Автореферат и диссертация по медицине (14.01.24) на тему:Новые подходы к созданию ксеноперикардиальных биопротезов для сердечно-сосудистой хирургии

На правах рукописи

ГЛУШКОВА ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

НОВЫЕ ПОДХОДЫ К СОЗДАНИЮ КСЕНОПЕРИКАРДИАЛЬНЫХ БИОПРОТЕЗОВ ДЛЯ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ ХИРУРГИИ (экспериментальное исследование)

14.01.24 - Трансплантология и искусственные органы

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 8 НОЯ 2012

Москва-2012

005054617

005054617

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний» Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Журавлева Ирина Юрьевна

Официальные оппоненты:

Семеновский Моисей Львович — доктор медицинских наук, профессор, заведующий кардиохирургическим отделением № 1 ФГБУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ

Муратов Равиль Муратович - доктор медицинских наук, профессор, руководитель отделения неотложной хирургии приобретенных пороков сердца ФГБУ «Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева» РАМН

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение «Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения имени академика Е.Н.Мешалкина» Минздравсоцразвития России

Защита состоится « {» ^ека^/лЯ 2012 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д.208.055.01 при ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ (123182, г. Москва, ул. Щукинская, д.1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ.

Автореферат разослан « октября 2012 г. Ученый секретарь

диссертационного совета Д.208.055.01

доктор медицинских наук, профессор Шевченко Ольга Павловна

Актуальность работы.

Для коррекции врожденных и приобретенных пороков сердца используют различные биологические протезы, изготовленные из аортального клапана свиньи и перикарда крупного рогатого скота. Наиболее распространенным консервантом для стабилизации биологической ткани остается раствор глутарового альдегида (ГА). Одной из основных причин дисфункций ГА-обработанных биопротезов является первичная тканевая несостоятельность, связанная с кальцификацией (Carrel Т, 2004). Научная гипотеза, согласно которой структурные трансформации коллагеновой матрицы под действием ГА определяют способность биоматериала к накоплению кальциевых солей, привела к замене ГА на диглицидиловый эфир этиленгликоля (ДЭЭ), что, в свою очередь, способствовало снижению риска кальцификации биопротезов клапанов сердца у взрослых пациентов. Однако у детей частота развития кальцификации остается высокой, даже при использовании эпоксидной консервации (Латыпов

A.К., 2005). Данная проблема требует поиска новых путей решения. В мировой практике известен клинический опыт применения соединений из класса дифосфонатов для антикальциевой обработки биоматериала, консервированного ГА (Webb C.L., 1988, Эльгудин Я.Л., 1992). Дифосфонаты являются аналогами пирофосфата - природного ингибитора кальция, и в иммобилизованном состоянии в значительной степени препятствуют кальцификации биоматериала (Connolly J.M., 2004). Применение дифосфонатов может оказаться перспективным для дополнительной обработки ДЭЭ-консервированного биоматериала с целью максимального подавления его кальций-связывающей активности.

По результатам клинического применения биологических протезов была отмечена различная интенсивность кальцификации биоматериалов, в зависимости от тканевой принадлежности. При реоперациях по поводу дисфункций клапаносодержащих кондуитов, имеющих в своем составе перикард, створки аортального клапана (АК) и стенку аорты, кальциевые депозиты отмечены в основном в стенке аорты, реже — в створках АК, перикардиальная часть практически всегда остается интактной (Акатов

B.C., 2002). Данный факт послужил предпосылкой для изучения возможности использования ксеноперикарда в качестве основного биоматериала при изготовлении эпоксиобработанных биопротезов клапанов сердца и клапаносодержащих кондуитов.

Использование ксеноперикарда при моделировании кардиоваскулярных биопротезов ставит перед производителями проблему точности воспроизведения каждого элемента при раскрое. Использование как стандартных режущих инструментов (скальпеля, ножниц), так и вырубных матриц приводит к отклонению от формы лекал, что усложняет процесс моделирования биопротеза. Кроме этого, возможны краевые надсечки, являющиеся негативным фактором для клапана, функционирующего в условиях длительной циклической нагрузки. В настоящее время для высокоточного раскроя различных материалов небиологического происхождения используют лазерные технологии (Вейко В.П., 2001). В связи с этим представляется перспективным

применить лазерные технологии для раскроя биологического материала.

Потенциальная устойчивость ксеноперикарда к кальцификации, выявленная в клинической практике, нуждается во всестороннем экспериментальном подтверждении. Представляется целесообразным создание клапанных биопротезов из эпоксиоб-работанного ксеноперикарда. Кальций-связывающая активность данного биоматериала может быть дополнительно снижена модификацией З-амино-1-оксипропилиден-дифосфоновой кислотой. Использование лазерных технологий может явиться перспективным подходом в разработке методов высокоточного раскроя ксеноперикарда при создании кардиоваскулярных биопротезов.

Цель исследования: обосновать в эксперименте применение новой технологии антикальциевой обработки и лазерного раскроя при изготовлении ксеноперикар-диальных эпоксиобработанных биопротезов для сердечно-сосудистой хирургии.

Задачи исследования:

1. Выполнить сравнительную оценку кальций-связывающей активности перикарда крупного рогатого скота, стенки аорты и створок аортального клапана свиньи, консервированных диглицидиловым эфиром этиленгликоля;

2. Оценить влияние иммобилизованной З-амино-1-оксипропилиден-дифосфоновой кислоты на кальций-связывающую активность эпоксиобработанных биоматериалов различной видовой и тканевой принадлежности;

3. Изучить влияние антикальциевой обработки на структуру, физико-механические свойства и гемосовместимость биоматериала, консервированного диглицидиловым эфиром этиленгликоля;

4. Оценить воздействие излучения различных лазеров на структуру биоматериала в области среза. Выбрать оптимальные параметры лазерного излучения для создания промышленной установки картирования и раскроя биоматериала.

Новизна исследования:

Впервые проведена оценка сшивающей активности диглицидилового эфира этиленгликоля в отношении стенки аорты.

Впервые проанализирована в сравнительном аспекте кальций-связывающая активность перикарда крупного рогатого скота, створок аортального клапана и стенки аорты свиньи, консервированных глутаровым альдегидом и диглицидиловым эфиром этиленгликоля.

Впервые исследован антикальциевый эффект З-амино-1-оксипропилиден-дифосфоновой кислоты, иммобилизованной на биоматериале, консервированном диглицидиловым эфиром этиленгликоля.

Впервые изучено воздействие З-амино-1-оксипропилиден-дифосфоновой кислоты на структуру, физико-механические свойства и гемосовместимость биоматериала, консервированного диглицидиловым эфиром этиленгликоля.

Впервые изучена возможность использования лазерных технологий для раскроя эпоксиобработанного биоматериала.

Впервые в мировой практике лазерное излучение применено для раскроя ксе-ноперикарда при изготовлении кардиоваскулярных биопротезов.

Практическая значимость работы. Экспериментально обоснован выбор биоматериала для изготовления кардиоваскулярных биопротезов с низкой кальций-связывающей активностью. Разработан способ антикальциевой модификации биоматериала, консервированного диглицидиловым эфиром этиленгликоля.

Определены оптимальные режимы лазерного излучения для раскроя биоматериала при моделировании кардиоваскулярных биопротезов из ксеноперикарда. На основе полученных результатов совместно с Институтом лазерной физики Сибирского отделения РАН созданы установки «МЕЛАЗ» и «МЕЛАЗ-1» для раскроя биоматериала.

Разработанные технологи антикальциевой модификации и лазерного раскроя биоматериала внедрены ЗАО «НеоКор» (Россия) в серийное производство ксенопери-кардиальных биопротезов клапанов сердца с 2008 г (Протез клапана сердца ксенопе-рикардиальный биологический консервированный монтированный на гибком опорном каркасе «ЮниЛайн» по ТУ 9444-010-57628698-2008).

Положения, выносимые на защиту:

1. Перикард крупного рогатого скота и створки аортального клапана свиньи, консервированные диглицидиловым эфиром этиленгликоля, обладают более низкой кальций-связывающей активностью, по сравнению с эпоксиобработанной стенкой аорты свиньи.

2. З-амино-1-оксипропилиден-дифосфоновая кислота в иммобилизованном состоянии достоверно снижает кальций-связывающую активность перикарда крупного рогатого скота и створок аортального клапана свиньи, консервированных диглицидиловым эфиром этиленгликоля.

3. Использование лазерного раскроя ксеноперикарда делает процесс изготовления кардиоваскулярных биопротезов более технологичным. В качестве активной среды лазера для раскроя ксеноперикарда могут быть использованы алюмоиттриевый гранат, легированный эрбием, и углекислый газ.

