Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Биологическая активность синтетического пептида - фрагмента бета-субъединицы хорионического гонадотропина человека

Р г 5 ОД

1 О !»■- <11ПГ

На правах рукописи

палуиских Аппа Николаевна

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ СИНТЕТИЧЕСКОГО ПЕПТИДА -ФРАГМЕНТА р-СУБЪЕДИНИЦЫ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА ЧЕЛОВЕКА

14.00.36 — аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических паук

МОСКВА - 1996

Работа выполнена

на кафедре клеточной физиологии и иммунологии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

доктор медицинских наук, профессор

И.Г. Харитоненков

А.В. Пронин

С.Б. Першин

Ведущая организация:

Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

Защита состоится 1996 г.

в -~>у часов на заседании Диссертационного Совета К 001.07.01 в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан '

1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор медицинских наук

Е.И. Коптелова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ: Проблема структурно-функциональной организации молекулы хорионического гонадотропина (ХГ) продолжает привлекать к себе внимание исследователей вследствие ее большого теоретического и практического значения.

Известно, что хорионический гонадотропин выполняет в организме ряд функций. Для мно1 их полифункциональных молекул показано шш предполагается наличие нескольких участков, каждый из которых опосредует определенный вид биологической активности, присущий целой молекуле. Данные по изучению функционально значимых участков в молекуле ХГ являются неполными, поэтому проблема поиска таких участков остается актуальной.

Структурно-функциональные исследования молекулы хорионического гонадотропина могут способствовать созданию новых молекул, обладающих более узким спектром биологической активности, чем ХГ, и являющихся потенциальными препаратами для клинического использования. С этой целью применяются различиые методы, такие как конструирование гибридных молекул, направленный мутагенез, протеолитическая фрагментация или химическая модификация молекулы. Одним из подходов к решению подобных задач является использование синтетических пептидных фрагментов молекулы хорионического гонадотропина.

Цель исследования: выявить биологическое действие синтетического пептида — фрагмента р-субъединицы хорионического гонадотропина человека со 128 по 145 аминокислотный остаток ("СТР") и сравнить активность данного пептида с активностью нативной молекулы ХГ в тестах in vitro.

Задачи исследования включали в себя: 1) Выявить биологическое действие пептида "СТР" в сравнении с ХГЧ: а) на пролиферацию монопуклеарных клеток периферической кропи человека, индуцированную поликлональным активатором; б) на пролиферацию клеток промиелоидной линии HL-60; в) на пролиферацию клеток карциномы яичника человека CaOv. 2) Изучить рецепцию пептида "СТР" и ХГЧ различными популяциями клеток периферической крови человека, а также клетками линий HL-60 и CaOv; определить параметры связывания. 3) Выяснить, взаимодействуют ли пептид "СТР" и ХГЧ с общими рецепторными структурами на поверхности клеток линии HL-60.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ. В результате проведенных диссертантом исследований впервые была обнаружена способность синтетического пептида, фрагмента р-субъединицы хориошмеского гонадотропина человека ("СТР"), подавлять пролиферацию мононуклеарных

клеток периферической крови, индуцированную поликтюнальным активатором.

Хорионический гонадотропин человека и его синтетический пептидный фрагмент специфически взаимодействуют с рецегггорными структурами на поверхности моноцитов периферической крови, но не Т-лимфоцитов. Таким образом, впервые показано, что антипролиферативное действие ХГЧ и пептида "СТР" опосредуется моноцитами.

Впервые была выявлена антнпролпфератшшая активность ХГЧ и синтетического пептида "СТР" в экспериментальной модели клеточных линий различного происхождения. Обнаружена способность ХГЧ и "СТР" специфически связываться со структурами на мембране клеток промиелоидной линии НЬ-60. Впервые было показано, что пептид "СТР" и ХГЧ конкурируют за общие участки связывания на поверхности клеток линии НЬ-60.

