Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Лабораторная методология и новые методы оценки иммунного статуса человека примассовых обследованиях и в клинической практике

В 1 о 91

иинистерство здравоохранения российской федерации

институт ншюнологии

На правах рукописи

СПИДОВ Парат Эиявдиновнч

лабораторная ИЕТОДОПОГИЯ и новые методы оценки шннного стптиса человека при пасших обследованиях и в клиническоп практике.

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москвя -1992 г.

Рабата выполнена в Институте имиуни/шгии Минздрава РФ

Научный консультант - доктор медицинских наук, профессор Б.В.Шшегнн

Официальные оппоненты - доктор, иеднцинских наук,

профессор Л.П.Алексеев.

доктор медицинских наук В.Ф.Семенков,

доктор медицинских наук Р.М.Рузнбакеев.

Ведуцая организации - Научно-исследовательский институт.

вакцин и сывороток на.И.И.Мечникова РАМН

Защита состоится "^/"^£-6^.41992 г. в_ .часов на заседании специализированного Совета Л 074.09.01 ъ по заците диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте иииунологии Минздрава РО ( 115478, Москва, Кавирскос воссе,24,кор.2 ). С диссертацией ыошо ознакомиться в библиотеке Института иммунологии Минздрава РО.

Пвтореоират разослан "г.

Учений секретарь специализированного Совета, /

Кохто> биологических наук й. В. Колобов

fiKTUA/QjHOCTb ПРОБЛЕМЫ. В настоящее врскя оценка икиунного статуса населения приобрела качественна новуи ступень своего развития, i в связи с резко обостривнейся экологической ситуацией в наяей стране. Применение химических средств загоны растений в сельском хозяйстве, распространение препаратов битовой хккии, интенсификация про-шлзлемого прогаводства обуславг.шэт пфокий контакт человека с ксенобиотиками антропогешюго происхогдамя. Этот контакт сопрозогдается ростом заболеваемости населения, йюгочислепнжи исследованиями показан юмуиотропный характер воздействия ксенобиотиков органической и неоргашеской природы, кндутфуг^их иниуннул недостаточность (ИН) и вторичные югаунодесмртщз состояния (НДС) гг,й до стадии кляшчесютй манифестации патологии (Рузнбакеев Р.Н.1587 г., Сидоренко Г.Н.и др. 1Э8Э г..Esa fi.H.et al.1388, Dean H. et al.1392. Popova E.et al.1983). В подобной ситуации особенно остро встала проблема проведения массовых обследован^ состоять здоровья населения с цэльа оценки влияния siro-логических. производстве!пых, а такзе социально-битовых и региональных факторов на развитие патолегга. В зтоа комплексе задач лидируг»еп по-лозение занимает изучение состояния иммунной' система как совокупности бистро пролиферирусда и д^гсренцируЕЗИхся меток мезенхгсального происхоадеиия, высокочувствнтелыох к воздействии экзо- и эндогеннчх Факторов. Появление экологически- и про^ессио'.илыю-обусловлешгай Ш1 осознание того факта. что крупная систсил язяяется пнятонентсм более Ифокой chctoííh гоиеостаза и адаптогенеза организм к сползи условиям шилось основой для фориироваси нового наупго-практического направления - эпидемиологии HI и ИДС под влиянием экзо- и эндогенных факторов среди групп населения, обьедипегаых какин-либо признаком, будь то профессиональная или этническая пркнадлежость, или зкапого-териториаль-ное распределение. Основой проведения кассовых иммунологических обсле-дбваний является отработанна лабораторная методология, отвечлщая критериям у№!$ицированности. стандартизированностн, достаточной wtjnp-ьативности, доступности используемых приборов и реагентов и простоты исполнения лабораторных тестов. Семидесятое годч назего столетия o^in неновались разработкой и гирогам использованием в клинической hjvijctkhp комплекса лабораторных кетодов оцеиш количества и ^mmrwiMi'ini состояли IÍKH (тесты рпзеткообразогания, РБТ/I га нагаяиппяытеп «нгп

- t -

геш и № III', оценка субпопуляций Т-лижроцитов-хелперов и супрессоров, определение классов и субклассов сывороточных иммуноглобулинов и др.). Несколько пале методический арсенал клмической иммунологии пополнился высокоэффективными методами тестирования клеточного фенотипа с использованием биотехнологических реагентов (МАТ), разработкой наборов для твердофазного а также РИА, использованием иммунохимических систем и других методов и аппаратуры. Такое лабораторно-методическое оснащение способствовало развитию как фундаментальных, так и прикладных исследований в области клинической иммунологии. Имевшиеся в распоряжении исследователей схемы развернутой оценки иммунного статуса, рекомендованные Р.В.Петровым с соавт.,1984 г., экспертами ВОЗ, 1983 г., R.Hong, 198$ и др. имели главную цель - оценку юмуююго статуса человека в условиях специализированного стационара. Эти схемы имели большую научно-щщаическую значимость, с их использованием разработаны основные принципы иммунодиагностики и иммунокорригирущей терапии, подтвердившие i.bob эффективность в многочисленных исследованиях (Авербах М.И.и др. 1УВ6г, Ананченко В.Г.и др.1987г. Белокриницкий Д.В. и др. 1989г., Bejituich Z. et al.1988).

Однако, использование подобных лабораторных методов и схем в условиях массовых исследований встречало ряд трудностей, обусловленных спецификой выполнения этих работ, а также критериями, предъявляемыми к ним при их щш, тческой реализации.

8 CBU3H С ВЦШ'ЖШШШ ЦКЛЬС НАСТОВД РПБОТЫ ЯВИЛОСЬ: -ijiHliHKdKiiii и адаптация к условиям массовых обследований на основе тестов 1 уривня оценки иммунного статуса схемы первичного лаборатор-но-иммунилогического обследования населения;

' -разработка и апробация при массовых обследованиях и н клинической !1(кжтике комплекса новых микрометодов оценки диагонального состояния ИКК и создании усивириенствовдюгой схемы оцет« иммунного статуса населения;

-апробация усовершенствованной схемы в условиях массовых обследова ний и оценка, на основе этой методологии, характера изменений иммунного статуса под влиянием хлор- и фопфорорганических соединений, содержащих в своем состав« диоксин,

в соответствии с поставлежои целью решись следущие конкретнее задачи:

1. На основе тестов I цровня оценки иммушгого статуса человека уни-{ицировать и адаптировать к условиям массовых обследоваюй схему первичного лабораторно-иммунологического обследования ¡иселеюм.

2. Разработать и апробировать в условиях массовых обследований и в клинической практике новые кикрометоды оценки иммунного статуса:

а) капиллярный микрометод количественного определения иммуноглобулинов в биологических средах,

б) спектрофотометрический микрометод определения активности киело-пероксидазы (МЯО) в фагоцитах,

в) спектрофотометрическкй микроаетод определения адгезии лейкоцитов на поверхность пластика.

г) капиллярный микрометод оценки хемотаксиса лейкоцитов,

д) капиллярный микрометод оценки активности естественных киллеров (ЕК).

е) способ оценки РБТЛ ih алло-АГ клеток Ragi и тестирования в этой системе продукции цитошгоз.

3. Разработать на основе унифицированной лабораторной методологии и новых кикрометодор оценки гаэцнного статуса усоверзенствованнцз схе:г| лзборатороно-кумунологического обследования населения.

4. Плроб'.фовать усозерзенствованнув схему лаборатороно-иммунологического обследования нлеелиш на контингенте рабочих химического производства.

5. Оценить характер изменений иммунного статуса рабочих, контакта ругаих в процессе производства с хлор- и фосфорорганическики соедине ниями, содсргацем в своем составе диоксин, и проанализировать эти то менения во взаимосвязи с клиническим состоянием здоровья обследованных лиц.

в результате проведению! исследовании получеш следущие результаты, состпв/июдо: tlfi'p0píí1 новизну рпротч.

С использованием и га оггаве тестов I чровня оценки rowjmioro ста nica человека унифицирована и адлптирпглна к условия* массовых оболе -дований схема лабораторий методологии первичного иммччолотчпекпгр обследования iw.ieima, проведшая анрпГицип при «асгопчх т«пп1»яоги ческих обследованиях.

Разработан капиллярный кикрометод количественного определения иммуноглобулинов ь биологических средах - "Иммунокап", имемлй достаточную степень стандарпиированности, чувствительности, простоты исполнения, а такхе ьизможшоь заготовки готовых к работе партий капилляров, и апробированный и условиях иассовах обследований.

Разработан инглрофотометрический ыикрометод определения активности Ш в фагоцитах. аиробировашшй в условиях кассовых обследований и в клинической щышике. При этом показано, что производствеший контакт рабочих (елкош ¡.иго завода по производству химических средств защиты растений с хлир и фосфорорганичешши соединениями, содереавда в своем составе дитя им, сопровоадается угнетением активности этого фермента (цеха 1 и ?.) С использованием этого микрометода показана существенная ипгибиция активности №10 при первичных НДС ( ХГБ, селективный 1вП-дефицит, 111 аммаглобулинемия ), а такхе тесная взаимосвязь процессов экскреырной дегрануляции фагоцитов и хекилшинесцентного ответа на стимулы три различной природы в эксперименте.

Разработан I псктрофотоыетрический микрометод определения адгезии лейкоцитов на шшерхность пластика, апробированный при массовых обследованиях и в клинической практике. Показано, что условия производства завода "Уралхимнласт", г.Н.Тагил в 19,3/С слувев индуцируют появление в крови рабочих факторов, блокирдачих адгезию тест-клеток, а в 9,3% случаев факшров. усиливащих адгезии тест-клеток 1н пластик. С использованием ¿того микрометода впервые показана специфическая сенсибилизации мйкикигои III0 1 инфмрфовапных лиц, вырахавдаяся в модуля -ции адгеыш лих клепок ш пял пи; в присутствии синтетических пептидных копий пыг.иктшжьрнативних, иммунпдоминантных районов оболоче<ошх белков ш'41 н вируса НЮ I.

Разработал капиллярный микрометод оценки хемотаксиса лейкоцитов по отновенш и I |).адиы!ту хемоаттракталта (1Ми>), ¿шробировлшшй при массовых ибыц'Доьаниих и н клинической практике. Показано, что усливия производства ¿анода "Цшхимпласт" в 4/.У7. случаев индуцируит ноавле-ниев крови оПеледоксниш рабочих (растворимых факторов, ингиоируицих хемотаксис тест-кпемк.

С иишльзов.шием пою нш^кшитод.-! впервые показана ингибищы хемотаксиса лейкоцитов Ши 1 ии]ицироьаншх лиц в |цшсут<:тьии синтети

ческкх пептидных копий высококонсерватиших, иммунодоминаптных районов оболочечных белков др4! и др!20 вируса НИМ.

Разработан каппилярный микрогетод оценки активности ЕК, апробированный в клинической практике при изучении эсфс.,шшг)сти виростат-ческой терапии при простои герпесе и оценке ЕК-активнопти у болыих раком толстой кигки. При этой использовался ранее разработанный ноаи принцип серийных клеточных разведений, как подход к диагностике качественного или количественного дефицита ЕК-активности.

Разработаз способ оценки РБТ/1 на алло-ЛГ клеток Йад1 в сметанной культуре. с тестированием продукции вахнейгях цитоккнов - ИЛ-1. ИЛ-2, а такге иумуноглсбулннов классов М.С.Й.

