Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Гемостимулирующие свойства и механизмы действия гранулоцитарного колониестимулирующего фактора

На правах рукописи

ПОПОВА Наталия Олеговна

ГЕМОСТИМУЛИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА И МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ГРАНУЛОЦИТАРНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА

14.00.25 - Фармакология, клиническая фармакология 14.00.16 - Патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск - 2005

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте онкологии и ГУ Научно-исследовательском институте фармакологии Томского научного центра Сибирского отделения РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Жданов Вадим Вадимович доктор медицинских наук, профессор Гольдберг Виктор Евгеньевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Заслуж. работник высшей школы РФ, доктор медицинских наук

Венгеровский Александр Исаакович Скурихин Евгений Германович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Кемеровская государственная медицинская академия

Защита состоится «_»_2005 г. в_часов на заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН

Автореферат разослан «_»_2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Амосова E.H.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Низкая избирательность цитостатическо-го действия противоопухолевых препаратов, применяемых в онкологии, требует постоянного внимания к проблеме токсичности лекарственных средств данной группы в отношении нормальных органов с высоким естественным темпом клеточного обновления [Ларионов Л.Ф., 1972; Проценко Л.Д., Булкина З.П., 1985; Гарин A.M., Хлебнов A.B., 1995]. Как известно, кроветворная ткань является одной из наиболее уязвимых к действию ан-тибластомных веществ, поэтому борьба именно с гематологическими осложнениями противоопухолевой химиотерапии представляет собой важнейший вопрос современной онкологии и гематологии [Гершанович М,Л., 1982; Переводчикова Н.И., 1996; Гольдберг Е.Д. и др., 1998].

Для того, чтобы нивелировать миелоингибирующий эффект цито-статиков, при проведении химиотерапии назначают препараты, обладающие гемостимулирующим действием. К ним относятся неспецифические протекторы гемопоэза - зимозан, спленин, витамины группы В, предшественники синтеза нуклеиновых кислот - нуклеиновокислый натрий, пенток-сил, метацил. Свойством стимулировать гемопоэз обладают гормоны, соли лития [Greco F., Breton H., 1977; Алмазов ВА и др., 1981; Закенфельд ПК., 1985; Мороз Б.Б. и др., 1986]. Однако применение вышеперечисленных препаратов в эксперименте и клинике показало, что они либо малоэффективны при выраженных миелосупрессиях, либо сами обладают целым рядом неблагоприятных побочных эффектов [Платонова Г.В., Софья-нова З.П., 1975; Алмазов В.А и др., 1981; Гершанович МЛ., 1982; Закенфельд Г.К., 1985; Patchen M., MacVittie Т., 1985; Goldberg E.D. e.a., 2000].

С патогенетических позиций весьма перспективными для клинического применения можно считать препараты качественно нового типа, созданные на основе эндогенных регуляторов гемопоэза (колониестиму-лирующие факторы, интерлейкины, эритропоэтин). Преимущества таких лекарственных средств обусловлены их исключительно высокой активностью и возможностью целенаправленного воздействия на отдельные ростки кроветворения [Vose J., Armitage J., 1995; Varas F. e.a., 1996; Волкова M.A., Ширин А.Д., 1997; Волкова MA, 1998; Moore M., 2002; Glaspy J., 2003]. Однако терапевтическое применение препаратов гемопоэтических ростовых факторов ограничено вследствие того, что они представляют собой дорогостоящие рекомбинантные формы цитокинов и выпускаются преимущественно за рубежом.

Одним из наиболее перспективных (для создания препаратов - стимуляторов кроветворения) гемопозтинов оказался гранулоцитарный колоние-стимулирующий фактор (Г-КСФ). Он является линейно-рестриктированным регулятором продукции нейтрофилов и мощным стимулятором терминаль-

ной стадии их развития [Metcalf D., 1989; Williams G. ca., 1990; Demetri G., Griffin J., 1991]. Специфические биологические свойства Г-КСФ послужили основанием для клинического применения его препаратов (нейпогена, грано-цита и др.) в качестве корректоров нейтропений различного генеза. В то же время не все фармакологические эффекты препаратов данного цитокина можно объяснить известными к настоящему времени механизмами его действия.

В связи с этим наше внимание привлек нейтростим, разработанный в НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ «Вектор» и НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН, который представляет собой препарат рекомбинантного человеческого негликозилированного Г-КСФ, вырабатываемого по оригинальной технологии.

Цель исследования. Изучить механизмы гемостимулирующего действия нейтростима и оценить его фармакологическую активность в сравнении с официнальным препаратом Г-КСФ.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние нейтростима на процессы восстановления подавленного циклофосфаном кроветворения.

2. Вскрыть механизмы стимулирующего действия нейтростима на процессы подавленного грануломоноцитопоэза.

3. Исследовать изменения в системе крови интактных мышей под действием нейтростима.

4. Оценить действие нейтростима на рост перевивных опухолей.

5. Провести сравнительное изучение влияния нейтростима и нейпогена на кроветворение.

Научная новизна и практическая значимость. В работе впервые проведено комплексное исследование механизмов стимуляции подавленного гранулоцитопоэза препаратом Г-КСФ. Показано, что важнейшим эффектом Г-КСФ является активация пролиферации гранулоцитарных предшественников, которую гемопоэтин осуществляет как путем непосредственного воздействия на кроветворные элементы, так и через неадгези-рующие клетки кроветворного микроокружения, за счет повышения продукции последними гемопоэтических ростовых факторов. На тех этапах цитостатической болезни, когда восстановление гранулоцитопоэза протекает без усиления пролиферации клоногенных клеток, что обусловлено действием циклофосфана, под влиянием Г-КСФ повышается скорость созревания гранулоцитарных прекурсоров. Ускорение процессов дифферен-цировки родоначальных элементов гранулоцитарного ростка обусловлено, в свою очередь, активацией формирования гемопоэтических островков

гранулоцитарного типа вследствие увеличения содержания в костном мозге предшественников стромальных механоцитов.

Наблюдающееся после введения препарата Г-КСФ как интактным животным, так и на фоне цитостатика, повышение числа циркулирующих лимфоцитов, моноцитов и эритроцитов обусловлено их миграцией из костного мозга и носит кратковременный характер.

