Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Механизм неквантового освобождения медиатора из двигательных нервных окончаний

Млаистерстзо здравоохранения РСФСР КаЗЛНСЮТ тш, трудового красного зндм-чш государственный шшшшй институт кменк с. в. кураикшл

Нч правах рукописи

ВОРОНИ: зячеслл* «п«1иЛ1с::г!

УДК 612.815.21615.7853

механизм неквантового освобождения медиатора из двигательных нервных окончаний

Г* - нормальная ф\<эистап«.:-

А Ь Т о р е ф «; Р I; '

я«-.««-:. н - соясканве ученей степени ыйдвдчтр кедецинехлх наук

Казань, 1930

Работа выполнена в Казанском государственном медицинской институте им. С. В. Курашова.

Научный руководитель: кандидат медицинских наук, доцент Е.Е.Никольский.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор П.Е. Дуйилей;

кандидат биологических наук, доцент С.С.Хируг.

Ведущее учреждение - институт эволюционной физиологии и

• биохимии им. И. М. Сеченова С г. Ленинград)

Защита состоится " /0 " С/Ле/. < 1990 г. в .у часов на заседании специализированного 'Совета Д 084.29.03 при Казанском ордена Трудового Красного Знамени государственном медицинском институте им. С.В.Курашова С420012, г.Казань, ул.Бутлерова, 49).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института Сул.Бутлерова, 496).

Автореферат разослан " /Л " ¿'ЧАС,* 1990 г.

Ученый секретарь специализированного теоретического Совета, кандидат медицинских наук

Р.Х.£"кедзянов

( ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Одной кз важных задач современной синапто-эрк ,,язляется выяснение молекуяярных механизмов освобождения ментор» из нерввня окончаний. В настоящее врем известив' тра оо-rsaua формы секреции ацвтнлхолина САЮ из двигательных нервных <ончаний: вызванная кааа.овая секреция, спонтанная кпантовая э&реция и спонтанное кэквантоэоэ освобождение CThesleff, 1986; ^kocii st ai. , 1989), Установлено, что неквантовое освобождение Зеспечивает <33-9W. общего выхода "елиатора вне возбуздения CVys-:-cii. Ules, 1Q70. 1979\ Показано, что неквантовое освобождение даатора является процессом, характерным не только для холичер-гсской системы, но также имеет место и в глутаматном синапсе »nMnov. Кадагапяк, ICSO; Аоточот, Млгаэанйи, 1С39), Такая odpa-)м, имеются основания полагать» что значение некзаятезлго ооьо-¡жденая медиатора для системы мекклеточных взаимоотношений досрочно существенно (Taue, 1982; Thesleff, 1936). В частности, гльзя исключить участие АХ неквантового происхождения в нзйро-гафическом контроле состояния поперечнополосатого мышечного важна со стороны мотонейрона (tethers, Thesleff, 1978; Drachman, anley, 1982). Кроме того, учитывая, что основная ч. зть спонтан-■ освобождаемого АХ имеет неквантовое происхождение, можно предлагать, что в условиях ннгибированной ацетилхолинестерагн 'АХЭ? vivo, например, при отравлениях соответствующими ингибиторами.. новные патогенетические изменения могут развиваться за счет на-пл<?ния в синаптичоской щели медиатора, освобождаемого именно в квантовой форме. Вместе с тем, механизм, осуществляющий нехван-вую секрецию медиатора, до сих пор точно не устаиовчен. Экспе-ментальны" данные позволяют лишь полагать, что процесс некван-вого освобождения значительно слоотее, чем простая дш5фузия по адйенту концентрации (Katz, Miledi, 1981; Dolezal et al., 3982; skocii el ai , 1983). Высказываемые гипотезы требует дополните-ных подтверждений поскольку не соответствуют отдельным эксп9-ментальным данным. Гак, гипотеза Визи о триггерной роли натрий-пиевого насоса в неквантовом освобождении СVizi, 1978) протиьо-чнт результатам исследования зависимости неквантового выхода от эклеточной концентрация ионов калия (Vyskocil et al., 1983), а ?длоз®нное Здвардсок с соавт. (Edwards et al , 1985, 19SS) объ-тение механизма неквантоЕОй секреции функционированием системы

-г -

транспорта АХ в везикулы не согласузтсл с дзннкуи об отсутствии прямой сияэи кеиу квантовым :i неквактовкк освобождением медкатс [ (Kalz, Miledi, 1981; Vyskocil et al. , 1C83). Относительно учг сткя АХ неквантового происхождения t нейротрсфдческом контроле, факта б пользу воздействия гидрелкзуекого холкномиметика на кемс ранний потенциал покоя (ШП) мыленного волокна имзет лишь косье* ь:;;Я характер CBray et al. , 1982; Dr&chnan et al. , 1982). Наряду этим приводятся данные против влияния АХ, освобождаемого б кеква ктовой па МПП мышечного волокна ССурОЕ'дев к соавт., 1S83)

Таким образом, иеяанкзм неквантового освобождения АХ и его роль в скстеиз нервно-мышечных взаи^соткоие.чий является еде кеде статочно изучекиыш, поэтому исследования в этой области актуаль ны как в теоретическом отновенкк, так и в прикладном, токсикологическом, аспекте проблемы.

Цель и задачи исследования. Целы) работы явилось исследовани механизма неквантового освобождения АХ ;;э двигательных нервны окончаний на объекте "диафрагмальный нерв - полудиафрагма" бело{ шага, а также выяснение способности АХ неквантового происхоадени модулировать состояние постсинаптической мембраны. В соотгетстви о этим были поставлены следующее конкретные задачи:

1. Поиск оптимальных экспериментальных условий для исследования неквантовой секреции АХ с установлением временного интервала в котором з-.jt способ секреции сохраняется неизменным при инкуба цки нервно-мышечного препарата in vitro.