Было впервые обнаружено, что на мембране клеток карциномы яичника человека СаСК находятся два типа структур, взаимодействующих с ХГЧ с разной аффинностью. Показано, что пептид "СТР" также взаимодействует с клетками линии СаОу.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Полученные результаты позволяют заключить, что синтетический пептид "СТР" является активным участком молекулы хорионнческого гонадотропина человека. Полученные результаты также свидетельствуют о том, чго антипролиферативное действие ХГЧ и пептида "СТР" на мононуклеарные клетки периферической крови опосредуется моноцитами.

Дальнейшее изучение биологической активности синтетического фрагмента р-субъединицы ХГЧ необходимо не только для исследования механизмов действия молекулы хорионнческого гонадотропина, но и для возможной разработки ..селективных иммунорегуляторных препаратов для клинического применения, а также для изучения молекулярных механизмов регуляции активности различных категорий иммунокомпетентньтх клеток.

АПРОБАЦИЯ. Материалы диссертации апробированы на 9-ом Международном иммунологическом конгрессе (23-29 июля 1995, Сан-Франциско) и на 23-ей конференции Федерации европейских биохимических обществ (13-18 августа 1995, Базель).

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Материалы диссертации изложены на 110 страницах машинописного текста (включая 12 рисунков), состоят из разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", "Выводы", "Список цитируемой литературы" (200 источников).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ МАТЕРИАЛЫ

Пептид-фрагмент С-концевой части р-субъединицы молекулы хорионического гонадотропнна человека, а также его аналог, содержащий на N-конце дополнительный аминокислотный остаток тирозина, были синтезированы научным сотрудником Института биоорганической химии им. Шемякина и Овчинникова Макаровым Е.В. Аминокислотная последовательность исследуемого пептида представлена в таблице 1.

В работе был использован хорионический гонадотропнн производства фирмы Serono (Италия).

В работе использовали радиоактнвномеченные реактивы: 3Н-тимидин фирмы Amersham (Англия) и Na125I, полученный из НЦ ГИПХ (Санкт-Петербург).

Также использовались моноклинальные антитела против CD16 и CD3, коньюгированные с флуоресцеинизотиацианатом, производства фирмы Bectoil Dickinson (США).

Остальные реактивы были получены от фирм Sigma (США), Difco (США), Pharmacia (Швеция) и Serva (ФРГ).

Клеточная линия CaOv была любезно предоставлена д.б.н. А.Н. Наровлянским (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи). Клеточная линия HL-60 била любезно предоставлена к.б.н. Копанцевым Е. (институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН).

Таблица 1

Последовательность аминокислот синтетического пептида — фрагмента р-субъединицы хориошгческого гонадотропнна человека в однобуквенном коде (в скобках —номер аминокислотного остатка)

(128)L-P-S-P-S-R-L-P-G-P-S-D-T-P-I-L-P-Q(145)

МЕТОДЫ

Выделение клеток из периферической крови здоровых доноров. В

проводимых экспериментах использовали популяции мононуклеарных клеток, моноцитов и Т-лимфошггов. Мононуклеарные клетки выделяли центрифугированием в градиенте фиколла-верографина по методу Воуит

[Boyum, 1968|. Популяцию моноцитов, содержавшую не менее 90% С016-полсжительных клеток, выделяли из фракции мононуклеарных клеток сорбцией на чашках Петри. После удаления из фракции мононуклеарных клеток моноцитов удаляли В-лимфощпы адгезией на нейлоновой вате и получали популяцию, обогащенную Т-лимфоцитами [Erdei et.al., 1986], содержавшую не менее 92% СОЗ-положительных клеток.

Для определения количества клеток: несущих маркеры CD16 и CD3, клетки окрашивали антителами против CD16 или CD3, коньюгированными с флуоресцеинизотиоцианатом, как описано [Walil et.al., 19841. Далее подсчет клеток' проводили на проточном цитофлуориметре FACS-I производства фирмы Becton Dickinson (США).

Условия культивирования клеток. Для культивирования клеток везде, если не указано иначе, использовали среду RPMI 1640, содержащую 5% инактивированной СПК, 100 мМ L-глутамина и 50 мкг/мл гентамищша. Культивирование клеток проводили при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2.