Обнаружено, что препарат Г-КСФ не только не стимулирует развитие перевивной опухоли при курсовом введении, но и оказывает ингиби-рующее влияние на ее рост, а также усиливает противоопухолевый и антиметастатический эффекты циклофосфана.

Проведенные исследования продемонстрировали высокую эффективность нейтростима, нового оригинального отечественного препарата Г-КСФ производства НИКТИ БАВ ГТЩ ВБ «Вектор», в качестве стимулятора кроветворения как у интактных мышей, так и в условиях цитостати-ческой миелосупрессии. Экспериментально установленные изменения картины костного мозга и периферической крови под действием нейтро-стима и механизмы, лежащие в их основе, практически идентичны таковым при применении препарата сравнения нейпоген («Hoffman-la Roche»). Этот факт позволяет рекомендовать нейтростим для коррекции изменений в системе крови, возникающих при химиотерапии злокачественных новообразований.

Полученные данные могут явиться основой для проведения исследований по дальнейшему изучению возможности использования нейтрости-ма с целью лечения лейкопений различного генеза, а также некоторых негематологических заболеваний дегенеративного характера.

По материалам работы подготовлен отчет об изучении специфической активности нейтростима в качестве гемостимулятора для представления в Фармакологический комитет Министерства здравоохранения и социального развития РФ.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на VIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001), И объединенной научной сессии СО РАН и СО РАМН (Новосибирск, 2002), II съезде Российского научного общества фармакологов (Москва, 2003), III международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2003).

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них 4 в центральных журналах; получен патент РФ на изобретение «Средство, стимулирующее грануломоноцитопоэз при гипопластических состояниях кроветворения».

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 6 рисунками и 14 таблицами. Библиографический указатель включает 273 источника, из них 79 отечественных и 194 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Эксперименты выполнены на 366 мышах-самцах линии CBA/CaLac массой 18-20 г в возрасте 2-2,5 месяцев и 60 мышах-самках С57В1/6. Животные 1 категории (конвенциональные линейные мыши), получены из питомника НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется). Распределение животных по сериям экспериментов в соответствии с поставленными задачами представлено в таблице 1.

Для моделирования цитостатической миелосупрессии использовали циклофосфан (Саранский завод медпрепаратов), который непосредственно перед применением растворяли в стерильном физиологическом растворе и вводили экспериментальным животным внутрибрюшинно однократно в максимально переносимой дозе (МПД, 250 мг/кг).

Препарат рекомбинантного человеческого Г-КСФ нейтростим (НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ «Вектор») произведен на основе негликозилиро-ванного белка, который вырабатывается оригинальным лабораторным штаммом бактерии E.coli, содержащим плазмиду с полноразмерным геном Г-КСФ человека. Нейтростим растворяли в стерильном фосфатном буфере (pH 7,2) и вводили в дозе 125 мкг/кг подкожно ежедневно в течение 5-ти дней. В качестве препарата сравнения использовали препарат негликози-лированного Г-КСФ человека филграстим, выпускаемый под коммерческим названием «Нейпоген» фирмой «Hoffman-la Roche», который вводили аналогичным способом.

Контрольным животным во всех сериях экспериментов в аналогичных условиях вводили эквивалентный объем растворителя. Фоновые показатели получали при исследовании интактных мышей.

Животных умерщвляли методом дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом в различные сроки после введения циклофосфана, либо после начала введения препаратов Г-КСФ (табл. 1).

Определение клеточности периферической крови и костного мозга, а также изучение их качественного состава осуществляли стандартными гематологическими методами [Кост Е.А., 1975; Меньшиков В.В., 1987].

Жизнеспособность кариоцитов определяли с помощью трипанового синего [Гольдберг Е.Д. и др., 1992].

Суспензию костномозговых нуклеаров из бедренной кости разделяли на прилипающую и неприлипающую фракции путем 40-минутной ин-

Таблица 1

Распределение животных по сериям экспериментов

№ Серия эксперимента Вид, Сроки иссле-

п/п количество животных дования

1 Изучение влияния нейтростима на Мыши До воздейст-

картину крови и костного мозга, со- CBA/CaLac, вия, 4-10, 12

держание клеток-предшественников 106 сут после вве-

в кроветворной ткани и уровни гу- дения цикло-

моральных факторов в кондицион- фосфана

ных средах клеток костного мозга

мышей, получивших циклофосфан в

МПД

2 Изучение влияния нейтростима на Мыши До воздейст-

пролиферативную активность кро- CBA/CaLac, вия, 3-6, 8, 10,

ветворных клеток-предшественни- 100 12 сут после

ков и структурно-функциональную введения

организацию костного мозга мышей, циклофосфана

получивших циклофосфан в МПД

3 Исследование изменений в системе Мыши До воздейст-

крови интактных мышей под воз- CBA/CaLac, вия, 3-8, 10,

действием нейтростима 58 12 сут после начала введения нейтростима

4 Определение действия нейтростима Мыши До воздейст-

на рост перевивных опухолей С57В1/6, 60 вия, 22 сут развития опухоли

5 Сравнительное изучение влияния Мыши До воздейст-

нейтростима и нейпогена на процес- CBA/CaLac, вия, 4-6, 8, 10

сы восстановления кроветворения, 100 сут после вве-

подавленного цитостатиком дения цикло-фосфана

б Влияние нейтростима на кроветворную ткань in vitro Мыши CBA/CaLac, 2

кубации в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Количество гранулоцито-макрофагальных колоние- (КОЕ-ГМ) и кластерообразующих (КлОЕ-ГМ) единиц, а также эритроидных (КОЕ-Э) и стромальных (КОЕ-Ф) предшественников определяли методом клонирования неадгезирующих миелокариоцитов в метилцеллюлозной среде in vitro [Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. Под колониями подразумевали образующиеся в полутвердой культуре клеточные агрегаты, содержащие более 30 кроветворных, либо фибробластоидных элементов, а под кластерами -от 5 до 30 клеток. Интенсивность созревания гемопоэтических прекурсоров определяли по величине индекса созревания (соотношение кластеры/колонии) [Дыгай A.M. и др., 1997]. Исследование пролиферативной активности предшественников грануломоноцито- и эритропоэза производили с помощью метода «клеточного самоубийства» путем поглощения гидроксимочевины в культуре ткани [Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. При этом определяли величину пула находящихся в S-фазе клеточного цикла кроветворных прекурсоров.

