Автореферат и диссертация по медицине (14.00.43) на тему:Маркеры активации и гибель клеток индуцированной мокроты при бронхиальной астме и хронической обструктивной болезни легких

на правах рукописи

Пазыч Светлана Анатольевна

Маркеры активации и гибель клеток индуцированной мокроты при бронхиальной астме и хронической обструктивной

болезни легких

14.00.43. - пульмонология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Владивосток 2005

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Владивостокском государственном медицинском университете Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Невзорова Вера Афанасьевна Научный консультант: доктор химических наук,

Лукьянов Павел Александрович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Дальневосточный государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «29» июня 2005 года в 10 часов на заседании диссертационного совета К 208.007.02 при Владивостокском государственном медицинском университете по адресу 690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан «28» мая 2005 года

Ученый секретарь

Потапов Владимир Николаевич доктор медицинских наук, Кочеткова Евгения Анатольевна

диссертационного совета

Актуальность проблемы

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) и бронхиальная астма (БА) относятся к наиболее распространенным заболеваниям человека, которые являются одной из ведущих причин заболеваемости, смертности, увеличения расходов на здравоохранение во всем мире и представляют значимую медицинскую и социальную проблему [А.Г. Чучалин, 2004].

В последние годы пристальное внимание привлек к себе неинвазивный, простой в выполнении, безопасный и экономичный метод индуцированной мокроты (ИМ), т.е. метод получения мокроты после ингаляции 3-5% гипертонического раствора NaCl [C.H. Авдеев и колл., 1998].

В настоящее время БА и ХОБЛ рассматриваются с позиции хронического воспалительного процесса дыхательных путей, при котором основные клеточные участники находятся в функционально активном состоянии и несут на своей поверхности выявляемые фенотипические молекулы [J. Bousquet et al., 2000; СИ. Овчаренко и колл., 2003]. При БА находят увеличенную воспалительную инфильтрацию бронхов активированными лимфоцитами и эозинофилами с последующей их дегрануляцией [В .И. Пылкий, 2001; D. Adamko, 2002]. Аллергический компонент воспаления связывают с присутствием CD4+ субпопуляций Т-лимфоцитов и экспрессией гена для интерлейкина (Ил)-4 и Ил-5 [А.Г. Чучалин, 1998; V. Gemou-Engesaeth, 2002]. Кроме того, у больных Б А на мембранах эозинофилов, мигрирующих из кровотока или находящихся в тканях, повышается экспрессия CDllb + , CD54+, CD63+, CD25+, CD4+ и HLA-DR+ рецепторов [МЛ. Потапнев, 1997]. Имеются данные об особенностях субпопуляционного состава лимфоцитов при аллергической и неаллергической формах астмы, которые экспрессируют на мембране различные маркеры активации и синтезируют различные виды цитокинов [А.Г. Чучалин, 1998; S. Ying,2001].

В патогенезе ХОБЛ ключевая роль принадлежит полиморфноядерным лейкоцитам (ПЯЛ), мигрирующим в стенку бронха и вырабатывающих большое количество биологически активных веществ, протеаз, повреждающих ткань бронхов и легких. Медиатором хемотаксиса нейтрофилов является Ил-8 [Е.И. Шмелев, 1999]. Показано, что при ХОБЛ увеличивается число CD3+, CD8+,

CD68+, CD25+, HLA-DR+ лимфоцитов. Причем повышение количества CD8+ лимфоцитов считают биологическим маркером ХОБЛ [M.Saetta, 2001].

В литературе широко обсуждается роль апоптотической гибели эффекторных клеток в развитии воспалительного повреждения при БА и ХОБЛ [H.U. Simon, 1998; A. Vgnola, 1999; А.А. Ярилин, 2001]. Как показывают работы некоторых авторов, в данной ситуации наблюдается угнетение апоптотической активности клеток, а применение глюкокортикостероидов (ГКС) вызывает индукцию их апоптоза [М. Melis, 2002]. При этом значение некротических процессов в формировании хронического воспаления при БА и ХОБЛ практически не изучено. В связи с этим представляет интерес исследование показателей некротической и апоптотической гибели клеток ИМ у больных БА и ХОБЛ.

Таким образом, изучение молекулярных механизмов функционирования рецепторной системы клетки, участия процессов апоптотической и некротической гибели эффекторных клеток в реализации воспалительного ответа при БА и ХОБЛ является актуальной проблемой медицины, решение которой позволит уточнить особенности воспаления при БА и ХОБЛ, разработать новые подходы к мониторингу течения болезни и оценке эффективности проводимого лечения.

Дель исследования состояла в изучении молекулярных и клеточных маркеров воспаления, показателей некротического и апоптотического индекса эффекторных клеток при БА и ХОБЛ в различные периоды заболевания и при использовании различных вариантов противовоспалительной терапии. Задачи исследования:

1. Определить содержание клеток, имеющих фенотип CD4+, CD8+, CD25+, CD 16+, CD95+ и HLA-DR+ в индуцированной мокроте при БА и ХОБЛ в динамике заболевания.

2. Выяснить рецепторную активность эффекторных клеток в индуцированной мокроте при аллергической и неаллергической форме БА.

3. Оценить влияние противовоспалительной терапии на состояние рецепторной системы эффекторных клеток в индуцированной мокроте при БА и ХОБЛ.

4. Изучить показатели некротической гибели эффекторных клеток в индуцированной мокроте при БА и ХОБЛ в динамике заболевания и при различных вариантах противовоспалительной терапии.

5. Установить показатели апоптотической активности эффекторных клеток в индуцированной мокроте при БА и ХОБЛ в динамике заболевания и при различных вариантах лечения.

6. Сравнить типы клеточной гибели эффекторных клеток при БА и ХОБЛ в различные периоды заболевания.

Научная новизна

Впервые продемонстрирована динамика экспрессии мембранных маркеров воспаления в индуцированной мокроте при БА и ХОБЛ в зависимости от периода заболевания, степени активности воспалительного процесса и применения различных лечебных программ.

Впервые оценена рецепторная активность клеток индуцированной мокроты при аллергической и неаллергической форме БА.

Впервые изучено содержание жизнеспособных и некротизированных клеток в индуцированной мокроте при БА и ХОБЛ в зависимости от периода заболевания, степени активности воспалительного процесса и применения ГКС-терапии.

