Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Химиорезистентность карцином пищевода и желудка в лабораторных тестах и возможные пути ее преодоления

На правах рукописи

Хнмнорезистеитиость карцином пищевода и желудка в лабораторных тестах и возможные пути ее преодоления

14.00.14 - онкология

Автореферат

диссертации на соискание-ученой степени кандидата биологических наук

г.Москва - 1997 г.

Работа выполнена в Московском иаучио-нсследо-вательском онкологическом институте имени П.А.Герцена МЗ РФ (директор - академик РАМЫ, профессор В.И.Чиссов)

Научные руководители:

академик РАМН, профессор В.И.Чисссо

доктор биологических наук Н.С.Сергеева

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Т.А.Богуш доктор медицинских наук, профессор И.Г.Русаков

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт диагностики и хирургии МЗ РФ

Защита состоится 18 марта 1997 года в 14 часов иа заседании диссертационного совета Д 084.17.01 при МНИОИ им.П.А.Герцена МЗ РФ по адресу: 125284, г.Москва, 2-ой Боткинский проезд, дом 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МНИОИ им. П.А.Герцена МЗ РФ.

Автореферат разослан // февраля 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор И.А.Максимов

Актуальность проблемы.

Одним нз основных методов лечения больных раком пищевода (РП) и желудка (РЖ) является хирургический. Однако у большинства больных заболевание диагностируют лишь в III-IV стадиях, когда радикальность хирургического вмешательства не достигается. Следствием этого является низкая 3-5-летняя выживаемость таких больных. Одним из путей улучшения результатов лечения РП и РЖ в III-IV стадиях считают применение адъювантного лечения и, в частности, химиотерапии. Количество исследований,, посвященных анализу результатов адъювантной химиотерапии больных РП и РЖ огромно, испытаны различные сочетания цитостатнков и режи. .ы их введения. Тем не менее высокоэффективных схем полнхимиотерапии, к которым чувствительны более 30,0-40,0% опухолей желудка и пищевода, пока не выявлено. Клинический опыт свидетельствует о первичной полихимиорезистентности значительной части этих новообразований.

Следовательно, прогнозирование индивидуальной реакции опухолей пищевода и желудка к химиопрепаратам , разработка подходов к выявлению случаев первичной резистентности данных карцином, исследование механизмов,обуславливающих эту резистентность и способов их отмены является актуальной задачей в плане улучшения результатов лечения больных РП и РЖ.

К настоящему времени показано, что устойчивость опухолевых клеток к цитостатикам в модельных системах In vitro может быть обусловлена разными причинами, в том числе экспрессией и/или активацией на мембране клеток Р-глико-протеина, способного выбрасывать некбторые цитостатики из клетки. Феномен Р-гликопротсин-опосредованной сочетанной резистентности клеток к винкаалкалоидам и антрациклииовым антибиотикам получил название множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Хотя изучению этого механизма посвящено сравнительно много публикаций, данные о его исследованиях в системах in vivo на опухолях человека в литературе практически отсутствуют. Вследствие этого, до сих пор не выяснено, насколько зиачима роль Р-глнконротеина в обеспечении первичной хи.миорезистентиости солидных злокачественных новообразований человека.

В отечественных и зарубежных публикациях опмсап ряд методой оценки индивидуальной реакции опухолей человека на химиопрспараты о системах in vivo и In vitro, включающих изучение как опухолевых клеток, так и опухолевой ткани. В целях прогнозирошшил индивидуальной реакции карцином на цнтостатики рядом авторов используется метод оценки скорости роста трансплантатов опухолей под капсулой почки животных • подкапсульный тест (ПТ) (Bogden A.E.et al., 19861. Несмотря на многочисленные исследования с помощью этого теста, систематических данных о его прогностической роли в отнрше-нии РП и РЖ не получено. В то же время, сами разработчики метода отмечают необходимость изучения его возможностей для опухолей разных типов, так как вряд лн ПТ можно с равным успехом иерользовать для всех • злокачественных новообразований человека.

Таким образом, с одной стороны к настоящему времени накоплен огромный клинический опыт о первичной химиорезн-стентностн значительной части карцином желудка и пищевода, с другой стороны, в ряде фундаментальных работ изучены возможные механизмы химиорезистентности опухолевых клеток, описаны методы для оценки степени чувствительности опухолевой ткани и опухолевых клеток к антпбластнческим воздействиям, что и явилось основанием для выполнения данной работы.

Цель рабртн

Изучение степени адекватности подкапсулыюго теста для выявления случаев первичной химиорезистеитности рака пищевода и рака желудка человека , исследование роли Р-гликопро-тенн-опосредованной множественной лекарственной устойчивости в развитии первичной полихимкорезкстентности этих карцином, а также разработка путей ее преодоления.

