Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Механизмы иммуномодулирующего действия гормонов репродукции

На правах рукописи

Ширшев Сергей Викторович

МЕХАНИЗМЫ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ГОРМОНОВ РЕПРОДУКЦИИ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Работа выполнена в Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского Отделения Российской Академии Наук и Пермской государственной медицинской академии Минздравмедпрома РФ

Научные консультанты:

Доктор медицинских наук, профессор Н.Н.Кеворков

Доктор медицинских наук, чл.-корр. РАН, профессор В.А.Черешнев

Официальные оппоненты:

Академик АЕН РФ, доктор медицинских наук, профессор А.А.ЯриЛНН

Доктор медицинских наук, профессор М.Ш.Вербицкий

Доктор медицинских наук А.А.Иванов

Ведущая организация - Институт экспериментальной медицины РАМН

Защита диссертации состоится 27 марта 1996 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д074.09.01. при Институте иммунологии Минздравмедпрома РФ по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24, корп. 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии.

Автореферат разослан "_"_1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Л.С. Сеславина

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Беременность является одним из загадочных феноменов иммунологии репродукции. Воспроизводство потомства стоит на одном из первых мест в иерархии жизненноважных функций млекопитающих. Однако, механизмы, обеспечивающие рост и развитие плода, несущего признаки генетической чужеродности, до сих пор остаются не выясненными. Изучение трансплантационного иммунитета, равно как и расшифровка некоторых механизмов персистенции опухолевых клеток, несмотря на близость решаемых задач, не дают ответа на вопрос: каков сценарий иммунопротекции, решающей судьбу оплодотворенной яйцеклетки в женском организме?

В последнее время появляется все больше публикаций, рассматривающих процессы репродукции с позиции иммунотрофики, предполагающей активное участие лимфоцитов матери в процессах формирования и развития плода при беременности [Wegmann, 1987]. Показано, что цитокины иммуннокомпетентных клеток матери способны активировать рост трофобласта и блокировать его неуместную инвазию в ткани матки [Hunt, 1989].

Значение гормонов в нейроэндокринной системе контроля процессов иммуногенеза достаточно велико и на данный момент не требует дополнительных подтверждений. Тем не менее, до сих пор отсутствуют попытки концептуального осмысления возможных механизмов гормонального контроля иммунных реакций при беременности.

Одним из необходимых условий создания подобной концепции является исследование молекулярных механизмов гормонального контроля как на уровне отдельных гормонов, так и в условиях их совместного действия. Изучение взаимоотношений: гормон - гормон, гормон - цитокин в разрезе иммуномодули-рующей активности позволило бы более достоверно отразить механизмы гормонального контроля иммунных реакций при физиологической беременности.

Цель и задачи исследования

Целыо данной работы было изучение механизмов иммуномодулирующего действия отдельных гормонов репродуктивной сферы и выявление общих закономерностей взаимодействия этих гормонов при формировании гуморального иммунного ответа, а также исследование зависимости их эффектов от функцио-

налыюй активности иммунокомпетентных клеток и присутствия цитокинов.

В работе решались следующие основные задачи:

1. Исследовать иммуномодулирующие эффекты физиологических доз хо-рионического гонадотропина (ХГ) in vivo и in vitro на спленоцитах, реализующих гуморальный иммунный ответ.

2. Определить самостоятельные и инициируемые ХГ иммуномодулирующие эффекты эстрадиола (Ег) и прогестерона на процессы формирования АОК и секреции основного автокоида репродукции - простагландина F2a (PGF2a).

3. Изучить молекулярные механизмы действия ХГ на иммунокомпетентные клетки селезенки, формирующие первичный иммунный ответ.

4. Выявить способность репродуктивных гормонов (ХГ и эндогенных половых стероидов яичника) влиять на процессы генерации и функциональную активность спленоцитов-супрессоров гуморального иммунного ответа, а также исследовать молекулярные механизмы действия ХГ на данный тип иммунокомпетентных клеток.

5. Изучить молекулярные механизмы совместных гормональноцитокино-вых эффектов на спленоциты, формирующие гуморальные иммунные реакции.

6. Исследовать зависимость иммуномодулирующих эффектов ХГ от уровня функциональной активности иммунокомпетентных клеток.

Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы

В результате проведенных исследований выявлен ряд новых закономерностей, определяющих процессы функционирования иммунокомпетентных клеток, реализующих гуморальный иммунный ответ в условиях гормонального воздействия, моделирующего эндокринный фон по основным репродуктивным гормонам при беременности. Показано, что половые стероидные гормоны in vitro обладают ярко выраженным иммуностимулирующим действием, а ХГ, контролирующий синтез и секрецию половых стероидных гормонов маточноплацентар-ной структурой, напротив, обладает иммунодепрессивной активностью. Впервые расшифрован вероятный механизм иммуномодулирующих эффектов физиологических доз ХГ. Показана возможность экспрессии высоко- и низкоафинных гормональных рецепторов ХГ, сопряженных с аденилатциклазным комплексом

мембраны интактных клеток селезенки. Установлены популяции спленоцитов, избирательно реагирующих с низкой и высокой дозами этого гормона. Показано, что низкая доза гормона, взаимодействуя с нммуноцитом, как правило, снижает уровень сАМР, а высокая - повышает. Функциональную активность интактных Т-лимфоцитов способна модулировать только высокая доза ХГ. При изучении процессов взаимодействия женских половых стероидных гормонов и ХГ, как единой ауторегулирующей системы, были получены оригинальные данные, раскрывающие реципрокный механизм иммуномодулирующих эффектов исследуемых гормонов.

Впервые изучен механизм угнетающего действия ХГ на функциональную активность зрелых спленоцитов-супрессоров. Установлен ранее неизвестный эффект ХГ, позволяющий рассматривать гормон в качестве костимулнрующего агента при взаимодействии ИЛ2 с неактивированными иммунокомпетентными клетками. На основании полученных результатов сформулирована новая концепция гормональной иммуномодуляции, строящаяся на принципах доминирования иммунопотенцирующих эффектов в системе, где находятся два и более им-мунотропных агента; зависимости гормональных эффектов от популяционпого состава иммунокомпетентных клеток, уровня их функциональной активности и цитокинового присутствия.

Проведенные исследования открывают ряд принципиально новых направлений в изучении проблем эндокринного контроля иммунной системы во время беременности, и в целом, как биологического явления. Работа показывает необходимость комплексного подхода в оценке иммуномодулирующих эффектов отдельно взятого гормона с учетом всех возможных факторов, способных мимикрировать его эффекты. В теоретическом плане, представленные исследования существенно расширяют представления о гормонах репродукции как важных интегрирующих элементах сложной схемы иммуноэндокринного контроля процессов гестации. Показан один из аспектов иммунного гомеостаза при физиологически протекающей беременности, суть которого заключается в само- и взаиморегулировании системы, тесной скоординированности запросов иммунокомпетентных клеток на регуляторные сигналы гормонов с уровнем активности и дифференцировки иммуноцитов. Расшифровка молекулярных механизмов имму-номодулирующего действия ХГ позволяет понять сложность его эффектов, а

главное, предвидеть направленность его действия в конкретных условиях. Полученные данные могут быть использованы для разработай принципиально новых подходов в изучении патогенеза абортов и патологии невынашивания.

В практическом плане полученные данные могут быть использованы в клинике акушерства и гинекологии для разработки новых приемов в тактике терапии и ведения пациенток с высоким риском спонтанных абортов, беременности, осложненной вирусной или бактериальной инфекцией, а также при онкологических заболеваниях репродуктивной сферы, связанных с гормон-продуцирующими или гормон-зависимыми опухолями. Не исключена возможность использования ХГ как фактора цитокинового ряда, в частности при JIAK-терапии онкологических больных или больных с различными формами иммуно-дефицитов. Наиболее удачным такое сочетание представляется у пациентов с явлениями эндокринной дисфункции.

Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедр нормальной и патологической физиологии, фармакологии, акушерства и гинекологии Пермской медицинской академии и биологического факультета Пермского государственного университета.

Апробация работы

Апробация проведена на совместном заседании Ученого Совета Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и Пермской государственной медицинской академии. Основные положения диссертации были представлены на следующих международных, всесоюзных и российских конференциях, симпозиумах и съездах:

- III Всесоюзном симпозиуме с международным участием "Иммунология репродукции" (Киев, 1987);

-1 Всесоюзном иммунологическом съезде (Сочи, 1989);

- IV Международном конгрессе по репродуктивной иммунологии (Киль, Германия, 1989);

- IV Всесоюзном симпозиуме с международным участием "Иммунология репродукции" (Киев, 1990);

- V Всесоюзном симпозиуме "Взаимосвязь нервной и иммунной систем" (Оренбург, 1990);

- V Всесоюзном симпозиуме "Взаимодействие нервной и иммунной систем"

(Ростов-на-Дону, 1990);

- II Всероссийском съезде эндокринологов (Челябинск, 1991);

- 1 Съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992);

- 5-ом Международном конгрессе по репродуктивной иммунологии (Рим, Италия, 1992);

- Международном симпозиуме по иммунотерапии инфекций (Берлин, Германия, 1993);

- 2-ом Международном форуме по репродуктивной иммунологии (Магдебург, Германия, 1993);

- 2-ом Международном конгрессе 13№М (Салерно, Италия, 1993);

- 12-ом Европейском иммунологическом конгрессе (Барселона, Испания,

1994);

- XII Российской научной конференции "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях" (Челябинск, 1995);

- Первом Международном симпозиуме по СПИД и нитокинам (Реймс, Франция, 1995);

- Международной конференции 1СОМЕ'95 (Санкт-Петербург, 1995). Публикации. Основные результаты опубликованы в 50 работах

(монография - 1; журнальные статьи - 26; работы в сборниках и тезисы докладов - 23).

Структура и объем диссертации. Работа включает следующие разделы: "Введение", "Обзор литературы" (4 главы), "Материалы и методы", "Собственные результаты" (6 глав), "Обсуждение", "Выводы" и "Список литературы" (685 источников). Работа иллюстрирована 27 рисунками и 43 таблицами. Общий объем диссертации 401 страниц.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Хорионический гонадотропин в физиологических дозах угнетает функциональную активность интактных спленоцитов, формирующих первичный иммунный ответ на тимус-зависимый антиген. Механизм данного иммуномодули-рующего действия гормона зависит от дозы хорионичсского гонадотропина и популяционного состава клеток селезенки. Присутствие макрофагов в суспензии интактных спленоцитов определяет реализацию гормон-зависимой иммуноде-

прессии. В отсутствие клеток этого типа низкая концентрация хориогонина избирательно активирует процессы антигеннезависимой дифференцировки В-лимфоцитов, а высокая, обладая селективной депрессисй Т-лимфоцитов, не в состоянии реализовать ее на уровне процессов, предшествующих формированию АОК.

2. Молекулярные механизмы иммуносупрессивного эффекта низкой дозы хорионического гонадотропина реализуются только в присутствии А-клеток, прямо связаны с активностью циклооксигеназы и угнетением внутриклеточного уровня сАМР. Иммуностимулирующий эффект связан с активацией В-лимфоцитов, молекулярный механизм которого зависит от вторичных мессенд-жеров фосфоинозитидпого обмена и угнетения внутриклеточного сАМР. Механизмы иммунодепрессивных эффектов высокой дозы хориогонина реализуются на уровне А-клеток и Т-лимфоцитов. При взаимодействии с А-клетками гормон модулирует функцию потенциалнезависимых Са2+-каналов при одновременном снижении уровня внутриклеточного сАМР. При контакте с Т-лимфоцитами хо-рионичсский гонадотропин угнетает их функциональную активность, повышая уровень внутриклеточного сАМР и секрецию PGI72a.

3. При взаимодействии со зрелыми спленоцитами-супрессорами гуморального иммунного ответа хорионический гонадотропин в дозах, характерных для периода физиологической беременности, угнетает их функциональную активность. Механизмы иммуномодулирующих эффектов гормона зависят от его дозы и клеточного состава спленоцитов-супрессоров. В низкой концентрации (10 ME/мл) гонадотропин способен модулировать функциональную активность только адгезивных клеток, реализуя свои эффекты через циклооксигеназу и по-тенциалнезависимые Са2+-каналы. В высокой концентрации (50 ME/мл) гормон угнетает функцию клеток-супрессоров, элюированных с нейлонового волокна, повышая уровень цитоплазматического сАМР с одновременным вовлечением в процессы транедукции вторичных мессенджеров фосфоинозигидного обмена.

