Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Механизмы гемостимулирующего эффекта глицирама в условиях цитостатических миелодепрессий

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК , р д 0 д ТОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

11 МОЯ 1996 ФАРМАКОЛОГИИ

ЛЮБАВИНА ПОЛИНА АНАТОЛЬЕВНА

МЕХАНИЗМЫ ГЕМОСПШУЛИР У10Щ1 ГО 1ФФ1: К1 А ГЛНЦИР.ША В УСЛОВИЯХ ЦИТОСГАТИЧЕСКИХ МИЕЛОДЕПРЕСа1Й

14.00.16 - "Патологическая физиология"

На правах рукописи

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск - 1996

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте фармакология Томского научного центра РАМН.

Научные руководители: академик РАМН, профессор Е.Д.Гольдбе[

член-корр. РАМН, профессор А.М.Дыгг

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор •

Ведущее учреждение - Научно-исследовательский институт

онкологии Томского научного центра РА^

на заседании специализированного совета К 001.33.01 при Н фармакологии ТНЦ РАМН по.адресу: 631028, г.Томск, пр.Ленина,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Н фармакологии ТНЦ РАМН. ,

В.В.Новицкий

доктор медицинских наук В.И.Агафонов

Зашита диссертации состоится

.1996 г. в чг

Автореферат разослан 9- /о

1996 г.

Ученый секретарь

специализированного совета

кандидат медицинских наук

Е.Н.Амосова

** С. -

Актуальность проблемы. Современная онкология располагает обширным спектром цитостатических средств, используемых для лечения злокачественных новообразований. Однако подавляющее большинство из известных антиблас-томных препаратов обладает .токсическим действием на кроветворную систему, что является одной из основных причин, ограничивающих возможности химиотерапии (Гершанович М.Л., 1982; Голь-дберг Е.Д., Новицкий В.В., Сальник Б.Ю. и др., 1984; Проценко Л.Д., Булкина З.П., 1985).

В этой связи встает вопрос о создании препаратов, способных восстанавливать костномозговое кроветворение, подавленное цитостатиками. Целенаправленная разработка высокоэффективных, патогенетически обоснованных методов фармакологической коррекции нарушений в системе крови в настоящее время осуществляется с учетом сложнейших механизмов функционирования кроветворной ткани в норме и при экстремальных воздействиях (Гольдберг .Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. и др., 1990). Такой научный подход к указанной проблеме открывает перспективу использования в качестве гемостимуляторов препаратов, созданных на основе естественных регуляторов гемопоэза и их производных. Поиск в этом направлении постоянно продолжается, поскольку ни одно из применяемых сегодня в клинике лекарственных средств не удовлетворяет требованиям онкологов в силу ряда причин: низкие ге-мостимулирующие свойства (нуклеинат натрия, витамины, зимозан, продигиозан, элеутерококк), серьезные побочные эффекты (коло-ниестимулируюшие факторы, интерлейкины) (Иране Л.Ю., Салазем-ниеце Г.Д., 1980; Гершанович М.Л., 1982; Пашинский В.Г., 1988;

Sieff A. Colin, 1987; Murfy M.J., Rizzoly V., 1990).

Внимание исследователей в последнее время привлекает из^ чение в качестве потенциальных гемостимуляторов гликозамино1 • ликанов и их производных. Являясь естественным компоненте клеточной мембраны и экстрацеллюлярного матрикса, ГАГ, входя: кроме того, в состав основных гемопоэтинов (Серов В.В., Шехп A.B., 1981; Харченко М.Ф., Шатская Т.Л., Остроумова С.С. др., 1984). Современные представления о ГАГ, их участии межклеточных взаимодействиях и способности выступать в качес: ве гуморальных регуляторных факторов, позволяют предположи: возможность использования этих соединений для стимуляции пс давленного кроветворения (Юшков Б.Г., 1984; Ястребов А.П., Dt ков Б.Г., 1988; Dexter Т.М., 1982; Noordegraaf Е.М., Ploemac her R.E., 1980; Vannucchi S., Fibbi G., Cella C. e.a., 1980),

Ранее было показано, что D-глюкуроновая кислота, входящ в состав большинства гликозаминогликанов, при внутривенн< введении мышам стимулирует процессы восстановления костномо; гового грануломоноцитопоэза в условиях гипоплазии кроветвор!