2. Выяснение температурной зависимости и эффективной энергии активащш процессов квантового и неквантового освобождения АХ.

3. Детализация влияния ионов кальция на неквантовое освобожде ние АХ.

4. Сопоставление динамики изменений спонтанной квантовой и не квантовой секреции АХ после нарушения анатомической целостности двигательного нерва и в ходе его регенерации.

5 Установление возможной корреляции между величиной некванто вой секреции АХ и уровнем НЛП скнаптической области мызечного во локка в процессе дегенерации и регенерации нервных терминале».

6. Лучение роли системы захвата холина высокого сродства в кахакизкэ неквантового освобождения АХ.

7. Исследование влияния АХ неквантового происхождения и экзогенного АХ в аналогичной концентрации на постс::лапт::ческу» мемб-

.ну в условиях интактной АХЗ.

Каучзгл .хзизка. Яровздено сйсте!йТ'.:ч"скоэ ксс.'.е'.ль»*!« <■ >вого АХ ул ^ъекте - ш^гр—^ал;.;::;;: ьор¿..г,-:^".•>;•;-

гГ' -г различных экспертг'дэнталья'л: рэзтт.--.:: ~

.-•'ссгавле,!-;:!. ос споет, няой квантовой седр^иея А.1.'. >станоы1>?.< нператуоная зависимость некБантового освобождена* Ал. Ьиъуоые рог- -ггьс онзч'Г.-.-г з$^к-пзкоа а. эргаа актива«.« процесса яеква-ог.-'и секрет:АХ. Попучепи вовне сашпю относительно действия чек на снитог.ы?. эьглод А". ~~?ято-

нт ¡¡^¡-аитсього сл\:у7стхзу<?т, одкгко эффект и'с'юв

льция на неквантовга выход по сравнен1!г> с влиянием «а спонтан-.. >.>--« с-йьглпап ^напи.^ует^я постепенно и зависит от интен

ии^ти П"ОтуП1?вЯЯЯ "0«0Н ГЯЯЫ1ИН НИуГОЬ НеОЬНОИ ТврЬоиШ. Й»>-

ны изменения квантовой а неквантовой секреции АХ в процессе де-черации нервных терминалей: после передавливания двигательного эва прегхе всего прекращается неквантовый выход АХ, в процессе ¡•снерчщч; нерва восстановление неквантового освобождения АХ чествует установление полноценной квантовой сек^-цни. Обнару-1? положительная корреляция ыеаду величиной неквантовой секре-) АХ и степенью гиперполяризации синалтичэской области мышечно-колокна в условиях и.чта.чт.чеЯ АХЭ. Впер?ь*с- покапало.. что блок::-¡ание сгсТ'Э'.'М захвата холина высокого сродства (СЗХВСЗ приводит »рекоазздв» неквантовой секреции, в то время хьк активирование '.':С ->я:лтст.гуат прзкрз&гнию кекгантоьо!' вы/.оа.а АХ в процессе :?*ль»сй и ;:.у;ацш; нервяо-мывечиых препаратов б проточном раст-

Получены свидетельства в пользу того, что АХ неквантового 1ИСУояд«н::я участвует в регуляции !'2Ш мышечного волокна.

Пс леденил, вьносимые на защиту. 1. Неквантовое освобождение АХ - особая форма нейросекрэцин, ичная от квантоЕ го освобождения медиатора, функционально зэнная с процессом захвата холкна в кгртоое ?. АХ неквантового срс::схо/дения являетс1 :нл:. ^акторов держания гиперполяризации синаптичесхои ооласти мембраны ыы-ного волокна по отношению к внесинаптической.

Научно-практическая ценность. Полученные данние позволяют Зяиэаться к понимании молекулярн.-п; механизмов функционировал;:.-: темп освобождения АХ в неквантовой форда, поскольку дают воз-чость прямо связать этот процесс с высокоаффинным транспортом

холнна ъ нервную термккаль.

Установленный факт прекращения неквантового освобождения АХ поело передавливают двигательного нерва ла фоне продолжающейся спонтанной квантовой секреции явился основой для разработки моде ли селективной блокады неквантового выхода, что привело к получе hîid убедительных доказательств участия АХ неквантового происхождения в регуляции Ш1 мышечного волокна.

Практическая ценность работы заключается в возможности использования полученных данных для более глубокого понимания взаимоотношений между нервом к мышцей, что необходимо для обоснования патогенеза нейродистрофических заболеваний, шетденервационных изменений в опорно-двигательном аппарате и отравлений антихолинес-теразными препаратами.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на I Всесоюзном биофизическом съезде СМосква, 19823, IV Всесоюзной конференции "Физиология и биохимия меди-аторных процессов" (Москва, 1985), III сессии Научного Совета АН СССР по физиологии висцеральных систем (Ленинград, 1986), обце-институтской конференции молодых ученых (Казань, 1S87), на научных заседаниях кафедры нормальной физиологии Казанского медицинского института и Татарского отделения Всесоюзного физиологического общества им. И. П.Павлова (Казань, 1988, 1989, 1990).

