Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Исследование механизмов нарушения кальциевого гомеостаза в нейронах при токсическом воздействии глутамата

1 I ¿3 л , 1

- 6 ¡/.¿Г:

На правах рукописи

ФАЮК Дмитрий Александрович

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ НАРУШЕНИЯ КАЛЬЦИЕВОГО ГОМЕОСТАЗА В НЕЙРОНАХ ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ГЛУТАМАТА

14.00.16. - Патолог ическая физиология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в лаборатории общей патологии нервной системы научно-исследовательского интститута Общей Патологии и Патофизиологии Российской АМН и в лаборатории мембранологии научно-исследовательского интститута Педиатрии Российской АМН.

Научные руководители: академик РАМН, профессор доктор медицинских наук, профессор

Г.Н. Крыжановский Б.И. Ходоров,

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор кадидат биологических наук

Р.Н.Глебов С.В.Ревенко

Ведущее учреждение:

Московский государсвенный университет им. М.В.Ломоносова

Защита диссертации состоится 1997 года в 15 часов на заседании

Диссертационного Совета Д.001.03.01 при Научно-исследовательском институте Общей Патологии и Патофизиологии Российской АМН (125315, Москва, Балтийская ул., д.8.)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан '¿¿У " <3, 1997 года.

Учёный секретарь Специализированного Совета: кандидат медицинских наук

Л.Н.Скуратовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В течение последнего десятилетия достигнут значительный прогресс в изучении механизмов повреждения клеток мозга, вызванного ишемией-гипоксией. Установлено, что лёгкая ранимость нейронов при этих патологических состояниях есть не что иное, как проявление нейротоксического действия эндогенного возбуждающего нейромедиатора, глутамата (Глу), высвобождающегося и накапливающегося во внеклеточном пространстве в период ишемии-гипоксии (Choi, Rothman, 1990; Manev et al., 1990a; Manev et al., 1990b; Meldrum, Garthwaite, 1991; Rothman, Olney, 1987).

Исследования, основанные на экзогенном применении Глу позволили более детально изучать процессы, происходящие в нервных клетках при гиперстимуляции их Глу. Механизмы, посредством которых чрезмерное Глу воздействие может вызвать повреждение нейронов, пока не совсем понятны, однако многие исследователи сходятся на том, что определяющим фактором является избыточный вход Са2+ в клетку, и стойкое повышение его концентрации в цитозоле ([Са2+],), сохраняющееся после устранения токсического Глу воздействия (Bouchelouche et al., 1988; Ciardo, Meldolesi, 1991; Dildy, Leslie, 1989; Kudo, Ogura, 1986, Kudo et al., 1987; Manev et al., 1989; Michaels, Rothman, 1990; Ogura et al„ 1988).

До сих пор остаются не установленными конкретные причины нарушения нормальной регуляции [Са2*} после токсического Глу воздействия. До недавнего времени большинство авторов считали основной причиной сохранения высокого уровня [Ca2+]i в пост-глутаматный период значительное возрастание потока Са2+ в клетку, по сравнению с состоянием покоя (Bouchelouche et al., 1989; de Erausquin et al., 1990; Glaum et al., 1990; Manev et al., 1989; Ogura et al., 1988), правда пути, обеспечивающие это, идентифицированы не были. Не была выяснена и роль в регуляции [CaH]i в постглутаматный период тех систем клетки, которые в норме обеспечивают поддержание [Са2+]* в физиологических рамках. В восстановлении [Ca2*]i после активации клетки, судя по многочисленным исследованиям, проведённым на разных типах клеток, важное значение могут иметь следующие процессы: 1) связывание Са2+ цитозольными белками, 2) захват Са2* митохондриями, 3) АТФ-зависимые секвестрация Са2+ эндоплазматическим ретикулумом, 4) выведение Са2+ через плазматическую мембрану посредством a) NaVCa2** обмена б) Са2*/Н+-насоса плазматической мембраны (см. обзор Carafoli, 1987). Однако, в конечном итоге, освобождение клетки от суммарной Са2* перегрузки может происходить только при помощи двух последних процессов. Кроме того общее количество Са2+, накопленного

как во время Глу активации, так и в постглутаматный период, возможно, один из важнейших факторов, определяющих дальнейшую судьбу клетки (Hartley et al., 1993; Eimerl, Schramm, 1994). Поэтому понятно, насколько важно для клетки, как эффективно функционируют системы, выводящие Са-+ наружу и не допускающие чрезмерного накопления Са2+ внутри клетки. Исходя из этого дальнейшее исследование механизмов регуляции [Ca2+]i в условиях нейротоксического Глу воздействия и выяснение причин, лежащих в основе её нарушения остаётся важной задачей нейробиологии.

Цель работы. Целью данного исследования было выяснение механизмов, лежащих в основе нарушения нормальной регуляции цитозольного кальция ([Саг+];) в культивируемых нейронах в результате нейротоксического глутаматного воздействия.

Основные задачи исследования.

1. Исследовать влияние токсического Глу воздействия на Са2+ проницаемость плазматичской мембраны нейрона и входящий поток Ca2t через неё.

2. Исследовать влияние токсического Глу воздействия на основные системы выведения Ca2v из клетки — Na7Ca2+ обменник и Саг+-насос нейрональной мембраны.

Научная новизна исследования. В опытах на культивируемых нейронах гиппокампа и зернистых клетках мозжечка впервые показано, что дестабилизация нейронального Ca2t гомеостаза, возникающая при гиперактивации глутаматных рецепторов (15-30 минутное воздействие 100 мкМ глутамата) обусловлена главным образом нарушением систем выведения избыточного Са2+ из цитоплазмы: Са247Н+-насоса и Na+/Ca2+ обменника нейрональной мембраны и Са2+-транспортирующей системы митохондрий. Впервые получены данные, позволяющие сделать заключение, что стойкое повышение [Са2*], в постглутаматный период ([Са2>]|-плато) не является следствием патологического возрастания входящего потока Са2* через альтерированную глутаматом нейрональную мембрану, как это до недавнего времени предполагали многие исследователи. Впервые показано, что плазмалеммальный Саг"7Н+-насос играет ведущую роль не только в поддержании низкого базального уровня [Ca2+]i, но и в механизме восстановления [Са2*], после Глу воздействия.