Публикации. По результатам диссертационного исследования опубликовано 19 работ в журналах, материалах научных съездов и конференций (из них 2 статьи в журналах, рецензируемых ВАК), а также получен патент РФ на изобретение. Список прилагается.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на Региональной научно-практической конференции с Международным участием «Актуальные проблемы сердечно-сосудистой хирургии» (Кемерово, 2006 г), где автор заняла I место на конкурсе молодых ученых с работой «Обоснование новой модели ксеноперикар-диального клапансодержащего кондуита», на XIII и XVI Всероссийских съездах сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2007, 2010 гг.), XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010 г),

Международном конгрессе «Кардиология на перекрестке наук» совместно с V Международным симпозиумом по эхокардиографии и сосудистому ультразвуку, XVII ежегодной научно-практической конференцией «Актуальные вопросы кардиологии» (Тюмень, 2010 г). Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы сердечно-сосудистой патологии» (Кемерово, 2010 г).

Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов и практических рекомендаций; содержит 3 таблицы, 31 рисунок. Указатель литературы включает 189 работ, в том числе 102 зарубежные.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В настоящем исследовании был использован биоматериал, применяемый в производстве кардиоваскулярных биопротезов: перикард крупного рогатого скота (КРС), створки АК и стенка аорты свиньи. Базовую консервацию исследуемых образцов осуществляли: 0,625% раствором глутарового альдегида (Барбараш U.C., 1995) (контрольная серия) и 5% раствором диглицидилового эфира этиленгликоля (патент РФ № 2008767).

Аминокислотный состав биоматериала, консервированного ДЭЭ (п=30) исследовали на автоматическом аминокислотном анализаторе «Hitachi-835» (Япония). Данный раздел работы выполнен в ГУ НИИФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ г. Москва (зав. отделом хроматографии, д.х.н. Л.А.Баратова).

Для антикальциевой модификации биоматериала, консервированного ДЭЭ, использовали З-амино-1-оксипропилиден-дифосфоновую кислоту (АОПДФК). Дифос-фонат синтезирован в Институте катализа им. Г.К. Борескова СО РАН (г. Новосибирск). Модификацию образцов проводили в одну и четыре стадии 0,15% раствором АОПДФК, приготовленным на 0,9% растворе хлорида натрия при комнатной температуре. При одностадийной обработке образцы помещали в раствор АОПДФК на 4 ч с последующей отмывкой от несвязанного дифосфоната и помещением в консервант. При четырехстадийной модификации образцы помещали в раствор АОПДФК на 3 ч, после чего переносили в консервирующий раствор на 12 ч. Данный процесс повторяли 4 раза, перед последним помещением в консервант образцы биоматериала отмывали от несвязанного дифосфоната.

Количество дифосфоната, иммобилизованного на биоматериале в процессе модификации в 1 и 4 стадии, оценивали микрометодом Бартлета по количеству дифос-фонатного фосфора. Для контроля использовали образцы с базовой консервацией (п=60). Оптическую плотность проб измеряли на кинетическом спектрофотометре UV/VIS Ultraspek Plus (LKB-Pharmacia) ().=830 нм). Концентрацию фосфора в пробе определяли по калибровочному графику, построенному в интервале 1-10 мкг.

Кальций-связывающую активность биоматериала, в зависимости от базовой консервации и дополнительной модификации, изучали на стандартной модели ускоренной кальцификации, путем подкожной имплантации исследуемого материала

б

крысам-самцам субпопуляции Wistar. Для сравнительного анализа антикальциевой эффективности при обработке в 1 и 4 стадии количество кальция определяли на 60 и 90 сутки после имплантации. Для оценки пролонгированного действия АОПДФК обработку биологического материала осуществляли в одну стадию. Срок имплантации биоматериала составил 60, 120 и 180 суток. Количество кальция определяли с помощью атомно-абсорбционного спектрофотометра «Perkin Elmer»-5100 (USA), расчет производили на 1г сухой ткани (п=920). Количество накопленного кальция оценивали относительно уровня неимплантированного биоматериала.

Исследования физико-механических свойств биоматериала в сравнительном аспекте после базовой консервации и антикальциевой модификации (п=200) выполнены совместно с лабораторией химии и технологии материалов для сердечнососудистой хирургии НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева (г. Москва) (руководитель лаборатории - профессор С. П. Новикова). В качестве второго контроля использовали на-тивный биоматериал. Испытания проведены на универсальной испытательной машине «Zwick/roell»-2.5H (Германия), в условиях одноосного растяжения образцов, в соответствии с ГОСТ 270-75. При оценке физико-механических свойств биоматериала учитывали показатели прочности и упруго-деформативных свойств.

Влияние модификации АОПДФК на гемосовместимость эпоксиобработанного биоматериала оценивали in vitro в сравнительном аспекте с ксеноперикардом, консервированным ГА, ДЭЭ и с эпоксиобработанным ксеноперикардом, модифицированным нефракционированным гепарином (НФГ), выбранным в качестве материала с доказанной высокой гемосовместимостью (Кудрявцева Ю.А., 2010).

Агрегацию тромбоцитов оценивали после контакта образцов с кровью в течение 3 мин. Агрегацию индуцировали раствором АДФ с концентрацией 1,25 мкг/мл. Скорость (%/мин) и максимум (%) агрегации тромбоцитов измеряли на полуавтоматическом анализаторе АР ACT 4004 (LABiTec, Германия). В качестве контроля использовали показатели агрегации тромбоцитов, не имевших контакта с поверхностью биоматериала (п=60).

Тромбогенность биоматериала оценивали по динамике пристеночного тромбо-образования, используя экспресс-метод, разработанный С.П. Новиковой с соавторами 1991г., модифицированный для плоских объектов (Кудрявцева Ю.А., 1997). Время контакта образцов с кровью составило 20, 40 и 60 мин (п=180).

Цитотоксичность оценивали по величине гемолиза, индуцированного биоматериалом. Исследуемые образцы (п=60) инкубировали в растворе 0,9% NaCl при 37°С в течение 120 мин, затем добавляли 200 мкл свежей цитратной крови, и повторно инкубировали 60 мин. После этого раствор центрифугировали и измеряли оптическую плотность раствора на спектрофотометре.

Структуру биоматериала исследовали методом световой микроскопии с окраской препаратов гематоксилином-эозином и пикрофуксином по Ван-Гизон (п=75). Ги-

стологические препараты исследовали с помощью микроскопа МИКМЕД-2 («JIOMO», Санкт-Петербург), при увеличении хЮО и х400.

Методом световой микроскопии было изучено влияние модификации АОПДФК на структуру эпоксиобработанного перикарда КРС и створок АК. Также методом световой микроскопии исследовали влияние способа раскроя на структуру биоматериала в зоне среза.

Для раскроя использовали перикард КРС, консервированный ДЭЭ. Раскрой производили стандартными хирургическими инструментами - ножницами и скальпелем, а также вырубной матрицей и лазерами с различными параметрами излучения. Использовали лазеры на алюмоиттриевом гранате, легированные неодимом (Nd:YAG) и эрбием (Er:YAG), генерирующие излучение на длинах волн 1,06 и 2,9 мкм, соответственно, и газовый углекислотный лазер (С02-лазер) с длиной волны генерации 10,6 мкм.

Обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами статистики при помощи пакета прикладных программ для обработки медицинской и биологической информации «STATISTICA 6.0» (StatSoft,Inc., USA). Все данные представлены как средние значения (М) и стандартная ошибка среднего (±т). Характер распределения определяли при помощи критерия Колмогорова — Смирнова. При нормальном распределении переменных для определения различий между двумя независимыми группами использовался t-критерий Стьюдента, а при неправильном распределении — непараметрический критерий Манна-Уитни. В случае множественных сравнений проводили попарно сравнение групп с использованием непараметрического теста Манна-Уитни, применяя поправку Бонферрони при оценке значения р. Достоверными считали различия при уровне значимости р<0,05.

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СВОЙСТВ БИОМАТЕРИАЛА РАЗЛИЧНОЙ ВИДОВОЙ И ТКАНЕВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ Сравнительный анализ аминокислотного состава стенки аорты, перикарда КРС и створок АК после консервации ДЭЭ

При консервации всех видов биоматериала с использованием ДЭЭ в поперечную сшивку белков вступают лизин (Lys), оксилизин (OH-Lys), тирозин (Туг), метио-нин (Met) и гистидин (His). Количественные характеристики сшивки коллагена для створок АК и ксеноперикарда при консервации ДЭЭ были изучены ранее (Барбараш Л.С. с соавт., 1995; Кудрявцева Ю.А. 1997). В настоящем исследовании проведен сравнительный анализ сшивки ДЭЭ-обработанной стенки аорты относительно створок АК и ксеноперикарда.

Было установлено, что в процессе консервации ДЭЭ сшивка коллагеновой матрицы в стенке аорты, так же, как в створках АК и ксеноперикарде, проходит по Lys, OH-Lys, His и Туг, однако отличается вовлеченностью каждой аминокислоты в данный процесс. Кроме того, в нативной стенке аорты содержание свободных остатков

OH-Lys и Lys в сумме меньше, а Туг - больше, чем в перикарде КРС и створках АК (р<0,05) (таблица 1).

