Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Механизм кальцификации биоматериалов для искусственных органов (электронномикроскопическое исследование)

Минздравмедпром РФ

Научно-исследовательский институт трансплантологии и искусственных органов

На правах рукописи УДК 541.64:612.11-616.126.3-089

(

\ Васин Сергей Львович

Механизм кальцификации

биоматериалов для искусственных органов (ЭЛЕКТРОННОМИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.00.41 - Трансплантология и искусственные органы

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена

в НИИ Трансплантологии и Искусственных Органов Минздравмедпрома РФ.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор В.И.Севастьянов

Научный консультант:

кандидат биологических наук И.Б.Розанова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А.Б.Шехтер доктор биологических наук Г.П.Иткин

Ведущее учреждение:

Институт Физико-химической Медицины МЗ и МП России

Защита состоится "_" _ 1996 г. в_часов

на заседании Специализированного Ученого Совета при НИИ Трансплантологии и Искусственных Органов (123436, Москва, Щукинская, 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ Трансплантологии и Искусственных Органов

Автореферат разослан "_"_1996 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук,

профессор А.А.Писаревский

Актуальность темы

Прогресс во многих областях современной медицины связан с появлением сложных технических устройств, разработкой новых технологий и материалов. Особые требования предъявля-------------- --------

ются к материалам, используемым для изготовления имплантируемых устройств и изделий предназначенных для длительного функционирования в среде организма (системы искусственного сердца и вспомогательного кровообращения, сосудистые и клапанные протезы, офтальмологические и урологические устройства) - биостойкость, отсутствие их кальцификации. Под кальцификацией - наиболее частом осложнении на дальних сроках имплантации искусственных органов, - понимается формирование кальцийсодержащих отложений, приводящее к потере функциональных свойств протезов. Целенаправленная разработка методов профилактики этого осложнения, включая использование новых материалов и модифицирующих технологий, невозможна без понимания механизма процесса кальцификации, знания его этапов и закономерностей их протекания.

Существует два основных подхода к исследованию механизма кальцификации имплантируемых искусственных органов: 1) экспериментальное изучение механизма кальцификации биоматериалов и факторов, влияющих на склонность биоматериалов к кальцификации [Nose Y. 1981; Schoen F.J. 1988 и др.]; 2) анализ клинических данных (отдаленные результаты имплантации [Малиновский H.H. 1988; Барбараш J1.C. 1991; Bortolloti U. 1991, Дземешкевич С.Л. 1994 и др.]. Следует отметить меньшую проработанность первого направления, что приводит к преобладанию эмпирического подхода в разработках методов ингибирования кальцификации. Развитие современных методов исследования, таких как сканирующая электронная микроскопия с рентгеновским микроанализом, позволяющих получить информацию о морфологических особенностях и составе кальцийсодержащих отложений, участии клеточных компонентов крови, приводит к появлению новых данных о механизме кальцификации.

Большинство гипотез о механизме кальцификации биоматериалов признают необходимость участия погибших клеток в развитии этого процесса. Практически отсутствуют исследования взаимосвязи первичных стадий кальцификации с фор-

мированием нерастворимых отложений. Нет четкого понимания роли компонентов плазмы крови (белков, липидов) в процессе кальцификации. В связи с вышеизложенным, изучение механизма формирования кальцийсодержащих отложений на поверхности и в объеме имплантата является актуальным.

Цель работы

Целью работы являлось исследование в условиях in vitro и in vivo механизма формирования кальцийсодержащих обложений на поверхности биоматериалов без их прямого контакта с клетками методом сканирующей электронной микроскопии с энергодисперсионным рентгеновским микроанализом.

Задачи исследования

Исходя из поставленной цели, основные задачи работы сводились к следующему:

- определить необходимость участия клеток в формировании кальцийсодержащих отложений;

- провести анализ динамики формирования кальций- и фосфорсодержащих отложений при кальцификации различных биоматериалов;

- разработать неразрушающий метод количественного определения сорбированного биоматериалами кальция;

- исследовать склонность к кальцификации различных полимерных материалов, используемых при изготовлении имплантируемых искусственных органов.

Научная новизна

1. В экспериментах in vivo с использованием микропористых камер, исключающих контакт клеток с материалом, обнаружены кальцийсодержащие отложения.