Теоретическая и практическая значимость. Проведённые исследования позволяют углубить существующие представления о механизмах регуляции [Са2+]* в нейронах как в физиологических, так и патологических состояниях. Результаты исследования могут найти применение в теоретической и экспериментальной патофизиологии, исследованиях по моделированию различных патологических состояний в мозге и в целом в нервной системе, связанных с нарушением ионного гомеостаза.

Положения, выносимые на защиту.

1. Пост-глутаматное [Саг+],-плато обусловлено развивающимися в течение длительного Глу воздействия нарушениями функций (ослаблением активности) основных систем клетки, участвующих в выведении избыточного Са!* из цитоплазмы — Ыа*/Са2+ обменника и Са^-насоса нейрональной мембраны, а также митохондрий.

2. Са2* проницаемость нейрональной мембраны значительно возрастает в начале Глу воздействия, затем, по мере увеличения его продолжительности, существенно уменьшается, приближаясь в пост-глутаматный период к значениям, незначительно превышающим Са2+ проницаемость в состоянии покоя.

3. Увеличение скорости накопления клетками 45Са2\ по сравнению с состоянием покоя, и после продолжительного (15-30 мин) и после короткого (2 мин) Глу воздействия обусловлено вторичной активацией ЫМОА рецепторов эндогенными возбуждающими аминокислотами.

4. Роль Ка^/Са1* обменника плазматической мембраны в поддержании базального уровня [Са1*],, а также в восстановлении [Са2+]| после Глу воздействия второстепенна в исследуемых нейронах.

5. Са2+/Н+-насос нейрональной мембраны играет ведущую роль в регуляции [Са2+]( не только в состоянии покоя, но также в механизме восстановления [Саг+], после Глу воздействия.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на межлабораторной конференции НИИ Общей Патологии и Патофизиологии (Москва, 1997), использованы в 9 научных статьях, а также представлены на 10 международных конгрессах, симпозиумах и конференциях.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментов и их обсуждения, выводов. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста и иллюстрирована 35 рисунками и 2 таблицами. Библиография содержит 192 источника, из них 190 иностранных.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Приготовление культуры гиппокампальпых нейронов мышей. Гиппокампы извлекали из мозга 17-19-дневных эмбрионов мышей линии С57 В1аск, помещали в сбалансированный солевой раствор без магния и кальция (СМРБ), и разрезали на мелкие фрагменты. После этого фрагменты инкубнровали 10-15 мин при 37 °С в 0.25% растворе трипсина в СМР5, промывали сначала в СМГБ, а по том в питательной среде

(ПС; 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 5% сыворотки плацентарной крови человека, 90% минимальной среды Игла, 600 мгЛ/о глюкозы, 0.2 ЕД/мл инсулина, 2 мМ глутамина, 10 мМ HEPES) и диссоциировали пастеровской пипеткой в 1-1.5 мл ПС. Затем суспензию центрифугировали 1 мин при 1500 об/мин. Осажденные клетки ресуспендировали в ПС. Полученную суспензию (до 5x105 кл/мл) переносили на покровные стёкла размером 22x22 мм2 (по 150 мкл на одно стекло), покрытые коллагеном с нанесённым на него поли-Ь-лизином и помещённые в модифицированную чашку Петри (Викторов, Кенарская, 1975), и культивировали СОг инкубаторе (95% воздуха + 5% СО2, относительная влажность 98%). Через 5-6 дней каждое стекло с культурой переносили в пластиковую чашку Петри диаметром 40 мм, содержащюю 1 мл ПС с добавлением арабинозинмоноцитозида (10 s М), подавляющего пролиферацию глиальных клеток, после чего помещали обратно в инкубатор для дальнейшего культивирования, продолжающегося (без смены ПС) до 3-4 недель.

Приготовление культуры зернистых клеток мозжечка крыс. Мозжечки извлекались из мозга 7-8 дневных крысят линии Wistar, промывались в CMFS и инкубировались в CMFS, содержащем 0.05% трипсина, 0.02% EDTA, 0.0004% ДНК-азы, 0.3% бычего сывороточного альбумина (БСА) и 0.8% глюкозы 15 мин при 37 "С. После инкубации мозжечки промывались в CMFS, содержащем 0.3% БСА и 1% эмбриональной телячей сыворотки, и диссоциировались пастеровской пипеткой в ПС. Суспензию центрифугировали 1 мин при 1000 об/мин. Осаждённые клетки ресуспендировали в соответствующем объёме ПС (106-5х106 кл/мл) и переносили (100 мкл) на покровные стекла размером 22x22 мм2, покрытые поли-Ь-лизином и помещённые в пластиковые чашки Петри диаметром 40 мм. Для радиоизотопных исследований ресуспендированные клетки переносились непосредственно в пластиковые чашки Петри ("Costar") диаметром 35 мм, дно которых было покрыто поли-Ь-лизином или в 24-луночные пластиковые планшеты ("Costar"), дно ячеек которых также было покрыто поли-Ь-лизином. После этого клетки культивировались в СОг инкубаторе 7-8 дней. На второй день культивирования в культивационную среду добавляли арабинозинмоноцитозид (10-5 М) для предупреждения пролиферации ненейрональных клеток.