Таблица 1.

Относительное содержание аминокислотных остатков в исследуемом биологи-

ческом материале на 1000 остатков в белке

Аминокислота Створки АК Перикард КРС Стенка аорты

Нативные ДЭЭ Нативный ДЭЭ Нативная ДЭЭ

Met 6,7±0,2 5,2±0,3 6,7±0,04 0,8±0,04 5,53±0,54 3,73±0,03

Туг 8,8±0,2 2,5±0,1 6,07±0,14 0,8±0,04 16,87±0,1 0,1±0,1

His 8,4±0,2 0,6±0,1 4,43±0,11 1,0±0,35 2,5±0,25 1,0±0,03

OH-Lys 9,5±0,2 0,4±0,04 8,67±0,36 0,53±0,08 2,5±0,06 0,93±0,12

Lys 33,5±1,2 2,3±0,5 30,0±0,13 1,07±0,06 20,53±1 0,9±0,02

По суммарному убыванию концентрации Lys и OH-Lys, как показателю эффективности сшивки, биоматериал можно расположить в следующем ряду: створки АК (95,9%) > перикард КРС (93,7%) > стенка аорты (92%). В связи с этим можно предполагать, что прочностные характеристики стенки аорты будут ниже, чем у створок АК и ксеноперикарда.

Известно, что поперечные связи с OH-Lys и Lys являются основным субстратом для образования интра- и интермолекулярной сшивки коллагена при консервации, предотвращая ферментативный лизис биоматериала после имплантации и сохраняя удовлетворительные физико-механические свойства (Барбараш JI.C. с соавт., 1995; Журавлева И.Ю. 1995).

Количественные показатели сшивки стенки аорты по His более чем в 1,4 раза уступают, а по Туг в 1,2 раза превосходят показатели сшивки по данным аминокислотам для створок АК и ксеноперикарда. Сшивка по Met характерна только для перикарда КРС.

По-видимому, качественные и количественные различия сшивки коллагена эпоксиобработанной стенки аорты, створок АК и ксеноперикарда обусловлены различным количественным соотношением коллагеновых и эластиновых волокон в составе данных видов биоматериала. Это может, в свою очередь, отражаться на трансформациях, протекающих в стенке аорты после имплантации в организм реципиента.

Сравнительная оценка физико-механических свойств биоматериала, консервированного ДЭЭ

По результатам исследования были выявлены отличия физико-механических свойств нативной стенки аорты от створок АК и ксеноперикарда, обусловленные различиями состава данных видов биоматериала (рис. 1). Прочность стенки аорты достоверно ниже, а относительное удлинение выше (р<0,05), по сравнению с аналогичными показателями створок АК и перикарда КРС. Различия по пределу прочности и относительному удлинению между нативным перикардом КРС и створками АК стати-

стически не значимы (р>0,05). Все виды биоматериала различались между собой по модулю Юнга (р<0,05). Уменьшение модуля Юнга наблюдали в ряду нативных материалов: створки АК > перикард КРС > стенка аорты.

Прочность (МПа)

Перикард Створки Стенка КРС А К" аорты

Относительное удлинение (%) 180

Модуль Юнга (Н/мм2)

Перикард Створки Стенка КРС АК аорты

крнкард Створки Стенка КРС АК аорты

Рис. 1. Физико-механические свойства биоматериала: нативного и консервированного диглицидиловым эфиром этиленгликоля (ДЭЭ). * —р<0,05 по сравнению с показателями нативного биоматериала. Ш - Нативный, 0 - ДЭЭ-обработанный

Одним из основных требований к предимплантационной химической обработке биоматериала является сохранение или улучшение его физико-механических свойств. Консервация биоматериала ДЭЭ не изменила его прочностных характеристик (р>0,05), однако оказала влияние на упруго-деформативные свойства. Относительное удлинение перикарда КРС и створок АК после консервации увеличивалось (р<0,001), а модуль Юнга уменьшался (р<0,01) относительно показателей нативного биоматериала. Для стенки аорты, напротив, после консервации наблюдали достоверное уменьшение относительного удлинения и увеличение модуля Юнга, что также связано с различиями в составе данных биоматериалов (рис. 1). Относительное удлинение и модуль Юнга являются показателями упруго-деформативных свойств, при этом снижение одного из показателей компенсируется повышением другого.

Необходимо отметить, что по результатам исследования показатель прочности и относительное удлинение эпоксиобработанного ксеноперикарда идентичны данным показателям нативных створок АК, что указывает на возможность использования перикарда КРС для изготовления створчатого аппарата биопротезов клапанов сердца.

Сравнительная оценка кальций-связывающей активности биоматериалов В работах МаБитоЮ Н. и ^Л^апаЬе Т. было отмечено, что кальций-связывающая активность различных видов ГА-обработанного биоматериала неодинакова, и процесс кальцификации протекает в них с различной интенсивностью (МаБи-тоШ Н., й а1. 2000). Патогенез кальцификации кардиоваскулярных имплантатов до настоящего времени не имеет единого теоретического обоснования. Однако количе-

ственные показатели кальцификации для ГА-обработанного биоматериала хорошо изучены клинически и экспериментально на мелких животных, в частности, крысах.

В настоящем исследовании было показано, что к 180 суткам имплантации содержание кальция в биоматериале, консервированном ГА, увеличилось более чем в 200 раз по сравнению с исходным уровнем (р<0,01), что сопоставимо с данными литературы (Mirzaie М. et al., 1999; Masumoto Н. et al, 2000) (рис. 2).

-о-Перикард ДЭЭ

- -О - Створки ДЭЭ

—Д • Стенка аорты ДЭЭ ♦ Перикард ГА

- - Створки ГА

—* • Стенка аорты ГА

60 120 180 срок имплантации (сутки)

Рис. 2. Динамика накопления кальция биологическим материалом, консервированным ГА и ДЭЭ. * —р<0,05 по сравнению с исходным уровнем кальция

В сравнении с ГА-обработанным биоматериалом, ксеноперикард и створки АК, консервированное ДЭЭ, продемонстрировали низкую кальций-связывающую активность. На 180 сутки имплантации уровень кальция в эпоксиобработанных ксенопери-карде и створках АК не превышал 5 мг/г сухой ткани (р<0,03) (рис. 2). Между образцами ксеноперикарда и створок АК на всех сроках наблюдения статистически значимых различий не выявлено.

Однако по результатам исследования отмечен высокий кальций-связывающий потенциал стенки аорты, консервированной ДЭЭ (рис. 2). По количеству накопленного кальция эпоксиобработанная стенка аорты приближалась к ГА-обработанному биоматериалу.

Оценка свойств эпоксиобработанного биоматериала, модифицированного

аминодифосфонатом

Несмотря на то, что створки АК и ксеноперикард, консервированные ДЭЭ, имеют низкий кальций-связывающий потенциал, риск развития отдаленных дисфункций, связанных с кальцификацией биопротезов, изготовленных из данных биоматериалов, сохраняется, особенно для пациентов молодого возраста. Одним из путей до-

полнительного снижения кальций-связывающей активности может служить иммобилизация ингибиторов кальцификации на биоматериале.

При антикальциевой модификации эпоксиобработанного биоматериала в одну стадию количество иммобилизованного АОПДФК составило 2,4±0,32 мкг/г, при модификации в четыре стадии - 2±0,14 мкг/г сухой ткани. Можно предположить, что на первой стадии при четырехстадийной обработке АОПДФК уже занимает все реакци-онноспособные группы, не задействованные в процессе консервации биоткани.

Уровень кальция, накопленного в перикарде КРС и створках АК, модифицированных АОПДФК в 1 и 4 стадии, к 90 суткам имплантации не превышал 1,3 мг/г сухой ткани, что достоверно ниже, чем в немодифицированных образцах (р<0,05). На протяжении всего периода наблюдения уровень кальция в модифицированных образцах не имел достоверных отличий от исходного уровня (р>0,05). Не выявлено достоверных отличий и между образцами, модифицированными АОПДФК в одну и четыре стадии (р>0,05). В связи с этим для долгосрочного исследования (180 суток имплантации) модификацию биоматериала АОПДФК осуществляли в одну стадию. В исследование была включена стенка аорты, как неотъемлемая часть биопротеза, изготовленного из аортального комплекса свиньи.

Согласно полученным результатам, в перикарде КРС и створках АК на протяжении всего периода наблюдения уровень кальция в модифицированных образцах не имел статистически значимых отличий от исходного уровня (р>0,05) (рис. 3).