С использованием новых микрокодов оценки иммунного статуса, а такзе принципов лабораторной методологии первичного иммунологического обследования разработана усовергенствоваь.ля схема лабораторно-юэуно-логического обследования населения. Преимущества этой схемы, по срав- -нения с первой, состоят з тоа, что ош вкпнает_в себя, по^ио коль чсствеюмх методов, достаточно Ефогай 1йбор <&нкционалыых тсстсв, представляю« ценнуз кн^оркащп) о состоянии 1лК. Схеха апробирован гтри кассовых обследованиях контгсгента р^бо'ся Целшвг.кого завода по протаводству химических средств зазгга растений.

Показано что производственный контакт с хлор- и ооссорорганческиы! соединениями, содерга^ми в своем составе диоксин, сопровоздаетса комплексны!:и изуенениягз! колнчестветюго и функционального состояли конкретных элементов Т-звена, В-звена геадюгого статуса, фагоцитарной системы, а такяе местного иммунитета.

ОСНОВ!ШЕ ПОЛОЖЕНИЯ. ВШОСШЕ НП ЗАЦШ.

1. Из основе тестоз I уровня оценки крупного статуса угафадкшан-на.и адаптиргвгюа к условия! кассовых обследортний схеаа лабораторной методологии первичного иммунологического обследования населен^, про-седвая апробации при проведении гег^оэпидееиологических исследований в различных регионах страна.

2. Разработан коаглекс новых ккфоаетодоз оценка камунного статуса населения, позволят^ слоить: количество -ой^оглобиязгаз в Сйопопь чесгак средах - гагсшляртый всфоаетод "Инкунокап"; ©цкаяквялкз параметры фагоцитарной системы - спектрофотокстричсские шофонетоди оп-

- Б -

ределенш активности НПО и адгезии лейкоцитов на поверхность пластика, кепиллярный юафоцетод оцага! хсаотакснса лейкоцитоз", состп'даия шле-12У ! .теигшшсЛ щгготскскчноста - капиллярный шфоаетод оценки ЕК-штюнооП!; фцнкцкснашаа гара^этря НКК - РЕТЛ на аьгпо-АГ или гок

3. Разрайогагиэ ШфСьзтоди проаяи априба^а прп иассових иадноло-п:!;ашй о&спедоваюта и в кяшическсЛ практике и )а этом ооюваша рексыендртся к практическое использования лабораториям клапгша^Л иэдртяогин ш пестах.

4. С ксгшьзованкеи новых кгфоастодов оценки кягупнсто статуса , а та^иги пршвдатаз лабораторией потодялзпгл псрш?вюго нгзунопгкческсго обспедования разработана усовергеиствсзашш схсш лабораторнэ-ищр:о-логаческаго обсяздсздниа тсет.агя, ¡жх^э правда. _ва .ю сраьш,.: -со схеиоА ¡1ьрв1Мюго и 0ослгдоза;са, превдг всего, в тем отшгек'Л, что ош позволяет подарить достаточно сфойй егкиггх ЙГ.кцнонашшх пдра*°тров Ш. наряду с бальпи набараа количестББзаиос показателей.

5. Змгкпзность усовсрсенствоинвюЛ схекл лабаратсрмсилаукшШгк-чзского обследования шсыжюы пр-тверздена про сЗследовлЕ« когггаь гента рабочих, контактируем« в ;тцессс прокшадства с хлор- и Слсфо-роргааччзскжи сосулсь.г^;, содерзази в сиоеа состасе днлски. Показано. что изменения в »гадиоа статусе рабочих 1асаитсз, ка;с количества вш: характеристик Ш1К ( Е-РОК. М-РСК, СДЗ), СД4». С£0» т&щ-пи). так и сукамишыюго состояния ИКК ( РБТЛ из Й'П, имитиз сыворо-то'вих блоюфЦЕ^и Факторов, .уровень ¡..аороточшх каэдюпгабфзшов ), а та; и у ссстсаше местна! о кхадгитета.

ютшчкш жчижть иилушшх результатов.

, Разработанный комплекс новых ижроаетодов оценен ^гааугаюго статуса рекомендуется дда работы в условиях лабораторий мтмеской июсуноло-гии страны, а также при массовых криологических обследованиях. Использование новых микроыетодив позволяет нолуать ценнцв юдориацив о состояв В-звена иммунитета ( "Иммунокап" ), фагарпарной систеки (микрометоды тестирования ИШ-активности, адгезии из по°ерхлс-ть пластика, хемиъжежя ), системы естественной цитотоксичюсти ' капиллярный миК|ЮМ';тод оценки ЕК активнисти ), а т.или функционального

- 7 -

состояния ИКК ( РБТЛ на алло fiT клеток Rag i ).

Рекомендуется к практичегкокц использозлга усовершенствованная схеяа оценки икиушого статуса, прогедсля апробация при кассовых обследованиях. Эта cxeta позволяет существенно увелгагъ возвогностн исследо'иння гсседшюй системы, вклстия параметры фушясгаияьного состояния ККК.

Янздодфозашпя лабораторная кетодолегиа первичного 13шунолопь ческого обследования нлзла свое отразит,re в кетодических рскокендацизх "Оцеша юсг^шого статуса человека при массовых обследовазих" И. 1331г. 50 с.

Принцип серкйчых клеточних разведешй представлен в кгтодичссгся рекомендациях "Расчет дозы э:геогенкого интерферона, стгаулир'тцей içi-тотокснческув активность естестьзшш клеток-кнллергз" й. 1986г. 7 с.

По результата* птоведеюмх исследований получены авторегие cbi^ö-тельства ib изобретения:

1. "Способ кгдаренцчапьной диагностики неспецифнческого нзгенного колита и бактериальной длзент . Í¡C ¡1 1163206. загпа Я 3597019, приоритет 25 пая 1033 г. fbin;;'j*. Саздоз Ü.3., Ковальчук Л.В., Стеной О..Чередеев ft.ll.. Лоренская И. Д.

2."Спосг5 определена ¡чг^уноглобусягов в нтлопгюаш епдкгтях "ItojiiuiKn", Í.C II 1312401, заявка N 4034329, приоритет 9 декабря 19B5r. íiSTopn: Петров P.D., Лебедев К.Я., Садов 'J.3., Бозун Е.П.

3."Состаз для определения юиушггобулзюз в биолоппеских гид-костях", fíC !1 1393079. заявка H Í035165, приоритет 5 марта lSGur. Авторы: Лебедев К.п.,Сгидов ÎÎ.3.

4."Способ определения адгез;я лейкоцитов",fïC H 1697008, заявка H 47G9G01,приоритет 9 ноября 1909г. Пзтсры: Саедоз М.З., Paierai Б.В.

„ 5."Способ определения хемотаксиса лейклрггев", fiC H 17128Ё0, заявка N 4765375. приоритет 30 ноября 1989г. Пзтсры: Саидов М.З., fbBîerrai Б.В. .

6."Способ определения гетгагасти киялороз", заязка й <841665, приоритет 15 пат ISSOr. Пзторн: Ьгг,оз У.З., Ihïïrn Б.В.. ftcœcsa П.F.

7."Способ определена йглстпсЛ трапс^срк^п .тгг^ецггеэ", з.тгг.та ;¡ 4"3!3Г)9, га:тятит 12 19S0 г. (Ьтора: Сггасз 13.. Кдагксз В.В.

'•йрнсуссз П.Д., 6.3.

- в -

МРОБАДО ДИССЕРТАЦИИ.

Результаты диссертационной работы представлены в 23 пасших публи-кацкл п доложены на конферекдак и симпозиумах различного уровна: н) Республиканской научной конферендеи "Иммунодефицита и ИЛ-систеиа", Таюяэгг, 1389 г.: на Бисовоной научной конференции "Проблемы мониторинга за здоровьем населенна промыаленшх городов" . Ангарск, 1989 г.; на X научной конференции "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при раздочных (диалогических и патологических состояниях", Челябинск, 1990 г.; на симпозиуме с международен* участием "Система мононуклеар-них фагоцитов в норме и при патологических состояниях". Новосибирск. 1990 г.; на I Всесопзной нзучно-практической конференции "Профилактика и борьба со СИНД в СССР", Ленинград, 1390 г.; на Всесовзной кшйюрен-"Экологические аспекты иммунопатологических состо^шй , Алма-Ата, 1990 г.; на 1 Республиканском съезде иммунологов и аллергологов Йзбе-юштана. Самарканд, 1991 г.; на Регпубликанской конференции "Экология и 1зсадшет",Н.Новпгзд. 1990 г., а такое на 6 Ймдунарсдпоа конгрессе по СИНД. СаНранцкско, СЮ, 1390 г. и на 14 Неадународном кшгрессе по аллергологии -и юаакческой иммунологии, Киото, 5Ьюнкя, 1991 г.

Рабата выполнена в рамках Всес туюй програшы № "Изучение иммунного статуса населения" на 1986-^90 гг.. тех}ьпеское задание на НИР N 00889.

оьъен и си>ушрп диссютйции.

Диссерт.щия _1ипнсана в монографическом стиле м состоит из введяиа. 3 'истей, 11 глав, заключения и выводов. Материал изложен на страниц маииимиси, вида оп» его И таблиц и ¿й рисунков. Список юстированной литературы вклшчает отечественных и иностранна источников.

' соди'иш: р№)0ты

На рис. 1 представлен ьбоивлиц.1Я схема унифицированной лабораторной методологии первичного иммунплш'ического обследования населения. Зт;1 методология намла свое отрахе.чие в 1ших методических рекомендациях "Оценка иммунного статуса человека при массовых оЬследоапиях' 11.1331 г.

'rtllFMKJWOUMtM

Ol ЛИЦ

4

f-POK

С «ЦТ

411t Oft* *M« «РОЦИТО*

sääj1u1w -^zs .

--- sr't' —

3>e

метод Uiuvtim

ЭйЕ

о о о о о о О•00 оо

О О о о 0 0 ~i»«ir.Uc PCR /0 0 оо ос^

/ОООООО// /О ООО о о/у

ЦжММКИ

ОТММШИ«

й

Фи__

ОООООО О О О О оо О О -

KAtT04Kkl6

ОС* ДО*

. и»гммчмые тесгы с теоФншином, ««ИМ»1О<0И

т-итивияом, мтолидом

«гсп«»)** («июцхто»

с чат «регтто»

>»J»ltltNH»S КАШ*'

цгтсмкат ат-1 0кт-4,лт-»е. оподедм*« »ктиости МЛО, НСТ-гест

Рису!. Схемд унифицированной методологии первичного иммунологического ОБСледовАния (методические рекомендАции института иммунологии М5 рр "Оценка иммунного статуса чею&ехд при массовых обслеаойаниях"!

Как видно из рис.1, схема базируется на тестах I уровня, рекомендованные Р.В.Пе.ровыы с сгуат. 1984 г. и прещезначенные, прегде всего, для клинической практики. Адаптация указанных т°стоз к •тловгаэ кассовых обследований проведена в лаборатории клинической кзднологга Института иммунологии. Отличительной особенностьв этой схены является использование .для работы небольших обьенов капиллярной крови (до 1 ил), получений из пальца, в т.ч. и в экспедиционных условиях. Необходимо отметить, что использование капиллярной крови для изучения параметров иммунного статуса предлояено в начале 60-х годов и в последуэ-цих исследованиях ( Лебедев К.П.и др.198?г.. Семенова E.H.и др.1981г.. Сьрябин (1.С.и др.1987 г.)