Реакция б.шсттрапсформации. Реакцию бласттрансформации проводили микрометодом в 96-ти луночных планшетах для культивирования клеток в объеме 200 мкл как описано [Erdei et.al., 1986], причем число повторностей в каждом опыте было не менее трех.

Суспензии мононуклеарных клеток (I06 клеток/мл) инкубировали в среде, содержащей поликлональный активатор (конканавалин А — 2 мкг/мл) и пептиды "СТР" (1x10"5 М), "тирозил-СТР" (Ы0"5 М) или хорионическнй гонадотропин человека (ЗхЮ"8 М) в течение 75 часов.

Пролиферативный ответ лимфоцитов оценивали по включению в ДНК радиоктивномеченного предшественника 3Н-тимидина. В последние 15 часов культивирования в лунки планшетов с культивируемыми клетками вносили 3Н-тимидин (0.5 цО/лунку). Затем клетки переносили фильтрацией на стекловолоконные фильтры GF-C (Watnian,CIiIA), фильтры промывали, удаляя несвязанную радиоактивность, и измеряли инкорпорированную в ДНК радиоактивную метку с использованием жидкостного сцинтилляшюнного счетчика RAC-BETA (LKB-WALLAC, Финляндия). В качестве контроля использовали нестимулированные поликлональными активаторами клетки и стимулированные, но не обработанные "СТР", "тирозил-СТР" или ХГЧ.

При исследовании зависимости пролиферативного ответа лимфоцитов от концентрации веществ использовали концентрации "СТР" от 1хЮ"4 М до 1,6х10"6 М, ХГЧ - от 2,5хЮ"7 М до 3,7х10"9 М.

Определение . пролиферативной активности клеток. Клетки линий HL-60 и CaOv (2х104 клеток/лунку) культивировали в присутствии

о

хорионического гонадотропина человека (3x10" М) или синтетических пептидов "СТР" или "тирозил-СТР" (1x10"5 М) в 24-луночных планшетах в объеме 1 мл 72 часа, пролиферативный ответ оценивали по включению в ДНК

радиоактивномеченного предшественника Н-тимидина. В последние 4 часа культивирования в лунки планшетов с культивируемыми клетками вносили 3Н-тимидин (1,0 uCi/лунку). Затем клетки переносили фильтрацией на стекловолоконные фильтры GF-C (Whatman), фильтры промывали и измеряли инкорпорированную в ДНК радиоактивную метку с использованием жидкостного сцинтилляционного счетчика.

В качестве контроля использовали клетки, культивировавшиеся в среде бе? синтетических пептидов или ХГЧ.

Иодирование ХГЧ и пептида "тироз№1-СТР". 7 мкг пептида "шрозил-СТР" или 5 мкг хорионического гонадотропина инкубировали с Na125! (80 МБк)

в присутствии иодогена как описано [Salasinski et.al., 1981 J. При этом 12"1 присоединяется к ароматическому кольцу остатков тирозина.

Меченные пептид и ХГЧ отделяли от непрореагировавшего Na'25I гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-1S. Удельная активность меченного пептида "тирозил-СТР" — 2,3*101S cpm/моль, хорионического гонадотропина —

1,7хЮ20 cpm/моль.

Связывание иодированных ХГЧ и пептида "тирозил-СТР" с метками.

Мононуклеарные клетки, монониты, Т-лимфоциты (2х106 на точку) или клетки опухолевых линий (1 х 106 на точку) инкубировали с |251-"тирозил-СТР" (концентрации от 1,2х 10"7 до 4,7x10"'° М) или с '"1-ХГЧ (кониентрашш от ЬЮ"8 до 1х10"!3 М) в объеме 100 мкл 1 час при

4°С в фосфатносолевом

буфере, содержащем 0,02% азида натрия и 1% бычьего сывороточного альбумина. После инкубации клетки центрифугировали в градиенте 10?с-ной сахарозы и измеряли ассоциированную с клетками радиоактивность на 7-счетчике (LKB, Швеция) |Langer and Pestka, 1986].

