Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Лекарственная устойчивость опухолевых клеток, опосредованная Р-гликопротеином: механизмы срочного становления и подходы к преодолению

р 'Г" о.

2 5 ЛЕК 2003

На правах рукописи

Штиль Александр Альбертович

ЛЕКАРСТВЕННАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК, ОПОСРЕДОВАННАЯ Р-ГЛИКОПРОТЕИНОМ: МЕХАНИЗМЫ СРОЧНОГО СТАНОВЛЕНИЯ И ПОДХОДЫ К ПРЕОДОЛЕНИЮ

14.00.14 - онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва 2003

Работа выполнена в Государственном учреждении Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина РАМН, Москва

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор A.M. Гарин,

доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ А.Н.Салрин,

доктор биологических наук, профессор Н.С. Сергеева,

Ведущее учреждение: Российская медицинская академия последипломного образования Минздрава РФ.

Защита диссертации состоится 25 декабря 2003 г. на заседании специализированного Ученого Совета Д.001.017.01 при

РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан 20 ноября 2003 г.

Ученый секретарь специализированного Ученого Совета

доктор медицинских наук

Ю.В. Шишкин

Общая характеристика работы Аюуальность темы

I. Множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток: биологические механизмы и значение в онкологии.

Несмотря на значительные достижения фармакологии, в том числе развитие ехнологий создания лекарств с ожидаемыми свойствами, успехи химиотерапии пухолей ограничены важнейшей особенностью живых систем — способностью датироваться к изменениям внешней среды. Одно га проявлений такой ластичности - развитие устойчивости опухолевых клеток к препаратам, [спользуемым в химиотерапии. Широкая распространенность и долговременный, стойчивый характер адаптации клеток к внешним воздействиям предполагают, то преодоление лекарственной устойчивости может быть связано не только с оиском более эффективных препаратов: вероятно, нет лекарства, к которому летки не были бы способны развивать устойчивость. Только выяснение иологических механизмов резистентности к различным видам стресса послужит сновой для разработки стратегий преодоления лекарственной устойчивости -еобходимого условия повышения эффективности лечения онкологических ольных.

Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) новообразований — охранение опухолевыми клетками жизнеспособности в ответ на воздействие азличных лекарственных веществ — одна из основных причин прогрессировать олезни: опухоль нечувствительна к химиотерапии независимо от комбинации р»меняемых лекарств. Феномен МЛУ имеет долговременный и стабильный арактер: механизмы резистентности наследуются в поколениях клеток. Таким бразом, МЛУ - один из ключевых факторов прогрессии опухоли.

Различают два основных вида устойчивости клеток к токсинам. Первичная г.е. наблюдающаяся до воздействия химиопрепаратов) устойчивость обусловлена кспрессией механизмов защиты при прогрессии опухоли. Так, активация

антиапоптотических механизмов, обусловливающая устойчивость к эффектора иммунитета, может иметь отношение к резистентности к лекарственным препаратам. Вторичная (приобретенная) устойчивость возникает в клетках, подвергнутых стрессовым воздействиям. До этих воздействий механизмы завд в таких клетках экспрессированы слабо или отсутствуют; выживая после обработки одним токсином, клетки приобретают резистентность ко многим веществам —МЛУ (Riordan, Ling, 1985). Дальнейший отбор закрепляет приобретенный фенотип в поколениях клеток.

Важнейшим механизмом МЛУ является пониженное накопление токсин» клетке, обусловленное выведением веществ в межклеточную среду. Такой транспорт осуществляется интегральным белком плазматической мембраны Р-гликопротеином (Pgp) за счет энергии гидролиза АТФ (Juliano, Ling, 1984)."! человека Pgp кодируется геном MDRI (multidrug resistance 1), локализованным хромосоме 7 (Chen et al., 1986). Многочисленные данные свидетельствуют о т( что увеличение иРНК MDRI и Pgp часто служит фактором устойчивости мноп типов опухолей к лечению (Linn et al., 1995; Stavrovskaya et al., 1998).

II. Становление МЛУ в опухолевых клетках: биологические механизмы как мишени для профилактики

Правомерно предположить, что повышение количества иРНК MDRI обусловлено амплификацией этого гена. Такой механизм МЛУ выявлен в культивируемых линиях клеток, прошедших селекцию на выживание в присутствии токсинов (Roninson, 1991). Однако при анализе опухолей человек амплификация гена MDRI не обнаружена ни в первичных опухолях, ни в новообразованиях после лечения. Вероятная причина клинической МЛУ — гиперэкспрессия MDRI и Pgp при неизмененной структуре гена (сохранении копийности инуклеотидной последовательности), т.е. эпигенетическая актива! фенотипа. В культурах опухолевых клеток человека повышение уровня иРНК MDRI и количества Pgp отмечено при однократной обработке химиопрепарата

зличными по химической структуре и механизмам действия (СЬаиёЬагу, эгипвоп, 1993). Получены доказательства накопления иРНК МОИ 1 в метастазах ркомы в легочную ткань уже через 20-50 мин после начала интраоперационной ¡рфузии легких доксорубицином (Abolhoda е1 а!., 1999). Эти результаты »дгверждагот возможность эпигенетической активации МЛУ в эксперименте и мнических ситуациях: повышение иРНК МОЯ 1 и Р§р в опухолях может юисходить без амплификации гена МИЯ1.

Такой тип биологической регуляции — срочная активация фенотипа — юдусматривает индукцию транскрипции гена (генов), кодирующего ответствующий фенотип, и/или посттранскрнпционный контроль (стабилизация 'НК, регуляция синтеза и функционирования белка). Применительно к МЛУ азанный тип регуляции означает возможность индукции гена МОЯ\ (еклеточными сгпшулами и относительно быстрое становление резистентности в [ухолевых клетках в ответ на стресс. Индуцибелыюсть гена МОЯ 1 предполагает тивацшо путей передачи сигналов от периферии клетки к ядру. Такими путями )гли бы быть стресс-реализующие сигнальные механизмы: протеинкиназа С КС), фосфолипазы и внутриклеточный Са2+, митогенактивируемые ютешпсиназы, ядерный фактор каппа В (№кВ). Передача сигналов к гуляторной области гена КЮЯ\ и транскрипту обеспечивает активацию спрессии гена.

Исследование регуляции МЛУ имеет и принципиальный практический пект. Ингибирование этих механизмов с помощью фармакологических и/или нетических воздействий позволило бы предотвратить развитие МЛУ в процессе миотерапии.

III. Преодоление сформировавшейся МЛУ опухолевых клеток.

Если блокирование активирующих ген МОЯ\ сигналов может едотвратшъ становление МЛУ в первично чувствительных клетках, то такой

подход неприменим для преодоления уже сформировавшейся резистентности. Традиционным методом борьбы с вторичной МЛУ является использование модуляторов Pgp в комбинации с цитостатиками (Lehne, 2000). Однако использование ингибиторов Pgp ограничено побочными явлениями (нарушения ритма сердца, иммунологический дисбаланс). Не менее важно, что эффективное комбинаций модулятор+цитостатик может быть снижена из-за блокирования по крайней мере некоторых механизмов клеточной смерти при селекции на МЛУ.

Преодоление сформировавшейся МЛУ достижимо при выполнении двух условий: 1) концентрация лекарственного препарата должна быть достаточна дл активации эффекгорных механизмов гибели клетки, 2) функции этих механизмо должны быть сохранены в клетках с МЛУ. Первое условие выполняется, если препарат преодолевает барьер Pgp. Однако требуется доказать, что достижение критической внутриклеточной концентрации агента достаточно для активации гибели клетки, резистентной ко многим воздействиям. Механизмы выживания, функционирующие в резистентных клетках, должны служить мишенями для элиминации последних.

Для реализации второго условия представляются перспективными подход направленные на лизис резистентных клеток как механизм индукции их гибели. Вакцинация мышей клетками сингенной миеломы, трансфецированными кДНК некоторых цитокинов, приводит к развитию опосредованного цитотоксическим] Т-лимфоцигами (ЦТЛ) иммунного ответа и отторжению прививаемой опухоли j иммунизированных животных (Dranoff et al., 1993; Levitsky et al., 1996). ЦТЛ лизируют клетки с помощью гранзима В и перфорина. Поскольку гранзим В активирует каспазу 3 - один из дистальных эффекторов апоптоза, а перфорин вызывает первичное повреждение плазматической мембраны (некроз), можно надеяться, что ЦТЛ будут эффективны, если проксимальные механизмы гибели блокированы; запуск дистальных звеньев апоптоза в комбинации с некрозом

б

риведет к гибели клеток, устойчивых к противоопухолевым препаратам -ндукторам программированной клеточной гибели.