Получены новые данные о состоянии апоптотической активности эффекторных клеток индуцированной мокроты при БА и ХОБЛ в динамике заболеваний и при различных вариантах лечения.

Впервые проведено сравнение некротического и апоптотического индекса клеток индуцированной мокроты при БА и ХОБЛ в динамике заболеваний.

Практическая значимость работы

Исследование индуцированной мокроты является доступным и информативным методом для мониторинга течения БА и ХОБЛ. В результате проведенных исследований определены возможности показателей экспрессии рецепторного аппарата клеток ИМ в качестве маркеров активности воспалительного процесса при БА и ХОБЛ, а также в качестве критериев для дифференцирования формы астмы. Расширение концепции биомаркеров позволит по новому взглянуть на патогенетические механизмы воспаления при БА и ХОБЛ, следовательно, появятся новые возможности более дифференцированного и эффективного подхода к диагностике и лечению этих двух заболеваний. Простым и достаточно

перспективным является метод оценки апоптотической и некротической гибели эффекторных клеток ИМ, внедрение, которого в клиническую практику позволит прогнозировать исход заболевания и оптимизировать программы лечения. Основные положения, выносимые на защиту

1. Экспрессия мембранных маркеров клеточной активации в ИМ при БА и ХОБЛ имеет значимые различия и зависит от активности воспаления, периода болезни и проводимой противовоспалительной терапии.

2. Установлены различия в состоянии рецепторного аппарата эффекторных клеток ИМ при аллергической и неаллергической астме.

3. Показатели жизнеспособности и некротической гибели эффекторных клеток ИМ у больных БА и ХОБЛ вариабельны в зависимости от периода заболевания, тяжести воспалительного процесса и проводимой терапии.

4. Апоптотический индекс ядер клеток, участвующих в воспалении, динамично меняется в течение БА и ХОБЛ и под влиянием противовоспалительной терапии.

Реализация работы

Рекомендации по применению метода ИМ для исследования рецепторной активности эффекторных клеток, показателей апоптотического и некротического индекса у больных БА и ХОБЛ внедрены и используются в клинической практике пульмонологических отделений Городской клинической больницы № 1 (ГКБ) и Главного госпиталя Тихоокеанского флота. Разработанные методические рекомендации используются в учебном процессе при подготовке клинических интернов, ординаторов, врачей-курсантов Владивостокского государственного медицинского университета. Апробация работы

Результаты исследования доложены на Европейском респираторном конгрессе (Берлин, 2001;Стокгольм, 2002; Вена 2003), XI Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Владивосток, 2004). Работа прошла апробацию на совместном заседании проблемных комиссий по внутренним болезням и пульмонологии ВГМУ (25 мая 2005г.). Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ.

Структура и объем работы

Материал диссертации изложен на 142 страницах машинописного текста на русском языке. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, состоящего из 210 источников (из них 72 отечественных и 138 иностранных). Материал иллюстрирован 30 таблицами и 21 рисунком, из них 12 фотографиями. Характеристика материалов и методов исследования

Нами обследовано 70 больных БА и 65 больных ХОБЛ, находившихся на лечении в ГКБ №1 и поликлинике №4 г. Владивостока с 2000 по 2004 г.г. Возраст пациентов с БА составил от 20 до 74 лет (средний возраст 43,8±2,1 года). Возраст пациентов с ХОБЛ составил от 40 до 70 лет (средний возраст 53,5±3,3). В контрольную группу вошли 30 здоровых лиц соответствующего пола и возраста, без клинических, лабораторных и функциональных признаков патологии легких.

Для постановки диагноза БА были использованы рекомендации адаптированного к российским условиям консенсуса (GINA 2002г.). Оценка функции внешнего дыхания у всех обследованных проводилась на спироанализаторе «Spirosift-500» фирмы «Fucuda» (Япония) с регистрацией петли поток-объем и компьютерной обработкой полученных результатов. Обратимость бронхиальной обструкции выявляли с помощью разгрузочной пробы с ингаляцией 400 мкг фенотерола.

В ремиссию астмы обследовано 39 человек, 10 из которых имели легкое течение заболевания, 22 - среднетяжелое течение, 7 - тяжелую астму, 18 человек имели неаллергическую (Intrinsic), 21 -аллергическую (Extrinsic) форму БА. В период обострения БА нами было обследовано 31 человек, из них у 4 пациентов наблюдалось легкое обострение астмы, 16 пациентов имели обострение средней степени тяжести, 11 - тяжелое, 14 человек имели неаллергическую (Intrinsic), 17 - аллергическую (Extrinsic) форму БА.

Для диагностики ХОБЛ была использована международная программа GOLD (Глобальная стратегия: диагностика, лечение и профилактика хронической обструктивной болезни легких, 2004 г.).

В ремиссию ХОБЛ было обследовано 31 человек, из которых 6 имели легкое течение, 20 пациентов - течение средней степени тяжести, 5 человек - тяжелое.

В период обострения ХОБЛ обследовано 34 пациента, из них 23 человека имели обострение средней степени тяжести, 11 - тяжелое.

Исследование ИМ проводили у пациентов БА и ХОБЛ, оценивая не только тяжесть течения и период заболевания, но также и с учетом проведения противовоспалительной терапии. В качестве противовоспалительных препаратов использовали иГКС (беклометазона дипропионат, флунисолид, будесонид, флютиказона пропионат), сГКС - преднизолон, пролонгированный теофиллин -теопек. При легком течении БА ряд пациентов получали кромогликат натрия. Кроме того, при обострении ХОБЛ 28 больным проводилась антибактериальная терапия.

ИМ получали после ингаляции 3-5% гипертонического раствора NaCl с помощью ультразвукового небулайзера «МУССОН». Для диспергирования и гомогенезации мокроты использовали 0,1% раствор дитиотриетола.

Материалом для исследования послужил клеточный осадок ИМ. Для определения рецепторов к CD4+, CD8+, CD25+, CD16+, CD95+ и HLA-DR+ антигенам использовали моноклональные антитела «Клоноспектр» (Россия, Москва). Апоптотически измененные клетки выявляли с помощью окрашивания клеточного осадка красителем Hoechst 33342 (Sigma). Некротизированные клетки выявляли окрашиванием клеточного осадка акридиновым оранжевым. Учет результатов реакций производился методом флюоресцентной микроскопии.

