Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Молекулярные механизмы взаимоотношений коллагеновых ксеноимплантатов и организма реципиента (экспериментальное исследование)

г п .»

на правах рукописи

2 9 ДПР ¡335

ГАНТИМУРОВА ИРИНА ЛЕОНИДОВНА

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ КОЛЛАГЕНОВЫХ КСЕНОИМПЛАНТАТОВ И ОРГАНИЗМА РЕЦИПИЕНТА (экспериментальное исследование)

14.00.17 - Нормальная физиология 14.00.16 - Патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Томск-1996

Работа выполнена в Кемеровском кардиологическом центре и Кемеровской государственной медицинской академии.

Научные руководители: доктор медицинских наук И.Ю.Журавлева доктор химических наук А.И.Кокорин

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Т.С.Федорова кандидат биологических наук, Н.Я.Костеши

Ведущее учреждение - НЦССХ РАМН им. А.Н.Бакулева (г.Москва).

Защита состоится "_"_1996г. в_часов на

заседании диссертационного Совета Д.084.28.02 при Сибирском государственном медицинском университете (634050, г.Томск, Московский тракт,2).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Сибирского государственного медицинского университета (г.Томск, пр. Ленина, 107).

Автореферат разослан " ¿¿гу^л*? 1996г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор медицинских наук, профессор

Н .А. Бражникова

Актуальность работы.

На сегодняшний день остается открытым вопрос: каков оптимальный тип кардиоваскулярного коллагенового ксеноимплантата для контакта с биологической средой реципиента? Поиски большинства исследователей, активно работающих в последние 15-20 лет над проблемой долговечности кардиоваскулярных биологических протезов, фокусируются на главной проблеме - проблеме дисфункции протеза (Барбараш JI.C. ссоавт.,1991,1995, Журавлева И.Ю., 1989,1995, Малиновский H.H. с соавт.,1988, Schoen F. et al.,1983).

Основная причина неудач при протезировании элементов сердечнососудистой системы с исполь-зованием химически обработанного биологического материала связана с минерализацией его коллагеновой основы (Glimcher M.I.,1985, Golomb G.,1987, Levy R. et al. 1986,1987, Журавлева И.Ю., 1995, Барбараш JI.C. с соавт., 1995).

Процесс имплантации сопряжен для ксеногенной ткани со структурными и биохимическим преобразованиями, которым та подвергается сразу после попадания в агрессивную среду реципиента. Главным фактором, определяющим отдаленную судьбу имплантированных биопротезов, является способ их предимплантационной обработки (Webb C.L. et al.,1988,1990, Levy R. et al.,1991, Hidaka S. et al.,1993).

При изготовлении кардиоваскулярных ксенопротезов общепринятой является их консервация в глутаровом альдегиде. Однако глутаро-вый альдегид способен, по-видимому, провоцировать начальную стадию минерализации консервированного имплантата. Патофизиологические основы данного процесса до сих пор не ясны, и вопрос о механизмах взаимодействия химически обработанных ксеноимплантатов с катионами кальция остается открытым.

Актуальность настоящей работы обусловлена тем, что молекулярные механизмы взаимодействия имплантированного материала с биологически активными факторами реципиента окончательно не изучены. Доказанная в ряде зарубежных работ ингибирующая активность катионов А13+ и Fe3+ в отношении минерализации биологической ткани имплантата (Baldwin M.T.et al.,1991, Hirsch D.et al.,1993, Levy R.J.et al.,1991, Webb C.et al., 1988,1990) связана, по-видимому, с конкуренцией данных ионов и катионов Ca (II) в процессе их комплексообразования с коллагеном. Сравнительная оценка комплексообразующих и антикальцифицирующих свойств ионов металлов переходного ряда, в известной степени аналогичных иону кальция по физико-химическим свойствам, несомненно, могут открыть новые страницы в разъяснении механизма данного явления.

В данной работе предпринята попытка изучения механизмов взаимодействия в активной системе "имплантат/реципиент" на молекулярном уровне. Использование для этой цели метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) предоставляет возможность изучения участия различных лигандов коллагеновых структур в процессе обра- . зования координационных связей с ионами переходных металлов.

Цель исследования- установление молекулярных механизмов взаимодействия имплантированного ксеноматериала и биологически активных факторов реципиента при перестройке координационной сферы металл-коллагеновых комплексов.

Задачи исследования:

1. Оценка возможности применения метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) для исследования процессов комплексе образования имплантированных коллагеновых структур с катионами

. переходных металлов.

2. Изучение взаимодействия "имплантат/реципиент" на молекулярном уровне при использовании ионов Cu(II), Gd(III), Mn(II), Сг(Ш) в качестве спиновых меток.

3. Характеристика процессов сорбции спиновых меток в зависимости от молекулярных трансформаций коллагеновых ксеноимплантатов при консервации глутаровым альдегидом и диглицидиловым эфиром этиленгликоля.

4. Исследование динамики взаимодействия спин-меченых коллагеновых структур с организмом реципиента при имплантации.

5. Изучение влияния катионов переходных металлов на кальци-фикацию коллагеновых ксеноимплантатов, обработанных глутаровым альдегидом.