Постановка проблемы

МЛУ - клинически неблагоприятный феномен, преодоление которого эебует знания механизмов его развития и путей реализации клеточной гибели, ребуется исследовать оба аспекта проблемы. Во-первых, необходимо изучить еханизмы становления МЛУ в MDR1 /Pgp-негативных клетках человека, сследование этих механизмов послужит предотвращению развития устойчивости первично чувствительных клетках. Во-вторых, анализ процессов гибели, ункционирующих в клетках с МЛУ, создаст основу для преодоления гзистентности в ситуациях, когда сформировалась вторичная МЛУ.

Цель исследования - установление механизмов срочного становления [ЛУ в опухолевых клетках человека и разработка подходов к преодолению этого ада устойчивости.

Задачи:

1. Оптимизировать модели становления МЛУ в культурах опухолевых клеток человека в ответ на воздействие химиопрепаратов и экспериментальных агонистов и антагонистов сигнальных механизмов.

2. Определить основной механизм срочного развития МЛУ при обработке клеток противоопухолевыми агентами: амплификация гена MDR\, селекция Pgp-позитивных клеток или индукция МЛУ de novo.

3. Исследовать пути передачи внутриклеточных сигналов, регулирующих активацию МЛУ - протеинкиназа С, фосфолипаза С, внутриклеточный Са2+, митоген-активируемые протеинкиназы, NFkB).

4. Выявить роль транскрипционной активации и поспранскрипционной регуляции (стабильность иРНК) экспрессии гена MDR\ в срочном становлешш МЛУ в ответ на воздействие химиопрепаратов.

5. Разработать способы предотвращения развотия МЛУ в опухолевых клетках при комбинировании химиопрепаратов с блокаторами КЮЯ\-активирующих сигнальных путей и ингибиторами генной транскрипцип

6. Исследовать кинетику активации инициирующих и эффекторных каспа изменения трансмембранного потенциала митохондрий, протеолитического расщепления поли(АДФ)рибозо-полимеразы, межнуклеосомной фрагментации ДНК и целостности плазма-тической мембраны в родительских клетках и вариантах с МЛУ при обработке препаратом, не транспортируемым Р-гликопротеином.

7. Использовать вакцинацию опухолевыми клетками, экспрессирующими

цитокины, для генерирования иммунного ответа против клеток с МЛУ. »

Положения, выносимые на защиту.

1. Становление Pgp-oпocpeдoвaннoй МЛУ - срочная реакция клетки на многие воздействия - опосредовано эпигенетической активацией гена МЗЯ 1. Эта активация обусловлена многочисленными механизмами передачи внутриклеточных сигналов, индукцией промотора гена и стабилизацией иРНК и может быть предотвращена ингибиторами указанных сигналов.

2. Преодоление Р§р-опосредованной МЛУ может быть связано с направленным воздействием на плазматическую мембрану резистентных клеток. Р§р не защищает клетки от нарушения целостности плазматической мембраны - некроза.

Научная повпзна

1. Впервые обосновано представление о становлении МЛУ как срочном ответе клетки на экзогенный стимул;

2. Впервые детально исследован механизм становления конкретного фенотипа лекарственной устойчивости — Р£р-опосредованной МЛУ: эпигенетическая активация кодирующего этот белок гена МОЯ 1.

3. Впервые разработана модель срочной активации гена МВШ,

сопровождающейся приобретением стабильного фенотипа Р§р-опосредованной МЛУ в культуре опухолевых клеток человека; 1. Выявлены пути сигнальной трансдукции, механизмы активации транскрипции и посттранскрипционной регуляции гена МОК 1 в клетках, подвергнутых воздействшо противоопухолевых препаратов. 5. Впервые охарактеризованы классы фармакологических веществ — блокаторов передачи внутриклеточных сигналов — для предотвращения становления Рцр-опосредованной МЛУ в опухолевых клетках. 5. Впервые исследованы мехшшзмы гибели, функционирующие в клетках с Р§р-опосредованной МЛУ, и разработан подход к преодолению резистентности, заключающийся в первичном повреждении целостности плазматической мембраны.

Практическая ценность.

1. Разработка методов предотвращения срочного становления Pgp-опосредованной МЛУ в культуре опухолевых клеток при воздействии химиотерапевтических препаратов.

2. Доклинические испытания модифицированных генно-инженерных вакцин для преодоления МЛУ.

Апробация работы.

Диссертация обсуждена 30 июня 2003 г. на совместной конференции габорагорий генетики опухолевых клеток, цитогенетики с группой молекулярной генетики, вирусных и клеточных онкогенов, молекулярной эндокринологии, противоопухолевого иммунитета, биохимической фармакологии, медицинской шмии, экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей; отделений шмунологии, гематологии, химиотерапии, клинической фармакологии, «шбшшрованных методов лечения РОНЦ им. Н.Н.Блохша РАМН.

Основные материалы диссертации представлены на следующих конференциях: 2-й международный симпозиум "Cylostatic Drug Resistance", (К Германия, 1991); Гордоновская конференция "Advances in Chemotherapy" (Ньк Лондон, США, 1994); "Molecular Toxicology" (Коппер Маунтин, США, 1995); "Inducible Genomic Responses" (Стивенсон, США, 1996); "Nucleic Acids — Integrating Molecular Diagnostics and Therapy" (Сан-Диего, США, 1996); ежегод конференции American Association of Cancer Research (1994-2001): 6-й и 7-й конгрессы "Advances in Oncology", (Херсониссос, Греция, 2001,2002); "Струк и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 2002), а также на семинарах в Oncotech, Inc. (Ирвайн, США, 1996), Институте Солка (ЛаХойя, США, 1997), онкологическом центре Ли Моффит (Тампа, США, 1997), The Jackson Laborati (Бар Харбор, США, 1997), онкологическом центре Слоун-Кетгеринг, Нью-Йо] США, 1999), университетах Копенгагена (2002), Инсбрука (2002) и Гронингс! (2003), МГУ им. М.В.Ломоносова (2002), НИИ экспериментальной патологии онкологии и радиобиологии им. Р.Е.Кавецкого (Киев, 2002).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 22 журнальные статьи и пол; международный патент.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 181 странице машинописи и состоит из введе глав "Обзор литературы", "Материалы и методы исследования", "Результаты исследования" (две части), обсуждения и выводов. Работа содержит 44 рисун 6 таблиц. Библиографический материал включает ссылки на 270 источников литературы.

Материалы и методы исследования.

Лабораторные животные и линии клеток. Использованы мыши линии Balb/c. Для экспериментов по активации МЛУ использовали линии клеток человека Н9 (Т-клеточный лейкоз), К562 (промиелоцитарный лейкоз), SW<

(рак толстой кишки), а также сублиниго K562Í/S9, в которой Pgp экспрессирован без селекции клеток на устойчивость к токсинам (Mechetner et al., 1997). Для экспериметов по созданию противоопухолевого иммунитета использовали линии миелом МРС11, J558 и S194. Для получения сублиний с МЛУ проводили ступетатый отбор клеток МРС11 на устойчивость к доксорубицину. Независимые сублшши МРС1 lDoxlO-1 и MPCllDoxlO-2 пролиферировали в присутствии 100 нМ доксорубнцшга.

Исследование МЛУ: и РНК гена MDRI, количество и функция Pgp.

Для активации МЛУ использовали щггозин-1Р-£>-арабинофуранозид (цитозар, Ara С), доксорубицин, винкристин, нокодазол, блсомицин, сфингомиелиназу, ионофор Са2+ А23187, тапсигаргин, 2-деоксиглюкозу, трихостатин А и форболовый эфир 12-0-тетрадеканоилмиристат-13-ацетат (ТФА). Для ингибирования активации МЛУ использовали актиномицин D, а-аманитин, эктеинасцидин 743 (ЕТ743), хелеритрин, бис-индолилмалеимид I, кальфостин С, ВАРТА/АМ, ТМВ-8, пирролидиндптиокарбамат (ПДТК), тозил-L-фенилалшшнхлорометилкетон (ТФХМК), натрия салицилат, салициловую кислоту, PD98095. Ингибиторы добавляли к клеткам за 30 мин. до внесения активаторов. Уровень иРНК MDR\ в клетках исследовали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией (Noonan et al., 1990; Shtil et al., 2000), используя праймеры: MDRV. прямой: 5'-ССС АТС АТТ GCA ATA GCA GG-3'; обратный: 5'-GTT CAA ACT ТСТ GCT ССТ GA-3'. Длина продукта 167 п.н. р2-микроглобулин: прямой: 5'-АСС ССС ACT GAA AAA GAT GA-3'; обратный: 5'-ATC TTC AAA ССТ CCA TGA TG-3'. Длина продукта 120 п.н.

Количество Pgp и его транспортную функцию определяли в проточной цитофлуориметрии с монокпональными антителами UIC2 (Mechetner et al., 1997). В качестве вторичных использовали антитела к IgG мыши, конъюгированные с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ). Для гоучения Pgp-

зависимого транспорта использовали флуоресцентные субстраты Pgp -родамин 123 (в экспериментах по индукции МЛУ) (Neyfakh, 1988) и ацетоксиметиловый эфир кальцеина (в экспериментах с клетками миеломы] (Holló et al., 1996; Shtü et al., 1999).