Микроспектрофлуориметрические исследования. Перед экспериментом клетки сначала инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре (20-25 °С) в контрольном солевом растворе (CSS), содержащем 5 мкМ ацетоксиметильного эфира fura-2 (fura-2 AM, "Molecular Probe", США) и имеющем следующий состав (в мМ):

NaCl - 135, KC1 - 5, CaCI - 1.8, MgCl - 1.0, Na2HP04 - 0.6, KH2PO4 - 0.4, HEPES - 20, глюкоза - 5, pH 7.4. После этого клетки промывали CSS и выдерживали в нём 30 минут для полной деэтерификации молекул fura-2 AM и равновесного распределения между связанной и не связанной с Са1* формами молекул fura-2 (Grynkewicz et ah, 1985). Затем стекло с клетками помещали в перфузионную камеру (объём — 0.2 мл, скорость протока — 0.2-1 мл в мин), смонтированную на столике инвертированного микроскопа ("Nikon", Япония), совмещённого со спектрофлуориметром ("Spex", США). Спектрофлуориметр оснащен двумя монохроматорами и зеркальным механизмом разделения лучей и управляется компьютером. Вся система позволяет одновременно регистрировать флуоресценцию от отдельной клетки при облучении её двумя лучами света с разными длинами волн. Концентрация Са2+ определялась из отношений F340/F360 и F340/F380 (где F340, Fjgu, и F3S0 — интенсивности флуоресценции при возбуждении светом с длинами волн 340, 360 и 380 нМ соответственно) по калибровочной кривой, полученной в результате калибровочного эксперимента в соответствии с Goldman et al. (1990). Для наиболее точного определения соответствия между отношениями F340/F300 и F340/F360 и концентрацией [Са3+]; необходимо делать калибровку в каждом эксперименте. Поскольку это чрезвычайно усложнило бы весь экспериментальный процесс, а точное определение [Ca2*]i не является задачей данной методики (главное — отражение динамики), мы приводим шкалу [Са-+], только в отдельных экспериментах, ограничиваясь в остальных случаях только шкалой отношений F340/F360 или F340/F380.

Радиоизотоппые исследования. В опытах использовали 7-8-дневную культуру зернистых клеток мозжечка, выращенную в пластиковых 24-луночных планшетах или 35-мм чашках Пегри. Количество клеток в каждой лунке/чашке составляло 0.5-1.ОхЮ6. Перед экспериментом клетки промывали CSS. Исследуемый раствор, содержащий 45Са2* (2мкКи/мл), добавляли к клеткам (в каждую лунку/чашку по 0.5/1 мл) на 2 или 5 мин. Затем клетки трижды быстро промывали охлаждённым на льду (t=0 °С) промывочным раствором следующего состава (в мМ): NaCl - 154, КС1 - 5.6, NaHCCh -3.6, EGTA - 2.0, HEPES - 10, pH 7.35. После этого клетки растворяли в 0.2% растворе додецилсульфата натрия (SDS) (1 мл в каждую лунку/чашку, t=37 °С, не менее 1 часа). Аликвоты клеточного лизата из каждой лунки/чашки брали для измерения радиоактивности (0.5 мл) и для измерения белка (0.1 мл).

А

4i Глу

Глу Глу

V

10 20 30 Время (мин)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. 1. Короткие и длительные Глу воздействии: влияние на Са2+ гомеостаз нейронов.

Короткое (1-2 мин) Глу (100 мкМ, 0 М«2\ 10 мкМ глицина) воздействие, как правило, не приводило к нарушению способности исследуемых нами клеток восстанавливать базальный уровень концентрации свободного цитозольного Са2+ ([Са2+];): резкий значительный подъём [Са2*]: при добавлении Глу во внеклеточную среду сменялся быстрым восстановлением уровня [Са^], при возвращении клеток в контрольный раствор (рис.1А). Повторение коротких воздействий с интервалом в несколько минут практичски не влияло на способность клеток восстанавливать базальный уровень [Са2+]„

В отличие от этого, длительное (15-30 мин), токсическое (в данной нейрональной культуре такое воздействие приводит к не менее чем 50% увеличению количества погибших через 4 часа клеток (Апс1гееуа е1 а1., 1991)) Глу воздействие часто вызывало стойкое увеличение [Са2*]„ достаточно долго сохраняющееся и после прекращения воздействия, так называемое "Са2+-плато" (рис.1 Б). Такое полное отсутствие восстановления [Са2*], наблюдалось не во всех клетках. Иногда в постглутаматный период происходило снижение [Саг+} до уровня, заметно превышающего базальный (рис.1 В). Степень восстановления варьировала от клетки к клетке.

10 20 30 40 Время (мин)

В

10 20 30 Время (мин)

40

Рисунок 1. Динамика [Ca2*], в культивируемых нейронах при (А) коротких (1-2 мин) и (Б,В) длительных (20 мни) воздействиях Глу (100 мкМ).

2. Са2+-проницаемость плазматической мембраны и входящий поток Са2* через неё в

покое, во время Глу воздействия и в пост-глутаматный период.

2.1. Исследование динамики Рея с помощью спектрофлуориметрического метода.

Использование попов Мп:* для исследования СаЛ -проницаемости плазматической мембраны. Мы использовали способность ионов Мп2+ проникать в клетку по

различным Сап-проницаемым ионным каналам (см. обзор Tsunoda, 1993), и прочно связываться с кальциевым флуоресцентным зондом fura-2 (сродство его к Мп!* в 40 раз больше чем к Са2*) с образованием нефлуоресцирующего комплекса, для оценки относительной величины проницаемости плазматической мембраны для двухвалентных ионов (Mason et al., 1991; Tsunoda, 1993), измеряя скорость, вызванного Мп2\ гашения флуоресценции (СГФ) на различных этапах эксперимента. Учитывая, что кинетика гашения определяется конкурентным взаимодействием в цитоплазме ионов Мп2+ и Са2+ с молекулами зонда, мы провели теоретический анализ зависимости СГФ от [Ca2+]¡ при данной концентрации Мп2* в наружном растворе и проницаемости мембраны для Мп3* (Рмп); при этом Рмп была принята пропорциональной Рса. С помощью кинетической модели реакции конкурентного связывания ионов Мп2+ и Ca2v с молекулами fura-2 было показано, что СГФ можно использовать как величину, линейно отражающую поток ионов Мп2+, только в случаях, когда [CaH]¡ не подвержена значительным изменениям, например, в покое или во время Са2+ плато. Например, возрастание (Са2*], от 100 до 1000 нМ при неизменных значениях наружной концентрации Мп2+ и Рса уменьшает скорость реакции образования комплекса Mn2t'fura-2 (а значит и СГФ) примерно в четыре раза. Мы проводили измерение СГФ при длине волны возбуждающего света 360 нм, при которой флуоресценция не зависит от [Ca2+]¡, и определяется только концентрацией зонда (так называемая изобестическая точка).