I .

ния, вызванной циклофосфаном (Симанина Е.В., 1990; Гольдбе) Е.Д., Дыгай A.M., Карпова Г.В. и др., 1993). Установлено таге наличие гемостимулирующих свойств у некоторых препаратов ра тительного происхождения (экстракт шлемника байкальского, 6ai калинат-лизин), содержащих остатки глюкуроновой кислоты (Уди цевС.Н., Разина Т.Г., Кузнецов В.В., 1988; Абрамова Е.В 1992;' Агафонов В.И., 1993). В продолжение начатых исследован] особого внимания заслуживает глицирам - препарат, молекула к торого содержит в своем составе два остатка глюкуроновой к» лоты. Глицирам выделен из корней солодки голой и традицион:

применяется в качестве противовоспалительного средства при бронхолегочных, аллергических и других заболеваниях (Азимов М.М., 1980; Корсун В.Ф.. 1993; Машковский М.Д., 1985; Нуралиев Ю.Н., 1988). Выявление гемопоэзиндуцирующих свойств у данного препарата позволило бы расширить его клиническое применение.

Цель исследования. Изучить возможность стимуляции костномозгового кроветворения с помощью глицирама и вскрыть механизмы регуляторных влияний препарата на гемопозз в условиях цитостатической миелодепрессии, вызванной введением 5-фторурацила, либо циклофосфана.

Основные задачи исследования.

1. Изучить механизмы восстановления гемопоэза, подавленного 5-фторурацилом, либо цикдофосфаном.

2. Оценить модулирующее влияние глицирама на кроветворение в условиях гемодепрессии, вызванной 5-фторурацилом, либо цикдофосфаном.

3. Вскрыть возможные механизмы регуляторного влияния глицирама на гемопозз в условиях гипоплазии костномозгового кроветворения.

Научная новизна работы.

В работе впервые в сравнительном аспекте изучены механизмы регенерации гемопоэза в условиях миелодепрессии, вызванной антиметаболитом (5-фторурацил), либо алкилирующим агентом (циклофосфан). Показано, что различный характер постцитостати-ческой репарации после введения 5-фторурацила,. либо циклофосфана, обусловлен различной степенью повреждающего влияния указанных препаратов на функциональное состояние элементов ГИМ. Впервые продемонстрирована возможность коррекции с помощью

глицирама нарушений со стороны системы крови при цитостатичес-кой миелодепрессии. Выявлена способность глицирама стимулировать преимущественно процессы костномозгового гранулоцитопоэза в условиях гипоплазии кроветворения, вызванной 5-фторурацилом и, в меньшей степени, циклофосфаном. Стимуляция процессов регенерации кроветворения под действием глицирама сопровождается повышением функциональной активности клеточных элементов адге-зирующей фракции ГИМ (активация секреции ЭПА и КСА), увеличением концентрации в костном мозге эритроидных и грануломоноци-тарных клеток-предшественников.

Практическая значимость. В результате проведенных экспериментов разработан принципиально новый патогенетически обоснованный метод фармакологической коррекции гипопластических состояний кроветворения, возникающих в условиях цитостатической химиотерапии ( заявка на изобретение N 94013606 "Гемостимулятор"; приоритет от 18.04.94 г.; положительное решение от 27.05.96 г.). Полученные результаты являются основой для проведения клинических исследований по изучению возможности применения глицирама с целью коррекции нарушений в системе крови в условиях противоопухолевой химиотерапии.

Положения, выносимые на защиту.

1. Регенерация гемопоэза в условиях гипоплазии кроветворения, вызванной 5-фторурацилом, характеризуется более поздним, по сравнению с циклофосфаном, повышением функциональной активности клеточных элементов ГШ и увеличением содержания в костном мозге Есех типов клеток-предшественников.

2. Глицирам в условиях цитостатической миелодепрессии при пероралыгом применении стимулирует преимущественно процессы

восстановления костномозгового гранулоцитопоэза.

