson, A.P. (1984) Cyclic complexes and high avidity antibodies. Trends Biochem. Sci., 9, 1-9.

95. Tiebout R. F., Van Boxtel-Oosterhof F., Strieker E. A. M. and Zeijlemaker W. P. (1987) A human hybrid hybridoma. J. Immunol., 139, 3402-3405.

96. Towbin H., Staelin Т., Gordon J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrilamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 76, № 9, 43504354.

97. Ward E.S., Gussow D., Griffits A.D., Jones P.T. and Winter G. (1989) Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherihia coli. Nature, 341, № 2, 544 546.

98. Weiner G. J. (1992) Bispecific IgG and IL-2 therapy of a syngeneic B-cell lymphoma in immunocompetent mice. Int. J. Cancer, Suppl., 7, 6366.

99. Weiner G.J., De Gast G.C. (1995) Byspecific monoclonal antibody therapy of B-cell malignancy. Leuk.-Lymphoma, 16, № 3-4, 199-207.

100. Wong J. Т., Colvin R. B. (1987) Bi-specific monoclonal antibodies: selective binding and complement fixation to cells that express two different surface antigens. J. Immunol., 139, 1369-1374.1. БЛАГОДАРНОСТИ