Научная новизна исследования

- впервые для изучения молекулярных механизмов взаимодействия "имплантат/реципиент" использованы методы электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и ядерного магнитного резонанса (ЯМР);

- выполнено скрининговое исследование кальций-ингибирующей активности металлов переходного ряда, сорбированных ксеногенной тканью до имплантации, и влияние на этот эффект некоторых параметров сорбции;

- впервые изучено образование и постимплантационная трансформация комплексов коллагеновых структур с катионами Си (II), Gd(III), Al(III), Mn(II), Fe(III), Cr(III);

- исследовано влияние свойств данных комплексов на капьцифи-кацию коллагеновых ксеноимплантатов;

- впервые показано влияние способа консервации на комплексо-образующие свойства коллагена;

- разработана и успешно апробирована новая модель для оценки кальций-связывающей активности ткани in vitro.

Положения, выносимые на защиту:

1. Для выяснения молекулярных механизмов процесса кальци-фикации кардиоваскулярных биопротезов могут быть применены физико-химические методы исследования закономерностей взаимо-

действия коллагеновых стуктур с катаонами переходных металлов. Методами ЭПР и ЯМР могут быть установлены состав и строение комплексов таких катионов, как Cu(II), Gd(III), Cr(III) и Al(III) с коллагеновой матрицей биопротезов, что связано с тем, что при взаимодействии "имплантат/реципиент" может происходить перестройка координационной сферы комплексов металл-коллаген.

2. Способность ионов переходных металлов формировать комплексы с лигандами коллагеновой матрицы ксеноимплантата может быть использована для определения степени конкурентной активности ' избранного канона в отношении ионов кальция. Продолжительность антикальциевого эффекта катионов переходных металлов, координированных коллагеновой матрицей, может зависеть от устойчивости сформированных комплексов.

3. Использование метода Са-селективной ионометрии имеет ряд преимуществ и позволяет in vitro охарактеризовать потенциальную способность биоматериала к необратимой сорбции ионов кальция и, в частности, влияние на нее такого фактора, как сорбция ионов переходных металлов.

Практическая значимость работы

Идентификация специфических лигандов коллагеновой матрицы, координирующих ионы металлов переходного ряда предоставляет возможность направленно ингибировать процесс минерализации. На практике, блокируя известные лиганды - мишени, связывающие кальций, конкретным химическим агентом, реализуется возможность непосредственного воздействия на систему механизмов кальцификации.

Установление основных механизмов комплексообразования при взаимодействии коллагеновых структур с катионами переходных металлов является ключом к пониманию молекулярных механизмов кальцификации.

Продемонстрированные в работе возможности метода электронного парамагнитного резонанса примененительно к изучению взаимодействия коллагеновых ксеноимплантатов с катионами переходных металлов, могут быть использованы в различных областях биологии и медицины.

Разработанная модель для оценки кальций-связывающей активности биоматериала в условиях in vitro является простой, не требует дорогостоящего оборудования, высокоинформативна и может широко использоваться для проведения скрининговых исследований в данной области.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 6 научных работ. Их список прилагается.

Апробация работы. Материалы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на 5-м Международном симпозиуме

IUPAC ("Комплексы металлов с макромолекулами") (Бремен, Германия, 1993); 43-м Международном конгрессе Европейского общества сердечнососудистых хирургов (Берлин, Германия, 1994); симпозиуме с международным участием "Биопротезы в сердечно-сосудистой хирургии" (Кемёрово, Россия, 1995); объединенной конференции Кемеровского кардиологического центра, ЦНИЛ Кемеровской государственной медицинской академии и кафедры патофизиологии Кемеровской государственной медицинской академии (Кемерово, 1995); расширенном заседании кафедры нормальной физиологии Сибирского^ государственного медицинского университета (Томск, 1996).

Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и практических рекомендаций; содержит 24 рисунка и 3 таблицы. Указатель литературы включает 188 работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В диссертации представлены результаты экспериментальных исследований, посвященных изучению общих закономерностей комплек-сообразования ксеногенных коллагеновых имплантатов, консервированных глутаровым альдегидом (ГА) и диглицидиловым эфиром этилен-гликоля (ДЭЭ), с ионами переходных металлов. В работе обоснованы новые для биологии и медицины подходы к изучению биологических имплантируемых материалов - использование методов ЭПР и Я MP -для изучения структуры коллаген-металлических комплексов, а также динамики взаимодействия "имплантат/реципиент".

В ходе выполнения данного исследования разработаны две принципиально новые модели для изучения in vitro динамики взаимодействия "имплантат/реципиент" и экспресс-оценки кальций-связывающей активности биоматериалов.

При изучении кальций-связывающей активности металло-обработанной биоткани на модели подкожной имплантации крысам выявлен ингибирующий эффект различной степени выраженности некоторых катионов металлов переходного ряда на процесс кальцифи-кации.

В целом изучение взаимодействия катионов переходных металлов с коллагеном позволило установить ряд общих закономерностей взаимодействия катионов переходного ряда с коллагеновыми структурами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Во всех сериях экспериментов были использованы створки ксено-аортального клапана свиньи и очищенный коллаген. Вторая тест-модель использовалась для доказательства корректности данного подхода путем установления степени однонаправленности взаимодействия с консервантами и катионами переходных металлов. В качестве консервантов

применили два принципиально различных сшивающих агента: глута-ровый альдегид (ГА) и диглицидиловый эфир этиленгликоля (ДЭЭ). При консервации ГА и ДЭ использовали технологию, разработанную в Кемеровском кардиологическом центре.

