Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Моноклональные антитела в оценке общего и местного иммунитета при раке гортани и орофарингеальной области

Г Г В 0:1

I РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК Онкологический научный центр

На правах рукописи

5У/ 6"3 - осс. е-оп

АТАЕВ СЕТДАР ЭДЫРГУЛИЕВИЧ

ЮНОИЛОНАЛЬШЕ АНТИТЕЛА В ОЦЕНКЕ ОБЩЕГО И МЕСТНОГО ИММУНИТЕТА ПРИ РАКЕ ГОРТАНИ И ОРОФАРИНГЕАЛЬНОЙ ОБЛАСТИ

( 14. 00.14 - онкология )

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА - 1994

РаОота выполнена в отделении опухолей верхних дихатель-но-пищеварительных путей, лаборатории клинической радиоимыуио-логии Онкологического научного центра РАМН.

Научные руководители:

д. и. н.. профессор Ыатякин Е. Г. д. м. н.. профессор Кадагидзе а Г.

Официальные оппоненты: д. и. н. Бабакова С. В. д. и. н. Поляков & Г.

Ведущее учреждение

Московский научно-исследовательский институт им. П. А. Герцена ИЗ РФ.

Защита диссертации состоится ". 3...". . 1004г.

на васедании специализированного ученого совета ( К 001.17.01 ) при ОНЦ РАМН ( Иосква. 115478, Каширское шоссе, 24 ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОНЦ РАМН Автореферат разослан .. . . 19&4г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук,

профессор Турусов Е С.

- г -

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Среди злокачественных новообразований человека немаловажное место оани»гает опухоли головы и шеи. Заболеваемость раком гортани и слизистой оболочки полости рта занимает одно из веду-пзпс мест при данной локализации. В связи с этим ведутся многочисленные исследования в области этиологии, патогенеза, ранней диагностики, лечения, профилактики и эпидемиологии рака головы И шеи (Пачес А. iL , 1983).

Неплохие результаты получены в лечении опухолей данных локализаций, основным методом лечения которых является - хирурги-чеекпй. Последний в той или иной степени влияет на функции органов этой области, вызывает юэсметические дефекты лица и в целом отражается на социальной жизни больных.

Данное обстоятельство требует разработки более щадящих методов лечения которые могли бы служить дополнением к уже су-црствущим с целью максимального сохранения функции органов.

В настоящее время изучению иммунологической реактивности онкологических больных придается большое значение, поскольку кимуниал с::рте).'д оказывает непосредственное влияние на возникновений и последующий рост опухоли. Результаты исследований пзаишдействия организма и опухоли показывают, что росту опухоли организм противопоставляет прежде всего иммунную защиту (Петров Р. R , 1982).

В литературе последних лет отмечен интерес к изменениям гамунитета при paice гортани и орофарингеальной области. Однако, шогиэ цомзнты, отралашие. иммунный статус больного при этих вгболеваниях, изучены недостаточно. Известно,что рак гортани у полости рта призодит к снижению неспецифической иммунореактив-пости оргаикзиа (Забиров P.A., 1982; Кочкаров У. К , Насыров & А-, 1989). Данное обстоятельство требует обязательной оценки иммунного статуса больного, т. к. от этого зависят результаты лечения и прогноз в целом (Лгпченко С. Е и соавт. , 1988 , Мельников О. Ф. и соавт., 1989).

С появлением гибридомной технологии и получения многочисленных ионоклональных антител открылись широкие возможности более детального изучения изменений иммунной системы организма. Уровень й глубина иммунодиагностики в настоящее время зависят от того насколько используются"в них моноклональные антитела (Петров Р. Е, 1982; Кеннет Р. Г. и соавт., 1983; Кадагидзе 3. Г. , 1989).

Достаточное количество специальной литературы посвящено изучению изменений иммунитета при опухолях головы и шеи. Большинство исследователей, исследуя иммунитет больных ограничиваются изучением основных популяций лимфоцитов. Наличие на сегодняшний день 78 кластеров лейкоцитарных дифференцировочных антигенов делает неэффективными работы по оценке общего пула Т- и В-лимфоцитов без учета их субпопуляций. Клинические и кдини-ко-экспериментальные исследования в этой области необходимы для выяснения роли общей и местной иммунореактивности. Результаты этих работ могут предоставить возможности для улучшения диагностики, более точного прогнозирования клинического течения рака гортани и слизистой оболочки полости рта и разработки методов адоптивной иммунотерапии, что является актуальной задачей современной клинической онкологии и валено как с теоретической, так и практической точек зрения.

Сель, исследования: Исследовать иммунофенотип лимфоцитов в периферической крови и в опухоли у больных раком гортани и оро-фарингеальной области.

Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:

1. Оценить иммунный статус больных раком гортани и слизистой оболочки полости рта с использованием моноклональных ан- , тител.

2. Проанализировать фенотип лимфоцитов периферической крови у больных с указанными локализациями в зависимости от распространенности процесса, метастазирования, формы роста и степени злокачественности опухоли.

3. Оценить местный иммунитет больных раком гортани и, полости рта в зависимости от клинических показателей с помощью МКА к эпителиальным антигенам: HLA-1, HLA-DR, CD15 и UKA серии ИКО к дифференцировочным антигенам лимфоцитов: CD45, CD18, CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, CD22, CD38, CDllb, RFB-1.

4. Выявить корреляции между фенотипом лимфоцитов в крови и инфильтрацией ими опухоли.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ:

Впервые, для изучения иммунитета у больных раком гортани и слизистой оболочки полости рта использована широкая панель моноклональных антител для фенотипирования лимфоцитов. Дана детальная характеристика изменений содержания иммунокомпетентных

клеток в крови и степени инфильтрации опухоли лимфоцитами. Выявлены общие закономерности изменений показателей иммунной системы в зависимости от ряда клинических характеристик (распространенности процесса, регионарного метастазирования, формы роста и степени злокачественности опухоли). Впервые проведены попытки связать содержание лимфоцитов в крови с уровнем инфильтрации опухоли у больных данными локализациями.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ:

Проведенные исследования показали необходимость применения сирокой панели ыоноклональных антител для исследования иммунного статуса больных раком гортани и орофарингеальной области. Выявленные закономерности изменений иммунитета в зависимости от клинических показателей дадут возможность прогнозировать заболевание и в связи с этим разработать методы иммунокоррекции и иммунотерапии у указанной группы больных.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных дан-пых, заключения, выводов и списка литература Работа содержит 65 таблиц, библиография включает 178 названий, из них отечественных авторов 57, зарубежных 121.

