Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Культура клеток кожи в дифференциальной диагностике базальноклеточного рака и его лечении

На правах рукописи

од

/ 2 ДЕК 1ЯС7

г

ДАВЫДОВА Ирина Леонидовна

КУЛЬТУРА КЛЕТОК КОЖИ В ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКЕ БАЗАЛЬНОКЛЕТОЧНОГО РАКА И ЕГО ЛЕЧЕНИИ

14.00.11 - кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва -1997

Работа выполнена в Московском областном научно-исследовательском клиническом институте

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

В.А. Молочков

доктор биологических наук

В.В. Терских

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

В.А. Самсоко!

доктор биологических наук, профессор

В.Я. Бродский

Ведущее учреждение:

Российский университет дружбы народов

Защита диссертации состоится 24 декабря 1997 г. в 12 часов на заседании специализированного совета Д 074.10.01. при Центральном научно-исследовательском кожно-венерологическом институте Министерства здравоохранения РФ по адресу: 101076, Москва, ул. Короленко, 3.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Центрального научно-исследовательского кожно-венерологического института МЗ РФ

Автореферат разослан ноября 1997г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

кандидат медицинских наук Н.К. Иванова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Базальноклеточный рак (БКР) кожи или базалиома является одной из наиболее часто встречающихся опухолей кожи [Курдина М.И. с соавт.,1992; Шумай Н.И., 1993; Boring СС et al., 1991; Weinstock MA, 1994]. Традиционно БКР занимает третье место по частоте среди всех опухолевых заболеваний (после рака желудка и легких), а среди злокачественных эпителиальных новообразований кожи составляет от 75 до 90% [Dahl Е et al.,1992; Preston DS, Stern RS, 1992]. Чаще БКР характеризуется относительно доброкачественным течением, в разной степени выраженным месгнодеструирующим ростом и редким метастазированием [Апатенко А.П., 1973; Miller S.J.,1991; Goldberg L.N.,1996]. В то же время данная опухоль имеет способность рецидивировать, при этом частота ее рецидивирования варьирует от 1 до 39% в зависимости от используемых методов лечения первичного очага поражения [Кусов В.В.,1990; Silverman М.К. et al.,1991]. В то же время рядом авторов отмечена тенденция роста заболеваемости БКР [Karagas M.R.,1994; Maia M. et al.,1995; MillerD.L.,1994], Актуальность проблемы обусловлена также недостаточной изученностью вопросов этиологии и патогенеза данного новообразования и необходимостью повышения эффективности лечения[Г1исклакова Т.П., Ильин И.И..19Э0; Motley R.J. et al.,1995; Roenigk R.K. et al.,1986 ]. Для изучения особенностей гисто- и патогенеза БКР, оценки воздействия противоопухолевых агентов и исследования других медико-биологических аспектов необходимо моделирование БКР вне человеческого организма.

С разработкой методов культивирования клеток вне организма появилась возможность использовать клеточные культуры для исследования проблем канцерогенеза, морфогенеза, дифференцировки и пролиферации клеток, изучения действия тех или иных средств на физиологические и кинетические параметры клеток, скрининга лекарственных препаратов и для некоторых друтх проблем клеточной биологии [Скрипкин Ю.К. с соавт.,1994;- Васильев А.В. 1993; Bouclier M. Et al.,1990]. Получение культуры первичных кератиноцитов позволило решать многие проблемы патогенеза кожных заболеваний, пренатальной диагностики ряда генодерматозов, задачи

практической дерматологии и тканевой инженерии [Мордовцев В.Н. с соавт., 1988]. В настоящее время методы культивирования эпидермальных кератиноцитов хорошо разработаны [Терских ВВ., Васильев A.B.,1995; Rheinwald J.G., Green Н.,1975,1977].Кроме того, получено большое количество перевиваемых клеточных линий из эпителиальных опухолей человека [Fabricant R.N. et al., 1977; Rheinwald J.G., Beckett M.A.,1981]. Базалиома в этом смысле является исключением. Число работ по изучению БКР в культуре весьма ограниченно, что связано с трудностями, возникающими при переносе биопсийного материала в условия культуры [Asada M. et al.,1992; Brysk M.M. et al.,1992]. Многие попытки выращивать клетки БКР в культуре оканчивались неудачей или получаемые культуры не могли быть с уверенностью идентифицированы как «базалоидные» из исходной опухоли [Bradbeer M. et al.,1988; Hernandez A.D. et al.,1985]. В отдельных работах описаны некоторые морфологические , кинетические и гистохимические параметры клеток БКР in vitro. Была также сделана попытка использования культуры клеток БКР в качестве тест-системы для исследования действия интерферона-альфа и интерферона-гамма на рост опухолевых клеток [Brysk M.M. et al.,1992].