7

s

св И н >к о X

>ч

■Перикард КРС (ДЭЭ)

-Перикард КРС (ДЭЭ+АОПДФК)

-Створки АК (ДЭЭ)

—л -Створки АК

(ДЭЭ+АОПДФК)

60 120 срок имплантации (сутки) Рис. 3. Динамика накопления кальция биоматериалом, консервированным ДЭЭ, с последующей модификацией АОПДФК в 1 стадию. * —р<0,05 по сравнению с исходным уровнем кальция

Однако стенка аорты, модифицированная АОПДФК, на протяжении всего исследования демонстрировала высокую кальций-связывающую активность (рис. 4). К 180 суткам имплантации уровень накопленного кальция превысил исходный в 285 раз

(р<0,01). Данный результат еще раз доказал, что в случаях высокого риска кальцифи-кации биопротеза следует отдавать предпочтение конструкциям, не содержащим в своем составе стенки аорты.

180 —«•—ДЭЭ

&1 80 -60 -2 40-

Рис. 4. Динамика накопления кальция в стенке аорты свиньи, консервированной ДЭЭ, модифицированной

АОПДФК в 1 стадию.

20 -0 *

*-р<0,05 по сравнению с исходным уровнем кальция

0

60

120

180

срок имплантации (сутки)

Таким образом, обработка аминодифосфонатом ДЭЭ-консервированного перикарда КРС и створок АК способствовала значительному снижению их кальций-связывающей активности. Однако любое химическое воздействие на биологический материал, в том числе и модификация АОПДФК, может привести к изменениям его свойств. В связи с этим были проведены исследования, направленные на изучение структуры, физико-механических и гемосовместимых свойств модифицированного биоматериала.

После консервации ДЭЭ биоматериал представляет собой ткань с полностью сохранившимися эластиновыми и коллагеновыми структурами. Этот факт имеет первостепенное значение для его долгосрочного функционирования в организме пациента. Согласно результатам настоящего исследования, модификация биоматериала АОПДФК в 1 и 4 стадии не изменяет его структуры. В модифицированном перикарде КРС и створках АК коллагеновые волокна сохраняли извитость, были расположены компактно, равномерно воспринимали краситель. В створках АК деление на слои было сохранено. Отека, разрыхления и фрагментации коллагена не наблюдали.

Модификация АОПДФК эпоксиобработанных ксеноперикарда и створок АК вне зависимости от стадийности не отразилась на прочностных и упруго-деформативных свойствах. Достоверных отличий по прочности, относительному удлинению и модулю Юнга между группами образцов, модифицированными в 1 и 4 стадии не было выявлено (р>0,05) (рис. 5).

Предел прочности (МПа) Относительное удлинение (%) Модуль Юнга (Н/мм2)

Перикард КРС

Створки АК

Перикард КРС

Перикард КРС

Створки АК

Рис. 5. Физико-механические свойства биоматериала, консервированного ДЭЭ, а так же с дополнительной модификацией АОПДФ в 1 и 4 стадии. ■ - ДЭЭ; 0- ДЭЭ+АОПДФК (1 ст.); ^ - ДЭЭ+АОПДФК (4 ст.)

Что касается гемосовместимых свойств, то биоматериал при контакте с кровью вызывал достоверное повышение скорости и максимума агрегации тромбоцитов (р<0,05), вне зависимости от способа обработки (рис. 6). Максимальные значения отмечены при контакте крови с поверхностью биоматериала, консервированного ГА. Скорость и максимум агрегации тромбоцитов при контакте с эпоксиобработанными образцами были ниже, чем при контакте с ГА-обработанными поверхностями на 20% и 24,1%, соответственно (р<0,05). Модификация образцов эпоксиобработанного ксе-ноперикарда НФГ достоверно снижала показатели агрегации тромбоцитов (р<0,05), что согласуется с литературными данными по агрегационной активности тромбоцитов после контакта с биопротезами ксеноартерий (Кудрявцева Ю.А., 2010г.).

Скорость агрегации

Максимум агрегации

100 т

контроль

12 3 4

Рис. 6. Агрегация тромбоцитов после контакта с перикардом КРС. 1 — ГА; 2 — ДЭЭ; 3 - ДЭЭ+НФГ; 4 - ДЭЭ+АОПДФК. *р<0,05 относительно контроля. **р<0,05 относительно эпоксиобработанного перикарда КРС

Было показано, что иммобилизация АОПДФК не оказывает негативного влияния на агрегационную активность эпоксиобработанного ксеноперикарда. Скорость и максимум агрегации не имеют достоверных отличий от данных показателей, индуцированных эпоксиобработанным ксеноперикардом (р>0,05).

В тесте пристеночного тромбообразования наиболее тромбогенным оказался ксеноперикард, консервированный ГА, а наименее тромбогенным — эпоксиобрабо-танный, модифицированный НФГ (рис. 7). Ксеноперикард, консервированный ДЭЭ без модификаций, занимал промежуточное положение между этими группами образцов, достоверно отличаясь от каждой из них (р<0,05).

-♦-ГА —ДЭЭ

-Л-ДЭЭ+АОПДФК -с^ДЭЭ+НФГ

20 40 60

время, мин

Рис. 7. Количество тромботических масс на перикарде КРС, консервированном ГА, ДЭЭ и эпоксиобработанном ксеноперикарде с дополнительными модификациями. *р<0,05 относительно эпоксиобработанного перикарда КРС

Иммобилизация АОПДФК не оказывала негативного влияния на тромбоген-ность ксеноперикарда, консервированного ДЭЭ. Масса пристеночного тромба на ксеноперикарде с антикальциевой обработкой была достоверно меньше, чем на ГА-обработанных образцах и достоверно больше, чем на эпоксиобработанных образцах, модифицированных НФГ (р<0,05). Между группами образцов эпоксиобработанного ксеноперикарда без модификации и модифицированного АОПДФК достоверных различий по массе пристеночного тромба не выявлено (р>0,05).

Степень гемолиза эритроцитов при контакте с биоматериалом, как показатель цитотоксичности, также является показателем гемосовместимости.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что обработка ксеноперикарда при любом виде обработки не оказывает существенного влияния на лизис эритроцитов. Степень гемолиза при контакте со всеми видами исследуемого биоматериала не превышала допустимой величины, равной 2% (Севастьянов В.И., 1999). Наименьшая степень гемолиза была выявлена при контакте с эпоксиобработанным ксеноперикардом, модифицированным НФГ (0,23±0,027%), наибольшая - при контакте с ГА-

обработанным ксеноперикардом (0,33±0,022%). Степень гемолиза при контакте с эпоксиобработанным ксеноперикардом составила 0,29±0,022%, при контакте с эпоксиобработанным ксеноперикардом, модифицированным АОПДФК -0,27±0,025%. Между данными группами образцов не выявлено достоверных различий (р<0,05) по степени индуцированного биоматериалом гемолиза.

Таким образом, можно сделать вывод, что эпоксиобработанный ксеноперикард обладает большей гемосовместимостью, чем ксеноперикард, консервированный ГА. Дополнительная модификация НФГ повышает гемосовместимость эпоксиобработан-ного ксеноперикарда, в то время как иммобилизация АОПДФК не оказывает влияния на его тромборезистентность, агрегационную активность, а также цитотоксичность.

В целом можно утверждать, что эпоксиобработанный перикард КРС с одностадийной модификацией 0,15% раствором АОПДФК является перспективным материалом для создания кардиоваскулярных биопротезов с низкой кальций-связывающей активностью, что крайне актуально для улучшения отдаленных результатов хирургического лечения врожденных и приобретенных пороков сердца.

РАСКРОЙ БИОМАТЕРИАЛА ПРИ ИЗГОТОВЛЕНИИ

КАРДИОВАСКУЛЯРНЫХ БИОПРОТЕЗОВ ИЗ КСЕНОПЕРИКАРДА

Изготовление биопротезов клапанов сердца и клапаносодержащих кондуитов из ксеноперикарда позволяет исключить из конструкции стенку аорты, имеющую высокий кальций-связывающий потенциал. Для создания объемной ЗО-конструкции биопротеза из плоского ксеноперикарда разрабатывают специальные лекала (ЕкЬо1ш СЛ. й а1., 2002). К раскрою биоматериала предъявляют ряд требований: строгое соответствие раскроенных деталей разработанным лекалам, отсутствие деструктивного воздействия режущего инструмента на структуру биологической ткани за границей среза, однородность толщин в пределах одного элемента и условия, не допускающие пересыхания биоматериала для сохранения целостности его структуры.

В настоящем исследовании проведена сравнительная оценка различных способов раскроя ксеноперикарда: с использованием стандартных инструментов (ножниц и скальпеля), вырубной матрицы и лазеров с различными параметрами излучения.

Сравнительная оценка способов раскроя биоматериала

Результаты, полученные в ходе исследования, продемонстрировали, что применение для раскроя ксеноперикарда ножниц и скальпеля приводило к отклонению от формы лекал и вызывало деструктивные изменения в виде разволокнения коллагена глубиной до 40 мкм от зоны среза (рис. 8). Использование вырубной матрицы минимизировало отклонение от формы лекал, при этом зона разволокнения не превышала 5 мкм. За зоной деструкции изменений структуры ксеноперикарда не выявлено.