АПРОБАПИЯ РАБОТЫ.

Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции с участием отделения опухолей верхних дыхательно-пищеварительных путей, опухолей головы и шеи, клинико-ради-оиммунологической лаборатории.

ПУБЛИКАЦИИ.

По материалам диссертации опубликованы три печатные работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

II. Методика определения иммунокомпетелтных клеток на криостатных срезах.

Непрямая реакция поверхностной иммунофлуоресценции

- 5 -

(РИФ) на криостатных срезах.

Замороженные срезы (толщиной 4-6 мкм) помещали по 3 среза на поверхность обезжиренных предметных стеюэл. Срезы фиксировали в ацетоне при комнатной температуре в течение 4 секунд. Перед окраской антителами срезы фиксировали в течение 10 минут в ацетоне при +4 С. Последующие этапы реакций проводили при комнатной температуре во влажной камере. Срезы инкубировали 10 минут в среде 199 рН-7,2-7,4. ЫКАТ (моноклональные антитела) наносили на 30 минут. Отмывали в среде 199 10 минут/Наносили ФИТЦ-меченные F(ab)2-фрагменты антисыворотки против глобулинов белой мыши на 30 минут. Отмывали в среде 199 10 минут. Клетки консервировали 50% глицерином на физиологическом растворе. Срезы закрывали покровным стеклом и характеризовали антигенположи-тельные клетки и структуры. Специфические реакции учитывали на микроскопе LeltE Orthoplan (ФРГ).

фи иммунофенотипировании опухолевых клеток с ЫКА ИКО 1, ИКО 53, Му 1 результаты реакции оценивали полуколичественным методом, предложенным НаттегИпд еЬ а1 (1987). Выделяли три типа взаимодействия антител с опухолью

1 тип - отсутствие реакции

(антигенположительные клетки не определяются)

2 тип - мозаичная реакция

(антиген присутствует на части опухолевых клеток)

3 тип - мономорфная реакция

(антиген присутствует на большинстве опухолевых клеток)

В качестве положительных считали реакции 2 и 3 типа

Цри иммунофенотипировании иммунокомпетентных клеток в опухоли выделяли 4 типа реакции:

1 тип - отрицательная

(практически полное отсутствие антигенположительных клеток в срезе)

2 тип - с минимальной инфильтрацией (единичные антигенопололи-

тельные клетки в срезе; несколько небольших групп анти-геноположительных клеток в срезе; единичные пенетрирую-щие в паренхиму опухоли клетки)

3 тип - с умеренной инфильтрацией

(небольшие группы антигенеположительных клеток; умеренное количество антигенположительных клеток, расположен-

них разрозненно; немногочисленные пенетрирующие в паренхиму опухоли клетки) 4 тип - с выраженной инфильтрацией

(крупные антигеноположительные инфильтраты; множественные группы антигенположительных клеток; множество одиночных клеток, пенетрирующих в паренхиму опухоли) Ери дальнейшем анализе 1 и 2 типы реакций оценивались как отрицательные, а 3 и 4 - как положительные.

Набор антител, использованный для определения иммунокомпе-тентных клеток представлен в таблице N1.

I. Иетодика определения иммунокомпетентных клеток в периферической крови.

Определяли актигенположительные лимфоциты с помощью реакции непрямой иммунофлуоресценции (РИФ) с подсчетом антигенположительных клеток на цитофлюориметре "РАСХсап"

III. Функциональные тесты.

Реакция бласттрансформации (РБТ), определение функциональной активности индометацин-чувствительных клеток и определение функциональной активности эндогенных супрессоров протекали в стерильных условиях.

Определяли количество иммуноглобулинов классов G, А и М в сыворотка венозной крови методом радиальной иммунодиффузии в агаре с помощью стандартных моноспецифических сывороток против человеческих иммуноглобулинов (Manchini G.,1965).

IV. Характеристика обследованных больных.

Основу исследования составили 56 клинических наблюдений, ранее не леченных больных раком гортани и раком полости рта, находившихся в отделении опухолей верхних дыхательно-пищеварительных путей ОНЦ РАМН с 1990 по 1992 гг.

В иммунологических, исследованиях контролем служили практически здоровые доноры в возрасте от 38 до 68 лет(п-35), средний возраст 52 года

Таблица 1.

Перечень моноклональных антител к дифференцировочным антигенам, использованных для фенотипирования лимфоцитов в крови, в опухоли и опухолевых клеток.

Название МКА Обозначение антигена Специфичность в гейте лимфоцитов

ИКО-ГМ1 CDllb ПК-клетки

ИКСЫ HLA-Dr В-кл., активирован. Т-кд.

ИКО 10 Thy-1 ранние тимоциты

ико-го CD38 тимоциты, ЯК-клетки, активированные Т-клетки

ИКО-30 мю-цепь IgM В-лимфоциты

ИКО-31 CD8 • супрессорные/цитотоксическив Т - клетки активированные клетки

ИКО-40 RFB-1 активированные клетки, ЫК-клетки гемопоэтические предшественники

ИКО-44 CDlc субпопуляции В-клеток, субпопул. ж-клеток, кортикальные тимоциты

ИКО-46 CD45 на всех лейкоцитах

ИКО-53 HLA-1 на всех лейкоцитах

ИКО 59 CD45 на всех лейкоцитах

ИКО-60 CDw50 на всех лейкоцитах

ИКО-66 CD45-RA • клетки памяти, ЫК - клетки

ИКО-80 CD5 все Т-клетки, субпопуляции. В-кл.