Аминокислотный состав створок аортальных клапанов свиньи и • очищенного коллагена из кожи крупного рогатого скота ибследовали методом аминокислотного анализа. Этот раздел и следования был выполнен совместно с к.б.н. В.В.Шапровым (НИИ Молекулярной биологии СО РАМН, г.Новосибирск).

Прйнцип метода спиновых меток состоит в том, что катионы не которых металлов переходного ряда - Cu(II), Mn(II), Cr(III), Gd(III) способны образовывать достаточно стабильные комплексы с функциональными группами аминокислот коллагенового ксеноимплантата. Наблюдая за изменением спектров ЭПР данных комплексов под воздействием среды реципиента, можно следить за поведением ионов металла.

При изучении параметров сорбции катионов Cu(II) для введения спиновой метки образцы отмывали от остатков консерванта и помещали .. в 2103 М раствор Cu(N03)29H20 на 12 часов при фиксированном, значении pH ( фосфатный, ацетатный, трис-буфер). Значения pH измеряли на приборе "pH/ion meter 135" фирмы CIBA Corning (Англия). Сорбцию ионов меди проводили в диапазоне pH 3,4-8,5.

Сорбция катионов Ni2\ Со2+, Мп2+, А13\ Gd3+, Fe3+ и Сг3+ проис- • ходила при инкубации ГА-обработанных створок в 0,01 М водных растворах солей данных металлов при pH, создаваемых самими растворами, в течение 12 часов. В зависимости от дальнейших задач образцы использовали в экспериментах in vivo и in vitro и использовали для изучения методом ЭПР и ЯМР.

В "статической" модели in vitro створки и коллаген, консервированные ГА и ДЭЭ и сорбировавшие Cu(II) при pH 5,4 и 7,4, помещали в широкие пробирки, каждая из которых содержала 0,9% раствор NaCl, 10% раствор СаС12, сыворотку или плазму крови, полученную от здоровых интактных крыс, где инкубировали 24, 48 и 72 часа при 37°С (п=128). Затем образцы отмывали от инкубационной среды и высушивали до постоянного веса, изучая в последующем методом ЭПР.

Оригинальная "динамическая" модель заключалась в следующем. 10 образцов каждого вида, помещали в широкие термостатируемые при 37°С пробирки, содержащие сыворотку или плазму крови крыс. Образцы инкубировали в течение 1,2,4,8 и 24 часов в режиме непрерывного помешивания, за счет чего достигалось активное взаимодействие образцов с биологическими средами (п=244).

Классическая модель ускоренной кальцификации при подкожной имплантации исследуемых образцов крысам имитирует влияние на имплантат агрессивной среды реципиента. Данная модель принята во всем мире для проведения скрининговых исследований кальций-связывающей активности ткани. Крысам-самцам линии Vistar с массой

тела 55-70 г в асептических условиях под эфирным наркозом в подкожные карманы имплантировали контрольные и опытные образцы.

Для изучения процессов десорбции катионов биоматериал имплантировали на 1,2,4,8,24,48 и 72 часа, параллели процессов десорбции и кальцификации - на 15 и 30 суток, для изучения процессов кальцификации - на 30, 60 и 90 суток: Удаленные образцы отмывали в растворе NaC1.30 мин, высушивали и изучали методом ЭПР, ЯМР или атомной абсорбционной спектроскопии (ААС). На модели in vivo было проведено 17 серий экспериментов (п=500). Общее количество образцов составило 2275.

Спектры ЭПР регистрировали на радиоспектрометре Х-диапазона "Varían Е-4" в тонкостенных кварцевых ампулах диаметром 4 мм при 77°К. Магнитное поле градуировали при помощи эталонов Мп2+ в матрице MgO и дифенилпикрилгидразила с g0=2,0036. Из спектров ЭПР измеряли значения g-фактора (g„ и gx) и константы сверхтонкого взаимодействия (СВТ) неспаренного электрона с ядром иона меди А„ по принятым методикам в соответствии с рекомендациями (Peisach J., 1974).

Для оценки количества координированных ионов Cu (II) использовали эмпирический параметр а = 10/m(dCu/dMn), где dCu - амплитуда линии ЭПР комплексов меди, a dMn - амплитуда эталонного сигнала ЭПР марганца. Коэффициент 10/ш показывает, что величина dCu/dMn приведена к 10 мг массы биоматериала. Для оценки количества координированных ионов Gd(III), Mn(II) и Cr(III) использовали эмпирический параметр а/ао, который позволяет сравнивать динамику десорбции катионов и демонстрировать данный процесс на одном графике.

Раздел исследования методом ЯМР выполнен совместно с к.х.н. О.В.Лапиной (Институт Катализа СО РАН, г.Новосибирск). Спектры ЯМР с использованием вращения образца под магическим углом были записаны на Импульсном фурье-спектрометре ЯМР Bruker MSL-400 (постоянное магнитное поле 9,4 Т). Резонансная частота для 27Al 104.3 МГц (SF), развертка 100 КГц (SW), число накоплений (NS) от 200000 до 250000, длительность импульса 2 мксек (D,), задержка между импульсами 0,2 сек (D0).