По графику зависимости отношения концентраций свободного пептида к связавшемуся с клетками (B/F) от концентрации связавшегося пептида (В), экстраполируя прямые на ось абсцисс, определяли число участков связывания на клетку:

N=n/k, где п—В при B/F-0, а к — количество клеток на точку. Константу диссоциации определяли по формуле: Kd=-F (n-B)/B [Rashidbaigi et.al., 1986]. Неспецифическое связывание вычитали как описано [Munson, 1983].

В экспериментах по конкурентному связыванию клетки инкубировали с постоянной концентрацией иодированного пептида (4х10"9 М) в присутствии различных концентраций немеченных веществ.

Обработка клеток трипсином. Клетки HL-60 (2х106/мл) инкубировали в среде RPM1 1640, которая содержала 5 мкг/мл трипсина, 30 мин на водяной бане при

37°С. Клетки периодически перемешивали. Затем блокировали действие трипсина добавлением 5% СПК и 2 раза осаждали клетки центрифугированием с последующим ресуспендированием в свежей порции

среды 199. После этого клетки использовали для эксперимента по связыванию радиоактивномеченных ХГЧ и "тирозил-СТР".

Обработка экспериментальных данных. Для оценки достоверности различий средних величин применяли t-критерий Стьюдента. Обработку экспериментальных данных осуществляли, используя пакеты программ QUATTRO PRO (Borland International Corp.) и HARYVARD GRAPHICS (Software Publishing Corp.). Проводилось не менее трех независимых экспериментов по каждой методике, причем количество параллельных измерений в каждой экспериментальной точке было не менее двух. Обработку результатов по связыванию радиоактивномеченного лиганда проводили с использованием программы SCATCHARD, разработанной аспирантом каф. АЭТУС Московского Энергетического института Валуйских С.Ф. Для определения Kd и числа участков связывания на клетку применялся корреляционный анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Целью настоящей работы являлось выявление биологического действия синтетического пептидного фрагмента ß-субъединицы ХГЧ и сравнение активности данного пептида с активностью нативной молекулы ХГЧ в тестах in vitro.

Для этого был синтезирован пептид, представляющий фрагмент аминокислотной последовательности С-концевой части ß-субъедишшы ХГЧ со 128 по 145 аминокислотный остаток ("СТР").

В проводимых экспериментах использовались популяции мононуклеарньгх клеток, моноцитов и Т-лимфоцигов, которые выделяли из периферической крови человека как описано [Boyum, 1968].

Первой моделью для изучения биологического действии "СТР" и ХГЧ послужила реакция бласттрансформации лимфоцитов периферической крови человека, стимулированных поликлональным активатором.

Было обнаружено, что ХГЧ (3xlO~8 М) и СТР (3*10~5 М) ингпбирукп пролиферативныи ответ лимфоцитов, индуцированный конканавалином А, на 45% и 42% соответственно (рис. 1А). Приведенные значения являются средними для выборки из 12 доноров. Прямого цитотоксического действия ХГЧ и пептидов на клетки в течение времени проведения экспсрголснтоп (75 часов) выявлено не было.

Была изучена зависимость пролиферативною ответ лимфошпов от концентрации ХГЧ и "СТР". На рис. 2 по оси абсцисс отложены концентрации ХГЧ или "СТР" в молях, по оси оринат — количество включенной метки в имп/мкп. Действие ХГЧ и "СТР" носит дозозависимый характер. 50%-ное ингибирование пролиферации лимфоцитов достигалось при концентрации ХГЧ 4х10"8 M и "СТР" - 5х10"5 М.

120 100

I 80

5.

о

* 60 н

40 20

А. Влияние ХГЧ, "СТР" и "тирозил-СТР" на пролиферацию моноиуклеарных клеток человека в присутствии конканавалина А

контроль

КонА

ХГЧ (3x10 я

М)

"СТР" (10'5 М)

"тирозил-СТР" (Ю-5 М)

Б. Влияние ХГЧ, "СТР" и "тирозил-СТР" на пролиферацию моноиуклеарных клеток человека, обедненных моноцитами, в присутствии конканавалина А

120

100 80 60 -40 20 О

контроль КонА

ХГЧ

"СТР"

-5

"тирозил-СТР"

(3x10"8 М) (10-5М) (Ю^М)