2. Доказано, что формирование кальцийсодержащего белкового слоя на биоматериале является необходимым условием для зарождения и развития нерастворимых отложений гидроксиапатита.

3. Показано, что образование зародышей нерастворимых солей фосфатов кальция начинается преимущественно в глубине, а не на поверхности адсорбированного слоя белка.

4. В условиях in vivo исследована динамика формирования кальцийсодержащих отложений на биоматериалах различной приро------------

ды. Установлена связь последовательности раздельного накопления минералообразующих компонентов с химическим составом материала.

5. Обнаружено, что предадсорбция на поверхности биоматериалов комплексов, в состав которых входит альбумин, ускоряет формирование кальцийсодержащих отложений.

6. Разработан и экспериментально обоснован неразрушающий количественный метод определения кальция на биоматериалах по данным знсргодисперсиопного рентгеновского микроанализа.

Практическая значимость

Показано, что комплексное использование метода электронной сканирующей микроскопии с рентгеновским энергодисперсионным микроанализом позволяет получить качественно новую информацию о механизме начальных стадий кальцификации биоматериалов.

Экспериментальная модель имплантации образцов биоматериалов в камерах, исключающих прямой контакт с клетками, дает возможность изучать влияние гуморальных факторов и лекарственных препаратов на процесс патологической и физиологической кальцификации в условиях in vivo.

Доказано, что при исследовании процесса кальцификации in vivo необходимо учитывать влияние условий эксперимента (замкнутое пространство с замедленным обновлением среды) на количество кальцийсодержащих отложений на поверхности биоматериалов.

Разработанным количественным методом определения кальция на поверхности биоматериалов можно оценивать склонность полимерных материалов к кальцификации в условиях кратковременных (до 7 дней) испытаний in vitro.

Полученные данные о механизме формирования кальцийсодержащих отложений на биоматериалах позволяют проводить целенаправленную разработку способов ингибирования кальцификации.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были представлены на VIII Всесоюзном симпозиуме "Синтетические полимерные материалы медицинского назначения", (Киев, 1989); на семинаре фармацевтического факультета Университета штата Юта, США (Солт-Лейк-Сити, 1989); на семинаре отдела искусственных органов Кливлендской клиники, США (Кливленд, 1989); Конференции американского общества искусственных органов (ASAIO, 1991); 1-ом Всесоюзном симпозиуме "Экспериментальная сердечно-сосудистая хирургия" (Суздаль, 1991); IV Всемирном конгрессе по Биоматериалам (Берлин, 1992); V Российско-Американском симпозиуме "Системы вспомогательного кровообращения и биоматериалы" (Москва, 1994).

Публикации

Результаты выполненных исследований отражены в 13 печатных работах, опубликованных в России и за рубежом.

Место выполнения работы

Данная работа выполнялась в Институте трансплантологии и искусственных органов (директор - академик В.И.Шумаков) в Центре по исследованию гемосовместимых биоматериалов (руководитель - проф. В.И.Севастьянов). Экспериментальные исследования на животных осуществлялись совместно с Институтом сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н.Бакулева с лабораторией биопротезирования клапанов сердца (заведующий - проф. Б.А.Фурсов).

Структура работы

Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов и практических рекомендаций; содержит 25 рисунков и 6 таблиц. Указатель литературы включает 140 работ.

Содержание работы

Анализ клеточного [Nose Y. 1981; Levy RJ. 1986; Girardot M-N. 1995 и др.] и концентрационного [Anderson Н.С., 1981; Boskey A.L., 1986; Schoen FJ. 1988 и др.] подходов к описанию процесса кальцификации биоматериалов показывает, что не доказана необходимость участия клеток в инициации минерализации, нет понимания закономерностей развития этого процесса (в каком виде откладываются фосфаты кальция на биоматериале и каким образом происходит переход аморфных солей фосфатов кальция в кристаллические формы); не выявлены взаимоотношения различных факторов (природа материала, условия имплантации, состав минералообразующей среды и т.д), определяющих степень кальцификации материалов.

В основу данной работы легла схема кальцификации имплантируемых изделий, разработанная в Центре по исследованию биоматериалов НИИТиИО, согласно которой первичные стадии кальцификации рассматриваются как совокупность процессов, протекающих на границе раздела биоматериал/кровь на молекулярном и клеточном уровнях. Эта схема допускает возможность развития кальцификации биоматериалов без их прямого контакта с клетками организма.