Предварительные сравнительные исследования параметров кэднного статуса в капиллярной и венозной крови на здоровых донорах, проведен-нье в 1ивей лаборатории. показали их практически идентичность и, таким образом, капиллярная кровь стала основннм объектом исследования С Пинегин Б.й.и др.1989 г.).

Использование указанной схекы позволяет оперативно и с достаточной приизвпдительнэстъп полуать количественные характеристик Ш я и»

растворимых продуктов. Они вкотвдт в себя: количество лейкоцитов и д»фо1>Ш1В, уровень Е-РОК (Т-лимфоцитов), М-РОК (sIßK-несута В-ли«ро-4HTlj), ¿АС-РОК (С-З* В-лимфоцитов, а также незначительная часть акти-Юфованшх Т-лимфоцитов), щгрузочше *есты с теофшином, левамизалом и др. иммунотрсгашми прииратами и реакции Е-РОК. уровень поглотитель-joü способности нейтрофилов в тесте с ь-елани формальдегид) мм латексом ((%), актир"ость миелопероксидазы (ЙПО) в спектрофотометр»'.jckom ккк-рометоде. HCT-тест на предметном стекле, а такве количественное содержание сывороточных иммуноглобулинов основных классов (М.б.Й) и уровень 1(£ в твердофазном Ш. В схему также вклячено определение количества И№, несущих фенотипичесгаж маркеры СДЗ, СД4, СД8 в реал,.« комшш-мерт-зависимого цитолиза, осуществляемого на местах в случае наличия соответствующих реагентов (ВАТ) и оборудования (ла~шесцентный микроскоп). Эта схеыа ковет .ополняться исследованием местного иммунитета (в частности. slgA).

Схеиа первичного -тиунологического обследования имела достаточную степень унифицированности, (цюстоты исполнения и юодштивности. что позволило нам рекомендовать ее к практическому использования лабораториями клинической ишунилогии нав й страны.

На основе этой схемы за перке. 1380-1990 гг. впервые получен вариант "иммдаолошческой карты" страна <И.В.0радовская,1991 г.), а такав изучены особенности иммунного статуса населения и регионах страны, где воздействие факторов химической, ({изической и биологической прцюда превысило тс разумные ¡феделы, за рамками которых сужествепным образом нарувается эаолтионно сложиввийся :,..алогический баланс (Рузыбакеев Р.К. 1987г..Козлю« Й.С. и др.198? г..Гариб «.D. и дг.1389 г.)

Однако, схема первичного иммунологического обследования имеет ряд " недостатков и, прежде всего, в отновении ограниченного набора коли-чествсших тестов и отсутствия адаптированных методов оценки функциональной активности ИКК. Отсутствие функциональных тестов оценки ИКК в свете "патогенетического" этапа оценки иммунного статуса человека (Когллъчух Л.Ь., Черсдееи fi.H., 1991 г.) является весьма сдаественш прицелом при рсвении важнейвих научно- практических задач экологической иммунологии.

- и -

В этой связи, мы разработали и апробировали, как при массовых обследованиях, так и в клжической практике комплекс микрокетодов оценки Оункционального состочния ИНК, касавдихся гуморс",ыюго звена иммунитета, фагоцитарной системы, системы еск-твенг'ой цитотоксич-носта. пролиз>еративной активности и дифференцировки ИКК. На этой основе, а также с использованием принципов уии?«п|ировашюй лабораторюй методологии первичного иммунологического обследования, преложена рассиренная схема оценки иммунного статуса населения, апробированная на контингенте рабочих Щелковского завода по производств^ хкм, веских средств залиты растений. Иосковской области.

Разработка новых микрометодоп оценки гуморального звена юа^итета и их апробация г"и массовых обследованиях,

В контексте вассовых иммунологических обследований наиболее рзаь _ ространенный метод РИД (Нагапп! С.1965) не лнзен недостатков, преаде всего, в скысле отсутствия достаточной степени стандарткзнровапности н унифицированности исполнения способа, а такге его трудоемкости и производительности. С учетом этих обстоятельств ки разработали кккрогетод определима количества (сагуноглобуягюз в биолог чееккх средах с использование* 1фугах или 5-каиалыга, плоских, стеклянных гатя^рот - "Кнаунокап". Схеш осуществления способа представлена на рис. 2

состав: о.б'/лгдр (Й1Гсо)

А5Г.пзг-г;со _ к» 0.1 ммю«»»-

«едя.'шокм

еуг1;рэ, ри56 ?07.<С г?стка

э}д э,м Э| б ,8 А

гл зг

Лге»иия» тпш«5гг» ссспгсм

вЁЕ

гх«5К!>сгь СТЩЦРТЫ ДА*

мгХ

М&С-9

»».»•Ш

ПСЛ'.СПГЧЯ'ЙЧСС * 1 я сет*»

и)

П0СТ1М06М1 МПШЯРНСЬО МИКГОН'ОТОДА определения ».чжчпг.т»* имчУШГЛСНУМНОЬ 6 рил^-м ичпгки* жи/^ГКЧЧУ "ИММУИОМП"

Микрометод основан на пршципе простой линейной иммунод-ффузии по Oudiu 3 л 1971г.) и заючнается в том, что специфическая антисыворотк^ цротив определенного класса имкуноглоб-тинав в 0,62 агаровом геле на верона/ншдавдовом буфере, pH 8,6 и 4,52 ПЭГ-600А помечается в круг-.ай капилляр иди в кажд 5-ганального капилляра, которые, в свою очередь, вносят 1 в исследуемую бкологическуя среду. Ив окончан-л инкубации результат фжсируется по дгаош столбиков предемтадо. Искомая коадштрация иммуноглобулинов определится по соответствущей калибро-вочюй кривой, построенной по кзвестнш стандартам. Отличительной особенное тьв этого кикрометода является возмогность заготовки .¡артий ка-гошяраз с приложением к нкм калибровочных кривых м хранения их в ш-нусовом режиме с исгояьзовашек 20-302 этилагднхоля. 1уьс ^витальность "йвтунокаги" составила дл~ IßS 10-30 вкг/lu. два Igfl 8-16 мкг/мл. дла lßH 5-10 мкг/мл. Коэфициент вариации мкиршетода для Igt - 3.52. дш. lüfl - 4,92, дла IgM 12.\г

Производительность микрометода - Ъ0-70 анализов за одну постановку. Показатели содерванкя иммуноглобуданов, получешые микрометодоа "Нмму-нокап" 10 группе здоровых доноров, п-40, В t в. для 1(£ 1485 t 116.4 мг2. дла igfl 1В1 + 12.9 irX. дль 1вй 147 t 13.6 vX . Иикрометод апробирован при массовых обследованиях контингентов рабо'их Армавирского РТИ, на ПО "Ломо" в г. Петербурге. Ваковском заводе резиновых изделй. Московский области. При этом показана достаточная стандартизириван-ность и простота исполнения микриметида, его производительность и информативность. С учетом характеристик микрометода мы вклвчили его в усовершенствованную схему оценки »¡ммужого статуса ' рис.У ).

Кроне этого нами разработан микрометод определения количества иммуноглобулинов с использованием ацетат -цсллплпзной мембраны в качестве üchgbu для пассивной иодтодюздзии. Принцип микрометода основан на том, *тми ацетат-целлшшжде мекбра11у, предварительно нропитлннуп соответствущей специфической антисывороткой, наносятся микромнрицом иа-лкдуемые образцов обьемг 2 мкл. ilo окончании инку&щки во вллний атмосфере мембрана отмывается и нрокрамкнаетса 0.1* амидо-черн*. Диметр образовавшихся округлых пятен иммунопренинитата соответствует ко1'црнтр.'«1йи искомого иммуноглобулина. Почетная величина этого пара

иетра определяется по калибровочной кривой, построений по известная стандартам.

Разработанные иикрогетодв определены геодюглобаязвз ~ биологических средах рекомендуется в качестве кетодоз г йора ; цчетоа коин ретпих условий для работа га вестах.

Разработка новых кикр¡методов оцеиад фагактарного звега иммунитета,

В схеме, представлений да рис.1, шэтдешсй. кюготшоненпвгй процесс фаг et ¡птоза оценивасся практически по двум параметр® - СИ п НСТ-тесту на предметном стекле. Информация, получаемая этиьм кетоддем, важна, но недостаточна с точки ->рення детализации дефектов фагоцитоза в тестах in vitro. С учетом этого обстоятельства, ми разработал» гск-рокетода, позвассте охарактеризовать уровень акттвности ШЮ, адгезт лейкоцитов la пластик, спонтанной шграции и хемотаксиса яейкощтоз -- casкейаих параметров ФЦ!кш«ншьного состошия фагоците®.

Разработка спектро^отометркческого иофоаетодз оценки КПО-активности и его апробация при касс эти об ледова-ниях и в клинической практте.

Схема, осуществления кикрометода представлена га рис.3

геишлзн •

ГОоШАЯКОДЭ н^бчиай .

с

•у

t У

тщы'гь

ИУАЬТИСЬЛН,

сптнческяя

плотность

♦ es «ил mm ОРД Q04Ji*AOi4/£ HjO*

/ о е ое о © Л /ее е«ео#

j ОООУОЦ [/ —

КАЗТО-J НЬ1!< fibiiST

ся 15

%0 Ai

С! 5 с& » ПХ

£;»<сггзСхеш BOCTAHOSK« спектеофогометричйского тхи>-

ЫОЮДА ïCCTU^O&AH'.îy f.iPO - Ш1Ш!;ОСТ!|.

IÇSSSÇffl Зг«С2?ОаТС8 В ÎC2, ЧТО В ЕредЯрЮМЫМ ЩГСГО-

пшшш « прссвлавяз га кгшачешз пакг^сгасдергл: £&кг;глю <{Ш) квсточнса £шате-(без sjKripoiçw, лоаяакц гюзгха&и оСкздаат

ПС853ДОПСрОШ!йЗЗЯОа ûifTCKiCCTLS) СЦ5Л 302Î Г.ПЗ-ЖГ.гЖСГЪ ВЗ CÏÎCJffilED

0.0i% срто^апгзддава в г^всутстви О.ОШ l.^ia $эс£зт-штратнаа % liï&apo, р!1 5,0 к пэ «лгошснзсти агокзашй пятюста (СП) реандан-ifflfl среда 432 ш судят ой активности 1210. В еяучза геобхоюшсти ед. Cil переводят в усл. ед. агткшюсгл стаиартшго раствора пероксм-дазы хрена ( уд. акт. 350-500 ЕДАг) по ка^-броютаюЛ кривой. Показатели активности ШЮ, полученные на группа здоровая до-оров, п- 22,

s

Mta, составили 34.9 t 1,0 усл.ед. при концентра«« ШЛ 2*10 /ш.

Производительность кккрокетода 20-30 анализов в день, чувствительность /-15 нг/вл стандартного раствора гароксидази хрена. коэ<р<циент еариации колеблется в пределах 6.4% - 15%. С учетов указанных характеристик. а такхе простоты исполнения кикрометода, мы вкдачнлм его в схеку оценки warjmiiiro статуса населенна, представленье.на рис.! м на рис.8.