3. В основе активирующего влияния глицирама на процессы постцитостатической регенерации гемопоэза лежит стимуляция функциональной активности адгезирующих элементов ГИМ, сопровождающаяся увеличением секреции гуморальных факторов роста, повышением содержания в костном мозге кроветворных прекурсоров.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Юбилейной конференции, посвященной 10-летию НИИ фармакологии ТНЦ РАМН (Томск, 1994); на 11-ом Международном симпозиуме фонда медицинского обмена Японии, России и стран Северо-восточной Азии (Владивосток, 1994); на конферкнции НИИ фармакологии ТНЦ РАМН "Создание новых ге-мостимуляторов" (Томск, 1996); на II-ом Международном конгрессе по иммунореабилитации (Анталия, 1996).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 8 - в центральной печати.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 192 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов и списка используемой литературы. Работа иллюстрирована 10 рисунками и 25 таблицами. Библиографический. указатель включает 282 источника, из них 170 отечественных и 112 иностранных.

Материал и методы исследования.

Эксперименты проведены на 579 мишах-оашах линии СВА массой 18-20 г. (питомник "Рассвет", г.Томск) и одном кролике.

До начала исследования экспериментальных животных выдер-

живали в течение недели на обычном пищевом рационе по 10-особей в пластиковых клетках. Мышей умерщвляли методом разр' шения позвоночника в шейном отделе.

Опытным и контрольным мышам внутрибрюшинно однократно МПД вводили 5-фторурацил (228 мг/кг), либо циклофосфан (21 мг/.кг). Определение. величины МПД при этом проводили метод! пробит-анализа по Литчфилду и Вилкоксону (Урбах В.Ю., 1975 Глицирам растворяли в дистиллированной воде (0,2 мл/мышь) и течение 5 суток после инъекции цитостатика вводили зондом желудок в дозе 50 мг/кг. Контрольным животным во все^ сери: экспериментов в аналогичных условиях вводили эквивалента объем дистиллированной воды (0,.2 мл/мышь).

Опухоль Эрлиха трансплантировали внутрибрюшинно (6-7 х и клеток в 0,2 мл физиологического раствора). Циклофосфан ввод; ли дважды внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг, начиная с 4 сут после перевивки опухоли. Лечение глицирамом начинали пос, второй инъекции цитостатика. Результаты оценивали на 7 сут после трансплантации опухолевых клеток, измеряя объем асцита опухолевых клеток, подсчитывая торможение роста опухоли в 7. контролю. Карциному легких Льюис (1-2 х 10б клеток) перевива внутримышечно в 0,2 мл физиологического раствора. Циклофосф животные получали внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг дважды с и тервалом между введениями-96 часов, через 9 суток после трас лантации опухолевых клеток. Лечение животных глицирамом нач напи одновременно с последней инъекцией цитостатика. На сутки определяли массу опухолевого узла, количество метастаз в легких, их площадь, подсчитывали торможение роста опухоли частоту метастазнрования в % к контролю (Софьина З.П., Сырк

A.B., Голдин А. и др., 1980).

Определение показателей периферической крови и костного мозга осуществляли стандартными гематологическими методами (Меньшиков В.В., 1987).

Определение жизнеспособности кариоцитов осуществляли с помощью трипанового синего (Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов

B.П., 1992). Клонирование клеток-предшественников грануломоно-цитопоэза (КОЕ-ГМ) и эритропоэза (КОЕ-Э) осуществляли в метил-целлюлозной культуре ткани (Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M...Шахов В.П., 1992). Под колониями подразумевали образовавшиеся в культуре очаги гемопоэза, содержащие более 50 клеток. С целью морфологического изучения колоний готовили препараты, которые окрашивали азур-11-эозином. Кондиционную среду клеток костного мозга получали инкубированием прилипающих, либо неприлипающих миелокариоцитов в среде RPMI-1640, содержащей 10% фетальной сыворотки теленка, при 37°С в течении 1 часа в атмосфере 5 7. СОг и 100% влажности. Колониестимулирующую (КСА) и эритропоэ-тическую (ЭПА) активности сыворотки крови и супернатантов клеток костного мозга определяли по Metealf (1977) в модификации Гольдберг Е.Д. и др. (1992). Определение способности глицирама стимулировать рост КОЕ-Э и КОЕ-ГМ'in vitro проводили в метил-целлюлозной культуре, добавляя препарат в концентрациях Ю-12, Ю-10, 10~8, 10~б и 10~4М. В качестве тест-системы испоьзовали цельный костный мозг интактных мышей и различные его фракции.