Полученные результаты позволяют заключить, что одним из приемлемых инструментов для раскроя ксеноперикарда при изготовлении кардиоваскулярных биопротезов является вырубная матрица. Однако данный способ раскроя не является

Рис. 8. Ксеноперикард, консервированный ДЭЭ. Зона среза: а - раскрой ножницами; б — раскрой скальпелем; в — раскрой вырубной матрицей. Окраска препаратов пикро-фуксином по Ван-Гизон, ув. х400

оптимальным, так как не решает проблему однородности толщин в пределах выкраиваемого элемента. Первый шаг на пути решения данной проблемы был сделан компанией Edwards Lifesciences с помощью цветного картирования лоскута по зонам толщин (Ekholm C.R. et al., 2003), с последующим переносом лоскута на другую поверхность для раскроя вырубной матрицей в соответствии с топографической картой толщин. Недостатком данного метода является смещение зон с определенной толщиной при переходе от картирования к раскрою. Исключение человеческого фактора при данном способе выкраивания не представляется возможным. Данные факты указывают на необходимость поиска альтернативного метода раскроя, который позволит оптимизировать процесс изготовления биопротезов для сердечно-сосудистой хирургии.

Раскрой ксеноперикарда Nd:YAG лазером

В настоящем исследовании исходили из того, что применение лазерного излучения в составе специально разработанного прибора позволит повысить точность раскроя и технологичность процесса изготовления кардиоваскулярных биопротезов из ксеноперикарда. Данный раздел работы посвящен подбору оптимальных параметров лазерного излучения для рассечения ксеноперикарда.

На первом этапе исследования на ксеноперикард воздействовали излучением Nd:YAG лазера (1=1,06 мкм), хромофором для которого в биоматериале являются биополимерные молекулы. Пятно фокусировки излучения было сведено до 40 мкм, скорость движения лазера вдоль лоскута составила 40 мм/мин, время воздействия импульса излучения на биоматериал не превышало 1,4хЮ"10сек. Полученные результаты продемонстрировали, что излучение Nd:YAG лазера в диапазоне средней мощности 5-9 Вт не способно рассекать ксеноперикард по всей толщине. Рассечение достигается лишь при увеличении средней мощности до 12 Вт. Однако методом световой микроскопии в зоне воздействия излучения были выявлены деструктивные изменения ксеноперикарда в виде разрушения фиброцитов, гомогенизации и разволокнения кол-

лагена (рис. 9). Деструктивные изменения связаны с коагуляцией коллагеновых и эла-стиновых волокон под действием высокой температуры, которая образуется при переходе световой энергии в тепловую в момент поглощения излучения биоматериалом. При малом коэффициенте поглощения (4 см"1) излучение Ш:УАО лазера частично проходило ткань насквозь, что сопровождалось потерей энергии. Поглощенной энергии было недостаточно для достижения температуры испарения ткани в пятне фокусировки, однако ее оказалось достаточно для нагрева биоматериала, прилегающего к зоне среза, что и привело к деструктивным изменениям. Необходимо отметить, что с увеличением средней мощности от 5 до 12 Вт увеличивалась и зона деструктивных изменений с 40 до 80 мкм.

Рис. 9. Ксеноперикард, консервированный ДЭЭ. Зона воздействия излучения Ш:УАО лазера средней мощностью: а - 5 Вт; 6-12 Вт. Окраска препарата по Ван-Гизон, ув. х400

В связи с этим можно утверждать, что Nd:YAG лазер непригоден для раскроя ксеноперикарда, так как подобные изменения структуры являются недопустимыми при производстве кардиоваскулярных биопротезов.

Раскрой ксеноперикарда Er: YAG лазером

В дальнейшем использовали лазерное излучение на алюмоиттриевом гранате, легированным эрбием (Er:YAG), генерирующим излучение с Х=2,9 мкм, хромофором для которого в биоматериале является вода.

Было установлено, что при использовании Er:YAG лазера для рассечения ксеноперикарда по всей толщине достаточно средней мощности 3 Вт. При этом скорость движения лазера была увеличена в 2 раза, по сравнению со скоростью Nd:YAG лазера, и составила 80 мм/мин. Остальные параметры излучения не изменяли. Скорость лазерной резки является важной составляющей для внедрения технологии в производство биопротезов, так как от нее зависит время пребывания биоматериала вне раствора для хранения и, следовательно, степень его высыхания.

Результаты, полученные методом световой микроскопии, показали, что излучение Er:YAG лазера не оказало деструктивного воздействия на биологическую ткань за областью среза (рис. 10). По краю среза выявлена кромка темного цвета, свидетельствующая о процессе карбонизации. Размер кромки не превышал 0,9 мкм, при этом коллагеновые волокна краевой зоны оставались эозинофильными.

Рис. 10. Ксеноперикард, консервированный ДЭЭ. Зона воздействия излучения Er:YAG лазера средней мощностью 3 Вт. Окраска препарата пикрофуксином по Ван-Гизон, ув. х400

Вследствие высокого коэффициента поглощения излучение Er:YAG лазера проникало в ткань на незначительную глубину (= 4 мкм) (Берлиен Х.П., 1997). Энергия поглощенного излучения преобразовывалась в тепловую в малом объеме ткани, что приводило к быстрому достижению температуры испарения ткани: как жидкой, так и твердой ее фазы, и рассечению биоматериала. Кратковременность воздействия излучения (14 нсек) не допускала нагрева тканей, прилегающих к зоне рассечения.

Полученные результаты доказали возможность использования Er:YAG лазера при раскрое ксеноперикарда для изготовления биопротезов клапанов сердца.

Установка для раскроя ксеноперикарда

На основе полученных результатов совместно с лабораторией лазерных медицинских технологий Института лазерной физики СО РАН г. Новосибирска (заведующий лабораторией — А.П. Майоров) была создана установка «MEJ1A3» для раскроя биоматериала, режущим элементом которой стало излучение Er:YAG лазера (рис. 11).

С целью подбора участка перикардиального лоскута для выкраивания деталей с необходимой толщиной установку оснастили механическим толщиномером. Во время сканирования толщиномер воздействует на ксеноперикард с незначительным усилием (~ 1 г/мм2), что стандартизирует измерение, исключая сдавливание ткани, и в то же время удаляя воздушное пространство между поверхностью, на которой располагается ксеноперикард, и самим ксеноперикардом. Информация с датчика импортируется в

Рис. 11 Принципиальная схема лазерной установки для раскроя ксеноперикарда «МЕЛАЗ»

компьютер, где с помощью специальной программы происходит обработка данных и автоматическое цветное картирование лоскута по зонам с одинаковой толщиной (рис. 12). Карта лоскута, отображающая его толщину по зонам, выводится на монитор компьютера, что позволяет оператору выбрать участок с необходимой толщиной и виртуально расположить на нем лекала биопротеза, после чего он запускает лазер для раскроя.

Рис. 12 Топографическая карта, отображающая толщину ксенопе-рикардиального лоскута, кодированная по цветам. Виртуальная схема расположения элементов биологического протеза перед раскроем

Таким образом, лазерная установка обеспечивает измерение толщины перикар-диального лоскута с точностью 10 мкм; составление топографической карты, отображающей толщину лоскута по зонам; размещение проекции лекал в местах с соответствующей толщиной; раскрой ксеноперикарда лазером.

Раскрой ксеноперикарда С02-лазером

В процессе эксплуатации установки «MEJIA3» стало очевидным, что ее производительность не соответствует требованиям производственного процесса из-за низкой скорости резки, равной 80 мм/мин. В то же время, увеличение скорости движения луча Er:YAG лазера при заданных параметрах приводило к ухудшению качества резки — оставались непрорезанные участки ксеноперикарда. Увеличение скорости возможно либо за счет повышения мощности имеющегося лазера с данной активной средой, либо за счет замены активной среды, генерирующей лазерное излучение. В связи с этим было проведено исследование возможности использования для раскроя биоматериала более мощного С02-лазера с непрерывной генерацией излучения (/.= 10,6 мкм), средней мощностью 50 Вт, хромофором для которого также является вода.

По результатам исследования было выявлено, что излучение С02-лазера рассекало ксеноперикард по всей толщине лоскута, а большая средняя мощность излучения позволяла производить раскрой ксеноперикарда со скоростью 400 мм/мин, что в 5 раз превосходило скорость при использовании Er:YAG лазера. Качество прорезывания при этом сохранялось.

Результаты, полученные методом световой микроскопии, доказали, что излучение С02-лазера, как и Er:YAG лазера, при рассечении перикарда по всей толщине не вызывало деструктивных изменений за зоной среза. Разрушения фиброцитов, гомогенизации и разволокнения коллагена не было выявлено (рис. 13).