4. В фертильном организме самок иммуномодулирующее действие хорионического гонадотропина реализуется опосредованно через половые стероиды яичников. Эстрадиол и прогестерон в концентрациях, соответствующих их уровню в I и III триместры беременности, значительно активируют процессы

формирования АОК. Иммуностимулирующее действие данных гормонов реализуется параллельно с активацией процессов секреции спленоцитами PGF2a- Инъекции гонадотропина некастрированным животным, равно как и комбинации его с одним из стероидных гормонов in vitro, приводят к полной потере самостоятельного иммунодепрессивного эффекта хорионического гонадотропина и, одновременно, лишает эстрадиол или прогестерон иммуностимулирующих эффектов.

5. Направленность иммуномодулирующих эффектов хорионического гонадотропина прямо зависит от исходной функциональной активности иммуноком-петентных клеток. Сигнал к активации макрофагов, Т- или В-лимфоцитов, приводящий к стимуляции гуморального иммунного ответа, как правило, доминирует над иммунодепрессивными эффектами гормона. Однако, выраженность подобного действия зависит от того, в какой степени конкретная популяция клеток определяет процессы формирования первичного иммунного ответа.

6. При формировании первичного или вторичного иммунного ответа, иммуностимулирующее доминирование отдельного цитокина (ИНФ-a, Р; ИЛ2) или хорионического гонадотропина, в условиях их совместного внесения in vitro, определяется эффектом стимуляции процессов формирования АОК, которым обладает то или иное соединение. При культивировании интакгных спленоцитов с хориогонином и рИНФ-a или рИЛ2, иммуностимулирующий потенциал цито-кинов, нивелируя самостоятельные иммунодепрессивные эффекты хорионического гонадотропина, использует молекулу гормона в качестве костимулирую-щего агента. В случае с рИЛ2, совместное гормональноцитокиновое действие реализуется через потенциалнезависимые Са2+-каналы и вторичные мессенджеры полифосфатидилового цикла.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объект исследования

В работе использовались фертильные и овариэктомированные мыши-самки линии СБА и (СВА • C57BL/6)F, массой 18-22 г.

Репродуктивные гормоны

Хорионический гонадотропин (ХГ) (Profasi, "I.F. Serono S.p.A.", Италия)

был предварительно протестирован на наличие высокомолекулярных примесей методом жидкостной хроматографии высокого давления HPLC на хроматографе System Gold ("Bechman") с колонкой Ultrapac TSK-G3000 SW 7,5x600 mm ("LKB").

Исследуемый гормон имеет монопиковый профиль, что свидетельствует о высокой степени чистоты препарата. При использовании гормона in vivo, учитывался период его полувыведения (20-36 ч. [Ross, 1977]). ХГ вводился подкожно от 1 до 19 дней, максимальное количество инъекций не превышало 10. При выборе доз ориентировались на результаты определения его концентрации в сыворотке крови беременных женщин в разные триместры [Димитров, 1979; Benveniste & Scommegha, 1981; Wide, 1962].

Гормон инъецировался в дозах 40 или 200 ME/мышь, что соответствует концентрации ХГ в крови беременной во II-III триместрах или на 70-й день беременности (пик секреции), соответственно. При работе in vitro исходили из количества трансплантируемых сингенным реципиентам иммунокомпетентных клеток: 2-107 спленоцитов/мышь. Летально облученный реципиент получал данное количество клеток на фоне инъекций ХГ 40 или 200 ME. Для культивирования клеток селезенки в аналогичной концентрации гормона необходимо вносить его в дозах 10 или 50МЕ/мл из расчета 5 -10б клеток/мл. Общий объем культуры при этом составил 4 мл соответственно.

Эстрадиол (Е2) ("Serva") использовался в концентрациях, сопоставимых с его уровнем в I и III триместры беременности у женщин, который, в среднем, составляет 1 и 10 нг/мл, соответственно [Kase & Reyniak, 1985].

Прогестерон ("Serva") использовался в концентрациях 20 или 100 нг/мл, что также отражает его уровень в I и III триместры, соответственно [Kase & Reyniak, 1985]. Половые стероидные гормоны исследовались только в экспериментальных моделях in vitro. Растворы этих гормонов готовились ex tempore. В качестве контроля использовался изотоничный растворитель.

Рекомбинантные цитокины

Интерлейкин 2 (ИЛ2) ("Дтгностикум", Львов) использовался в минимальной митогенной концентрации: 37,5МЕ/мл.

Интерферон-a и -ß (ИНФ-а, ß) ("Д1агностикум", Львов) вносился в куль-

туры спленоцитов в дозе 250МЕ/мл, которая экстраполировалась от уровня эндогенной продукции этих ИНФ лейкоцитами в условиях in vitro [Roberts & Steigbigel, 1978; Семенов и др., 1982]. ИНФ 1-го типа, также как и ИЛ2, готовили ex tempore на среде 199.

Моноклональные антитела и митогены

Для активирования B-лимфоцитов использовались моноклональные анти-IgM-антитела против мыши ("Calbiochem") в концентрации 10 мкг/мл [Schreier & Unane, 1976].

В качестве поликлонального активатора B-лимфоцитов использовался бактериальный липополисахарид (ЛПС) ("Д1агностикум", Львов) в дозе 50 мкг/мл [Takasuka е.а., 1991].

Для стимуляции Т-лимфоцитов использовался Кон A ("Calbiochem") в дозе - 5 мкг/мл [Клаус, 1990].

Ингибиторы ферментных систем, отвечающих за транедукцню

гормональных сигналов

Ингибитор циклооксигеназы - диклофенак натрия (Вольтарен, "Pliva", Хорватия) в дозе 0,015мг/мл [Ки е.а., 1974].

Ингибитор "медленных", потенциалнезависимых Са2+-каналов - вераиамил ("Изоптин", КлоН, AG, ФРГ) в дозе 0,025мг/мл [Markward е.а., 1985].

Ингибитор ннозитол-1-монофосфатазы - оксибутират лития (Таллинский химфармзавод) в дозе 1,5 мг/мл или 1,28мМ [Markward е.а., 1985; Belmaker е.а., 1990].

Ингибитор фосфодиэстеразы -теофиллин, использовался в концентрации 3

мМ.

Кальциевый ионофор - А 23187 ("Serva"), применялся в дозах: 100 или 500 иг/мл [Doe Senam е.а., 1990].

Облучение

Тотальное облучение животных проводилось с помощью рентгеновской установки РУМ-17 в дозе - 219,3 мКл/кг (850 Р или 7,4 Гр).

Антигены

В качестве антигена использовались натнвные эритроциты барана (ЭБ), которые перед употреблением трижды отмывались изотоничным раствором NaCl.

Условия культивирования иммунокомпетеитных клеток селезенки

Спленоциты помещались в стеклянные флаконы с питательной сре-дой 199 без добавок в концентрации 5 • 106 ядросодержащих клеток (ЯСК) на мл. Общий объем культуры составлял 4 мл, т.е. количество пленоцитов в каждой отдельной культуре составляло: 2-107 ЯСК. Клетки инкубировались при t= 37°С в течение 60 мин. В экспериментальных моделях, требующих переноса 5-107 ЯСК, объем культур составлял 10 мл.

Определение количества IgM-секретирующих клеток селезенки Для определения количества антителообразующих клеток (АОК), секрети-рующих иммуноглобулины класса М, использовался модифицированный прямой метод локального гемолиза в геле агарозы [Jerne & Nordin, 1963].

Определение количества IgG-секретирующих клеток селезенки Использовался модифицированный непрямой метод локального гемолиза в геле агарозы [Dresser & Wortis, 1965]. Для этого использовалась стандартная кроличья поликлональная сыворотка против IgG-мыши (ИЭМ им. Гамалеи, Москва) в титре 1:200.

Получение клеточных суспензий, обогащенных Т-лимфоцнтами Для выделения Т-лимфоцнтов из селезенки использовался метод фильтрования суспензии клеток через нейлоновую вату ("Нитрон") [Julius е.а., 1973]. Собранные клетки осаждались центрифугированием и подсчитывались. Как правило, в эшоате содержались 70-75% Т-лимфоиитов (цитотоксическая реакция с ан-ти-ТЬу1,2 моноклональными антителами) и 1-6% B-лимфоцитов (ЕАС-розетки). Получение клеточных суспензий обогащенных В-лимфоцитами. Для выделения B-лимфоцитов, использовалась реакция комплемент-зависимого масс-цитолиза. В качестве цитотоксических сывороток использовались моноклональные антитела против Thy 1,2 антигенов мыши ("Диа-М", Москва) в титре, который определялся эмпирически и составлял от 1:32 до 1:64, или анти-Ва©-сыворотка [Golub, 1971]. При тестировании фракционированной данным способом клеточной суспензии только 0-2% несли Thy 1,2 маркеры. Получение клеточных суспензнй, лишенных адгезивных клеток Для удаления макрофагов из суспензии спленоцитов использовался метод негативной селекции, заключающийся в активной адгезии макрофагов на стек-

лянной поверхности [Эккерт, 1987].

Оценка функциональной активности спленоцитов, инкубированных in vitro

Для оценки функциональной активности иммунокомпетентных клеток селезенки использовалась модель сингенного переноса. Мыши-реципиенты подвергались тотальному рентгеновскому облучению. Иммунокомпетептные клетки селезенки или отдельные фракции спленоцитов, предварительно подвергшиеся воздействию изучаемых агентов in vitro, концентрировались таким образом, чтобы в 0,5 мл содержалось 2- 107 ЯСК. Параллельно готовилась суспензия тимус-зависимого антигена - ЭБ (2-108/0,2 мл). Исследуемые клетки и антиген инъецировались в одном шприце в латеральную хвостовую вену мышей-реципиентов. Реципиенты, таким образом, представляли собой "живую пробирку". На 4-5-е сутки от момента переноса клеток реципиенты забивались и у них определялись ЛОК прямым или непрямым методом локального гемолиза в геле агарозы.

Полученные результаты сравнивались с контролем - адоптивный иммунный ответ интактных спленоцитов, инкубируемых в макрокультурах без добавок, и рассчитывались на количество трансплантированных спленоцитов. Экспериментальная модель генерации спленоцитов, реализующих супрессию гуморального иммунного ответа

Использовалась экспериментальная модель Вислера и Стобо (1976). Клет-ки-супрессоры выделялись на 14 сутки и внутривенно переносились ннтактным сингенным реципиентам в дозе 5 • 107 ЯСК. Одновременно мыши-реципиенты иммунизировались (ЭБ 2-108). Эффект супрессии регистрировался на 5-е сутки от момента иммунизации по угнетению числа АОК. Для контроля антигенной специфичности генерированных супрессоров, некоторым реципиентам трансплантировались клетки-супрессоры, индуцированные эритроцитами кролика. Помимо этого, проводились процедуры фракционирования клеток-супрессоров, используя методы негативной и позитивной селекции Т-лимфоцитов.

После выделения спленоциты-супрессоры находились в условиях макрокультуры (5-107/10мл) куда вносились различные фармакологические и гормональные агенты.

Радиоиммуиный метод оценки уровня PGF2a, сскретнруемою

иммунокомпетентнымн клетками

Уровень PGF2a в супернатантах макрокультур клеток селезенки определялся после их часовой инкубации в бессывороточной среде 199. Для этого использовался стандартный КИТ производства Института изотопов Венгерской академии наук (3H-Prostaglandin F2a RIA KIT-Direct. H-1525 Budapest, Hungary). Радиоактивность проб измерялась на сцинтилляционном счетчике "Бета-2" (Киев). Результаты оценивались в пг/мл.