йзфотетод апробирован в условиях массовых обс/гедсэашй ta leraw-харной крова контингента работа Шелковского завода. Показало, чго производственна контакт с хлпр- и фосфорорганичешки сс даненнжи, содерга-ях в своей составе диоксин, сопровоздаета достс^ерии угнето-ниез «згггоиости Ш13 (цеха 1 и 2), котор!й, как известно, езлязтся кдэ-чеиа Сериенто^ уффекторт бактеркцидних систен фагоцитов. Исследования. проведение с использование:« этого юафокетода. на группе с первичными НДС показали, что селекттаад недостаточность Igfl (CHIgfl) - 6 случаев, хр-лтеская гранулеаатозная болезнь (ХГ01 - 6 случаев, агам-каглобулинеши (ЙГГ) - 8 случаев такге сопровоздштся достоверна из-иенениша активности этого фераагга. Активность ШО при CHtgft составила 24 t 1.8 усл.ед., при КГБ - 24 t 3.6 усл.ед..- ИТ - 19.7 t 2,4 цсл.ед., в контрольной группе С п = 22 ) - 34,9 + 1.6 усл.ед., Р<0.01.

Разработка спектрофотонетрического еикрокетода оценки адгезии лейкоцитов на поверхность пластика и его апроба-цг-я при яассовых обследованиях и в клинической практике.

Cxesa осуществления кжроаетода представленг на рис.4

ГСЛкМШПИГОВМММ »DIk

17. ж«шии. rV»»"«HT М-г*ц

U

с»спеч»и* «««0-

читоиппс

см-1,5 tov»»

/»ооо во/

-/ооооо®/— /оааооо/

QlM»C»tlt»«Jim t HKTlTt«»HOÊ смд*

/ о о о о о о h, /оооооо a. „_/ —/ооое с Q о ооо о о /JL™ry <

/ о о о с о о «у о о о о cor / в

ИИ1УОЧИ» М,5ч»сл Д7*С, 57. cbj

О ф 09 О О

♦0.1т виДисТинию-едино« юди

1Д5Ш

МУМТИССМ

•0.04% 0»Д 0.0Ц7.Н«0, их***«-цитсдтиом s»ve'«, »И 5.0

в»»'»* ш* ww«eei»o клеток

IU

Рис >1Ч Схем* постановки спектрофотометрического микоометод* оценки ддгегии леикоцитоа

fenun вкроиетода закачается в том. что из периферический гепа-рмкизкфовашой крови (капиллярно! крови, подучежой кз полым, либо кровь, из веял) идедзется лейкоцитарная суспензия на гаютностаи гра-дюитах, ибо спонтанной седквентац^й эритроцитов в 1Z аел«»ше в сраа£ 193. После ддоер-ОДРОвсцкиго подсчета кавмества клеток (ПЯЛ, "К) меточая суспензия в концентра»« 1-1,5-ю''Ш/вя в обьекв 100 ou пекечзетгз в Jwoa плоаюдаяш пласткковых пластин для гааунаво-пяееких реаш*!Й, По окончании инкуба«« в течение 1-1,5 часов при 37 С в цжсутствкн SX Ц оценивается количество пркшших клеток по уров->ш активности интраюшлиюфной КПО в шгокашшюа спектрофотокетре т. Предварительша исследовании! на груше эдг авых доно-. ров наш истансалет зависююстъ активности зцдагенноа ШЮ от кавн чветва прадеша клеток, щкдетизлмда на схеве. Нез>; 1еп „лише колебания количества интриг .итляриоА ЫШ и здоровкх доноров входят в оевбку ошта и кз сказывается на характере кривей. фокяюдетеАНосп Вдфсжатода - НО 20 рчмвоов в рабочий день, чдествмтвлыюстъ адекват-т чдаствитйгьност цкдидучого аофоагтеда и составляет 7-IS etr/ki стагщрлиго раствора !П. дд. m. 350-500 ЕД/аг. кя^здззгг eapHauct - 13.SK.

Еи^роаетод щмшалзет тестер' затъ фенгжел игк&ади адгезм дейко-щлов, СБИдетйвьствдаада о специфической скижбаказдш клеток к кссиадеетиу гвтгену (toldrusen И.II. 1УУ9). С учетоа этою обстоятельства и с шшльзивсигаз рязрайотиагаго кзфшгтида «а вэучаа состоять тточн о иаа»#мтета ВИЧ »фадровакяя находивегсея на обследовав и лечетвм в клкшю Института issyüwwrai. Всего обследовано 18 оди(еиккителгй. Кягатаский ддагно? стоило) на юи-ьании кошиякса юимческик признаков tüfl -инфе.чц.м и лйораторнах да-Н5Д, вклачая по^рвпедывй; результата на нохячйь ЙТ к вирусу HIU-1 в тиердгчнши* подтт-радсиных ветидгл вестерн-блоттюга.

Кигтрошаэ »рули вшгечлоа .'0 щиктича-ии здоровых дэдей. В работе тестировались гледдаие синтетические kwwi шй-ококонсераатив«« ишу-ипдп«ошт1их районе» оЛоаскг«« Ьелкш gp4i и gpl20 ввдеа НИМ. ншп-гл-нгая иемммя тптидной пвоа в Ижтитуте кауношгка ( Г.Н.Аа,-регр и др.). -&\-7Л Bïiao. 308 m ail?0. 423 «О щ>120. 5в4-612 !пч i»«: с ионьегл&и г, sí лат» и: и, так и чжпгй па под. Ib

лцчеюие экспериментальные дашие показшмш .что совиесттая инкубация

лейкоцитов ВИЧ-инфицированных лиц с указавши пептндакм в диапазоне -Г -г -?

концентраций последних 10 И. 10 !!. 10 Ц сопровождается с^ествашй модуляцией адгезии клеток нз пластик как с сторону упелггасэ, так и в сторону снижения. Эти изменения достигает достовер!КХ 31ИЧС{С$ при Р< 0.05 в сторону ингибиции для пептида 251-272 ер!20 в концентрации 13 !1 ( НИА в опыте 55,6 + 11. в контрольной группе здорових доноров 116 + 5) н в сторону стимуляции адгезии для пептида 584-612 др41 в концентрации 10 М.как истого, так и в коныгацни с еелатином ( Ш ь опше 1461 1 16,2 и 129 * 12.7, соответственно, в контроле 108.7 ♦ 5 н 97 \ 3.4, соответственно).

Полученные результаты свидетельствует о то*, что прошотговение вируса НИМ в организм сопровождается, помимо глубоких и хорозо известных изменений в иммунном статусе, индукцией специфической сенсибилизации лейкоцитов к юаунодоминантным районам оболочечных белков НИМ.

Чикрометод апробирован при массовах обследованиях. Изучались сиво-ротки рабочих завода "Уралхншшаст" г.Нютий Тагил на наличие факторов. модулирупоа адгезивна способность тест-клеток здоровых доноров. Всего исследсзаны сыворотки 451 рабочих. При этом показано, что условия производства в 19,3% слуиев индуцирует фе-тгоры, ггибиругзие адгезии .тест-шигток, а в 9.32 случаев зарегистрирован противоположный эффект - усиление адгезии.

С цельп изучения взаиаоотнояений блокнрущих факторов в реакции Е-РО и в тес.е аягезга мы из обследованного контигента рабочих завода "Уралхиапласт" сделали выборку в 57 человек, у которых процент /ГГ1+ клеток, по данным проточной цитокетрии, прывкзал процент Е-Р0К у этих же лвдей 1й 10"/ и более, т.е. можно было предположить, что в сыворотке этих люлей циркулирует фактора, блокируете СД2 кластер Т-лкафоцитов, поскольку между Е-Р0К и ЛТ1* клетками (обеее количество Т-ли5*Юцитов) наблцдается практически однозначное соответствие.

Изучение влияния этих сывороток на адгезии тест-лгйкоцитов показало достоверное увеличение этого параметра по сравнима с контролем: 0.69^ *. 0,02 в опте., 0.47 \ 0,03 в контроле, Р <. 0,05, указана единицы оп-пмеской плотности, I ( а. Тестирование влияшы этих же сывороток на Е-Р0 ликфоцитов здоровых лцдей показало, что в 312 слу>вез ссторотга

ишши Е-РОК на 10% к более. Иными словами, сывороточные факторы, ин (ийирущиз Е-РО (блокада СД2) обладает противопшговшки свойствами по опшенив ь ад еэии, а именно - усиливает гфилигание тест-лейкоцитов. Нодо&ЕЙ инверсный эффект трудно поддается интерпретации. Возможно, исследованная 1ши выборка вклыаяз индивидуумов, контакт с прокз-водствиики вредностям;: пятерых сопрововдался индукцией факторов, обцеловиваих шаеог-санные эдекти.

С учетом характеристик клфоиетода, его и»фораатквности и простоты ипюлтния он вюанен в усовервенствованнуэ схему оценки иммунного статуса (ркс.8).

Р"^работка капиллярного киироветода оценки спонтанной миграции и хемотаксиса лефявдтов и его апробация пр: массовых обследооани; ; н в квгамнеской практике.

Схема осуществления шшрметода представлена на рис.5

ещринш'гомнхт

IX пешня ге^»«ит М Р4М

1 Л

»ешкщигс»

»г.пс.оцб ю/«

/еёвоТв!

* /9 О ОО О О // /ОС РОС о II

01м« СУСПеи!><М •¿йвдцитсл « рЬс

ь5 КкиААвЬОМ штмп

•п» 09-1". м ллс X» 10 и (К фогыкд- метко -KxiC6t.it пептиды)

ИЧИУ»1ЦЧ* Я'Ю часо»

МИ «РОС ноле ОИМКО'

С-ХЮТДКСИСУ, СПОНТ»»КОЙ МИГЦЦИГ

Схем постдноьки капиллярного микрометодд оценки хемотАкСисл лёйкоцитоь

Принцип микрометода зшшгпетса в тип. чти в 5-канальный плоский стеклянный капилляр вносится 0.9-1% агар ШСсо) на полной питательной среде (ППС) без и с хеыоаттракт*нтом (ХП). В качестве ХП м~ использовали синтетические Н-форхилметнокиловые пептиды г коне'чой концентра--г

ции 10 И.

Затем эти капилляры в вертикальной позш|ии вносятся в исследаеыу-

f

клотоида суспензия на ППС. получения в концентрации 1-1,5-10 /мл га

плотностных градиентах или спонтанной седгаентацией эритроцитов п I%

желатине в педе 199 из капиллярной, либо венозной крови. В работе

ксиользуптса 98-луноч1ие гигос кодою гае шшзеты. По окоьгачми гскубацки в

в течение 8-10 часов при ЪУ С в присутствии 5У. С0^ проводят измерение дясш пробега кигрирусхих клеток по фронту миграции в кофоскопз с окуляров-ндарометроя (ув.'В).

Спонтанная миграция оценивается в кагширах без ХЯ. хсматаксис в капиллярах с ХП. В случае "^тирования влияния растворимых Сактсроз га хемотаксис, исследуеиая среда добавляется непосредственно к тест-илет-каа в лунки плоскодоюшх пласткн. Показатели спонтанной мзтрации и хемотаксиса, полученные 1« группе здоровых доноров, п - 20, составили, соответствен!,о, 0.33 1 0.04 км и 1,01 + 0,03 иа.

Кикрометод прост в исполнении, его производитель ость - до 10-20 анализов в рабочий день, коэффициент вариации составляет 10.2% для спонтанной миграции и 5,2% для хемотаксиса.