Рис. 13 Ксеноперикард, консервированный ДЭЭ. Зона воздействия излучения С02-лазера средней мощностью не более 50 Вт. Окраска препаратов пикрофуксином по Ван-Гизон, ув. х400

По краю среза также присутствовала темная кромка шириной до 1,2 мкм, свидетельствующая о процессе карбонизации. При этом коллагеновые волокна краевой зоны оставались эозинофильными, без деструктивных изменений. Несмотря на то, что размер карбонизированной кромки при воздействии С02-лазера был немного больше, чем при воздействии Er:YAG лазера (0,9 мкм), он значительно меньше раз-

мера деструктивных изменений, образующихся при раскрое перикарда вырубной матрицей, ножницами, скальпелем и излучением К'±УАС} лазера.

Таким образом, использование С02-лазера для раскроя ксеноперикарда с целью повышения технологичности процесса производства кардиоваскулярных биопротезов возможно.

На основании полученных результатов совместно с лабораторией лазерных медицинских технологий Института лазерной физики СО РАН г. Новосибирска (заведующий лабораторией — А.П. Майоров) была создана новая лазерная установка «МЕЛАЗ-1», которая по принципиальной схеме не имеет отличий от установки «МЕЛАЗ». Модернизация установки включала в себя замену блока лазерного излучателя и стеклянной поверхности координатного стола на металлическую с целью предотвращения взаимодействия стекла с излучением С02-лазера.

ВЫВОДЫ:

1. Новые подходы к изготовлению кардиоваскулярных биологических протезов из эпоксиобработанного ксеноперикарда, заключающиеся в модификации его 3-амино-1-оксипропилиден-дифосфоновой кислотой, а также в применении лазеров для его раскроя, являются перспективными.

2. Перикард крупного рогатого скота и створки аортального клапана свиньи, консервированные диглицидиловым эфиром этиленгликоля, имеют значительно (р<0,05) меньший кальций-связывающий потенциал (5 мг/г сухой ткани к 180 суткам подкожной имплантации), чем стенка аорты, консервированная диглицидиловым эфиром этиленгликоля (157,9±1,03 мг/г к этому же сроку).

3. Модификация З-амино-1-оксипропилиден-дифосфоновой кислотой эпоксиобработанного ксеноперикарда и створок аортального клапана достоверно (р<0,05) снижает их кальций-связывающую активность до уровня неимплантирован-ных образцов (менее 1 мг/г). Модификация З-амино-1-оксипропилиден-дифосфоновой кислотой стенки аорты обеспечивает менее выраженный антикальциевый эффект: к 180 суткам имплантации количество кальция составляет 91,28±13,01 мг/г.

4. Модификация эпоксиобработанных створок аортального клапана и ксеноперикарда З-амино-1-оксипропилиден-дифосфоновой кислотой не оказывает негативного влияния на микроструктуру, физико-механические свойства и гемосовместимость биоматериала.

5. Излучение Ыс1:УАО лазера с Х= 1,06 мкм вызывает деструктивные изменения биоматериала в виде разрушения фиброцитов, гомогенизации и разволокнения коллагена глубиной до 80 мкм от зоны среза, что делает его непригодным для раскроя ксеноперикарда при изготовлении кардиоваскулярных биопротезов.

6. Для раскроя биологического материала при изготовлении кардиоваскулярных биопротезов оптимально использование лазеров, хромофорами для которых яв-

ляется вода. Излучение Er:YAG лазера с Х= 2,9 мкм и С02 лазера с Х= 10,6 мкм при рассечении биоматериала не оказывает деструктивного воздействия на биологическую ткань за границей среза. ■

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Биологические протезы клапанов сердца и клапаносодержащие кондуиты, предназначенные для пациентов с высоким риском кальцификации, рекомендуется изготавливать из эпоксиобработанного перикарда крупного рогатого скота, что позволит исключить из их конструкции стенку аорты, имеющую высокий кальций-связывающий потенциал.

2. Для максимального снижения кальций-связывающей активности биоматериала, консервированного диглицидиловым эфиром этиленгликоля, эффективна его дополнительная обработка З-амино-1-оксипропилиден-дифосфоновой кислотой в одну стадию: с однократным помещением биоматериала в модифицирующий 0,15% раствор З-амино-1-оксипропилиден-дифосфоновой кислоты на 4 часа при комнатной температуре (22 — 25°С) с последующей двукратной отмывкой в физиологическом растворе и помещением в раствор консерванта.

3. При изготовлении ксеноперикардиальных биопротезов с целью повышения точности раскроя и минимизации деструктивных изменений за зоной среза целесообразно для раскроя биоматериала использовать излучение Er:YAG лазера с \= 2,9 мкм, средней мощностью 3 Вт, временем воздействия импульса излучения 14 нсек, а также излучение С02 лазера с Х= 10,6 мкм, средней мощностью 50 Вт в режиме непрерывного излучения.

4. С целью повышения производительности раскроя биоматериала следует использовать излучение С02 лазера, так как скорость раскроя биоматериала с использованием данного лазера составляет 400 мм/мин, что в 5 раз выше, чем при использовании Er:YAG лазера.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАНЫХ РАБОТ

1. Влияние различных эпоксисоединений и антикоагулянтов на структуру ксеногенного митрального клапана / Т. В. Глушкова, Ю. А. Кудрявцева, Б. А. Трофимов, И. Ю. Журавлева // Бюллетень НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН IX ежегодная сессия научного центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева. -Москва, 2005,- Т.6.-№3. — С. 250.

2. Веремеев A.B. Обоснование новой модели ксеноперикардиального клапансодержащего кондуита / А. В. Веремеев, Т. В. Глушкова // Актуальные проблемы сердечно-сосудистой хирургии : сб. тр. регион, научно-практ. конф. — Кемерово, 2006. - С.209

3. Влияние различных консервантов на гемосовместимость ксеногенного митрального клапана / Ю.А.Кудрявцева, Т.В. Глушкова, А.Т. Титов, Л.А. Опарина //

Актуальные проблемы сердечно-сосудистой хирургии : сб. тр. регион, научно-практ. конф. - Кемерово, 2006. - С.215

4. Новая технология антикальциевой обработки биопротезов клапанов сердца / Ю. А. Кудрявцева, Т. В. Глушкова, С. В. Лосева, И. Ю. Журавлева // XIII Всероссийский съезд сердечно-сосудистых хирургов : тез. докл. - М:, 2007. - Т.8. - № 6. — С.305.

5. Возможности использования лазерных технологий в производстве кардиоваскулярных биопротезов / Т. В. Глушкова, А. Ю. Бураго, В. М. Тарасов, А. М. Гончаренко, А. П. Майоров // XIII Всероссийский съезд сердечно-сосудистых хирургов : тез. докл. — Москва, 2007. — Т.8. — № 6. — С.319.

6. Лазерный раскрой элементов кардиоваскулярных протезов / А.П. Майоров, В.М. Тарасов, A.M. Гончаренко, Т.В. Глушкова, А.Ю. Бураго // «Альманах клинической медицины» III Троицкая конференция Медицинская физика и инновации в медицине : Троицк Московской обл., 2008. - Т. 17. - ч.-2. - С.-115.

7. Laser Cutting of Elements of Cardiovascular Prosthesis / A. Mayorov, V. Tarasov, A. Goncharenko, I. Zhuravleva, T. Glushkova, A. Burago // V International symposium «Modern problems of laser physics» : Novosibirsk, Russia, 2008. — P.-198.

8. Кудрявцева Ю.А. Разработка технологий повышения биосовместимости ксеноперикардиальных заплат для ангиопластики / Ю.А. Кудрявцева, Т.В. Глушкова, И.Ю. Журавлева // Облитерирующие заболевания сосудов: проблемы и перспективы : сб. тр. всерос. научно-практ. конф. — Кемерово, 2009. — С. 119-120.

9. Глушкова Т.В. Влияние модификации аминодифосфонатом на кальций-связывающую активность эпоксиобработанного биоматериала / Т.В. Глушкова // Ломоносов-2010 : тез. докл. Международного молодежного научного форума. [Электронный ресурс] — М.: МАКС Пресс, 2010. — 1 электрон, опт. диск (CD-ROM)

Ю.Кудрявцева Ю.А. Пути повышения биосовместимости ксеноперикардиальных заплат для интракардиальной и ангиопластики / Ю.А. Кудрявцева, Т.В. Глушкова, И.Ю. Журавлева // Материалы Международного конгресса «Кардиология на перекрестке наук» совместно с V Международным симпозиумом по эхокардиографии и сосудистому ультразвуку, XVII ежегодной научно-практической конференцией «Актуальные вопросы кардиологии» — Тюмень, 2010, —С.153-154.

11. Предупреждение кальцификации эпоксиобработанного биоматериала с использованием аминодифосфоната / Ю.А. Кудрявцева, Т.В. Глушкова, C.B. Лосева, И.Ю. Журавлева // Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов : сб. тр. Всерос. научно-практ. конф. с международным участием. — СПб., 2010. — С. 50-51.

12. Кудрявцева Ю.А. Сравнительная оценка способов модификации биоматериала аминодифосфонатом / Ю. А. Кудрявцева, Т. В. Глушкова //

Вахидовские чтения : сб. тр. XV Республ. научно-практ. конф. - Узбекистан, 2010. -С. 10-11.