Математическую обработку полученных результатов осуществляли на компьютере в операционной среде Windows XP с помощью приложения Microsoft Excel с вычислением средней арифметической (М), ее ошибки (m), достоверности различий (р). Результаты исследования и обсуждение

Исследование ИМ контрольной группы обследованных показало, что у здоровых лиц присутствуют все виды исследуемых рецепторов (табл.1).

Таблица 1

Экспрессия CD-рецепторов в ИМ при ба_

Маркеры, % БА, ремиссия n=39 БА, обострение n=31 Контроль n=30

CD4+ 5,5 ±1,1" 27,7±2,1# 4,1 ±0,8

CD8+ 6,9 ±1,4" 16,5 ±1,3* 7,2 ±1,5

CD25+ 2,3+0,3" 18,4 ±2,2* 3,8 ±0,3

CD16+ 6,8 ±0,7" 20,1 ± 1,2* 7,1 ±0,9

CD95+ "10,4 ±1,6* 22,3±2,0# 5,1 ± 1,0

HLA-DR+ "4,9 ±0,7* 24,3 ±1,4* 12,1 ±1,1

* - значения достоверны по сравнению с контролем при р<0,05

# - значения достоверны по сравнению с контролем при р<0,02

" - значения достоверны по сравнению с обострением при р<0,05

При обострении астмы наблюдается повышение активности всех изученных маркеров с преимущественным усилением почти в 7 раз CD4+ рецепции. Имеющий место факт увеличения экспрессии CD4+ рецепторов многие исследователи связывают с доминирующим при БА присутствием аллергического компонента в структуре воспалительного ответа [А.Г. Чучалин, 1998]. Потапнев М.П. и колл. (1997) считают, что усиление HLA-DR+ рецепции обусловлено активной миграцией клеток в дыхательные пути во время реализации астматической реакции в период обострения заболевания. Активация CD25+ рецепторов, по мнению K.F. Chang (1999) и L. Cameron (2001), является результатом цитокиновой продукции. Повышение количества CD8+, CD 16+ и CD95+ может возникать в ответ на активную пролиферацию эффекторных клеток воспаления.

Установлено, что усиление рецепции для CD4+, CD25+, CD 16+, CD95+ и HLA-DR+ антигенов происходит параллельно нарастанию степени тяжести БА и максимально выражено при ее тяжелом течении. Тогда как число CD8+ клеток уменьшается по мере утяжеления течения заболевания и становится наименьшим при тяжелом обострении астмы.

При обострении астмы наиболее выражено снижает рецепторную активность клеток сочетанное использование сГКС и иГКС. В этом случае число CD4+ и CD8+, CD25+ и HLA-DR+ клеток максимально приближается к их содержанию у здоровых. Численность CD 16+ и

CD95+ клеток также уменьшается, но продолжает оставаться выше нормы, отражая сохраняющуюся пролиферативную активность клеток.

В ремиссию астмы независимо от тяжести течения заболевания происходит снижение количества CD4+, CD8+, CD 16+ и CD25+ клеток до контрольных значений, а рецепция HLA-DR+ становится даже ниже (см. табл.1). Число CD95+ клеток остается в 2 раза выше, чем у здоровых и нарастает параллельно тяжести течения болезни. Уменьшение маркеров клеточной активности и дифференцировки в период ремиссии астмы обусловлено ингибирующим действием ГКС, используемых в качестве базисной противовоспалительной терапии [А.Г. Чучалин, 1997; М.С. Liu, 2001]. С другой стороны сохранение более высоких показателей CD95+ антигена является результатом ее недостаточной эффективности и рассматривается как маркер Fas-рецепции при персистирующем течении воспаления [СВ. Бойчук и колл., 2001]. Максимальное падение уровня экспрессии CD+ антигенов наблюдается у пациентов с базисной терапией иГКС и их комбинации с теофиллинами при несущественном влиянии на нее кромонов. Предполагается, что противовоспалительный эффект теофиллина, установленный наряду с его бронхолитической активностью, сходен по механизму действия с ГКС и, может свидетельствовать о синергическом действии данных препаратов [А.Г. Чучалин, 2001].

В результате нашего исследования установлены различия в рецепторной активности клеток ИМ при обострении аллергической и неаллергической астмы, когда в первом случае происходит выраженная экспрессия CD4+ и CD95+ рецепторов и уменьшение представленности CD8+ и HLA-DR+ (табл.2).

Экспрессия CD-рецепторов в ИМ при аллергической БА

Таблица 2 неаллергической и

Маркеры

Контроль

Неаллергическая БА

% n=30 обострение n=14 ремиссия n=18 обострение n=17 ремиссия n=21

CD4+ 4,1±0,8 6,3+1,4 3,9+0,7 20,1 +2,6* #6,3+1,6

CD8+ 7,2+1,5 13,4+2,0* 10,2+1,9 3,1 + 0,7* 3,2+1Д*

CD25+ 3,8±0,3 11,2+1,8* #2,3+0,6 5,4 +0,5 #2,7+0,8

CD16+ 7,1+0,9 13,2+1,8* #6,1+1,0 [7,8 +1,1 #3,9+1,3

CD95+ 5Д±1,0 6,1+1,2 7,4+1,6 16,2 +1,3* 13,4+2,5*

HLA-DR+ 12,1+1,1 17,5+1,6* #4,9+1,7* 6,0 +1,1* 4,5+1,2*

Аллергическая БА

* - значения достоверны по сравнению с контролем при р<0,05

# - значения достоверны по сравнению с обострением при р<0,05

Обострение неаллергической астмы характеризуется повышением экспрессии всех маркеров клеточной активности, за исключением CD4+ и CD95+, содержание которых практически не меняется. М. Humbert (1999) в своих исследованиях установил, что дыхательные пути больных аллергической формой БА содержат высокий процент CD4+ активированных Т-клеток, в то время как при неаллергической астме имеет место выраженная тенденция к экспрессии CD8+ Т-клеток и активация таких маркеров как CD25+ и HLA-DR+.

В ремиссию БА различия в рецепторной активности клеток ИМ при аллергической и неаллергической форме заболевания регистрируются только в 2 популяциях - CD8+ и CD95+ клеток. Число цитотоксических CD8+ клеток максимально выражено при неаллергической астме, а количество CD95+ клеток остается повышенным при аллергической форме болезни.