Кроме того, в серии предварительных экспериментов, в которых мы применяли Мп2+ один раз, добиваясь полного гашения флуоресцентного сигнала в условиях, когда [Ca2t]i заметно не изменялась, было показано, что падение флуоресцентного сигнала примерно до половины его исходного значения происходит практически линейно. Такой характер гашения, на наш взгляд, позволяет сравнивать "марганцевые пробы", многократно сделанные на протяжении одного опыта, при условии, что суммарное падение флуоресценции в течение всего опыта было не более чем наполовину от исходного сигнала. Значения СГФ мы получали непосредственно из экспериментальных кривых динамики флуоресценции клетки следующим образом. На участке гашения при помощи компьютера рассчитывали среднюю скорость падения флуоресцентного сигнала, поделив разницу значений интенсивности флуоресценции между моментами окончания и начала применения Мп2* на время, в теченеие которого происходило гашение, выражая её в относительных еденицах светового потока в секунду. При многократном применении Мп2+ в опыте, максимальная величина СГФ принималась за еденицу, остальные значения выражались в долях единицы относительно максимальной величины СГФ в данном опыте.

Изменение скорости Мпг*-индуцированного гашения флуоресценции (СГФ) 60 время глутаматпого (Глу) воздействия. Применение глутамата (или NMDA) вызывает значительное возрастание СГФ, По сравнению с состоянием покоя. Во всех случаях (п=21) Глу воздействие вызвало многократное (в 3-7 раз) возрастание СГФ, по сравнению с базальным значением, измеренным перед применением Глу. Поскольку возрастание СГФ сопровождалось значительным подъёмом [Ca2+]¡, мы полагаем, что истинное увеличение Рм„ (а значит и Рса). вызванное Глу, значительно превышает наблюдаемое возрастание СГФ. Данное наблюдение согласуется с результатом, полученным в электрофизиологических исследованиях (Mayer, Westbrook, 1987), прямо показавших, что нейрональные NMDA каналы проницаемы для Мп2+. Однако по мере увеличения продолжительности Глу воздействия СГФ снижалась в несколько раз (рис.2). Все эти данные позволили нам интерпретировать наблюдаемое снижение СГФ в течение Глу воздействия, как результат уменьшения входящего потока Мп2+. Поскольку в этих условиях плазматическая мембрана постоянно деполяризована (Coulter et al., 1992), снижение СГФ можно объяснить только уменьшением Рмп (а значит и Рса).

Прекращение Глу (или NMDA) воздействия приводило к дальнейшему снижению СГФ, вследствие закрывания (деактивации) Глу-активируемых каналов (рис.2). При этом величина СГФ, измеренная в пост-глутаматный период (СГФпг), когда [CaH]¡ оставалась на высоком уровне ([Саг']г"плато"), была существенно меньше, чем при измерении, предшествующем активации (СГФ*). Такое снижение СГФпг по отношению к СГФК наблюдалось не только в экспериментах, где Мп2+ применяли многократно, но также и в тех случаях (п=!2), в которых СГФ измеряли только два раза: в покое (СГФк) и в пост-глутаматный период (СГФпг).

Мы показали также, что снижение СГФ в течение продолжительного (15-20 мин) Глу воздействия практически полностью устраняется при удалении Са2+ из Глу-содержащего раствора. Поэтому было сделано заключение, что рассматриваемые изменения СГФ (при нормальной концентрации Са2+ в наружном растворе) отражают

1.3 1.2

г 11 1 1.0

^ 0.9

0.8

0.7-

-Глу

027

10

20 30 40 50 Время (мин)

60

Рисунок 2. Динамика [Са2*], (отношение Fíjo/Fj») и изменения СГФ (относительные величины) в опыте на зернистой клетке мозжечка.

U-

медленную Са2+-зависимую десенситизацию (инактивацию) NMDA каналов, в результате возрастания [Са2+],, вызванного Глу.

Падение чувствительности [Са2* ], к удалению наружного Са2+ после длительного глутаматного воздействия. В гиппокампалышх нейронах до Глу воздействия наблюдались спонтанные осцилляции [CaJ*]i (рис.ЗА), которые как известно (Ogura et al., 1987) связаны с эпилептиформной электрической активностью данной культуры клеток. Смена контрольного раствора на

бескальциевый сразу же устраняла осцилляции и приводила к снижению [Са1+](- Такая чувствительность осцилляции к уборке наружного Са24" вполне понятна, так как каждый всплеск [Са2*]| — результат входа Са2* через открытые глутамат-активируемые и потенциал-зависимые Са2+-каналы (С^ига е! а]., 1987). Уборка наружного Сан в первые минуты Глу воздействия также приводила к достаточно быстрому и ярко выраженному снижению [Са2+], (рис.ЗБ). В отличие от этого, в постглутаматный период высокое [Са2+](-плаго, как правило, лишь очень слабо изменялось при уборке наружного Са2+ (рис.ЗА.Б). Таким образом, высокий уровень [Са2+], в постглутаматный период не зависит от наружного Са2\ что противоречит предположению о значительном усилении в этих условиях входящего потока Са2*.

2.5 2.0 1.5 1.00.5-

1.2

1.0

0.8

OQaf

10

20 30 40 Время (мин)

50 60

- ОСа2*

Глу

0 10 20 30

Время (мин)

Рисунок 3. Эффекты удаления Са2> {0 Са2\ 50 мкМ EGTA) m наружного раствора на [Ca-'*]i до, во время и после длительного (15 мин) Глу (100 мкМ) воздействия в отдельных нейронах культуры пшпокампа (А) II мозжечка (Б).