)

Задачи работы

1. Определить биологические особенности роста трансплантатов рака пищевода и желудка под капсулой почки иммуно-депрессированных животных.

2. Исследовать реакцию на цитостатикн рака пищевода и рака желудка человека с помощью подкапсульного теста.

3. Разработать критерии хнмнорезистентностЬ рака пищевода и рака желудка к отдельным цитостатикам в подкапсульном тесте и оценить степень адекватности подкапсульного теста для ее выявления.

4. Исследовать роль Р-глнкопротени-опосредованной множественной лекарственной устойчивости о обеспечении первичной химиорезистентиости рака желудка человека.

5. Изучить возможности использования антагониста Р-гли-копротеина - верапамнла для отмены множественной лекарственной устойчивости карцином желудка.

ЙГаучная.црвцзна.

Показано, что опухоли желудка и пищевода человека относятся к медленнорастущим под капсулой почки животных .

Путем клинико-экспериментального анализа совокупности полученных данных обнаружено, что скорость роста трансплантатов РП и РЖ под капсулой почки животных является дополнительным биологическим критерием агрессивности опухолевого процесса у больного.

Выявлено, что чувствительность карцином пищевода и желудка человека к цитостатикам невозможно прогнозировать по исходным клиническим характеристикам опухолевого процесса.

Установлено, что более половины (75%) случаев первичной резистентности РЖ к винкаалкалоидам, а также часть случаев исходной резистентности к платидиаму при росте под капсулой почки обусловлены экспрессией на мембранах опухолевых клеток Р-гликопротеина. В исследованиях ¡n vivo показана возможность отмены Р-гликопротеин-опосредованнои резистентности к вышеупомянутым цитостатикам с помощью антагониста Р-гликопротеина верапамила.

Практическая значимость работы

Доказано, что П? является адекватным лабораторный методой для выявления случаев _первичной химиорезистеит-ностн рака пищевода и рака желудка человека. Основным ограничением для широкого использования ПТ в клинике абдоминальной и пищеводной онкологии является низкая скорость роста примерно половины опухолей пищевода и желудка под капсулой почки животных, что препятствует оценке их хи-мночувстоительности.

Установлено, что скорость роста трансплантатов карцином пищевода и желудка под капсулой почки животных иожет быть использована для уточнения степени распространенности опухолевого процесса у больного.

Клинические испытания ПТ на ограниченном контингенте больных РЖ III ст. свидетельствуют о целесообразности индивидуального подбора адьюаантной химиотерапии для этой группы больных с целью улучшения результатов лечения.

Показана целесообразность клинического испытания вера-памила для отмены первичной резистентности карцином желудка к Р-гликопротеии-зависимым цитрстатикам под контролем лабораторных данных.

Дпробаиия работы

Основные положения диссертации доложены на: XXX конференции молодых ученых МНИОИ Ям.П.А.Герцена в ноябре 1994 г; II Национальном Конгрессе молодых ученых-медиков Украины (Киев, 1994); V Международном Конгрессе по противоопухолевой терапии (Франция, 1995); V Международной Конференции по противоопухолевым исследованиям (Греция, 1995).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 научных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на страницах Печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам, 3-х глав, в которых представлены собственные результаты и их обсуждение, заключения, выводов и списка литературы, содержащего -2-/ отечественных и/Г/иностранных источников." Диссертация содержит /<, таблиц и / /рисунков.

Материалы и методы исследования

Объект исследования

В анализ индивидуальной чувствительности к химиопре-паратам было взято 77 образцов РП и 88 образцов РЖ (операционный материал) первичных больных. Доминантную группу среди, опухолей пищевода составляли плоскоклеточные раки, а среди опухолей желудка - адекокарциномы (Табл.1).

Таблица 1. Гистологические формы опухолей пищевода и желудка, взятых в анализ

Гистологический тип Рак пищевода Рак желудка .

Плоскоклеточный рак 67 (87%) 11(13%)

Аденокарцинома 5(6%) 57 (65%)

Диморфный рак 3 (4%) . 16(18%)

Редкие формы рака 2 (3%) 4 (4%)

В соответствии с величиной первичного опухолевого узла эти опухоли распределились следующим образом: доля опухолей пищевода и желудка, соответствующих символу Т(, составила 1,0% и 6,0% соответственно, Тг - 10,0% и 10,0% соответственно, Тз - 47,0% и 17,0% соответственно, Т4 -42,0% и 67,0% соответственно. То есть, доминантную группу составляли новообразования больных, размер первичного опухолевого узла которых соответствовал символам Т3 и Т4 .