Для оценки достоверности результатов применяли методы вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента, U- и Т-критериев Вилкоксона (Лакин Г.Ф., 1980).

Результаты исследования и их обсуждение.

Введение мышам 5-фторурацила приводило к развитию выраженной . гипоплазии кроветворной ткани за счет угнетения грану-ломоноцитарного (2-12 сутки) и эритроидного (2-19 сутки) ростков, что проявлялось резким падением числа полиморфноядерных лейкоцитов, моноцитов и эритрокариоцитов вплоть до полного их исчезновения с препаратов костного мозга. Соответствующая картина наблюдалась в периферической крови с 5 по 9 сутки, когда при изучении гемограмм не удавалось обнаружить ни одного нейт-рофильного или зозинофильного гранулоцита, а при подсчете 1000 эритроцитов - ни 9дного ретикулоцита (4-6 сутки), содержание эритроцитов было достоверно сниженным.

Вместе с тем, уже со 2 суток отмечалось накопление в кроветворной ткани гранулоцитарных и эритроидных прекурсоров, максимальный уровень содержания которых (выше исходных значений соответственно в 12,8 и 5,8 раз) регистрировали на 8 сутки опыта. Одновременно с указанными изменениями (7-8 сутки) повы-

I

шалась секреторная активность прилипающих элементов ГИМ (на 75-125 7. от начального уровня). Пик выделения КСА и ЭПА (в среднем 3-кратное увеличение по сравнению с контролем, Р<0,001) клетками неприлипающей фракции кроветворного микроокружения приходился на 9 сутки опыта.

Очевидно, указанные процессы и предопределили начало восстановительного периода, следующего за периодом депрессии кроветворения, вызванной введением 5-фторурацила.

В настоящее время известно, что при цитостатическом воздействии нарушается структурно-функциональная организация

костного мозга, ь частности формирование гемопоэтических островков, обеспечивающих пролиферативные и дифференцировочные потенции кроветворных клеток (Горизонтов П.Д., 1981; Дыгай A.M., Жданов В.В., Хлусов И.А.. 1995; Gale R.P., 1985). Результаты ранних исследований указывают на pesicoe угнетение выхода ГО различных типов из костного мозга животных, получавших 5-фторурацил (Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Хлусов И.А., 1993).

Длительное угнетение костномозговых показателей грануло-цитарного и зритроидного ростков под действием 5-фторурацила сопровождалось накоплением предшественников в кроветворной ткани, что могло быть вызвано нарушением нормального' течения процессов созревания последних. Указанное явление обусловлено, вероятно, повышением секреции гемопоэтических ростовых факторов клетками ГИМ и соответственно стимуляцией пролиферации прекурсоров на фоне невосстановленной структурно-функциональной организации костного мозга (Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Хлусов И.А., 1993).

Последовательное развитие процессов регенерации грануло-цитарного ростка от незрелых до зрелых форм (мшссималыюе содержание клеток - на 12 и 14 сутки соответственно) завершилось восстановлением общей клеточности костного мозга к 14 суткам.

Состояние эритрона нормализовалось лишь к окончанию эксперимента (25 сутки).

Введение мышам циклофосфана также вызывало существенные, но менее продолжительные по времени изменения в системе крови. Наблюдалось резкое обеднение костного мовга нейтрофильными гранулоцитами (1-6 сутки), значительное падение числа эритро-кариоцитов (1-12 сутки) и лимфоидных клеток ( на протяжении

всего периода наблюдения), снижение содержания моноцитар-но-макрофагальных элементов. Общее количество миелокариоцитов на 2 сутки составляло 12 X от контрольного значения. Отражением процессов, происходящих в центральном звене гемопоэза, явилась картина периферической крови: с 1 по 6 сутки наблюдалось развитие выраженной лейкопении (вплоть до полного отсутствия на гемограммах нейтрофильных гранулоцитов на 3-4 сутки), на мазках крови практически не обнаруживались ретикулоциты (4 сутки).