Определение концентрации внутриклеточного сАМР в силеноцитах

радиоиммунным методом

Уровень внутриклеточного сАМР определялся радиоиммунным методом с использованием стандартного набора КС-АЦФ-Н-3 ("Изотоп", С.-Петербург). Концентрация сАМР определялась в нуклеотид-белковом комплексе, осажденном сульфатом аммония из разрушенных клеток.

Учитывая, что сАМР образуется в первые минуты рецепции, замеры его уровня проводились на 10, 30 и 60 мин. культивирования иммунокомпетентных клеток.

Уровни радиоактивности в пробах определялись на счетчике "Бета-2". Результаты выражались в пмолях (пМ) на 106 клеток.

Статистический анализ результатов

Данные экспериментов обрабатывались с помощью методов вариационной статистики. В работе определялись две средние (М): арифметическая и геометрическая. Последняя определялась при преобразовании натуральных чисел в logio (lg). Подобное преобразование более точно отражает нелинейные системы. Достоверность различий между группами (Р) оценивалась с помощью критерия Стьюдента [Плохинский,1980].

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Влияние ХГ и эндогенных половых стероидных гормонов на уровень первичного иммунного ответа

Специально проводимые экспериментальные исследования эндокринного статуса лабораторных животных, которым инъецировались различные дозы ХГ,

показали, что яичники мышей-самок дают выраженную лютеиновую реакцию с высокой степенью эстрогеннон активности. В связи с этим все эксперименты in vivo выполнялись параллельно на интактных и оварнэктомированных самках. Такой подход позволяет не только дифференцировать непосредственные и опосредованные иммупомодулирующие эффекты ХГ, но и оценивать иммунорегуля-торную активность эндогенных половых гормонов яичников.

Влияние ХГ на формирование первичного иммунного ответа у некастрированных и оварнэктомированных мышей-самок Введение ХГ некастрированным самкам, начиная инъекции за 15 дней до иммунизации и заканчивая за день до забоя, формирует различный по интенсивности первичный иммунный ответ. В дозе 40МЕ/мышь гормон статистически достоверно повышает количество IgM-AOK как по отношению к контролю, так и к животным, получавшим ХГ в дозе 200МЕ/мышь, которая не оказывает значимого влияния на величину изучаемого показателя (табл. 1). У оварнэктомированных мышей обе дозы ХГ статистически достоверно угнетают первичный иммунный ответ, что говорит об опосредованности иммуномодулирующих эффектов ХГ в организме интактных самок.

Таблица 1

ВЛИЯНИЕ ХГ IIA УРОВЕНЬ ПЕРВИЧНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА

У НЕКАСТРИРОВАННЫХ И ОВАРНЭКТОМИРОВАННЫХ МЫШЕЙ (Mim)

№ группы Экспериментальное воздействие Число мышей lgM-AOK/10<> ЯСК lg М-АОК на орган

1 Контроль 12 2,810±0,044 (708,2) 5,040+0,040 (116160,2)

2 ХГ(40МЕ/мышь) 12 3,050±0,033 (1193,2) P(ii)<0,001 5,350+0,025 (230158,9) P¡2 п<0,001

3 ХГ(200МЕ/мышь) 12 2,84010,042 (751,2) Р(з-2)<0,001 5,071+0,039 (125492,5) Р(з 2)<0,001

4 Контроль (овариэктомия) 9 2,628+0,040 (447,0) 4,972+0,051 (100210,4)

5 Овариэктомия, ХГ(40МЕ/мышь) 10 2,389+0,028 (252,6) Р(5-4)<0,001 4,72110,036 (54788,7) Р(5-4)<0,001

6 Овариэктомия, ХГ(200МЕ/мышь) 10 2,33610,042 (228,9) Рм,<0,001 4,760+0,050 (61760,0) Р(6-4)<0,001

Животные, получавшие в сумме 8 инъекций ХГ в течение 15 суток только

до иммунизации, служили моделью для оценки влияния ХГ и эндогенных половых стероидов на антигеннезависимый этап иммуногенеза. У некастрированных и овариэктомированных мышей, ХГ, инъецированный по этой схеме, оказывает однозначный иммунодепрессивный эффект, который наиболее четко фиксируется в при использовании дозы 200МЕ/мышь (табл. 2). Таким образом, на этапе ан-тигеннезависимой дифференцировки ХГ, равно как и эндогенные половые стероидные гормоны яичников, индуцированные гонадотропином, оказывают однозначное иммунодепрессивное действие.

Таблица 2

ИЗМЕНЕНИЕ ПЕРВИЧНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА У НЕКАСТРИРОВАННЫХ И ОВАРИЭКТОМИРОВАННЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ВВЕДЕНИИ ХГ

ДО ИММУНИЗАЦИИ (М±т)

№ группы Экспериментальное воздействие Число мышей ^ М-АОКЛО ЯСК ^ М-АОК на орган

1 Контроль 12 2,810+0,044 (708,2) 5,040+0,040 (116160,2)

2 ХГ(40МЕ/мышь) И 2,670±0,017 (477,6) Р(м)<0,01 4,930±0,023 (87447,0) Р(м)<0,05

3 ХГ(200МЕ/мышь) 11 2,597+0,046 (424,0) Р(з-1)<0,01 4,816+0,044 (69989,1) Р(з-1)<0,001

4 Контроль (овариэктомия) 9 2,62810,040 (447,0) 4,972±0,051 (100210,4)

5 Овариэктомия, ХГ(40МЕ/мышь) 10 2,488+0,037 (321,8) Р(5.4)<0,05 4,877+0,031 (77688,9) Р(5-4)>0,05

6 Овариэктомия, ХГ(200МЕ/мышь) 10 2,378+0,054 (259,9) Р(б-4)<0,002 4,758+0,059 (62771,0) Р(б-4)<0,02

Таким образом, на фоне овариэктомии ХГ угнетает формирование гуморального иммунного ответа вне зависимости от используемой дозы и от этапов клеточной дифференцировки. У животных с сохраненными яичниками гормон оказывает более избирательное действие, что связано с эндогенным синтезом половых стероидов, иммунорегулирующие эффекты которых, по-видимому, в большей степени зависят от процессов антигензависимой дифференцировки спленоцитов.

3.2. Влияние эстраднола, прогестерона, ХГ и нх комбинаций на формирование адоптивного иммунного ответа и уровень PGF2«

При исследовании гормональных эффектов в системе in vivo невозможно избежать системного действия эндокринных факторов, которое может опосредоваться не только через железы внутренней секреции, но и через модулирование функциональной активности других органов. Изучение гормонов in vitro устраняет системные влияния, однако результаты, полученные в культуре клеток, часто не находят подтверждения на уровне организма, оставаясь "феноменом in vitro". В связи с этим, в дальнейшем использовался нетрадиционный подход, новизна которого заключается в объединении двух экспериментальных систем in vitro (непосредственное воздействие гормонов на иммунокомпетентные клетки) и in vivo (последующая оценка действия гормонов на уровне целостного организма).

Известно, что большинство гормонов опосредует свои эффекты на клетки через систему циклооксигеназных продуктов арахидоновой кислоты, так называемые эйкозаноиды. В силу этого, необходимо было исследовать влияние эстрогенов и прогестинов, равно как и ХГ, не только на процессы формирования АОК, но и на способность спленоцитов продуцировать PGF2a.

Влияние эстрадиола (Ег) на формирование адоптивного иммунного ответа и уровень PGF;„ в суспензии интактных спленоцитов Ег или его растворитель (контрольная группа) вносился в культуры интактных спленоцитов на час, функциональная активность которых оценивалась в системе сннгенного переноса по уровню АОК. В других сериях из клеточных культур производился забор супернатанта, в котором методом радиоиммунного анализа определялся PGFza-

Как видно из рис. 1, часовая инкубация интактных спленоцитов с Ег приводит к статистически достоверному росту уровня АОК и PGF2a- Соотношение между АОК-стимулирующей активностью и РСРга-стимулируюшим действием используемых концентраций гормона позволяет сделать два заключения. Во-первых, иммуностимулирующая активность Ег связана со способностью гормона активировать продукцию PGFia иммунокомпетентными клетками. Во-вторых, диапазон концентраций PGF2a, который сопряжен со стимуляцией процессов

■ Уровень АОК —¿г— Уровень контроля для АОК

—•— Уровень РС.тР2 —о— Уровень контроля для РОР2

Рис.1. СООТНОШЕНИЕ АОК- И РСР2.-СТИМУЛИРУЮЩИХ АКТИВНОСТЕЙ

РАЗНЫХ ДОЗ Е2

По осп ординат: слева - уровень АОК/2-Ю7 ЯСК

справа -уровень РОр2а(пмолъ/мл). По оси абсцисс: 1,- Е2 (0,01 нг/мл); 2. - Е2 (0,175 нг/мл);

3,- Е2 (1,0 нг/мл); 4. - Е2 (10,0 нг/мл).

—в—Уровень АОК —л—Уровень контроля для АОК

-»-Уровень РОР2 —о— Уровень контроля для РОР2

Рис.2. СООТНОШЕНИЕ АОК- И РОРь-СТИМУЛИРУЮЩИХ АКТИВНОСТЕЙ РАЗНЫХ ДОЗ ПРОГЕСТЕРОНА

По оси ординат: слева - уровень АОК/2 Ю7ЯСК;

справа - уровень РСтРь (пмоль/мл). По оси абсцисс: 1. - прогестерон (0,325 нг/мл): 2. - прогестерон (2.250 нг/мл);

3. - прогестерон (20,0 нг/мл); 4. - прогестерон (100 нг/мл).

формирования АОК, имеет верхнюю границу, переход которой приводит к утрате иммуностимулирующего эффекта.

Влияние прогестерона на уровень адоптивного иммунного ответа и уровень PGF2„ в суспензии интактных спленоцитов

Внесение прогестерона в краткосрочную культуру интактных спленоцитов приводит к формированию адоптивного иммунного ответа вдвое, превышающего оптимальный контрольный уровень. Одновременно спленоциты отвечают выраженной секрецией PGF20 (рис. 2). При сравнении результатов действия прогестерона на способность интактных клеток селезенки формировать АОК и продуцировать PGF2a обращает на себя внимание, что дозы гормона, незначительно стимулирующие формирование АОК, более существенно активируют спленоциты к продукции PGF2a и, наоборот (рис.2).

Влияние Ез. прогестерона, ХГ и их комбинаций на уровень первичного адоптивного иммунного ответа и уровень PGFa^ в суспензии интактных

спленоцитов

Схема постановки экспериментальных серий была аналогична предыдущим исследованиям. Особенности заключались лишь в использовании большего числа гормонов и их сочетаний между собой. ХГ использовался в дозах сопоставимых с использованными в эксперименте in vivo. Доза ЮМЕ/мл экстраполировалась с 40МЕ/мышь, 50МЕ/мл с 200МЕ/мышь. При экстраполяции доз ХГ главным критерием служило количество клеток, переносимых сингенным реципиентам.

В отличие от предыдущих экспериментов Ег и прогестерон использовались в концентрациях, которые наблюдаются только во время физиологически протекающей беременности: Е: - 1,0 нг/мл или 10,0нг/мл; прогестерон - 20,0нг/мл или 100,0нг/мл на 8-й нед. (I триместр) или 30-й нед.(Ш триместр), соответственно [Савельева и др., 1991; Баграмян, 1984; Kase & Reyniak, 1985].

Комбинации доз ХГ и Ej моделировались таким образом, чтобы отражать физиологическую ситуацию при беременности: в I (ХГ-50МЕ/мл+Е2-1,0нг/мл) или III (ХГ-ЮМЕ/мл+Ег-Ю.Онг/мл) триместрах. С прогестероном ХГ комбинировался аналогичным образом: I триместр - ХГ-50МЕ/мл+прогестерон-20,0нг/мл; III триместр - ХГ-10МЕ/мл+прогестерон-100,0нг/мл.

Контроль ХГ (10МЕ/МЛ) ХГ (50МЕ/мл)

!Уровень АОК -»-Уровень РОР2а)

Рис.3. ВЛИЯНИЕ ХГ НА СПОСОБНОСТЬ СПЛЕНОЦИТОВ ФОРМИРОВАТЬ

АДОПТИВНЫЙ ПЕРВИЧНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ И ПРОДУЦИРОВАТЬ РОК^

По оси ординат: слева - количество АОК/2 • 107 ЯС'.К;

справа - уровень РС»Р2а (пмоль/мл).