Исследованные злокачественные новообразования пищевода и желудка принадлежали больным с разной стегенью распространенности опухолевого процесса. Степень вовлеченности в процесс узлов у этих больных была следующей: доля опухолей пищевода и желудка, соответствующих символу No , составила 34,0% и 31,0% соответственно, Nj - 14,0% и 18,0% соответственно, N2 - 35,0% и 30,0% соответственно, N3 - 8,0% и 19,0% соответственно, Nx - 9,0% и 2,0% соответственно.

Техника выполнения подкапсульного теста (ПТ)

Образцы опухолевой ткани помещали в охлажденную среду 199 с добавлением пенициллина и стрептомицина (100 ед/мл ) и оставляли на 16-18 часов в холодильнике при 4°С.

В работе использовали мышей-самцов линии СВА массой 20-25 г разводки питомника "Столбовая" АМН РФ. С целью временной иммунодепрессии для предотвращения реакции отторжения трансплантатов всех животных за 1 сутки до эксперимента подвергали тотальному однократному у-облучению в дозе 4,0 Гр. Опухоль освобождали от некротических участков, разрезали на фрагменты объемом 3,0-4,0 мм3 и трансплантировали под капсулы почек мышей. Оперативное вмешательство у животных проводили под гексеналовым наркозом (150 мг/кг внутрибрюшинно). Техника оперативного вмешательства описана ниже. Через вертикальный боковой разрез стенки брюшной полости слева вывихивали почку мыши в операционное поле. Тонким пинцетом приподнимали капсулу почки и острой препаровальной иглой делали в ней надрез длиной примерно 1 мм. Далее тупой препаровальной иглой проталкивали под капсулу почки фрагмент опухоли и отпускали капсулу. Далее с помощью бинокулярного микроскопа МБС-10 измеряли 2 перпендикулярных максимальных лиямгтрл к.чж [пи) тргн1с!1лант;1та. В каждой

контрольной и опытной группе было по 7-10 животных. То есть фрагменты опухоли каждого больного трансплантировали 30-40 животным. На 6-ой день животных умертвляли с помощью эфирного наркоза, вскрывали брюшную полость и вновь измеряли 2 максимальных диаметра каждого трансплантата под капсулой почки [Bogden A.E.et al.,1979; Rofstad E.R.,1989].

Методика введения химиопрепаратов мышам с трансплантированными опухолями желудка и пищевода человека

При исследовании степени хнмиочувствительности трансплантатов карцином человека животным опытных групп вводили цитостатики 4-кратио, внутрибрюшинно, ежедневно, начиная со второго дня после трансплантации, разводя их в физиологическом растворе ( объем введения 0,2 мл). Контрольным животным по той же схеме вводили физиологический раствор. " Препараты использовали в максимально переносимых (для 4-кратного введения) дозах (МПД), которые были близкими к дозам, используемым в ПТ другими авторами [Kikuchi H.et al., 1989; Maenpaa J.et al.,1985]. Курсовая доза для циклофосфана составила 50,0 мг/кг, для мето-трексата - 4,0 мг/кг, для адриабластииа - 4,0 мг/кг, для цисплатина - 1,5-2,0 мг/кг, для доксорубицина - 4,0 мг/кг, для винкристииа - 2,0 мг/кг, для этопозида - 32,0 мг/кг, для блеомицина - 30,0 мг/кг, для 5-фторурацила - 20,0 мг/кг [Parnés S.M. et al.,1989; Stratton J.A.,1987].

В качестве антагониста Р-гликопротеина был использован верапамил (производное фенилалкиламина, "Sigma", США) в концентрациях: 2,3, 4,5, 9,0, 13,5, 22,4 и 31,4 мг/кг. Схема введения верапамила животным аналогична выше-описанной методике введения химиопрепаратов.

Оценка чувствительности опухолей человека к химиотерапии с помощью ПТ

Скорость роста трансплантата оценивали но относительному изменению площади каждого из них за 6 суток:"^:-^^5, где S0 - исходная площадь, a Si - конечная площадь трансплантата. Затем вычисляли относительный средний прирост трансплантатов для каждой группы'"J где Vs- средний

»

относительный прирост трансплантатов (опытных и контрольных), 8оп-исходная площадь п-го трансплантата; -конечная площадь п-го трансплантата; п • количество животных в опытной группе. Если трансплантаты опухолей и опытных группах( при действии цитостатиков) увеличивались в размерах, то эффект цитостатика выражали в процентах торможения роста опытных трансплантатов в сравнении с контрольными по формуле:где X - процент торможения роста . опытных трансплантатов цитостатиком. Если прн действии цитостатиков трансплантаты опухолей опытных групп животных уменьшались в размерах (в сравнении с исходным), то эффект цитостатика выражался в процентах регрессии опытных трансплантатов в сравнении с их исходными размерами по формуле: ^ '100% , где

У - процент регрессии трансплантатов от исходной величины.