Исследования с использованием метода атомно-абсорбционной спектроскопии (ААС) были выполнены совместно с инженером Кемеровского бюро судебно-медицинской экспертизы В.В.Потаповым. Всего методом ААС исследовано 2000 образцов.

Для изучения кальций-связывающей активности биоткани in vitro была разработана оригинальная модель. В данной серии экспериментов 'использовали 4 вида створок биопротезов:

I - консервированные глутаральдегидом (контрольные образцы);

II- ГА-образцы, обработанные Cu(Il) при pH 5,4;

III- ГА-образцы, обработанные Cu(II) при pH 7,4;

IV- ГА-образцы, обработанные Сг(Ш) в водном растворе СгС13.

3/4 части образцов каждой серии помещали в плазму крови крыс и инкубировали в динамических условиях в течение 2,8 и 24 часов, отбирая равные по массе доли образцов через каждый из указанных сроков. Затем все образцы помещали в химические стаканы, содержащие 80 мл 0,01 M раствора СаС12. На йономере ЭВ-74 с помощью селективного кальциевого электрода измеряли в каждом стакане рСа исходного раствора, через 10 мин, 1, 2, 4, 8, 24, 48 и 72 ч инкубации образцов в растворе СаС12. Падение концентрации Са2+ (у) в растворе и общую кальций-связывающую активность необработанной и металлообра-ботанной биоткани расчитывали по формулам.

Статистическую обработку проводили с помощью прикладного пакета "STATGRAPHICS" на компьютере IBM PC/AT 386. Расчитывали значения средней арифметической величины (М), стандартной ошибки (±ш), и критерия Стьюдента (t).

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ "ИМПЛАНТАТ\РЕЦИПИЕНТ" ПРИ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИИ КОЛЛАГЕНОВЫХ СТРУКТУР С ИОНАМИ Cu(II)

Первый этап исследования был посвящен отработке методики введения ионов Cu(II) в образцы коллагена и створок ксеноаортальных клапанов, условий регистрации и интерпретации спектров ЭПР.

Координация ионов меДи белками створок клапанов происходит количественно при каждом значении рН в диапазоне 4,0<рН<7,5. Это подтверждает линейная зависимость связанной меди от массы образца. Наибольшее количество ионов меди координируют образцы [СГА] и [КГА] при рН 5,4-6,0.

Состав и строение образующихся комплексов в значительной мере зависят от рН сорбции (рис.1). Так, при 4,0<рН<7,0 наблюдается одновременное образование комплексов нескольких типов, включающих в координационную сферу иона меди атомы кислорода карбоксильных групп Glu, Asp и до 3-х атомов азота, принадлежащих функциональным группам His, Lys, LysOH и Arg (Martin R.P. et al, 1973). При значениях pH<5,0 в состав комплексов входят карбоксильные группы Asp и Glu. Незначительная координация азота происходит за счет стереохимически доступных аминокислот His, Lys, OHLys и Arg. При рН » 7,0 происходит формирование насыщенных по азоту комплексов типа [Cu(N)J2+, а при рН>8,0 - азот пептидных связей (Crawford Т.Н.,1969, Falk К., 1989).

При сорбции ионов меди из нитратных водных растворов модельным коллагеном [КГА] и створками [СГА], в зависимости от величины рН, образуются комплексы различного состава и строения.

Вид спектров ЭПР и параметры спин-гамильтониана для образцов [СГА+Си] и [КГА+Си] были настолько близки при одинаковых значениях рН, что можно с уверенностью утверждать, что в створках основным белком, координирующим ионы меди, является коллаген.

Н, Гс

Рис. I. Спектры ЭПР комплексов меди в створках, консервированных глутаральдегидом. Обработка Си(Н) .прирН 4,0 (1), 7,4 (2) и 8,5(3).

В активной системе "имплантат/реципиент" происходят реакции двухвалентных ионов с коллагеном имплантата и собственными белками реципиента, идет перестройка комплексов, образовавшихся перед имплантацией, и формирование новых с белками реципиента. При имплантации образцов на различные сроки наблюдали изменение формы и интенсивности сигнала ЭПР, что отражает изменения состава и количества (десорбция) комплексов в имплантированном материале (рис.2).

В течение первых суток после имплантации все места в экваториальной плоскости координационной сферы занимают 4 атома азота. Наибольшее количество ионов Cu(II) десорбируется в первые 4-8 часов после имплантации (рис.3). По истечение 48 часов после имплантации сигнал ЭПР Cu(II) в образцах [СГА+Си(5,4)] уменьшался в 50-80 раз. Через 15 суток количество комплексов меди в образцах уменьшалось в 50-100 раз по сравнению с исходным, однако было достаточным для идентификации (рис.4). Через 30 суток сигнал Cu(II) становился еще в 2-4 раза слабее. В процессе вымывания менее стабильных комплексов возрастает относительное количество прочных комплексов.