2.2. Опыты с 45Са2*.

Скорость накопления 4!Са2* в течение длительного Глу воздействия и в постглутаматный период. Добавляя ^Са2* во внеклеточную среду на одинаковые отрезки времени на различных этапах эксперимента, мы отслеживали изменение входящего потока Са2+ по изменению количества накопленного клетками за одно и то

же время изотопа (=скорость накопления). Полученные результаты суммированы в таблице I.

Таблица 1. Скорость накопления 45Са2* (1Жа.) в культивируемых зернистых клетках мозжечка крыс на разных этапах Глу воздействия и постглутаматного периода. Во всех опытах каждое значение — результат усреднения значений UR.cs, полученных в 5-6 отдельных чашках/лунках с сестринскими нейрональными культурами.

№ опыта .; ;Гяутаматное воздействие . • г Посц-лутаматный период Отношение иЯса на данном этапе опыта к (Же»

в состоянии покоя / в начале Глу воздействия

1. . 0'- 5' 6.80** 15'- 20' -3.47* /0.51 25'- 30" 3.16*/0.46

2. о-- 2' 7.97** 15'-¡7' 3.44/0.43 ••■" 30'-32' 3.57/0.45

3. Т; •;•':: 7.26** . . 15'- 17' 4.77* / 0.66 30-- 32* 4.12* /0.57

4. И-'З*' 5.45** . : ; ¡5'- 17' , 3.84* / 0.70 15'- \7 1.35*/0.25

5. ТГ '. '""-V 30'- 32' 3.46** - 5'-7.' 1.63 . 15'- 17 1.65

6. 30'- 32' 3.89** Г-3'/.': 2.01 15'-17' • 1.80

* статистически достоверное различие (р<0.01) между данными значениями (в одном опыте)

** статистически достоверное различие (р<().01) с другими значениями (в одном опыте)

Скорость накопления изотопа изменялась в течение Глу воздействия и в постглутаматный период таким же образом, что и СГФ. Возрастая в первые минуты Глу воздействия примерно в 5.5-8 раз, скорость накопления изотопа в постглутаматный период лишь в 1.5-2 раза превышает уровень покоя.

■ Таким образом, данные, полученные при помощи трёх различных методических подходов, согласованно свидетельствуют о том, что в течение длительного Глу воздействия и после его окончания поток Са2+ в клетки значительно снижается, по сравнению с началом активации. Несмотря на это, [Саг+]| может удерживаться всё это время на высоком уровне плато.

Скорость накопления 45Са2+ в постглутаматный период после короткого Глу воздействия. Пытаясь выяснить причины различий в способности нейронов восстанавливать базальный уровень [Са2*], после короткой и длительной активации Глу рецепторов (см. рис.)), мы оценили поток Са2* внутрь клеток при помощи метода меченых ионов также и после короткого Глу воздействия. В этих экспериментах 45Са2+ добавляли в инкубационный раствор на 5 минут сразу же после быстрой (15-20 секунд)

промывки культуры клеток от Глу. В среднем URca в посттлутаматный период была з 2.20±0.16 раза выше, чем в состоянии покоя (суммированы результаты 8 опытов, в каждом из которых было использовано по 6 чашек/лунок на пробу). Если сравнивать их с теми, что получены при длительном Глу воздействии, то можно заключить, что возрастание захвата после короткого Глу воздействия в среднем было, по крайней мере, не меньше чем после длительного. Дальнейшие эксперименты показали, что причиной увеличения захвата 4iCa2t" в постглутаматный период является вторичная активация НМДА рецепторов эндогенно выделяющимися возбуждающими аминокислотами. Добавление во внеклеточную среду конкурентного антагониста НМДА рецепторов АР-5 (200 мкМ) вместе с изотопом снижало скорость накопление изотопа клетками практически до уровня контроля. Несмотря на это, способность клеток восстанавливать базальный уровень [Ca2+]j после короткого и после длительного Глу воздействия радикально отличается. Этот факт служит ещё одним свидетельством в пользу предположения, что в основе дестабилизации Са2* гомеостаза нейронов после токсического Глу воздействия лежит нарушение нормальной работы систем клетки, обеспечивающих регуляцию [Са2*}.

3. Роль различных Са2+-гомеостатических систем клетки в регуляции [Са2+], во время и

после Глу воздействия. 3.1. Роль NaVCa2* обменника и Са27Н*-насоса плазматической мембраны в поддержании базального уровня [Са2*], и его восстановления после коротких глутаматных воздействий.

Известно, что Са2*-насос нейроналъной мембраны обменивает внутриклеточный Са2+ на внеклеточные протоны используя при этом энергию АТФ (Tsukamoto et al., 1991; Thevenod, Schulz, 1988; Niggly et al., 1983; Thomas, 1993). Поэтому подщелачивание наружной среды до 8.5-9.0 единиц рН ингибирует выведение Са2+ из клетки (DiPolo, Beauge, 1988). В наших опытах повышение рН контрольного раствора до 8.5-9.0 в 60% случаев (п=37) вызывало небольшое обратимое увеличение базального [Са2+]| (рис.4А,5Б). Если же защелачивание внеклеточной среды производилось сразу после короткого (1-2 мин) Глу воздействия, то это всегда (п=31) приводило к поразительной задержке восстановления [Са2'*], (рис.4Б). Исходя из этих данных, было сделано заключение, что Са2*/Н+-насос нейроналыюй мембраны играет основную роль не только в поддержании низкого базального [Ca2t]i, но и в процесе восстановления [Ca2+]i после Глу воздействия.