Реализация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 10 работ. Данные исследования включены в лекционные курсы по нормальной физиологии, а также медицинской и биологической физике для студентов Казанского государственного медицинского института им.С.В. Курашова.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы. Работа изложена на 138 стр., иллюстрирована 15 рисунками и 5 таблицами. Указатель литературы включает 188 работ, из них 155 - иностранных авторов.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили на нервно-мышечном препарате из диаф-рагмального нерва и полудиафрагмы беспородных белых мышей обоих полов. Для опытов брали взрослых половозреякх особей весом 18-20

v, в acuj^mre от 9 до 15 мостов. Всего било вспояъзовэяо 1200 м1в0ткых.

Гш приготовления йерзко-иыгэчггого" препарата у»йотнс*> декапк-тировалн, вскрывал;' грудную клетку, брали на лигатуру левый дкаф-рагкаяьанй нерв на максимальном ур.'апеяж от и. отх-репа-

ровкиала до коста »хождения a муецу, после чего отделяли переднэ-левый сектор диафрагмальноя мыашы с. нервом, длина культи которого составляя?, и у мепге 3 см. Препарат» отмюаяг от крови р течение

минут в 2-3 сменах растьоса Рапгера-Кре-бс« ь псязйвяа в чку, фиксируя мыицу с помоаьо тонких металлические ца дис:.е к смо.тн Svlg?td СИЛА).

В эксперимента через ваааичку с ^¿^едл^г""- г

рвко-мшечиым препаратом вепреривно, со скоросхьо 1 мл з ¡яш., перфузкроваяи раствор Ряигера-Кребса для тепяокроаиых следующего состава Св ммоль/я): Кай - 137,0; КС1 - 5,0; CaClg - 2,0; MgCl2 •• 1,0; йаЯСОд - 11,0; МзН2Р04 - 1,0; глюкоза - 11,0; рН раствора поддергивали на уровне 7,2-7,25; температура в большинстве экспериментов составляла 20+0,5°С. В течение 40-50 минут до начала а во вр.лш эксперимента раствор аэрировали газовой смесью, состоящей из 95% кислорода и Ъ'А углекислого газа.

Лл? необратимого ингибирования АХЭ использовали сулыЬат аоьм-на ¡'СССР) в концентрации 1-10 коль/я. Блокирование никотиновых холшгороцептсрсЕ СУР) осуществляли d-тубскураринхлоридои CWellco-р.е, Великобритания) в концентрации 1-10"® мель/л.

Биопотенциалы регистрировали внутрикяеточно, с помоцью обычной микроэлектродной техники CLing, Gerard, 1949; Костик, 1960).

Спонтанное неквантовое освобождение АХ оценивали по величине Н-эффекта CVyskocil et al., 1983): в 16-25 мышечных волокнах : ¡-меряли МПП в синаптической области после необратимого ннгкбирова-ния АХЭ армином при ..нкубашга в течение 30 минут, затем с помоцью сЬтубок^аринхлорида блокировали ХР и через 5 минут вновь измеряли МПП синаптической области в 16-25 мышечных вояоконах; Н-зффек-том считали разницу между средними величинами МПП до и после блокады ХР. На каждое измерение МПП в 16-25"мышечных волокнах требовалось 3-5 минут.

При статистической обработке экспериментальных данных исполь-зом"и параметрический t-критерий Стьпдента СУрбая, 1963; Плохин-гкий, 1970; Лакин, 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Дипа^ша изменений спонтанной ьекьант вой секреции АХ при инкубации нерзйо-кышечного препарата в проточном растворе

Исходная величина МПП синаптаческой области гсышечнш: волокон предварительно обработайте армином нервко-мьЕЗЧНьгх препаратов сук-^атвенно не менялась лишь в течение 1 часа пребывания препарата в проточной растворе (73,310,4 мВ; п = 100; Р > 0,13. Ужэ через 30 минут инкубации МПП возрастал (01,9*0,5 иВ; п = 100), м разница по сравгеаив с исходном уровнем становилась достоверной СР < 0,05). В дальнейшем МПП продолжал увеличиваться л стабилизировался через 3 часа от начала опита (03,7*0,5 ;.!3; п = 120). Результата измерения Н-эффекта в аналогичных условиях полностью согласуются с данными первой серии экспериментов. И-зф^ек.т в начале опыта составлял 6,140,6 мВ Сп = 80) и оставался относитольно постоянным в течение 1 часа СР > 0,03). Через 80 минут Н-з$фект существенно отличался от исходной величины (4,1 ±0,7 мЗ; п = 80; Р < 0.05), а через 2 часа снижался более чем в два раза. Через 3 часа добавление б-тубокурарина практически не угняло МПП синаптическсп области (1,110,8 «В; п = 100).

В контрольных экспериментах средняя акплитуда к частота МПКП не изменяли . достоверно эа 3 часа инкубации в протоке СР > 0,15. В дополнительной контрольной серии опытов при ингнбированной АХЭ после З-хчасоьой инкубации нервно-мшечнмх препаратов в проточны!! раствор вводили ацетилхолина хлорид з близкой к создаваемой неквантовым способом секреции концентрации (5-10~®моль/л). Это деполяризовало синоптическую область в среднем на 3,0±0,6 мВ (п = 7Ь), а последующее добавлениз б-тубокурарина гиперполяризовало облает, синап л на 5,1*0,7 ыВ Сп = 75). То есть Н-эффект, вызванный экзогеннш АХ, был близок к контрольному значению. Поэтому привеченные результаты позволяет считать, что изменения уровня поляризации синаптической области мышечных волокон при ингибиро-ванной АХЭ, а также снижение Н-эффекта при пребывании нервно-мы-.ючннх препаратов в проточном растворе отражают изменения величины неквантовой секреции АХ. То есть с течением времени ш vit.ro происходит по репейное угнетение неквантового выхода АХ с полным прекращением через 3 часа инкубации.