Цитологический контроль

Перед выполнением подкапсульного теста осуществляли цитологический контроль опухолевой природы и жизнеспособности тканей, выбранных для трансплантации. На этапах исследования осуществляли анализ цитологических препаратов 6-дневных трансплантатов контрольных и опытных групп животных. Окраску цитологических препаратов производили по методу Паппенгейма [Никитина Н.И. с соавт.,-1975]..

Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием общепринятых методов статистической обработки [Белицкая Е.Я.,1972].

Результаты исследований и их обсуждение

Исследована скорость роста трансплантатов карцином пищевода и желудка под капсулой почки иммунодепрессиро-ванных животных (Рис.1). Прижившимися считали те опухоли, которые в контрольной группе животных за 6 дней увеличивали свой объем не менее чем на 30,0% от исходного. Как видно из рис.1, максимум гистограмм как для карцином пищевода, так и для карцином желудка приходится на диапазон прироста на 30,0-60,0% от исходной величины. Доля неприросших и медлен порасту щах опухолей была высокой н состапила для юрцниом пищевода и желудка 44,0% и

41,0% соответственно. Средняя скорость под капсулой почки карцином пищевода и желудка составила 0.42±0,06 и 0,39±0,11 соответственно, что примерно вдвое ниже, чем, например, для немелкоклеточного рака легкого (0,б4±0,05) [Бильданова Л. А. ,-1993]. Таким образом, карциномы пищевода и желудка следует отнести к медленнорастущим под капсулой почки, что является , препятствием оценки химиочувствительности части из них.

Рнс.1 Гистограмма распределения карцином пищевода и желудка по скорости роста под капсулой почки

35

30

'5 25

§

Е? 20

0

1 16

§

б О

0.3 0,0 0,9 1,2 1,5 1,6 2.1 2,4

Скорость роста трансплантата, отн.од.

□ -РП Ш -РЖ :

Дальнейший анализ будет касаться 42 случаев РП и 49 случаев РЖ, расцененных нами как прижившиеся под капсулой почки.

В соответствии с задачами исследования на первом этапе работы мы попытались ответить на вопрос, можно ли использовать величину скорости роста карцином пищезода и желудк-под капсулой почки в качестве дополнительного критерия агрессивности опухолевого процесса.

Для этого были исследованы корреляции между скоростью роста трансплантатов РП и РЖ под капсулой почки мышей и критериями клинической агрессииности опухолевого процесса.

Рис.2 Прирост <Уб, отн.ед.) под капсулой почкн животных трансплантатов карцином желудка н пищевода больных разных клинических групп.

а»| $0.» ЛЛ «АТ

М,

М»

РП

-РЖ

N - степень распространенности опухолевого процесса Ь/^1 М+ - отсутствие/наличие отдаленных метастазов

Для опухолей пищевода были прослежены прямые достоверные корреляции между скоростью роста пол капсулой почки мышей с одной стороны и степенью вовлеченности в опухолевый процесс регионарных лимфоузлов, а также наличием у больных отдаленных метастазов с другой стороны (Рис.2).

Для карцином желудка при сходном анализе установлена прямая достоверная корреляция между скоростью роста опухолей с одной стороны и наличием у больных отдаленных метастазов с другой стороны. Прослежена и тенденция увеличения средней скорости роста трансплантатов с увеличением степени вовлеченности в опухолевый процесс регионарных лимфоузлов (Рис.2).

Таким образом, средняя скорость роста трансплантатов РП и РЖ в группе контрольных животных может быть использована в качестве дополнительного параметра при оценке степени распространенности опухолевого процесса у больных РЖ и РП.

На следующем этапе работы с помощью ПТ была оценена степень чувствительности РП и РЖ к цитостатнкам , традиционно применяемым в онкологической клинике. В целом проведено 730 тестирований химиочувствительности.

Оказалось, что ' ПТ выявляет значительную меж-опухолсвую гетерогенность в степени чувствительности РП и РЖ к каждому из препаратов - от случаев стимуляции роста опухоли - до ее регрессии.