Формирование кальцийсодержащих отложений на биоматериалах (эксперименты in vivo)

Материалы и методы

Для определения необходимости непосредственного участия клеток в кальцификации биоматериалов проведены эксперименты in vivo с использованием микропористых камер, изготовленных с применением полиэтилентерефталатных мембран (размер пор 0,56 мкм, Институт ядерной физики, Обнинск, Россия). Опорный каркас в виде цилиндра внутренним диаметром 5 мм и длиной 20 мм выполнен из фторопласта.

Образцы биоматериалов искусственного и естественного происхождения размещали в камерах, которые подкожно имп-

лантировали молодым кроликам-самцам породы Chinchilla массой 1,5 кг на срок 3, 7, 21 и 60 дней. Размер'пор камеры практически исключал возможность прямого контакта клеток окружающих тканей с исследуемыми материалами, что подтверждено данными цитологических исследований внутрика-мерного экссудата — показано наличие лишь единичных клеток.

Для определения влияния состава окружающей образцы среды на формирование кальцийсодержащих отложений использовали три группы животных, получавших различные добавки в рацион питания:

первая группа - для увеличения концентрации кальция и фосфора в крови животньш перорально вводился масляный раствор витамина D в количестве 50 ООО МЕ/(кг сут); вторая группа - для увеличения концентрации кальция получала перорально 0,5г/(кг сут) СаСЬ; третьй группа - контрольная.

Всего в экспериментах m vivo использовано 63 кролика породы ^Chinchilla.

В работе исследовали полимерные материалы медицинского назначения — силиконовая резина на основе полидиметилси-локсана (разработчик — ОКБ Кабельной промышленности, Мытищи, Россия) (CP); полиэтилен низкой плотности (ГОСТ 10354-73) (ПЭНП); полиуретан Витур (ОСТ-0533-90) (ПУ). Эти материалы являются гемосовместимыми и их физико-химические свойства изучены достаточно полно. В качестве биома-. териала естественного происхождения использовали образцы обработанного 0,625% раствором глутарового альдегида бычьего перикарда (БП), широко используемого при изготовлении протезов клапанов сердца.

Образцы пленочных полимерных материалов в виде дисков диаметром 0,7 см, толщиной 0,1-0,5 мм и образцы БП в виде квадратов размером 5x5 мм, толщиной 0,25 мм, стерилизовались у-облучением в дозе 2,5 Мрад. Камеры перед имплантацией заполняли стерильным физиологическим раствором. Каждому животному, с использованием теопенталовой анестезии, имплантировали до 6 камер и 2-3 образца без камер. После имплантации образцы отмывали физиологическим раствором и сушили на воздухе между предметными стеклами. То-копроводящее покрытие на образцах получали методом ионного напыления в течение 5-7 мин при постоянном токе 5-7 мА

на установке JFC-1100 (Jeol, Япония). В качестве напыляемого материала использовали золото или медь. Морфологический анализ отложений на биоматериалах проводили на микроскопе JSM Т-330 (Jeol, Япония). Состав отложений определялся по

данным энергодисперсионного анализа (ЭДА), проводимого-------------------

на рентгеновском энергодисперсионном микроанализаторе AN-10 ООО (Link Analytical, Англия). В зависимости от глубины анализа и состава отложений использовали ускоряющее напряжение в диапазоне от 5 до 30 кВ. Для получения картины распределения кальция и фосфора по площади использовали рентгеновское картирование в диапазонах энергий, соответствующих выбранным элементам.

Обработку спектров ЭДА проводили полуколичественным методом - по площади пика характеристического излучения и количественно - методом ZAF-P/B коррекции.

Степень кальцификации образцов определяли: полуколичественно - по наличию и величине пика характеристического излучения кальция при ЭДА всей площади образца; по частоте обнаружения кальцийсодержащих отложений на полимерных образцах; по площади, занятой кальцийсодержа-щими отложениями;

количественно - по специально разработанной методике.

Дополнительно, содержание кальция во внутрикамерном экссудате определяли флуориметрическим методом на анализаторе Corning 940 (Англия).