13. Журавлева И.Ю. Оценка антикальциевой эффективности аминодифосфоната для обработки биологических протезов клапанов сердца / И. Ю. Журавлева, Т. В. Глушкова, Ю. А. Кудрявцева // Актуальные проблемы сердечнососудистой патологии : сб. тр. Всерос. научно-практ. конф. — Кемерово, 2010. — С.102-103.

14. Возможности использования лазерных технологий в производстве кардиоваскулярных биопротезов / JI. С. Барбараш, Т. В. Глушкова, А. П. Майоров и др. // Бюллетень Сибирского отделения российской академии медицинских наук. — Новосибирск, 2010. — Т.ЗО. — № 5. — С.35-39.

15. Применение аминодифосфоната для профилактики кальцификации эпоксиобработанных биопротезов / И. Ю. Журавлева, Т. В. Глушкова, А. В. Веремеев и др. // Патология кровообращения и кардиохирургия. - М:, 2010. - № 2.-С 18-21.

16. Глушкова Т.В. Пути снижения кальций-связывающей активности биологических протезов для хирургического лечения пороков сердца / Т. В. Глушкова // XVI Всероссийский съезд сердечно-сосудистых хирургов: сб. тр. - М:, 2010. -Т.11. — № 6. - С.269.

17. Глушкова Т.В. Обоснование применения С02 лазера в производстве кардиоваскулярных биопротезов из ксеноперикарда / Т. В. Глушкова // Ломоносов-2011 материалы Международного молодежного научного форума. [Электронный ресурс] — М.: МАКС Пресс, 2011. — 1 электрон, опт. диск (DVD-ROM)

18. Глушкова Т.В. Обоснование выбора биоматериала при создании биопротезов для детской кардиохирургии / Т. В. Глушкова, А. Г. Тогулева // Проблемы медицины и биологии : сб. тр. межрегион, научно-практ. конф. молодых ученых и студентов с международным участием. — Кемерово, 2011. — С.59-60.

19. Glushkova T.V. Use of Laser-based Technologies in Cardiovascular Bioprosthe-ses Production / T. V. Glushkova, A. P. Mayorov, I. Y. Zhuravleva // European Journal Of Natural History. - 2011. - № 2. - C.25

Способ антикальциевой обработки биологических протезов клапанов сердца : пат. 2374843 Рос. Федерация : МПК51 А 01 N 1/02 ; А 61 F 2/24 ; А 61 L 27/50 ; А 61 L 33/04 / И.Ю. Журавлева, Л.С. Барбараш, Т.В. Глушкова ; патентообладатель Закрытое акционерное общество «НеоКор». - № 2008124123/15 ; заявл. 16.06.2008 ; опубл. 10.12.2009, Бюл. № 34. - 4 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

АК - аортальный клапан

АОПДФК- З-амино-1-оксипропилиден-дифосфоновая кислота

ГА — глутаровый альдегид

ДЭЭ - диглицидиловый эфир этиленгликоля

КРС - крупный рогатый скот

НФГ - нефракционированный гепарин

Er:YAG - алюмоиттриевый гранат, легированный эрбием

His — гистидин

Lys-лизин

Met - метионин

Nd:YAG - алюмоиттриевый гранат, легированный неодимом OH-Lys — гидроксилизин Туг — тирозин

Подписано в печать 08.10.2012г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Отпечатано на ризографе. Уч.-изд. Л. 1,75 Тираж 100 экз. Заказ 0810/12-01. Отпечатано в ООО «ВВС-А». 650099, г.Кемерово, ул.Островского, 16

Актуальность работы

Для коррекции врожденных и приобретенных пороков сердечнососудистой системы созданы десятки моделей биологических протезов из аортального клапана свиньи и перикарда крупного рогатого скота. Наиболее распространенным консервантом для стабилизации биологической ткани остается раствор глутарового альдегида (ГА). Одной из основных причин дисфункций ГА-обработанных биопротезов является первичная тканевая несостоятельность, связанная с кальцификацией (Gross J.M., 2001). Существует гипотеза, согласно которой структурные трансформации коллагеновой матрицы под действием ГА определяют способность биоматериала к накоплению кальциевых солей. Замена глутарового альдегида на диглицидиловый эфир этиленгликоля (ДЭЭ) способствует снижению риска кальцификации биопротезов клапанов сердца у взрослых пациентов, однако у детей частота развития кальцификации остается высокой (Латыпов А.К., 2005). Это требует поиска новых путей решения данной проблемы. Одним из известных способов снижения кальций-связывающей активности является модификация биоматериала различными веществами, ингибирующими процесс кальцификации. Наиболее эффективные методики, нашли применение в коммерческих моделях биопротезов, консервированных ГА: обработку гепарином в дополнение к ПАВ использует компания Shelhigh,Inc в технологии No-React (Abolhoda А., 1996), альфа-амино-олеиновую кислоту использует компания Medtronic, Ltd. при изготовлении клапанов Mosaic и Freestyle (Chen, W., 1994), гомоцистеиновую кислоту применяет компания Sorin Biomedica Cardio S.R.L (Stacchino G., 1998), обработку AICI3 и этанолом использует компания St. Jude Medical, Inc. в технологии BiLinx (Levy R.J. 2003). Однако количество кальция в биоматериале, обработанном в соответствии с данными технологиями, составляет от 6 до 30 мг/г сухой ткани при подкожной имплантации крысам на 60 - 150 суток (Webb C.L., 1992, Connolly J.M., 2004, Ozaki S., 2004, Clark

J.N., 2005). Это превышает уровень кальцификации биоматериала, консервированного ДЭЭ без дополнительных обработок при аналогичных сроках имплантации (Шапошников А.Н., 1992, Бураго А.Ю., 1993, Журавлева И.Ю., 1995, Барбараш Л.С., 1996). В связи с этим в настоящей работе не проводили сравнительную оценку эффективности антикальциевой модификации эпоксиобработанного биоматериала и известных обработок на основе консервации ГА. Настоящее исследование направлено на изучение возможности улучшения свойств эпоксиобработанного биоматериала. С целью максимального подавления его кальций-связывающей активности может быть использована технология иммобилизации соединений из класса дифосфонатов, предложенная и апробированная в эксперименте для биоматериала, консервированного ГА (Dewanjee М.К., 1985, Webb C.L., 1988, Эльгудин Я.Л., 1995). Дифосфонаты являются аналогами пирофосфата -природного ингибитора кальция, и в иммобилизованном состоянии в значительной степени препятствуют кальцификации биоматериала (Fleisch Н., 1998).

По результатам клинического применения биологических протезов была отмечена различная интенсивность кальцификации биоматериалов, в зависимости от тканевой принадлежности. При реоперациях по поводу дисфункций клапансодержащих кондуитов, имеющих в своем составе перикард, створки АК и стенку аорты, кальциевые депозиты отмечены в основном в стенке аорты, реже — в створках АК, перикардиальная часть практически всегда остается интактной (Акатов B.C., 2002, Латыпов А.К., 2005). Данный факт послужил предпосылкой для изучения возможности использования ксеноперикарда в качестве основного биоматериала при изготовлении эпоксиобработанных биопротезов клапанов сердца и клапансодержащих кондуитов.

При моделировании кардиоваскулярных биопротезов из ксеноперикарда необходимо учитывать строгое соблюдение геометрических параметров каждого элемента при раскрое. При использовании как обычных режущих инструментов (скальпеля, ножниц), так и вырубных матриц, происходит отклонение от формы лекал, что усложняет процесс моделирования биопротеза. Возможны надсечки, являющиеся негативным фактором для клапана, функционирующего в условиях длительной циклической нагрузки. В настоящее время для высокоточного раскроя различных материалов небиологического происхождения используют лазерные технологии (Вейко В.П., 2001). В связи с этим представляется перспективным изучить возможности применения лазерных технологий для раскроя биологического материала.

Потенциальная устойчивость ксеноперикарда к кальцификации, выявленная в клинической практике, нуждается во всестороннем экспериментальном подтверждении. Данный феномен может быть усилен дополнительной модификацией З-амино-1-оксипропилиден-дифосфоновой кислотой. В этом случае представляется целесообразным создание клапанных биопротезов из эпоксиобработанного ксеноперикарда. Использование лазерных технологий может явиться перспективным подходом в разработке методов высокоточного раскроя для перевода плоских деталей в объемные конструкции.

Цель настоящего исследования - обосновать в эксперименте применение новой технологии антикальциевой обработки и лазерного раскроя при изготовлении ксеноперикардиальных эпоксиобработанных биопротезов для сердечно-сосудистой хирургии.