Исследование клеточной гибели. Выживание клеток в присутствии токсинов изучали по восстановлению 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Р-тетразолия(МТТ-тест) (Mossman, 1983; Sidorova et al., 2002). Для определения количества апоптотических клеток использовали аннексии V-ФИТЦ; некротические клетки выявляли пропидия иодидом (ПИ). Трансмембранный электрически потенциал митохондрий определяли по флуоресценции зонда JC-1 (Zamzair et al., 1997). Для определения фрагментации геномной ДНК клетки лизировали в буфере, содержащем цитрата натрия, NP-40, РНКазу А и ПИ; суспензию анализировали на проточном цитофлуориметре (Shtil et al., 1999; Фрагменгированную ДНК выявляли в суб-Gl области. Для изучения образования свободных форм кислорода в клетках использовали эфир дихлорофлуоресцеина диацетата (DCFDA), проникающий в цитоплазму и флуоресцирующий после окисления внутриклеточными метаболитами.

Активность ПКС в цитозоле и фракции частиц определяли радиоактивным методом по фосфорилированию основного белка миелина после лизиса клеток и разделения фракций центрифугированием (Shtil et al. 2000).

Активность митогенактивированных протеинкиназ ERK1/2 и JNK1 определяли по фосфорилированию специфических субстратов (основного белка миелина и c-Jun) после лизиса клеток и иммунопреципитации киназ ( etal., 1996).

Репортерные плазмиды, экспрессирующие векторы, трансфекция.

Клетки К562 и Б\У620 траиефецировали плазмидой, несущей участок троксимального промотора гена МОЛ 1 -1202/+118 н.о. относительно сайта инициации транскрипции, клонированный в вектор рОЬ2Ь. Репортерным 5елком служила люцифераза Пге/1у. Для проверки трансактивирующей наивности №кВ клетки траиефецировали промотор-репортерной сонструкцией, имеющей сайты связывания ОТкВ (5х№кВ-лгоцифераза). Для гормирования активности люциферазы в клетки одновременно вводили щазмиду, несущею люциферазу ЯепШа под контролем промотора 8У40. В >яде опытов активность люциферазы Рпе]\у относили к концентрации общего 5елка в трансфецированных клетках. Для трансфекции использовали шпофекпш или липофектамин, а также "генное ружье" (для клеток миеломы) КаЫиш1еУ1'сЬ е[ а!., 1996). Вектора, экспрессирующие субъедииицы р50 и р65 ^кВ под контролем промотора БУ40, использовали для котрансфекции с щазмидой -1202/+118-люцифераза. Активность люцифераз в лшатах клеток 1сследовали хемшпоминесцентным методом.

Иммунизация мышей. Клетки МРС11 и сублинии с МЛУ облучали (40 ~р), траиефецировали плазмидой, несущей кДНК гранулоцит-макрофаг-солониестимулиругощего фактора (ГМ-КСФ) и вводили мышам (1,5х105 леток на животное) подкожно. Контрольным мышам вводили такое же :оличество облученных клеток, трансфецированных вектором без вставки. 1ерез 7 дней свежие клетки облучали и траиефецировали плазмидой, несущей [ДНК интерлейкина-12 (ИЛ-12) или облученные клетки, трансфецированные шазмидой без вставки (контроль). Еще через 7 дней (всего 14 дней после юрвой вакцинации) животным прививали свежие клетки подкожно (10е на шшь) (Тишег й а1., 1998).

Активность ЦТЛ в смешанной культуре с миеломными клетками. Через 11 день после инъекции мышам миеломных клеток, трансфецированных ИЛ-2, извлекали селезенку. Спленоциты культивировали 5 дней при 37°С, 5%

СОг со свежими облученными клетками линии, использовавшейся для иммунизации. Затем свежие миеломные клетки нагружали 51Сг (клетки-мишени для ЦТЛ). Об активности ЦТЛ судили по выходу мСг в среду после инкубации с мишенями. Для ингибирования процессинга перфорина спленощггы инкуб!фовали с конканамицином А, а затем с мишенями (Kataok et al., 1996).

Результаты исследования

Срочная активация Pgp-опосредованной МЛУ.

И-РНК MDRI накапливается в клетках в ответ на воздействие противоопухолевых лекарств (Chaudhary, Roninson, 1993). Для выяснения вопроса о том, связан ли этот эффект с селекцией Pgp-положительных клеток или с индукцией МЛУ, эксперименты проводили на МЭШ/Р§р-негативных клетках Н9. Клетки обрабатывали Ara С - не транспортируемым Pgp препаратом, применяемым у больных раком молочной железы и гемобластозами. Экспрессия MDR\ в необработанных клетках не выявляется после 25 циклов ПЦР, тогда как в обработанных Ara С клетках повышение иРНК MDRI отмечается через 3-6 час. воздействия (рис.1,А). Повышение иРНК MDRI можно наблюдать и быстрее - уже через 1 час воздействия, ест увеличить концентрацию цитозара до 75 мкМ. Увеличение иРНК MDRI сохраняется в клетках, переживших однократное воздействие Ara С, не мене 6 недель.

Далее исследовали, повышается ли количество Pgp параллельно накоплению иРНК MDRI. На рис. 1 ,Б показано, что обработанные Ara С клетки экспрессируют Pgp. Важно, что воздействие Ara С вызывает сдвиг вправо всей популяции, что свидетельствует о том, что накопить Pgp способна практически любая клетка в культуре. Обработанные Ara С клетки экспрессируют функционально активный Pgp: в этих клетках выведение

родамина 123 шггенсивнее, чем в интактных клетках; эффект снимается верапамилом - блокатором Pgp-зависимого транспорта.

A 25uM АгаС

О 1 3 6 10 16 24 ЧАС.

MDR1

в2м

100

1 80 UPC10

1 60

§ 40 Л UIC2

•г го /

0 7

флуоресценция (Ig) -►

Рис.1. Увеличение иРНК MDRX и Pgp после однократного воздействия Ara С. А: клетки Н9 обработаны 10 мкМ Ara С. иРНК MDR1 и р2-микроглобулина (В2М) определяли в ПЦР после обратной транскрипции. Б: клетки обработаны 10 мкМ Ara С 24 час.{ниэю<яя панель). Контроль - необработанные клетки (верхняя панель). Таким образом, накопление иРНК MDR\ наблюдается в течение первых

асов воздействия агентом, не транспортируемым Pgp. Это означает, что

аиболее вероятным механизмом данного эффекта является индукция фенотипа,

не селекция "предсуществующих" резистентных клеток.

На рис. 2 приведена зависимость выживания клеток от концентрации винкристина - химиопрепарата, транспортируемого Pgp. Клетки, выжившие

Рис. 2. Однократное воздействие цптозара приводит к формированию устойчиво« Pgp-транспортируемому препарату.

Клетки Н9 обработаны 10 мкМ Ara С 24 час., рееуспензированы в свежей среде и инкубированы 12 дней. После восстановления логарифмического роста клеток исследована их чувствительность к винкристину в сравнении с клетками, не обрабатывавшимися цитозаром (контроль). Результаты 4-х экспериментов (МТТ-тест)

Итак, однократное воздействие не транспортируемого Pgp химиопрепарат на Pgp-негативные клетки приводит к быстрому - в пределах одного клеточнс цикла - накоплению иРНК гена MDRI, функционально компетентного Pgp и, что наиболее важно, развитию устойчивости к транспортируемому Pgp агенту Первично чувствительные клетки приобретают Pgp-опосредованную МЛУ. Механизм этого феномена - не селекция Pgp-положительных клеток, а активация фенотипа de novo. Как происходит становление Pgp-опосредовали! МЛУ: за счет активации транскрипции гена MDRX или стабилизации иРНК, i функционируют оба механизма?

В представленных на рис.3 экспериментах клетки Н9 обрабатывали Ara С в присутствш! ингибиторов транскрипции - актиномицина D, а-аманитина и эктеинасцидина 743 (ЕТ743). Все исследованные ингибиторы предотвращали индуцируемое Ara С повышение уровня иРНК MDRI.

Рис. 3. Ингибиторы транскрипции предотвращают накопление «РНК MDR1. Клетки Н9 обработаны 10 мкМ Ara С 24 час. без или в присутствии актиномицина D, а-аманитина или ЕТ743. Суммированы результаты 3-х экспериментов.

Для изучения времени полужизни (стабильности) иРНК клетки были обработаны Ara С в течение 10 час. и перенесены в свежую среду или среду с актиномицином D и инкубированы еще 36 час. В необработанных клетках иРНК MDRI оказалась короткоживущей: время ее полужизни ~ 30 мин. Обработка Ara С удлиняла время полужизни иРНК до 6 час. Таким образом, накопление иРНК MDRI, а, следовательно, и развитие Pgp-опосредованной МЛУ в ответ на цитотоксический стресс, обусловлены не только активацией транскрипции MDR1, но и стабилизацией иРНК этого гена.