Кондиционную среду клеток костного мозга получали инкубированием прилипающих, либо неприлипающих миелокариоцитов в жидкой культуральной среде при 37°С в течение 24 часов в атмосфере 5% СО2 и 100% влажности. Тестирование колониестимулирующей (КСА) и эритро-поэтической (ЭПА) активностей в супернатантах от клеток костного мозга и в сыворотке периферической крови осуществляли в условиях метилцел-люлозной культуры [Гольдберг Е.Д. и др., 1992].

Структурно-функциональную организацию костного мозга исследовали путем ферментативной диссоциации костного мозга с последующим изучением количественного и качественного состава гемопоэтических островков (ГО) [Crocker P.R., Gordon S., 1985; Дыгай А.М., Шахов В.П., 1989].

Способность нейтростима непосредственно стимулировать образование колоний гранулоцитарными клетками-предшественниками костного мозга интактных мышей оценивали in vitro в сравнении с нейпогеном, добавляя препараты Г-КСФ в культуральную среду в концентрациях 5, 10, 20,30 и 40 нг/мл.

Действие нейтростима на рост перевивной опухоли (карциномы легких Льюис) изучали путем определения процента торможения роста опухоли (по массе опухолевого узла) и оценки интенсивности процесса мета-стазирования. При этом животным вводили нейтростим в дозе 125 мкг/кг в течение 5 или 10 сут, либо включали препарат Г-КСФ в схему лечения опухоли циклофосфаном.

Полученные результаты обрабатывали методами вариационной статистики.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что пятикратное введение ней-тростима после цитостатика ускоряет на сутки восстановление общего количества циркулирующих лейкоцитов. При этом содержание в крови сешентоядерных нейтрофилов превысило контрольный уровень более чем в 10 раз (рис. 1). Наиболее выраженное увеличение общего числа клеток белой крови у мышей, леченых нейтростимом, наблюдалось на 5-е сут, когда оно составило 386% от контрольного уровня. Стимулирующий эффект препарата в отношении указанного показателя регистрировался до 8-х сут исследования включительно. Анализ содержания отдельных морфологических форм лейкоцитов показал, что отмеченные изменения обусловлены увеличением числа палочкоядерных, сегментоядерных нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов. Среднее содержание зрелых нейтрофилов у животных, получавших нейтростим, достигало максимального абсолютного значения на 6-е сут - 28,21 Г/л. Количество моноцитов в периферической крови у мышей опытной группы было достоверно выше контрольного уровня на 5 - 7-е сут наблюдения, а лимфоцитов - на 8 - 9-е сут.

При изучении влияния нейтростима на показатели периферического звена эритрона было обнаружено преходящее снижение содержания в крови эритроцитов на 4-е сут и ретикулоцитов на 5-е сут исследования соответственно на 33 и 89% относительно такового у мышей, получавших только циклофосфан. В дальнейшем у опытных мышей регистрировалось увеличение содержания в крови красных кровяных телец.

Общая клеточность костного мозга мышей достоверно не изменялась под действием препарата Г-КСФ. В то же время при анализе миело-грамм было зарегистрировано существенное увеличение содержания в костном мозге как незрелых (на 5-е сут), так и зрелых нейтрофилов (с 4-х по 8-е сут исследования). При этом количество последних восстанавливалось под влиянием нейтростима до фонового уровня на 2 суток раньше, чем в контроле (один цитостатик). Препарат гемопоэтина не оказывал стимулирующего действия на клеточность других ростков кроветворения. Напротив, наблюдалось кратковременное снижение числа костномозговых лимфоцитов, моноцитов и эритрокариоцитов (рис. 2), что, однако, не отражалось отрицательно на качественном составе периферической крови.

Выявленные на модели цитостатической миелосупрессии эффекты препарата Г-КСФ свидетельствуют о том, что он оказывает стимулирующее действие преимущественно на процессы восстановления гранулоци-топоэза, что, собственно, и является его основным свойством по данным литературы [MetcalfD., 1989; Williams G. e.a., 1990]. Обнаруженные изменения содержания в крови клеток других ростков носят, по всей видимости, перераспределительный характер. При этом если повышение числа

Рис. I. Динамика общего количества лейкоцитов (А), содержания палочкоядерных (Б) и сегментоядерных (В) нейтрофилов, моноцитов (Г) и лимфоцитов (Д), в периферической крови мышей линии CBA/CaLac после введения им циклофосфана, циклофосфана и нейпогена, либо циклофосфана и нейтростима. Линии, паралельные оси абсцисс - границы доверительного интервала для исходного уровня.

По оси абсцисс - сроки исследования, сутки. По оси ординат - содержание клеток в периферической крови (х 109/л). Доверительные интервалы при Р=0,05.

Рис. 2. Динамика общего количества миелокариоцитов (А), незрелых (Б) и зрелых (В) нейтрофильных лейкоцитов, лимфоидных клеток (Г), моноцитов и макрофагов (Д), эртроидных клеток (Е) в костном мозге мышей линии CBA/CaLac после введения им циклофосфана, циклофосфана и нейпогена, либо циклофосфана и нейтростима. Линии, паралельные оси абсцисс - границы доверительного интервала для исходного уровня.

По оси абсцисс - сроки исследования, сутки. По оси ординат - содержание клеток (х 10 /бедро). Доверительные интервалы при Р=0,05.

циркулирующих моноцитов и лимфоцитов обусловлено ускоренным выходом из костного мозга, где их количество снижается, то в основе уменьшения клеточности эритроидной ткани лежат, вероятно, реципрок-ные взаимоотношения между гранулоцитарным и эритроидным ростками гемопоэза. Они заключаются в том, что резкое увеличение потребления ранних гемопоэтических прекурсоров вследствие их массового выхода в гранулоцитарную дифференцировку приводит к временному дефициту клеток, способных развиваться в направлении красного ростка кроветворения [de Haan G. е.а., 1992]. Кроме того, существуют данные о непосредственной способности Г-КСФ направлять развитие примитивных гемопо-этических предшественников в сторону миелоидного ростка кроветворения [Richards М. е.а., 2003].