Участие клеток в кальцификации биоматериалов

На всех имплантированных образцах во всех группах животных обнаружены кальцийсодержащие отложения при сроках имплантации 21 и 60 дней. На рис. 1 в качестве примера приведены данные ЭДА для СР. Полученные данные указывают на возможность развития процесса кальцификации биоматериалов без прямого контакта клеток с поверхностью образца.

Х-ЯПУ1 О - Ю к«и

и I V*! 100* Рг<1«11 100* Р11М1П1П01 112« ИХ Ом!

Са 1

Витамин О

1-е -.1 3.020 к «и

Р8-23Э СЬ 912«

мемпшт Р. 6.0Р_

10.1 > 6 егс

Х-|»ЯУ« о — 10 к«и

87* Рг«*«г« _100* Р«п)»|щп0| 13> Ru.ll 99я 12*

СаСЬ

Са

«кий

1р8'239

НЕМ1»спсиг.вор

5.020 к«О

СЬ 312-

Х-РЯУ1 0—10 к«и

«IV«! 100* Рг««*г1 Р«я* I п| па!

taa.li 112« 11* Ош1

Контроль

аШМ

Са

< --'

гв-гзз 1МЕМ1■комтя,

Г>ОР

«и

312-

10.1 > 3 с«.«

Рис. 1. Данные ЭДА образцов СР имплантированных животным из различных групп (срок имплантации 60 дней)

Адгезированная на поверхности мембраны клетка может распластываться с образованием псевдоподий (рис. 2), проникающих в поры мембраны и высвобождать продукты активации в камеру, изменяя, таким образом, состав среды, в которой происходит минерализация биоматериалов.

Рис. 2. Клетки на поверхности мембраны камеры (предположительно нейтрофил)

Влияние гуморальных факторов на степень кальцификации биоматериалов

Наиболее интенсивно кальцификации развивается на материалах имплантированных животным, получавшим витамин О. На образцах материалов из контрольной группы животных отмечена самая низкая степень кальцификации. Выявлено раннее (7 дней) появление

пика кальция при анализе всей площади некоторых образцов, имплантированных животным из первой группы (витамин £)). При этом отдельные кальцийсодержащие отложения малого размера (до 2 мкм) обнаруживаются и после трех дней имплантации. Распределение их по площади образца носит случайный характер и с увеличением сроков имплантации увеличивается занятая ими площадь и их массивность (толщина).

Анализ кальцийсодержащих отложений при сроках имплантации до 21 дня выявил различия в скорости их формирования на различных материалах. Вероятность обнаружения таких отложений была выше для образцов из СР. При этом различия по группам животных сохранялись. Первоначально на поверхности всех образцов образуется слой, в котором детектируется сера и хлор (рис. 3). Этот слой был интерпретирован как отложение белка. Накопление минералообразующих компонентов на образцах происходит раздельно и исследованные материалы различаются по последовательности накопления кальция и фосфора. Так, на СР и ПЭНП первым (после 7 дней имплантации) детектируется кальций, в то время как на образцах ПУ - фосфор. Видимо, за счет мягких уре-тановых блоков происходит более активное накопление фосфора на образцах полиуретана в виде фосфолипцдов.

Морфологических различий кальцийсодержащих отложений, сформировавшихся на различных материалах, не выявлено. ЭДА участков образцов с массивными отложениями указывает на сходство их состава с ГАп, применяемым в хроматографии и использованным нами в качестве эталона сравнения.

Формирование отложений с составом близким к ГАп происходит непосредственно в слое белка на биоматериале. На это указывают проведенные морфологические исследования участков отложений при различных ускоряющих напряжениях и картирование их в рентгеновском излучении, соответствующем характеристическому излучению кальция и фосфора. На рис. 4 представлены электронномикроскопические изображения участка белкового слоя, полученные при ускоряющих напряжениях 15 и 30 кВ. Увеличение ускоряющего напряжения приводит к увеличению глубины "просматриваемого" слоя. На рис. 4 (Б) отчетливо видно появление более светлой электронноплотаой области (на рисунке указано стрелкой).

Рис. 3. Морфология (А) и состав (Б) формирующегося на поверхности биоматериалов слоя

Рис. 4. Морфология слоя белка на поверхности образцов из СР после 7 дней имплантации, снятая при ускоряющих напряжениях 15 (А) и 30(Б)кВ

Рис. 5. Картирование участка рис. 4 (Б) в рентгеновском излучении, соответствующем кальцию (А) и фосфору (Б)

Картирование данного участка в рентгеновском излучении, соответствующем характеристическому излучению кальция и фосфора (рис. 5), указывает на присутствие этих элементов именно в электронноплотном участке отложения. Дальнейший рост отложений происходит в сторону жидкой фазы, обогащенной ми-нералообразующими компонентами, что приводит к выходу их на поверхность и образованию отложений имеющих вид, показанный на рис. 6.