Задачи исследования:

1. Выполнить сравнительную оценку кальций-связывающей активности перикарда крупного рогатого скота, стенки аорты и створок аортального клапана свиньи, консервированных диглицидиловым эфиром этиленгликоля;

-92. Оценить влияние иммобилизованной З-амино-1-оксипропилиден-дифосфоновой кислоты на кальций-связывающую активность эпоксиобработанных биоматериалов различной видовой и тканевой принадлежности;

3. Изучить влияние антикальциевой обработки на структуру, физико-механические свойства и гемосовместимость биоматериала, консервированного диглицидиловым эфиром этиленгликоля;

4. Оценить воздействие излучения различных лазеров на структуру биоматериала в области среза. Выбрать оптимальные параметры лазерного излучения для создания промышленной установки картирования и раскроя биоматериала.

Новизна исследования

Впервые проведена оценка сшивающей активности диглицидилового эфира этиленгликоля в отношении стенки аорты.

Впервые проанализирована в сравнительном аспекте кальций-связывающая активность перикарда крупного рогатого скота, створок аортального клапана и стенки аорты свиньи, консервированных глутаровым альдегидом и диглицидиловым эфиром этиленгликоля.

Впервые исследован антикальциевый эффект З-амино-1-оксипропилиден-дифосфоновой кислоты, иммобилизованной на биоматериале, консервированном диглицидиловым эфиром этиленгликоля.

Впервые изучено воздействие З-амино-1-оксипропилиден-дифосфоновой кислоты на структуру, физико-механические свойства и гемосовместимость биоматериала, консервированного диглицидиловым эфиром этиленгликоля.

Впервые изучена возможность использования лазерных технологий для раскроя эпоксиобработанного биоматериала.

Впервые в мировой практике лазерное излучение применено для раскроя ксеноперикарда при изготовлении кардиоваскулярных биопротезов.

Практическая значимость работы. Экспериментально обоснован выбор биоматериала для изготовления кардиоваскулярных биопротезов с низкой кальций-связывающей активностью. Разработан способ антикальциевой модификации биоматериала, консервированного диглицидиловым эфиром этиленгликоля.

Определены оптимальные режимы лазерного излучения для раскроя биоматериала при моделировании кардиоваскулярных биопротезов из ксеноперикарда. На основе полученных результатов совместно с Институтом лазерной физики Сибирского отделения РАН созданы установки «МЕЛАЗ» и «МЕЛАЗ-1» для раскроя биоматериала.

Разработанная технология антикальциевой модификации биоматериала, консервированного диглицидиловым эфиром этиленгликоля, и раскрой биоматериала с использованием лазерных технологий внедрены ЗАО «НеоКор» (Россия) в серийное производство ксеноперикардиальных биопротезов клапанов сердца с 2008г. (Протез клапана сердца ксеноперикардиальный биологический консервированный монтированный на гибком опорном каркасе «ЮниЛайн» по ТУ 9444-010-57628698-2008).

Положения, выносимые на защиту:

1. Перикард крупного рогатого скота и створки аортального клапана свиньи, консервированные диглицидиловым эфиром этиленгликоля, обладают более низкой кальций-связывающей активностью, по сравнению с эпоксиобработанной стенкой аорты свиньи.

2. З-амино-1-оксипропилиден-дифосфоновая кислота в иммобилизованном состоянии достоверно снижает кальций-связывающую активность перикарда крупного рогатого скота и створок аортального клапана свиньи, консервированных диглицидиловым эфиром этиленгликоля.

3. Использование лазерного раскроя ксеноперикарда делает процесс изготовления кардиоваскулярных биопротезов более технологичным. В качестве активной среды лазера для раскроя ксеноперикарда могут быть использованы алюмоиттриевый гранат, легированный эрбием и углекислый газ.

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации доложены на:

1. Региональной научно-практической конференции с Международным участием «Актуальные проблемы сердечно-сосудистой хирургии» (Кемерово, 23-25 сентября, 2006 г).

2. XIII Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 23-28 ноября 2007 г).

3. XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 12-15 апреля 2010 г).

4. Международном конгрессе «Кардиология на перекрестке наук» совместно с V Международным симпозиумом по эхокардиографии и сосудистому ультразвуку, XVII ежегодной научно-практической конференцией «Актуальные вопросы кардиологии» (Тюмень 19-21 мая 2010 г).

5. Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы сердечно-сосудистой патологии» (Кемерово 24-25 сентября 2010 г).

6. XVI Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 28 ноября - 1 декабря 2010 г).

Публикации. По результатам диссертационного исследования опубликовано 19 работ в форме научных статей и тезисов в журналах, материалах научных съездов и конференций (из них 2 статьи в журналах, рецензируемых ВАК), а также получен патент РФ на изобретение.

Работа выполнена в ФГБУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний» Сибирского отделения РАМН (директор - д.м.н., профессор О.Л. Барбараш).

Автор благодарит научного руководителя работы д.м.н., профессора И.Ю. Журавлеву за консультативную помощь в подготовке диссертации, а также выражает искреннюю признательность за практическую помощь и дружеское участие коллективу лаборатории химии и технологии материалов для сердечно-сосудистой хирургии ФГБУ «Научный центр сердечнососудистой хирургии им. А.Н. Бакулева» РАМН под руководством д.б.н., профессора С.П. Новиковой (г. Москва), заведующему лабораторией лазерных медицинских технологий Института лазерной физики Сибирского отделения РАН А.П. Майорову (г. Новосибирск) и коллективу лаборатории новых биоматериалов отдела экспериментальной и клинической кардиологии ФГБУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний» Сибирского отделения РАМН (г. Кемерово).

- 124-ВЫВОДЫ:

1. Новые подходы к изготовлению кардиоваскулярных биологических протезов из эпоксиобработанного ксеноперикарда, заключающиеся в модификации его З-амино-1-оксипропилиден-дифосфоновой кислотой, а также в применении лазеров для его раскроя, являются перспективными.

2. Перикард крупного рогатого скота и створки аортального клапана свиньи, консервированные диглицидиловым эфиром этиленгликоля, имеют значительно (р<0,05) меньший кальций-связывающий потенциал (5 мг/г сухой ткани к 180 суткам подкожной имплантации), чем стенка аорты, консервированная диглицидиловым эфиром этиленгликоля (157,9±1,03 мг/г к этому же сроку).

3. Модификация З-амино-1-оксипропилиден-дифосфоновой кислотой эпоксиобработанного ксеноперикарда и створок аортального клапана достоверно (р<0,05) снижает их кальций-связывающую активность до уровня неимплантированных образцов (менее 1 мг/г). Модификация З-амино-1-оксипропилиден-дифосфоновой кислотой стенки аорты обеспечивает менее выраженный антикальциевый эффект: к 180 суткам имплантации количество кальция составляет 91,28±13,01 мг/г.

4. Модификация эпоксиобработанных створок аортального клапана и ксеноперикарда З-амино-1-оксипропилиден-дифосфоновой кислотой не оказывает негативного влияния на микроструктуру, физико-механические свойства и гемосовместимость биоматериала.

5. Излучение Nd:YAG лазера с 1= 1,06 мкм вызывает деструктивные изменения биоматериала в виде разрушения фиброцитов, гомогенизации и разволокнения коллагена глубиной до 80 мкм от зоны среза, что делает его непригодным для раскроя ксеноперикарда при изготовлении кардиоваскулярных биопротезов.

6. Для раскроя биологического материала при изготовлении кардиоваскулярных биопротезов оптимально использование лазеров, хромофорами для которых является вода. Излучение Er:YAG лазера с 1= 2,9 мкм и С02 лазера с Х= 10,6 мкм при рассечении биоматериала не оказывает деструктивного воздействия на биологическую ткань за границей среза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Биологические протезы клапанов сердца и клапаносодержащие кондуиты, предназначенные для пациентов с высоким риском кальцификации, рекомендуется изготавливать из эпоксиобработанного перикарда крупного рогатого скота, что позволит исключить из их конструкции стенку аорты, имеющую высокий кальций-связывающий потенциал.

2. Для максимального снижения кальций-связывающей активности биоматериала, консервированного диглицидиловым эфиром этиленгликоля, эффективна его дополнительная обработка З-амино-1-оксипропилиден-дифосфоновой кислотой в одну стадию: с однократным помещением биоматериала в модифицирующий 0,15% раствор З-амино-1-оксипропилиден-дифосфоновой кислоты на 4 часа при комнатной температуре (22 - 25°С) с последующей двукратной отмывкой в физиологическом растворе и помещением в раствор консерванта.

3. При изготовлении ксеноперикардиальных биопротезов с целью повышения точности раскроя и минимизации деструктивных изменений за зоной среза целесообразно для раскроя биоматериала использовать излучение Er:YAG лазера с 1= 2,9 мкм, средней мощностью 3 Вт, временем воздействия импульса излучения 14 нсек, а также излучение С02 лазера с ~к= 10,6 мкм, средней мощностью 50 Вт в режиме непрерывного излучения.

4. С целью повышения производительности раскроя биоматериала следует использовать излучение С02 лазера, так как скорость раскроя биоматериала с использованием данного лазера составляет 400 мм/мин, что в 5 раз выше, чем при использовании Er:YAG лазера.

- 126