В отличие от Са2т/Н+-насоса, ~На*/Са2* обменник нейрональной мембраны играет по-видимому лишь вспомогательную роль как в поддержании базального [Са2*]„ так и в выведении Са2* из нейрона после коротого Глу воздействия. Так, блокирование Ыа+о/Са2+|-обмеиа при замене Ыа* в наружном растворе на 1Л+ в условиях нормального функционирования Са27Н*-насоса обычно не изменяло (в 23 из 31 опыта) базальный уровень [Са2+1 (рис.4А). И лишь при ингибировании Са2*/Н+-насоса повышением рН0 до 8.5 блокада Ка%/Са2+к>бмена приводила к хорошо выраженному дополнительному возрастанию [Са2+], (рис.4.А). Замена К'аг в наружном растворе на после короткого Глу воздействия существенно не отражалась (в 11 из 14 опытов) на процессе восстановления [Са2*]; (рис.4В).

700 О

В

Оу

10 20 Время (мин)

о

Ц*

Ггу

10

Время (мин)

10 20 Время (мин)

Рисунок 4. Эффекты блокирования Ка+&/Са2+, обмена (замена Ка* в наружном растворе на 1л+) и Са3*-насоса (повышение рНо до 8.5) на базаяшнй уровень [Са2*], (А) II процесс восстановления [Са-ч в нейронах после короткого Глу (100 мкМ, 1 мни) воздействия (К,В).

20

3.2. Роль ЫаУСа2* обменника и Са2*-насоса плазматической мембраны в регуляции [Саи]| посте длительного Глу воздействия.

В подавляющем количестве экспериментов (в 19 из 22) замена На+ на 1Л+ или ЫМБО во время промывания клеток после токсического Глу воздействия не отражалась на динамике [Са2*]*. Причём независимо от того, имело ли место в этот период частичное восстановление [Са3+|1, или же [Са2+]| оставалась на уровне, достигнутом в период действия Глу (рис.5А;6А). Судя по всему, в постглутаматный период >1а+/Са2+ обменник, не вносит существенного вклада в выведение Са2+ из клетки. Это может происходить по следующим причинам. Во-первых, показано, что во время Глу активации нейронов в цитоплазме возрастает не только [Са2+]1 но и [Ш*} (Юеёгошзк! е1 а!., 1994Ь; РшеНэ е1 а!.. 1994), что резко снижает трансмембранный Ыа+

градиент — основную движущую силу, определяющую направление работы обменника. Во-вторых, есть данные, что после токсического Глу воздействия плазматическая мембрана нейрона остаётся в значительной степени деполяризованной (Coulter et al., 1992), а потенциал на мембране — второй важный фактор, определяющий работу Na7CaJ* обменника. Так что есть все основания полагать, что в постглутаматный период роль Na7CaJ* обменника в выведнии Ca2t из клетки не велика. Похоже также, что и NaVCa2*0 обмен также не значителен, так как удаление наружного Са2+ не приводит к снижению [Ca2,]i в постглутаматный период, а эффект возрастания скорости накопления клетками ^Са2* в постглутаматный период практически полностью снимается применением антагониста NMDA каналов.

А

Б

3.0, 2.5

LL

1 1-5

и.

1.0 0.5

NMDG

NMDG

10 20 30 Время (мин)

РУГ

2.5,

2.01 1.5 1.0 0.5;

8.5

7.4

Ггу

10 20 30 40 Время (мин)

50

Рисунок 5. Ни удаление Иа* (замена на ЫМОО) ии повышение внеклеточного рН (до 8.5) в наружном растворе не влияло на уровень постглутаматного [Са>]|-плато.

NMDG

NMDG

10 20 30 40 Время (мин)

2.5

2,0

е- is

1.0

0.5

10

20 30 40 Время (мин)

50

Рисунок 6. Различие эффектов удаления Ка4 (замена на NN100) (А) н повышения рН (Б) в наружном растворе на [Са3*], в триод её частичного восстановления после длительного (15-20 мин) Глу (100 мкМ) воздействия.

В отличие от эффектов без-Na"* среды, эффекты повышения рНо зависели от того, происходило ли восстановление [Ca2+ji после прекращения Глу воздействия. Если [Ca2+]i оставалась во время отмывания без изменения, то щелочной раствор не вызывал существенного подъёма [Ca2t]i (рис.5Б). Если же в постглутаматный период имело место частичное восстановление [Са2+],, то эффект повышения рНо проявлялся в ярко выраженном обратимом Саг*-зависимом увеличении [Са2+], (рис.бБ).

Такое различие, скорее всего, связано с тем, что Са2+-насос в тех клетках, в которых восстановления [Ca2+]i не было, так же как и NaVCa2* обменчик, в значительной степени угнетён, и что, собственно, именно это и является причиной неспособности клетки восстанавливать базальный уровень [Са2+], после токсического Глу воздействия. Такое объяснение хорошо согласуется с данными о том, что после продолжительной активации нейронов ВАК снижается уровень АТФ в цитоплазме (Богачёв и др., 1992), что естественно ингибируег Сап-насос, являющийся Са2+-АТФ-азой. Кроме того, снижение концентрации АТФ уменьшает чувствительность Ма+/Са1+ обменника к Ca2+i (DiPolo, Beauge, 1988). Установлено также, что в этих условиях происходит снижение цитоплазматического рН (Hartley, Dubinsky, 1993; Irwin et al, 1994), что также ингибирует работу и Са;'-пасоса, и Na*VCa2+ обменника (обзор DiPolo, Beauge, 1988). Таким образом, всё говорит за то, что в период постглутаматного [Ca2+ji плато работа обеих систем, способных обеспечивать выведение Ca2v из клетки, если не полностью, то в значительной степени ингнбирована.

2.4. Эффекты бепредила.

Первоначально бепредил был применён в наших опытах в качестве блокатора NaVCa1+ обменника плазматической мембраны (Kaczarowski et al., 1989; Stys et al., 1992). Исследование показало, однако, что эффекты бепредила не могут быть объяснены только его блокирующим действием на NaVCa2+ обменник. Это побудило нас более детально изучить влияние этого вещества на Ca2t гомеостаз нейронов.