Дальнейшие эксперименты были направлены на вскрытие механизмов стимулирующего влияния нейтростима на гемопоэз.

Как известно, состояние костномозгового кроветворения во многом зависит от функциональной активности пула кроветворных клеток-предшественников, способных давать начало определенному числу зрелых специализированных клеток крови. Проведенные исследования позволили установить, что введение препарата Г-КСФ препятствовало возрастанию содержания в костном мозге как гранулоцитарных, так и эритроидных прекурсоров, закономерно развивавшемуся после введения циклофосфана. Более выраженным и продолжительным оказалось ингибирующее влияние цитокина на формирование гранулоцито-макрофагальных колоний (до 6-х сут опыта). Характер же изменений содержания в костном мозге клеток-предшественников стромальных механоцитов отличался от такового кроветворных прекурсоров, в первую очередь, благодаря имеющему место накоплению КОЕ-Ф в гемопоэтической ткани.

Поскольку количественное состояние пула любых незрелых клеток определяется интенсивностью пролиферации и дифференцировки составляющих его элементов, мы обратили особое внимание на изучение этих процессов в отделе прекурсоров грануломоноцитопоэза.

Вызванное циклофосфаном снижение пролиферативной активности гранулоцитарно-макрофагальных предшественников в ранние сроки опыта полностью нивелировалось под влиянием препарата Г-КСФ. Более того, он вызывал повышение содержания в костном мозге мышей данной группы КОЕ-ГМ, находящихся в S-фазе митотического цикла, на 4-е и 6-е сут.

У животных, которым вводили нейтростим на фоне циклофосфана, наблюдалось, как и в контроле, ускорение созревания КОЕ-ГМ. Однако максимальная интенсивность данного процесса приходилась уже на 5-е сут исследования (на 2 дня раньше, чем в группе мышей, получавших только цитостатик). После 7-х сут значения изучаемого параметра в сравниваемых группах были ниже таковых у интактных мышей, достоверно не

различаясь между собой.

Таким образом, изменения состояния пула коммутированных прекурсоров играют важную роль в ускорении постцитостатической регенерации грануломоноцитопоэза под действием препарата Г-КСФ. Как показано в работах D. Metcalf (1989), Е. Platzer (1989), М. Moore (2002) и др., его гемостимулирующий эффект обусловлен активацией как пролиферации, так и дифференцировки соответствующих предшественников. Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что повышение пролиферативной активности КОЕ-ГМ играет важную роль в реализации фармакологического эффекта нейтростима в условиях цитостатической миелосупрессии. Однако ускорение созревания клоногенных элементов под действием Г-КСФ является важнейшим механизмом реализации его гемостимулирующего действия в условиях отсутствия активации клеточной пролиферации (5-е сут опыта) и препятствует накоплению в костном мозге гранулоцитарных прекурсоров.

Под действием препарата Г-КСФ происходили и определенные изменения структурно-функциональной организации костного мозга мышей линии СВА, получавших циклофосфан. В частности, не наблюдалось достоверного угнетения общего количества ГО в костном мозге на 3-й и 12-е сут опыта. Напротив, на 6-е сут их число существенно возрастало благодаря усилению формирования клеточных ассоциаций, содержащих в своем составе как стромальную клетку, так и макрофаг. Морфологический анализ островков показал, что указанное явление обусловлено стимуляцией образования в костном мозге гемопоэтических островков преимущественно гранулоцитарного типа.

Результаты изучения структурно-функциональной организации костного мозга показали, что ускоренная дифференцировка гранулоцитарно-макрофагальных предшественников под действием нейтростима во многом обеспечивается опережающей стимуляцией формирования ГО, в особенности гранулоцитарного типа, в которых, как известно, и происходит созревание гранулоцитов от коммутированных до зрелых форм [Дыгай А.М., Шахов В.П., 1989; Гольдберг Е.Д. и др., 1999].

Свое влияние на процессы пролиферации и дифференцировки кроветворных прекурсоров клеточные элементы гемопоэзиндуцирующего микроокружения (ГИМ) осуществляют как через непосредственные клеточные контакты, что выражается в изменении структурно-функциональной организации костного мозга, так и посредством продукции широкого спектра короткодистантных гуморальных факторов [Дыгай A.M., Клименко H.A., 1992; Натан Д.Г., Зифф К.А., 1994; Wilson J., 1997; Гольдберг Е.Д. и др., 1999].

Традиционное мнение о том, что гемостимулирующее действие Г-КСФ обусловлено непосредственным его эффектом в отношении крове-

творных клеток, не исключает возможности изменения под его влиянием функции добавочных клеток, формирующих микросреду в гемопоэтиче-ской ткани. Так, F. Bussolino с соавт. (1991) показали, что Г-КСФ проявляет ангиогенную активность (без признаков стимуляции воспаления) путем индукции программы дифференцировки, включающей повышение способности к пролиферации и миграции эндотелиальных клеток (Bussolino F. e.a., 1991). Кроме того, имеются свидетельства активации функций (фагоцитарной, бактерицидной и др.) мононуклеарных фагоцитов под действием Г-КСФ [Kitano К. е.а., 1991; Hebert J. e.a., 1994].

К настоящему времени накоплено большое количество сведений о влиянии данного цитокина на состояние компонентов лимфоцитарного звена кроветворного микроокружения. Так, экспериментально получены свидетельства иммунорегуляторных свойств Г-КСФ, которые заключаются в повышении под его действием продукции Т-клетками растворимых регуляторных факторов, ингибиции пролиферации лимфоцитов и индукции парциальной активации лимфоцитов после митогенной стимуляции [Rutella S. е.а., 1999]. Однако Е. Reyes и соавт. наблюдали у больных раком молочной железы, получавших препараты Г-КСФ, преходящее угнетение пролиферативного ответа Т-клеток на митоген [Reyes Е. е.а., 1999]. Введение мышам препарата Г-КСФ поляризует Т-клетки в сторону продукции цитокинов 2-го типа, что связано с угнетением продукции цитокинов 1-го типа. Указанные изменения обусловливают, по мнению L. Pan и соавт., уменьшение выраженности реакции «трансплантат против хозяина» [Pan L. е.а., 1995]. У пациентов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека, Г-КСФ вызывает существенный подъем общего числа лимфоцитов, общего количества Т-клеток, CD8+ Т-клеток и естественных киллеров [Strieker R., Goldberg В., 1996; Nielsen S. e.a., 1998].