ИКО-86 CD4 Т-хелперы/индукторы

ИКО-87 CD7 все Т-клетки. ЫК-клетки

ИКО-90 CD3 все Т-клетки

ИКО-91 CD22 В-клетки

ИКО-105 CD25 рецептор к интерлейкину 2

HLe 1 CD45 на всех лейкоцитах

My 1 CD15 Х-гаптен

Примечание: все МКА серии ИКО получены профессором А. Ю. Барышниковым. МКА Ыу 1 представлены Т. Тришман (США) в ходе совместного сотрудничества Ше-1 - коммерческие МКА (ВесЬоп Шк!пбоп,Германия)

Определение иммунного статуса проведено у всех Сольных, исследование криостатных срезов опухолей проведено у 45 пациентов. Возраст обследованных лиц колебался от 37 до 73 лет, составляя в среднем 55 лет. Из них мужчин было 49(87.5Z), женщин 7 (12.52). Соотношение между ними составило 7:1.

Из всей группы больных рак гортани был у 30 больных (63,62,возраст от 37 до 67 лет). Из этого количества мужчин было 28 ( 932), женщин 2 (77.).

Рак полости рта был у 26 пациентов. Из них рак языка у 13 (501), рак дна полости рта-8 (317.) и рак альвеолярного отростка нижней челюсти-5 (192). Средний возраст составлял 56 лет и колебался от 39 до 73 лет. Цужчин было 21 (812), женщин 5 (192).

У всех больных гистологически верифицирован плоскоклеточный рак.

По клиническим признакам все больные разделены на группы: по стадиям, по системе символов TNM, по степени злокачественности, по форме роста опухоли, по наличию или отсутствию послеоперационных осложнения (Табл. 2).

Взятие периферической венозной крови и опухоли проводилось до лечения.

Статистическая обработка цифровых данных проведена на персональном компьютере типа IBM PC/AT с использованием пакета статистических программ.

Таблица 2.

Распределение больных в соответствии с международной клинической классификацией по системе символов ТНМ.

1 1 т РАК ГОРТАНИ 1 РАК ПОЛОСТИ РТА |

N0 Ml | N2 | всего | КО 1 N1 N2 | 1 всего |

| Т1 8 8 1 - - |

I Т2 3 - - 3 1 6 1 - 7 I

| ТЗ И 5 1 17 | 6 6 1 13 |

| Т4 1 1 - ■ 2 I .4 2 - б I

| всего i..... 23 6 1 30 | 1 16 9 1 .26 | 1

- д -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Фенотип лимфоцитов крови Сольных раком гортани и слизистой оболочки полости рта отличается от такового здоровых лиц: эти отличия имеют разнонаправленный характер, а именно, повышается количество В-лимфоцитов и различных типов активированных лимфоцитов (5?РВ-1, С025, С01с, ТЬу1) с одной стороны, и снижается количество Т-клеток, а также клеток с линейно-неограниченными антигенами (последнее как и снижение С045-1?А+ клеток, по-видимому, ассоциировано со снижением количества Т-лимфоцитов). Обращает на себя внимание резкое снижение количества СЕ138+ клеток (в отличии от других типов активированных клеток (количество которых повышается ). Способность лимфоцитов больных к бласт-трансформации, а также продукция 1^(3 и 1вМ существенно не изменена Уровень 1вА повышен в' периферической крови, что характерно для многих опухолевых процессов, где затронуты слизистые оболочки и подслизистый слой (Табл. 3).

Сравнительный анализ групп больных раком гортани с нормой и раком слизистой оболочки полости рта с нормой показал, что общая направленность изменений при обеих нозологических формах носит такой же характер, что и в общей группе, однако при раке гортани более выражено снижение Т-клеток и клеток, несущих линейно-неограниченные антигены, а в группе больных раком полости рта в большей степени повышено количество лимфоцитов, экспрессирующих активационные антигены и Б-клеток. Это, а также повышенный уровень спонтанной пролиферации свидетельствует об определенной напряженности иммунной системы у больных раком полости рта по сравнению с больными раком гортани. Очевидно, что иммунная система по-разному реагирует на опухоль в зависимости от ее распространенности.

фи распространенных формах рака гортани, в отличие от локализованных опухолей (Табл. 4) повышаются или имеют тенденцию к повышению количество Т-лимфоцитов (в основном за счет С1Э4+ популяции, что ассоциировано с тенденцией к увеличению количества клеток, экспрессирующих линейно-неограниченные АГ), а также количество -1+клеток (киллеры, активированные клетки) и Т11у1+ клеток. Напротив, количество СОНЬ+клеток (несущих СЗЬ компонент комплемента), представленный в основном на ЫК-клетках и активированных лимфоцитах двукратно уменьшается. Учитывая тот факт, что при III-IV стадиях заболевания абсолютное количество лим({оцитов не отличается от такового в группе больных с 1-11

Таблица 3.

ПОКАЗАТЕЛИ ИММУНИТЕТА БОЛЬНЫХ РАКОМ ГОРТАНИ И ПОЛОСТИ РТА ПО СРАВНЕНИЮ С ГРУППОЙ ЗДОРОВЫХ ЛИЦ.

АНТИГЕН НОРМА n-35 РАК ГОРТАНИ И ПОЛОС. РТА п-56

Z абс. г абс.