T?î.tn -\: к* процесса >.г.олта.:«ой квантовой и !гскр?:чтовсй секреции

-"■о?-': •-;- - ' .--г мг ^.re^L^e '¡смлерагур с. Y * 1 ' " '■ : :.л 1: .v.'i г ¿'0;üC_d;i.

ваК" у?» "Г" I? r:rtr-c-~s;<-.n, ; оспами

т'У -.плс -; -7' \ „; > J '.у -ос.;.;».,>;ла i.JvV, uD

Cr. - iLZ'y, a i.pw IG С - o.ysû.V" кв (n = 100.!. Увеличение Н-яф-

r^ ,•-• . г-.. „ ' '" ' '' " .......

20 до 25°C сопровождалось снпг.эни-з:,! Н-зф$ек1а практически а 3 ра- — inbJ Ч. i| — iJUJ. Vldilt^HfJll'Il^1^ m-dmiUOUllû 1Г-П.1ПАГ,Л1.1».>1

lu--- я p^crj îl • i л, и цра 3'j^'j ого сродкяз ген'ичя-

па составляла 5,2iO,8 мВ Cn - 1003. При -д.-щ1оратур2 растворов ваше 35°С нам не удгяось по::ут:тъ уотойчиього Ес-ярсизгедснгя результатов, очеаадао, рсярдст&кс резкого снлу.енил ыкавгексста тканей in vitro и нарастания дегенеративных процессов. Кривая зависимости величины Н-зффекта от температуры окружавде;. среды была скор тировэна на возможнее изменения чувствительности постсинап-TH4t.-t:noü мембраны к медиатору.

и;,г, т-^лпрьгург; л j...; И частота i'JÎKJl

nor ■!..:.■.v Ii ■: ¡::-рг:'л акт/г.аи:::! (.t. J двух iopM

гра J.i:? и ; лл ri л. ллл л,л 'л.л лррсл.л ¡'лло.лзь '.'. с^аьт. , 1972: сгде-ьн: лл .лчл .-,л>ьГ, ' лть ï / лягоеои секреции. Ey сгллтл-koîî клл1: л :- '--'лллл .v.-'j:.:.;:';;:-: 13 б хчая/моп., a ДЛЯ

CL

Ч'-кр лггл с : :■ zzz<~ кдлл; 'i: /ллтлл т^.-жсратурк^й за-

£,-.-, л,лл и "лл-лт,< l л-орллл J;l,5 - Я0°0 :: £5 - 35°С Е* равнялась, состгетсrtfcHHO, 10.3 и 3,2 ккал/уоль.

Итак, температ)_ шэ зависимости двух видов спонтанного осво-6r'j;er'\! л.лллл. ло лллгл: е;:о дс:-:г.гать.'1ьс';ьо:.1 раз-

г.гга" ''-:".:.:глзко1, ргатизуяеих эти процессы. Что se касается неквантового освобождения АХ, то гипотеза о простой "электродиффузии" молекул медиатора может быть отвергнута, так как энергозависимость такого транспорта веществ не превышает 3 ккал/моль (Fran-kenhauser, Moore, 1S63), что существенно ниже полученных данных.

Влияние ионов кальция на .механизм неквантового освобождения АХ

Среднее значение МПП синаптической области в условиях инги-

- в -

бированаой АХЭ при нормальном ионном составе раствора составило 78,1*0,6 ыВ (п = 120). Блокирование ХР сЬтубокурарлнок гиперполя-оизовало сннаптическую область ка .6,1*0,7 мВ (п = 100). Через 5 минут после удаления кальция из растворг. МПП синаптичоской области равнялся в среднем 79,4*0,5 мВ (п = 100), а Н-эффокт - 5,5*0,6 мВ Сп = 100). В дальнейшем МПП продолжал постепенно увеличиваться, а Н-эффект сниааться, и через 45 минут уровень МШ1 си'.гг.тиче-ской области достигал 83,9* 0,7 мВ (п = 120), в то время как добавление d-тубокурарина в раствор не вызывало гиперпояяризации. Срадняя амплитуда МПКЛ в бескальциевой среде снижалась не солее чем на 10% от исходной величины. Следовательно зарегистрированные изменения МПП и Н-зффекта отражают преимущественно пресинаптичес-кие события, а именно, угнетение иеквантового освобождения АХ.

Для выяснения, обратимы ли изменения в нервной терминала после блокады неквантовой секреции удалением кальция из среды,били проведены эксперименты в обратной последовательности, то есть с нормализацией ионного состава внеклеточного раствора: после ингиби-рования АХЭ в бесхальциевоы растворе Н-эффект отсутствовал, а добавление кальция в среду до 2,0 кмоль/л приводило к постепенному, в течение 45 «¡нут, восстановлении величины Н-эффекта до контрольного уровня в 5,9*0,7 мВ (п = 100); одновременно с ростои Н-эф-фекта в области концевых пластинок развивалась деполяризация -МПП снижал i па 4,1*0,8 мВ Сп = 120).

При исследовании зависимости Н-зффекта от содержания ионизированного кальция в среде показано: максимальный неквантовый выход приходится на концентрацию, равную 2,0 мыольуя, что соответствует литературным данным CVyskocil et al., 1983). Однако, как уменьшение, так и увеличение внеклеточного содержания кальция приводило к болте крутому угнетению иеквантового выхода, а при 7,0 i эль/л гльций в среде Н-зффэкт отсутствовал.