Вместе с тем, наблюдалась стимуляция функциональной активности элементов кроветворного микроокружения, что проявлялось усилением секреции гуморальных факторов адгезирующей фракцией ГИМ на 2-3 сутки (4-х и 7-ми кратное увеличение по сравнению с контролем соответственно для ЭПА и КСА) и повышенном (в 2 раза, Р<0,001) выделении ЭПА неприлипающими клетками костного мозга на 1 сутки после введения циклофосфана. По-видимому, результатом активации элементов ГИМ явилось возрастание содержания в костном мозге клеток-предшественников как гранулоцито-макрофагального, так и эритроидного ростков (1-3 сутки), максимальные уровни которых регистрировали на 3 сутки (соответственно 12-ти и 5-ти кратное увеличение). О возрастающей функциональной активности компонентов ГИМ в этот период свидетельствуют и данные исследований, указывающие на раннее восстановление (6 сутки) числа ГО в костном мозге мышей, получавших циклофосфан (Дыгай А.М., Жданов В.В., Хлусов И.А. и др., 1995).

Можно предположить, что быстрое восстановление структурно- функционаяъной организации костного мозга, высокая секре-

торная активность адгезирующей фракции ГИМ на 2-3 сутки после применения циклофосфана обеспечивали ускоренный выход прекурсоров в дифференцировку, благодаря чему уже на 5-7 сутки резко возрастало содержание нейтрофилов в костном мозге. Общее количество миелокариоцитов достигало начальных значений к 7 суткам, в основном, за счет восстановления гранулоцитарного ростка. Более продолжительная депрессия числа зритроидных и лимфо-идных элементов объясняется, видимо, выраженным повреждающим действием циклофосфана непосредственно на соответствующие клетки-предшественники костного мозга экспериментальных животных (Дыгай A.M., Жданов В.В., Хлусов И.А. и др., 1995).

Подводя итог изложенному, можно заключить, что характер течения восстановительных процессов в кроветворной ткани после цитостатического воздействия определяется не только непосредственным влиянием данных препаратов на гемопоэтические клетки, но и их действием на элементы кроветворного микроскруления. Причем развитие процессов регенерации в костном мозге во многом определяется структурно-функциональным состоянием ГКМ: его организацией и секреторной активностью. Следовательно, различия в динамике восстановления кроветворения после применения 5-фторурацила и циклофосфана во многом обусловлены именно неодинаковым влиянием данных цитостатиков на функцию элементов ГШ. .

Таким образом, на модели цитостатической миелосупрессии, вызванной введением противоопухолевых препаратов с разными механизмами действия, продемонстрировано токсическое воздействие цитостатиков на гемопоэз, а также различия в степени повреждения отдельных ростков кроветворения, клеток кроветворного мик-

роокружения и особенностях постцитостатической регенерации костного мозга.

Пятикратное введение глицирама per os после инъекции 5-фторурацила способствовало более раннему и интенсивному восстановлению костномозгового кроветворения, подавленного цистостатиком. При этом наблюдалось усиление секреции КСА и 8ПА (3 и 5 сутки соответственно) адгезирующими кариоцитами, а также повышение активности гуморальных факторов, выделяемы^ неприлипающей фракцией ГИМ, в отношении эритропоэза (5, 10-12 сутки). Применение глицирама приводило к возрастанию накопления в костномозговой ткани грануломоноцитарных (до 5,79 + 0,15 х Ю5 миелокариоцитов на 6 сутки) и эритроидных (до 14,56 + 0,47 х Ю5 мйелокариоцитов • на 6 сутки) клеток-предшественников. Таким образом, указанные процессы обеспечили создание достаточного плацдарма кроветворения для более быстрого восстановления гемопозза. В этой связи, закономерной была стимуляция регенерации гранулоцито- (8-12 сутки), лимфо- (10 сутки) и моноцитопозза (3, 6 сутки) в кроветворной ткани животных, леченых глицирамом. Описанные изменения повлекли за собой увеличение общей: клеточности костного мозга в более ранние сроки у Кшшей при сочетанном'применении 5-фторурацила и препарата из солодки.

Однако при применении глицирама наблюдалось развитие более выраженной нейтро-,■ лимфо- и моноцитопении в периферической крови. Необходимо отметить, что и восстановление указанных показателей отставало по срокам от такового в группе сравнения . Применение глицирама совместно с 5-фторурацилом существенно не влияло на содержание эритроцитов в периферической

крови. При этом исследуемый препарат стимулировал восстановление уровня ретикулоцитов.