CD3 67. 0+2. 4 1240.0+67. 0 ** 61.9+2.1 1006. 0+60. 9А*

CD5 65.0+2.0 1248.0+65.0 ** 61.8+2.2 1005.0+61.7**

CD7 67.0+2. 6 * 1242. 0+70. 0 75.9+2.9 * 1225.0+79.9

CD4 38. 9+1. 5 746.0+41.0 37.9+1.7 613.1+43.3

CD3 28.0+1.8 532.0+36.0 28.1+1.3 457. 0+30. 3

.CD4 / CD8 1.389+0.8 1.389+0. 8 1.55+0.11 1.55+0.11

CD45RA 56.0+4.9 1008,0+98.0 ** 48. 9+1. 8 776. 3+56.9 **

CD22 7.3+1.5 131.4+16.5 8.0+0.7 125.1+11.1

ш цепь IgM 5.4+0.9 * 99.9+11.0 ** 9. 9+1. 0 * 155. 4+19. 6 **

HLA-DR 14. 0+0.8 252.0+23.0 14.5+0.8 241. 0+19. 2

CD38 за 0+3.1 * 840. 0+42. 0 ** 27.6+1. 4 * 451.1+33.8 **

RFB-1 23.0+2.5 * 437. 0+39. 0 ** 35.7+2.0 * 594. 8+49. 0 **

CDllb 20.0+2.5 384. 0+35. 0 21. 0+1. 8 354. 2+40. 8

CD25 a 0+1. 5 * 58. 0+10. 0 ** 8.4+1.0 * 118.7+15.7 **

CDlc 2.9+0. 4 * 52. 0+7.0 5. 4+1.1 * 106.1+26. 5

Thyl 2.5+0.4 45.0+7. 2 5. 8+1. 5 101. 9+29. 5

CD18 96.0+2.1 * 1721.0+62. 0 ** 79.3+3.4 * 1252.0+76.1**

CD45 95. o+a 1 * 1710. 0+91. 0 ** 80.5+3.1 * 1325. 0+84. 7**

HLA-1 94.0+1.3 * 1692. 0+71.0 ** 77.7+3.4 * 1261.0+82.9**

ЛИМХОЦИТЫ 35.0+1.6 * 1920. 0+85. 0 ** 27.1+1.2 * 1652. 0+85. 5**

ЛЕЙКОЦИТЫ 5700. 0+600.0 5977. 0+230. 0

Знаком * -обозначены достоверные различия относительных

показателей в группах (р<0.05) Знаком **-обозначены достоверные различия абсолютных ' показателей в группах (р<0.05)

стадией, а также то, что достоверно увеличивается процентное содержание Т-клеток, а не их абсолютное количество, мы полагаем, что у больных с III—IV стадией рака гортани уменьшается доля лимфоцитов не несущих маркеров Т-клеток и линейно неограниченных антигенов. Эта популяция представлена и основном различными гемопоэтическими клетками-предшественниками, которые определяют как О клетки.

Таким образом для распространенного рака гортани характерно уменьшение доли О-клеток и СЕ)11Ь+ клеток (в основном это М клетки), а также снижение бласттрансформации в ответ на ФГА и увеличение количества ШЗ-1+ цитотоксических/активированных лимфоцитов и доли СБ4+ клеток в популяции, что подтверждается наличием положительной корреляции между долей ИТЗ-1+ и С04+ клеток со стадией процесса.

В связи с этим относительное увеличение доли этих субпопуляций лимфоцитов в периферической крови больных раком гортани можно рассматривать как неблагоприятный прогностический признак.

Мы попытались выяснить, изменения каких иммунологических показателей характерны для метастазирования в регионарные лимфоузлы и какие, связаны с размерами опухоли.

Метастазирование в регионарные лимфоузлы при раке гортани сопровождается тенденцией к относительному повышении уровня Т-клеток, а также к существенному повышению йТ$-1+ клеток. Повышение последних вызыает значительный интерес с клинической точки зрения. Более детальное изучение этих клеток даст возможность выявлять регионарные метастазы и прогнозировать их возникновение. Вместе с тем примерно в 2 раза снижается количество ТЬу1+ и С01с+ лимфоцитов. 1Ьу1 и С01с антигены представлены в основном на клетках предшественниках, расположенных в тимусе (Табл. 5).

При увеличении размеров опухоли наблюдается сходная картина: тенденция к относительному нарастанию доли Т-клеток и СМ+ клеток, к существенному увеличению процента и количества ИТЗ-1+ клеток. Параллельно, при поражении нескольких анатомических областей уменьшается уровень СШ1Ь+ клеток.

Увеличение ($13-1+ клеток характерно, как для регионарного метастазирования, так и для обширного поражения гортани. Уменьшение доли и количества СШ1Ь+- клеток напротив характеризует степень распространенности только первичного очага Увеличение способности лимфоцитов к пролиферации (как спонтанной, так и

Таблица 4.

ПОКАЗАТЕЛИ ИММУНИТЕТА ВОЛЬНЫХ РАКОМ ГОРТАНИ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СТАДИИ ЗАБОЛЕВАНИЯ.

АНТИГЕН I И II СТАДИИ п-11 III и IV СТАДИИ П-19

X абс. X абс.

СОЗ 53.5+3.6 * 894.9+101.2 64.4+3.3 * 1022.0+101.2

СБ4 30.2+2. 4 * 508.8+73. 3 39.6+2.1 * 616. 5+54. 0

етв-1 25.8+3.1 * 449.7+72. 8 38.9+3.9 * 639. 9+96.1

сонь 26.4+4. 9 * 465. 9+78. 4 ** 16.1+2.0 * 264.1+48.5 **

ТИу1 2.5+0. 4 * 54.3+12.7 5.5+1.3 * 98. 7+52.1

>

Таблица 5.

ПОКАЗАТЕЛИ ИММУНИТЕТА ПРИ РАКЕ ГОРТАНИ В ЗАВИСИМОСТИ •ОТ РЕГИОНАРНОГО МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ.

АНТИГЕН ОТСУТСТВИЕ МЕТАСТАЗОВ п-23 НАЛИЧИЕ МЕТАСТАЗОВ п-7

X абс. * абс.

СОЗ 59.2+3. 1 936. 4+79. 0 66. 6+6. 2 1169.0+284.2

С05 59.в+а1 952.4+77.9 66. 8+6. 8 1151.0+269.9

31.3+2.3** 512.6+62.6 * 48.1+6.8** 858.4+139.1 *

СИо а з+р. 4 108.6+12.9 * 4. 2+0. 6 65. 8+12. 4 *

ТЬу1 5.4+2.2 102.3+28.5 * 2. 0+0. ¡> 34. 0+6. 2 *

Знаком * -обозначены достоверные различия относительных

показателей в группах (р<0.05) Знаком **-обозначены достоверные различия абсолютных показателей в группах (р<0.05)

Таблица 6.

ПОКАЗАТЕЛИ ИММУНИТЕТА ВОЛЬНЫХ РАКОМ ГОРТАНИ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СТЕПЕНИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОСТИ ОПУХОЛИ, (абсолютные показатели)

АНТИГЕН . .. I п-7 II п-18 III п-5

СОЗ 751.9+82.0 * 1015.0+100.1 * 1144.0+231.8

ЯРВ-1 418. 6+81. 6 * 533. 8+80. 3 ** 913.4+119.5 * **

С018 1115.0+126. 6 1245. 0+147.1 1483. 0+336. 5

ЛИМФОЦИТЫ 127а 0+152. 8* ** 1776. 0+165. 4 * 1813.0+306. 4* **

Знаками * .** -обозначены достоверные различия показателей в группах, отмеченных данными символами СГХО. 05).