В связи с этим для дальнейшего выяснения механизмов стимулирующего влияния препарата Г-КСФ на процессы регенерации костномозгового кроветворения были исследованы уровни ЭПА и КСА супернатан-тов костномозговых нуклеаров.

Под действием нейтростима наблюдалось увеличение подавленной цитостатиком секреторной активности клеток неадгезирующей фракции костного мозга. У опытных мышей ЭПА начинала возрастать на двое суток раньше, чем в контроле, и достоверные различия отмечались на 5 - 7-е и 12-е сут эксперимента (рис. 3). Стимуляция продукции КСА неприли-пающими миелокариоцитами под влиянием препарата Г-КСФ также наблюдалась, начиная с 5-х сут опыта, и была особенно выраженной на 7 -10-е сут. Применение нейтростима на фоне циклофосфана практически не изменяло динамику секреции цитокинов, составляющих КСА, адгезирую-щими элементами кроветворного микроокружения. В то же время наблюдалось кратковременное усиление продукции ЭПА прилипающими мие-локариоцитами на 7-е сут опыта.

Рис. 3. Эритропоэтическая (А - неприлипающие, Б - прилипающие) и колониесгимулирующая (В - неприлипающие, Г - прилипающие) активности супернатантов клеток косного мозга мышей линии CBA/CaLacY после введения им циклофосфана, циклофосфана и нейпогена, либо циклофосфана и нейтростима. Линии, паралельные оси абсцисс - границы доверительного интервала для исходного уровня.

По оси абсцисс - сроки исследования, сутки По оси ординат - количество колоний, выросших из 105 интактных неадгезируюших миелокариоцитов Доверительные интервалы при Р=0,05

Вскрытое участие секреторных продуктов клеток микроокружения в активации процессов кроветворения под действием Г-КСФ свидетельствует о наличии опосредованного пути реализации гемостимулирующей активности его препарата.

Дальнейшие исследования показали, что нейтростим вызывает существенные изменения в системе крови не только на фоне цитостатиче-ской миелосупрессии, но и у интактных животных.

Так, введение препарата Г-КСФ интактным мышам приводило к развитию выраженного лейкоцитоза в периферической крови с 4-х по 10-е сут наблюдения, что было обусловлено преимущественно увеличением содержания палочко- и сегментоядерных форм нейтрофилов. Общее количество лейкоцитов достигло максимальных значений к 5-м сут после начала воздействия. Необходимо отметить, что наряду с увеличением содержания в крови нейтрофильных гранулоцитов в этот срок исследования имело место повышение количества и циркулирующих лимфоцитов. Кроме того, на протяжении большей части периода наблюдения отмечались эритроцитоз и ретикулоцитопения.

Морфологическое изучение костного мозга показало, что изменения в гемопоэтической ткани в целом соответствуют таковым в крови. Обращало на себя внимание постепенное увеличение клеточности костного мозга, достигавшее статистически значимой разницы с таковой до введения нейтростима, к 8-м сут исследования. Однако анализ миелограмм показал, что изменения качественного состава кроветворной ткани под действием препарата Г-КСФ начинались значительно раньше. В частности, содержание незрелых нейтрофильных гранулоцитов достоверно возрастало в костном мозге на 4-е, а затем - с 7-х по 12-е сут наблюдения, а зрелых - на протяжении всего эксперимента, что свидетельствует в пользу ускоренного созревания нейтрофилов под действием нейтростима.

Клеточность лимфоидного ростка кроветворения, напротив, снижалась с 3-х по 7-е сут исследования, а эритроидного - на 7 - 8-е сут. В ранние сроки опыта наблюдалось также падение содержания в кроветворной ткани мононуклеарных фагоцитов.

Таким образом, нейтростим вызывал выраженную активацию грану-лоцитарного ростка гемопоэза у интактных мышей, сопровождавшуюся возрастанием общего количества миелокариоцитов (в отличие от животных, получавших предварительно цитостатик). Кратковременное повышение числа циркулирующих лимфоцитов и моноцитов сопровождалось снижением клеточности соответствующих ростков костного мозга, а эрит-роцитоз - ретикулоцитопенией и непродолжительным угнетением эритро-поэза. Аналогичные изменения в системе крови наблюдали исследователи, изучавшие эффекты Г-КСФ на других видах животных, в частности, у кошек и собак, которым вводили данное вещество длительным курсом

[Fulton R. e.a., 1991; Mishu L. e.a., 1992]. Выявленные феномены могут быть следствием возникновения реципрокных взаимоотношений в гемо-поэзе под влиянием гемопоэтического ростового фактора, а также ускорения созревания кроветворных клеток и развития перераспределительных реакций в системе крови.

Обязательным требованием к препаратам, которые планируется применять в онкологической клинике, является отсутствие у них способности стимулировать рост и метастазирование опухолей. В этом отношении данные о Г-КСФ, имеющиеся в литературе, достаточно противоречивы. Показано, что in vitro Г-КСФ обладает широким спектром действия на различные типы клеток, включая лейкозные и другие злокачественные элементы [Westphal G. e.a., 2002; Ancliff P. e.a., 2003]. Цитокин способен стимулировать пролиферацию некоторых клеточных линий мелкоклеточной карциномы легких и карциномы толстой кишки [Berdel W. e.a., 1989; Avalos В. e.a., 1990]. Однако по наблюдениям большинства исследователей, не отмечается отрицательных побочных эффектов Г-КСФ, включая усиление роста опухолей, при его применении как в онкологической, так и гематологической клинике [Ohno R. e.a., 1990; Crawford J. e.a., 1991; Lowenberg В., Touw I., 1993; Ottmann О. e.a., 1993; Scherrer R. e.a., 1993].