Проведенные исследования позволили выявить гемостимулиру-ющие свойства у глицирама и в отношении кроветворения, подавленного циклофосфаном. Препарат активировал секрецию ЭПА и КСА адгезирующими клетками ГИМ в ранние сроки наблюдения и неадге-зирующими - на 6 сутки. Указанные изменения сопровождались повышением содержания в костном мозге' гранулоцито-макрофагальных (до 10,67 + 0,33 х 105 миелокариоцитов, Р<0,001) и зритроидных (до 7,00 + 0,42 х Ш5 миелокариоцитов, Р<0,001) прекурсоров (3 и 4 сутки опыта, соответственно), что и лежало в основе ускорения процессов регенерации гемопоэза. В результате с 8 по 10 сутки регистрировали' увеличение общей клеточности костного мозга (в среднем на 20 % по сравнению с контрольной группой) за счет повышения числа незрелых (3, 8 сутки) и зрелых (7, 10 сутки) форм гранулоцитов, а также лимфоидных элементов (2-3, 9-10 сутки).

В то же время и в этом случае (как и при применении 5-фторурацила) наблюдалось развитие более выраженной грануло-цито- и лимфопении в периферической крови при сочетанием использовании глицирама и цитостатика. С другой стороны, введение исследуемого препарата приводило к более раннему восстановлению в периферической крови числа ионоцитарно-макрофагалъ-них элементов и ретикулоцитов.

Регенераторные процессы з костномозговой тгани протекал!! на фене возрастания уровня ЭПА сыворотки крови.

Полученные з сбеих сериях экспериментов данные, свиде-' тельствукщке об активации процессов костномозгового кроветво-

рения и одновременно с этим задержке выхода зрелых клеточных форм в периферическую кровь, согласуются с представлениями некоторых исследователей (Ястребов А.П., КХжов Б.Г., Большаков В.Н., 1988) о способности ГАГ стимулировать митозы ранних предшественников гемрпоэза и тормозить дифференцировку более поздних.

Вместе с тем, влияниё глицирама на систему крови следует рассматривать, принимая во внимание-и тот факт, что данный препарат под действием кишечных бактерий гидролизуется с образованием молекулы глицирретовой кислоты, обладающей кортикос-тероидоподобным действием, и двух молекул D-глюкуроновой кислоты, • обязательного компонента большинства ГАГ (Балтика JI.A:, Рыжова С.А., Васильева Е.В. и др., 1994; Ловко-ва М.Я., Рабинович A.M.,.Пономарева С.М. и др., 1989; Акао Т., Hayashi Т., Kobashi К. . е.а., 1994; Stormer F.С., Reistad R., Alexander J., 1993). Очевидно, что и действие глицирама будет складываться из эффектов указанных соединений. В частности, в литературе встречаются указания ряда авторов на возможное влияние кислых ГАГ на миграцию лимфоидных клеток в костный мозг (Ястребов А.П., Юшков Б.Г., Большаков В.Н., 1988) и о способности глюкокортикоидов снижать число лимфоцитов, циркулирующих в Крови, что также связывают с перераспределительными механизмами (Гершанович М.Л., 1982). По-видимому, эти данные объясняют динамику лимфоидных элементов под влиянием глицирама. Вполне возможно, что и характер распределения гранулоцитарных клеток при использовании исследуемого препарата связан с указанными выше механизмами.

Анализ динамики постцитостатических репарационных процес-

сов на фоне действия глицирама позволяет предположить, что ге-мостимулирующий эффект препарата реализуется на уровне элементов кроветворного микроокружения, и в частности, клеток адге-зирующей фракции костного мозга, что влечет за собой активацию процессов пролиферации, либо дифференцировки клеток-предшественников в зависимости от функционального состояния ГИМ.

Следующий этап работы был посвящен изучению механизмов гемостимулирующего эффекта глицирама. Эксперименты In vitro позволили подтвердить наши предположения о прямом влиянии препарата на клетки ГИМ. Стало очевидным, что исследуемый препарат воздействует непосредственно на прилипающие элементы кроветворного микроокружения, поскольку активацию колониеобразо-вания регистрировали при добавлении глицирама (Ю-4 М) в тест-систему из клеток нефрационированного костного мозга в присутствии ЭПА (КСА), либо при культивировании неприлипахшдах элементов ГШ на адгезирующем слое, преинкубированном с глици-рамом (Ю-4 М). Добавление исследуемого препарата в данную тест-систему в меньших концентрациях (1СГб, 10~8.М) активировало рост только эритроидных колоний. Обработка же препаратом фракции неприлипаюших мкелокариоцитов не влияла на эффективность колониеобразования, происходящего в присутствии ЭПА (КСА).