Кикроаетод апробирован на той ге группе 18 ВНЧ-гафщированных лиц. которая исследовалась в тесте адгезии лейкоцитов на пластик. Контрольная группа вклетала 20 практически здоровых яэдей. Исследовалось состояние спонтанной миграции и хемотаксиса лейкоцитов ВИЧ-инфицированных лиц и влиягме на хемотаксис синтетических копий висококонсерва-тирных иммчнодомиианттвд районов ооолочечшх белкоз др41 и рр120 вируса НИМ. Это были срагмента 251-2/2 гр120. 423-450 ер!20. 584-612 Ср41. в последнем слуие как '¡истый пептид, так и его коньггат с аелэ-тином. Зкспергаенталы-не данные показали, что присутствие ХЛ в катил-_ --ляре сткиулирозаяо ииграцимекр активность клеток, ту, у ВИЯ чзфвдтро-ва!м«. тбк и •( здоровых доноров. Длси гаюбега ипся^квалась в средне* в 2-4 раза, но у ВЯЧ-и$?я5Ф08дпах и и бага «яьзэ. хотя и ие-иостовсрно. В ели* вой сг.снтачнпй миграции Е! Г (- и л;; !розл;сгх< тагас

несколько юзе по сравнении с контролен. Исследование влияния вывеуха-занных пептидов на хемотаксис лейкоцитов юфщированда лиц показать ингибирукаее влитие этих вецеств на локомоторную од надо клето Еашшуа достоверной ингибиции падая а фрагменты 251-272 gpl20 it 423-450 0)120. Длина пробега в огше составила 0 \ + 0,03 «ш и 0,22 + 0,09 si, соответствен«), о контроле 0.73 t 0,1 un.Этн Факты находятся в тесной па -генетической взаимосвязи с ингибиторнам эффектом на адгезии клеток от« ве болы их фрагмента 251-272 И)120.

Капндларшй микрометод бия ацюйирован при массовых обследованиях контингента рабочих завода "Уралхюпласт" г.Килний Тагил при изучении вшякия условий производства на гашушшй статус. Всего исцеловано 64 сс ротки. При этой показано, что в 43.72 случаев регистрируется достоверный кнгибиторный эффект сывороток на хевотилсис тест-клеток здоровых доноров.

По результатах изучения адши" сиворотох рабочих на хекотакси-тест-лейкоцитов бшп сформирована две rptfra. Первая - это гругвю с наличием бликирущей активности в сыворотках, вторая - это группа с отсутствием- блокиругцей активности в сиворотках. В каадой из этих групп били просчитана параметры к.лунного статуса и проведено их сравнение не аду собой по L-критерии. Результаты показам, что подобное разделение обследованных на группы, затрагивает достоверное изменение трех параметров - процента лии}оцитсш. наличие в сыворотке крови факторов. ингибирдачих адгезии тест-клеток и фагоцитарного индекса. Причем, эти па[Ч1*етры в группе с наличием блокируиций активности в хемотаксисе претерпевали изменения в сторону авоения. что подтвервдает тешгув взаимосвязь функцианллыих параметров фагоцитирую^ клеток. Таким образом, с учетом характеристик юсфометода, его информативности и проститы исполнения он также вкличен в усовершенствоваищю схему оценки wop.jiutcro статуса (рис.13).

Раз^оотка каг&сиырного кикрометода оценки активности егтестьешшх киллеров и его апробация в клинической практике

Наиболее распространенные в ¡истовее вреыя ветода тестиропаниз ЕК-активности предусаатркваит использование радилжттаной метки, что с!п"ствешю ослоаиет их п, иаенение в практике работы лабораторий кля-icnecKoft геицнплопи и в условиях нассовых обследований. С учетом этих обстоятельств ш разработали простой и достуший кикрокетод оценю! ци-тотогапеской активности ЕК.

Схена осуществления кикроаетода представлена на рис.б

ППНШапШаИ »4»

8 — Р

Г>«ДМ»«Т

ficoll-plque

CKIDIH

вое /).,«,/гэзэ /Г, / о ® о о о <i /} ' в э о э о о © // - / о о © о о в // i £4f

J о-у в о ООО о/ /ооооео^у *£е

МД0СМЛ01

. соси»

olojm« mnk 0,05«. K-i6k tutu

соотношение з&ФекЪД*?—-Cab «О 1; го I; O l

Q!Jt тплиони Синь

rflhtrl

«>( £01 SOI 5 |ч«д»1лыз ст«ик ммшры

и

tunrettlM 4-3НС» ЗГС.Э/.СОв

сч«гХ лгокрдшсшы К 53г~'Лцитото«скч • мост*

Pen/ Схемл постано&ки кашвярного микрометодд твстирования .спонтанной цмтотоксмчности

ГЬимси шкроиетода закапается в тез, что взвесь тестируемых кле-

тоа-езфекторов (Ей, выделенные на плопгастшх градиентах) и кле-

тск-сяенсй ( ЕК-чувстветельнш. линия К-562, культивкруемя In vitro )

з соотношениях '0:1, 20:1, l^'l вносятся в 5-каналышй плоский стек

данный капилляр в 0.7Z агаре ( Difco ) на полно). культуральной среде в"

(]рнсутствии 0.1 X трипановой сим. Концы капилляров закрывается воском

0

кгч швстилнноа и инкубнруэтся при j? С в течение 4-5 часов.

По окончак! икубац>а в световом кжроскопе ( уз,25» 10 ) проводят счзт процента прскрааенЕЯ К-562, дифференцируя послглние от Ш1К по разйерга а есрфолгппссксй структуре. Процент прохрагекках к^тсж-кь еией соответствует проценту спонтанной цитотоксичностк. Контролем

слухит капилляр с чистой суспензией К-562. юшеспособность которых по иооптению тртшювой сини долхш быть нс менее 95-96 У. до начала опыта. В работе используется разработанный ранее нами принцип серийных клеточных разведений для тестирования т vit.ro количественного, либо качественного дефицита ЕК ( Саидов М.З. с соавт. 19Б6г.)

Показатели активности естественных киллеров, полученные 1а групле здоровых доноров, N - 15. составили при соотновеми 40:1 - 24,2 + 2.1 У.. при соотновении 20:1 - 16,И £ '.4 X . при соотновесии 10:1 - 10 » 0,9%.

Производительность микроиетода до 10-15 аллизов в день в зависимости от диапазона соотновений эф}ектор:миген1). Коэффициент вариации гифометода колеблется от 10 до 23

Иккрометод апробирован в клинической практике при изучении Мактивности больных раком толстой кивки, а также простым герпесом и оценке эффективности виростатической и иниунокорригируздей терапии зо-вкрайком, гадазфероном, тактквинои (Алкеева П.Б. с соаот. 1991 г.) В виду достаточно высокой информативности, зкспрессности и простоты исполнены, он вкгамен наии в усовераенствованнув схему оценки гааедь ного статуса населения ( рис.И ).

Разработка метода оценки РЬТ/1 на алло-йГ клеток Кадк

ДизшЛ метод разработан нахи с цельв изучения процессов распознавания ИКК адло-ЙГ ( совокупности ПГ-дстеркинант клеток ответственных за прол>!фератюный ответ Ш1К, в ключа ЙГ ККС ), пролиферации и дифреретдфовки. В последнем случае по уровни продукции в сутгрштанты цитокинов. Перечисленные обстоятельства язляэтея принципиальный отличней предлошшого метода от наиболее распространенных .фисков оценки РБТЛ на I зликлоналыше кит осени. Получаемая информация в сс^те "патогенетического" этапа оценки иммунногс статуса является весьма ценной в кошглега.оа а!илизе функционального гостояшы ИКК.

Схеш осуществления метода представлена н: рис./

ref}Af*nwj**>uru» fP»lH«nT

fiCOlt* •P40UI

\

CK"M«IM Kiii

f 1e*/>uiiocit' '

IT.«*«-

♦ Угихщии

/'о а ; t: e /! / о о s с с о Л с о о о с с f/^iL/ г о а о э о /и

5гт.___________MtViti. '--г-тгг '.

J95C6? /! с i е с з //

О ДО З О/У

cser. /S-4>«

ссиашие V.CMOCIOH KIJI «iib«

W»tTM**( ОЬИЮМкиоп*

Q0!% ПОД*Ч-А*1*«ОМ

11

i

9 О О О 9 О

DO© f 3 Э //^

J_ /О О О О э О

/ о о ОС в о I о о о о о с

О С О О S

, с*', ^•jfe«, ИС =

тис -с с » с« «1,11

стттиты хл мстнгомм«* ТЯф-»С,фДф, ИА-1, ИЛ-2 » «г

КИЛ/ЫИ«. ОПЫт ИМ"/МИН, КОЧТРОДЬ

Pwj 7 Сксма постдмоаяи РбТЛ на алло-АГ (rterдофлзныйисуспемзион-^

|>«РШТИ) .....

fipjcnSTi кетода заключается в тем, что при схегнБания клеток-стшгу-

лятсроз ( обработанное 1 X парафзрЕалъдегадоа клетки Raji ) и кле-

тск-респсндероз ( Ш, е^елшшо на ги: относим градиентах ) ß соот-

нсгении J:l, по кстечешз! 'всоз coni!ecTi.jro кульп®1фовги"ш в

„rjm<ax шюскодонна пласта! проводят лдеику прокчератквной активности

клеток респовдеров по уровня шсягзчеша3Н-тю!вдъ... Концентрация клеток t i

в сгате колеблется от 10 до 2«! О /т. Нетод нсвет осуществляться в дзух вариантах - твердо^шноа к суспензиоююа. 6 первой случае' дм зтето создается специалиай иокослой клеток Ragi на пластиковой поверхности. предварительно обработашоЯ 0,01 'А поли-1-лизиноа. Суперна-тгпп кяеточнгн культур нзплек^чтся для тестирования продукции цитокинез - И/И, Ш1-2, ТО„'и л>. Наги специальные исследования показали, чтг синтез и секреция ИЛ-1. IW-2 и ТНФ^кяеет иг-то в данной иодельисЛ системе. Продан THfe". определенная ветодм твердофазного Сисайтово-го 1ЙЛ. через 48 лсов культквирос шя. составила в конгро-з ( чистые ИНК ) - 43 f 8.4 пг/ил, в опыте - 777 + 89 пг/цд. [&>идукция ЙЛ-1, по истечении 48 часов культивирования, в кошпогенно* тесте нз hue кии ой котированной нат 010.64 составкяа в контроле 118 + 4,2 р1/ил. в aa.d 1210 i &47 ЕД/ал. Прс^ага ИЗ-2 по истечиси 72 часов сизаест-

ньго культивирования в комитогешшм тесте на ИЛ-2-зависиаой линии CTU.-2 составила в контроле 29 ♦ Ч.З UE/ил. в опыте 43.5 ♦ 10.2 КЕ/мл. уровень пролиферации в группе здоровых доноров, N - 15, по истечении 48 •исов культивирования, составил ЮЮ t 350 тгл/кш в контроле и 6203 i 82Э шэт/иин в опыте. КС г 6.4 ♦ 1.2.

На величад пролиферативного ответа буде-i вл>ить степень гомологии по ИГ 1С.А клеток-респондсров и клеток Ragi. Изучение модуляции проли-фсратишюго оте ;та в зависимости от степени гомологии по ПГ ИЛ представляет собой отдельную научную задачу. Нави цитоф-луорикетрические исследования, не являюциеся аналогом икмуногенети-ческого ткпирования, поселяй. что клети Ragi в фазе экспоненциального роста in vitro в 98 ЗУ X экспресщщит ЙГ II класса Ш1С - HLfl-DR. (fl.fl DQ и HLfl-DP, ответсвенные за индукции СД4+ отвечавших клеток в смевлшой культуре с последущей их пролиферацией.