По оси абсцисс: I. - Контроль; 2. - ХГ (ЮМЕ/мл); 3. - ХГ (50МЕ/мл). а - Р<0,002 по отношению к контролю; Ь - Р<0,001 по отношению к контролю; с - Р<0,05 по отношению к контолш и ХГ (1 ОМЕ/мл).

Как видно из рис. 3, внесение ХГ (10 или 50МЕ/мл) в краткосрочную культуру интактных сплсноцитов приводит к статистически достоверному угнетению их функциональной активности, что выражается в двукратном снижении выхода АОК. На продукцию РОРга ХГ действует в дозозависимой манере: 50МЕ/мл -достоверно повышает его уровень, а 1 ОМЕ/мл - не оказывает влияния. По-видимому, уровень РОРга является свидетелем разных механизмов, реализующих иммуносупрессивный эффект низкой и высокой доз гормона.

Совместное внесение в клеточную культуру ХГ и Ег в комбинациях доз, отражающих их уровень в I триместре, не оказывает статистически значимого влияния на количество АОК (рис. 4).

При оценке совместного действия гормонов с их индивидуальными эффектами установлено, что комбинации исследуемых доз Ег с ХГ полностью нивелируют иммуносупрессивпую активность последнего и статистически достоверно повышают концентрацию РОЕга в суспензии клеток - предшественников АОК. Иначе говоря, на протяжении всех триместров беременности Ег способен блокировать иммуносупрессивные эффекты ХГ.

|г ''Уровень ЛОК —»-Уровень Г'ОГ2а |

Рис.4. ВЛИЯНИЕ Е2, ХГ И ИХ КОМБИНАЦИЙ НА УРОВЕНЬ АОК- И Р01-2с1

По оси ординат: слева - уровень АОК/2 ■ 107 ЯСК;

справа - уровень РОР2о (пмоль/мт). По оси абсцисс: 1. - Контроль; 2. - ХГ (10МЕ/мл); 3. - ХГ (50МЕ/мл); 4. - П2 (I,Онт/мл); 5. - Е2 (10нг/чл);

6. - Е2 (1 Онг/мл)+ХГ (1 ОМЕ/мл);

7. - Е2 (1,()нг/мл)+ХГ (50МЕ/мл)

Рис.5. ВЛИЯНИЕ ПРОГЕСТЕРОНА, ХГИ ИХ КОМБИНАЦИИ НА УРОВЕНЬ

АОГ И РОР2а

Пи оси ординат: слепа - уровень АОК/2 • 107 ЯСК;

справа - уровень ГСР2а (лмоль/мл). По осп абсцисс: 1. - Контроль; 2. - ХГ (1 ОМЕ/мл); 3. - ХГ (50МЕ/мл);

4. - Прогестерон (20,0пг/мл); 5. - Прогестерон (ЮОнг/мл);

6. - Прогестерон (100нг/ш)+ХГ (ЮМЕ/мл);

7. - Прогестерон (20,0нг/мл)+ХГ(5ОМБ/мл).

Часовая инкубация интактных спленоцитов с ХГ и прогестероном, внесенных одномоментно в дозах, отражающих концентрации репродуктивных гормонов в I или III триместры беременности, не оказывает статистически значимых эффектов на процессы формирования АОК (рис. 5). При сравнении самостоятельных эффектов прогестерона и ХГ с их комбинациями, отмечается своеобразная интерференция иммуностимулирующих эффектов прогестерона и иммуносу-прессивных действии ХГ, что приводит к взаимному "гашению" иммуномодули-рующих механизмов друг друга и формированию оптимального уровня АОК, не отличимого от контроля (рис. 5).

При изучении функциональной активности спленоцитов по уровню PGF2a обращает на себя внимание схожесть данных, регистрируемых при инкубации только высокой дозы ХГ (227,5±71,0 имоль) и сочетания этой дозы ХГ с прогестероном, отражающих их взаимодействие в I триместре (224,3+85,1 пмоль). По-видимому, в данном случае доминирует РОРга-стимулирующая активность ХГ, в то время как в сочетании ХГ и прогестерон, характерных для III триместра на первый план выступает аддитивность гормональных эффектов (рис. 5).

Таким образом, иммуностимулирующие эффекты Ег и прогестерона прямо связаны с процессами активации продукции интактными спленоцитами PGF:i;t. Однако зависимость силы этого эффекта от выраженности иммуностимулирующего влияния носит обратную зависимость и, по-видимому, при высоких концентрациях PGF2a либо оказывает тормозящее действие на процессы стероид-индуцированной стимуляции антигсннезависимой дифференцировки, либо утрачивает контроль над этими процессами, выступая как независимый эффект гормонов. ХГ оказывает иммуносупрессивные эффекты, реализация которых осуществляется разными механизмами. Однако половые стероидные гормоны способны полностью нивелировать иммунодепрессивную активность ХГ ценой собственного иммуностимулирующего действия. Интерференция гормональных эффектов затрагивает лишь процессы формирования АОК, но не продукцию PGF2a.

3.3. Молекулярные механизмы мессснджерной транедукции гормонального сигнала ХГ у ннтактных спленоцитов

Известно, что лимфоидные клетки способны не только секретировать ХГ

при активации их в условиях СКЛ [НагЬоиг-МсМепатт е.а.,1986], но и взаимодействовать с гормоном [УатаисЫ е.а., 1981]. Эксперименты выполнены на самках р1 (СВА-С57ВЬ/6). ХГ вносился в краткосрочную культуру клеток интакт-ной селезенки или фракционированных спленоцигов. Фракционирование проводилось методами негативной или позитивной селекции иммунокомпетентных клеток. Макрофаги удалялись из суспензии путем активной (37°С) адгезии к стеклянной поверхности. Т-лимфоциты элюировались с колонки нейлоновой ваты, а В-лимфоциты выделялись с помощью массиитолиза. Во всех случаях ХГ вносился в культуру на 1 час в дозах 10 или 50 МЕ/мл. После инкубации клетки инъецировались внутривенно летально облученным сингенным реципиентам совместно с тимусзависимым антигеном (ЭБ). Функциональная активность обработанных гормоном клеток оценивалась на 4-5-е сут. от момента переноса. В ряде экспериментов одновременно с ХГ или без него (контроль) в культуру клеток вносился один из ингибиторов, позволяющих оценить значение того или иного вторичного мессенджера или систем, их генерирующих, для механизма трансмембранной передачи гормонального сигнала.

Как видно из табл. 3, существенную роль в механизмах гормональной им-мунорегуляпии играет клеточный состав, па который воздействует ХГ.

Таблица 3

ВЛИЯНИЕ ХГ НЛ ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ИНТАКТНЫХ СПЛЕНОЦИТОВ И ОТДЕЛЬНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ КЛЕТОК СЕЛЕЗЕНКИ, РЕАЛИЗУЮЩИХ АДОПТИВНЫЙ ПЕРВИЧНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ

Экспериментальное воздействие Спленоциты Спленоциты, лишенные А-клеток Т-клетки В-клетки

ХГ (ЮМЕ/мл) 1 1 4-►

ХГ (50МЕ/мл) 1 1

Так, на этапе аитигеннезависимой дифференцировки нативной клеточной суспензии спленоцптов, основными акцепторами и регуляторами функциональной активности клеточных популяций выступают А-клетки. Их удаление из суспензии нивелирует иммунодепрессию, наводимую как низкой, так и высокой дозами ХГ. Одновременно, для низкой дозы гормона, удаление А-клеток является необходимым условием, позволяющим реализовать иммуностимулирующие эф-

фекты посредством избирательного повышения функциональной активности В-лимфоцитов. При взаимодействии с фракционированными клетками селезенки четко прослеживается зависимость модулирующей активности ХГ от его дозы. Так, в низкой дозе ХГ не способен оказывать существенного влияния на Т-клетки, но резко повышает функциональную активность В-лимфоцитов, в то время как в высокой дозе, напротив, не оказывая влияния на способность В-лимфоцитов реализовать гуморальный иммунный ответ, гормон существенно угнетает эту способность у Т-клеток. Подобное действие, по-видимому, связано с наличием различных по количеству и/или степени аффинности гормональных рецепторов или их аналогов на клеточной поверхности данных популяций спле-ноцитов.

Молекулярные механизмы транедукции иммуносупрессорного эффекта низкой дозы ХГ полностью зависят от А-клеток. При взаимодействии ХГ с адгезивными клетками селезенки гормон оказывает двойное действие. Во-первых, он активирует циклооксигеназу, усиливая тем самым негативный контроль со стороны макрофагов за процессами антигеннезависимой дифференцировки лимфоцитов. По всей вероятности, в качестве негативного регулятора выступают молекулы РвЕг (табл. 4). Во-вторых, угнетает процессы образования внутриклеточного сАМР (табл. 6). Не исключено, что угнетение уровня сАМР прямо связано с потерей макрофагами эффекторной активности как фагоцитирующих и антиген-презентирующих клеток [Регпкс11еуа-11оБ1а^ е.а., 1979]. Лимфоидные клетки, присутствующие в этот момент в суспензии спленоцитов, либо не испытывают непосредственного эффекта гормона, либо, взаимодействуя с его молекулами (В-лимфоциты), не в состоянии реализовать иммуностимулирующий эффект, находясь под РвЕг иммуносупрессивным прессом макрофагов (табл. 4,5).

Таблица 4

ЗАВИСИМОСТЬ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИХ ЭФФЕКТОВ ХГ ОТ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ НЕКОТОРЫХ СИСТЕМ ВТОРИЧНЫХ МЕССЕНДЖЕРОВ

Экспериментальное воздействие Интактные спленоциты Спленоциты на фоне блокады синтеза Р1Рг Спленоциты на фоне блокады Са2+- каналов Спленоциты на фоне блокады синтеза простаглацдинов

ХГ (ЮМЕ/мл) 4 4 4 4--►

ХГ (50МЕ/мл) 4 4 «— 4

Таблица 5

ЗАВИСИМОСТЬ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИХ ЭФФЕКТОВ ХГ ОТ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ НЕКОТОРЫХ СИСТЕМ ВТОРИЧНЫХ МЕССЕНДЖЕРОВ В КУЛЬТУРАХ СПЛЕНОЦИТОВ, ЛИШЕННЫХ А-КЛЕТОК

Экспериментальное воздействие Интактные спленоциты Спленоциты на фоне блокады синтеза Р1Рг Спленоциты на фоне блокады Са2<-каналов

ХГ (ЮМЕ/мл) т 1

ХГ (50МЕ/мл <-►

Таблица 6

ИЗМЕНЕНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО УРОВНЯ сАМР ПРИ ЧАСОВОЙ ИНКУБАЦИИ ХГ С НЕКОТОРЫМИ ПОПУЛЯЦИЯМИ КЛЕТОК ИНТАКТНОЙ СЕЛЕЗЕНКИ

Экспериментальное воздействие Уровень внутриклеточного сАМР

Т-лимфоциты В-лимфоциты

ХГ (!0МЕ/мл) «-► I

ХГ (50МЕ/мл) 1 I

На основании полученных данных предложена схема вероятного механизма действия низкой дозы ХГ (рис. 6). В механизме гормональной трансдукции В-лимфоцитов принимают участие две мессенджерные системы (рис. 7). Во-первых, как и в репродуктивных клетках [МсРаг1апс1 е.а., 1989], ХГ задействует сАМР (табл. 6). По-видимому, это действие осуществляется через 1*1 и сопрягающий его с аденилатциклазой О; ОТР-связывающий белок, что приводит к существенному снижению внутриклеточного сАМР. Однако, подобным эффектом обладает и высокая доза ХГ (табл. 6), но данный механизм не ведет к активации В-лимфоцитов (табл. 4).