Таким образом, в результате воздействия клеточных и гуморальных факторов организма реципиента на имплантат в нем появляются новые азотсодержащие функциональные группы, способные координировать Cu(II). Возможно, этот феномен связан с пропиткой имплантата белками и другими компонентами среды реципиента, предоставляющими свои ллганды для координации катионов. Внутренняя перестройка самого имплантата происходит в первые часы после попадания его в организм реципиента, что сопровождается десорбцией 90-95% комплексов Cu(II), образовавшихся перед имплантацией. В процессе перекоординации ионов Cu(II) различными органическими лигандами и функциональными белками сыворотки или плазмы реципиента наибольшая часть вновь

Рис.2. Высокопольные компоненты перпендикулярной ориентации спектров ЭПР комплексов меди в образцах коллагена, консервированного глутаральдегидом: 1 - исходный образец, рН сорбции ионов Си (II) - 7,4, 2 - через I час, 3 -через 4 часа имплантации.

(рВ 7.4)

-Q-

сттюршв (рН 5,4) коятагЕЯ (рН 74)

Рис.3. Зависимость относительного содержания комплексов Си(Н) (а/а^ в биоматериале, консервированном глутаральдегидом, от длительности имплантации (в скобках , указана рН сорбции ионов меди до имплантации).

сформировавшихся комплексов покидает коллаген имплан-тата, что может быть обусловлено постоянным выходом белков в среду реципиента.

При моделировании процессов десорбции Cu(II) in vitro путем статической инкубации образцов [СГА] и [КГА] в 0,9% растворе NaCl, 10% растворе СаС12, сыворотке и плазме крысиной . крови было установлено, что десорбция, ионов Си (II) происходила только при наличии в инкубационной среде других ионов и ' молекул, способных вытеснить Cu(II) из первоначально сформировавшихся ком-; плексов.

Концентрация Си2+ в [СГА] не уменьшалась даже после 3-х суточной инкубации в растворе NaCl. Низкая десорбция ионов меди из раствора слабого компЛексообра-зователя Са2+ была связана с термодинамическими причинами (рис.5).

В процессе активного динамического взаимодействия образцов с сы-

Рис.4. Спектры ЭПР глутаральдегид-обра-ботанных створок, сорбировавших Си(П) при рН 5,4: исходного (1), через 1 сутки (2), 2 суток (3) и 15 суток (4) после имплантации.

вороткой и плазмой крови скорость десорбции резко увеличивалась и приближалась к полученной в эксперименте in vivo. По-видимому, основным фактором, вызывающим изменения в имплантате, является взаимодействие коллагена с биологически активными молекулами сыворотки и плазмы крови, а не с ее клеточными элементами.

При этом не удалось выявить принципиальных различий в основных закономерностях сорбции и десорбции ионов Cu(II) между группами материала, обработанными ГА и ДЭЭ (рис.5 и 6).

Взаимодействие ионов Cu(II) с [СДЭ] принципиально не отличается от случая [СГА]. Методом ЭПР показано, что все особенности этого взаимодействия адекватно моделируются коллагеном, обработанным ДЭЭ. Основные закономерности комплексообразования Cu(II) с белками ' глутаральдегид- и эпоксиобработанных тканей не имеют принципиальных различий.

Одним из важнейших результатов, полученных в данном разделе работы, можно считать данные о рН-зависимых различиях структуры комплексов Си2+.

05-

1 2 t, супси

--«-- Рис.5. Зависимость относи-

тельного содержания комплексов Cu(II) (а/ctg) в образцах ГА-обработанных створок, сорбировавших Cu(II) при рН 7,4 от времени статической инкубации in vitro: 1 - в 0,9% растворе,NaCl, 2 - в 10% растворе СаС1т 3 - в сыворотке крови, 4 - в плазме крови крыс.

о

ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ ОБРАЗОВАНИЯ И ТРАНСФОРМАЦИИ IN VIVO И IN VITRO КОМПЛЕКСОВ КОЛЛАГЕНОВЫХ СТРУКТУР С КАТИОНАМИ Сг(Ш), Al(III), Gd(III), Fe(III), Co(II),

Mn(II), Ni(II)

Противокальциевое воздействие на коллагеновый имплантат способны оказывать многие двух- и трехвалентные катионы металлов. В ряде работ была показана способность некоторых катионов (Al3+, Zní+, Fe3f) вмешиваться в рост кристаллов гидроксиапатита в процессе развития кальцификации биоматериалов in vivo и in vitro (D.Hirsch et al., 1991,

Допустимо предположить, что данный эффект связан с конкуренцией этих ионов и иона кальция за координирующие лиганды в коллагене. Исходя из этого, целесообразно исследование общих закономерностей комплексообра-зования катионов переходной группы с коллагеном.

Процессы образования и • трансформации in vivo и in vitro комплексов коллагеновых ксеноимплантатов с ионами Cr(III), Mn(II) и Gd(III) были изучены методом ЭПР (рис.7), А1(Ш) - методом ЯМР. Ионы Ni(II), Co(II) и Fe(III), не обладающие спиновым и ядер-

R.Levy et al. 1993, C.Webb et al., 1990).

Рис.7. Спектры ЭПР катионов Мп2* (1), Сг" (2), СсР+ (3) в створках обработанных глутаральдегидом, сорбировавших данные ионы до имплантации.

Fe Cr Al Cu Un Gd Ni Co Cu

Рис.8. pH сорбции катионов переходных металлов.

ным моментом, использовали в скрининговом исследовании кальций-связывающей активности металлобрабо-танной ткани.