Примерно в половине случаев (в 14 из 26) применение бепредила (50 мкМ) в состоянии покоя никак не влияло на уровень [Ca2+]i, В остальных опытах имело место различной степени выраженности обратимое повышение. Применение бепредила в период Глу воздействия всегда приводило к дополнительному обратимому повышению [CaI+]i (рис.7 А).

В постглутаматный период эффекты применения бепредила строго зависели от характера динамики (Ca2*]i в этот период. Применение бепредила вызывало новое увеличение [Ca2+]i, иногда даже превышающее первоначальное, вызванное Глу, в тех

клетках, которые проявляли способность частично восстанавливать [Са2+], после Глу воздействия (рис.7А,Б). Однако, в случае, если восстановление было практически полным, эффект бепредила уже не проявлялся.

В тех же клетках, в которых [Са2^ оставалась на высоком уровне плато после прекращения Глу активации, применение бепредила или не давало дополнительного подъёма [Са2+]| (п=9), или приводило к очень небольшому его увеличению (п=3).

10 20 30 40 50 Время (мин)

20 30 40 50 Время (мин)

Рисунок 7. (А) Влияние бепредшм (50 мкМ) на [Ся2+], в состоянии покоя, во время Глу воздействия и в период восстановления [Са24], после глутаматного воздействия. (Б) Сравнение в одном опыте эффектов удаления Ыа* (замена на КМОС) и применения бепредила в период восстановления [Са2*], после глутаматного воздействия.

Во многих экспериментах мы сравнивали в постглутаматный период эффекты бепредила и удаления наружного Na+. В период восстановления [Са2>], после длительного Глу воздействия удаление Na+ (замена его на NMDG или Li*) иногда проявлялось лишь в задержке восстановления. Применение же бепредила приводило к быстрому увеличению [Са2+], до высокого уровня (рис.7Б). Таким образом, в условиях, когда блокирование Na+/Ca2+ обменника в прямом режиме при удалении наружного Na+ не влияло на [Ca2+]i, бепредил оказался очень эффективным агентом, что не оставляло сомнений в том, что это соединение действует не только на Na'/Ca2* обменник, но и на другие системы клетки, активно участвующие в регуляции [Са2+], при Са2* перегрузке в результате Глу воздействия.

В литературе имеются данные о блокирующем действие бепредила на Са2+/Н+-насос плазматической мембраны (Raess, Record, I990) и на процесс дыхания в митохондриях (Matlib, 19S5; Younes et al., 1977). Мы предположили, что наблюдаемые нами эффекты бепредила могут быть в значительной степени обусловлены блокирующим действием этого соединения на процесс потенциал-зависимого захвата Са2+ митохондриями. С целью проверки этого предположения мы исследовали влияние

бепредила на митохондриальный потенциал при помощи флуоресцентного красителя родамин-123 (Duchen, Biscoe, 1992). В заряженных родамином-123 нейронах бепредил (50 мкМ) вызывал усиление флуоресценции этого зонда (рис.8), что свидетельствует о деполяризации внутренней мембраны митохондрий, в ке меньшей степени, чем блокатор дыхания NaCN (5 мМ). Таким образом, бепредил эффективно

деэнергизирует митохондрии.

Из этих результатов следует, что наблюдаемые нами эффекты бепредила на [Ca2+]¡ обусловлены комплексным блокирующим действием этого химического соединения на разные процессы, определяющие Са2+-гомеостаз нейронов, включая выведение Са2+ Na+/Ca2+ обменником и С а2+/Н* насосом плазматической мембраны и захват Са2+ митохондриями.

Полученные недавно в нашей лаборатории данные (Khodorov et al., 1996) свидетельствуют, что способность неГфОнсв восстанавливать [Ca2+]¡ после токсического Глу воздействия хорошо коррелирует со степенью деполяризации митохондрий в период Глу воздействия. Чем значительнее деполяризация — тем выше уровень [Ca2+]¡ в постглутаматный период. Учитывая это, легко объяснить различие эффектов бепредила в состоянии покоя и в постглутаматный период при частичном восстановлении [Ca2+]¡. В покоящейся клетке митохондрии, судя по всему, не содержат значительное количество Са2\ Поэтому применение бепредила в состоянии покоя вызывало лишь слабое повышение [Ca2+]¡. Тот факт, что применение бепредила в период частичного восстановления [Ca2tj¡ после длительного Глу воздействия приводит к новому увеличению [Са2*]| свидетельствует о том, что в этом случае митохондрии не подверглись сильной деполяризации во время Глу воздействия и Са2+/Н+-обменник был лишь частично инактивирован. Митохондрии при неполной деполяризации не только сами способны поглощать Са2+ из цитоплазмы, но и продолжают синтезировать молекулы АТФ — субстрат для работы Са2<7Н*-насоса, что по-видимому и позволяет этой системе участвовать в регуляции [Са2+},. Участие Са2+/Н+-насоса в регуляции [Са2*], в этих условиях подтверждается опытами с повышением рНо. Поэтому даже без учёта

10 16 время (мин)

20

Рисунок 8. Влияние бепредила (Врг; 50 мкМ) и NaCN (CN-, 5 мМ) на мнтохон-дрнальный потенциал нейрона.

повышенной проницаемости плазматической мембраны для Са2+ в постглутаматный период, вызванные бепредилом блокирование Са!47Н*-обменника и ещё большая деполяризация митохондрий непременно приведут к новому повышению [Са2+]н

ВЫВОДЫ

1. Длительное глутаматное воздействие (100 мкМ, 15-30 мин) нарушает Са2* гомеостаз культивируемых нейронов, что проявляется в утрате этими клетками способности восстанавливать низкий базальный уровень цитоплазматического Са2* (Са2+]0 в постглутаматный период.