В отличие от БА рецепторная клеточная активность у больных ХОБЛ в период обострения демонстрирует значительное повышение CD8+ субпопуляции (табл.3), которая по данным А.Г. Чучалина (1998), М. Saetta (1998), является биологическим маркером этого заболевания.

Таблица 3

Экспрессия CD-рецепторов в ИМ при ХОБЛ

Маркеры, % Контроль ХОБЛ ХОБЛ

п=30 обострение, п=34 ремиссия, п=31

СБ4+ 4,1 ± 0,8 5,7 ±0,7 0

СБ8+ 7,2 ±1,5 37,6 ±2,8" 8,1 ± 1,9#

СБ25+ 3,8 ±0,3 1,3 ±0,2* 0

СБ16+ 7,1 ±0,9 2,8 ±0,5* 0

СБ95+ 5,1 ±1,0 7,8 ± 1,3 3,4±0,7#

НЬА-БЯ+ 12,1 ± 1,1 6,9 ±1,2* 4,2 ±0,5*

* - значения достоверны по сравнению с контролем при р<0,05 " - значения достоверны по сравнению с контролем при р<0,02

# - значения достоверны по сравнению с обострением при р<0,05

Согласно нашим данным число СБ8+ клеток в ИМ увеличивается одновременно с нарастанием тяжести ХОБЛ. Численность СШ+ и СБ95+ клеток в ИМ при обострении заболевания не зависит от тяжести его течения и находится на уровне показателей у здоровых. Представляет интерес установленное снижение ниже контрольных значений количества СБ 16+, СБ25+ и Н!А-ВК+ клеток в ИМ при обострении ХОБЛ (см. табл.3). При этом экспрессия последних двух маркеров уменьшается с нарастанием тяжести обострения.

Как показали наши исследования, назначение в период обострения ХОБЛ сГКС вызывает снижение активности рецепторов для всех исследуемых СБ-антигенов, за исключением СБ95+, экспрессия которого не зависит от противовоспалительной терапии.

В фазу ремиссии ХОБЛ по сравнению с заболеванием происходит снижение СБ8+, СБ95+ и Н1А-ОК+ клеток с уменьшением двух последних даже ниже контрольных значений. Установленная динамика может быть объяснена уменьшением активности воспалительного процесса в дыхательных путях. В ремиссию ХОБЛ отмечено полное исчезновение рецепторной активности СШ+, СБ 16+ и СБ25+, которое вероятно связано с депрессией иммунного ответа и нарушениями дифференцировки и пролиферации Т-клеток. Нарастание тяжести ХОБЛ в период ремиссии характеризуется увеличением количества СБ8+, СБ95+ и НЬА-БК+ клеток.

Рецепторная активность клеток ИМ зависит от присутствия базисной терапии. Наиболее высокие показатели СБ8+ и СБ95+

наблюдаются у пациентов, не получающих противовоспалительное лечение. Применение теопека и иГКС равнозначно подавляют рецепцию CD8+. Снижение экспрессии CD95+ и нормализация HLA-DR+ рецепции происходит только при назначении теопека.

Нами изучено содержание жизнеспособных и некротизированных клеток в ИМ у больных БА и ХОБЛ. Согласно полученным данным в период обострения и ремиссии БА наблюдается равномерное увеличение в ИМ количества жизнеспособных и некротизированных лимфоцитов. Содержание живых ПЯЛ в ИМ при обострении и ремиссии БА значительно увеличивается, заметно превышая число погибших клеток в период обострения болезни (рис.1).

Наряду с этим при обострении БА происходит уменьшение количества жизнеспособных макрофагов и увеличение некротизированных клеток. В период ремиссии БА в ИМ количество живых макрофагов достигает контрольных значений, тогда как число некротизированных клеток возрастает еще более заметно. Содержание, как живых, так и некротически измененных эпителиоцитов в ИМ при обострении и в ремиссию астмы меньше, чем у здоровых (рис.2).

В период обострения ХОБЛ происходит увеличение в ИМ количества жизнеспособных и некротизированных лимфоцитов. Число живых ПЯЛ в этот период болезни также повышается, а содержание некротизированных клеток достоверно не отличается от контроля (рис.3).

В ремиссию ХОБЛ по сравнению с обострением заболевания цитограмма ИМ характеризуется снижением численности жизнеспособных лимфоцитов и ПЯЛ с одновременным повышением их количества с признаками некротической гибели (рис.3).

При обострении ХОБЛ содержание, как живых, так и погибших макрофагов не имеет достоверных различий по отношению к контролю. Тогда как число жизнеспособных и некротизированных эпителиоцитов становится достоверно ниже по отношению к их содержанию у здоровых (рис.4). В ремиссию ХОБЛ число живых макрофагов и эпителиоцитов практически не меняется. В то же время происходит увеличение их НИ (рис.4).

макрофага (ж) макрофаги (н) эпитслиоцкты (ж) эгштелиоциты (н) □ ХОБЛ обострение О ХОБЛ ремиссия Ш контроль * - значения достоверны по сравнению с контролем при р<0,05 # - значения достоверны по сравнению с обострением при р<0,05 Рве. 4. Содержание жизнеспособных и некротнэвроваявых клеток в ИМ при

ХОБЛ

Исследование апоптотической активности показало, что в ИМ как здоровых, так и больных БА и ХОБЛ присутствуют клетки, находящиеся на разных этапах апоптотической гибели. За апоптотический индекс (АИ) был принят показатель конечной стадии апоптотической гибели.

При обострении БА в ИМ число клеток с признаками преапоптоза снижается в 1,5 раза, а количество клеток с ярко выраженной фрагментацией ядерной ДНК увеличивается по сравнению с контрольной группой (табл.4).