Створки ксенобиопро-тезов сорбировали катионы Fe3+, Сг3+, Al3+, Mn2+, Gd3+, Ni2+, Со2+ из водных растворов в широком диапазоне значений рН, создаваемых солями данных металлов в водных растворах (рис. 8).

При изучении десорбции Сг3+, Мп2+ и Gd3+ были установлены существенные

различия количественных характеристик данного процесса. Так, наиболее прочные комплексы с коллагеном образуют катионы Сг3+, причем динамика, десорбции их из ксеноткани в условиях in vivo и in vitro ' практически совпадает.

По сравнению с комплексами, образованными Сг(Ш), комплексы Мп(И) и Gd(III) с коллагеном оказались менее стабильными in vivo и in vitro (рис.9), а динамика их десорбции напоминает динамику десорбции катионов Cu(II).

Комплексы коллагена с катионами Al(III) достаточно стабильны, по крайней мере, в течение 24 часов динамической инкубации в плазме крови крыс.

Таким образом, катионы переходных металлов в целом обладают различной комплексообразующей активностью в отношении коллагена, а образованные ими комплексы - различной прочностью. Наиболее стабильные комплексы образуют катионы хрома и алюминия. В составе этих комплексов катионы металлов имеют кислородное окружение.

Рис.9. Десорбция in vitro катионов Mn(II), Gd (III) и Cu(II) (a/aj из образцов створок, консервированных глутаральдегидом:

МЕХАНИЗМЫ КОНКУРЕНТНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ Са2+ С КАТИОНАМИ ПЕРЕХОДНЫХ МЕТАЛЛОВ

Теоретическими предпосылками данного раздела работы послужили некоторые положения, как известные из литературы, так и сформулированные в ходе настоящего исследования.

1) Известно, что кальцификации подвержен биологический материал, консервированный глутаровым альдегидом, в то время, как эпокси-обработанная ткань абсолютно резистентна к кальцификации.

2) Вместе с тем, по отношению к другим катионам переходных металлов коллагеновые структуры ведут себя практически одинаково, независимо от способа консервации: структура формируемых комплексов, количественные параметры сорбции и десорбции катионов • металлов приблизительно совпадают в ГА- и ДЭЭ-обработанной ткани.

3) Известно, что катионы некоторых металлов (Al3+, Fe3+, Zn2*), сорбируясь на глутаральдегид-обработанной ткани, подавляют ее минерализацию, однако данный эффект не имеет удовлетворительного объяснения.

4) Проведенные в настоящей работе исследования позволили установить определенные закономерности в процессах сорбции и десорбции, а также образования и трансформации комплексов целого ряда катионов с коллагеном:

- структура комплексов Cu(II) с коллагеном имеет выраженную зависимость от рН сорбции - при слабокислых рН координационная сфера Cu(II) содержит преимущественно атомы кислорода, при рН>7,0 образуются обладающие высокой константой устойчивости комплексы меди с атомами азота;

- комплексы катионов переходных металлов с коллагеном обладают различной стабильностью; наиболее стабильны комплексы Cr(III), сформированные в кислой среде и имеющие кислородное окружение катиона.

Данные положения послужили основой для интерпретации результатов, полученных при изучении кальций-связывающей активности металлообработанной ткани на моделях in vivo и in vitro.

Основной задачей настоящего раздела явилось установление комплексообразующих свойств, которыми должен обладать конкретный катион для эффективного конкурентного взаимодействия с кальцием за места связывания в биологической матрице.

Пользуясь тем, что для 5 катионов эти свойства были изучены спектральными методами, и результаты этих исследований представлены в предыдущих разделах работы, решение поставленной задачи возможно после изучения динамики накопления кальция в коллагеновых ксеноимплантатах, предадсорбировавших различные катионы. В эксперименте использовали только ГА-обработанную биоткань.

Результаты изучения in vivo кальций-связывающей активности

i

\ 100

i

* M Co Ma Gd jU Cr Те

N1 Co Uo Cd II Cr Fe

Рис. 10. Показатели кальцификации створок ксенобиопротезов клапанов сердца, сорбировавших до имплантации катионы переходных металлов: А - через 30 суток, Б - через 60 суток имплантации.

металлообработанной ткани створок биопротезов показали, что некоторые катионы металлов переходного ряда оказывают на процесс кальцификации ингибирующий эффект различной степени выраженности (рис.10).

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать ряд выводов. Во-первых, антикальциевый эффект предимплантационной обработки биоткани катионами переходных металлов в какой-то мере связан с рН сорбции. Влияние рН реализуется, по-видимому, в формировании комплексов различной структуры - в кислой среде формируются комплексы катиона с кислород-содержащими лигандами коллагена, в нейтральной или кислой среде состав их принципиально другой. Это было убедительно показано на примере катионов Cu(II), для которых состав и трансформации комплексов с коллаген-содержащими структурами были расшифрованы очень подробно. При образовании комплексов катиона с кислород-содержащими лигандами коллагена достигается антикальциевый эффект различной степени выраженности.

Во-вторых, стабильность достигаемого эффекта в значительной мере зависит от прочности сформированных перед имплантацией комплексов. В ряду изученных комплексов стабильность убывает следующим образом: " Gd3+<Mn2+<Cu.2+<Al3+<Cr3+, и, почти в соответствии с этим, возрастает кальций-связывающая активность ткани при имплантации на длительные сроки.