Для выяснения влияния на неквантовое освобождение интенсивности поступления кальция в нервную термяналь измеряли Н-эф$ект в препаратах, инкубированных в растворах с различной концентрацией кальция, а также с повышенным (7,5 ммоль/л) и пониженным (2,5 ммоль/л) содержанием калия в среде. Изменение интенсивно^ и поступления ионов кальция в нервную терминаль адекватно изменяло величину неквЕ "ового освобождения АХ, приводя к смешению всей кривой зависимости неквантового освобождения от внеклеточной концен-

трацин кальция: при деполяризации мембраны нервной терминалн по-

выкенкем кзлик в среде максимальный Н-эффект имел место при ; ,5 мколь/л, а при гиперполяризаций - линь на уровне 2,5 умоль/л кальция в растворе.

При с.лекаже г.:ояа кальция в клетку ионами марганца (5-30'" моль/я) /ш:1?!ти:а гтпететм неквантовой секреции АХ била аяало.нч-на таково-л, найт.да&мой после изъятия из среги ионов г а лык*

В оесяальциевой среде добавление сахарозы до кемвватрздиь ОЗяг'Иб-ДО^Ы&й КОСМЗлглчМР ЧаСГоТП ЙЙКП Сб-!0~" П?! 'Л/ """ стмюклкъэмо ьвкьакгс1».>го ссвоЗо'здэи!« ч ЛХ. Следс^л-ггы»- зо:лп • некие ионизированного кальция внутри нервных терминален не диота-то"»" ппщиомпйл Цивьс^* «^р«»?'"

¡■¡так, устайоьлепп |;ис;\>;;с«:2£гс?1. 3 цжмччгитм «-в

крецин на бистро? изменение концентрации кальция и среде а развитием максимума эффекта через 45 минут. Однако изменение величины неквантового выхода в ответ на смэну растворов начинается практически сразу, хотя и развивается медленно. Така» отсутствует кальций-независимый компонент неквантового освобождения АЗ'.. Таким оо-разем, мы имеем основания утве-рндать, что действие ионов кальция на процесс кехгаитового освобождения АХ зн~читеяька сложнее, чем на *ь.чнтоьув секрецкв, и, видкчз. вкжшт н сося пкмаие н* опсередэзтккш: звенг.с*ь, например, на сингеь АХ, но наряду о наш нельзя исключать и прямое дейстано кальция на механизм пэклытг вой секр-ец!»'.

Изменения спонтанного квантсьога и неквантового осмЗмяаккз АХ при дегенерации и регенерации ц^рвивк терминале;:

Величина 'Н-эффэкта уже через ] час после денерваиии составила всего 3,710,7 мВ Сп - 186), ю есть снизилась по сравнению с исходным уровнем почти на 50% СР < 0,001). Через 2 часа после пере-давлинания нерка Н-эффект уменьшился до 30%, а через 4 часа достиг пределов стандартной ошибки измерения - 0,810,9 кВ С а - НО). Через 5 часов, после денервации добавление в среду оЬтубокурарина практически не вызывало гиперполяризации постсинаптической мембраны - 0,2Ю,8 мВ Сп = 104). В дальнейшем, вплоть до начала реге-нера ./а, Н-эффект отсутствовал. Таким образом, была зарегистрирована монофаг,ная динамика угнетения неквантовой секреции АХ после передавливания двигательного нерва.

Изменения спонтанного квантового освобождения развивались

иначе: средняя частота МПКП достоверно не менялась в первые 4 часа после денервации и составляла от 0,7*0,1 с_1(п = 50) до 0,831 0,1 с"Чп =69); Р > 0,05. Однако к 6 часу после передавливания нерва частота МПКП возрастала и этот сдвиг становился существенным - более чем в 1,5 раза СР < 0,001), а к 8 часу частота МПКП увеличивалась более чем в 3 раза (2,55*0,25 с-1, п = 60). Позже начиналось снижение частоты МПКП и одновременно с этим в отдельных нервных окончаниях прекращалось спонтанное квантовое освобождена медиатора. Так, через 10 часов после передавливания нерва в 38%, а через 12 и 14 часов, соответственно, в 64 и 02% мышечных потоков но регистрировалась спонтанная квантовая активность. Через 56 часов после денервации 1-ШКП исчезали во всех исследованных волокнах.

Вместе с тем, за все 16 часов, истекших с моманта передавливания лиафрагмального нерва, мы не обнаружили достоверного изменения чувствительности постсинаптической мембраны к медиатору: средняя амплитуда МПКП оставалась в пределах от 1,2*0,2 мВ (п = 50) до 1,07*0,2 Сп = 50), Р > 0,05.

В отличие от события, связанных с дегенерацией нервных тер-миналей, процессы реиннервации более продолжительны. Кроме того изменения, наблсдаемые в ближних к месту передавливания мышечных волокнах, опережали таковые в более удаленных участках. Первым признаком восстановления нервно-мышечного контакта в ближайших к месту передавливания нерва мышечных волокнах был небольшой Н-эф-фект: на 8-е сутки после денервации - 1 3*0,6 мВ Сп = 100, Р < 0,05). МПКП при этом отсутствовали во всех исследованных мышечных волокнах. В дальнейшем имело место постепенное увеличение Н-эффе-кта в ближних к месту передавливания нерва волокнах , и на 10-е сутки после денервации он уже превышал 50% от исходной величины, составляя 3,7*0,7 мВ Сп = 116, Р < 0,01). На те же 10-е сутки приходится начало восстановления спонтанной квантовой секреции: в 8,5*/. исследованных волокон были зарегистрированы МПКП, однако, крайне низкой частоты - 0,1210,06 с~*(п = 45). Впоследствие восстановительные процессы в более отдаленных от места передавливания нерва мышечных волокнах отставали на 2-4 суток от проксимальной зоны препарата. В наиболее отдаленных участках, а следовательно и во всем исследованном сегменте диафрагмалькой мышцы, Н-зф-фект устанавливался в пределах исходной величины (6,2*0,55 мВ, п