Ранее при исследовании химиочувствительности немелкоклеточного рака легкого, критерий для деления в ПТ чувствительных и резистентных к цнтостатикам опухолей, составлял 95,0% торможения роста [Сергеева Н.С.,1991]. Условием адекватности критерия является совпадение доли опухолей, резистентных к каждому из препаратов в ПТ и в клинике. Для РЖ и РП мы просчитали эти данные для критерия в 95,0% торможения, 10,0% регрессии, 15,0% регрессии и 20,0% регрессии опухоли. В качестве критерия, разделяющего химиочувствительные и химиорезистентныс опухоли желудка и пищевода в ПТ, мы выбрали границу, равную 15,0% регрессии опухоли. Этот критерий оказался наиболее близким .. клинической химиочувствительности карцином пищевода и желудка.

ПТ подтвердил исходную химиорезистентность значительной части карцином пищевода и желудка (Табл.2). Так,

доля злокачественных опухолей пищевода, резистентных ко всем исследованным цитостатикам, составила 24,0±6,6%, а желудка • 35,0±6,8%; чувствительных не более, чем. к 1 препарату - 16,0±5,7% и 24,0±6,1% соответственно; .к трем и более . -31,0±7,1% и 24,0±6,1% соответственно. То есть, примерно половина опухолей пищевода и желудка была исходно резистентной в ПТ . к большинству использованных цитостатнков.

Таблица 2. Реакция карцином пищевода и желудка на цитостатики в подкапсульном тесте

Доля карцином пищевода (%) , Доля карцином желудка(%)

Резистентны ко всем цитостатикам 24,0±6,6 35,0 ±6,8

Чувствительны только к одному цитостатику 16,0± 5,7 24,0± 6,1

Чувствительны только к двум цитостатикам 29,0 ±7,0 16,0 ±5,2

Чувствительны к трем и более цитостатикам 31,1± 7,1 24,0± 6,1

Карциномы пищевода чаще всего были чувствительными в ПТ к 5-фторурацилу и этомозиду, реже - к метотрексату, платиднаму, блсомишшу и винкристину, и, наиболее редко - к циклофосфану, просиидину и адриабластину (Рис.3).

Рнс.З Средняя эффективность цитостатиков в отношении рака пищевода по данным подкапсульного теста

.Т"

5 фторурацил

3

этопозид

метотрексат

платидиам

бпеомицин

винкристин

"3

циклофосфан ^

проел

адр

10 20 30 40 50 60 70 Доля опухолей, чувствительных к цитостатику, %

Карциномы желудка чаще всего, но данным ИТ, были чувствительны к зтопознду и 5-фторурацилу; реже эффектнее костью обладали платидиам, циклофосфан и метотрексат; и наиболее редко - винкристин и адркабластин (Рис.4).

1

Рис.4 Сравнительная эффективность цитостатиков в отношении рака желудка по данным подкапсульного теста

«Б

этопозид

5~фторурацил

платидиам

4ВВ1

циклофосфан

метотрексат

вк

адриабластин

10 30 40 50 60

Доля опухолей, чувствительных к цитостатику, %

70

о

Было установлено, что по клиническим характеристикам опухолевого процесса невозможно прогнозировать реакцию опухоли на цитостатики, т.к. полихимиорезистентиые (ПХР) и полихимиочувствительные (ПХЧ) в ПТ опухоли как пищевода, так и желудка примерно в равной мере встречались у больных РП и РЖ.

Лишь средняя скорость роста опухолей пищевода, ПХР в ПТ, была несколько выше, чем ПХЧ (0,91±0,18 и 0,61±0,10 соответственно).

Следующий этап работы был посвящен клинической апробации индивидуального подбора химиопрепаратов для адъювантной химиотерапии больных РЖ, которым была определена химиочувстантельность опухолей к цитостатнкам с помощью ПТ.

Данные о больных были разделены на 2 группы . Первая группа включала в себя 11 больных РЖ III стадии, которым была выполнена радикальная операция (у 4 больных - резекция желудка, у 3 - гастрэктомия, у 3 - резекция с лимфаденэк-томией и у 1 - гастрэктомия с лимфаденэктомией). Этим 11 больным проведено 37 курсов химиотерапии с учетом чувствительности опухоли к цитостатнкам.

За время динамического наблюдения - от 6,0 до 64,0 мес, у 73,0% больных (8 из 11) рецидивов и метастазоь не выявлено. Среднее время безрецидивного периода к настоящему моменту для этой группы пациентов составило 24,4±6,3 мес. У 3 (27,0%) больных прогрессирование заболевания было выявлено в сроки 3,0, 4,0. и 21,0 мес. соответственно, что в среднем составило 9,3±8,3 мес.