С целью экспериментального подтверждения основного положения данной работы о том, что выраженность конкурентного взаимодействия катиона переходного ряда зависит от прочности образуемых им комплексов с кислород-содержащими лигандами коллагена, была выполнена серия исследований на оригинальной модели in vitro, позволившей разделить процессы десорбции сформированных перед имплантацией комплексов и процессы сорбции и связывания кальция': с коллаген-содержащими структурами.

Рис.11. Динамика связывания кальция из 0,01М раствора СаС12 образцами, консервированными глутаральдегидом (А), дополнительно предадсорбировавшими катионы Сг(Ш) (Б), Си(II) прирН5,4 (В), Си(Н) при рН 7,4 и инкубированными в плазме крови в течение 2, 8 и 24 часов соответственно.

Было установлено, что максимальной скоростью связывания кальция и максимальной кальций-свлзываюшей активностью обладают контрольные образцы, консервированные ГА и не обработанные катионами металлов (рис. 11а, 12). Минимальную скорость связывания кальция демонстрировали образцы, предадсорбировавшие Сг(Ш). Однако в данном случае инкубация образцов в плазме крови резко повышала скорость связывания кальция тканью (рис.116).

Близкими к данной группе образцов оказались створки, сорбировавшие Си(П) при рН 5,4, особенно не инкубированные в плазме (рис.Пв).

Серия образцов, обработанных Си(11) при рН 7,4, занимала промежуточное положение между контрольными и предадсорбировавшими медь при рН 5,4 образцами - как по кальций-связывающей активности, так и по скорости сорбции кальция из раствора (рис.11г,12).

Рис.12. Максимальная кальций-связывающая активность биоткани створок, обработанных различными катионами.

Таким образом, полученные результаты являются прямым подтверждением следующему:

1) наиболее выраженный конкурентный эффект в отношении катиона Са2+ проявляют катионы переходных металлов, образующие комплексы с кислород-содержащими лигандами коллагена (в данном случае это Сг3+ и Си2+, сорбированная при рН 5,4);

2) скорость связывания кальция и общая кальций-связывающая активность ткани увеличиваются по мере десорбции предадсорбиро-ванных катионов, и, чем стабильнее комплексы данного катиона с коллагеном (Сг3+), тем стабильнее антикальциевый эффект обработки данным катионом. '

Кислород-содержащие лиганды в коллагене, обработанном ГА и ДЭ, практически не различаются, так как оба сшивающих агента реагируют с боковыми аминогруппами лизина и оксилизина; ГА не реагирует с другими аминокислотами, а ДЭ, хотя и реагирует с метиони-ном и тирозином, не задействует при этом каких-то специфических кальций-связывающих центров (1шашига Е.,1989, \Voodroof Е.А.,1979).

Таким образом, специфические кислород-содержащие лиганды в глутаральдегид-обработанном материале могут присутствовать лишь в структуре самой связи данного консерванта с коллагеном, что согласуется с работой E.Woodroof. Связи в коллагене, консервированном ГА, представлены пиридиниевыми основаниями и продуктами взаимодействия коллагена с полимерными формами консерванта (рис.13).

Данные структуры представляют собой типичные калйций-связы-вающие центры (ИЛ¥иИиег,1982), и блокирование их при комплексо-образовании с другими катионами приводит к резкому уменьшению кальций-связывающей активности ткани. По мере десорбции этих катионов центры связывания становятся доступными для кальция.

Коллаген Коллаген

Рис. 13. Реакции коллагеновых белков с глутаровым альдегидом (по ЕЛ. \Voodroof, 1979): А - формирование пиридиниевой поперешой связи; Б - реакция первичных аминов коллагена с полимерными формами глутаральдегида.

Дальнейшее образование прочных комплексов кальция с данными лигандами и вовлечение в процесс комплексообразования ионов фосфата приводит к формированию центров нуклеации кристаллов гидрокси-апатита. Дальнейшие события характеризуются количественными изменениями - нарастанием массы кристаллов.

В целом изучение взаимодействия катионов переходных металлов с коллагеном позволило установить ряд общих закономерностей процессов сорбции и десорбции катионов коллагеновыми структурами, идентифицировать состав и структуру формируемых комплексов и их трансформации в организме реципиента или при контакте с биологически активными компонентами крови.

Идентификация лигандов коллагена, входящих в состав металло-комплексов, при моделировании конкурентных взаимодействий катионов переходного ряда с катионом кальция выявила молекулярные механизмы начальных стадий кальцификации коллагеновых ксеноимплантатов, обработанных глутаральдегидом.

выводы

1. На основании совокупности физико-химических методов анализа разработана методика исследования закономерностей взаимодействия коллагеновых структур с катионами переходных металлов, позволившая выяснить молекулярные механизмы процесса кальцификации кардио-васкулярных биопротезов.

2. Методами ЭПР и ЯМР установлены состав и строение комплексов Cu(II), Gd(III), Cr(III) и Al(III) с коллагеновой матрицей биопротезов. Обнаружено, что при взаимодействии имплантат/реципиент происходит перестройка координационной сферы комплексов металл-коллаген, а также частичная десорбция ионов металлов из сформированных до имплантации комплексов.