Из этого следует, что данный механизм, имея место, не является определяющим в реализации иммуностимулирующей программы ХГ-10МЕ. Во-вторых, взаимодействие низкой концентрации гормона с В-лимфоцитами связано с обме-

ном мембранных инозитидов (табл. 5), которые определяют процессы пролиферации и дифференцировки В-лимфоцитов [Утешев, 1991]. Блокада этой системы вторичных мессенджеров полностью лишает низкую дозу ХГ иммуностимулирующего влияния на В-клетки селезенки (табл. 5).

Рис. 6. ВОЗМОЖНЫЙ МЕХАНИЗМ РЕАЛИЗАЦИИ

ИММУНОДЕПРЕССИВНОГО ДЕЙСТВИЯ НИЗКОЙ ДОЗЫ ХГ НА УРОВНЕ

А-КЛЕТОК ИНТАКТНОЙ СЕЛЕЗЕНКИ

Примечание: здесь и в последующих схемах

Фл-С - Фосфолипаза-С

Фл-А2 - Фосфолипаза-Аг

нжк - Насыщенная жирная кислота

АК - Арахидоновая кислота

Я; - Высокоаффинный рецептор ХГ

С, - вТР-связывающий белок

Рис. 7 ВОЗМОЖНЫЙ МЕХАНИЗМ РЕАЛИЗАЦИИ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ НИЗКОЙ ДОЗЫ ХГ НА УРОВНЕ В-ЛИМФОЦИТОВ ИНТАКТНОЙ СЕЛЕЗЕНКИ

Механизмы иммунодепрессивного эффекта высокой дозы ХГ, в отличие от механизмов низкой дозы, имеют более сложную структуру как на уровне клеточных популяций, так и на уровне систем вторичных мессенджеров (табл. 4, 5, 6). ХГ в высокой дозе, также как и в низкой, реализует иммунодепрессивный эффект посредством взаимодействия с А-клетками, активируя негативный контроль через стимуляцию циклооксигеиазы. В то же время, иммунодепрессивное действие гормона ассоциировано с функцией потенциалнезависимых Са21"-каналов (рис.

8). Это, по всей вероятности, приводит к поступлению экстрацеллюлярного Са2+ в цитоплазму, что и определяет иммуносупрессивные эффекты гормона на уровне А-клеток.

Рис. 8 ВОЗМОЖНЫЙ МЕХАНИЗМ РЕАЛИЗАЦИИ ИММУНОДЕПРЕССИВНОГО ДЕЙСТВИЯ ВЫСОКОЙ ДОЗЫ ХГ НА УРОВНЕ А-КЛЕТОК ИНТАКТНОЙ СЕЛЕЗЕНКИ

Помимо этого необходимо отметить способность высокой дозы ХГ взаимодействовать как с В-, так и Т-лимфоцитами интактной селезенки. В первом случае эффект гормона не отражается на способности клеток формировать первичный иммунный ответ, несмотря на угнетение процессов образования внутриклеточного сАМР. Во втором, И* белок, выполняющий функцию рецептора стимулирующего аденилатциклазу, при взаимодействии с ХГ активирует образование вторичного мессенджера - сАМР, который, по-видимому, и определяет низкий уровень активности Т-лимфоцитов. При этом, ХГ одновременно активирует циклооксигеназу Т-лимфоцигов, усиливая продукцию РСтРга (рис. 9). Не исключено, что РОИго., который стимулирует процессы пролиферации клеток крови

[Ивашкин и соавт.,1987], является своеобразной отрицательной обратной связью в межклеточных коммуникациях: А-клетка - Т-лимфоцит, которая обеспечивает порог ХГ-зависимой иммуносупрессни.

Рис. 9 ВОЗМОЖНЫЙ МЕХАНИЗМ РЕАЛИЗАЦИИ ИММУНОДЕПРЕССИВНОГО ДЕЙСТВИЯ ВЫСОКОЙ ДОЗЫ ХГ ИЛ УРОВНЕ Т-ЛИМФОЦИТОВ ИПТАКТНОЙ СЕЛЕЗЕНКИ И* - Низкоаффинный рецептор ХГ

ОТР-связывающий белок Таким образом, на уровне А-клеток ХГ реализует стратегию иммуносу-прессивного контроля. Если концентрация гормона высока, основным трапсдук-тором иммуносупрессивного эффекта выступает экстрацеллюлярный Са2+, достаточна - продукты цнклооксигеназы.

3.4. Влияние ХГ на функциональную активность зрелых клеток-супрессоров in vitro

Для подтверждения возможности непосредственного гормонального действия на клетки-супрессоры проводилась серия экспериментов in vitro. Супрессо-ры индуцировались по ранее представленной схеме [Whisler & Stobo, 1976]. На 14-е сутки доноры супрсссорных клеток забивались, спленоциты помещались в специальные флаконы и культивировались с ХГ в течение часа при t 37°С. Концентрация гормона составляла 10 или 50 МЕ/мл при общем объеме одной макрокультуры - 10 мл (5- 10б ЯСК в мл или 5-107/культуру), т.е. была аналогична курсовым дозам гормона при постановке эксперимента in vivo.

В ряде экспериментов силеноциты-супрессоры предварительно подвергались фракционированию на колонке нейлоновой ваты. Элюированные Т-лимфоциты также инкубировались в течение часа с ХГ в аналогичных условиях. Оценка функциональной активности спленоцитов и/или Т-лимфоцитов, оказывающих негативный контроль на процессы формирования гуморального иммунного ответа, проводилась на 5-й день от момента трансплантации по уровню АОК, регистрируемых у сингенных реципиентов.

Таблица 7

ВЛИЯНИЕ ЧАСОВОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ХГ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ

АКТИВНОСТЬ ЗРЕЛЫХ СПЛЕНОЦИТОВ-СУПРЕССОРОВ (М±т)

№ группы Экспериментальное воздействие Число мышей ЯСК селезенки (• 10'-) IgAOK/lO ЯСК

1 Контроль (первичпый иммунный отпет) 23 266,5±16,7 2,657±0,050 (517,2)

2 Контроль (перенос супрессоров) 38 268,3±11,0 Р(М)>0,05 1,771 ±0,019 (61,1) Р(2-1)<0,001

3 ХГ(1 ОМЕ/мл) 23 230,0±13,4 Р(и)<0,05 1,936+0,036 (93,4) Р(з-2)<0,001

4 ХГ(50МЕ/мл) ¡2 253,7±12,4 Р(4-2;>0,05 1,935±0,038 (89,8) Р(«)<0,001

Часовая инкубация спленоцитов-супрессоров с ХГ приводит к угнетению иммуносупрессивной функции этих клеток, что проявляется в статистически достоверном увеличении АОК у сингенных реципиентов (табл. 7).

Внесение ХГ в краткосрочную макрокулътуру лимфоцитов-супрессоров, профильтрованных через нейлоновое волокно, также приводит к снижению супрессивной активности данных клеток. Если у нефракционированных клеток доза ХГ не играет существенной роли, то при контакте с фракционированными су-прессорами дозовая зависимость присутствует (табл. 8). Так, статистически достоверные результаты фиксируются только при внесении высокой дозы ХГ (табл. 8). По-видимому, для успешной реализации иммунодепрессивного действия низкой дозы ХГ необходимо присутствие супрессоров макрофагального ряда, которые задерживаются нейлоновым волокном.

Таблица 8

ВЛИЯНИЕ ХГ IN VITRO НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ

СУПРЕССОРОВ, ЭЛЮИРОВАННЫХ С КОЛОНКИ НЕЙЛОНОВОЙ ВАТЫ (М+гп)

№ группы Экспериментальное воздействие Число мышей ЯСК селезенки (• Ю6) ¡gAOK/lO6 ЯСК

1 Контроль (первичный иммунный ответ) 23 266,5+16,7 2.657±0,050 (517,2)

2 Контроль (перенос нефракционированных супрессоров) 10 169,6+13,9 Р{2-!><0,001 2,20810.066 (179,0) Р(2-п<0,001

3 Ко1ггролъ (перенос Т-лимфоцитов-супрессоров) 12 252,2+12,6 Рв-2)<0,001 2,262+0,051 (198,0) Р(3-2!>0.05

4 ХГ(1 ОМЕ/мл) 11 245,4+16,3 2,37210,057 (256,5)

5 ХГ(50МЕ/мл) 11 280,4+26,3 Р<5 з)>0,05 2,506±0,044 (337,6) Р(«)<0,002

Таким образом, вновь установлена зависимость иммуномодулирующего эффекта ХГ от его дозы. На данном этапе исследований реализация угнетающего функциональную активность действия ХГ зависит, как и в случае интактных спленоцитов, от популяционного состава зрелых спленоцитов-супрессоров. Воздействие гормона на гетерогенную популяцию клеток, реализующих антигенспе-цифическую супрессию, приводит к частичной потере этими клетками функциональной активности. Удаление из суспензии макрофагов и В-клеток, которые сорбируются нейлоном, приводит к утрате клеток-мишеней для низкой дозы ХГ. Аналогичный эффект гормона фиксируется и на уровне целостного организма.

Молекулярные механизмы трансдукции сигнала ХГ у спленоцитов-супрессоров

Целыо представленных в данном разделе исследований являлось изучение молекулярных механизмов угнетающих эффектов низкой и высокой доз ХГ у зрелых спленоцитов-супрессоров на уровне трансдукции гормонального сигнала.

ХГ в дозах 10 или 50 МЕ/мл вносился в макрокультуры спленоцитов-супрессоров, куда параллельно с ХГ вносились ингибиторы Са21 -каналов, ино-зитол-1-монофосфатазы и циклооксигеназы. В ряде экспериментов в клетках-супрессорах определялся уровень внутриклеточного сАМР.

Таблица 9

ЗАВИСИМОСТЬ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИХ ЭФФЕКТОВ ХГ' ОТ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ НЕКОТОРЫХ СИСТЕМ ВТОРИЧНЫХ МЕССЕНДЖЕРОВ В КУЛЬТУРАХ СПЛЕНОЦИТОВ-СУПРЕССОРОВ

Экспериментальное воздействие Спленоциты-супрессоры Супрессоры на фоне блокады синтеза PIPi Супрессоры на фоне блокады Са3*- каналов Супрессоры на фоне блокады синтеза простагландинов

ХГ(10МЕ/мл) 1 1

ХГ (50МЕ/мл) 1 «-► 1 1

Таблица 10

ИЗМЕНЕНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО УРОВНЯ сАМР ПРИ ЧАСОВОЙ ИНКУБАЦИИ ХГ С СПЛЕНОЦИТАМИ-СУПРЕССОРАМИ И СУПРЕС.СОРАМИ, ФРАКЦИОНИРОВАННЫМИ НА КОЛОНКЕ НЕЙЛОНОВОЙ ВАТЫ

Экспериментальное воздействие Уровень внутриклеточного сАМР

Спленоцигы-супрессоры Супрессоры, элюированные с нейлонового волокна

ХГ (ЮМЕ/мл) i-► 1

ХГ (50МЕ/мл) 1 1

Как видно из табл. 9 и 10, при часовой инкубации in vitro со зрелыми клет-ками-супрессорами гормон угнетает их функциональную активность, реализуя свой эффект двумя разными механизмами, которые определяются концентрацией гормона. Так, ХГ (50 МЕ/мл), взаимодействуя преимущественно с Т-лимфо-цитами, не прилипающими к нейлоновому волокну, повышает у этих клеток уровень цитоплазматического сАМР с одновременным вовлечением в механизм

гормональной трансдукции вторичных мессенджеров фосфоинозитидного обмена (рис. 10). В то время как ХГ (10 МЕ/мл), взаимодействуя преимущественно с адгезивными клетками, модулирует активность циклооксигеназы и функционирование потенциалнезависимых Са2+-каналов (рис. 11).