Рис. 6. Кальцййсодержащее отложение на СР (срок имплантации 7 дней)

Различия в кальцификации образцов, имплантированных животным из различных групп, заключаются в скорости и интенсивности появления на их поверхности кальцийсодержащих отложений. При сроке имплантации 3 дня единичные кальцийсодержа-щие отложения размером 1 -2 мкм обнаружены на образцах, имплантированных животным 1-ой группы (витамин Б). После 7-ми дней имплантации кальций детектируется только на некоторых

образцах. Но при этом обнаружены отдельные участки значительной кальцификации практически на всех образцах. Данные локального ЭДА таких участков указывают на формировние отложений близких по составу к ГАп. В образцах, имплантированных животным из второй группы (добавки СаСЬ) на этом сроке имплантации без труда обнаруживаются единичные калышйсо-держащие отложения с.различным соотношением Са/Р, в то время как в контрольной группе такие отложения редки. Для полимерных материалов, имплантированных разным животным внутри одной группы на срок 3 и 7 дней, обнаружено значительное различие в степени кальцификации образцов. Поэтому сравнительный анализ склонности к кальцификации использованных полимерных материалов было решено проводить на образцах после 21 дня имплантации, когда удается детектировать кальций со всей площади практически на всех образцах. При этом толщина отложений еще позволяет использовать ЭДА для определения их состава на полную глубину. Из-за ограничений на толщину анализируемого слоя не удалось применить количественный ЭДА к образцам БП, т.к. даже при максимально возможном ускоряющем напряжении (30 кВ) глубина анализа была меньше толщины бычьего перикарда.

Оценка склонности полимерных материалов к кальцификации 1. Общепринятым критерием сравнения склонности биоматериалов к кальцификации является измерение количества кальция, накопленного материалами в определенных экспериментальных условиях. ЭДА позволяет проводить количественное определение состава отложения с использованием метода ZAF-P/B коррекции. При этом вычисляется процентное содержание анализируемых элементов. Трудность перевода процентной концентрации, определенной методом ЭДА, в абсолютное количество вещества заключается в неизвестном значении массы анализируемого объема. Поэтому для измерения абсолютного количества кальция на образцах была разработана специальная процедура калибровки с использованием изучаемых материалов и данных количественного ЭДА. На основании проведенных исследований установлено, что силиконовая резина обладает большей склонностью к кальцификации, по сравнению с полиуретаном и полиэтиленом.

Роль органических компонентов в формировании кальцийсодержащих отложений

Анализ особенностей формирования и состава отложений на образцах, имплантированных в камерах, особенно на ранних сроках (3 и 7 дней), показал, что появлению кальцийсодержащих участков предшествует образование органической матри» цы на поверхности биоматериалов. Для выяснения роли белковых и липидных компонентов в развитии кальцификации биоматериалов были проведены эксперименты in vitro и in vivo.

Материалы

В серии экспериментов in vitro определяли влияние альбумина (СА) и жирной кислоты (ЖК) в виде пальмитата калия на адсорбцию кальция на поверхности ПЭНП из модельных сред. За основу была взята минеральная среда (МС), приготовленная на дистиллированной воде: СаСЬ - 3 мМ, КН2РО4 -2,25 мМ, КС1 - 55 мМ. Исследования проводили после инкубации образцов ПЭНП в модельных растворах в течение 1, 2, 3 и 5 суток с ежедневной сменой растворов.

В эксперименте in vivo определяли влияние предадсорбирован-ных из раствора СА и ЖК на развитие кальцификации. Образцы инкубировали в средах на основе Tris буфера в течение 120 мин. Имплантация образцов животным осуществлялась в микропористых камерах. Животные находились на диете без каких-либо добавок в рацион питания. Срок имплантации составил 21 день.