Таблица 4

Показатели апоптотической гибели клеток в зависимости от _стадии процесса__

Группы обследованных Начальная стадия апоптоза АИ(%)

БА, обострение п=31 40,7±3,1* 36,3±2,0*

БА, ремиссия п=39 43,5±3,3* #28,5±1,1*

ХОБЛ, обострение п=34 44,6±2,4* #30,1 ±1,5*

ХОБЛ, ремиссия п=31 46,1±2,4* #24,4±1,8

Контроль п=30 60,5±0,7 #22,5±1,2

* - значения достоверны по сравнению с контролем при р<0,05

# - значения достоверны между стадиями апоптоза при р<0,05

Установлено, что одной из главных причин задержки апоптоза является повышенная экспрессия белка Ьс1-2 и уменьшение активности молекул Вах, противодействующих их антиапоптотической активности [Новиков, 1996; А. У1§по1а, 2001]. Активация конечной стадии апоптоза, наблюдаемая в нашем исследовании, может быть связана с использованием ГКС в лечении БА, которые являются источниками внешних сигналов для запуска генетически детерминированной гибели, и направлена на уравновешивание пролиферативной активности клеток при воспалении.

В ремиссию астмы по сравнению с обострением заболевания количество клеток с признаками ранней стадии апоптоза не изменяется и остается ниже показателей у здоровых. В то время как в конечную стадию наблюдается снижение апоптотической активности клеток ИМ (см. табл.4).

По данным нашего исследования, АИ ядер клеток ИМ в период обострения и ремиссии БА зависит от тяжести воспалительного процесса и максимально выражен при тяжелом течении болезни (рис.5).

БА обострение БА ремиссия контроль

0 легкая БА В средняя БАИ тяжелая БА * - значения достоверны по сравнению с контролен при р<0,05 Рис. 5. АИ ядер клеток ИМ при ВА

Применение ГКС в период обострения астмы снижает содержание клеток с начальными признаками апоптоза и вызывает его индукцию в конечную стадию. Назначение в период ремиссии БА ГКС оказывает противоположное действие и приводит к снижению АИ ядер клеток и повышению их количества с ранними проявлениями апоптоза.

Обострение ХОБЛ также характеризуется снижением числа клеток в стадию преапоптоза и повышением их АИ (см. табл.4). Индукция апоптоза эффекторных клеток при ХОБЛ, в частности нейтрофилов, может быть обусловлена проапоптотическим действием цитокинов. Кроме того, зрелые нейтрофилы экспрессируют большое количество молекул CD95+, что является причиной их массовой гибели [МЛ. Потапнев, 2002]. Как показано на рис.6 степень повышения АИ клеток ИМ не зависит от тяжести обострения.

В период ремиссии ХОБЛ содержание клеток с признаками преапоптоза не отличается от их количества при обострении заболевания. Тогда как показатель АИ ядер клеток ИМ снижается и соответствует значению контрольной группы (см. табл.4). Установлено, что АИ клеток по мере нарастания тяжести заболевания имеет тенденцию к повышению, достоверно не отличаясь от контрольных значений при легком и среднетяжелом течении

ремиссии ХОБЛ. Максимальные показатели апоптотической активности зафиксированы при тяжелом течении ХОБЛ (рис.6).

31.4 ♦

28.8* 27 Л* <Ш1И ...... .

223 /Р-ЪУУ- 23,7 22.5

= 1

ЕЕ Ш-

'1лшг"г71 I

=кггг 555

'•»•И*»*»' |

вяаг

ХОБЛ обострение ХОБЛ ремиссия контроль

ЕЗ ХОБЛ I ст. И ХОБЛ П ст ШХОБЛШст. * - значения достоверны по сравнению с контролем при р<0,05 Рис.6. АИ ядер клеток ИМ при ХОБЛ

Использование в лечении обострения ХОБЛ теопека способствует увеличению числа апоптотически измененных клеток. Назначение сГКС в этот период болезни не оказывает влияния на показатели АИ клеток ИМ. Применение теопека при стабильном течении ХОБЛ индуцирует, а назначение ГКС замедляет апоптотическую гибель клеток.

В результате исследования выявлено, что в период обострения БА в ИМ количество некротически и апоптотически измененных клеток было одинаковым, тогда как в ремиссию заболевания преобладают некротические процессы. В период обострения ХОБЛ в ИМ преобладают клетки с признаками некротических изменений, а в ремиссию болезни их количество становится еще больше (рис.7).

Итак, проведенное нами исследование рецепторной активности клеток ИМ, показателей апоптотической и некротической гибели у больных БА и ХОБЛ показали дополнительные возможности оценки активности воспалительного процесса при этих заболеваниях, их дифференциальной диагностики, включая различные формы астмы, контроля течения болезни и оптимизации проводимой терапии. Выводы

1. Содержание активационных и дифференцировочных маркеров клеток ИМ у больных БА и ХОБЛ зависит от периода заболевания, тяжести течения и применяемой противовоспалительной терапии. При этом в клетках ИМ при БА преобладает экспрессия CD4+ антигена, тогда как при ХОБЛ происходит выраженное усиление ОБ8+ рецепции.

2. Установлены различия в состоянии рецепторного аппарата эффекторных клеток ИМ при обострении аллергической и неаллергической астмы, когда в первом случае происходит значительное повышение количества CD4+ и CD95+ клеток и уменьшение представленности CD8+ и HLA-DR+, во втором наблюдается повышение экспрессии всех маркеров клеточной активации, за исключением CD4+ и CD95+. В ремиссию БА различия в рецепторной активности клеток регистрируются только в популяциях CD8+ и CD95+ клеток.

3. Применение ГКС, а также их комбинация с теофиллинами при БА снижает активность всех изученных дифференцировочных маркеров. Назначение ГКС при ХОБЛ уменьшает активность в ИМ CD8+, CD25+, HLA-DR+ и CD 16+ антигенов и не влияет на состояние €Б95+ рецепторов.

4. Содержание жизнеспособных и некротизированных лимфоцитов в ИМ при БА повышается при обострении болезни, не изменяясь в ремиссию болезни. Пул полиморфноядерных лейкоцитов характеризуется увеличением числа жизнеспособных клеток со снижением их количества в ремиссию астмы. Эпителиальные и макрофагальные клетки ИМ при БА имеют противоположную тенденцию к содержанию лимфоцитов и полиморфноядерных лейкоцитов.

5. При обострении ХОБЛ увеличивается количество жизнеспособных и некротизированных лимфоцитов и полиморфноядерных лейкоцитов, уменьшается число живых и погибших эпителиоцитов, и отсутствуют изменения в группе макрофагальных клеток. Ремиссия ХОБЛ характеризуется снижением численности жизнеспособных и повышением некротически измененных лимфоцитов, полиморфноядерных лейкоцитов и макрофагов.