Вторая группа включала в себя 9 больных РЖ IV ст., у которых операционное вмешательство закончилось пробной лапаротомией. Объектом исследования индивидуальной хи-миочувствительности с помощью ПТ были метастатические лимфоузлы лгбо биоптаты первичной опухоли. 5 из 9 больных была проведена послеоперационная химиотерапия (до 4 курсов) эффективными (по данным ПТ) препаратами. У 3 из них в сроки наблюдения заболевания от 5,0 до 39,0 мес. (в среднем 16,3±9,3 мес.) на фоне химиотерапии наблюдалась стабилизация опухолевого процесса. У 3 (из 6 ) больных после 1 курса химиотерапии от 1,5 до 2,0 мес. (в средние сроки 1,8±0,2 мес.) зарегистрировано дальнейшее прогрессирование процесса. Остальным 3 (из 9 ) больным провели адъювантную химиотерапию стандартными схемами ввиду того, что опухоли этих пациентов оказались полихи миорезистептными по данным ПТ. У всех больных в процессе адъювантной химиотерапии (от 1 до 3 курсов) была установлена дальнейшая генерализация процесса (о средние сроки 7,0±0,5 мес.).

Небольшое число наблюдений в первой группе больных, которым проводили адъювантную химиотерапию после ради-

калыюй операции с учетом оикобиограммы, не позволяет делать категорические выводы. Однако, у тех пациентов, которым протшюопухолевая терапия проводилась по чувствительности с помощью ПТ, рецидив заболевания диагностируется в более поздние сроки. Тем не менее для подтверждения этих данных необходимо дальнейшее наблюдение за больными и проведение рандомизированных исследований. Адъювант-ная химиотерапия больных раком желудка IV стадии с учетом индивидуальной чувствительности вызвала стабилизацию процесса у 3 из 6, что побуждает к проведению дальнейших изысканий в этом направлении, так как известно, что у больных раком желудка средняя продолжительность, жизни при наличии метастазов в отдаленные органы и ткани не превышает 6-8 месяцев.

Исключение неэффективных цитостатиков из схем лечения является лишь первым шагом в разработке технологии индивидуального прогнозирования. Следующим же этапом должно стать исследование механизмов химиорезистептности карцином человека, в частности, таких как феномен Р-гликопро-теин-опосредованной сочетанной резистентности клеток к вин-каалкалоидам и антрациклиновым антибиотикам.

Одной из задач нашей работы было выяснение того, заинтересован ли Р-гликопротеин (известный как переносчик вин-каалкалоидов и антрациклиновых антибиотиков из опухолевых клеток in vitro в модельных системах) в первичной химиоре-зистентности РЖ, а также можно ли с помощно блокатора кальциевых каналов верапамила - антагониста Р-гликопротеи-на отменить эту резистентность к химиопрепаратам.

На первом этапе исследования было показано, что сам ве-рапамил в терапевтически эквивалентных дозах существенно влияет на скорость роста опухолей желудка под капсулой почки у животных (Рис.5).

Так, при концентрациях от 2,3 до 4,5 мг/кг верапамил тормозил рост опухоли, в концентрациях от 4,5 до 13,5 мг/кг наблюдалось уменьшение этого эффекта, а при дальнейшем увеличении концентрации верапамила вновь нарастало торможение роста опухоли (Рис.5).

Рис.5 Усредненная кривая доза - эффект для влияния верапамила на рост трансплантатов карцином человека под капсулой почки животных

доза переломила,иг/кг

То есть, в целом зависимость доза • эффект для верапамила носила синусоидный характер, а амплитуда синусоиды для каждой опухоли была индивидуальной. Так, максимальный положительный эффект верапамила выражался в регрессии опухолей, а максимальный отрицательный - в стимуляции их роста.

На втором этапе работы для 20 опухолей желудка было исследовано влияние верапамила на антибластический эффект винкрнстина (Рис.б). Верапамнл вводили животным внутри-брюшинно, начиная со второго дня после транснлантанин опухоли за 0,5 часа до введения цитостатика.

Рис.6 Влияние верапамила в разных дозах на степень чувствительности к винкристину уме-реннодифференцированной аденокарциномы желудка

доза верапамила,мг/кг

I - эффект верапамила

П - ожидаемый совместный эффект верапамила и

винкристина Ш - реальный совместный эффект верапамила и винкристина

Оказалось, что в дозах от 9,0 до 13,5 мг/кг верапамил усиливал актибластический эффект винкристина для 9 (из 20) опухолей. То есть реальный эффект сочетания верапамила и винкристина был существенно выше ожидаемого. Дополнительный противоопухолевый эффект (т.е. разница между реальным и ожидаемым эффектами сочетания верапамила с винкристнном) был достоверным, строго зависел от концентрации верапамила и был максимальным для концентрации верапамила - от 9,0 до 13,5 мг/кг (Рис.7).