Рис. 10. ВОЗМОЖНЫЙ МЕХАНИЗМ РЕАЛИЗАЦИИ УГНЕТАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ВЫСОКОЙ ДОЗЫ ХГ НА УРОВНЕ КЛЕТОК-СУПРЕССОРОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ С ПОМОЩЬЮ НЕЙЛОНОВОЙ ВАТЫ

По-видимому, лимфоциты-супрессоры экспрессируют на своей поверхности ннзкоавндные гормон-связывающие рецепторы, которые как и у интакт-ных Т-лимфоцитов, сопряжены с Ог-ОТР-связывающим белком, который активирует аденилатциклазу и повышает уровень сАМР, что, как известно [Брондз, 1987], приводит к угнетению функции Т-клеток. Вторичные мессенджеры фосфа-тидилинозитольной системы повышают уровень цитоплазматического Са2+, активируя его выход из эндоплазматического ретикулума [Ивашкин и др., 1987], ко-

торый, акцептируясь кальмодулином, повышает его фосфодиэстеразную активность [Беррндж, 1985]. Таким образом, одновременная трансдукция гормонального сигнала через С5-сопрягаюш,ие белки по аденилатциклазному и фосфатиди-линозитольному метаболическим путям приводит к быстрому нарастанию сАМР, который также быстро инактивируется благодаря негативному контролю цепи инозитидных мессенджеров (рис. 10). Зависимость угнетающего действия ХГ от активности циклооксигеназы и функциональности потенциалнсзависимых Са2+-каналов дает основание считать, что механизм действия низкой дозы гормона на клетки, обладающие высокой адгезивной способностью, заключается в модулировании активности циклооксигеназы с одной стороны, и функционированию Са2+-каналов, с яругой (рис. 11).

Рис. 11. ВОЗМОЖНЫЙ МЕХАНИЗМ РЕАЛИЗАЦИИ УГНЕТАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ НИЗКОЙ ДОЗЫ ХГ НА УРОВНЕ А-КЛЕТОК-СУПРЕССОРОВ

Таким образом, результирующим действием низкой и высокой доз ХГ на

клетки-супрессоры является, по-видимому, увеличение цитоплазматического Са2+. Разница заключается в том, что низкая доза, акцептированная макрофагами, повышает уровень Са2+ через функционирование потепцналнезависимых Са2+-каналов, а высокая - при непосредственном контакте с лимфоцитами-супрессорами, через вторичные мессенджеры инозитидного обмена. В первом случае, Са2+ - экзогенного, во втором - эндогенного происхождения.

Важно подчеркнуть, что Т-лимфоциты, вне зависимости от их субпопуля-ционной детерминированности способны эффективно взаимодействовать только с высокой концентрацией ХГ, отвечая на его сигнал типовой реакцией - снижением функциональной активности. Если ХГ взаимодействует с предшественником Т-хелпера наблюдается снижение иммунного ответа, если с Т-клеткой, реализующей супрессию иммунного ответа - повышение уровня АОК.

3.5. Значение цнтокннов в ХГ-опосредованнон модуляции гуморального иммунного ответа

В последние время установлено, что плацента и некоторые репродуктивные органы способны синтезировать и выступать в роли акцепторов широкого спектра цитокинов [Hunt, 1989; Hedge, 1991]. Цитокины принимают непосредственное участие в иммунных механизмах, обеспечивающих сосуществование генетически чужеродных организмов матери и плода при беременности [ITunl, 1989; Hedge, 1991; Wegmann, 1990].

Поскольку ИНФ 1-го типа относятся к группе рост-ингнбирующих, пмму-носупрессивных цнтокннов [Scarozza & Evans,1991], выполняющих важную функцию по обеспечению неспецифической противовирусной резистентности организма [Семенов и др., 1982], а ИЛ2, напротив, является мощным рост-стимулирующим цитокином и активатором Т- и В-лимфоцитов [Armitage & Cawlei, 1986; Chun е.а., 1985], было важно оценить возможность их совместного с ХГ действия на процессы формирования антителообразующих клеток. Тем более, что плацента синтезирует эти цитокины и ХГ на протяжении всей беременности.

Способность ИНФ-q и р влиять на ХГ-зависимую модуляцию иммунного ответа

Все эксперименты проводились на мышах-самках линии СВА. В макро-

культуры интактных клеток селезенки на 1 час вносились: ХГ(10 или 50МЕ/мл), рекомбинантные (р) ИНФ-а или -р в концентрации 250МЕ/мл или различные сочетания данных цитокинов с разными дозами ХГ. Функциональная активность клеток селезенки оценивалась по уровню адоптивного иммунного ответа.

Таблица 11

ВЛИЯНИЕ ХГ И рИНФ-а, р НА СПОСОБНОСТЬ ИНТАКТНЫХ СПЛЕНОЦИТОВ

ФОРМИРОВАТЬ АДОПТИВНЫЙ ПЕРВИЧНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ (М±ш)

№ группы Экспериментальное воздействие Число мышей lgAOK/2-Ю'ЯСК Значение р

I Контроль 22 3,123+0,050 (1511,8)

2 ХГ(1 ОМЕ/мл) 8 2,893+0,103 (947,5) P(2-D<0,05

3 ХГ(50МЕ/мл) 12 2,949+0,047 (950,0) Р(з-1)<0,01

4 рИНФ-а (250МЕ/мл) 13 3,364+0,050 (2509,2) P(4-i)<0,001

5 рИНФ-а+ХГ(1 ОМЕ/мл) 13 3,492±0,034 (3229,2) P(5-i)<0,001 Р(5-2)<0,001 Р(5-4)<0,05

6 рИ НФ-а+ХГ(50МЕ/мл) 10 3,365+0,074 (2646,0) Pi6-i)<0,01 Р(6-3)<0,001

7 рИНФ-p (250МЕ/мл) 12 3,299±0,094 (2573,3) Р(7-О>0,05

8 рИНФ-р+ХГ(1 ОМЕ/мл) 12 3,28810,049 (2088,3) P(s i)<0,02 Р(8-2)<0,001

9 рИНФ-р+ХГ(50МЕ/мл) 12 3,38410,061 (2691,6) P(9-i)<0,001 Р(«-3)<0,001

Внесение в культуру интактных спленоцитов рИНФ-а в концентрации, отражающей средний уровень эндогенной продукции ИНФ 1-го типа при митоген-или вирусиндуцированном интерфероногенезе [Roberts & Steigbigel, 1978], статистически значимо стимулирует процессы формирования АОК (табл. 11). Одновременное присутствие ХГ и рИНФ-а в краткосрочной культуре интактных спленоцитов, приводит к выраженному иммуностимулирующему эффекту, наиболее высокий уровень которого наблюдается при комбинациях рИНФ-а с низкой концентрацией гормона (табл. 11). Что касается высокой дозы ХГ, то здесь можно лишь констатировать полную утрату ее иммунодепрессивного действия.

В отличие от рИНФ-а, рИНФ-p не способен статистически значимо повышать количество АОК (табл. 11), однако его часового присутствия достаточно

для нивелирования иммуносупрессивных эффектов низкой и высокой доз ХГ.

Способность рИЛ2 изменять направленность нммуномодулнрующих

эффектов ХГ

Как было отмечено выше, ИЛ2 присутствует в маточно-плацентар-ном компартаменте в норме. Как и ранее, ХГ использовался в концентрациях, характерных для физиологической беременности (10 или 50МЕ/мл), рИЛ2 вносился в культуру в минимально эффективной дозе, которая способна индуцировать пролиферацию митоген-активированных тимоцитов мыши (37,5МЕ/мл).

Таблица 12

СОВМЕСТНОЕ ВЛИЯНИЕ ХГ И рИЛ2 НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ИНТАКТНЫХ СПЛЕНОЦИТОВ, ФОРМИРУЮЩИХ ПЕРВИЧНЫЙ ИММУННЫЙ

ОТВЕТ В СИСТЕМЕ СИНГЕННОГО ПЕРЕНОСА (М+т)

№ группы Экспериментальное воздействие Число мышей 1ЕАОК/2-Ю7ЯСК Значение р

1 Контроль 40 3,237±0,033 (1926,5)

2 ХГ(1 ОМЕ/мл) 8 2,893+0,103 (947,5) Р(5-О<0,002

3 ХГ(50МЕ/мл) 12 2,949±0,047 (950,0) Р(з-1)<0,001 Р{з-2)>0,05

4 рИЛ 2(37,5МЕ/мл) 9 3,282+0,095 (2253,3) Р(4-1)>0,05

5 рИЛ2+ХГ(10МЕ/мл) 9 3,299+0,110 (2600,0) Р(5-Ц>0,05 Р(5-2)<0,02

6 рИЛ2+ХГ(50МЕ/мл) 10 3,58710,071 (4344,0) Р(б-1)<0,001 Р(б-з)<0,001 Р(б-4)<0,02 Р(6-5)<0,01

Как видно из табл. 12, часовое присутствие рИЛ2 в культуре интактных спленоцитов мышей-самок не приводит к статистически значимым изменениям адоптивного первичного иммунного ответа. Известно, что ИЛ2 способствует терминальной дифференцировке и пролиферации активированных антигеном, а не интактных лимфоидных клеток [Чередеев, Ковальчук, 1989].

Реципроктная инкубация рИЛ2 с исследуемыми дозами ХГ приводит либо к нивелировке иммунодепрессивного действия гормона (низкая доза), либо к выраженному иммуностимулирующему эффекту (высокая доза) (табл. 12). Важно отметить, что выход АОК в данном случае в 2,5 раза превышает контрольный уровень и в 4,5 количество АОК, формирующееся при воздействии только высо-

кой дозы ХГ. Вероятно, в данном случае, эффект гормона можно рассматривать как костимулирующий.

Таким образом, цитокины, появление которых в маточно-плацентарной зоне детерминировано способностью трофобласта к их продукции, могут существенно изменять направленность иммунорегуляторных эффектов таких плацентарных гормонов как ХГ. Несмотря на то, что ИНФ 1-го типа и ИЛ2 существенно различаются по механизму действия на иммуноциты и выполняют разные функции, их совместное с ХГ влияние приводит к однотипным результатам: нивелировке самостоятельного иммунодепрессивпого эффекта гормона и реализации иммунопотенцирующих эффектов. В то же время полученные результаты открывают новый, ранее неизвестный, аспект действия ХГ, который может объяснить как феномен одновременной секреции ИЛ2 и ХГ плацентой, так и способность лимфоцитов, при их активации в СКЛ, секретировать как ИЛ2, так и ХГ [Harbour-McMenamin е.а., 1986]. Очевидно, что костим у л н р у ю щ ая активность ХГ необходима, с одной стороны, клеткам трофобласта при их контакте с ИЛ2, как рост-стимулирующим цитокином, с другой - активированным лимфоцитам в м икст-ку льтур е.

3.6. Зависимость иммуномодулирующих эффектов ХГ от функциональной активности различных популяций спленоцитов

Уровень функциональной активности лимфоидных клеток во многом определяет их способность к взаимодействию с биологически активными соединениями, в том числе и гормонами. Установлено, что число гормональных рецепторов и/или сродство к гормону могут быть изменены активацией лимфоцита [Plaut, 1981; Helderman е.а., 1978]. В некоторых случаях, гормональные рецепторы экспрессируются только после активации лимфоцитов [Helderman е. а., 1978].

Учитывая подобные особенности клеток иммунной системы и постоянное динамичное состояние лимфоидных клеток при беременности, важно было оценить способность ХГ реализовать свои эффекты у митоген-активированных лимфоцитов.

Влияние ХГ на уровень адоптивного первичного иммунного ответа Кон А-активированных спленоцитов

Эксперименты выполнены на интактных мышах-самках линии (СВА • C57BL/6) Fi. В часовые макрокультуры вносился ХГ и параллельно с ним

митоген Т-лимфоцитов - Кон А в концентрации необходимой для индукции синтеза ИЛ2 (5 мкг/мл). Функциональная активность, как и ранее, оценивалась по уровню АОК в селезенках сингенпых летально облученных реципиентов.

3000 -]----рут-,п—;--

2500 -I----

2000 —I :--- -

1500 -I -----— - а

юоо — - — —.........!?„ -г— — ' — ^—

4 \ : >,- - ». к

500 — ■— —;— _ :— — ' —

О ■■ ■--А | . . - -— I I --— ■ ; | --------—1 I ---—• -—,

1 2 3 4 5 6

| ОАОК/2 10 ЯСК |

Рис.12. СОВМЕСТНОЕ ВЛИЯНИЕ ХГ И КОН А НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ИНТАКТНЫХ СПЛЕНОЦИТОВ, ФОРМИРУЮЩИХ АОК в СИСТЕМЕ СИНГЕННОГО ПЕРЕНОСА По оси ординат: количество АОК/2- Ю7 ЯСК селезенки. По оси абсцисс: 1. - Контроль; 2. - ХГ (1 ОМЕ/мл);

3. - ХТ (50МЕ/мл); 4. - Кон А (5мкг.'мл);

5. - Кон А+ХГ (1 ОМЕ/мл); 6. - Кон Л+ХГ (50МЕ/мл).