Следовательно, глицирам не обладает пря>яым активирующим действием в отношении клеток-предшественников эритро- и грану-лсмоноцитопоэза. Стимуляция колониеобразования из меток цельного костного мозга in vitro является опосредованным эффектом препарата и обусловлена повышением под его влиянием функциональней активности адгезирующих элементов кроветворной ткани.

Таким образом, нами выявлена способность препарата из солодки стимулировать восстановление костномозгового кроветвор-ния при цитостатических гемодепрессиях, вызванных введением 5-фторурацила, либо циклофосфана. Обнаруженный эффект связан с изменениями функции элементов ГИМ под действием глицирама.

Результаты настоящей работы указывают также на несомненно более выраженный гемостимулирующий эффект исследуемого препарата на фоне действия 5-фторурацила, нежели циклофосфана.

• Ранее полученные в нашей лаборатории данные свидетельствуют о мощном деструктивном влиянии 5-фторурацила на структурно-функциональную организацию костного мозга, в частности, на макрофагальный компонент ГИМ, и более мягком в этом отношении действии циклофосфана (Дыгай A.M., Жданов В.В., Хлусов И.А. и др., 1995). Сопоставчв этот факт с описанными выше данными о преимущественной активации прилипающих клеток микроокружения, можно объяснить более выраженную гемостимулирующую активность глицирама на фоне цитостатической миелосупрессии, вызванной 5-фторурацилом, компенсацией указанного звена патогенеза цитостатической болезни.- Современные представления о механизмах кроветворения включают в себя такой важнейший момент дифферен-Йировки гемопоэтических клеток, как адгезия стволовых нуклеа-ров на клетках стромы (Науменко О.И., 1992; Gordon M.Y., 1988). Считается, что процесс прикрепления обеспечивают регу-ляторные молекулы (протеогликани), расположенные на мембранах клеточных элементов ГШ. Различные комбинации ГАГ в структуре протеогликанов способны определять специфическую ориентацию клеток и, связывая гуморальные фактры роста, в конечном счете влиять на напрьлешюсть гемопоэза (.Науменко О.И., 1992; Gordon

M.Y., 1988; Slczkowski M.; Andrew Т., Amos S. e.a., 1993). Bee вышесказанное дает нам возможность предположить, что и глици-рам реализует гемостимулируюшие свойства посредством вовлечения одной из составных частей своей молекулы (остаток D-глюку-роновой кислоты) в процесс взаимодействия ранних кроветворных предшественников с клеточными элементами ГИМ.

Важно заметить, что к гемостимуляторам-,. используемым в онкологии, предъявляются особые требования: не стимулировать рост опухоли и не снижать эффективность цитостатической терапии (Пашинский В.Г., Яременко К.В., 1993). Проведенные эксперименты показали, что препарат из солодки был практически неактивен в отношении развития опухолевого процесса (на моделях асцитной опухоли Эрлиха и карциномы легких Льюис у мышей) при его изолированном применении. Использование же глицирама совместно с циклофосфаном в схеме химиотерапии опухоли либо не изменяло антибластомную активность цитостатика (на модели асцитной опухоли Эрлиха), либо значительно повыпало его противоопухолевые свойства (на модели карциномы легких Льюис): уменьшалась масса опухолевого узла, .снижалась частота метастазиро-вания по сравению с таковым у животных, которым вводили только циклофосфан.

Таким образом, результаты наяих исследований свидетельствуют о возможности использования глицирама в качестве гемссти-мулятора при цитостатнческих миелодепрессиях.

ВЫВОДЫ

1. Восстановление кроветворения после продолжительной гипоплазии костного мозга, вызванной однократным введением мышам Б-фторурацила в МПД, характеризуется повышением секреторной активности адгезирующих и неадгезирующих клеток ГИМ и накоплением в костном мозге гранУлоцито-макрофагальных и эритроидных клеток-предшественников в поздние сроки наблюдения.