Между тем, культура клеток исследуемой опухоли может служить хорошей моделью для оценки антипролиферативного эффекта тех или иных противоопухолевых агентов [Boucler M., 1990] Тестирование лекарственных средств на клеточных культурах является более чувствительным, быстрым и дешевым методом, чем использование с этой целью лабораторных животных [Мымрина И.А. с соавт, 1992]. Кроме того, накапливающиеся результаты клинических и экспериментальных исследований показывают, что опухоли даже идентичной морфологии часто в разной степени чувствительны к действию цитостатических препаратов. Поэтому чрезвычайно важным является развитие методов для подбора «направленной» химиотерапии, специфичной для данной опухоли и данного пациента.

Цель настоящей работы: разработать новые подходы к совершенствованию дифференциальной диагностики и лечения БКР кожи на основе использования культуры клеток.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи исследования:

1. Разработать метод полумения и культивирования клеток БКР in vitro.

2. Изучить ультраструктуру клеток БКР в культуре.

3. Оценить возможность использования культуры клеток для дифференциальной диагностики различных форм БКР на ультраструктурном уровне.

4. Разработать модель тестирования противоопухолевых препаратов в культуре клеток БКР.

5. Провести сравнительное изучение действия проспидина, циклофосфана и гаммаферона на пролиферацию клеток в культурах БКР, перевиваемой линии эпидермоидной карциномы А-431 и эпидермальных кератиноцитах, выделенных из кожи здоровых доноров.

6. Оценить возможность использования культуры клеток БКР для индивидуального подбора противоопухолевых препаратов.

Научная новизна исследования:

Впервые разработан метод получения культуры клеток БКР из биопсийного материала больных и использованы методы культивирования клеток БКР в средах с разным содержанием ионов кальция.

Описаны особенности поведения клеток БКР in vitro в различных условиях культивирования. Проведено сравнение с культурой эпидермальных кератиноцитов, выделенных из кожи здоровых доноров и культивируемых в аналогичных условиях, по морфологическим параметрам и скорости роста.

Изучены ультраструктурные особенности клеток в культурах БКР с разным типом клеточной дифференцировки. Показана возможность использования электронно-микроскопического исследования культуры клеток для дифференциальной диагностики опухолей и оценки эффективности различных методов лечения.

Впервые проведена сравнительная оценка воздействия противоопухолевых препаратов (проспидина и циклофосфана) и иммуномодулятора ( гаммаферона) на пролиферацию клеток в культурах БКР, эпидермоидной карциномы А-431 и эпидермальных кератиноцитах выделенных из кожи здоровых доноров.

Впервые показано, что проспидин и циклофосфан значительно сильнее ингибируют пролиферацию опухолевых клеток в культурах БКР и

эпидермоидной карциномы, чем эпидермальных кератиноцитов человека, выделенных из кожи здоровых доноров. Обнаружено усиление ингибирования пролиферации опухолевых клеток в культуре при совместном применении цитостатиков и гаммаферона.

Показана корреляция между антипролиферативным действием проспидина в культуре клеток и его противоопухолевым клиническим эффектом. Обоснована возможность использования культур клеток БКР, полученных из биопсийного материала от конкретных больных, для предварительного отбора эффективных препаратов.

Практическое значение:

Разработанная клеточная система позволяет проводить предварительную оценку перспективных противоопухолевых препаратов с целью их дальнейшего внедрения в клиническую практику.

Полученные результаты по совместному действию проспидина и гаммаферона на пролиферацию опухолевых клеток позволяют рекомендовать их комплексное использование в клинической практике для лечения различных форм БКР.

Культивирование клеток от конкретных больных дает возможность индивидуального подбора и прогнозирования клинической эффективности противоопухолевых препаратов, сокращению сроков лечения за счет подбора курсовых доз, уменьшению числа рецидивов, позволит избежать развития осложнений от применения больших курсовых доз цитостатиков и возникновения устойчивости к ним.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработан метод получения культур клеток БКР из биопсийного материала больных и культивирования в средах с различным содержанием ионов кальция. При культивировании в среде с низким содержанием кальция (0,1мМ) клетки БКР не образуют многослойную структуру и обладают более высоким пролиферативным потенциалом, что делает такую культуру удобной для проведения различного рода исследований.

2. В условиях in vitro клетки БКР сохраняют основные морфологические и пролиферативные параметры , свойственные клеткам БКР в организме.

Однако, клетки первичной культуры БКР отличаются по морфологии и скорости роста от культуры клеток эпидермальных кератиноцитов, выделенных из кожи здоровых доноров и культивируемых в аналогичных условиях.

3. В условиях культуры клетки БКР сохраняют тканеспецифические и цитоспецифические признаки, присущие клеткам опухоли в состоянии in vivo.