Рис.7 Зависимость величины сверхаддитивного эффекта сочетания верапамнла с винкри-стином от дозы верапамила

В остальных 11 (нз 20) случаях усилении аффекта вннкристина под влиянием верапамнла не установлено: эффект сочетания был аддитивным.

Нами проанализированы условия, при которых происходило усиление эффективности винкристина под воздействием верапамнла (Табл.3).

Таблица 3. Условия отмены резистентности опухоли к винкристнну верапамилом.

Препараты Реакция опухолей на препараты в ПТ О'бщее количество случаев Количество случаев усиления эффекта винкристина верапамилом

Винкристии Верапамил оп.чувствит. оп.чувствит. 3 .0

Винкристии Верапамил оп.чувствит. оп.рсзист. 3 0

Винкристии Верапамил оп.резист.. оп.чувствит. 2 0

Винкристии Верапамил оп.резист. оп.резист. 12 9

Общее количество случаев: 20

Оказалось, что если оба препарата (винкристии и верапа-мил) были эффективны в отношении подавления роста опухоли, т.е. вызывали ее регрессию, то эффект их совместного применения был аддитивным, Не было усилеиия и в том случае, когда хотя бы одни из препаратов (верапамил или винкристии) был эффективен. И лишь тогда, когда и верапамил и винкристии были неэффективны (т.е. наблюдалась резистентность опухоли к обоим препаратам), в 9 из 12 случаев (т.е. в 75,0%) наблюдалась отмена резистентности опухоли к винкристину с помощью верапамила. Если предположить, что эффект верапамила является неспецифическим ( обуславливается, например, вазодилатанией, и, как следствие, повышением концентрации цитостатиков в опухолях), то, в таком случае, усиления эффекта винкристина можно было ожидать для всех, а не для части опухолей при пре.чедикации животных верапамилом. Это служит аргументом в пользу специфичности эффекта верапамила. Другим доказательством специфичности отмены резистентности опухоли к винкристину с

помощью, иерапамнла является исследование влияния верапа-мила на эффективность разных цитостатиков - тех, в резистентности к которым, по данным литературы, Р-гликопро* теин заинтересован (вннкрнстин, платндпа.м) к не заинтересован (5-фторурацил, этопозид) . Результаты такого исследования представлены а табЛ.4.

Учитывая данные табл.3, все данные разделили на 2 категории: 1) случаи резистентности опухоли к верапамилу к исследуемому цнтостатнку; 2) случаи чувствительности опухоли к верапамилу или исследуемому цитостатику.

Таблица 4. Влияние иерапамила на противоопухолевую активность цитостатиков в под-капсулыюм тесте

Препарат Общее количество тестирований Кол-во случаев усиления эфг фекта цито-статика вера-памилом/кол-во случаев чувствительности к цитостатику или верапамилу Кол-во отмен резистентности /кол-во случаев резистентности к цитостатику и верапамилу

Винкристин 20 0/8 9/12

Платидиам 5 0/1 2/4

Другие препараты (5-фу,этоп) 12 0/10 0/2

Всего: 37 0/19 11/18

Отмену резистентности наблюдали лишь в нерпой группе опухолей: к винкрнстину в 9 из 12 случаев н к млатидиаму - в

2 из 4 случаев. В то же время мы не наблюдали ни одного случая отмены резистентности верапамилом к 5-фторурацилу и этопоэиду. Не наблюдали и ни одного случая (ил 19) усиления эффекта иитостатнкоп под влиянием верапамила тогда, когда опухоли были чувствительны либо к верапамнлу, либо к цитостатнку.

Следовательно, отмену резистентности рака желудка к винкристину при помощи верапамила следует считать специфической, связанной с блокированием функционирования Р-гликопротеина.

Таким образом, в настоящей работе исследованы возможности использования ПТ для индивидуального прогнозирования химиочувствитслыюсти РП и РЖ. Получены доказательства биологической адекватности теста для выявления случаев химиорезистентности опухолей пищевода и желудка человека. Установлено, что более половины случаев первичной резистентности РЖ к винкаалкалондам, а также часть случаев исходной резистентности к платидиаму, обусловлены экспрессией в опухолевых клетках Р-гликопротеина. В опытах in vivo гс помощью антагониста Р-гликопротенна блокатора кальциевых каналов верапамила удалось добиться специфической отмены этой резистентности.

Вмдщдм

1. Скорость роста карцшюм пищевода и желудка человека под капсулой почки животных отражает биологическую агрессивность опухолевого процесса и может быть использована в качестве дополнительного критерия при оценке степени его распространенности у больных. .