Адсорбция кальция на поверхность биоматериалов из модельных сред (эксперименты in vitro)

На рис. 7 представлены данные адсорбции кальция в относительных единицах на поверхность ПЭНП в зависимости от времени инкубации. Видно, что присутствие белковой компоненты в растворе приводит к снижению адсорбции кальция на поверхности ПЭНП. Добавки ЖК к растворам, содержащим СА, приводят к увеличению адсорбции кальция. Морфология

адсорбированного слоя, формирующегося из растворов, содержащих СА, подобна морфологии органической матрицы в

экспериментах т vivo.B этом слое обнаруживаются кальцийсо-держащие отложения.

Рис. 7. Адсорбция кальция на ПЭНП из модельных растворов по данным ЭДА (I - MC, II - МС+СА, III - МС+СА+ЖК, IV -МС+ЖК)

Влияние предадсорбции органических компонентов на формиро-шние кальцийсодержащих отложений (эксперимент in vivo)

Цанные ЭДА образцов из CP показывают, что наиболее интенсивно сальцифшсация развивается на образцах, содержавших в предад-¡орбированном слое белок.

Площадь занятая кальцийсодержащими отложениями и их тепень развития (прорастание в сторону жидкой фазы) также ущесгвенно выше на этих образцах. При этом добавление в пре-[адсорбированный слой комплексов кальция с ЖК несколько нижает степень кальцификации образцов. Это выражается в меньшении пика кальция (данные ЭДА) и частоты обнаружения формировавшихся кальцийсодержащих отложений. Аналогич-ые данные получены и для образцов БП.

Отличий в морфологических особенностях формирования кальцийсодержащих отложений на образцах с предадсорбиро-вэнными органическими компонентами по сравнению с чистыми материалами не выявлено: в слое белка происходит накопление минеролообразующих компонентов, образующих кальцийсодержащие отложения и их разрастание в сторону жидкой фазы с формированием характерных структур.

Таким образом эксперименты in vitro и in vivo показывают ведущую роль адсорбированного слоя белка в формировании кальцийсодержащих отложений. Полученные расхождения в результатах экспериментов in vitro и in vivo объясняются предложенным механизмом кальцификации биоматериалов.

Механизм формирования кальцийсодержащих отложений на биоматериалах

Формирование слоя белка, в состав которого в виде комплексов входит кальций, является, на наш взгляд, ключевым событием в развитии кальцификации биоматериалов. Естественная ограниченность времени жизни белков приведет к ситуации, когда в слое белка произойдет увеличение концентрации кальция из-за распада комплексов с белком. В результате степень пересыщения может превысить критическое значение и начнется формирование ГАп. Распределение по времени жизни адсорбированных белков носит случайный характер. Поэтому появление отдельных кальцийсодержащих отложений возможно даже при малых сроках имплантации. После двух-трех недель имплантации, когда 75-90% адсорбировавшихся в первый момент взаимодействия биоматериал/кровь белков распались, формирование ГАп должно происходить наиболее интенсивно. Именно такую динамику развития кальцийсодержащих отложений мы и наблюдали в экспериментах: отдельные кальцийсодержащие отложения обнаруживаются на сроках 3 и 7 дней, к 21 дню их количество значительно увеличивается и наиболее интенсивное минералообразование происходит после трех недель имплантации. При этом морфология формирующихся отложений (множественное зарождение кристаллов в виде отдельных частиц, нарастающих друг на друга) указывает на то, что кристаллизация проходила в сильно пересыщенном вязком

растворе с большим количеством примесей, ингибирующих рост отдельных кристаллов (полное отсутствие правильных кристаллических форм).

Положительное влияние деградированного белка на формирование кальцийсодёржащих отложений согласуется с данными по увеличению степени кальцификации материалов в среде с инактивированной сывороткой [Sawyer P.N. 1974]. Использование же обновляемой среды с белком снижает уровень кальцификации образцов в экспериментах in vitro.

Отмеченная в литературе связь локализации отложений ГАп с местами наибольших механических нагрузок в материале также может быть объяснена с позиций представленного механизма - появление микротрещин вызывает повышенную адсорбцию белков. Развитием кальцификации в слое адсорбировавшегося на биоматериале белка объясняется и зависимость скорости формирования кальцийсодёржащих отложений от места имплантации - в потоке крови и подкожном расположении. Сдвиговые напряжения в потоке снижают вероятность и скорость образования слоя необратимо адсорбировавшегося белка. В таких условиях (в потоке) отложения начнут формироваться в местах наименьших сдвиговых напряжений, например, в застойных зонах искусственных желудочков сердца, и на участках микротрещин в местах наибольших механических нагрузок, обладающих повышенной силой адгезии белка.