РИС. 1

8

7 -j б

5-1

i 4-1

2 -I

1 О

ХГЧ и "СТР" дозозависимо ингибируют пролиферацию моноиуклеарных клеток человека в присутствии конканавалина А

8-

Ч

\

1

Ч

10-

-1-1-1—I I I I I I--1-1-1 I I I I I !-1-1-1—II I I I I

V 8 л п 7 О "6

Ю-8 10'

концентрация ХГЧ (М)

1 - пролиферация в отсутствие ХГЧ

2 - пролиферация в отсутствие ХГЧ и КонА

7 6-

i

I5i I 4-1

у

н 3 2 1-

10

Т-1—I I I I I Л-1-1—I I I I III-1-1—I I I I I II--|-1 1 I I I

-7 Ю-6 ю-5 ю-4

концентрация "СТР" (М)

1 - пролиферация в отсутствие "СТР"

2 - пролиферация в отсутствие "СТР" и КонА

9

РИГ 2

120 100

I 80

X га

й 60 и

«£ 40 20 0

Вытеснение пептида 1251 - "тирозил-СТР", связанного с мембранными рецепторами, немеченными пептидами "СТР" и "тирозил-СТР*

120 100

!

1 1 ШИП ......... 'III 1'.И 1 1 1 1 П » ' 1 1 И"» 1 .....

Ш-Ю 10-9 10-8 ш-7 10-6 10-5 10-4

концентрация немеченного "СТР" (М)

§ 80 X

ГЗ

1 60 п; ш и

40 20 0

"II: III I ЩИ_ I | |

I НИШ 11111

ш-10 ш-9 ш-8 ш-7 Ш-6 1()-5 Ш-4

концентрация немеченного "тирозил-СТР" (М)

РИС. 3

Связывание |251-ХГЧ с моноцитами периферической крови человека

\ \

\ \ \ \ \

* \ 'X *

О 5 10 15 20 25 30 35

В (М) х 1012

Константа диссоциации: 6,9 х 10~9 М Участков связывания на клетку: 1700

Количество клеток

в каждой экспериментальной точке: 1x10

Связывание 1251-"тирозил-СТР"

с моноцитами периферической крови человека

Б (М) х Ю"11 Константа диссоциации: 9 х 10'9 М

Участков связывания на клетку: 1680

Количество клеток

в каждой экспериментальной точке: 1x10

РИС. 4

Результаты, полученные при изучении антипролиферативной активности ХГЧ, согласуются с данными литературы. Так, например, Ricketts and Jones сообщают о 50%-ном подавлении пролиферативного ответа лимфоцитов, стимулированных митогеном, при обработке ХГЧ в концентрации от 2х10"8 М до

п

1x10-' М для разных доноров (Ricketts and Jones, 1985]. Сравнить данные, полученные при исследовании антипролиферативного действия "СТР", с результатами других авторов не представляется возможным, поскольку в литературе отсутствуют сообщения о проявлении антипролиферативной активности какими-либо фрагментами С-концевой области ß-субъединицы ХГЧ.

Известно, что использовавшаяся в данном тесте популяция моноиуклеарных клеток содержит около 70% Т-лимфоцитов, 20% В-лимфоцитов и 5-10% моноцитов. В том случае, когда для реакции бластгрансформации использовалась популяция мононуклеарных клеток, обедненная моноцитами, антипролиферативное действие ХГЧ и "СТР" было менее выраженным (рис 1Б). Это давало основания предположить, что антипролиферативное действие ХГЧ и пептида "СТР" опосредуется моноцитами.

Следующим этапом работы было выявление специфического взаимодействия и определение параметров связывания пептида "СТР" и ХГЧ с клетками различных субпопуляций периферической кропи человека. Для этой цели использовался радиолнгандныи метод. Введение радиоактивного изотопа 1251 в молекулу пептида в присутствии иодогена происходит в ароматическое кольцо остатков тирозина [Salasinski et.a!., 1981|. Поскольку пептид "СТР" не содержит тирозина, был синтезирован пептид-аналог, отличающийся от "СТР" только по содержанию на N-конце дополнительного остатка тирозина. Хорионический гонадотропин и пептид "тирозил-СТР" были помечены радиоактивным изотопом по остаткам тирозина. Следует отметить, что

пептид "тирозил-СТР" так же, как и "СТР", обладал антипролифератнвным действием (рис. 1), а эксперименты по конкурентному связыванию показали, что "СТР" и "тирозил-СТР" конкурируют за общие рецепюрные структуры на клеточной мембране (рис. 3). Таким образом, введение дополнительного аминокислотного остатка не повлияло на биологическую активность изучаемого пептида в выбранных молельных системах.