4. Созданная клеточная модель БКР позволяет в условиях in vitro проводить оценку действия противоопухолевых препаратов по степени угнетения ими пролиферации клеток данной опухоли. Использование эпидермальных клеток разной степени трансформации дает возможность в полной мере оценить антипролиферативный эффект препаратов и осуществить предварительный отбор перспективных лекарственных средств с целью их дальнейшего внедрения в клиническую практику для лечения различных форм БКР.

5. Предложено использование культур клеток БКР , выделенных из биопсийного материала конкретных больных , для индивидуального подбора противоопухолевых препаратов, прогнозирования их клинической эффективности и корректировки курсовых доз цитостатиков.

Апробация работы:

Материалы диссертации доложены на VII Российском съезде дерматологов и венерологов (Казань, 1996г.), на научно-практической конференции, посвященной 75-летию ЦНИКВИ (Москва, 1996г.), на XVII научно-практической конференции дерматологов и венерологов Хабаровского края (Хабаровск, 1996г.), на Республиканском научном симпозиуме «Пролиферативные заболевания кожи» (Москва, 1996г.), на заседании Московского городского научного общества дерматологов и венерологов (Москва,1997г.)

Структура диссертации:

Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, иллюстрирована

56 рисунками, 18 таблицами. Библиографический указатель включает 62 отечественных и 133 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Работа выполнена на основании клинического обследования и экспериментального изучения биопсийного материала 56 больных БКР кожи, в том числе 5 больных с рецидивами данного заболевания. Обследование больных проводилось в отделении дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ и в Московском областном кожно-венерологическом диспансере. В каждом случае диагноз заболевания ставился на основании анамнестических сведений, клинической картины патологического процесса, результатов цитологического и пзтоморфологичеекого исследований, которые проводились в цитологической лаборатории и отделении патоморфологии МОНИКИ.

Вся экспериментальная культуральная работа была проведена на основе использования материала 82 биопсий БКР кожи. Для разработки методов культивирования клеток БКР в средах с высоким и низким содержанием кальция были использованы 38 биоптатов. Изучение действия препаратов (проспидина, циклофосфана, гаммаферона) с использованием метода авторадиографии проведено на 44 биоптатах различных форм БКР. 20 больным проводилось изучение индивидуальной чувствительности опухолей к проспидину. В качестве контроля использовали операционный материал нормальной кожи 6 лиц, полученной из оперблока подразделений МОНИКИ.

Работа по культивированию клеток проводилась в Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, в лаборатории проблем клеточной пролиферации под руководством д.биол.н. В.В. Терских.

Выделение и культивирование нормальных эпидермальных кератиноцитов (ЭКЦ) человека. Биоптаты кожи брали у здоровых пациентов в ходе косметических хирургических операций в стерильных условиях операционной, помещали в стерильный раствор Хэнкса, содержащий 500 ед/мл пенициллина и 0,25 мг/мл стрептомицина и транспортировали в лабораторию. Непосредственно перед обработкой биоптаты тщательно

промывали в растворе Хэнкса, содержащем 2000 ед/мл пенициллина и 1 мг/мл стрептомицина. Фрагменты кожи размером 5-10 мм2 или более длинные полоски помещали в 0,25%-ный раствор трипсина и инкубировали при 4°С в течение 16-20 часов. Затем эпидермис отделяли пинцетом от дермы по линии базальной пластинки и кусочки пипетировапи для выделения ЭКЦ. Для более полного выделения ЭКЦ проводили дотрипсинизацию кусочков в 0,125%-ном растворе трипсина в течение 10 минут при температуре 37°С. Действие трипсина останавливали добавлением 2% эмбриональной телячьей сыворотки. После получения суспензии ЭКЦ клетки осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 минут. Культивирование нормальных ЭКЦ проводили в среде DMEM/F12 с ростовыми добавками. Посуду сорбировали коллагеном I типа.

Получение коллагена и сорбирование им культуралькой посуды.

Коллаген 1 типа получали из сухожилий хвостов лабораторных крыс. После ампутации хвосты погружали в 70%-ный этанол на 1-2 часа. В стерильных условиях, с помощью пинцета и ножниц, отделяли сухожилия и помещали их в раствор уксусной кислоты 1.1000. на 1 литр раствора кислоты и использовали сухожилия от 10 хвостов. Экстракцию коллагена проводили 48 часов при 4° С. Раствор центрифугировали при 250Q об/мин 2 часа при 4° С. Супернатант сливали в стерильную посуду и хранили при 4°С. Для сорбирования культуральной посуды раствор коллагена заливали в флаконы, инкубировали 20 мин при 37°С, затем коллаген сливали, а флаконы 2-3 раза промывали раствором Хэнкса.