= OOi л*< iß-«*- оутк« посие переяаыжезякя нерва. Bowanr.sr.eHHe спои ..язтгт'Ч'ой секреции иродо.чгаяось ни фол1- кориыюэоьэд-

шегоот ,1-л, .-..рчт';. с. мдл'да ■•'•-> Нд i''"- лттпг ноопе донеивайп:. ЮТ? регистри(.«/ыыа^ ро ж*х •< г -лг^тн-.ч ,-aw :> ,.:! тяьник у-:.!. Ti;r.... ;-:¡sr.u сгоп««!.т частота ffiui с-. ыкьль mi-твльис. '.¡¡<mí». ,»..oä и да .vu.i.'i i.-mвольно:; ¡^ин'Г.'н: тч» воем

;--•!':■'„!..'.> ЧЯ 3U~e «У Ш; ;„■;!>€ ¡¡Йр0дпи:мпа><.ин '.¡-«и! CV,' :

Связь Некваич-Ubv/.'C „'.i •• ..: •

--.-.унята холина высокого сродства

Блокпну -а;»!' • • •> .. —"-™"1 »"'•«»WI- iiyví-««::."::' «»у»« спо-

собами.- слэтнмчески' нвгиэпторя/ - гь^иилпиипс... С 1958: Pot.trr, íS^O: Узвгкига, Suyóoi ,i973) п кэьягяеи »5 среды ■1ЛНОП }Tavp«íT с ;v:.í?Hcn ¡jA на uoau л;:;нл (Vaca, Piiar, учи-

гьгоая вкраюгнкую иатриеьув Cí-дБС (Dirks, Haga,

toda, 1973; Sitr.on, Kuíur, 1976). Сказалось, что уке через 10-15 «тут после введения гомикояшшя s раствор ii-эффект снихаяся до "•AHr.iCTJjr'í опвбки измерения - 0,0*0,7 мВ Си = 80). По

'!'• '•:•" вклйд гимихоли-

^riüOi ■ . -¡ve ;/r С * Ь..; ;. i.

ЗО'чк" к л::, c;ib:<-'i ь ^ .це:^: ь.-,; í •-.•■••.иг. -

нд-З ьл '.■ л!!. 3¿:.:;;¡.± -wi.™

НТ»Й В раСТЮЬС- ьр^^иЫа ь S;C4í'óHijb.Ji:i:¿,

оаобне действе» гкмихолкнил: í'illi ь ехшапичеекои при «л-

нбировакной АХЭ составлял через 15 минут после э.имкнйаи» иомл» атрия из среды 81,8*0,4 мВ (п = 120), а после добавления d-r/0o-/рарина - 81,1*0,6 мВ m = 120).

Таким сбраэом, блокада захвата холина вццекого сродства как гмихолинием, так и изъятием ионов натрил из средь, приводила к гстрому прекращению неквантового освобождения АХ.

Активация СЗХВС присутствием холина хлорида в среде (1-10"^ >ль/,т) существенно замедляла динамику угнетения неквантового ос-)бох,..>ния AX in vitro по ср^вноиию с бесхолиноЕкм раствором: чг -■а 2 час;! инкубации препаратов величина Н-эффекта снижалась лишь . 25% С в то время как в растворе без холина Н-эффект уменьшался лее чем на 50%), через 3 часа протока, когда неквантовое осво-

бождение в бесхоликовом растворе прекращалось, величина Н-эффекта в среде с холином составляла в среднем 3,8*0,7 мВ (п = 110), то есть более 60% от исходной величины.

При активации СЗХВС сочетанием присутствия холина в среде с низкочастотной, СЗ имп. -с-1) вызванной активностью нервных терминален Н-эффект. оставался практически в пределах исходной величины и составлял через 3 часа 5,7*0,6 мВ Сп =80)!

В нервно-мышечных препаратах, подвергаемых непрямой электро-стимуяяцни с более высокой частотой (20 имп. •свеличина Н-эффекта через 15 мин. составляла 3,6*0,7 мЗ Сп - 80), а 30-минутная стимуляция снижала Н~зф$ект до 2,1*0,С мВ Сп = 100).

Исходная средняя амплитуда МПКП составляла 1,2*0,2 мВ Сп = 50), а после SO-минутной вызванной активности нерва снижалась до 0,85*0,3 мВ Сп = 50), то есть более чем на 30%. Следовательно определенный вклад.в уменьшение Н-эффекта вносило и понижение постсинаптической -чувствительности, однако более суяественное значение в снижении Н-эффекта в этих условиях имело, таким образом, уменьшение неквантового освобождения АХ.

Полученные результаты указывают на наличие тесных взаимоотношений между процессом неквантового освобождения АХ и обратным захватом холина высокого сродства. Конечно интенсивность неквантовой секреции может .^висеть от содержания АХ в нервных окончаниях, а следовательно и от скорости синтеза медиатора. При угнетении СЗХВС происходило, видимо, со временем и снижение, содержания АХ в нервных терминалях, однако прекраш. чие неквантовой секреции наступало сразу после блокирования захвата холина. Вместе с тем, известно, что для быстрого истощения запасов АХ в ткани необходимо сочетание блокады обратного захвата холина с высокочастотной стимуляцией нерва CBirks, Macintosh, 1961). То есть, в наших экспериментах модулировалась в первую очередь именно СЗХВС, что и обусловливало сдвиги в процессе неквантового освобождения АХ. Вместе с тем, снижение неквантового выхода при повышении частоты стимуляции нерва можно объяснить смещением равновесия в распределении, ресинтезируемого АХ в сторону более важного для нервно-мы-цданой передачи квантованного медиатора.