Для определения параметров связывания клетки инкубирован) в присутствии различных концентраций меченного лиганда, затем центрифугированием в градиенте сахарозы удаляли несвязавшиися лшанд и измеряли ассоциированную с клетками радиоактивность. Полученные данные обрабатывали по Скетчарду. Неспецифическое связывание определяли как описано IMuiison, 1983J.

На Т-лимфоцитач не было обнаружено специфических участков связывания ни для ХГЧ, ни для пептида "тирозил-СТР". В то же время наблюдалось специфическое взаимодействие хорионнческого гонадотропина и пептида "тирозил-СТР" с моноцитами (рис. 4). Были определены параметры

■-- Влияние ХГЧ и "СТР" на пролиферацию клеток линии НЬ-60

РИС. 5

Связывание 1251-ХГЧ с клетками линии НЬ-60

о 3 \

X >

и_ > 4-ш VI

3 \ \

2 \ \

1- \ \ \

О 5 10 15 20 25 30

В (М) х 10"11

Константа диссоциации: 1,4 х 10~9 М Участков связывания на метку: 4800

Количество к.и'ток < ■: в каждой эксперимента:ыюи точке: 2,5хЮ''

Связывание 1251-"тирозил-СТР" с клетками линии НЬ-60

РИС. 6

8 10 12 В (М) х 1011

Константа диссоциации: 1,6 х 10 Л} М Участков связывания на клетку: 5000 Количество меток -' ' .

в каждой экспериментальной точке: 0,6х10ь

Связывание 1251-ХГЧ с клетками линии НЬ-60

ю

гч

о

ж

и_ 8

\ со

6

4

2

0 2 4 6 8 10 12 14 16

В (М) х 10~11

1 - клетки не обработаны трипсином

2 - клетки обработаны трипсином

? 1

1 Ь \ ч ------ 1

2

т

Связывание 1251-"тирозшт-СТР" с клетками линии НЬ-60

6

го

о *5

и_

\

ш

4

3

2

1

0 12 3 4

В (М) х Ю"10

1 - метки не обработаны трипсином

2 - клетки обработаны трипсином

РИС. 7

Вытеснение пептида 1231-"тирозил-СТР", связанного с мембранными рецепторами, хорионическим гонадотропином человека

концентрация немеченного ХГЧ (М)

РИС. 8

связывания: для ХГЧ Kd = (6,3±l,5)xlO"9 М, участков связывания на клетку — 1600±170; для пептида "тирозил-СТР" Kd - (1±0,3)х10"8 М, участков связывания на клетку — 1700±400. Следует отметить, что значения констант диссоциации для ХГЧ и "тирозил-СТР" близки.

Полученные результаты подтверждают гипотезу о том, что антипролиферативное действие ХГЧ и "СТР" опосредуется моноцитами. Поэтому для дальнейшего изучения биологического действия ХГЧ и пептида "СТР" была использована промиелоиднаи клеточная линии HI -60.

На рис. 5 показано действие хорионического гонадотропина и пептида "СТР" на пролиферацию клеток линии HL-60. Как видно, ХГЧ (ЗхЮ"8 М) и "СТР" (Зх КГ"5 М) угнетают пролиферацию на 48?е и 43% соответственно.

Радиолигандным методом было показано, что хорионический гонадотропин и пептид "тирозил-СТР" специфически взаимодействуют со структурами на поверхности клеток HL-60. На рис. 6 представлены результаты этих взаимодействий в координатах Скетчарда. Для ХГЧ Kd = (1,5±0,2)х10"<) М, число участков связывании на клетку — 5000*720. Для "тирозил-СТР" Kd — (1,9±0,4)х10"9 М, число участков связывания на клетку — 4600±540. Мы видим, что параметры связывания ХГЧ и "тирозил-СТР" близки между собой и в то же время сопоставимы с величинами, характеризующими взаимодействия этих веществ с моноцитами периферической крови.