а - Р<0,01 по отношению к контролю:

Ь - Р<0,001 по отношению к контролю;

с - Р<0,02 по отношению к ХГ (1 ОМЕ/мл);

с! - Р<0,05 по отношению к Кон А (5мкг/мл).

Как видно из рис. 12, часовое воздействие Кон А не приводит к статистически значимому изменению уровня адоптивного иммунного ответа. Присутствие Кон А в культуре препятствует реализации ХГ иммуносупрессивного действия. Однако отмечается зависимость такого противодействия от используемой концентрации ХГ. Так, при внесении низкой дозы ХГ, Кон А в большей степени нивелирует ее негативный эффект, чем высокой дозы, что проявляется в статистически достоверной разнице между самостоятельным иммунодепрессивным действием ХГ и комбинации низкой дозы с Кон А (рис. 12).

По-видимому, в основе нивелирования Кон А иммуносупрессивного действия ХГ лежат механизмы индукции синтеза ИЛ2 Кон А-активированными спленоцитами. С этой позиции, иммуносупрессию ХГ в культуре интактных спленоцитов можно рассматривать как угнетение механизмов, отвечающих за индукцию процессов синтеза ИЛ2, и дополнительное вмешательство фактора,

с

усиливающего эти процессы, вступает с гормоном в антагонистические отношения. Это, в конечном счете, приводит к нивелировке как иммуносупрессивной (ХГ-индуцируемой), так и иммуностимулирующей (Кон А-индуцируемой) активности.

Влияние ХГ на функциональную активность интактных спленоцитов, формирующих адоптивный первичный иммунный ответ, на фоне ЛПС и анти-1еМ-сыворотки В отличие от Кон А, ЛПС и анти-^М-антитела взаимодействуют преимущественно с В-, а не Т-лимфоцитами. Поэтому совместное с ХГ внесение в культуру интактных спленоцитов данных агентов активирует прежде всего В-лимфоциты, а в случае с ЛПС - и макрофаги [Smith е.а., 1979; Klaus & Westphal, 1975].

6000 5000 4000

зооо 2000 1000

h г

ш

b

ОСпленоциты ЕЗСпленоциты без А-клеток1

Рис.13. СОВМЕСТНОЕ ВЛИЯНИЕ ХГ И ЛПС НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ СПЛЕНОЦИТОВ И СПЛЕНОЦИТОВ, ЛИШЕННЫХ А-КЛЕТОК, ФОРМИРУЮЩИХ АДОПТИВНЫЙ ПЕРВИЧНЫЙ ИММУННЫЙ

ОТВЕТ

По оси ординат: количество АОК/2 107 ЯСК селезенки. По оси абсцисс !. - Контроль; 2. - ХГ (ЮМЕ/мл);

3. - ХГ (50МЕ/мл); 4. - ЛПС. (50мкг/мл);

5. - ЛПС+ХГ (ЮМЕ/мл): 6. - ЛПС+ХГ (50МЕ/мл).

а - Р<0,002 по отношению к контролю;

Ь - Р<0,001 по отношению к контролю и группам №2, 3, 4;

с - Р<0,0| по отношению к контролю и группе №4;

■1 - Р<0,02 по отношению к группе №2.

В каждую экспериментальную макрокультуру вносились параллельно с ХГ(Ю или 50МЕ/мл) либо ЛПС в дозе 50 мкг/мл, либо моноклональные антитела против ^М мыши в митогенной для В-лимфоцитов дозе - 10 мкг/мл. В ряде экс-

периментов спленоциты подвергались предварительному освобождению от макрофагов путем их активной адгезии к стеклянной поверхности.

Как видно из рис. 13, часовая инкубация клеток селезенки с ЛПС не оказывает существенного влияния на процессы формирования АОК. В то же время отсутствие А-клеток в суспензии на фоне ЛПС приводит к более чем двукратному усилению выхода АОК. Этот факт предполагает конкуренцию во взаимоотношениях между акцептирующими ЛПС клетками селезенки. В полноценной культуре клеток селезенки ХГ выступает в качестве костимулирующего фактора, а в культуре, лишенной А-клеток - нивелирующего эффекты ЛПС агента.

Таким образом, ХГ, как и в случае с рИЛ2, в присутствие бактериального ЛПС кардинально меняет направленность свойственных ему эффектов, выступая как костимулирующий агент.

Для уточнения возможности гормональной модуляции активированных В-клеток селезенки, использовались моноклональные антитела, направленные против т^М. Внесение анти-1§М-антптел в культуру нефракционированных спле-ноцитов в 2,5 раза усиливает выход АОК (контроль - 1468,8; анти-1§М-антитела (10мкг/мл) - 3186,0). Присутствие в культуре спленоцитов ХГ не оказывает имму-номодулирующих эффектов (АОК/2-Ю7: 2990,0-3135,0). Создается впечатление, что поликлональная активация интактных В-лимфоцитов приводит их в состояние рефрактерности к иммуномодулирующей активности ХГ.

В заключение необходимо отметить, что направленность иммуномодули-руюших эффектов ХГ прямо зависит от исходной функциональной активности иммунокомпетентных клеток. Иммунопотенцирующий сигнал доминирует над иммунодепрессивными эффектами гормона, но в различной степени, что, по-видимому, связано со вкладом разных популяций спленоцитов в процесс формирования первичного иммунного ответа и механизма действия ХГ на конкретную популяцию клеток. Кроме того, для направленности гормонального эффекта большое значение имеет качество активационного сигнала.

ВЫВОДЫ:

1. Хорионическнй гонадотропин непосредственно угнетает процессы формирования первичного и вторичного иммунных ответов, а в фертильном организме самок иммуномодулирующее действие гормона реализуется опосредованно через половые стероиды яичников. Степень выраженности эффектов хо-рионического гонадотропина прямо зависит от длительности гормонального воздействия, дозы и этапа клеточной дифференцировки.

2. В динамике первичного иммунного ответа инъекции хорионического гонадотропина оварнэктомированным животным приводят к избирательной депрессии 1ёС-ЛОК, а в организме фертильных самок угнетают как так и 1сМ-АОК, что приводит к существенному нарушению процессов формирования вторичного иммунного ответа.

3. Инъекции хорионического гонадотропина оварнэктомированным животным в период после повторной иммунизации приводят к угнетению только ^О-ЛОК, усиливая их миграцию в костный мозг. В фертильном организме самостоятельные эффекты хорионического гонадотропина но перераспределению ^С-АОК нивелируются активностью эндогенных половых стероидных гормонов яичников.

4. В культуре интактных спленоцитов эстрад!юл и прогестерон в дозах, отражающих их уровень в период беременности у женщин, значительно активируют процессы формирования АОК. Иммуностимулирующее действие данных гормонов реализуется параллельно с активацией секреции сплсноцитами РОР:а-Хорионическнй гонадотропин, напротив, вдвое снижает способность клеток селезенки формировать АОК, однако его комбинации с одним из стероидных гормонов приводит к полной потере этой способности и одновременно лишает эс-традиол или прогестерон иммуностимулирующего действия.

5. Присутствие макрофагов в суспензии интактных спленоцитов является главным условием реализации гормон-зависимой иммунодепрессии. В отсутствие клеток этого типа низкая концентрация хорионического гонадотропина избирательно активирует процессы антигсннезависимой дифференцировки В-лимфоцитов, а высокая, обладая селективной депрессией Т-лимфоцигов, не в состоянии реализовать ее на уровне процессов, предшествующих формированию

АОК.

6. Молекулярные механизмы иммуносупрессивного эффекта низкой дозы хорионического гонадотропина реализуются только в присутствии А-клеток, заключаются в достоверном снижении уровня сАМР и прямо связаны с активностью циклооксигеназы. В то время как иммуностимулирующий эффект связан с активацией В-лимфоцитов, молекулярный механизм которого реализуется вторичными мессенджерами фосфоинозитидного обмена и низким уровнем сАМР.

7. Механизмы нммунодепрессивных эффектов высокой дозы хорионического гонадотропина реализуются на уровне двух клеточных популяций интакт-нон селезенки: А-клеток и Т-лимфоцитов. При взаимодействии с А-клетками гормон модулирует функцию потеициалнезависмых Са2+-капалов и, одновременно, снижает уровень внутриклеточного сАМР. При контакте с Т-лим-фоцитами хорионический гонадотропин угнетает их функциональную активность, повышая уровень внутриклеточного сАМР и секрецию PGF2a.

8. На фоне овариэктомии хорионический гонадотропин активирует процессы генерации спленоцитов-супрессоров, но препятствует реализации ими су-прессорного эффекта. У фертильных самок хорионический гонадотропин индуцирует к иммуномодулирующим действиям половые стероидные гормоны яичников, которые, нивелируя самостоятельные эффекты гонадотропина, оказывают прямо противоположное действие как на процессы генерации, так и процессы реализации спленоцитами-супрессорами своих эффектов.

9. При часовой инкубации in vitro хорионического гонадотропина со зрелыми клетками-супрессорами гормон угнетает их функциональную активность, взаимодействуя как с адгезивными клетками (ЮМЕ/мл), так и с Т-лимфоцитами (50МЕ/мл), рехшзуя свои эффекты у первых, через циклооксигеназу и потен-циалнезависимые Са2+-каналы, а у вторых - повышая уровень цитоплазматиче-ского сАМР с одновременным вовлечением вторичных мессенджеров фосфоинозитидного обмена.

10. Иммунотропное доминирование отдельного цитокина или хорионического гонадотропина определяется иммуностимулирующим эффектом, которым обладает то или иное соединение в конкретной экспериментальной модели. При культивировании интактных спленоцитов с хорионическим гонадотропином и

ИНФ-а или рИЛ2 иммуностимулирующий потенциал цигокинов, нивелируя самостоятельные иммунодспрессивные эффекты хорноннческого гонадотропина, использует молекулу гормона в качестве костимулирующего агента. В случае с рИЛ2 совместное гормонально-цитокнновое действие реализуется через потен-циалнезависимые Ca2'-каналы и вторичные мессенджеры полифосфатидилового цикла.

11. Направленность иммуномодулирующих эффектов хорионического гонадотропина прямо зависит от исходной активности иммунокомпетентных клеток. Сигнал к активации макрофагов, 'Г- или B-лимфоцитов доминирует над им-мунодепрессивными эффектами гормона, но лишь в той степени, в которой конкретная популяция клеток влияет на процессы формирования первичного иммунного ответа.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Кеворков H.H., Шилов Ю.И., Бахметьев Б.А., Ширшев C.B., Созинова Г.М. Гормональная модуляция функциональной активности иммунорегулятор-ных клеток II Нейро-гуморальная регуляция иммунного гомеостаза.: Тез. докл. IV Всесоюзн. симпозиума. -Л.,1986. -С.41-42.

2. Кеворков Н.Н, Шилов Ю.И., Созинова Г.М., Бахметьев Б.А., Ширшев C.B., Гуссв Е.Ю. ПСКК и претимические клетки-предшественники, их диффе-ренцировка в условиях гормональных воздействий // Кроветворные клетки-предшественники в механизмах повреждения и компенсации системы крови при действии на организм экстремальных факторов.: Тез. докл. симпозиума, Челябинск. -1986. -С.8.

3. Кеворков H.H., Ширшев C.B. Хориопический гонадотропин как модулятор клеточных взаимодействий в индукции первичного иммунного ответа // Пробл. эндокринологии. -1987. -Т.ЗЗ, №2. -С.60-62.