Механизмы передачи внутриклеточных сигналов в активации МЛУ На рис.4 показано, что однократная обработка клеток Н9 ТФА, агонистом ПКС, приводила к индукции гена MDRI. Специфические ингибиторы ПКС -хелеритрин, кальфостин С и бис-индолилмалеимид I - предотвращали активацию MDR\ форболовым эфиром и химиопрепаратами. Аналогичные

данные получены на клетках К562, обработанных Ara С, доксорубицином ил ТФА в присутствии указанных ингибиторов ПКС.

Рис. 4. Ингибиторы ПКС предотвращают индукцию MDRI. Клетки Н9 обработаны 10 мкМ Ara С 16 час. без или в присутствии ингибиторов ПКС. Суммированы результаты 3-х экспериментов.

Итак, ПКС важна для регуляции MDRI (и, следовательно, фенотипа MJI этот ген может быть индуцирован агонистом ПКС, а ингибиторы ПКС предотвращают активацию MDRI противоопухолевыми препаратами.

Физиологическим агонистом ПКС является диацилглицерин (ДАТ), образующийся при гидролизе фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата (ФИг) фосфатвдилинозитол-спецпфической фосфолипазой С и/или при распаде фосфатидилхолина под действием специфической для этого фосфолипида фосфолипазы С (Berridge, Irvine, 1984). Ивдуцированная Ara С или доксорубицином активация MDRI может быть блокирована неомицина сульфатом и U73122 - ингибиторами фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (рис.5). Активация же MDRI форболовым эфиром нечувствительна к неомицина сульфату и U73122 потому, что ТФА-прямой агонист ПКС, а эта киназа функционирует дистальнее фосфолипазы С. Ингибирование фосфатидилхолин-специфической

юсфолипазы С (препарат Б609) не приводило к изменению экспрессии МОЯ 1 рис.5). Эти результаты указывают на значимость гидролиза ФИ2 юсфатидилинознгол-специфической фосфолипазон С в активащш МОЯ 1.

Рис. 5. Ингибиторы фосфолипязы С в индукции MDR\.

Клетки Н9 обрабатывали 10 мкМ Ara С 16 час. без или в присутствии неомицина сульфата, U73122 или D609. Суммированы результаты 3-х экспериментов.

Фосфолипаза С расщепляет ФИ2 на ДАТ и ФИз. Первый продукт активирует ПКС, второй повышает уровень внутриклеточного Са2+ за счет его мобилизации из эццоплазматического ретикулума. Роль внутриклеточного Са2+ в индукции MDRI доказана способностью Са2+-сиецифического ионофора А23187 и тапсигаргина - ингибитора Са2+-АТФаз - актив1фовать этот ген; специфический хелатор Са2+ ВАРТА/АМ предотвращал индукцию MDR\ и химиопрепаратами, и ТФА (рис.6).

MDR1 ^ В2М

1 2 3 4 5 в 7 8 Э 10 11 12 14 14 15 1617 18 19 Рнс. б. Роль внутриклеточного Са2+ в нндукцнп АЯ)Я1.

Клетки Н9 обрабатывали индукторами МОИ\ 16 час. отдельно или в присутствии кальциевого хелатора ВАРТА/АМ. Треки: 1-необработанные клетки, 2,3-А23187; 4,5-

тапсигаргин; 6,7-АгаС; 8,9-доксорубицин; 10,11-блеомицин;12,13-2-дезокси-глюкоза;14,15-нокодазол;16,17-сфингомиелиназа;18,19-ТФА. Четные треки: индуктор нечетные (кроме 1): индуктор»-5 мкМ ВАРТА/АМ.

Для выяснения участия внутри- и внеклеточного Са2+ в активации MDR проведены две серии опытов. Во-первых, активацию гена изучали в условиях инкубации клеток в среде без Са2+. Удаление внеклеточного Са2+ не нарушал« активацию MDRI химиопрепаратами и ТФА. Во-вторых, агент ТМВ-8, предотвращающий вход Са2+ в клетки и не изменяющий концентрацию внутриклеточного Са2+, не влиял на индукцию MDRI. Таким образом, для активации MDRX необходим внутриклеточный, но не внеклеточный кальций. Приведенные эксперименты доказывают принципиальную роль сигнальных путей фосфолипаза С->ДАГ-*ПКС и ФИ3->Са2+ в активации гена MDRX различными веществами, в том числе химиопрепаратами.

Однако ПКС - не универсальный механизм активации МЛУ. Активность ПКС в клетках, обработанных отдельными индукторами MDRX, различна. Т< активирует ПКС, Ara С не оказывает существенного влияния на активность этой киназы, а церамид - вторичный мессенджер, накапливающийся в обработанных химиопрепаратами клетках (Bose et al., 1995), ингибирует ее (табл. 1).

' Таблица 1. Эффекты индукторов гена MDRI на активность ПКС.

Обработка Активность ПКС, пмоль/мг белка/мин.

цитозоль фракция частиц

Контроль 119±13 59+9

ТФА, ЮОнМ 47+10* 153+14*

Ara С, 25 мкМ 143+16 65+10

Церамид, 1 мкМ 138+15 27+8*

Церамид, ЮмкМ 83+15* 15+7*

*р<0,05 в сравнении с контролем (необработанные клетки). Данные 6 опытов.

Ингибиторы ПКС хелеригрин и бис-индолнлмалеимид I предотвращали активацию MDR\ Ara С, докеорубицином и ТФА, но не церамидом (рис.7). Следовательно, активация ПКС не является непременным условием индукции гена MDRX. Некоторые агенты (например, церамвд) активируют ПКС-независимые сигнальные механизмы или действуют дистальнее ПКС.

100-]

о о Т( 80 •

s 60-

е т-§ 40200-

■с® *

Рис. 7. Церамнд активирует MDR\ независимо от интбпрования ПКС.

Клетки Н9 обработаны 25 мкМ С2-церамида 24 час. отдельно или в присутствии ингибиторов ПКС. Контроль эффективности ингибиторов - блокирование ими активации MDR\ при воздействии 10 мкМ цитозара.

Такими механгамами могут быть митогенактивируемые протеинкиназы. Доксорубицин и Ara С в концентрациях, активирующих MDR\, повышали активность JNK1, но не ERK1/2, тогда как ТФА активировал ERK1/2, а активность JNK1 не изменялась (рис.8). В соответствии с этими данными ингибитор ERKI/2 PD98059 отменял активацию MDRI ТФА, но не химиопрепаратами. Таким образом, митогенактивируемые протеинкиназы служат уровнем расхождения MDR1 -активирующих сигналов, генерируемых разными веществами.

Активация МАР-киназ доксорубицином и ТФА

Рис. 8. Дифференциальная активация МАР-кнназ индукторами MDR1. Клетки Н9 обработаны доксорубицином и ТФА. Активность ERK1/2 и JNK1 определяли после иммунопреципитации и фосфорилированто субстратов. Эффекты индукторов выражены как уровень активации каждой киназы по сравнению с необработанными клетками, в которых активность принята за 1. Суммированы данные 3-х экспериментов.

Транскрищионный фактор NFkB - механизм быстрого ответа клеток на внешние стимулы (Karin, 1995). В покоящейся клетке этот белок находится в цитоплазме в комплексе с ингибирующей субъединицей; в ответ на воздейсп NFkB диссоциирует из комплекса, транспортируется в ядро и активирует ген регуляторные области которых имеют сайты связывания NFkB. Ингибиторы NFkB ПДТК, ТФХМК и салицилаты предотвращали активацию MDRX цитозаром, доксорубицином и ТФА (рис.9). Особенно важно, что салицилап широко применяемые в клинике препараты - оказываются эффективными блокаторами срочной активации MDRI. Более того, салицилат натрия отмен долговременную (до 7 сут.) активацию MDRX цитозаром (рис.10), подтверж; значение NFkB как механизма активации МЛУ.

Рис. 9. Предотвращение индукции MDR1 ингибиторами NFkB. Клетки Н9 обработаны 10 мкМ Ara С, 5 мкМ доксорубицина или 10 нМ ТФА 16 час. отдельно или в присутствии ингибиторов активации NFkB. Обобщены результаты 4-х экспериментов.

4, отмывка

т т т **

Л га С - + +----

салицилат - - + \ з 5 7

дни без АгаС

Рис. 10. Долговременный эффект салнцнлата натрия как ингибитора индукции MDRI.

Клетки Н9 обработаны 10 мкМ Ara С 48 час. отдельно или в присутствии салицилата натрия, ресуспензированы в свежей среде и инкубированы еще 1-7 сут.

Важность установления роли №кВ еще и в том, что этот механизм "объединяет" цитоплазматические и ядерные события в активации гена МОЯ 1. Такая связь подтверждается опытами по активации промотора ген; АЮШ экзогенным №кВ. Котрансфекция субъединиц ОТкВ р50 и р65 приводила к активации района -1202/+118 н.о. промотора АЮШ (рис. 11). Однако в указанном районе не обнаружен канонический сиквенс 5'-СООИМ^ УУСС-З' (Я-любое пуриновое основание, аЫ-любое пиримидиновое) для взаимодействия с №кВ или гомологичные последовательности. Возможны следующие предположения: 1) №кВ взаимодействует с еще не идентифицированной последовательностью в участке -1202/+118 и.о.; 2) №кВ активирует промежуточный ген (гены), продукт которого связывается с районом -1202/+118 н.о. и индуцирует промотор MDR1.