Для выяснения природы структур, связывающих хорионический гонадотропин и пептид "тирозил-СТР", клетки обрабатывали протеолитическим ферментом трипсином. На рис. 7 показаны графики в координатах Скетчарда, отражающие взаимодействие ХГЧ и пептида с клетками HL-60 до и после обработки трипсином. Видно, что в обоих случаях после обработки трипсином полностью исчезает та часть графика, которая отражает специфическое взаимодействие, остается только прямая, параллельная оси абсцисс, для которой нельзя вычислить ни Kd, ни число участков связывашш. Следовательно, рецепторы для ХГЧ и для пептида "тирозил-СТР" являются чувствительными к трипсину.

Были проведены эксперименты по конкурентному связыванию пептида "тирозил-СТР" и хорионического гонадотропина с клетками линии HL-60. Было обнаружено, что хорионический гонадотропин вытеснял радиоактивномеченный пептид "тирозил-СТР" со специфических рецепторов (рис. 8). Эти результаты говорят о том, что ХГЧ и синтетический пептид "тирозил-СТР" конкурируют за общие участки связывания.

В настоящее время в литературе имеются данные но взаимодействию хорионического гонадотропина с фолликулярными клетками яичника. Показано, что константа диссоциации для такого взаимодействия — 4x10"" М [Azhar and Menon, 1976]. Эта вели'шна значительно отличается от полученных нами параметров связывания ХГЧ как с моноцитами, так и с клетками линии

Влияние ХГЧ и "СТР" на пролиферацию клеток линии CaOv

РИС. 9

Связывание 1251-ХГЧ с клетками линии СаОу

Связывание 1251-"тирозил-СТР" с клетками линии СаОу

30

10 12 14 В (М) X Ю-12

Константы диссоциации: К(1 { = 6,7 х 10 9М;

К(12 =3,6х10-иМ Участков связывания на метку: N \ = 1260;

Количество клеток

N2 = 210

о

V—

X и_ \ со

20-

151

10

\ * \

\ \

\

\

\

\

\ \

\ \

*

\ \

* \ \ \

\*

\

\

\

\

\

5

I-10

15 20

25 30 35 В (М) х 10 12 Константа диссоциации: 7,2 х 10 е* М Участков связывания на метку: 1600

Количество клеток

в каждой экспериментальной точке: 1x10

в каждой экспериментальной точке: 1x10

РИС. 10

5

0

НЬ-60. В связи с этим представлялось целесообразным исследовать взаимодействие изучаемого пептида в сравнении с ХГЧ с рецепторными структурами на клетках яичника. С этой целью была взята опухолевая клеточная линия СаОу, представляющая собой карциному яичника человека.

А нт 1 ш ро.тпфе рати в н о е действие хориошгческого гонадотроппна и пептида "СТР" на клетки линии СаО показано на рис. 9. Мы видим, что : ХГЧ (ЗхЮ"8 М) и "СТР" (ЗхЮ"5 М) подавляют пролиферацию на 62% и 52% соответственно.

На рис. 10 в координатах Скетчарда представлено взаимодействие радиоактивномеченных хорионического гонадотроппна и пептида "тирозил-СТР" с клетками СаО\\ Видно, что в случае ХГЧ гра(|)ик имеет два линейных участка, что соответствует двум типам связывающих структур, обладающих различным сродством к лиганду. Следует отметить, что в литературе нами не обнаружено данных о наличии на клетках гонад двух типов рецепторов для ХГЧ с разной специфичностью. Для высокоаффинных участков связывания Кс1 — (3±1)х!0"" М, число их на клетку — 200+32, что вполне соответствует литературным данным о взаимодействии ХГЧ с рецептором. В то же время очевидно, что параметры связывания ХГЧ с. низкоаффинными участками связывания (К(1 — (7±0,9)»Ш"5 М и число участков связывания на клетку — 1200+110) практически одинаковы с параметрами связывания для пептида "тирозил-СТР" (Кс1 — (7±0,5)х 10"9 М. число участков связывания на клетку — 1700±140).

Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что исследуемый пептид — фрагмент С-концевой области р-субъедишшы хорионического гонадотроппна взаимодействует с низкоаффинным участком связывания нативной молекулы ХГ, хотя для подтверждения этой гипотезы требуются дополнительные эксперименты.

ВЫВОДЫ

1. Синтетический пептид — фрагмент аминокислотной " последовательности р-субъедишшы молекулы хорионического гонадотроппна человека со 128 по 145 аминокислоту ("СТР") подавляет пролиферацию мононуклеарных клеток периферической крови человека, индуцированную конканавалином А.

2. ХГЧ и синтетический пептид "тирозил-СТР" специфически взаимодействуют с рецепторными структурами на мембране моноцигов периферттческои крови человека. Параметры связывания для ХГЧ: ■ Кс1 = (6,3+1,5)х10"9 М, 1600±170 участков связывания на клетку; для "тирозил-С1 Р": К.с1 = (1±0,3)хШ" М, 1700+400 участков связывания на клетку.

3. ХГЧ и синтетический пептид "СТР" подавляют пролиферацию клеток промиелоидной линии НЬ-60 и карциномы яичника человека СаО.

4. Хорионический гонадотропин человека и синтетический пептид "тирозил-СТР" специфически взаимодействуют с рецепторными структурами на поверхности клеток HL-60. Параметры связывания для ХГЧ: Kd = (1,5±0,2)х10~9 М, 5000+720 участков связывания на клетку; для "тирозил-СТР": Kd — (1,9+0,4)* КГ9 М, 4600±540 участков связывания на клетку. Структуры, специфически связывающие ХГЧ и "тирозил-СТР", являются чувствительными к трипсину.

5. Хорионический гонадотропин человека вытесняет синтетический пептид "тирозил-СТР" со специфических участков связывания на мембране клеток HL-60.

6. Хорионический гонадотропин человека и синтетический пептид "тирозил-СТР" специфически взаимодействуют с рецепторнылш структурами на поверхности клеток CaOv. Параметры связывания для ХГЧ: Kdi = (7±0,9)х10 9 М, Kd2 = (3±I )хЮ~" М, число участков связывания на клетку - 1200+110 и 200+32 соответственно; для "СТР": Kd = (7±0,5)х10"9 М, 1700+140 участков связывания на клетку.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. О. Targoni, A. Karulin, A. Danilkovich, К. Freze, A. ValujskiKh, J. Romashkova, N. Makarova and A. Kushch. Antiproliferative effect of synthetic peptides on human lymphoid cell lines. Abstr.4th European Congress of Cell Biology, Prague, 26 June—1 July 1994.

2. K. Frese, A. Danilkovich, A. Valujskikh, J. Romashkova, Eu. Makarov. Synthetic fragment of human chorionic gonadotropin affects proliferation of human blood lymphocytes. Abstr. 9-th International Congress of Immunology, San Francisco, 23—29 July 1995.

3. K. Frese, A. Danilkovich, A. Valujskikh, J. Romashkova, Eu. Makarov. Carboxy-terminal peptide of beta subunit of human chorionic gonadotropin modulates activity of human blood monocytes. Abstr. 9-th International Congress of Immunology, San Francisco, 23-29 July 1995.

4. Danilkovich A., Freze K., Romashkova J., Valujskikh A., Makarov E., Targoni O., Makarova N., and Kushch A. Influence of synthetic peptides on the proliferation of lymphoblastoid cells in vitro. 1. Growth inhibition and receptor's binding. — FEBS Let., 1995, V. 369, p. 161-164.

5. Valujskikh A., Danilkovich A., Freze K., Kharitonenkov I., Makarov E. Effect of synthetic peptide — fragment of human chorionic gonadotropin on the proliferation of HL-60 cells. Abstr. 23rd Meeting of the FEBS, Basel, 13-18 August 1995.