Мы изучали влияние нейтростима на рост перевивных опухолей на мышах линии C57BL/6 с карциномой легких Льюис.

Результаты экспериментов показали, что при пятикратном введении указанным животным препарата Г-КСФ отмечено достоверное уменьшение массы основной опухоли. Показатели развития процесса диссемина-ции опухоли у мышей этой группы не отличались от таковых в контроле. При включении нейтростима, вводимого в течение 5-ти дней, в схему лечения экспериментальной опухоли циклофосфаном, выявлено усиление противоопухолевого действия цитостатика: масса опухоли уменьшилась в 1,2 раза по сравнению с величиной этого показателя у животных, получавших только циклофосфан. Если же в схему лечения циклофосфаном добавляли препарат Г-КСФ, применяя его в течение 10-ти сут, наблюдалось достоверное усиление ингибирующего влияния цитостатика на развитие процесса диссеминации: индекс ингибирования метастазирования в данной группе животных составил 89%. Масса опухоли у мышей в этом случае также уменьшилась относительно контрольного уровня.

Таким образом, нейтростим не проявил стимулирующего действия на развитие карциномы легких Льюис. Более того, мы выявили его инги-бирующее влияние на рост перевивной опухоли. Отмечено также достоверное усиление противоопухолевого и антиметастатического эффектов циклофосфана при его сочетанном применении с изучаемым препаратом.

Полученные нами данные вполне согласуются с результатами клинических наблюдений, свидетельствующих о большем числе полных ре-

миссий и увеличении их продолжительности у онкологических больных, получавших препараты Г-КСФ в период лейкопении [Dombret Н. е.а., 1995; Estey Е. е.а., 1995; Hiddemann W. ел., 1997; Virchis А. е.а., 2004].

В связи с обнаруженной нами высокой эффективностью нейтрости-ма как стимулятора гранулоцитопоэза возник вопрос о соответствии уровня его специфической активности таковой нейпогена - официнального препарата Г-КСФ фирмы «Hoffinan-la Roche». Нейпоген (филграстим) также производится по рекомбинантной технологии с использованием модифицированного штамма E.coli, и в силу этого по своей структуре, также как и нейтростим, является препаратом негликозилированного гемопоэти-на [Gilberte, 1996; ВолковаМ.А., 1998].

Изучение колониестимулирующей активности сравниваемых препаратов Г-КСФ в условиях in vitro показало, что в обоих случаях существует зависимость эффекта от дозы. При этом активность нейтростима сравнима с таковой нейпогена. Достаточно высокой оказалась и удельная активность препарата производства НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ «Вектор» (порядка 108 МЕ/мг).

Влияние нейтростима и нейпогена на процессы восстановления кроветворения, подавленного циклофосфаном, также носило схожий характер.

Так, общее количество лейкоцитов в периферической крови у животных обеих сравниваемых групп увеличивалось по сравнению с контролем на 5 - 8-е сут после введения цитостатика, что было обусловлено преимущественно увеличением числа сегментоядерных нейтрофильных гранул оцитов и моноцитов (рис. 1). Нейтростим вызывал на сутки более раннее повышение содержания в крови палочкоядерных нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов по сравнению с нейпогеном. Подъем числа циркулирующих лейкоцитов и их отдельных морфологических форм под действием отечественного препарата Г-КСФ оказался также более продолжительным (вплоть до 8-сут исследования).

Введение как одного, так и другого препарата гемопоэтина приводило к задержке восстановления в периферической крови содержания рети-кулоцитов, сменявшейся непродолжительным эритроцитозом.

Изучение картины костномозгового кроветворения показало, что и нейтростим и нейпоген стимулировали восстановление гранулоцитопоэза, подавленного циклофосфаном, не изменяя общее количество миелокарио-цитов. Указанное явление сопровождалось непродолжительным снижением содержания в костном мозге клеток других ростков кроветворения. Эффекты, вызываемые сравниваемыми препаратами, были весьма похожи и различались преимущественно временем возникновения (на сутки раньше при применении препарата отечественного производства). В этой же

группе регистрировались самые высокие абсолютные значения содержания зрелых костномозговых нейтрофильных гранулоцитов (рис. 2).

Как известно, состояние костномозгового кроветворения во многом зависит от функциональной активности пула кроветворных клеток-предшественников, способных давать начало определенному числу зрелых специализированных клеток крови. Проведенные эксперименты позволили установить, что у животных обеих опытных групп на 5-е сут исследования не наблюдалось такого выраженного подъема числа КОЕ-ГМ, а на 4-е - КОЕ-Э в кроветворной ткани, как у мышей, получавших только цик-лофосфан. Обнаруженный факт свидетельствует в пользу того, что под действием как Г-КСФ производства НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ «Вектор», так и препарата фирмы «Hoffinan-Ia Roche», происходит мобилизация кроветворных предшественников из костного мозга в периферическую кровь, что является характерным свойством Г-КСФ [Watanabe %. е.а., 2003; Levesque J. е.а., 2003]. Необходимо отметить, что количество гранулоцито-макрофагальных клоногенных клеток у мышей, леченых нейтростимом, достоверно превосходило таковое в группе с нейпогеном на 6-е сут опыта.

Изучение продукции гуморальных факторов клетками костного мозга экспериментальных животных показало, что в активации процессов подавленного кроветворения под действием обоих препаратов Г-КСФ участвуют факторы кроветворного микроокружения. Так, секреторная активность костномозговых клеток неадгезирующей фракции возрастала на отдельные сроки эксперимента как у мышей, получавших после циклофос-фана нейпоген, так и (в большей степени) нейтростим. Однако повышенные уровни КСА и ЭПА в супернатантах от адгезирующих клеток костного мозга наблюдались только в группе животных, леченых нейпогеном, на 6-е сут наблюдения (рис. 3).

Проведенные эксперименты по сравнительному изучению специфической активности нейтростима и нейпогена продемонстрировали, что эффекты, вызываемые ими как in vitro, так и in vivo, достаточно сходны. Однотипный характер изменений картины периферической крови и костного мозга, развивающихся под действием обоих препаратов Г-КСФ, обусловлен одинаковыми механизмами, лежащими в их основе.