2. Однократное введение мышам циклофосфана в МПД вызывает угнетение всех ростков гемопоэза и одновременно стимуляцию функциональной активности элементов кроветворного микроокружения, что проявляется усилением секреции гуморальных ростовых факторов клетками адгезирующей фракции ГИМ и повышенным выделением ЭПА неадгезирукшдами нуклеарами, а также увеличением содержания в костном моаге эритроидных и гранулоцито-макрофа-гальных клеток-предшественников в ранние сроки наблюдения.

3. Введение мышам глицирама стимулирует процессы восстановления костномозгового гранулоцитопоэза и, в меньшей степени, других ростков гемопоэза в условиях гемодепрессии, вызванной цитостатическими препаратами.

4. В механизмах гемостимулирующего эффекта глицирама' существенная роль принадлежит прямому активирующему влиянию препарата, либо его метаболитов на функциональную активность ад-геэирующих элементов ГИМ.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. The principles of hemostimulators creation for treatment of anemias and leukopenias of various genesis / E.D.Goldberg, A.M.Dygai, V. I.Agafonov e.a. // Abstr. of the Il-nd International symposium of Japan-Russia medical exchange foundation and the NEA region, Vladivostok, Sept. 19-21, 1994. -Vladivostok. - 1994. - P. 53-54.

2. К механизмам регенерации кроветворения при цитостати-ческих гемодепрессиях / Совместно с В.В.Ждановым, И.А.Хлусо-вым, Е.В.Симаниной // Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов. - Томск. - 1994. - С. 24-25.

3. О механизмах стимулирующего, действия глицирама на кроветворение в культуре // Труды молодых ученых института фармакологии. - Томск. - 1995. - С. 28-29.

4. Препараты из лекарственных растений в терапии гемодеп-рессий различного генеза / Совместно с Е.Д.Гольдбергом, А.М.Дыгаем, В.В.Ждановым и др. // Тез. докл. II Российского национального конгресса "Человек и лекарство", Мрсква, 10-15 апреля 1995. - Москва. - 1995. - С. 197.

5. Принципы создания лекарственных препаратов - стимуляторов кроветворения природного происхолдения / Совместно с Е.Д.Гольдбергом, А.М.Дыгаем, В.И.Агафоновым и др. // Эксперим. и клин, фармакология. - 1995. - N 1. - С. 3-7.

6. О возможности стимуляции глицирачом костномозгового кроветворения в условиях цитостатнческой гемодепрессии / Совместно с А.М.Дыгаем, В.В.Идановым, И.А.Хлусовым и др. // Экс-перил. и клин, фармакология. - 1095. - Т. 58. N 2. - С. 40-42.

7. Создание гемостимуляторов на основе принципа подражания естественным регуляторным системам" макроорганизма / Совместно с Е.Д.Гольдбергом, А.М.Дыгаем, В.И.Агафоновым и др. // Фундаментальные исследования как основа создания лекарственных средств. Сборник тез. 1-го Съезда Российского научного общества фармакологов, 9-13 окт. 1995, Волгоград. - Москва. - 1995. - С. 114.

8. Итоги работ по созданию гемостимуляторов природного происхождения / Совместно с Е.Д.Гольдбергом, А.М.Дыгаем, В.В.Ждановым и др. // Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов. - Томск. - 1995. - С. 3-10.

9. 0 'регулирующем влиянии гемопоэзиндуцирующего микроокружения на процессы кроветворения при действии цитостатических препаратов / Совместно с А.М.Дыгаем, В.В.Ждановым, И.А.Хлусо-вым и др. // Гематол. .и трансфузиология. - 1995. - N 5. - С. 11-15.

10. Влияние глицирама на систему крови у интактных мышей // Клинические и экспериментальные исследования молодых ученых Сибирского отделения РАМН. - Новосибирск. - 1996. - С. 74.

11. О Способности глицирама стимулировать гемопозз в условиях цитостатическйх миелодепрессий / Совместно с Е.Д.Гольдбергом, А.М.Дыгаем, В.В.Ждановым // International journal on immunorehabilitation. May, 1996. - И 2. - P. 89.

12. A capacity of glycyrrammum to stimulate hemopoiesis under cytostatic myelodepression / E.D.Goldberg, A.M.Dygai, V.V.Zhdanov //■ International journal on immunorehabilitation, May, 1996. - N 3. - P. 51.