В результате взаимодействия белка с биоматериалом происходит конформационное изменение его молекулы, что изменяет характер образования комплексов с кальцием. При этом степень этих изменений зависит от свойств материала: CP, в отличии от ПЭНП и ПУ, вызывает значительные конформаци-онные изменения молекулы альбумина, приводящие к увеличению числа мест связывания кальция [Розанова И.Б. 1993]. Таким образом, CP должна обладать повышенной, по сравнению с ПЭНП и ПУ, склонностью к кальцификации. Проведенный сравнительный анализ этих материалов по результатам экспериментов in vivo также показал повышенную склонность CP к кальцификации.

Различную интенсивность кальцификации образцов в экспериментальных группах животных можно объяснить влиянием использованных диет на состав минералообразующей среды. Известно, что витамин D способствует всасыванию кальция и фосфора в кишечнике. Проведенные измерения концентраций кальция и фосфора в

плазме Животных после 14 дней эксперимента показали более высокое содержание кальция и фосфора для животных I группы: Са - 13,2 мг% (11,7 мг% для контрольной группы) и Р - 8,12 мг% (6,25 мг% для контрольной группы). В результате происходит увеличение степени пересыщения минералообразующей среды, что приводит к интенсификации процесса кальцификации образцов из 1-ой группы.

Таким образом, начальные стадии кальцификации биоматериалов можно представить как образование кальцийсодер-жащей белковой матрицы, за счет которой создается степень пересыщения кристаллообразующей среды выше критической, что приводит к формированию устойчивых зародышей ГАп и их росту.

Выводы

1. В экспериментах in vivo с использованием камер, исключающих контакт клеток с материалом, показано, что прямой контакт клеток с биоматериалом не является необходимым условием развития кальцификации.

,2. По данным экспериментов in vivo и in vitro установлен механизм создания критического пересыщения минералообразующей среды, необходимого для зарождения и развития нерастворимых отложений гидроксиапатита.

3. Образование зародышей нерастворимых солей фосфатов кальция начинается преимущественно в глубине, а не на поверхности адсорбированного на биоматериале слоя белка.

4. В экспериментах in vivo установлена связь последовательности раздельного накопления в слое белка минералообразу-ющих компонентов с химическим составом материала.

5. Предадсорбция на поверхности биоматериалов комплексов, в состав которых входит альбумин, способствует развитию кальцификации. Витамин D ускоряет процесс кальцификации на ранних сроках, вызывая перераспределение ионов кальция и фосфора.

6. В экспериментах in vivo показано, что силиконовая резина обладает большей склонностью к кальцификации, по сравнению с полиуретаном и полиэтиленом.

Практические рекомендации

Комплексное использование метода электронной сканирующей микроскопии с рентгеновским энергодисперсионным микроанализом позволяет получить качественно новую информацию о механизме начальных стадий кальцификации биоматериалов.

Экспериментальная модель имплантации образцов биоматериалов в камерах, исключающих прямой контакт с клетками, дает возможность исследовать влияние гуморальных факторов и лекарственных препаратов на процесс патологической и физиологической кальцификации в условиях in vivo.

При сравнении степени кальцификации биоматериалов в условиях in vivo на сроках имплантации образцов более трех недель необходимо учитывать влияние условий эксперимента (замкнутое пространство с ограниченным обновлением среды) на количество кальцийсодержащих отложений на поверхности биоматериалов.

Разработанный количественный метод определения кальция на поверхности биоматериалов позволяет проводить сравнительную оценку склонности полимерных материалов к кальцификации в условиях кратковременных (до 7 дней) испытаний в условиях in vitro.

При разработке новых способов регулирования кальцификации следует учитывать двойственную роль белков в развитии кальцификации: с одной стороны, адсорбируясь на кристалле гидроксиапатита, они замедляют скорость его роста, с другой - слой белка является фактором риска образования новых центров кристаллизации.

Наиболее перспективным направлением ингибирования кальцификации биоматериалов является воздействие на её первичные стадии, связанные с процессами адсорбции и десорбции кальцийсодержащих комплексов. В частности, эффективной представляется модификация поверхности материалов биологически устойчивыми соединениями, способными ковалентно связывать кальций, высвобождающийся из комплексов с белком.