ВЫВОДЫ

1. Введение мышам нейтростима на фоне цитостатической миелосупрес-сии приводит к стимуляции процессов восстановления, преимущественно, гранулоцитарного ростка гемопоэза, как на уровне его центрального, так и периферического звеньев.

2. Эффект нейтростима во многом обусловлен непосредственной активацией пролиферации гранулоцитарных предшественников, а в условиях ее отсутствия - ускорением созревания соответствующих элементов.

3. Существует опосредованный путь реализации гемостимулирующей активности препарата Г-КСФ, заключающийся в стимуляции функциональной активности клеток гемопоэзиндуцирующего микроокружения (повышение содержания в костном мозге предшественников стромальных механоцитов, активация образования гемопоэтических островков, преимущественно, гранулоцитарного типа, стимуляция секреции гемопоэтических ростовых факторов).

4. У интактных мышей препарат Г-КСФ вызывает выраженную активацию гранулоцитопоэза. Кратковременное повышение числа циркулирующих лимфоцитов; моноцитов и эритроцитов обусловлено их миграцией из костного мозга.

5. Нейтростим оказывает ингибирующее влияние на рост перевивной опухоли (карцинома легких Льюис), а также усиливает противоопухолевый и антиметастатический эффекты циклофосфана.

6. Экспериментально установленные изменения картины костного мозга и периферической крови под действием препарата Г-КСФ нейтростим (производства ГНЦ ВБ «Вектор») и препарата сравнения нейпоген («Hoffman-la Roche»), вводимых на фоне цитостатической миелосу-прессии, как и механизмы, лежащие в их основе, практически одинаковы.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Механизмы стимуляции миелопоэза при цитостатических миелоде-прессиях пантогематогеном и гранулоцитарным колониестимулирую-щим фактором // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2000. - № 11. - С.512-515 (соавторы Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, Л.А. Гурьянцева и др.).

2. Механизмы компенсации при повреждении гранулоцитарного ростка у больных раком легкого в условиях противоопухолевой химиотерапии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2001. - № 6. -С.669-672 (соавторы В.Е. Гольдберг, В.В. Жданов, М.Г. Матяш и др.).

3. Механизмы гемостимулирующего эффекта кропанола при цитостати-ческих миелосупрессиях // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2002. - Приложение 1. - С.78-81 (соавторы В.В. Жданов, В.Е. Гольдберг, Т.Ю. Хричкова и др.).

4. Гемостимулирующие свойства кропанола при цитостатической миело-супрессии // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2002. -№ 6. -С.37-40 (соавторы В.В. Жданов, В.Е. Гольдберг, Т.Ю. Хричкова и др.).

5. Препараты, обеспечивающие переносимость цитостатиков и улучшающие качество жизни больных в процессе химиотерапии // Сибирский онкологический журнал. - 2004. -.№ 1. - С. 51-54 (соавторы В.В. Высоцкая, И.О. Недавняя).

6. Влияние гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на кинетику клеток - предшественников гранулоцитопоэза // Компенсаторно -приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты. - Новосибирск, 2004. - С.21-22 (соавторы В.Е. Гольдберг, Л.А. Гурьянцева, В.В. Удут и др.).

Патент на изобретение

Средство, стимулирующее грануломоноцитопоэз при гипопластиче-ских состояниях кроветворения. № 2182007 от 10.06.2002 (соавторы Е.Д. Гольдберг, Л.А. Гурьянцева, A.M. Дыгай и др.).

Тираж 100. Заказ 308. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники. 634050, г. Томск, пр. Ленина, 40

Актуальность. Низкая избирательность цитостатического действия противоопухолевых препаратов, применяемых в онкологии, требует постоянного внимания к проблеме токсичности лекарственных средств данной группы в отношении нормальных органов с высоким естественным темпом клеточного обновления [Ларионов Л.Ф., 1972; Проценко Л.Д., Бул-кина З.П., 1985; Гарин A.M., Хлебнов А.В., 1995]. Как известно, кроветворная ткань является одной из наиболее уязвимых к действию антибла-стомных веществ, поэтому борьба именно с гематологическими осложнениями противоопухолевой химиотерапии представляет собой важнейший вопрос современной онкологии и гематологии [Гершанович М.Л., 1982; Переводчикова Н.И., 1996; Гольдберг Е.Д. и др., 1998].

Для того чтобы нивелировать миелоингибирующий эффект цитоста-тиков, при проведении химиотерапии назначают препараты, обладающие гемостимулирующим действием. К ним относятся неспецифические протекторы гемопоэза - зимозан, спленин, витамины группы В, предшественники синтеза нуклеиновых кислот - нуклеиновокислый натрий, пентоксил, метацил. Свойством стимулировать гемопоэз обладают гормоны, соли лития [Greco F., Breton Н., 1977; Алмазов В.А. и др., 1981; Закенфельд Г.К., 1985; Мороз Б.Б. и др., 1986]. Однако применение вышеперечисленных препаратов в эксперименте и клинике показало, что они либо малоэффективны при выраженных миелосупрессиях, либо сами обладают целым рядом неблагоприятных побочных эффектов [Платонова Г.В., Софьянова З.П., 1975; Алмазов В.А. и др., 1981; Гершанович М.Л., 1982; Закенфельд Г.К., 1985; Patchen М., MacVittie Т., 1985; Goldberg E.D. е.а., 2000].

С патогенетических позиций весьма перспективными для клинического применения можно считать препараты качественно нового типа, созданные на основе эндогенных регуляторов гемопоэза (колониестимули-рующие факторы, интерлейкины, эритропоэтин). Преимущества таких лекарственных средств обусловлены их исключительно высокой активностью и возможностью целенаправленного воздействия на отдельные ростки кроветворения [Vose J., Armitage J., 1995; Varas F. e.a., 1996; Волкова M.A., Ширин А.Д., 1997; Волкова M.A., 1998; Moore M., 2002; Glaspy J., 2003]. Однако терапевтическое применение препаратов гемопоэтических ростовых факторов ограничено вследствие того, что они представляют собой дорогостоящие рекомбинантные формы цитокинов и выпускаются преимущественно за рубежом.