Метод был апробирован в экспедиционных условиях при проведении массовых обследований рабочих металлургического комбината г. Н.Тагила. С этой цельв за[инее заготовленные шшки с монослоем Ra^i транспортировались »и место проведения работы, где проводилась реакция РБТЛ ю алло-fll', согласно схеме. Но окончании работы шнеки замораживались. а счет уровня радиоактивности проводился в Институте иммунологии. Обследовано 20 человек, ИС составил 4 4 0.74. Нави специальные исследгвания показали, что хранение клеток Ragi в V/. параформальдещде на PBS сохраняет их стимуляторнуп способность по крайней мере в течение одного месяца, что открывает возмохность хранения клеток Ragi дня работы на местах.

Коэффициент вариации метода в контроле-26,82. в опыте-23/1. Производительности - - 6-7 анализов за одну »¡остановку. РЬ'ГЛ ва алло АГ рекомендуется нами в качестве метода выбор! оценкь ццнкционалыюго состоя ния ИКК, oi. также вклпчен нами в усовервенствованнуп схему оценки иммунного статуса.

Представленная на рис.1 унифицированная схема первичного лаборатс? но-иммунологического обследования »вселения, как отмечалось, явилась методическс1 основой гтановления лабораторий клинической иммунологии назей страны. Однако, эта схема имеет ряд недостатков, прежде всего, в г.адсле отсутствия функциональных тентов и ограниченного набора пологи-

«их кшнчестзенгаЬс параметров. С у>етса этих обстоятельств мы предлагаем уссвервенствованида схему оценки ианунног*- статуса населения -- рис.В.

г*а*мпщк>с*|>»м I »Ott

— «UIM

t<MT Ч«(ЧЙ-

/3»и JiL

/,3,6 м 1

Г-у---U

т

и UOM/T»

км

*»ГОП1 I nniltnw ' ItMfiUKl.

l-w, PtT»

0«i«>««kf «I

M |ЧЛ«ОС I мы t I4IM.TI1

pim.iif«

»II

ÜMT OW1M

DCUO« ft n«T4lt*»-

«9« С1ЧД6

------_( РОК. мгf>i«4ju« нети

V . if fOX.

M-PCK/.tCAM

N

«in(l«Ut, UCNItfwi TW

*W III«urKf» KH»ov«r<u «Ct- t«ei

[I IltWetOUNW* 4{I

оилитшм м nerv-, UM WU»»»ai«r04«O»

HTI u HH'ir «oro*.«« U№IM emwerma

cuu'icif.ciicuw.Ci .ein, .

CtfSCIO. Ш0

I^TIt VTCttiKn*»* 41

Pem S. Усогзраеиствовлшя схем* о&сшдовш* i /атой системы при м cco3wx о&следошн«

пггя m о&ектоа i .сде&гадгл пгаетсл гепаракязю-

егнзз креп», рпздйяаааа на кгето»иЛ стадии и ддауэ часть, котор». з своз очгркдь. гюгзергаэтея кшгпга^теа aiswmy, отразаг^еау разно-образа сторон состсяса икгцнноа сястсга,* Этот гнало склгтезт а -себя нзйор соответстщр-^и кокувстЕиггл я кячзеттога; (Оуцхцяяаяь-1гл) тестсэ. Эта тсста г> достаточной стеши станкартизкрозаы. вяед-p~in гз ta езстад пр.ч:прлг"им!о возгетт, йяюрггагкзкость котсдов годтверзд»а р*пуя>тат^лн кх anpoösja. iaa в шгшчзшй практика, т>- . !i прэ кассовых ойоледозасст. Схг^а вястрт п ссаокупность разра-ботет-я isai нкшх гйвфеззтодез.

Ccscpsae® ^^¡аглобулпюа oijcseancrrca гсутеэ иенвяьгчзая нлогь роз "fcssiexan". дгбо РИД. D схеку вжззчгяа катода лмрдофазиого KJÄ для тестирована «ровна ПТ к тр'зппра^еггйЫЕэ группа*, ревкзтездюго Сзхтсрз (РЭ) и антипфеоглябилиюси ЙТ ( A.C,.lä3" г,), а

тага урез; а сбг^го Igt. '..¡стъ шага отбжгтез га кссладоаа«е йя>-

кирдагих факторов в тестах адгезии, хемотаксиса, Е-РОК и РБТЛ. Клеточный осадок изучается во ишгих направлениях. Они вклвчавт в себя набор стандартных РО-тестов, в т.ч. и нагрузочных. Спектр методов оценки фагоцитарной системы позволяет получить основные функциональные параметры фагоцитов. Это микроаетоды оценки ФИ, хеаотаксиса, адгезии, МПО-ак-тгезности, НСТ-теста. Существенным нововведением в схеме является получение ИНК на шштноспых градиентах, которые исг зльзуится в капиллярной тесте оценки ЕК-активности и в РБТЛ на алло-АГ клеток Яад1. Супер-натанты клеточных культур, в последнем случен, могут использоваться для тестирования цитокююв и иммуноглобулинов. Важное место в схеме занимает кммунофенотширование ИКК. в т.ч. и субпопуляций Т-ликфоцитов в проточном цитоаетре. Лимитирущими моментами при иммунофенотипирова-нии является наличие самого цитометра, а также набор МАТ для этих целей. Здесь же присутствует и ЦГГ с комштмент-финсирущими АТ. ю-вдйа методом выбора. Последний с успехом можно заменить методом поверхностной иммунофлуоресценции с использованием ЮТ. Отдельной стрелкой выде-ена РЬТЛ на ФГА в цельной крови, поскольку этот метод доказал свою приемлемость и информативность при массовых обследованиях. При необходимости для этих целей можно' использовать Ш. Конечно, представленная схема может видоизменяться и дополняться. Все зависит от возможностей и уровня профессиональной подготовки сотрудников на местах. Однако, информацмия, получаемая по этой схеме, отражает основные количественные и качественные характеристики состояния иммунного статуса, имевдие неоспоримую значимость, как при кассовых обследованиях. так и.в клинической практике.

С целы) апробации усовервснствовашюй схемы, а также сравнительного анализа последней со схемой, представленной ьа рис.1, мы обследовали контингент рабочих Щелковского опытного завода по производгтву химических средств защиты растений. Московской области.Обследование включало та"же и оценку клиничес-их признаков ИН. согласие ре:лмендчциям И.В.Орадовской (1989г.) ^ заболеваемости, выявляемой по картам амбулаторных болышх в местной МСЧ.

Ко*21лексн2Я оценка иаиушгаго статуса пабочих юсягческого производства.

Всего обгчэдсшно 519 человек d да этапа, со стазеп рз£оты ¡и этоэ предприятии от i до 20 дет. lb intx 373 челозек па оспкзо цнирадь роздгюЛ cxe;sj п:ркгзгого ¡р^иолошческого "бслгдовгга я 176 челосек па ссксзе уссвер-епствоэаппоД схсai сцс:п"1 1гс*ут5:сго статуса,

ß зависимости от характера нроизподствепшго кситеэтл группа сбсдз-доазщх бага разбита па участки прстазсдства - цеха 1,2,3,4,3. Рабочее ¡-ели npœt?i -здствагай контакт с хлор- ч сок^срергамчеваггя ccssi-пггсгяя ( три -хэдк.2Тсфос, три->. .ороль, 50% зхуаска рататаз и WO. сог.срзаия з сваей ссстеге дяогаа. Это сггрстсо щжэзекаэт гцэтсташюз ;:з гссхгдогателсЛ в сигд се ?а ПфоглЯ ргспрэстра-нпггстп, еиокоЛ «jc-ofsraocT» со рнегнеЗ среде и ropatpisttsi доядо-дсг-; вссиккя, bî.-6p-:oTcitar<ecK5?;ï.Tep3Tcrc'.BS(ni и ггкгк^хеизга сьс-.'стгг.^! (С'пгз! fi.3. lS35r., Зяги П.Р.1Ж) Статист^ха^з o5?a-fimrj рсгцсьтатгя грк.-сд.чп с испзяяогзсяз t-í^.iTcpui. р-юпгал тл\-;сь дсстойср:при Р< 0,05.

f;:H!3ö паказлтслсЛ :r:hr.::tro статуса, патюзгсс по rxei-o. ггпг.стапсаспА га г '-с. 1, паезам, «го у рзбо'ск всех цехов tœcsîcn примерно огЛ!а;япое ч.гло (5,0) дсспагрцо .изучнзашх параметров го cpasHEiGO с зянтраздхй rpyrsicS ( табл.i). Причтя эти изкснамя. гасяотра ib i .-атгапгкхкуп достоверность. ne походили за предела извести« глряалыся гпзче^'Л гараяетрсз гекунпого -статуса человека ( Retaría Б.О. 10СЗ г. )

- 2В -Табл.1

Параметр« гаицшюго статуса рабочих химического производства, получавше по дофоффоважой лабораторной методологии первичного иммунологического обследованы.

Показатель Контрольная группа Цех 1 Цех 2 Цех 3 Цех 4 Цех 5

п г57 nr5? n-47 n-100 m45 n-67

лей>.01кга H t H t t H

ливроцитм,2 N H N N i 1

Е-Р0КД Я U i i 1 U

Í--P0K.Z Я N i ï i i

ШЛ Я H H N N H

Тф-РОК.% " N H H î u M

1ВИ.НГХ N N N i N N

IfiG.MTZ H i 1 1 ; i

Ififl.Mrt N H К К H 1

Igfl секр. H i .1 N 1 N

Активность i i

m, ус.ед N 1 N H H

Здогъ и в табл..! Я - норма,J f соответственно, повышение при Г1 < 0,05 и Р < 0.01. i , il соответственно, понижение Hi'H Р / 0.0'i и Р с 0. П1 но г;WW!ото с контрольной групгкЛ.

Как видно из таблицы 1 у рабочих всех це;:ов понижен по сравнении с контрольной группой уровень Т-лим$юцитов. а также уровень IgG. Эти данные согласуется с результата»! исследований (Нихайленко. Л.ft.1388 г,). показавшей, что факторы нефтехимического производства вызывает аналоги'жые иэеенеия в иимумом статусе рабочих. Существенным является факт отсутствия различий в содержании секреторного Igfl у рабочих цеха 5. где выявлена наиболъвая ицекциогаш забо^ваеиость и чаличие этих различий у рабочих цехов 1.2 и не различан?ихсяпо уровня заболеваемости. Особениостъв состояния нмлунного статуса рабочих цеха 3, в которой имеется достаточно высокая заболеваемость, является увеличение количества Тф-резистентных Т-лиафоцитов. Известно, что Тф вызывает мо-д^гацет Е-рецептора л,л$одатсв, как результат изменения баланса :нут-ркклето'шых nftlT и цПМ» (Йрилан fl.fi. 1985 г.). Угеличивая уроврнь цй!!Ф, Тф способствует экспрессии на незрела Т-ли»роцнтах д|ВДеренцировочкых Т-йнп!ге;юв. т.е. в назей тггергретагдеи, увеличен;« количества Тф-ре-зястенпых Е -РОК является показателем ierrata нецелых Т-лимфоцитов в перкфери'Ьской 1г«рк«уации, как кохпексатор1Шй еехелгом юмунной систе-hl на действие факт .ров игячгской пр роды,

отмечено визе, у рабочих, иаегаи* приозь..дствешшЯ контакт с хлор- н фосфорорганичесшея соеданеюпгя, содераавдх в своем составе Еяжсин,' допиверно понижен уровень Т-ливфоцитов. Анализ характера этого понижения показал, что у рабочих цехов 1,2,3,4 уровень Т-лга^о-цггоз сига преедхествиаю за счет блокада, так как оно восстанавли валось после иняубачя« щш 3?'с с левашзолом. М рабочих цеха N 5 еы-ssjeie теидеияз к узели-.еккз числа ищиекдов с тетиным механизмом по-ши.иа уровня Т-ляйЗоцитоз.