Рис. 11. NFkB - активатор промотора MDR\.

Клетки К562 трансфецированы указанными конструкциями и плазмидой, несущей reí люциферазы Renilla под промотором SV40. Активность люциферазы Firefly, отражающая индукцию участка -1202/+118 н.о промотора MDRX (обозначен как MDF нормализована на активность люциферазы Renilla.

Регуляция промотора гена MDR1.

Пути передачи Л/£>Л1-активирующих сигналов должны иметь общую "точку схождения" - регуляторную область гена и иРНК. Для исследования промотора MDRI мы использовали препараты, модулирующие физико-химическое состояние хроматина - ингибиторы гистондеацетилаз трихостатин А и бутират натрия, представители классов химиопрепаратов-непосредственных регуляторов генной транскрипщш. Важно сравнить механизм активации МЛУ этими агентами и Ara С и доксорубицином - лекарствами, для которых хроматин не является прямой мишенью. Трихостатин А и бутират натрия активируют эндогенный ген MDRX в клетках Н9, К562 и SW620. Увеличение иРНК (рис.12, левая панель) сопровождалось активацией люциферазы, транскрибируемой с участка -1202М18 н.о. промотора MDRI (рис.12, правая панель).

Рис. 12. Ингибиторы гистондеацетилаз индуцируют эндогенный ген MDRX и промотор (временная трансфекция).

Слеш, клетки Н9, К562 и SW620 обработаны указанными препаратами 24 час. Уровень иРНК MDRX исследован в ГТЦР. Справа: клетки К562 трансфецированы конструкцией -1202/+П8 н.о.-люцифераза. Через 24 час. клетки стимулированы указанными препаратами в течение 16 час. Представлены результаты 3-х опытов.

Установлено, что трихостатин А и бутират активируют MDRI за счет паимодействия транскрипционного фактора NF-Y с инвертированным ХААТ-боксом (Jin, Scolto, 1998), что подтверждает цепь событий "индуктор—► модификация хроматина -> активация промотора MDRI". Однако в условиях «ременной трансфекщш хроматин на плазмиде остается "несовершенным".

S

é к

2

га 1600 ч

о

Для изучения роли хроматина в индукции MDRI клетки SW620 трансфецированы конструкцией -1202/+118 н.о.-люцифераза Firefly и плазмидой, несущей ген neo; затем проведен отбор клеток на выживание в присутствии неомицина. В селектантах, как и при временной трансфекции, трихостатин А и бутират натрия вызывали накопление эндогенной иРНК MDRI и индуцировали транскрипцию с района -1202/+118 и.о. промотора этого гена. Активацию MDRI ингибиторами гистондеацетилаз отменял ЕТ743 - блокатор транскрипции. Так показана прямая связь повышения количества иРНК MDRI и активации промотора этого гена через ацетилирование хроматина.

Эти данные получены при действии на клетки агентов, непосредственно изменяющих физико-химическое состояние хроматина. Всегда ли выявленны механизм имеет место, ведь не все химиопрепараты (и иные экзогенные стимулы) - прямые регуляторы хроматина? Мы отмечали, что время полужи: иРНК MDRI увеличивается в клетках, обработанных Ara С и ТФА. На рис.1: показано, что ТФА и трихостатин А - мощные индукторы промоторной активности (транскрипции) MDRI, тогда как ни Ara С, ни доксорубицин, ни церамид не активировали промотор или вызывали лишь слабый эффект.

Рис. 13. Эффекты активаторов МЛУ на индукцию промотора MDRI. Клетки К562 трансфецированы конструкцией -1202/+118 н.о.-люцифераза Firefly, разделены на равные части и стимулированы 16 час. указанными препаратами.

Активность люциферазы в необработанных клетках, нормализованная на содержание общего белка в лизатах клеток, принята за 1. Результаты воспроизведены в 3 опытах.

Эти результаты позволяют утверждать, что повышение уровня иРНК А/Ш1 происходит как в результате активации транскрипции (ТФА, трихостатин А), так и без прямой индукции промотора (цитозар, доксорубицин, церамид). В последнем случае следует признать или механгам стабилизации иРНК, или активацию промежуточного гена, продукт которого индуцирует промотор МИЕХ или стабилизирует транскрипт (см. опыты с экзогенным №кВ).

Таблица 2. Ингибиторы сигнальных механизмов, предотвращающие срочную активацию гена МЖ1 цнтозпром.

Препарат Внутриклеточная мишень Ингибирующая концентрация

хелеритрин ПКС 10 мкМ

кальфостин С ПКС 1 мкМ

бис-индолил-

малеимид I ПКС 5 мкМ

ВАРТА/АМ Са2+ 5 мкМ

ПДТК №кВ 5 мкМ

ГФХМК №кВ 25 мкМ

натрия салицилат №кВ 20 мМ

ютирин №кВ 10 мМ

зиэфиры высших плазматическая

жирных кислот мембрана? Юмкг/мл

1КТШГОМИЩШ Б элонгация транскрипта? 500-1000 нг/мл

х-аманитин РНК-полимераза II 9 мкг/мл

жгеинасцищш 743 не установлена 100 нМ

В таблице 2 приведены фармакологические препараты-представители груп ингибиторов сигнальной трансдукции, предотвращающих активацию MDR\ цигозаром или доксорубицином в клетках лейкоза Н9 и К562.

Преодоление Pgp-опосредованной МЛУ: плазматическая мембрана какмишен

цитотоксического действия.

Итак, Pgp-опосредованная МЛУ может формироваться достаточно быстро в течение одного клеточного деления, и сохраняться в поколениях выживших клеток. Индукторами МЛУ являются многие стимулы, в том числе используе] в клинике противоопухолевые препараты разных химических групп. Pgp - ода механизмов, препятствующих активации программированной гибели (апопто (Johnstone et al., 1999). Следовательно, опухоль с первичной устойчивостью к апоптогенным стимулам и быстро приобретшая МЛУ в ответ на лечение, представляет особую трудность для терапии. Каковы стратегии преодоления многофакторной резистентности?

Исследована гибель таких клеток при действии эффекторов иммунитета. Предпосылкой такого подхода явились данные об отторжении прививаемой миеломы спленоцигами, накапливающимися при вакцинации мышей клетка; той же опухоли, модифицированными для экспрессии цитокинов (Turner et al.,1996). Поскольку свойства сублиний МРС1 IDoxlO-l и МРС1 1Dox10-2 оказались схожи, ниже анализируются клетки MPCllDoxlO-1.

Фенотип МЛУ в селектантах характеризовался гиперэкспрессией гена mdrVo, снижением транспорта кальцеина и устойчивостью к доксорубицину винкристину - субстратам Pgp. Для создания иммунитета к прививке миелол клетки МРС11 и MPCI IDoxlO-l трансфецировали кДНК цитокинов ГМ-КС ИЛ-12. Прививаемое количество клеток пятикратно превышало минимально 100%-ю опухолеродную дозу.

Таблица 3. Частота отторжепня опухоли у контрольных и

иммунпзнрованных животных.

Мыши Прививка

МРС11 MPCllDoxlO-1

Интактные 0/15* 0/10

Иммунизация клетками МРС11:

облученные клетки 1/15 0/10

■М-КСФ/ИЛ-12-трансфецированные клетки 15/15** 9/10**

Иммунизация клетками МРС1 Шох10- 1:

облученные клетки 0/15 0/10

'М-КСФ/ИЛ-12-трансфецировашше клетки 9/10** 10/10**

Частота отторжения опухоли: в числителе - число мышей, у которых не появилась опухоль; в 1аменателе - общее количество привитых мышей, **Р<0,001 по критерию х2 в сравнении с еиммунизированными (интактными и вакцинированными только облученными клетками) ивотными.

Из таблицы 3 видно, что клетки МРС11 и МРС1 IDoxIO опухолеродны: у 100% неиммунизированных животных отмечено появление опухолей через 8-10 дней после прививки соответствующих клеток. Однако у мышей, иммунизированных цитокинэкспрессиругощими клетками, опухоли не появлялись (прививка МРС11) или были редкими (прививка резистентной сублинии). Противоопухолевый иммунитет оказался длительным: опухоли не возникли в течение 5 недель после инокуляции свежих клеток. Частота отторжения прививаемых клеток была схожей в группах, иммунизированных клетками MPC 11 и резистентной сублинией. Эти результаты свидетельствуют о возможности гибели злокачественных резистентных клеток при воздействии фактора (-ов), обнаруженного в опытах in vivo.