Одним из наиболее перспективных (для создания препаратов - стимуляторов кроветворения) гемопоэтинов оказался гранулоцитарный колоние-стимулирующий фактор (Г-КСФ). Он является линейно-рестриктированным регулятором продукции нейтрофилов и мощным стимулятором терминальной стадии их развития [Metcalf D., 1989; Williams G. e.a., 1990; Demetri G., Griffin J., 1991]. Специфические биологические свойства Г-КСФ послужили основанием для клинического применения его препаратов (нейпогена, граноцита и др.) в качестве корректоров нейтропе-ний различного генеза. В то же время не все фармакологические эффекты препаратов данного цитокина можно объяснить известными к настоящему времени механизмами его действия.

В связи с вышесказанным наше внимание привлек нейтростим, разработанный в НИКТИ БАБ ГНЦ ВБ «Вектор» и ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН, который представляет собой препарат рекомбинантного человеческого негликозилированного Г-КСФ, вырабатываемого по оригинальной технологии.

Цель исследования. Изучить механизмы гемостимулирующего действия нейтростима и оценить его фармакологическую активность в сравнении с официнальным препаратом Г-КСФ.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние нейтростима на процессы восстановления подавленного циклофосфаном кроветворения.

2. Вскрыть механизмы стимулирующего действия нейтростима на процессы подавленного грануломоноцитопоэза.

3. Исследовать изменения в системе крови интактных мышей под действием нейтростима.

4. Оценить действие нейтростима на рост перевивных опухолей.

5. Провести сравнительное изучение влияния нейтростима и нейпогена на кроветворение.

Научная новизна работы. В работе впервые проведено комплексное исследование механизмов стимуляции подавленного гранулоцитопоэза препаратом Г-КСФ. Показано, что важнейшим эффектом Г-КСФ является активация пролиферации гранулоцитарных предшественников, которую гемопоэтин осуществляет как путем непосредственного воздействия на кроветворные элементы, так и через неадгезирующие клетки кроветворного микроокружения, за счет повышения продукции последними гемопо-этических ростовых факторов. На тех этапах цитостатической болезни, когда восстановление гранулоцитопоэза протекает без усиления пролиферации клоногенных клеток, что обусловлено действием циклофосфана, под влиянием Г-КСФ повышается скорость созревания гранулоцитарных прекурсоров. Ускорение процессов дифференцировки родоначальных элементов гранулоцитарного ростка обусловлено, в свою очередь, активацией формирования гемопоэтических островков гранулоцитарного типа вследствие увеличения содержания в костном мозге предшественников стро-мальных механоцитов.

Наблюдающееся после введения препарата Г-КСФ как интактным животным, так и на фоне цитостатика, повышение числа циркулирующих лимфоцитов, моноцитов и эритроцитов обусловлено их миграцией из костного мозга и носит кратковременный характер.

Обнаружено, что препарат Г-КСФ не только не стимулирует развитие перевивной опухоли (карциномы легких Льюис) при курсовом введении, но и оказывает ингибирующее влияние на ее рост, а также усиливает противоопухолевый и антиметастатический эффекты циклофосфана.

Практическая значимость. Проведенные исследования продемонстрировали высокую эффективность нейтростима, нового оригинального отечественного препарата Г-КСФ производства НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ «Вектор», в качестве стимулятора кроветворения как у интактных мышей, так и в условиях цитостатической миелосупрессии. Экспериментально установленные изменения картины костного мозга и периферической крови под действием нейтростима и механизмы, лежащие в их основе, практически идентичны таковым при применении препарата сравнения нейпоген («Hoffman-la Roche»), разрешенного для использования в онкологической практике. Этот факт позволяет рекомендовать нейтростим для коррекции изменений в системе крови, возникающих при химиотерапии злокачественных новообразований.

Полученные данные могут явиться основой для проведения исследований по дальнейшему изучению возможности использования нейтростима с целью лечения лейкопений различного генеза, а также некоторых негематологических заболеваний дегенеративного характера.

По материалам работы подготовлен отчет об изучении специфической активности нейтростима в качестве гемостимулятора для представления в Фармакологический комитет Министерства здравоохранения и социального развития РФ.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на VIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001), II объединенной научной сессии СО РАН и СО РАМН (Новосибирск, 2002), II съезде Российского научного общества фармакологов (Москва, 2003), III международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 4 в центральных журналах; получен патент РФ на изобретение «Средство, стимулирующее грануломоноцитопоэз при гипопластических состояниях кроветворения».

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 6 рисунками и 14 таблицами. Библиографический указатель включает 273 источника, из них 79 отечественных и 194 иностранных.

выводы

1. Введение мышам нейтростима на фоне цитостатической миело-еупресеии приводит к стимуляции процессов восстановления, преимущественно, гранулоцитарного ростка гемопоэза, как на уровне его центрального, так и периферического звеньев.

2. Эффект нейтростима во многом обусловлен непосредственной активацией пролиферации гранулоцитарных предшественников, а в условиях ее отсутствия - ускорением созревания соответствующих элементов.

3. Существует опосредованный путь реализации гемостимулирую-щей активности препарата Г-КСФ, заключающийся в стимуляции функциональной активности клеток гемопоэзиндуцирующего микроокружения (повышение содержания в костном мозге предшественников стромальных механоцитов, активация образования гемопоэтических островков, преимущественно, гранулоцитарного типа, стимуляция секреции гемопоэтических ростовых факторов).

4. У интактных мышей препарат Г-КСФ вызывает выраженную активацию гранулоцитопоэза. Кратковременное повышение числа циркулирующих лимфоцитов, моноцитов и эритроцитов обусловлено их миграцией из костного мозга.

5. Нейтростим оказывает ингибирующее влияние на рост перевивной опухоли (карцинома легких Льюис), а также усиливает противоопухолевый и антиметастатический эффекты циклофосфана.

6. Экспериментально установленные изменения картины костного мозга и периферической крови под действием препарата Г-КСФ нейтростим (производства ГНЦ ВБ «Вектор») и препарата сравнения нейпоген («Hoffman-la Roche»), вводимых на фоне цитостатической миелосупрес-сии, как и механизмы, лежащие в их основе, практически одинаковы.