Постсинап твчес*сое действие АХ неквантового происхождения в условиях интактной АХЭ

При контрольных измерениях в условиях интактной АХЭ гиперпо-

ляризация ситиптической области мышечных волокон по отношении к ячеоинаптической составила в среднем 2,3*0," мР Сп = 100; Р < 0,05), Блокирован;:? ХР не иэмеаялс соотношения l ;«елкчиье МИЛ да-хду "нервной** и "беэк^рвной" частям? ><даечных видэксн: МПЛ равнялся, соответственно, 63,9*0,5 мВСп = 80) и 81,5*0,4 ','5 Сп = 80; Р < 0,05). Обработка препаратов специфическим ингибитором ATФазы, оу аба инок С1 -Ю'^соль/л), приводила вначале к исчезновение избыточной поляризации зоны синапсов: через 5 минут после введения оупбяина в п»рфуэиру<?&гч* раствор НПП в синаптической области составлял 80,9*0,5 мВ Сп = АО), а во йкесянагтической - 81,2*0,5 мВ Сп = ВО; Р > 0,05). В дальнейшем снижение МЯЛ а пр"сутстьни оуа-баина происходило параллельно в иннервироьанной и неиннервиронан-ной частях мышечных волокон

В препаратах, приготовленных через 2 часа после передавливания диафрагмального нерва, различие в МИЛ между синаптической и вне-синаптической областью уменьшалось до 1,3*0,7 мВ Сп = 80; Р > 0,05) а через 4 часа после денервации гкперполяриэация синапти-ческогс участка исчезала полностью? НПП в зоне концевых пластинок - 80,7*0,4 мЗ С г» = ТОО), а в "беткермгой" чьсти - 81,1*0,4 мВ Сп = 100). Пося^гуяее поетденервацисгаюе снижение НПП интенсивнее развивалось в синаптической области мышечных волокон, что соответствовало литературным данным (Albuquerque el al.. 197!, 1972).

Следует отметить практически полнее совпадение сроков уравнивания МТШ синаптической и ьнесинаптической области ь условиях активной АХЭ после передавливания нерва со сроками прекращения неквантового освобождения АХ после аналогичного экспериментального воздействия.

Для определения концентрации АХ, обеспечиваемой неквантовым освобождением, кг.:тьзп*али модель селективной блокады неквантовой секреции АХ - нервно-мышечнпй препарат, приготовленный из де-нервированной за 4-5 часов до начал;. опыта нолудиафрагмы. Величина Н-эф-^кта в присутствии экзогенного холиномиметика в среде была ближе всего к контрольному значению С5,7*0,5 мВ; п = 100) при конце; градин АХ-С1 5-Ю-8 мсль/л.

В нерьно-м1тэ>рчных препаратах, приготовленных через 4-5 часов после денеовации мышцы, добавление в перфузионный раствор АХ-С1 в установленной концентрации вызывало при неингибированяой АХЭ гиперполяризацию синаптической области мембраны мышечных волокон в

- ь;

среднем ка 3,4t0,6 мВ Сп - 150; Р < 0,05), б то же Бремя МЛП вне-сикаптическоЗ облает;; не менялся: 81,7*0.5 мВ (п = 150) в присутствии АХ ь среде и Gl,lt0,5 v.3 (n = 150) в исходном состояния CP > 0,05). Как предварительное, так и последующее введение d-тубо-курарина ь раствор не ьлияло на МПП

В среде, содергацей оуабаии, добавление АХ до "неквантовой" ксяиентраци не вызывало возникновения гиперполяризации спнаптиче-ской области мембраны мышечных волокон: МПП ь зоне концевых пластинок - 78,7±0,5 мВ Сп = 110), в несиналтической зоне - 77,9±0,4 «В Сп = 110; Р > 0,05).

В препаратах, приготовленных из нормально инкервированных и из денерьированных за 5 часов до эксперимента диафрагм, изучали влияние ионов кальция на гиперполяризацк» синаптическо;! области мембраны мышечного волокна по отноиению к внесинаптической при интактной АХЭ. Полученные результаты показали кальциевую зависимость гиперполяризуюцего эффекта АХ неквантового происхождения: избыточная поляризация области синапсов исчезала после изъятия кальция из среды как в нормально инпервированных, так и ь денер-вированньа препаратах с добавленным в среду АХ в "неквантовой" концентрации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Источником медиатора как квантового, так и неквантового происхождения является цитоплазматическиР АХ, который синтезируется с использованием холина, захваченного из внеклеточной среды с по-мооьп системы захвата холина высокого сродства ССЗХВС). Работа этой система сопряжена с неквантовым освобожением АХ из цитоплазмы нервной термннали.

Полученные данные позволяют считать АХ неквантового происхождения одним из факторов, регулирующих МПП мышечного волокна, а именно, фактором, участвующим в обеспечение гиперполяризации синап ти ческой области мкиечного волокна по отношению к Бнесмнапи -ческой в условиях интактной АХЭ.