нндуцированной) также характерно как при появлении регионарных метастазов, так и при увеличении размеров опухоли.

Степень злокачественности опухоли при раке гортани очевидно также влияет на фенотип лимфоцитов. Нарастание степени злокачественности сопровождается повышением количества лимфоцитов при II и III степени злокачественности по сравнению с I степенью, которая в свою очередь .обусловлена увеличением количества Т-клеток и их субпопуляций. CD45-RA+ клеток и лимфоцитов, несущих линейно-неограниченные антигены (эти изменения хотя и не достоверны, но имеют четко выраженную тенденцию) и увеличение количества RFB-1 лимфоцитов.(особенно при III степени злокачественности), которые положительно коррелируют со степенью злокачественности опухоли (Табл. 6).

Несомненна связь иммунологической системы с формой роста опухоли. Так в группе больных с экзофитной формой повышены или имеют тенденцию к повышению, по сравнению с больными с инфиль-тративной.формой рака, большая часть исследованных показателей. В частности в два и более раза увеличено количество CD8+ клеток, В-клеток, HLA-DR+, RFB-1+, CDllb+, CD25+ клеток (Табл. 7).

Таким образом фенотип лимфоцитов у больных раком гортани несет дополнительную информацию о развитии опухолевого процесса. Неблагоприятными прогностическими факторами в отношении распространенности процесса и его злокачественности являются относительно высокое процентное содержание Т-клеток, CD4+ популяции, клеток несущих линейно-неограниченные антигены; снижение уровней CDlc, Thyl, CDflb клеток. Высокоинформативным является повышение доли лимфоцитов, несущих маркер RFB-1. RPB-1+ клетки встречаются как среди гемопозтических предшественников, так и в периферической крови.

Изменения фенотипа лимфоцитов периферической крови у больных раком слизистой оболочки полости рта можно свести к следующему: повышено содержание минорных субпопуляций лимфоцитов, несущих рецепторы к интерлейкину 2, Thyl антиген и антиген CDlc; повышен уровень RFB 1+ клеток; увеличена доля B-клеток в популяции (несущих мю-цепь IgrM).

Рассмотрение иммунофенотипических изменений в зависимости от стадии заболевания позволяет выяснить, на какой стадии заболевания эти изменения максимальны (Табл. -8). Так содержание клеток с рецепторами к интерлейкину 2 повышено на всех стадиях заболевания; уровень CDlc+ клеток на III стадии, Thyl+ клеток на III и IV стадиях заболевания, уровень RFB 1+ клеток повышен

Таблица 7.

ПОКАЗАТЕЛИ ИММУНИТЕТА БОЛЬНЫХ РАКОМ ГОРТАНИ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ФОРМЫ РОСТА ОПУХОЛИ, (относительные показатели)

АНТИГЕН ИНФИЛЬТРАТИБНЫЯ п-12 ЭКЗОФИТШЯ. п=6

CD7 70. 2 + 7. 2. 82. 5 + 8.1

CD8 24. 0 + 1. 3 * 31.9 + 2.8 *

CD4 / CD8 1. 43 + 0.1 л 1.17 + 0.06 *

CD22 б. 0 + 1.1 * 11.2 + 1.8 А

HLA-DR 11.9 + 1.5 А 18. 4 + 2. 5 *

RFB-1 28. 4 + 2.9 * 40. 5 + 4.9 *

CDllb 16.4 + 2. 6 * 29. 0 + 3.4 А

CD25 2.4 + 0.1 А 9. 5. + 2. 3 А

CD45 71.3 + 7.8 86.2 + 7.7

HLA-1 68. 8 + 8. 9 83. 7 + 10. 4

Знаком * -обозначены достоверные различия показателей в группах, отмеченных данными символами (р<0.05).

на 111 и IV стадиях, а уровень В лимфоцитов и CD38+ клеток на III стадии рака полости рта. При IV стадии заболевания отмечается также тенденция к снижению клеток с линией неограниченными маркерами (уменьшение CD45+ клеток является достоверным).

Изменения иммунологических показателей, в основном различных типов активационных клеток, в'группах больных, различаются по стадиям опухолевого процесса отражают включения различных механизмов иммунного гомеостаза в процессе опухолевой прогрессии.

Размеры рака полости рта, по-видимому, не так резко влияют на фенотип лимфоцитов: так структура лимфоидной популяции при размерах опухоли менее 3 см. и от 3 до б см. существенно не "отличается, хотя при опухоли больших размеров снижается доля лимфоцитов среди лейкоцитов и количество лимфоцитов, экспрессирую-цих CD45 и CD18 маркеры.

Выявляются достоверные корреляции размеров опухоли с количеством В-клеток (CD22J+ и IgA. -

Таблица 8.

ПОКАЗАТЕЛИ ИММУНИТЕТА БОЛЬНЫХ РАКОМ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ПОЛОСТИ РТА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СТАДИИ ЗАБОЛЕВАНИЯ, (относительные показатели)

АНТИГЕН II стадия п-7 III стадия п-12 IV стадия п-7

С07 65.9 + 10.6 83.3 + 8.2 74.6 + а 2

СЭ4 38.6 + 4.7 43.8 + 5.0 35.3 + 5.6

СШ 32.1 + 5.0 28.4 + 2.3 24.2 + 3.2

СП45ЯА 54.3 + 6.7 54. 8 + а 6 * 42.7 + 4.3 *

СВ22 5. 8 + 0.8 * ** 10.9 + 1. 9 * 9.3 + 1.0 **

СБ38 28.4 + 4.5 * 39.0 + 2.9 * ** 24.5 + 4.1 **

РРВ-1 30. 4 + 4.0 * , 43.3 + 3.6 * 37.9 + 5.8

С025 9.3 + 3. 5 8.1 +1.9 10.2 + 1.6

СОЮ 4.7 + 1. 0 * 12.5 + 2. 3 * ** 5.0 + 0.8 **

ТЬу1 1.9 + 0.4 * 8.1 + 2.5 * .12.1 + а 9

С045 88.6 + 4.8 93.0 + 2.5 * • 75.2 + 6.2 *

НЬА-1 84.1+8.7 89.4 + 5.0 69.2 + 8.4

ЛИМХОЦИТЫ 32.3 + 2.3 * ** 25. 6 + 2. 4 * 24.1 + а 0 **

Знаками * , ** -обозначены достоверные различия показателей в группах, отмеченных данными символами (р<0.05).