Список опубликованных работ

1. Розанова И.Б., Васин C.JI. О возможности оценки ин вит-ро склонности биоматериалов к кальцификации. Мат-лы VIII Всесоюз. симп. "Синт. полим. мат. мед. назн.", Киев, 1989, стр. 96 -98.

2. Мищенко Б.П., Зайцев В.В., Розанова И.Б., Васин СЛ., Саломатина JI.A., Самуилова Т.А. Изучение патогенеза кальцификации биопротезов клапанов сердца в условиях эксперимента на животных. Сб.науч.трудов ИССХ им.

A.Н.Бакулева "Экспериментальная сердечно-сосудистая хирургия", Москва, 1989, стр. 77 - 80.

3. Rosanova I.B., Michenko В.P., Zaitsev V.A., Vasin S.L., Sevastianov V.I. The Effect of Cells on Biomaterials Calcification: Experiments with Diffusion Chamber. J. Bio-med.Mater.Res., 1991, 25, pp. 277-280.

4. Розанова И.Б., Васин C.JI., Зайцев В.В., Саломатина JI.A., Севастьянов В.И. Первичные стадии кальцификации и возможные способы их ингибирования. Мат-лы I Всесоюз. Симп. "Экспериментальная сердечно-сосудистая хирургия", Суздаль, 1991, стр. 106 - 108.

5. Sevastianov V.I., Rosanova I.B., Vasin S.L. The Effect of Model Medium Composition on Adsorption of Calcium (Ca) and Phosphorus (P) on Silicone Rubber Surface (SR) Trans, of 4th World Biomat. Cong., Berlin, 1992, p. 472.

6. Rosanova I.В., Zaitsev V.V., Vasin S.L., Sevastianov V.I. The Influence of Preadsorbed Ca and Ca-containing Complexes on Silicone Rubber Calcification in Animal Model. Trans.of 4th World Biomat. Cong., Berlin, 1992, p. 196.

7. Розанова И.Б., Бузулина В.П., Васин С.Л., Севастьянов

B.И. Оценка склонности биоматериалов для эндопротези-рования к кальцификации в условиях ин витро. 1-ая Международная конф. "Современные подходы к созданию эффективных перевязочных средств и полимерных импланта-тов", Москва, 1992, стр. 21.

8. Розанова И.Б., Васин C.JI., Степеренкова Е.А., Шафир Е.В., Севастьянов В.И. Механизм начальных стадий кальцификации биоматериалов. I. Молекулярные процессы начальных стадий кальцификации (эксперименты in vitro).

Биосовместимость 1994, 2, 4, стр. 177 - 195.

9. Rosanova I.B., Vasin S.L., Steperenkova E.A., Shafir E.V., Sevastianov V.I. Mechanism of the Initial Stages of Biomaterials Calcification I. Molecular Processes during the Initial Stages of Calcification {in vitro experiments). Biomaterial-Living System Interac'lon, 1994, 2, pp. 161 - 176.

10. Розанова И.Б., Васин C.J1., Саломатина Л.А., Мищенко Б.П., Зайцев И.И., Севастьянов В.И. Механизм начальных стадий кальцификации биоматериалов. II. Взаимосвязь молекулярных и клеточных факторов кальцификации биоматериалов (эксперименты in vivo). Биосовместимость, 1994, 2, 4, стр. 195 - 209.

11. Rosanova I.B., Vasin S.L., Salomatina L.A., Mishenko В.P., Zaitsev V.V., Sevastianov V.I. Mechanism of the Initial Stages of Biomaterials Calcification II. Inerrelation between Molecular and Cellular Factors in Biomaterials Calcification {in vivo experiments). Biomaterial-Living System Interaction, 1994, 2, pp. 177 - 189.

12. Бузулина В.П., Розанова И.Б., Васин С.Л., Ермакова И.П. Сорбция кальция нативными тканями in vitro. Биосовместимость, 1994, 2, 4, стр. 221 - 231.

13. Buzulina V.P., Rosanova I.В., Vasin S.L., Ermakova I.P. Calcium Sorption by Native Tissues in vitro. Biomaterial-Living System Interaction, 1994, 2, pp. 199 - 206.