6. При обострении БА и ХОБЛ наблюдается усиление апоптотической активности эффекторных клеток, которое только в первом случае зависит от тяжести течения воспалительного процесса. В период ремиссии БА и ХОБЛ происходит снижение показателей апоптотической гибели клеток ИМ.

7. Использование ГКС в терапии обострения БА приводит к снижению числа клеток в начальной стадии апоптоза и повышает их количество на завершающем этапе апоптотического процесса. В ремиссию астмы ГКС активизируют начальную стадию и подавляют конечный этап апоптотической гибели клеток ИМ.

8. При ХОБЛ ГКС не оказывают влияния на АИ клеток ИМ в период обострения болезни и снижают его показатель в ремиссию. Назначение теофиллинов повышает АИ ядер клеток ИМ во все периоды течения ХОБЛ.

9. При исследовании типов клеточной гибели в различные периоды течения БА и ХОБЛ некротический индекс показывает преобладание над апоптотическим, за исключением обострения астмы, когда показатели АИ и некроза клеток ИМ практически одинаковы.

Практические рекомендации

1. Исследование в ИМ экспрессии маркеров клеточной активации у больных БА и ХОБЛ можно использовать для дифференцирования двух наиболее распространенных заболеваний, прогноза их течения и оптимизации проводимой терапии.

2. Оценка показателей жизнеспособности и некротической гибели клеток ИМ является информативным методом для диагностики периода болезни, тяжести воспалительного процесса и индивидуализации вариантов лечения.

3. Исследование апоптотической активности эффекторных клеток ИМ позволяет оценить тяжесть течения и период заболевания, а также получить информацию об эффективности используемых лечебных программ.

Список опубликованных научных трудов и изобретений

1. Биохимическое тестирование индуцированной мокроты у больных бронхиальной астмой и хроническим обструктивным бронхитом / Е.Н. Коновалова, ВА Невзорова, И.В. Чикаловец, С А. Пазыч // Пульмонология. - 2003. - № 3. - С. 43 - 47.

2. Исследование индуцированной мокроты при заболеваниях органов дыхания: учебн.-методич. пособие для врачей / ВА Невзорова, СА. Пазыч, Е.Н. Коновалова, Г.И. Масалов -Владивосток; Медицина ДВ, 2003. - 116 с.

3. Невзорова, ВА. Исследование мембранных рецепторов Т-лимфоцитов в индуцированной мокроте больных бронхиальной астмой и хроническим обструктивным бронхитом / В А. Невзорова, С А. Пазыч, С В. Кабанов // Бюл. патологии и физиологии дыхания. -2004.-№9.-С. 25-27.

4. Некоторые цитологические и биохимические показатели индуцированной мокроты у больных бронхиальной астмой и хроническим обструктивным бронхитом / В А. Невзорова, Е.Н. Коновалова, А.В. Хоменко, Н.Г. Плехова, С А Пазыч // Цитология. -2002. - Т. 44, № 12. - С. 1212-1219.

5. Содержание CD16, CD25, CD95 и HLA-DR антигенных детерминант в индуцированной мокроте больных бронхиальной астмой и хроническим обструктивным бронхитом / ВА. Невзорова, Е.Н. Коновалова, С А. Пазыч, А.В. Костюшко // Терапевт, арх. - 2003. -№11.-С.61-64.

6. Apoptosis and CD95-receptor in main cells of induced sputum of patiens with bronchial asthma and chronic obstructive bronchitis / VA. Nevzorova, E.N. Konovalova, T.N. Sourovenko, SA. Pazych // Eur. Respir. J. - 2001. - 502 s. - P. 3389. - Abstracts 11-th ERS Annual Congress. - Berlin, Germany, September 22-26.

7. Endothelial function of asthma patients in stable state and during exacerbation / E.V. Kalenic, V.A. Nevzorova, E.N. Konovalova, S.A. Pazych, I.M. Martynenko // Eur. Respir. J. - 2003. - 279 s. - P. 1810. -Abstracts 13-th ERS Annual Congress. - Vienna, September 27 - October 1.

8. Nevzorova, VA. Cell composition of induced sputum of patiens with bronchial asthma and chronic obstructive bronchitis / VA. Nevzorova, E.N. Konovalova, SA. Pazych // Eur. Respir. J. - 2001. - 368 s. - P.2529. - Abstracts 11-th ERS Annual Congress. - Berlin, Germany, September 22-26.

9. Nevzorova, VA. The regulation of apoptosis in induced sputum cells of patients with bronchial asthma using different therapeutic programms / VA. Nevzorova, E.E. Peteshova, SA. Pazych // Eur. Respir. J. - 2003. - 79 s. - P. 592. - Abstracts 13-th ERS Annual Congress. -Vienna, September 27 - October 1.

10. Nevzorova, VA. The typing of cells in the induced sputum and its apoptosis in patients with chronic obstructive bronchitis / V A. Nevzorova, SA. Pazych // Eur. Respir. J. - 2002. - 89 s. - P. 642. - Abstracts 12-th ERS Annual Congress. - Stockholm, Sweden, September 14-18.

11. Pazych, SA. Apoptosis activated T-lymphocytes in induced sputum of patients with asthma / S A. Pazych, VA. Nevzorova // Eur. Respir. J. - 2004. - 596 s. - P. 3656. - Abstracts 14-th ERS Annual Congress. - September 6-7.

12. Pazych, SA. Apoptosis activated T-lymphocytes in induced sputum of patients with chronic obstructive bronchitis / SA. Pazych, VA. Nevzorova // Eur. Respir. J. - 2004. - 319 s. - P. 2030. - Abstracts 14-th ERS Annual Congress. - September 6-7.

13. Pazych, SA. The influence of gluco-corticoids on apoptosis of activated cells in the induced sputum of patients with bronchial asthma / SA. Pazych, VA. Nevzorova // Eur. Respir. J. - 2002. - 384 s. - P. 2384. -Abstracts 12-th ERS Annual Congress. - Stockholm, Sweden, September 14-18.

14. Pazych, S.A. The typing of cells in the induced sputum and its apoptosis in patients with bronchial asthma / S.A. Pazych, V.A. Nevzorova // Eur. Respir. J. - 2002. - 384 s. - P. 2385. - Abstracts 12-th ERS Annual Congress. - Stockholm, Sweden, September 14-18.