Таким фактором являются ЦТЛ, генерируемые в селезенке в ответ на иммунизацию цитоюшэкспрессирующими клетками. На рис. 14 показано, что спленоциты мышей, иммунизированных экспрессиругощимн ГМ-КСФ и ИЛ-12 клетками MPC 11, лизировали клетки-мишени MPC 11 и MPCllDoxlO-1 с практически одинаковой эффективностью (рис. 14).

80 -i г_Ж

-ér-MPCU/MPCJlDoilO

МРС11/МРСИ

-0-МРС11-

эффекторьг.мишенн

Рис. 14. Лизис ЦТЛ родительских и Pgp-положительных клеток.

В числителе: клетки для иммунизации, в знаменателе: прививаемые клетки.

Следовательно, противоопухолевый иммунитет у животных, привитых цитокинэкспрессирующей клеточной вакциной, связан с чувствительность!' клеток с МЛУ к логическому действию ЦТЛ.

Киллерная активность ЦТЛ обусловлена секрецией этими клетками CD95/Fas лиганда и/или тандема гранзим В-перфорин (Ветке, 1994). Для решения вопроса о том, какой из указанных механизмов функционирует в исследуемой системе, изучали выживаемость клеток в присутствии Fas лиганда Клетки МРС11 и МРС1 ШохЮ-1 оказались устойчивы даже к относительно высоким концентрациям Fas лиганда. Таким образом, кандидатом на роль механизма цитотоксического действия иммунных UTJ следует считать гранзим В/перфорин. Действительно, преинкубация имму] ЦТЛ с конканамицином А, ингибитором процессинга перфорина, уменьшг лизис клеток-мишеней MPCllDoxl 0-1 (рис. 15).

Для поиска способов преодоления МЛУ важно, что сублинии с MJB сохраняли чувствительность к цитотоксическому действию, обусловленно нарушением целостности плазматической мембраны перфорином. Проникновение в клетку гранзима В через поры в плазматической мембра образуемые перфорином, приведет к активации эффекгорных каспаз. Такс

киллерный тандем - одновременное действие агента, формирующего поры в наружной мембране, и протеазы - позволяет вызывать гибель клеток, устойчивых к ряду внешних воздействий. Следовательно, плазматическая мембрана - важная мишень для терапии, направленной на элиминацию резистентных клеток.

40-

о 30г)

4 20 -9-

!ю

т; со к) о о о

п (о n ii) о о

<ч и о

эффектор: мишень

Рис. 15. Гранзнм В/псрфорин - механизм ЦТЛ-опосредованной гибели. Конканамицин А (светлые столбцы) снижает ЦТЛ-опосредоваиный лизис клеток МРС1 ШохЮ-1. Темные столбцы - лизис мишеней ЦТЛ без преинкубации с конканамицином А. Приведен один из 3-х репрезентативных опытов.

Церсшид и свободные кислородные радикалы в преодолении МЛУ. Если плазматическая мембрана - искомая мишень, то как вызвать ее товреждение? Особенно желательно, чтобы такое воздействие оказывал бы $>актор, общий для многих противоопухолевых препаратов. Одним из таких 'посредников" является церамвд. Для того чтобы церамид был эффективен для треодоления МЛУ, он должен удовлетворять как минимум двум требованиям: ;) не транспортироваться из клетки посредством Pgp; 2) запускать пути гибели, функционирующие в резистентных клетках. Достаточно ли "обойти" рансмембршшый транспортер - ведущий механизм МЛУ, чтобы вызвать ибель клеток, устойчивых к ряду воздействий?

Церамид не транспортируется Р-гпикопротеином.

Поскольку церамид накапливается в ответ на воздействие ряда химиопрепаратов, мы исследовали, удовлетворяет ли этот метаболит указанн условиям. Оказалось, что кинетика накопления церамида в родительских клетках К562 и их Р§р-позитивной сублинии К5621/89 практически одинаков (рис.16). Вместе с тем, клетки К562^Б9 накапливали существенно меньше родамина 123, чем клетки К562 (контроль Р§р-опосредованного транспорта). Следовательно, церамид не является субстратом транспорта для Р§р.

юооо

*

8000 6000 4000 2000 0

0 0,05 0,2 1 5 С5-ВОО!РУ-церамид

Рис. 16. Pgp не транспортирует короткоцепочечный церамид. Клетки К562 и К5621/59 инкубировали 30 мин. с С5-церамидом, конъгогированным с флуорохромом ВСЮ1РУ (верхняя панель) или родамином (Ш1)123 (нижняя панель). Свечение клеток исследовали в проточной цитофлуориметрии. Данные 3-х экспериментов.

Не выявлено различий цитотоксичности синтетического (С2) и естественного (Си) церамидов для клеток К562 и К5621/89, а также для пар

родительских клеток и селектантов: МСР-7 и МСР-7Ас1г, КВ-3-1 и КВ-8-5-11. Таким образом, церамид вызывает гибель Р§р-отрицательных и Р§р-положительных клеток с одинаковой эффективностью.

не препятствует нарушению целостности плазматической мембраны.

Для выявления механизмов гибели клеток К5621/59 под действием церамида изучали следующие параметры: активацию каспаз 9 и 3, расщепление поли-АДФ-рибозо-полимеразы (РАКР), межнуклеосомную деградацию ДНК, внутримембранную транслокацию фосфатидилсерина, (по связыванию аннексина V), трансмембранный электрический потенциал митохондрий и целостность плазматической мембраны (по включению ПИ в клетки). На рис. 17 показано, что к 24 час. воздействия церамидом процент гибнущих клеток достигал 37+4 %. Особенно важным оказалось появление "двойных положительных" (аннексин^ПИ4) клеток, означая, что в клетках К562ЛБ9 церамид довольно рано вызывает нарушение проницаемости плазматической мембраны (некроз или поздний апоптоз). При этом характерная для классического апоптоза активация каспазы 3 не выявлена; протеолиз РАШ> оказался поздним событием (48 час. воздействия).

Действие церамида на клетки К5621/Б9 практически не сопровождалось изменением трансмембранного потенциала митохондрий: этот показатель в гибнущих клетках не отличался от соответствующей величины для необработанных клеток. Межнукпеосомная фрагментация ДНК также не была ведущим признаком гибели: только около 11% событий приходилось на суб-01-область (гиподиплоидные клетки), тогда как процент гибнущих клеток (сумма аннексин+/ПИ", аннексин7ПИ+ и двойных положительных) при той же продолжительности воздействия составил 64+4%. Таким образом, важнейшим признаком гибели клеток К562ЛБ9 при действии церамида оказывается раннее нарушение целостности плазматической мембраны -некроз.

g 80

& 60

5 40

г? 20

Ж

о

о

24

48

время (час.) с церамидом

■ К562,Аннексин+ □ К562,Аннексин+ПИ+ BK562i/S9,nH+

ИК562.ПИ+ В K562i/S9,AHHeKCHH+ ■ К562|789,Аннексин+ПИ+

Рис. 17. Показатели гибели клеток К562 и K562L/S9 под действием церамида. Клетки обрабатывали 25 мкМ С2-церамида в течение указанных промежутков времет Процент аннексии V-положительных, пропидия иодид (ПИ+)-положительных и "двойных позитивных" (аннексин+ПИ+) клеток определяли в проточной цито-флуориметрии.

В клетках К562 р53 не функционирует, и экспрессирована химерная протеинкиназа Всг/АЪ1, т.е. в этих клетках присутствуют молекулярные детерминанты устойчивости к апоптозу. Поэтому можно рассматривать сублинию K562i/S9 как модель плейотропной резистентности, где Pgp - одел из механизмов. Тем важнее данные о способности церамида вызывать гибел! таких клеток по механизму некроза.

Метаболитами, способными вызвать некроз, могут являться свободны кислородные радикалы. Для установления их роли в церамидиндуцированнс гибели клеток K562/iS9 изучена цитотоксичность церамида в присутствии N ацетилцистеина (NAC), хелатора радикалов кислорода и исследована кинеи образования кислородных радикалов в клетках, обработанных церамидом. Ь рис.18 показано, что NAC отменял цитотоксичность церамида. Таким образ свободному кислороду принадлежит решающая роль в гибели резистентны* клеток при воздействии церамида. На рис.19 приведена зависимость

луоресценции клеток, нагруженных ОСРОА, от времени действия церамида и

»нтрольного агента - перекиси водорода, донатора О2'. Н2О2 вызывала быстрое

же через 20 мин. - увеличение флуоресценции клеток. Церамид же вызывал

ютивоположный эффект: через 15 мин. воздействия наблюдали резкое - на 1,5

•рядка - снижение свечения. Лишь к 24 час. обработки интенсивность

гуоресценции клеток возвращалась к уровню этого показателя в

обработанных клетках и нарастала к 48-72 час. воздействия, когда количество

бнущих клеток было уже велико (рис. 17). Следовательно, в обработанных

рамидом клетках первоначально имеет место восстановление, а окисление

\

оисходит позднее, вероятно, в результате истощения ресурсов восстановления утриклеточных субстратов.