Появление регионарных мётастазов у больных раком полости рта ассоциировано со снижением уровня СБЗ+, С1М+ и ТЬу1+ клеток и повышением В-лимфоцитов. СМ1Ь+ и С01с+ клеток (Табл. в).

Эти изменения в фенотипе лимфоцитов могут служить дополнительным диагностическим фактором.

К сожалению изменения фенотипа лимфоцитов при регионарном метастазировании не являются универсальными,' а имеют характерные особенности, как при раке гортани, так и при раке полост" рта. Тем не менее высокий уровень ИРВ-1+ клеток отмечается при обоих заболеваниях.

Представляется актуальным вопрос, может ли фенотипическая характеристика лимфоцитов человека использоваться как фактор прогноза результатов лечения?

Таблица 9.

ПОКАЗАТЕЛИ ИММУНИТЕТА ПРИ РАКЕ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ПОЛОСТИ РТА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ РЕГИОНАРНОГО МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ.

АНТИГЕН ОТСУТСТВИЕ МЕТАСТАЗОВ п-16 4 НАЛИЧИЕ МЕТАСТАЗОВ п-10

г абс. % абс.

СЮ 68.1+3.6 * 1091.0+132.7 56.1+4. 0 . А 956. 8+119. 2

СБ4 43.3+3. 0 * 704. 6+115.8 34.0+3. 0 А 570. 8+81. 9

СЛ22 8. 4+1. 8 109. 5+12. 7 АА 10.1+1.7 165. 3+21. 4АА

мю цепь1кМ 9.7+1.8 А 150.0+30.5 АА 15. 6+2.2 А 262.1+40. 1АА

НЬА-Ш 13.2+1.5 * 211. 9+28. 3 аа 17.0+1.1 а 299. 3+30. 9аа

СОНЬ 18.8+3.2 а 328.5+86.5 28.1+3. 2 А 444. 9+72. 3

СИ с 5.3+0.6 * 79.7+11.3 аа 11.9+2.4 а 169. 7+33. 6аа

ТЬу1 8.9+2.6 а 148.0+25.3 аа 4.8+0. 4 73. 7+14. 8**

Знаками *,** - обозначены достоверные различия показателей в группах (р<0.05).

Больные были разделены на две группы по наличию или отсутствию гнойно-воспалительных послеоперационных осложнений, т. к. нарушения в иммунной системе или ее определенные особенности могут способствовать появлению таких осложнений после операции. Действительно, у больных раком гортани, у которых в дальнейшем возникли осложнения, исходный иммунный статус характеризуется относительно высоким ( по-сравнению с другой группой) уровнем Т-клеток и С1)8+ клеток, С018+ и НЬА-1+ популяций лимфоцитов, а так я» повышенным уровнем Т1">у1+ клеток. Этот результат в определенной степени является пародоксальным, т. к. за исключением ТЬу1+ клеток, значения которых в груцпе с осложнениями выше чем в норме, значения Т-клеток.С08+ клеток., а так хв клеток с линейно-неограниченными антигенами "нормальнее" чем в группе без осложнений.. Возможно это связано с преобладанием в группе с осложнениями больных с более распространенными и злокачественными формами заболевания, которые характеризуются по-выпенным уровнем различных субпопуляций. Аналогичное сравнение было сделано в группе больных раком полости рта Однако здесь картина другая: в группе больных с осложнениями увеличен уровень С1Э7+ клеток и уменьшены уровни С045-1?А+, С011Ь+, С025+ и СШс+ клеток.

Таким образом, несмотря на определенное сходство фенотипа лимфоцитов в обшей группе больных раком гортани и раком слизистой оболочки полости рта при разделении на подгруппы видно, что каадое из этих заболеваний имеет свою характерную "картину".

Проведено исследование особенностей иммунофенотипа и характеристики местного иммунитета у больных раком гортани и раком слизистой оболочки полости рта При анализе иммунофенотипа опухолевых, клеток установлено, что наибольшим постоянством характеризуется экспрессия ыономорфных детерминант молекул HLA-I класса (МКА ИКО 53). Практически во всех случаях рака полости рта и рака гортани отмечена экспрессия этого антигена Данный факт представляет интерес с точки зрения проведения сопоставлен - с опухолями ряда других локализаций (рак легкого, молочной железы, желудка), при которых утрата молекул HLA-1 класса происходит с большей частотой и отражает как правило, степень диф-ференцировки л анаплазии опухоли. Выявлены различные типы экспрессии молекул HLA-DR при раке гортани: моноыорфная-34.8Z, мозаичная - 47.8%, отрицательная -17.4Z; при раке полости рта: 18.7.7., 63.67., 18.27. соответственно, что позволило оценить связь уровней экспрессии антигенов с проявлениями местных иммунных реакций.

Сопоставление взаимосвязи экспрессии молекул HLA-I, HKA-DR, CD15, проведенное попарно, не т'.нвило статистически значимой взаимосвязи в экспрессии этих маркеров. Следовательно появление/утрата данных антигенов происходит независимо друг от друга на клетках рака гортани, и рака слизистой оболочки полости рта

При исследовании местных иммунных реакций нами были применены отечественные МКА к антигенам основных субпопуляций Т-лимфе ^итов (CD4, CD8), общим Т-клеткам (CD3, CD5, CD7), В-клеткам CD22, мю-цепь IgM, CD45-R0 (ИКО 66), линией неограниченным антигенам ( RFB-1). Проведена сравнительная оценка общих уровней лимфоидной инфильтрации с применением отечественных и коммерческих (Becton Dickinson) моноклональных антител к антигену CD45 (ИКО 59, HLe-1).. Для изучения молекулы CD18 использовали отечественные МКА ИКО 60. Проведенные исследования показали высокую информативность использования отечественных МКА кластеров CD45, CD18, CD7, CD5, CD4, CD8, RFB-1, для изучения уровней содержания иммунокомпетентных клеток в гистологических свежезамо-

роженных срезах рака гортани и слизистой оболочки полости рта

Оценка связей уровня местных реакций проведена в зависимости от иммуноморфологических характеристик опухоли и клинических проявлений (размер опухоли, наличие/отсутствие метастазов в регионарные лимфоузлы, степень злокачественности, форма роста опухоли и клиническая стадия).