3. Элиминация ионов металлов, координационно связанных с тканью имплантата, наиболее активно происходит вследствие их взаимодействия с биологически активными компонентами среды реципиента, в первую очередь, органических кислот, аминокислот и белков плазмы или сыворотки крови реципиента.

4. Установлено, что максимальной конкурентной активностью в отношении ионов кальция в модели подкожной имплантации крысам обладают катионы металлов, формирующие комплексы с кислородсодержащими лигандами коллагеновой матрицы ксеноимплантата -Cr(III), Fe(III) и Cu(II) в кислой среде.

5. Показано, что продолжительность антикальциевого эффекта катионов переходных металлов, координированных коллагеновой матрицей, в значительной мере зависит от устойчивости сформированных комплексов.

6. На основе метода Са-селективной ионометрии разработана и испытана модель, позволяющая in vitro охарактеризовать потенциальную способность биоматериала к необратимой сорбции ионов кальция и влияние на нее различных факторов, в том числе сорбции ионов переходных металлов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Для экспериментального изучения взаимодействия коллагеновых структур (ксеноимплантатов) с ионами переходных металлов, обладающих спиновым моментом, высокоинформативным является метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), а для ионов металлов, обладающих ядерным моментом - метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР).

2. При изучении динамики взаимодействия"имплантат/реципиент" можно использовать метод спиновой метки для исследования образования и трансформации металлокомплексов с коллагеновой матрицей биологических эндопротезов.

3. Параметры процесса десорбции металлокомплексов из коллагена, получаемые в предложенной модели динамической инкубации в сыворотке или плазме крови, аналогичны таковым in vivo, что позволяет использовать данную модель, как более простую, для изучения трансформации и элиминации металлокомплексов из биологического материала при воздействии среды реципиента.

4. Для изучения процессов образования (при сорбции) и пост-имплантационной трансформации (при десорбции) комплексов коллагеновых структур с ионами переходных металлов в качестве тест-модели может бьггь использован очищенный коллаген из кожи крупного рогатого скота, т.к. коллаген является преобладающим компонентом кардио-васкулярных биопротезов, и структурные трансформации в очищенном

« коллагене и ксеноклапане при их консервации затрагивают одни и те же аминокислоты.

5. В комплекс мероприятий при скрининговых исследованиях кальций-связывающих свойств имплантируемых материалов может быть включена разработанная модель in vitro, как технически простая, позволяющая тестировать большое количество материала и обладающая высокой информативностью.

6. Для предадсорбции катионов металлов переходного ряда на коллаген целесообразно использовать следующие режимы: концентрация водных растворов не более 0,01 М (использование буферных растворов нежелательно, так как ионы буфера могут включаться в комплексо-образование), время инкубации в растворах солей (предпочтительыми являются хлориды, как наиболее физиологичные) - 12 часов с последующей 3-кратной отмывкой в течение 3 часов от несвязанных катионов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Журавлева И.Ю., Кузнецов П.В., Гантимурова И.Л., Барбараш Л.С. Диэпоксиды и их производные в консервации биопротезов клапанов сердца.// Биосовместимость.- 1994.- т.2.- N 1.- с. 13-22.

- I.Yu.Zhuravliova, P.V.Kuznetsov, I.L.Gantimurova, L.S.Barbarash. The use of diepoxy compounds and derivatives in the preservation of heart valve./ / Biomaterial-Living System Interactions.- 1994.- v.2.- N.I.- p,l 1-19.

2. И.Ю.Журавлева, И.JI.Гантимурова, Е.И.Ромашевская, А,И,Коко-рин, Л.С.Барбараш. Взаимодействие ионов Cu(II) с коллапеновыми ксеноимплантатами, консервированными глутаральдегидом. // Био- = » совместимость,- 1994.-T.2.- N 4.- с.20-26.

- I.Yu.Zhuravliova, I.L.Gantimurova, E.I.Romashevskaya, A.I.Kokorin,-L.S.Barbarash. Interaction between Cu2+ and collagen xenoimplants preserved ' -with glutaraldehyde.// Biomaterial-Living System Interactions.- 1994.-V.2.-N.4.- p. 189-197.

3. Л.С.Барбараш, И.Ю.Журавлева, И.Л.Гантимурова, И.Ю.Кудрявцева. Влияние факторов реципиента на кальцификацию ксено-имплантатов, консервированных глутаровым альдегидом.// Трансплантология и искусственные органы. -1995. -N 3. с.48-51.

4. АИ.Кокорин, И.Л.Гантимурова, И.Ю.Журавлева, А.Н.Кузнецов, Л.С.Барбараш.' Изучение ксенобиопротезов клапанов сердца методом ЭПР.// Биофизика,- 1995. -т.40,- N 3. с.609-613.

5. Zhuravleva IJu., Novikova S.P., Igolinskij V.A, Gantimurova I.L., Barbarash L.S. A new generation of conservants for bioprostheses of the heart- » vessel system. //J. Adv. Materials. 1995,- N2,- P.133-138.

6. И.Л.Гантимурова. Взаимодействие коллагеновых ксеноимплан-татов с ионами переходных металлов.// Биопротезы в сердечно-сосудистой хирургии.- Мат-лы Симпозиума с международным участием. Кемерово, 1996 г. - с. 174-184.