2. Подкапсульный тест является адекватным для выявления исходной резистентности карцином желудка и пищевода к цнтостатикам. Основным ограничением методики является низкая скорость роста этих опухолей у животных.

3. Регрессия трансплантатов опухолей желудка и пищевода человека при воздействии химиопрепаратов менее, чем на 15,0% отражает их химиорезистектность, а более чем иа 15,0% • их хнмиочувствительность.

4. По данным подкапсульного теста среди исследованных цитостагиков наиболее эффективными при раке пищевода оказался 5-фторурацил, а при раке желудка - 5-фторурацил и этопозид; соответственно наименее эффективными при раке пищевода - цнклофосфап, адриабластин, проспидин и блеомицин, а при раке желудка - циклофосфаи, адриабластин и винкристин.

5. Более половины (75%) случаев исходной резистентности карцином желудка к вннкаалкалоидам .и антрациклиновым антибиотикам' при росте под капсулой почки обусловлены экспрессией в мембранах опухолевых клеток Р-гликопротеина.

6. В исследованиях In vivo показана принципиальная возможность отмены резистентности рака желудка к винкаалкалоидам и антрациклиновым антибиотикам, а также к платидиаму с помощью антагониста Р-гликопротеина блокатора кальциевых каналов верапамкла.

Список публикаций по теме диссертации

1. Storozenko I.V., Skotnikova O.I., Guljak N.S. et al. The influence of verapamil on human esophagus carcinomas transplants growth in subrenal capsule assay. XVI Int. Cancer Congress, New Delhi, India, p.223,1994.

2. Storozenko I.V., Skotnikova O.I., Sergeeva N.S. et al. The influence of verapamil (VER) - antagonist P-glycoprotein (P-GL) on growth and sensitivity to vincristin (VCR) of solid human carcinomas transplants subrenal capsule assay. Vth Int. Congr. on Anti-Cancer Chemotherapy, Paris, France, p.202, 1995.

3. Storozenko I.V., Skotnikova O.I., Sergeeva N.S. et al. The influence of verapamil on the growth and drug sensitivity of human carcinoma transplants in subrenal capsule assay. Vth Int. Conf. of Anticancer Research, Corfu, Greece, V.15, N 5A, p.lG47, 1995.

4. Сторожеико II.В., Скотннкова О.И., Сергеева II.С. и др. Подкапсульиый тест в выявлении первичной резистентности опухолей пищевода человека к цнтостатикам. Эксиер. Онкол., т.16, N 4-6, стр.461-463, 1994.

5. Сторожеико И.В., Скотннкова О.И., Мамонтов А.С. Прогностическое значение подкапсульного теста о выявлении первичной химнорезистентностн опухолей пищевода человека. В сб,"Прогнозирование в онкологии" МНИОИ им.П.А.Герцеиа, стр.79-83, 1994.

6. Сторожеико И.Р. Влияние веранамила на рост трансплантатоп карцином пищевода человека под капсулой ночки животных. В сб. тезисов II Нац. Конгр. молодых ученых-медиков Украины, Киев, стр.5, 1994.

7. Сторожеико И.В., Скотиикова О.И., Сергеева Н.С. и др. Изучение роли глутатиона и Р-гликопротеина в первичной химнорезистентностн некоторых опухолей человека. В сб. тезисов IV съезда онкологов России, стр.228-229, 1495.

8. Сторожеико И.В., Сергеева Н.С., Чиссов В.И. и др. Реакция на цнтостатики карцином желудка человека при росте под капсулой почки животных. Экснер. Онкол., N 2, стр.166-169, 1996.

9. Сторожеико И.В., Сергеева Н.С.; Чиссов В.И. и др. Влияние верапамила на рост и чувствительность к винкристину опухолей человека, трансплантированных под капсулу ночки. БЭБМ, N 6, стр.681-683, 1996.

10. Сторожеико И.В., Сергеева Н.С., Чиссов В.И. и др. Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) как один из возможных механизмов клинической химнорезистентностн опухолей человека. Рос. Онкол. журнал, N 3, стр.51-55, 1996.

11. Вашакмадзе Л.А., Збарская И.И., Алешкина Т.Н., Сторожеико И.В. Предварительные результаты адъювантнон химиотерапии рака желудка с учетом индивидуальной чувствительности опухоли к цнтостатикам. В сб. тезисов конф, МНИОИ им.П.А.Герцена, Москва, стр.56-57, 1996.

_Участок множительное техники ОНЦ РАМН_

Подп. к печати 7 O^z Заказ \ :jL ' Тираж ./J 00 3Ki