15. State of endothelial function in patients with COPD in stable and during exacerbation / V.A. Nevzorova, E.V. Kalenic, E.N. Konovalova, S.A. Pazych, LM. Martynenko // Eur. Respir. J. - 2003. - 279 s. - P. 1811.

- Abstracts 13-th ERS Annual Congress. - Vienna, September 27 -October 1.

Список сокращений

АИ - апоптотический индекс, БА - бронхиальная астма, ГКБ -Городская клиническая больница, ГКС - глюкокортикостероиды, ИЛ

- интерлейкин, ИМ - индуцированная мокрота, иГКС -ингаляционные глюкокортикостероиды, НИ - некротический индекс, ПЯЛ - полиморфноядерные лейкоциты, сГКС - системные глюкокортикостероиды, ХОБЛ - хроническая обструктивная болезнь легких, CD - кластер дифференцировки, Fas - рецептор готовности клеток к апоптозу.

Лицензия на издательскую деятельность ИД № 03816 от 22.01.2001 Зак. № 167п. Формат 60x84/16. Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Подписано в печать 27.05.2005 г. Печать офсетная с оригинала заказчика.

Отпечатано в типографии ВГУЭС 690600, г. Владивосток, ул. Державина, 57.

H №005 \

1ЧЛ

ч

%

Актуальность Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) и бронхиальная астма (БА) относятся к наиболее распространенным заболеваниям человека, которые являются одной из ведущих причин заболеваемости, смертности, увеличения расходов на здравоохранение во всем мире и представляют значимую медицинскую и социальную проблему [10,55,59,63].Одним из наиболее ценных диагностических методов, используемых в клинике легочных заболеваний, является исследование мокроты. В последние годы пристальное внимание привлек к себе неинвазивный, простой в выполнении, безопасный и экономичный метод индуцированной мокроты (ИМ), т.е. метод получения мокроты после ингаляции 3-5% гипертонического раствора NaCl [2,100]. Исследование ИМ при Б А [210] и ХОБЛ включает оценку клеточного состава мокроты и биохимическое изучение супернатанта. Кроме того, с помощью исследования ИМ можно оценить вклад процессов активации и гибели эффекторных клеток в течение БА и ХОБЛ, а также возможности их регуляции при использовании разработанных лечебных программ [27,33].В настоящее время БА и ХОБЛ рассматриваются с позиции хронического воспалительного процесса дыхательных путей, при котором основные клеточные участники находятся в функционально активном состоянии и несут на своей поверхности выявляемые фенотппические молекулы [37,44,82,84]. При БА находят увеличенную воспалительную инфильтрацию бронхов активированными лимфоцитами и эозинофилами с последующей их дегрануляцией [74,131]. Аллергический компонент воспаления связывают с присутствием CD4+ субпопуляцией Т-лимфоцитов и экспрессией гена для интерлейкина (Ил)-4 и Ил-5 [63,101,116]. Кроме того, у больных БА на мембранах эозинофилов, мигрирующих из кровотока или находящихся в тканях, повышается экспрессия CDllb+, CD54+, CD63+, CD25+, CD4+ и HLA-DR+ рецепторов [44]. Имеются данные об особенностях субпопуляционного состава лимфоцитов при аллергической и неаллергической формах астмы, которые экспрессируют на мембране различные маркеры активации и синтезируют различные виды цитокинов [63,77,117,133].В патогенезе ХОБЛ ключевая роль принадлежит полиморфноядерным лейкоцитам (ПЯЛ), мигрирующим в стенку бронха и вырабатывающих большое количество биологически активных веществ, протеаз, АФК, повреждающих ткань бронхов и легких. Медиатором хемотаксиса нейтрофилов является Ил-8 [37,66,153]. Показано, что при ХОБЛ увеличивается число CD3+, CD8+, CD68+, CD25+, HLA-DR+ лимфоцитов.Причем повышение количества CD8+ лимфоцитов считают биологическим маркером ХОБЛ [63,92,137].В литературе широко обсуждается роль апоптотической гибели эффекторных клеток в развитии воспалительного повреждения при БА и ХОБЛ. Как показывают работы некоторых авторов, в данной ситуации наблюдается угнетение апоптотической активности клеток, а применение глюкокортикостероидов (ГКС) вызывает индукцию их апоптоза [27,33]. При этом значение некротических процессов в формировании хронического воспаления при БА и ХОБЛ практически не изучено. В связи с этим представляет интерес исследование показателей некротической и апоптотической гибели клеток ИМ у больных БА и ХОБЛ. Источниками внешних сигналов, приводящих к развитию апоптоза, являются многие факторы, в том числе и ГКС. Использование стероидов в терапии БА приводит к снижению экспрессии мембранных маркеров активации и повышению апоптотического индекса эффекторных клеток [159]. Однако мало изученными остаются вопросы медикаментозного влияния на процессы активации и гибели клеток при использовании различных методов лечения ХОБЛ. Таким образом, изучение молекулярных механизмов функционирования рецепторной системы клетки, участия процессов апоптотической и некротической гибели эффекторных клеток в реализации воспалительного ответа при БА и ХОБЛ является актуальной проблемой медицины, решение которой позволит уточнить особенности воспаления при БА и ХОБЛ, разработать новые подходы к мониторингу течения болезни и оценке эффективности проводимого лечения.Цель исследования состояла в изучении молекулярных и клеточных маркеров воспаления, показателей некротического и апоптотического индекса эффекторных клеток при БА и ХОБЛ в различные периоды заболевания и при использовании различных вариантов противовоспалительной терапии.Задачи исследования: 1. Определить содержание клеток, имеющих фенотип CD4+, CD8+, CD25+, CD 16+, CD95+ и HLA-DR+ в индуцированной мокроте при Б А и ХОБЛ в динамике заболевания.2. Выяснить рецепторную активность эффекторных клеток в индуцированной мокроте при аллергической и неаллергической форме БА.

3. Оценить влияние противовоспалительной терапии на состояние рецепторной системы эффекторных клеток в индуцированной мокроте при БА и ХОБЛ.