Наиболее интересные данные получены при изучении .влияния иммунологического фенотипа рака гортани с выраженностью местных иммунных реакций. Отмечена статистически значимая корреляция уровней инфильтрации рака гортани RFB-1+ лимфоцитами при наличии на опухолевых юхетках HLA-DR антигенов. В HLA-DR+ группе выраженные реакции составили - 80Z, в HLA-DR - 0%, р<0,05. Этот же маркер в значительной степени детерминировал общие уров. л инфильтрации рака гортани CD 45+ клетками, Т-клеточный ответ (CD7) и участие в противоопухолевом иммунитете CDllb+ клето1с. Наличие практически во всех случаях рака гортани экспрессии на клетках опухоли мономорфных молекул HLA-1 делает невозможным формирование групп сравнения для изучения связи местного иммунитета с экспрессией этого маркера. Экспрессия Х-гаптена (CD15) на опухоли не влияла на выраженность местных иммунных реакций. Не отмечено таюяэ взаимосвязи интенсивности местного иммунитета с особенностями иммунофенотипа рака слизистой оболочки полости рта.

Проведенные клинико-иммунологические сопоставления позволили установить существование взаимосвязи между уровнем местных иммунных реакций в опухолях (рак гортани, рак полости рта) и клиническим течением болезни. Установлено нарастание инфильтрации опухоли 1а+ лимфоцитами последовательно от I к IV стадии рака гортани,' а также избирательность з зависимости Ьт стадии CDllb+ клеток. Шскольку группы были малочисленны, то для целей статистической обработки нами были объединены больные с 1,11 стадиями и с III,IV стадиями, сопоставление местных иммунных реакций проведено в этих двух группах сравнения. Общая тенденция для большинства клеточных типов, включая CD45+ клетки и Т-клетки состояла в некотором нарастании уровней инфильтрации опухоли на поздних стадиях рака гортани и рака слизистой оболочки полости рта. Однако, можно говорить лишь о существовании тодобной тенденции, т. к. различия не были статистически значивши. Вместе с тем отмечено высоко достоверное усиление реакции JLA-DR+ лимфоцитов на поздних (III-IV) стадиях рака гортани.

- 19 -

При сопоставлении уровней инфильтрации опухолей субпопуляциями лимфоидных клеток в зависимости от наличия/отсутствия ре-, гионарных метастазов, установлено, что выраженные иммунные реакции, оцениваемые по общелейкоцитарному антигену CDw50 (ИКО 60) были отмечены (27,87.) только у больных раком гортани, не имеющих метастазов, а в группе с N1-OZ. Слабый тип реакции CD45 RA+ клеток отмечен лишь у больных раком гортани с индексом N1. По остальным маркерам группы достоверно не различались. Изучение по этому признаку рака слизистой оболочки полости рта показало нарастание CD7+, Т-хелперных клеток у больных с метастазами в лимфоузлах (различия олизки к достоверным). Ib остальным субпопуляциям лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, группы больных с наличием или отсутствием регионарных метастазов не различались.

Исследование уровней инфильтрации опухоли в зависимости от размеров опухоли показало, что по мере увеличения размеров рака гортани инте; ;ивность общелейкоцитарной инфильтрации (CD45) не снижается. Вместе с тем количество интенсивных местных реакций, активированных (1а+) лимфоцитов было уменьшенным при опухолях крупных размеров. При раке слизистой оболочки полости рта отмечено усиление инфильтрации опухоли Т-хелперными (CD7, CD5, CD4) клетками, а также .RFB-1+, CD45 RA+, 1а+ лимфоцитами по мере увеличения размеров первичной опухоли. Этот факт заслуживает пристального изучения механизмов несостоятельности местных иммунных реакций на фоне нарастания числа интратуморальных Т-клеток. По-видимому, одним из объяснений данного явления может быть крайне низкое участие ртотоксических (CD8+) клеток в местном противоопухолевом иммунитете при раке слизистой оболочки полости рта, как это было продемонстрировано в реакциях с отечественными МКА ИКО 31,

Изучение местных иммунологических реакций в зависимости от степени злокачественности опухоли проведено в анализируемых группах больных раком гортани и раком слизистой оболочки полости рта. Нарастала слабая реакция CD4+, CD3+ клеток при увеличении степени злокачественности рака гортани. Аналогичные данные были получены для CD4+ клеток и CD45 RA+ клеток при раке слизистой оболочки полости рта. Достоверных различий для других субпопуляций лимфоцитов не получено. Это свидетельствует о важности оценки Т-хелперных клеток (CD4+), определяемых с МКА ИК086 в местном иммунном ответе при раке гортани и полости рта.

Полученные данные впервые продемонстрировали пригодность отечественных моноклоналышх антител серии ИКО для изучения им-мунофенотипа и местного иммунитета при раке гортани и раке слизистой оболочки полости рта. С помощью этих реагентов установлены наиболее важные субпопуляции лимфоцитов, имеющих характерную связь с клиническим течением и иммунофенотипом опухолей. Кроме того, были установлены дефектные звенья иммунитета, на основе чего открываются новые возможности осуществления программ иммунорегуляции и иммунотерапии при раке гортани и раке слизистой оболочки полости рта.

В единичных работах авторов произведена попытка сопоставить и выявить взаимосвязь общего и местного иммунитета при раке области головы и шеи (Lozak Н. Р., 1987).

Нами также проведено сопоставление уровней местных иммунных реакций лимфоцитов со средним содержанием их в крови, а также оценка наличия корреляционных связей между этими параметрами.

При раке гортани близкие к достоверным результаты были получены в реакциях с антигенами CDllb и CD45, где отмечался высокий относительный уровень этих лимфоцитов в периферической крови при наличии местной лимфоцитарной инфильтрации опухоли.