Лаяопгашй анализ некоторых параметров иаадшого статуса, получениях во вревя второго обследовам ; по уссверзенствовагагй схеме, представлен о табя.2.

Табл.2

Параметры иммунного статуса рабочих химического производства, полученные по усовервенствованной схеме оценки иммунного статуса.

Показатель Контрольная группа п-21 Пек 1 п=30 Цех 2 п~32 Цех 3 п=28 Цех 4 П--25 Цех 5 п-39

СДЗ+лимф.% Н 1 N 1 N 1

CД4^ливф.% N 1 N 1 N 1 '

СД8+лимф.% Н н N Н Н Н

Спшгганная пралир. гаэт/кин * (624) !к 16423) Т(3448) N |(2856? (13493)

Индекс стимуляции ; (СШ (81.6) Ц(1.7) й N 1 (43) | (36.7)

СЕзероточнио блжЗчЩгсяе 0 В 4 23 ¿7 13

РФ * О'Т с У I СТ У Е Т 1 '

* Средой уропечь еклгчикл изотопа " "

** ¡¡роцз-гг л;яд е сеэтветствуг;еи г,тле . с !!ши5-гигй злк сляторог в сшорстзю кропи.

Из таблицы видно, что для рабочих цехов с наибольией заболовае мостьп (3 и 5). а такте для цеха Н 1 характерно достоверное потаите уровня СДЗ+ и СД4+ лиздоцитов (общая популяция и субтгапулзция Т-хелпе-ров/индукторов), У рабочих цехов 2 и у "аторцх достоверно потаено •мело Т-лка;эцнтов в реакции Е-РОК, процент СДЗ+ клеток существенно не изменялся, что подтверхдает данные литературы об отсутствии параллелей кевд обозшченншэд показателями. При анали-е йркционалышх свойств ликфоцнтов обрапает на себя вниыание исклгмителыга высокая спонтанная (без китогена) пролярерация клеток у рабочих всех цехов, за ксклпчеш-см цеха 3. Индекс спонтанной проли}ерации (оп.звепие спонтанного уровня Екичепна кзиопа по участкам производства к аналогичному показателя контрольной группы) у рабочих цехов 1,2,4,5 составил, соответственно, 26,3: 5,5; 4,5 и 21,6, т.е. наибольше изменения, по-прежнеыу,определяется в цехах 1 и 5. Соответственна лредс.азленныи дшвш в этих цехах зарегл.|-р:з>ован л юиаеньгий индекс стиауляции в реакции Р6"'/1 из СГЛ. &щгсй хар-иерной особенностью 1-жумого статуса рабочих.всех цехов с суивдюнаяыих тестах аалаетеэ наличие в скворотке факторов, блокзэдр-за пршз^рациз аутологичных лгсг^оцнтов под влиянием Этот факт позволяет трактовать палу-гсиие даише. как показатель неб-яагоприяпш проазводствешых воздействий >а иицн-ща систем (в конт-ргтьной группе факт ры. блоклругцие п; элнферацга аутологичных лимфоцитов, отсутствовали). Сивко, наличие этих факторов на коррелирует с индексом епшуляцга под Влиашем СТА и со спонташой пролиферацией яафоцнтоз обследованных лиц.

йасо изменений параь-троа намунного статуса, в зависимости от контента с кшкргтшгз! химическими вещества®, показал, что длителымй щэдгводствентгй контакт с хгсвт^скгея вецествагя различной природы (сргаггсской. пеоргазг .¿скоЯ) вызызает соответствуйте изменения иа -мунгтета. но ни одно го вецеств не индуцировало ияенти'шых изменений.

Су-жруя данные о влиянии хлор- и фосфорорганических соединений, содерзззях в своеа ^остазе диоксин, ото закяпчить, что пом1-« енкхо-нмя количества (но не : кодя^их за пределы среднестатистических показателей > лейкоцггов, числа Т-лквфоцгтов, рышляекых в реакции Е-РОК и в проточной 1#тометрки с исполъзоза*кеа Ш к СДЗ н СД4 и пгчтения урозпЯ 1вС, для действия „гих вецеств на иимушда систему т.мкхе хар.1К-

терно резкое повшаение спонтанной пролиферации клеток периферической крови, понижение пролиферативноги ответа на ЧТО и наличие сывороточных блокирупих факторов.

Для выяснения связи между выявленными изменениями в иммунном статусе рабочих и их здоровьем мы сопоставили параметры иммунитета группы практически здоровых лвдей и лиц с тем или иным синдромом №. выявленные по данным анкетирования. Анализ показал, по из всех параметров значимыми оказались 3 - это индекс стимуляции в РЬТЛ. уровень ревматоидного фактора и наличие сывороточных факторов, блокирующих пролиферации аутологичных лимфоцитов под влиянием ФГй. У рабочих с ючекциощшм и аллергическим синдромами индекс стимуляции в РБТ/1 был достоверно ниже , чем у практически здоровых. Для группы обследованных с инфекционным синдромом характерно и значительное увеличение среди них лиц с наличием в сыворотке блокирующих факторов. Природа и свойства зтих-фак-тороз пока неизвестны. Неясна и их роль в патологии. Для группы лиц с сопутствующим заболевания»! характерно наличие в крови РФ. Вссыа важным гвляется установление связи наличия этого фактора с последущиа развитием у этих ладей аутоюшугошх процессов, Но всем остальным параметрам достоверных отклонений не зарегистрировано,включая секреторный 1ей для инфекциошшго синдрока и 1рЕ для аллергического синдрома.

Такиа обрлзои, на основании проведенных исследований можно заюш--чить, что утфщированшя лабораторная методология первичного иммунологического обследования пригодна для оценки икмушого статуса различных контингентов населения. Эту методология мопп применять не только для нденпфкации "грубых" изменений в иммунитете, но и для оценки влияния на него различных неблагоприятных экологических факторов, а также для прогнозирования развития заболеваний. Прюенение усовер-венстворадгой схемы оценки иммунного статуса значительно раскиряет возмошости изучения иммунной системы при воздействии иммунотропных згаоген!"« факторов. Эта ехги позволяет ползать высокоикформатданые характеристики функционального состояния ИКК, а также расвиренный спектр количесттвш параметров. вклгия все основные зшм иммунной системы - Г-звено, В-дано, фагоцитарши систему, а также растворимое факторы, тесно взаимосвязанные с .эдивдшналмым состоянием ИКК.

- «-выколи.

1 ЛЬ основе лабораторных тестоо I уровня унифицирована и адаптирована к условиях массовых обследований схема пврругвшй оценки иммунного статуса населе'мя, проведвая апробацию при проведении икмунозпидекиологи-ческнх работ в различных регионах страны.

2.Разработан капиллярный микрометод определения количества 1соуног-лобулинсв в Сиологичесгаи среди - "Иймунокап". апробирований при иассовах обследованиях. От стапельной осоОсююстъв ипсрояетода является возкоаюсть заготовки болыгих партий капилляров, готовых к 1жпользрва1сэ. достаточный уровень стандартизированностм, точности и простоты исполнения кикрометода.

3.Разработан спектрсфяоггетрическнй кикрокетод определетш актив 1юсти ваэейзего фервеита бактертгдаости сагоотов - оюлопероксида-за. .од алроГ-рслан в услов!!Я нассовых обследований и в клинической практаг Показано, что производственный контакт рабочих ¡¡ел-Ж2ского зазода с хлор- и сосфороргагичесюса! соединившая. содерзаяь

о своеа составе диошз!. сопровождается упгстеннеи активности .лого С^ркекта. Су^ествензш ¡:зт6и15'.а активности й!п зарегистрирована при первичных !ШС - хронической пип^еаатозтоЯ болезни. селективной годостато>5:ости 1[/\ ага5С4аглобулкнег'и,

4.Разработан спектркготокетрическкй кикрохето~ определена адгез!:и лейкоцитоз на поверхность пластика. Иикро^етод апробирован при еассо сих геглрюяог.. веют обелгдованых н в. кяюетгеской практике. Показано, что условия нг :оводства на заводе "Уралхккплает",г.Н.Тапм. • з 19.32 схуиез иодцирупт появление Ь крзв1 сбследовамюго К0нтгаге!гга рг5с?тч соктороз, гагибирупз« адгезия лейкоцитов здоровых доноров,

а в 9.32 случаев - Светлов. усилоагза адгезия лейкоцитов здоровых догчрпз. С использованием этого кикроиетода впепвае пясазлш спецк^ршская сенсибилизация лейкоцитов НИИ-юфадарованных лиц, выракгзазса в пг. 5кцк1 адгезвд зт -х клеток в присутствия синтетического пспти.'И, коппущего кгиунодежзенпгй ра>. !1 251-272 рр!20 1И1Н ь в стимуляция адгезии в присутствии синтетического пептида, ко-Гсфуг-его ЕгувдоЕикнпсй район 584-612 др41 Н11М.

5.Разработан кагшяяриый кикрокетод оценки хемотаксиса лейкоцитов. Использование микрокетода при оценке гезедвюго статуса контшгента рабо'ок завода "Уратааашст" г.Н.Тагил. показало, что условия производства на этом предоиятии в 43,7% случаев индуцирузт появлешт в крови обследованных рабода факторов. гагибируиэ« хемотаксис лейкоцитов здоровых доноров. С пойо^ье этого дикроиетода впервые показало. что синтетические пептидные котя имидаедомгавтых районов 251-272 и 423-450 оболоче'пгого бедга др120 1110-1 ингибирупт хемотаксис лейкоцитов НИИ-инфищфованшк лиц.

6.Для создания кетода оценки состшс-и системы естественной 15110-токсичности без использования радиоакишных изотопов разработан капиллярный кгафометод определения активности естественных киллеров. обладавший достаточна црсЕнеы точности и щтстати исполнения. вифометод апробирован в клинической практик при оценке юиушшго статуса больных ракой толстой гагаки и Гфостш герпесом, а такве при изучении эффектив-ьости виростатической и иимунокоррипфуяцей терапии гактквшои. зозирая-соа. гаизагероноа.

7.Разработан метод оценки РЫЛ ел аило-АГ клеток йод в сиезашой культуре. Кетод чозьоляет оценить процессы распознавания ККК адлознти-гааых детерминант клеток-стимуляторов, процессы пролиферации, а тахге процессы де',$форенцировки ЧКК по уровни продукции цитокинов в супсрна-танть.

8.Разработана и рекомендована к практическому использовании усо-вертнетвиангая схем глСораторм-га^рлолсгичеикого обследования населения, вкя^чг^ая е себя нов-'а кнкрометодн оцызз; ихадшого статуса.