ВЫВОДЫ

1. Неквантовое освобождение АХ обладает сложной температурной

' —-"'а ОТНОСИЧёЛ^.Л/Л 7ЛМу:,<Л><Л , л'

ЛИ М.-ЧГ.'-! = Г- - у.у ?-;>:.':<-'« -;•*-■:. ! *0'"' Л-ЛСРЧНТСВЬГИ г г» --•Т^-.'^Т. ^фй^КТИУчаЛ оЛ;7Л'Л "Г..":-' Л ■

5- сл • с* •*«<» квантоьий

с. и,". л г.\'.-> п;-'. -. -т ' - .я -.Г ?--• ; ■ г- ¿X иа ксхия

."--У::-.""'.'«* ионы кальиця /¡-....г . . -

| --" р'1 < т *о •■•л.' •'. ^ : пост<п,^(...;:. - ' *

чие от розяелстайя я-•• » -• • . _• ••

"вчшуо.'.ру"'"1 т састворз приводит к . - •

со»д>-кв.: С? а^^:""""* кальция в среду ьосстая^ь-

лйр&»т некьантоьуг; сеьгедик» » т:'""™» >«.,7 г »пеуе-

ни.

3. Угнетение нчу ьан^ового ссвоЗозллнля АХ ь ходе дегенерации неррной термин а ли предшествует /.зченсииям спонтанней кьавтойсй секреции.

4. Исчезновение гиперголяриэации синалтической об ль ста "-'«брани мышечного волокна в условиях интактноЯ АХЭ после анатомической

■ аи:-".' лул-о-о.^л с:н'*рочно с яр«крааеннем неквантового осьо-

осл-.л-лш ~ -X.

^ д пчегя-т.л1 — глл" "и »-'--л-- •' л-ллкдл-ш-- А> ~ол лз» 1;-ллг-.лтея пг^где - --г-.

Г < ч- ■ у"....."-и- 7-с -" лл с. Л '-{•:■■ л- --л

Н"!\>-'1НТ - 7 1 -С" .■)- Ал Г>">< ; ' .5;' . ■■ ;

Ч.11.СЧ' улл-лр-л

7 ',-у.'.-Т„'И?уТО'гг-^ 7 ."ЛИ-- Лл-Л'- 7 , .....Л,Л ■ 4

имп. о '') акт:1---'-, с к" , л • с ^ л ■: л:--1 ■--тл77л,'г-7'

снижению неквантовой секреции Ал гру ан?л-гг-с-л^е'^'ллл пркми-т ь састЕоре. Увеличение чв^т-г^: -. .'ч/л.-цил

г>.!г:.1"с>г~юг'> -—л-.--. ."'л •>"- *.г.-:-т<»в1т скит.ение кеквантозсп

секреции АХ.

8. Добавление гечихолиния-З в среду, л«.-. у, • - ич---

рия, приводит к прекращении неквантового освобождения АХ.

3 *н-.<■•> ~ч "У « концентрации, близкой к обеспечяваеютЯ не-

«•»н- --у .•г-'-с-кч-'/. •"' л-. •■'яЛггочпус поляризецип

.чил»:::., ^ -••.:. ^ •- л-7 7- лу-'- 'к: < и «пи гтснов

ция из средн.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Воронин В.А., Никольский Е. Е., Выскочил Ф. Влияние температуры ü ионов калия на неквантовое освобождение медиатора из двигательных нервных окончаний // I Всесоюзный биофизический съезд. Тез. докл.- М., 1982.- C.108-Î09.

2. Воронин В.А., Никольский Е.Е. Исследование температурной зависимости неквантового освобождения ацеталхолина // Периферический синапс. V Всесоизн. скт. Тез.докл. - Казань, 1S84.- С. 57.

3. Оранская Т.К.» Воронин В.А., Никольский Е.Е. Соотношение квантового и неквантового освобождения ацетиихолина аз двигательных нэрвянх окончаний на ранних сроках после анатомической денерва-ций // Там же - С. 170.

4. Воронин В. А. Роль неквантового освобождения ацеталхолина в регуляции мембранного потенциала мышечного волокна // Тез.докл. IV Всессвзн.коиф. по фиэиол. и биохим. медиаторов.- М» 1985. - С.67.

5. Никольский Е. Е., Воронин В. А., Оранская Т. И. Динамика изменений caoHTaHKofä квантовой и неквантовой секреции ацеталхолина и& двигательных нервных окончаний посла перерезки нерва // Доклады АК СССР. - 1985.- Т. 281, Ii 3,- С. 762-764.

6. Никольский Е.Е.„ Воронин В.д., Оранская Т,И. Восстановление спонтанной квантовой к неквантовой секреции медиатора из двигательных нервнга окончаний в ходе реиннервации диафрагмальной мышцы мыши // Доклады AI, СССР, - 1985,- Т. 285, Ml. - С. 246-249.

7. Воронин В.А., Никольский Е.Е. Значение ионов кальция для процессов неквантовой секреции ацеталхолина из двигательных нервных окончаний // Доклады АН СССР, - 1985,- :.285, H 4.- С. 1019-1021.

8. Никольский Е.Е., Воронин В.А. Температурная зависимость процессов спонтанного квантового и неквантового освобождения медиатора из двигательных нервных окончаний мыши // Нейрофизиология.-1986.- Т. 18, № 3, - Ç. 361-367.

9..Воронин В.А., Оранская Т.И. Кальций как модулятор неквантового освобождения ацеталхолина из двигательных нервных окончаний // Вопросы нейробкологии. Иаучн.труды КГМИ. - Казань, 1987.- С. 16-20. lO.Effect of cholinomimetic agents and of electrical stimulation of the development of postdenervational depolarization of muscle fibers in manraaiia / Khamitov Kh.S., Poletaev G. I., Volcov E. M., Urasaev A. Kh.. Chikin A. V., Voronin V. A. // Trends in the Pharmacology of Neurotransmission. Bulg?"-'11" - 1987.