4. Шилов Ю.И., Кеворков H.H., Ширшев C.B. Основные гормоны репродукции в регуляции межклеточных коммуникаций, реализующих иммунный ответ // Иммунология репродукции.: Тез. докл. 3-го Всесоюзного симпозиума с международным участием, Киев. -1987. -С. 167-168.

5. Ширшев C.B., Кеворков H.H., Шарый Н.И. Влияние хорионического

гонадотропина на кооперативные взаимоотношения спленоцитов, реализующих первичный иммунный ответ//Бюл. эксперим. биологии и медицины. -1987. -Т.54, №9. -С.337-340.

6. Бахметьев Б.А., Ширшев C.B., Гусев Е.Ю. Статистический анализ дозо-вой зависимости иммуномодулирующего действия гормонов // Деи. в ВИНИТИ, Л'°8897-В87.

7. Кеворков H.H., Шилов Ю.И., Ширшев C.B. Основные гормоны репродукции как регуляторы межклеточных коммуникаций при гуморальном иммунном ответе // Регуляция иммунного ответа.: Сб. научи, тр. / Пермь: изд. ПГМИ, 1987. -С.3-16.

8. Ширшев C.B. Роль гормонов репродукции в регуляции антителообразо-вания II Регуляция иммунного ответа.: Сб. научн. тр. / Пермь: изд. ПГМИ, 1987. -С. 16-22.

9. Kevorkov N.N., Shirshev S.V. Chorionic gonadotropin as a modulator of cell interactions in the induction of primary immune response // Neurosci. Behav. Physiol. -1987. -V.I7, №5. -P.448-451.

10. Кеворков H.H., Ширшев C.B., Князев Ю.А. Роль хорионического гонадотропина в регуляции гуморального иммунного ответа II Пробл. эндокринологии. -1988. -Т.34, № 6. -С.79-83.

11. Ширшев C.B., Бахметьев Б.А. Комплексное иммунологическое исследование человеческого рекомбинантного интерлейкина-2 в системе in vivo II Первый всесоюзный иммунологический съезд. Москва, Сочи. -1989. -T.I. -С.404.

12. Ширшев C.B. Влияние хорионического гонадотропина на отдельные этапы иммуногенеза // Интерлейкины и другие медиаторы в клинической иммунологии. / Респ. сборник научн. тр. VI.: 2-й МОЛГМИ им. Н.И. Пирогова, 1989. -С. 116-120.

13. Kevorkov N.N., Shirshev S.V., Shilov Ju.I. Reproductive hormones as regulators of cell-to-cell interaction in humoral immune response // J. Reprod. Immunol. -Suppl. -1989. -P.297.

14. Ширшев C.B., Бахметьев Б.А. Комплексное исследование влияния ИЛ-2 на гемопоэз, иммунный ответ клеточного и гуморального типов в системе им ви-во / Ред. ж. Бюл. эксперим. биологии и медицины. -М., 1990. -13 с. -ДЕП. в ВИНИТИ 07.06.90, №3136-В90.

15. Ширшев C.B., Шилов Ю.И., Кеворков H.H. Гормоны репродукции в регуляции антигеннезависимой дифференцировки иммунокомпетентных клеток // Иммунология репродукции.: Тез. докл. 4-го Всесоюзного симпозиума с международным участием, Киев. -1990. - С.226-227.

16. Ширшев C.B., Кеворков H.H. Влияние хорионического гонадотропина на стволовые кроветворные клетки // Бюл. эксперим. биологии и медицины. -1990. -Т.59, №1. -С.62-65.

17. Ширшев C.B., Кеворков H.H. Способность эстрадиола замещать ко-роткодистантные медиаторы иммунных реакций - простагландины при формировании гуморального иммунного ответа // Взаимодействие нервной и иммунной систем.: Тез. докл. V Всесоюзн. симпоз., J1., Ростов-на-Дону. -1990. -С.44.

18. Ширшев C.B. Значение хорионического гонадотропина в регуляции антигеннезависимой дифференцировки иммунокомпетентных клеток селезенки // Бюл. эксперим. биологии и медицины. -1991, №2. -С.181-183.

19. Kevorkov N.N., Shilov Ju.I., Shirshev S.V. Major reproduction hormones as regulators of cell-to-cell interactions in humoral immune responses II Brain, Behav. Immunity. -1991. -V.5. -P. 149-161.

20. Ширшев C.B., Кеворков H.H. Репродуктивные гормоны белково-пептидной природы как регуляторы иммунных реакций // Успехи соврем, биологии. -1991. -Т. 111, №5. -С.683-697.

21. Ширшев C.B., Шилов Ю.И., Кеворков H.H. Половые стероиды яичников препятствуют реализации иммунодепрессивных эффектов хорионического гонадотропина II Тез. докл. II Всероссийского съезда эндокринологов, Челябинск. -1991. -С.45-46.

22. Ширшев C.B., Кеворков H.H. Механизмы транедукции гормонального сигнала при реализации иммуномодулирующих эффектов хорноническим гона-дотропином // Тез. докл. I съезда иммунологов России, Новосибирск. -1992. -С.559.

23. Ширшев C.B. Влияние хорионического гонадотропина на динамику первичного иммунного ответа II Бюл. эксперим. биологии и медицины. -1992. -Т.63, №6. -С.624-626.

24. Shirshev S.V. Chorionic gonadotropin costimulating effect on lymphokine-activated splenocytes. Transduction mechanisms //J. Reprod. Immunol. -1992. -Suppl.

-Р.495.

25. Ширшев С.В., Кеворков Н.Н. Зависимость иммуномодулирующих эффектов хорионического гонадотропнна от исходной функциональной активности спленоцитов, реализующих адоптивный иммунный ответ // Пробл. эндокринологии. -1993. -Т.39, №1. -С.54-57.

26. Ширшев С.В. Белки фетоплацентарного комплекса в регуляции иммунных реакций //Успехи соврем, биологии. -1993. -Т.113, №2. -С.230-246.

27. Ширшев С.В. Чувствительность нммунокомпетентных клеток к гормональному сигналу на фоне митогенного воздействия // Бюл. эксперим. биологии и медицины. -1993. -Т.65, №5. -С.497-499.

28. Ширшев С.В., Кеворков 11.11. Вторичные мессенджеры в реализации иммуномодулирующих эффектов хорионического гонадотропнна // Мол. биология. -1993. -Т.27, №3. -С.500-506.

29. Кеворков H.II., Шилов Ю.И., Ширшев С.В., Черешнев В.А. Гормоны репродукции в регуляции процессов иммунитета. -Екатеринбург.: УИФ "Наука", 1993. -172 с.

30. Ширшев С.В. Влияние хорионического гонадотропнна на формирование вторичного иммунного ответа // Бюл. эксперим. биологии и медицины. -1993. -Т.66, №10. -С.388-390.

31. Shirshev S.V. The immunocompetent cell sensitivity to hormonal signal on the background of mitogen activation // Abstr. 2nd International congress ISNIM. -Paestum (Salerno), Italy. -1993. -P. 199.

32. Ширшев С.В., Кеворков Н.Н. Костимулирующий эффект хорионического гонадотропнна на лимфокинактивированные спленоциты. Новый аспект иммуномодулирующего действия гормона беременности // Бюл. эксперим. биологии и медицины. -1993. -Т.66, №8. -С. 163-165.

33. Ширшев С.В. Влияние хорионического гонадотропнна па формирование вторичного иммунного ответа// Пробл. эндокринологии. -1993. -Т.39, №6. -С.41-43.

34. Shirshev S.V., Kevorkov N.N. Role of chorionic gonadotropin in regulation of mitogen-and lymphokine-activated splenocytes: Immunotherapeutic aspect in infection // International Symposium on Immunotherapy of Infections. -[Abstr.]. Berlin, Germany. (May 4-7), 1993. -P.471.

35. Shirshev S.V., Kevorkov N.N. Secondary messengers in the immunomodulating effects of chorionic gonadotropin // Molecular Biology. -1993. -У.27, №3, Part 1. -P.296-300.

36. Shirshev S.V. Chorionic gonadotropin effect on functional activity of T-lymphocytes suppressors // 2nd International Forum of Reproductive Immunology. -[Abstr.], Magdeburg, Germany. (June 14-18), 1993. -P.38.

37. Ширшев С.В. Цитокины плаценты в регуляции иммуноэндокринных процессов при беременности // Успехи соврем, биологии. -1994. -Т.114, №2. -С.223-240.

38. Ширшев С.В., Шилов Ю.И., Кеворков Н.Н. Влияние женских половых стероидов на способность силеноцитов формировать адоптивный иммунный ответ. Роль простагландина в механизмах гормональной иммунорегуляции // Пробл. эндокринологии. -1994. -Т.40, №3. -С.47-49.

39. Ширшев С.В. Механизмы совместного влияния хорионического гона-дотропина и рекомбинантного интерлейкина 2 на спленоциты при формировании гуморального иммунного ответа // Цитология. -1994. -Т.36, №5. -С.459-464.

40. Shirshev S.V., Shilov Ju.I. Influence of estradiol and progesterone on adoptive immune response and production of prostaglandin Fia by splenic cells // Abstr. 12th European Immunology Meeting, Barcelona. -1994. -P.314.

41. Shirshev S.V., Kevorkov N.N. Role of chorionic gonadotropin in regulation of mitogen-and lymphokine-activated splenocytes: Immunotherapeutic aspect in infection // Immunotherapy of infections / Ed. K. N. Masihi, New York, Basel, Hong Kong.-1994. - P.471-478.

42. Ширшев С.В. Роль гормонально-цитокиновых взаимодействий в формировании гуморального иммунного ответа II Пробл. эндокринологии. -1995. -Т.41, №1. -С.32-34.

43. Ширшев С.В., Шилов Ю.И., Кеворков Н.Н. Изменения продукции простагландина Fia под действием эстрадиола и прогестерона как возможный механизм их иммунорегуляторного действия // Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях.: Тез. докл. XII Российской научной конференции, Челябинск. -1995. -С.120-121.

44. Shirshev S.V. Influence of chorionic gonadotropin on splenic suppressor cell

functional activity. Possible mechanisms of the hormonal signal transduction // Abstr. International co-conferences on Enviromental Pollution (ICEP'95) and Neuroimmuno Interactions and Environment (ICONE'95), St. Petersburg, Russia. -1995. -P. 172.

45. Kevorkov N.N., Shirshev S.V. Chorionic gonadotropin - humoral immune response modulator // Abstr. International co-conferences on Enviromental Pollution (ICEP'95) and Neuroimmuno Interactions and Environment (ICONE'95), St. Petersburg, Russia. -1995. -P. 129.

46. Ширшев C.B., Шилов Ю.И., Кеворков H.H. Значение репродуктивных гормонов в регуляции продукции простагландина F2a иммунокомпетентными клетками // Бюл. эксперим. биологии и медицины. -1995. -№8. -С. 178-180.

47. Shirshev S.V. Mechanisms of IL2-depending activation by chorionic gonadotropin of antibody-forming cells, possible role at pregnancy, complicated by HIV // First international symposium on HIV and cytokines. [Abstr.], Reims, France (March 15-17), 1995. -P.372.

48. Shirshev S.V. Mechanisms of chorionic gonadotropin transduction at humoral reactions modulation, possible role in reproductive tract // 8th International Congress of Mucosal Immunology. [Abstr.], San Diego, California, USA (July 16-20), 1995. -P.565.

49. Ширшев C.B. Влияние препарата хорионического гонадотропина в регуляции функциональной активности антигеноспецифичных Т-лимфоцитов-супрессоров // Пробл. эндокринологии. -1995. -Т.41, №5. -С.31-33.

50. Ширшев С.В. Механизмы действия хорионического гонадотропина на спленоциты, реализующие супрессию гуморального иммунного ответа // Биохимия. -1995. -Т.60, №11. -С.1765-1774.

Благодарности.

Выражаю искренгаою благодарность за неоценимые услуги и содействие в работе научным консультантам: доктору медицинских наук, профессору Н.Н. Кеворкову, доктору медицинских наук, члену-корреспонденту РАН, профессору В.А. Черешневу, а также старшим научным сотрудникам Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН Ю.И. Шилову, М.Б. Раеву и Б.А. Бахметьеву.