Э.Уссвеоггнствованная схеиа оценки иьыунного статуса апробирована и подвергнута сравнительно^ анализу г. унифицированной схекой первичного иммучоло! ического обследовогсы при двукратной обследовании рабочих Целкоьляго зазодз. Показано, что эта схеьа и^еет су^ествешае преиау-цзстга 1;о сравнена с вш^ызировашой методологией, преаде всего, в отношении более веского спектра количествешых характеристик ККК, бкяэ-ш тег.т1фова!&;-' ^котила глоток в проточной цптехзтрни. а такса кгзчяя тестю, хара.чтер«зугз$х сдоздюсльнос постояла ЕЖ. Эти обстоятей.стп<1 пеззагягт получать байге дау&шада вдермфэ о

состоянии кмушой система и о характере изиенешй ее па^кетро» под шияниеа ксблагопрштних производственных Факторен-,

10.Хроническое производственное воздействие хлор- и фосфорорга:ш-ческих соединения, содерзазк в своем сости:е диоксин, сопровождается нзяепенкеи количества Ш и чх продуктов: Т-ясдощтов и 1« субпонуля-цй, В-л^оцмтоз, ^акздкглебулинеа'.сЛ, а такте угнетаг/еы ^штопального состоял 1!КК - - спнгениеи итрлжлроз фагоцитарной' акт;пз-ности, Р1Л71 на '.ТА. высоки;! ijpoEney спонтанней r!pon*^spai^2i я^тсцн-тов, кущхдеей 1ап:битир>кх сывороточных факторов.

П.Ппгзо ik^jühüto статуса рабочих jarcreciraro пронпеодства, ш основе усовершенствованной cxeso», в зависгаости от участков производства, скндро;я 13!. забалрваеьоети, а та^е производственного стаза плвзал несднозначш» кзнспегая исследованных пареяетроэ:

а) у рабочих всех укстков производства peí..стрируется достоверное D"2eir,n ypo¿iIgS у. Т-якфоцитов в реакц-ni Е-РО, хотя и находигчихся ч .-•родслзх ср^лнсстетксткчгских знзчежй нори. Это сбсточтегьсгса гсзя оСьааспь фзктоя скрапа Т-гггфаятов в цехах Н 1,2,3 и 4 преи-rt^screcis» за с:гт блокада,. а в цехе Я 5 тендишеЛ к росту «cuau .та! с гггсига aexai2c.*3tj пс:::~г!пы ц-'ин тесг/рус-.'М" Т-лк^яцатсз. Регистрируется пкскс:.1 июяснь спонтанной гдю.'ш^орецт т е ех учхпш прон:зодствэ. за исклиг ннсм цеха Í1 3. нжсньек-} индекс ст,»ч|1!Ягл1 в í'bTjl ¡п 'ГА »а этих se участи np¡ хгводства, »алтее в ш*ьроп® 5фС1-и рлбо'пк всех цехов акторов, блокирдзздх нро.с»?ерсзц:гз гутапопгЕгс; j^rroir-fTcn под влишиеа Я'Л, а та-ге cimzcir.e СДЗ» и СДН £?.лзцитез з цехах !i 1.'' и

б) в rp-jiRix рабочих с гакекцкапям fi аслергкчеша cnnposssf» с^г;":'рсз2;епл ir.) дгзавз* акзтрчовзю«. Сило нанбольгее гашггсеге»

с шп:г::ея в сетсротсгз сиктзров, блокирущ« пролиферации ауто-лаг лктиргтов под влилннея !.ТП, а такие н^'меньпЗ индекс cr/wj-вдз! в РБТЛ па СТА по сракгася с контрольной rpyrinort прагстнчесга здоряпдей. Э.,1 re группа харг: теркзовались изкенюми. члеттлшога ккупгтета (сн"~йп:еа ¡..ювня E-РОК. 3-PGK, СД4* клеть.>), а такта енч-соиея нроднкцз! IgS;

з) цгзлгйяя прс'.сгсдстееиюго стгга рабочих ссяропогдаетгч ростс-j количества достоверно кз.ене зых, в сторону ешхекэ. параметров ка

мушого статуса (E-PUK, M-POK, CffSt и Cfl4i лимфоцитов. lßG,left\ так«е возрастанием уровня заболеваемости этих лиц:

г) наибольшее количество измененных параметров иммунного статуса, в зависимости от заболеваемости, наблвдается в группе лиц с патологией дыхательных путей. Это касается СДЗ* и Wf клеток, а также уровня Iß6.

СШСОК РАБОТ. ШШБШОВПШШХ 110 ТЕИЕ ДИССЕРТАЦИИ,

1. Саидов Н.Э. Использование ацетат-целлюлозной мембраны в качестве основы для пассивной иммунодиффузии.// /Ьбораторное дело. 1996.й 8, 1.4ЭЗ-4Э5.

2. Саидов Н.З,,Копалъчук Л.В. Использование принципа серийных клеточных разведений для диагностики наруяений активгости естественных киллеров у человека.// Иммунология, 198G, N 4, с,76-78.

3. Саидов U.J., Ереюша О.Ф.. Кавун Е.П. Информативность тестов I уровня оценки иммунного статуса при иымуюзпидемиологичееккх исследованиях. //Республиканская научная конференция "Кймунодефициты и HLft-система". те*.докл., Гавкент.

4. Саидов И.3., Котова О.Й..Балаяов К.й,. Симонова A.B.. Толстов В.В. Комплексная оценка гаиужого статуса рабочих, контактирущнх с юиунотрогаши ксенобиотикам. Таы se, с.76-77.

5. Саидов U.3.. Симонова Й.В.. (¿реши О.Ф.. Балагоз К.П.. Толстов Ю.В., Баиун E.H.,-Пикзгин Б.5. Сравнительная оценка шмунного статуса рабо>!их различных участков химического производства. // Всесоюзная науч. конф. "Проблемы мониторинга за здоровьем населения проьыаленных городов", тез.докл.. Ангарск, 1989г. "зсть 2, с. 105-10?.

6. Саидов М.З.. Орадовская И.В.. Нартынов О..Котова О.Й.. Еремина О.Ф.. Кушов Й.В. Клинико-иммунологическая оценка состояния иммунной систем:: у рабочих химического производства.// ^Иммунология. 1390г.. N 5. с.36-41.

7. Садов М.З.,Еремиш ОА.Коннова З.В, Тестирование сывороточных блокирущнх факторов j рабочих металлургического производства.// Тез. конф. "Факторы гуморального и клеточного иммунитета при различных зиоинтгкскгос и патологических состояниях". Челябинск, 1990г., с Ш-127.

8. Саидов 8.3., Грипевич Й.С., Голубева Н.М. Иммуноэпидекишгаги-ческое обследование рабо»п<х, занятых на производстве химических средств защиты растений. // Всесопз. конф. "Экологические аспекты иммунопатологических состоя)мй", тез.докл.. Алма-Ата, 1 УУОг.. c.ttO HI.

9. Саидов Н.З., Пинегин Б.В.. Сидорова П.В., Андреем С.И., Борисова ft.У. Оценка клеточного геэдмтета у лиц, инфицироа.ипш МЧ-1.// Тез.докл. 1-ой Всесовз. конф. "Профилактика и борьба си СПИД н СССР", Ленинград. 1 УУОг.. п.09-70.

10. Saidov M.Z., Pinegin B.U., BorisovaA.il.. llmlieev УМ. The study of cellular imiriity of llUJ-infected people.// Sixth Int. Conf.of AIDS. San-Francisco, California, USA. 1490.v.3 p.lSB, S.A.306.

11. Saidov H.Z., Pinegin B.U., Ereaina O.F., tunes I..11.. llutakov A.A.,Yarcev M.H. Tlie estimate of infornativiti of Methods at rosplex research of phatjocytar part of issuniti. flbsti'acts я'и.шшг:!ear phagocyte systen in norcal and pathological stat.es.// lilt-Union Synposius uit.h participation of' foreing scientists. Nuvusibii :'k, 1990, p. 122-123.

12. Пинегин П.В., Орадовская И.В.. Саидов М.З.. Кргши О.Ф., Симонова fl.В., Котом 0.П. Методология оценки иммунного статуса населения.// Тез. респ. конф. "Экология и иммунитет". Горький, 1990 г., с.120-121.

13. Пинегин Г).В.. С.адов Й.З., Ерекина О.Ф.. Борисом O.K. Сывороточные блокируете {акторы при ВИЧ-инфекции.// Гез. докл. 1-ой ВсесоЕг». конф. "Профилактика и борьба со СПИЛ в СССР", Ленинград,

1990г..с.0/ (Ш.

И. Liiuuu M.J., ILiHLimi.li.lt., Бирисива A.M.. Андреев С.И.. Сидорова М.В.. X 1ИТов Р.И. Изучение систояния клеточного иммунитета у IIIU-1 Ki4HiiSipoi).iiiHwx лиц.// Sypnui микробиологии, эпидемиологии, иаау-нологии, 19911 . N 2. (..;:3 2!i.

15. Саидов М.,1.. I hmci II.А., Урцев Н.Н., Мальцева II.П., Еремгаа О.Ф., Вкарупета М.А., Бутиков А.Л., Пинегин Б.В. Комплексное исследование фагоцитарного иммунитета при первичных иммун0де^и|итных состояниях.// Яурнал микриоиилогии, эпидемиологии. иммунологии. 1991г. N 5, с.44 17.

И* (.мидии Ii. )., Пинегин Б.В. Спектрофптоыетрический способ опреде ленич мкт№'1|||(ли миалопероксидазы в фагоцитирущих клетках.// Лабораторное дело, 1991г., N 3, с.56-60.

I/, Саидов И.il. Черноусое Й.Д., Оганезов В.К., Пинегин Б.В. Разработка метода оценки пролиферативной активности и продукции цитокинов 1И алло -антигены клеток Ragi.// Тез. докл. I Республ. сьезда иммуно-лт ив и аллергологов Узбекистана, 1391г., с.119-120,

18. Пинегин Б.В., Саидов Н.Э., Еремина О.Ф.,Борисова fl.П.,Хаитов Р.И. Ипгибиторные факторы в сыворотке больных со ШЩ-ассоциированым комплексом.// 1урнал микробиологии, эпидемиологии, иммунологии, 1331г., N 2. с.26-27.

19. Бакуев K.M., Саидов К.З., Бутаков fi.fi. Особенности секреции ми-елопероксидазы и хемилхминзсцентного ответа нейтрофилов человека при контакте со стимуляторами различной природы.// Имаднология. 199iF.N 1. с.15-17.

20. ßiaitov R.H..Pinegln B.U.,Saidou H.Z.,ßndreev S.H. Cellular iBsunity investigation in HIO-1-infected patients using gpi20 and gp41 synthetic peptides.// XIU Int. Cong, fillergol. and Clin.Issun. 1991, Oct.13 18, p.170, N 312, Kyoto, Зарап.

21. Борисова fl.П., Алкеева А.Б., Саидов Н.З..Пинепш Б.В., Черноусой fl.Д..Семенова Т.Б.Джукиго П.й. Роль системы естественной цито-токсичности в ишунопатогенезе рецидавирупчей герпетической инфекции и влияние юлгушыодуляторов на кяшшко-шаунологический статус.// Иммунология, 1991 г..N.6,с.60-63.

PP., Польнгр ft.ß., Власов fl.fi.,Сссгкин М.Ю..Саидов Х.З.,Голубева II.У. Изучение действия хлор- и фосфорорганических соединений на продубил [(¡Е в эксперименте и при гаагдаозпидемиологических исследованиях . // Иммунология, 1391 г., H 4, с.31-34.

23. Мартынов П.И. .Саидов Ï.3. Анализ динамики иммунного статуса в услогиях производства химических средств зациты растений.// Тез.докл. I Рог.пцб. съезда игоунологов и- аллергологов Угзбекистши, Таикент, Г.!!Нг.с.Я1 «2.