При изучения корреляционной взаимосвязи наличия местной реакции с процентным и абсолютным содержанием лимфоцитов в крови при раке гортани выявлено, что с увеличением процента CD45+ клеток в крови, увеличивается инфильтрация CD38+ лимфоцитами опухоли, а с увеличением процента и количества В-клеток снижается инфильтрация опухоли CD5+ лимфоцитами. С увеличением абсолютного количества CD4+ клеток в крови, возрастала инфильтрация HLA-DR+ лимфоцитами опухоли.

Цри paite слизистой оболочки полости рта отмечен достоверно низкий уровень процентных и абсолютных значений CD38+ клеток в крови при наличии инфильтрации этими же клетками (р-0.03); низкий уровень абсолютного количества CD45+ клеток в крови при наличии местной инфильтрации этими же клетками.

Корреляционный анализ местного и общэго иммунитета при раке слизистой оболочки полости рта позволил выявить следующие взаимосвязи: С повышением процента CD8+, CD18 и Thyl+ клеток в крови снижается инфильтрация опухоли HLA-DR+ лимфоцитами; с повышением CDlc+ клеток в крови, снижается уровень CD38+ лимфоцитов' в опухоли.

- 21 -

Повышение инфильтрации CDllb* лимфоцитами опухоли сопровождается увеличением в крови абсолютного количества Т-клеток ( CD3, CD5, CD7), субпопуляций Т-клеток CD4, активированных лимфоцитов (CD38) и линией неограниченных лимфоцитов (CD45, HLA-1), в то же время повышение CD45+ лимфоцитов в опухоли сопровождается снижением в крови абсолютных количеств Т-клеток (CD3, CD5), субпопуляций Т-лимфоцитов (CD4), активированных клеток (CD38), линией неограниченных лимфоцитов (CD45, RFB-1), а также CD45-RA+ клеток.

Таким образом существует несомненная взаимосвязь общего и местного иммунитета при раке гортани и полости рта, которая характеризуется разнообразным и неоднозначным проявлением. Не удалось выявить прямых корреляционных связей между уровнем какой либо популяции или субпопуляции -лимфоцитов в периферической крови и инфильтрацией этими же лимфоцитами опухоли.

Лишь при раке полости рта обнаружена обратная корреляционная связь М(~..!ду уровнем CD45+ лимфоцитов в крови и в опухоли. Напротив-, имели место корреляции между различными типами антигенположительных лимфоцитов в крови и в опухоли.

Таким образом проведенные исследования по изучению обвдэго иммунитета, проявлений местных иммунных реакций, а также их взаимосвязи при раке гортани и раке слизистой оболочки полости рта в полной мере характеризуют какие звенья иммунной системы организма в большей.степени реагируют на воздействие опухоли, и это в сбою очередь дает возможность для дальнейшего использования полученных данных в целях диагностики и иммунокоррекции у данной группы больных.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые в одновременных, параллельных исследованиях системного и местного противоопухолевого иммунитета у больных раком гортани и раком слизистой оболочки полости рта . была успешно апробирована панель отечественных моноклональных антител серии ИКО.

2. Изменения■содержания субпопуляций лимфоцитов в лерифе-рической крови при раке гортани и полости рта свидетельствуют об их корреляции со стадией заболевания, формой роста и степенью злокачественности опухоли.

3. При III-IV стадиях рака гортани в периферической крови

отмечено 'повышение уровня Т-клеток, в том числе CD4+ суСпопуля-цни и RFB-1 лимфоцитов, а также двукратное снижение уровня NK-клеток.

4. При наличии регионарных метастазов paica гортани харак-терпо повышение RFB-H- клеток и двукратное уменьшение CDlc+-

лимфоцитов.

5. При наличии регионарных метастазов pajea слизистой обо-лочют полости рта характерно снижение уровня Т-клеток, субпопуляции CD4+ ¡слеток и повышение уровня В-лимфоцитов.

6. Прз1стическн во всех-случаях (>95%) на опухолевых клет-1шх обеих локализаций отмечена экспрессия мономорфных детерминант молекул HLA-I класса, реже (80Z)-KLA-DR и с наименьшей частотой (50Z)-CD15. Эти антигены зкспрессирукггся независим друг от друга

7. Наибольшую роль в интенсивности лимфоидной инфильтрации опухоли «траст популяции С045+клеток, Т-хелперов/шадукторов (CD5*. CD7+, CD4+), а также линейно нёрестриктированные лимфоциты (Ia+, RFB-1+), плазшциты (CD38+) и миелоидно-макрофагаль-пш клетки (CDllb).

8. гсспрессия молекул HLA-DR в опухоли при раке гортани коррелирует с выраженностью местного противоопухолевого иммунитета.

9. Степень локальных иммунных реакций взаимосвязана с фор-шЯ опухолевого роста (CD38+, CDllb*-, RFB-1+ клетки) и степенью злокачественности (CD3+, CD4+, CD45-RA+).

10.Г5зи уЕеличошш размеров опухоли происходит усиление иммунных реакций С07+, CD5+, RFB-1+, CD45-RA+ (рак полости рта) и HLA-DR+ (рак гортани). Вовлечение в процесс регионарных лимфа- " Tinccraix узлов, а такте наличие распространенных форм первичных опухолей • приводит к ослаблению иптратуморалыюй инфильтрации CD4+, HLA-DR+ ЛКфОЦНТОВ.

CffilCOi; РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Атаев С. X , Кадагидзе 3. Г. , Уатякин Е. Г. , Барышников А. Ю., Тупицын Н. R Изучение иммунологических маркеров рака гортани и рака полости рта с помощью моноклональных антител. // Сборник научных трудов Республиканского онкологического научного центра "Ц»блемы онкологии и медицинской радиологии" - Тез. докл. Баку. 1992, Том 2, С. 140-141.

- ЕЗ -

2. Ившина А. Е , Атаев С. X Фенотип лимфоцитов больных раком гортани. "Опухоли головы и шеи" Сборник научных трудов Онкологического Научного центра РАЖ - Москва, 1993, С. 3-8.

3. Алферов Е С., Атаев С. X , Ившина А. Е Иммунологическая характеристика больных раком гортани. "Здравоохранение Туркменистана". - 1993, N 4, С. 17-21.