4. Изучить показатели некротической гибели эффекторных клеток в индуцированной мокроте при БА и ХОБЛ в динамике заболевания и при различных вариантах противовоспалительной терапии.5. Установить показатели апоптотической активности эффекторных клеток в индуцированной мокроте при БА и ХОБЛ в динамике заболевания и при различных вариантах лечения.6. Сравнить типы клеточной гибели эффекторных клеток при БА и ХОБЛ в различные периоды заболевания.Научная новизна - Впервые продемонстрирована динамика экспрессии мембранных маркеров воспаления в индуцированной мокроте при БА и ХОБЛ в зависимости от периода заболевания, степени активности воспалительного процесса и применения различных лечебных программ. - Впервые оценена рецепторная активность клеток индуцированной мокроты при аллергической и неаллергической форме БА. - Впервые изучено содержание жизнеспособных и некротизированных клеток в индуцированной мокроте при БА и ХОБЛ в зависимости от периода заболевания, степени активности воспалительного процесса и применения ГКС-терапии. - Получены новые данные о состоянии апоптотической активности эффекторных клеток индуцированной мокроты при БА и ХОБЛ в динамике заболеваний и при различных вариантах лечения. - Впервые проведено сравнение некротического и апоптотического индекса клеток индуцированной мокроты при БА и ХОБЛ в динамике заболеваний.Практическая значимость работы Исследование индуцированной мокроты является доступным и информативным методом для мониторинга течения БА и ХОБЛ. В результате проведенных исследований определены возможности показателей экспрессии рецепторного аппарата клеток ИМ в качестве маркеров активности воспалительного процесса при Б А и ХОБЛ, а также в качестве критериев для дифференцирования формы астмы. Расширение концепции биомаркеров позволит по новому взглянуть на патогенетические механизмы воспаления при БА и ХОБЛ, а следовательно появятся новые возможности более дифференцированного и эффективного подхода к диагностике и лечению этих двух заболеваний. Простым и достаточно перспективным является метод оценки апоптотической и некротической гибели эффекторных клеток ИМ, внедрение которого в клиническую практику позволит прогнозировать исход заболевания и оптимизировать программы лечения.Положения, выносимые на защиту 1. Экспрессия мембранных маркеров клеточной активации в ИМ при БА и ХОБЛ имеет значимые различия и зависит от активности воспаления, периода болезни и проводимой противовоспалительной терапии.2. Установлены различия в состоянии рецепторного аппарата эффекторных клеток ИМ при аллергической и неаллергической астме.3. Показатели жизнеспособности и некротической гибели эффекторных клеток ИМ у больных БА и ХОБЛ вариабельны в зависимости от периода заболевания, тяжести воспалительного процесса и проводимой терапии.4. Апоптотический индекс ядер клеток, участвующих в воспалении, динамично меняется в течение БА и ХОБЛ и под влиянием противовоспалительной терапии.

ВЫВОДЫ

1. Содержание активационных и дифференцировочных маркеров зависит от периода заболевания, тяжести течения и применяемой противовоспалительной терапии. При этом в клетках ИМ при БА преобладает экспрессия CD4+ антигена, тогда как при ХОБЛ происходит выраженное усиление CD8+ рецепции.

2. Установлены различия в состоянии рецепторного аппарата эффекторных клеток ИМ при обострении аллергической и неаллергической астмы, когда в первом случае происходит значительное повышение количества CD4+ и CD95+ клеток и уменьшение представленности CD8+ и HLA-DR+, во втором наблюдается повышение экспрессии всех маркеров клеточной активации, за исключением CD4+ и CD95+. В ремиссию БА различия в реценторной активности клеток регистрируются только в популяциях CD8+ и CD95+ клеток.

3. Применение ГКС, а также их комбинация с теофиллинами при БА снижает активность всех изученных дифференцировочных маркеров. Назначение ГКС при ХОБЛ уменьшает представленности в ИМ CD8+, CD25+, HLA-DR+ и CD 16+ клеток и не влияет на состояние CD95+ рецепторов.

4. Содержание жизнеспособных и некротизированных лимфоцитов в ИМ при БА повышается при обострении болезни, не изменяясь в ремиссию. Пул полиморфноядерных лейкоцитов характеризуется увеличением числа жизнеспособных клеток со снижением их количества в ремиссию астмы. Эпителиальные и макрофагальные клетки ИМ имеют противоположную тенденцию к содержанию лимфоцитов и полиморфноядерных лейкоцитов.

5. При обострении ХОБЛ увеличивается количество жизнеспособных и некротизированных лимфоцитов и полиморфноядерных лейкоцитов, уменьшается число живых и погибших эпителиоцитов, и отсутствуют изменения в группе макрофагальных клеток. Ремиссия ХОБЛ характеризуется снижением численности жизнеспособных и повышением некротически измененных лимфоцитов, полиморфноядерных лейкоцитов и макрофагов.

6. При обострении БА и ХОБЛ наблюдается усиление апоптотической активности эффекторных клеток, которое только в первом случае зависит от тяжести течения воспалительного процесса. В период ремиссии БА и ХОБЛ происходит снижение показателей апоптотической гибели клеток ИМ.

7. Использование ГКС в терапии обострения Б А приводит к снижению числа клеток в начальной стадии апоптоза и повышает количество клеток на завершающем этапе апоптотического процесса. В то время как в ремиссию астмы ГКС активизируют начальную стадию и подавляют конечный этап апоптотической гибели клеток ИМ.

8. При ХОБЛ ГКС не оказывают влияния на АИ клеток ИМ в период обострения болезни и снижают его показатель в ремиссию. Назначение теофиллинов повышает АИ ядер клеток во все периоды течения ХОБЛ.

9. При исследовании типов клеточной гибели в различные периоды течения БА и ХОБЛ некротический индекс показывает преобладание над апоптотическим, за исключением обострения астмы, когда показатели АИ и некроза клеток практически одинаковы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Исследование в ИМ экспрессии маркеров клеточной активации у больных БА и ХОБЛ можно использовать для дифференцирования двух наиболее распространных заболеваний, прогноза их течения и оптимизации проводимой терапии.

2. Оценка показателей жизнеспособности и некротической гибели клеток ИМ является информативным методом для диагностики периода болезни, тяжести воспалительного процесса и индивидуализации вариантов лечения.

3. Исследование апоптотической активности эффекторных клеток ИМ позволяет оценить тяжесть течения и период заболевания, а также получить информацию об эффективности используемых лечебных программ.