Рис.18. NAC блокирует гибель клеток K562i/S9. Клетки обрабатывали Сг-церамидом без или с 5 мМ NAC. Отдельно NAC не влиял на жизнеспособность клеток.

Рис. 19. Окисление в клетках К562|/89 под действием церамида. Клетки обрабатывали 25 мкМ С2-церамида в течение указанных интервалов времени. Внутриклеточное окисление изучали по изменению флуоресценции клеток, нагружем Е>СГОА. Н2Ог использовали как контроль "кислородного взрыва". Суммированы результаты 3-х опытов.

Обсуждение результатов

Анализ механизмов активации гена МОИ1 позволяет утверждать следующее: 1) Ген АЮМ и фенотип МЛУ могут быть индуцированы при кратковременном воздействии на клетки многих веществ. Гиперэкспрессия МБЯ\ и накопление Р§р выявляются в клетках, выживших после прекращен! воздействия ксенобиотика. Таким образом, эпигенетическая активация гена МОЯ\ обеспечивает стабильный фенотип МЛУ.

2) Срочное становление МЛУ регулируется общими сигнальными механизмами клетки. Действительно, активация фосфолипаз, мобилизация внутриклеточного Са2+, индукция №кВ и каскадов стресс-активируемых протеинкиназ — механизмы, обеспечивающие реакцию клетки на стресс. Кр того, транскрипционные факторы и функционально активные сайты в

ipoMOTope гена MDR1, важные для активации МЛУ, не уиикальны для этого ена: для регуляции транскрипции большинства эукариотических генов важны ■JF-Y, ССААТ-бокс и хроматинмодулирующие сигналы. Этим, по-видимому, бъясняется высокая индуцибельность генаMDRX: данный ген активируется гногими стимулами в клетках различного гистогенеза. В свою очередь, егуляция MDRX общими стресс-реализующими механизмами подчеркивает ивиологическуго важность активации МЛУ наряду с другими реакциями летки на экзогенные воздействия.

3) Множественность и взаимозаменяемость механизмов активации МЛУ шс.20) определяются многоуровневым характером регуляции этого фенотипа. а каждом из этих уровней клетке предоставляется возможность «выбирать» ути активации МЛУ. Во-первых, выбор диктуется природой стимула (разные енты действуют через разные механизмы). Во-вторых, конкретный механизм висит от наличия тех или иных сигнальных молекул и их взаимодействия в (етках данного типа. В-третьих, выбор происходит на уровне собственно анскрипционных механизмов (состояние хроматина в области промотора DRI). Из этих соображений понятны как причины высокой индуцибельности на MDRX (широкая взаимозаменяемость и взаимопересекаемость сигнальных тей и транскрипционных механизмов обеспечивает индукцию многими имулами и в разных типах клеток), так и случаи отсутствия индукции сгивирует не всякий стимул и не в любой экспериментальной системе).

Схема срочной активации гена MDRX (на примере цитозара и ТФА) едставлена на рис.20.

Представление об индукции MDRX как отсроченном событии, гдусматривающем вначале активацию белков, необходимых для индукции toro MDRX, еще более усложняет картину эпигенетической активации МЛУ. <ой каскадный механизм может быть главным или дополнительным,

Регуляция МОЯ 1 химиопрепаратами и ТФА

АгаС

неомицин, 1173122

ТФА

активация Транскрипции стабилизация иРНК

Рис. 20. Механизмы срочной активации гена МОЯ 1.

интенсифицируя или поддерживая темп транскрипции. Возможность выбора клеткой различных путей индукции МЛУ — прямых (без активации промежуточных генов) и/или опосредованных индукцией других генов — еще более затрудняет профилактику развития МЛУ.

Активация транскрипции гена ЛЯ)/? 1 — не единственный механизм становления МЛУ. Другим важным компонентом эпигенетической регуляции может оказаться стабилизация нРНК МОК 1. Не исключено, что в отношешш баланса между индукцией транскрипции и стабилизацией иРНК МОЯ 1 механизмы активации МЛУ при воздействии различных индукторов и в разных типах клеток также неодинаковы. Такое предположение согласуется с представлениями о многоуровневой регуляции экспрессии гена МйЯХ (рис.19).

4) Целенаправленная профилактика МЛУ возможна при установлении механизмов передачи М)Л1-активирующих сигналов. Подгвержде1шем необходимости профилактики становления МЛУ в клинике является связь гйттации МЛУ и цитотоксичности лекарственных веществ. Действительно, уровень иРНКА/£У?1 в клетках, обработанных токсинами, возрастает с увеличением концентрации последних. Следовательно, применение высокодозных режимов химиотерапии (оправданное для повышения эффективности лечения) может вести к развитию МЛУ в выживших клетках. Концентрации лекарств, требуемые для полной резорбции новообразования, могут оказаться выше допустимых для больного, что определяет предел эскалации доз в химиотерапии. Идентифицированные выше антагонисты передачи внутриклеточных сигналов могут служить прототипами будущих лекарственных блокаторов МЛУ, используемых в сочетании с традиционными противоопухолевыми препаратами. Таким образом, предотвращение срочного становления МЛУ расширяет возможности преодоления этого клинически неблагоприятного феномена.

Каковы подходы к преодолению сформировавшейся МЛУ? Одной из "уязвимых" мишеней в резистентных клетках может быть плазматическая мембрана. Нарушение ее целостности вызывает гибель резистентных клеток: Pgp не предотвращает гибель от воздействий, индуцирующих некроз. Идентифицирована важная в терапевтическом отношении клеточная структура, на которую следует направить воздействие. Очевидно, просто мембранолигические агенты непригодны из-за неконтролируемой токсичнос для тканей, в том числе неопухолевых. Следует найти агенты, преодолевающие барьер Pgp и вызывающие повреждение плазматической мембраны, т.е. создать внутриклеточную концентрацию препарата, достаточную для активации некроза Веществом, удовлетворяющим указанному условию, может быть церамид — сфинголипид, накапливающм в клетке в ответ на многие стимулы, в том числе противоопухолевые препараты. Церамид не транспортируется Pgp, что обеспечивает достаточна для индукции гибели концентрацию этого метаболита в резистентных клеп

Токсичность церамида для резистентных клеток означает, что сигнальные пути дистальнее накопления церамида в этих клетках не блокированы ни Pgp, ни иными механизмами, связанными с селекцией на МЛУ. Следовательно, преодоление резистентности должно быть связано с поиском способов накопления церамида (и, возможно, других токсических метаболитов) в резистентных клетках. Для цитотоксичности церамида требуются кавеолы или их аналоги - подмембранные образования, богатые фосфолипвдами и белками и накапливающиеся при селекции на МЛУ (La\ et al., 1998). Важно, что отбор на МЛУ может сопровождаться увеличение клетках молекулярных мишеней для противоопухолевой терапии.

Существенным механизмом индуцируемой церамвдом гибели оказываются свободные формы кислорода. Это ставит вопрос о значении митохондрий в выживаемости клеток с МЛУ. Митохондриальный путь

хнерирует дополнительные сигналы к активации эффекторных каспаз. ■Литохондриальная "петля" - мощный фактор потенцирования таких сигналов, «еда падение электрического потенциала митохондрий и особенно выход в рггоплазму цитохрома С обеспечивают необратимость процесса гибели. 1оскольку не представляется возможным предсказать, будет ли отбор на стойчивость связан с инактивацией того или иного пути гибели, важно, чтобы толь "надежный" каскад сохранял функщпо в клетках с МЛУ.

Наши результаты свидетельствуют о чувствительности к кислородным адикалам клеточных линий с Р§р-опосредованной МЛУ. Можно полагать, что, отя первичная резистентность и отбор на лекарственную устойчивость бусловлены многими механизмами, все же удается преодолеть ногофакторную резистентность повышением внутриклеточного окисления. Свободный кислород немедленно вступает в многочисленные реакции кисления, приводя к поврежденшо важных для жизнедеятельности клетки груктур - ДНК и мембран. В приведенных экспериментах ведущим способом 1бели при воздействии кислородных радикалов оказался некроз. Это не шачает, что некроз — единственный путь смерти, индуцируемый свободными ормами кислорода. В конкретной ситуации следует установить преобладание )го или иного вида гибели; стандартное разграничение апоптоз-некроз не хпностью характеризует многообразие механшмов смерти. Это эотивопосгавление имеет смысл для определения, первично ли повреждение шматической мембраны или этот процесс отсрочен. Однако представляется (айне важным оценить проницаемости плазматической мембраны в любой ггуации: нарушение целостности мембраны обусловливает необратимость [бели. Следовательно, некротический компонент гибели важен для иминации клеток с МЛУ, поскольку Pgp может защищать клетки от агентов, (дуцирующих апоптоз, но не от веществ, вызывающих некроз.