2. Стойкое повышение [Са2+]| в постглутаматный период не может быть объяснено патологическим увеличением входящего потока Са2+ через нейрональную мембрану. Это заключение основано на следующих данных: (1) [Са2+]|, сохраняющаяся на высоком уровне после прекращения Глу воздействия ("[Са2*]гплато") мало чувствительна к удалению Са2+ из внеклеточной среды; (2) проницаемость нейрональной мембраны для двухвалентных катионов, оценивамая по скорости Мп2+-индуцированного гашения флуоресценции Сига-2 в нейроне, прогрессивно снижается на фоне стойкого повышения [Са2+]| во время Глу воздействия и после его окончания; и (3) скорость накопления ^Са24 культивируемыми нейронами существенно уменьшается на протяжении длительного Глу воздействия и после его окончания, приближаясь в постглутаматный период к уровню покоя.

3. Умеренное возрастание, по сравнению с состоянием покоя, скорости накопления ■"Са2* культивируемыми нейронами после длительного (15-30 мин) и после короткого (2 мин) Глу воздействия обусловлено дополнительным притоком 45Са2+ по N¡410 А каналам, активируемым через соответствующие рецепторы эндогенно выделяющимся глутаматом. Применение в постглутаматный период конкурентного антагониста рецепторов — аминофосфоновалериановой кислоты (200 мкМ) полностью снимает этот эффект.

4. №+/Са2+ обменник плазматической мебраны нейрона не вносит существенного вклада в выведение Са2+ из клетки после Глу воздействия. На это указывает тот факт, что удаление Ыа+ из наружного раствора (замена на Ы+ или ЫМБв) в постглутаматный период мало влияет на динамику [Са2+]*.

5. Плазмалеммальный Са2+/Н*-насос играет ведущую роль не только в поддержании низкого базального уровня [Са2*]!, но и в механизме восстановления [Са2*], после Глу воздействия. Блокада Саг,/Н+-насоса, путём повышения наружного рН

с 7.4 до 8.5-9.0 существенно замедляет или даже полностью останавливает восстановление [Са2*], после Глу "удара".

6. Использование бепредила в качестве инструмента исследования природы Глу нейротоксичности показало, что наряду с блокированием Са2*-выводящих систем нейрона бепредил вызывает эффективную деэнергизацию митохондрий. Этим обусловлено то, что в случае частичного восстановления [Са2*]* после длительного Глу воздействия бепредил (50 мкМ) вызывает значительно больший новый подъём [Са2*]» чем повышение наружного рН.

7. На основании анализа результатов, полученных в данной работе, сделано заключение, что стойкая Са2+ перегрузка нейронов под влиянием токсического Глу воздействия обусловлена, главным образом, нарушением систем выведения избыточного Са2+ из цитоплазмы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Effects of a prolonged glutaraate challenge on plasmalemmal calcium permeability in mammalian central neurons. Mn2+ as a tool to study calcium influx pathways.// Int. J. Neurosci. -1997. -Vol.88, -p.215-241. -(coauth. Khodorov В., Koshelev S., Vergun O., Pinelis V., Vinskaya N., Storozhevykh Т., Arsenjeva E., Khaspekov L., Lyzhin A., Isaev N-, Victorov ]., Dubinsky J.)

2. Bepredil exacerbates glutamate-induced deterioration of calcium homeostasis, cultured nerve cell injury.// Int. J. Neurosci. -1997. -Vol.88, -p. 199-214. -(coauth. Storozhevykh Т., Sorokina E., Vinskaya N., Pinelis V., Vergun 0., Sobolevskiy, A., Khodorov B.)

3. Dramatic effects of external alkalinity on neuronal calcium recovery following a short-duration glutamate challenge: the role of the plasma membrane Ca2+/H* pump.// FEBS Letters. -1995. -Vol.371, -p.249-252. -(coauth. Khodorov В., Pinelis V., Vergun O., Storozhevykh Т.,Vinskaya N., Arsenjeva E., Khaspekov L., Lyzhin A., Isaev N., Andreeva N., Victorov I.)

4. On the origin of a sustained increase in cytosolic Ca2+ concentration after a toxic glutamate treatment of the nerve cell culture.// FEBS Letters. -1993. -Voi.324. -№3. -p.271-273. -(coauth. Khodorov В., Pinelis V„ Golovina V., Andreeva N., Uvarova Т., Khaspekov L., Victorov I.)

5. Наружный алкалоз усиливает нарушение Са2*-гомеостаза, вызываемое токсичским воздействием глутамата, в культивируемых нейронах мозжечка.// Биологические мембраны. -1996. -Т. 13. -№3. -с.236-243. -(соавт. Вергун О.В., Сторожевых Т.П., Винская Н.П., Пинелис В.Г., Ходоров Б.И.)

6. Динамика концентрации ионов кальция в культивируемых нейронах гиппокампа при гипоксии иглюкозной депривации.// Биологические мембраны. -1992. -Т.9. -№10-11. -с. 1042-1045. -(соавт. Викторов И.В., Лыжин A.A., Головина В.А., Пинелис В.Г., Ходоров Б.И.)

7. О природе "кальциевой перегрузки" нейрона после токсического воздействия глутамата.// Биологические мембраны. -1992. -Т.9. -№10-11. -с.1045-1049. -(соавт. Ходоров Б.И., Пинелис В.Г., Головина В.А., Уварова Т.М., Андреева H.A., Хаспеков Л.Г., Викторов И.В.)

8. Стойкое кальцийзаиисимое снижение иитоплазматического pH в культивируемых нервных клетках после токсического воздейчтвия глутамата.// Биологические мембраны. -1992. -Т.9. -№10-11. -с.1049-1051. -(соавт. Пинелис В.Г., Ходоров Б.И., Загулова Д., Андреева H.A., Уварова Т.М., Хаспеков Л.Г., Головина В.А., Викторов И.В.)

9. Ингибитор натрий-протонного обмена — этилизопропиламилорид (Е1РА) уменьшает кальциевую перегрузку нейрона при применении в постглутаматный период.// Биологические мембраны. -1992. -Т.9. -№10-11. -с.1051-1055. -(соавт. Ходоров Б.И. Пинелис В.Г., Головина В.А., Хаспеков Л.Г., Андреева H.A., Викторов И.В.)