Последнее обстоятельство не удивительно. Для функционирования этог белка плазматической мембраны необходимо ее определенное физико-химическое состояние, обусловленное целостностью. При некрозе произойду грубые повреждения клетки, главным образом из-за нарушения транспорта воды и ионов. Эти повреждения затронут практически любые клеточные структуры, в отличие от апоптотических каскадов, выражающихся в последовательном расщеплении субстратов - процессе энергозависимом, предусматривающем формирование в клетке многокомпонентных белково-липидных комплексов и строгую специфичность взаимодействия каспаз с субстратами. Блокирование одной или нескольких звеньев такого каскада (например, в результате нарушения транспорта липидов в клетках с МЯУ мс не образовываться "правильно" локализованные сигнальные комплексы) прервет передачу сигналов на нижележащие механизмы, результатом чего станет ускользание клетки от гибели и, в итоге, формирование устойчивости Еще и по этой причине для борьбы с МЛУ желательно, чтобы механизмы смерти были множественными и включали активацию не только каспаз, но: других семейств протеаз (лизосомных, протеосомных, ядерных), а также пу потенцирования сигнала (митохондриальный путь) и нарушение проницаем плазматической мембраны. Чем больше механизмов смерти удастся активировать в резистентных клетках, тем надежнее конечный результат -преодоление МЛУ.

ВЫВОДЫ:

1. Ген МОЯ\ и фенотип Р-гликопротеин-опосредованной МЛУ могут 61 индуцированы при однократном кратковременном воздействии на клетки мн< веществ, в том числе противоопухолевых препаратов. МЛУ закрепляется в

жолениях клеток, выживших после воздействия. Эпигенетическая активация на МОт формирует стабильный фенотип МЛУ.

2) Срочное становление МЛУ обеспечивается активацией экспрессии гена ЭЯ1: индукцией его транскрипции и стабилизацией иРНК.

3) В активации МЛУ участвуют общие мехашомы ответа клетки на стресс: сфатидилинозитольный путь, протеинкиназа С, мобилизация внутриклеточного 2+, активация №кВ, митогенактивируемые протеинкиназы и регуляция физико-мического состояния хроматина. Ингибирование этих механизмов едотвращает становление МЛУ в клетках, выживших после обработки этивоопухолевыми препаратами.

4) Преодоление барьера Р§р и индукция механизмов гибели, жционирующих в клетках с МЛУ - необходимые и достаточные условия минации таких клеток.

5) Р§р в отдельности и фенотип МЛУ в целом не обеспечивают выживание ггок при воздействиях, вызывающих первичное нарушение целостности оматической мембраны. Таким образом, плазматическая мембрана -апевтическая мишень, а индукция некроза - одна из стратегий преодоления арственной устойчивости.

6) Гибель клеток с МЛУ, обусловленную нарушением целостности зматической мембраны (перфоршюпосредованный лизис), вызывают отоксические Т-лимфоцигы, генерируемые в ответ на иммунизацию холевыми клетками, модифицированными для экспрессии цитокинов.

7) Внутриклеточными метаболитами, способными повреждать зматическую мембрану и вызывать гибель клеток с МЛУ, являются свободные икалы кислорода. Генерирование их при действии противоопухолевых гаратов - эффективный механизм преодоления МЛУ.

Основные публикации по теме диссертации:

1. Shtil A., Shushanov A., Stavrovskaya A., Moynova Е. Frequency of metastasis in Syrian hamster tumor cells selected for low levels of 'typical' multidrug resistance. Experimental and Toxicological Pathology, 1994, 46, 257-262.

2. Erokhina M., Shtil A., Shushanov S., Sidorova Т., Stavrovskaya A. Partial restoration of the actin cytoskeleton in transformed Syrian hamster fibroblasts selected for low levels of'typical' multidrug resistanceJ/FEBS Letters, 1994,341, 295-298.

3. Stromskaya Т., Filippova N., Rybalkina E., Egudina S., Shtil A., Elisseenkova A., Stavrovskaya'A. Alterations in melanin synthesis in human melanoma cells select in vitro for multidrug lesislaaccJ/Experimental and Toxicological Pathology, 199 47, 157-166.

4. Yu R., Shtil A., Tan T.-H., Roninson I., Kong T. Adriamycin activates c-Jun N-terminal kinase in human leukemia cells: a relevance to apoptosis JlCancer Letter: 1996,107, 73-81.

5. Komarov P., Shtil A., Buckingham L., Balasubramanian M., Piraner O., Emanuel M, Roninson I., Coon J. Inhibition of cytarabine-induced MDR1 (P-glycoprotein gene activation in human tumor cells by fatty acid-PEG-fatty acid diesters, novel inhibitors of P-glycoprotein function. I I International Journal of Cancer, 1996,68 245-250.

6. Walter R., Shtil A., Roninson I., Holian O. 60 Hz electric fields inhibit protein kinase С activity and multidrug resistance gene (MDR1) up-regulation JIRadiatio Research, 1997,147, 369-375.

7. Walter R., Shtil A., Roninson I., Reyes H., Holian 0. Effects of 60 Hz electric f on protein kinase С activity and multidrug resistance gene (MDR1) expression.// Current Surgery, 1997, 54,366-370.

Stromskaya T., Rybalkina E., Filippova N., Shtil A., Stavrovskaya A. Regulation of MDR1 gene expression and P-glycoprotein function in cultured melanoma and hepatoma cells .//British Journal of Cancer, 1998, 77, 1716-1725.

Komarov P., Shtil A., Holian 0., Tee L., Buckingham L., Mechetner E., Roninson I., Coon J. Activation of the LRP (lung resistance-related protein) gene by short-term exposure of human leukemia cells to phorbol ester and cytarabine.f/Oncology Research, 1998,10, 185-192.

I. Shtil A, Mandlekar S, Yu R., Walter R., Hagen K., Roninson I., Tan T.-H., Kong T. Differential regulation of mitogen-activated protein kinases by microtubule-binding agents in human breast cancer cellsJ/Oncogene, 1999,18,377-384.

. Damiano J., Cress A., Hazlehurst L., Shtil A., and Dalton W. Cell adhesion mediated drug resistance (CAM-DR): role of integrins and resistance to apoptosis in human myeloma cell linesMBlood, 1999,93, 1658-1667.

. Shtil A., Turner J., Durfee J., Dalton W., and Yu H. Cytokine-based tumor cell vaccine is equally effective against parental and isogenic multidrug-resistant myeloma cells: the role of cytotoxic T-lymphocytes. I/Blood, 1999,93, 1831-1837.

Shtil A., Ktitorova O., Kakpakova E., and Holian O. Differential effects of the MDR1 (multidrug resistance) gene-activating agents on protein kinase C: evidence for redundancy of mechanisms of acquired MDR in leukemia cells .//Leukemia and Lymphoma, 2000, 40, 191-195.

Shtil A., Grinchuk T., Tee L., Mechetner E., Ignatova T. Overexpression of the MDR1 gene is associated with a decreased mitochondrial transmembrane potential in K562 human leukemia cells selected for P-glycoprotein-mediated multidrug resistance.//International Journal of Oncology, 2000,17,387-392. Shtil A., Turner J., Dalton W., Yu H. Alternative pathways of cell death to :ircumvent pleiotropic resistance in myeloma cells: role of cytotoxic T-lymphocytes.// Leukemia and Lymphoma, 2000,38, 59-70.

16. Shtil A.A. Signal transduction pathways and transcriptional mechanisms as targei for prevention of emergence of multidrug resistance in human cancer cells.HCurre, Drug Targets, 2001,2, 57-77.

17. Штиль А. А. Эпигенетическая активация множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток: передача сигналов, транскрипционная активация и возможности профилактики.//"Успехи современной биологии", 2001,121, 563-575.

18. Sidorova Т.А., Nigmatov A., Kakpakova E.S., Stavrovskaya А.А., Gerassimova G.K., Shtil A.A., and Serebtyakov E.P. Effects of isoprenoid analogues oiSDB-ethylenediamine on multidrug resistant tumor cells alone and in combination with chemotherapeutic dmgs.l/Journal of Medicinal Chemistry, 2002,21,5330-5339.

19. Shtil A. A. Emergence of multidrug resistance in leukemia cells during chemotherapy: mechanisms and prevention.1 ¡Journal of Hematotherapy and Stei Cell Research, 2002,11, 231-241.

20. Shtil A. A. Multifactorial drug resistance: P-glycoprotein on the apex of the Vyraxmi.llJournal of Hematotherapy and Stem Cell Research, 2002,11,437-43

21. Shtil A. A. P-glycoprotein as a therapeutic target: good news.l/Leukemia, 2002, 2169-2170.

22. Штиль А.А. Развитие множественной лекарственной устойчивости как срочный ответ клетки на экзогенные воздействия.// "Биологические мембр( 2003,20,236-243.

23. Lehne G., Shtil A. A. Targeting P-glycoprotein for execution of cellular death mechanisms in cancer.,H'TargetedCancer Therapies, An Odyssey', 2003,203-i

Служба множительной техники ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН Подписано к печати 14 . II .03г. Заказ № 24'/. Тираж 100 экз.