Тестирование лекарственных препаратов в культурах БКР и нормальных ЭКЦ. Клетки БКР и нормальные ЭКЦ получали, как описано выше. На 5 сутки культивирования среду меняли на MCDB 153 с добавлением эпидермального фактора роста (10 нг/мл, Sigma), инсулина (5 мкг/мл, Sigma), трансферрина (5 мкг/мл, Sigma.), селенита натрия (5 мкг/мл, Sigma), гидрокортизона (0,5 мкг/мл, Sigma), изопротеренола (10"6 М, Sigma), этаноламина (0,1 мМ, Sigma), бычьего сывороточного альбумина (0,25%, Sigma), фактора роста фибробластов (5 нг/мл, Sigma). Через 48 часов вносили исследуемый препарат. Одновременно добавляли 3Н-тимидин (1 мкКи/мл; уд.

акт. 48,6 Ки/Моль). Через 24 часа клетки дважды промывали раствором Хэнкса и фиксировали в 70%-ном этаноле в течение 2 часов при 4°С.

Авторадиография клеточных культур. Фиксированные препараты промывали в 96%-ном этаноле и высушивали. Затем покрывали фотоэмульсией типа М и экспонировали в темноте в течение 30 суток. Проявляли в растворе типа Д-19 при 18°С в течение 10 мин. Затем выдерживали в 40%-ном растворе гипосульфита натрия в течение 15 мин, тщательно промывали проточной, а затем дистиллированной водой. В некоторых случаях препараты окрашивали гематоксилином.

Тестирование лекарственных препаратов в культурах базальных ЭКЦ. После выращивания пласта ЭКЦ культуру в течение 3 дней инкубировали в среде FAD без Са2+, сыворотки и митогенов, в результате чего супрабазальные клетки отделялись и их можно было удалить. После этого в культуры вновь вносили полную питательную среду вместе с изучаемыми препаратами и 3Н-тимидином сроком на 48 часов, после чего клетки дважды промывали раствором Хэнкса и в течение 10 минут дважды промывали 3%-ным раствором холодной трихлоруксусной кислоты. Клетки лизировали в 0,1 N NaOH и вносили в сцинтилляционную жидкость. Радиоактивность включившегося эН-тимидина определяли на счетчике.

Тестирование лекарственных препаратов в культуре эпидермоидной карциномы человека А-431. Клетки А-431 культивировали в среде Игла (Производство Института полиомиелита и вирусных энцефалитов) с 10% эмбриональной телячей сыворотки (НПФ «Биолот»), Для тестирования лекарственных веществ клетки снимали обработкой трипсином и раствором Версена (1:2) и высевали в пластиковые 24-луночные планшеты (Nunc) в концентрации 40 тыс. клеток/мл. Через 24 часа среду меняли на среду Игла без сыворотки. Через 72 часа вносили среду Игла с 10% сыворотки, одновременно добавляли исследуемые препараты и 3Н-тимидин. Через 48 часов клетки обрабатывали, как описано выше для базальных ЭКЦ.

Культивирование фибробластов из очагов БКР и от здоровых доноров. Фибробпасты культивировали в среде Игла с 10% эмбриональной телячей сыворотки. Смену среды производили регулярно через 3-4 дня в

зависимости от интенсивности роста культуры. После достижения конфлуентного слоя клетки снимали обработкой трипсином и Версеном (1:2) в течение 5-10 минут. Суспензию клеток готовили в концентрации 5x103 в 1 мл среды и рассевали в культуральные флаконы.

Электронно-микроскопический метод исследования культуры клеток БКР. Изучение особенностей ультраструктуры культуры клеток БКР проводилось совместно с ведущим научным сотрудником, д.биол.н. Смирновой Е.А. в лаборатории гистохимии и электронной микроскопии отдела патологической анатомии опухолей человека НИИ клинической онкологии Онкологического научного центра РАМН. Подготовка материала проходила стандартным методом: фиксация в глютаральдегиде с фофиксацией в осмиевой кислоте, обезвоживание в спиртах восходящей концентраций и заключение в смесь эпоксидных смол (ЭПОН-812). Ультрэтонкие срезы готовились на ультратоме ЛКБ-Ш (Швеция), контрастировали уранилацететом и цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе ¥ЕМ-1200-ЕХ-П (Япония).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Под нашим наблюдением находилось 56 больных БКР кожи, в том числе 5 больных с рецидивами опухоли. В группе обследованных больных 45 имели единичные очаги поражения, 11 - множественные. Возраст пациентов варьировал от 33 лет до 81 года (средний возраст - 62 года). Среди больных женщины преобладали над мужчинами (32 женщины и 24 мужчины). У подавляющего числа обследованных нами пациентов (55,4%), опухоли существовали от 1 года до 6 лет. Изучение клинических проявление показало, что в нашем исследовании преобладали больные с опухолевыми формами БКР(53,6%), реже встречались поверхностный(16,1%), язвенный(10,7%), склеродермоподобный БКР(8,9%) и сочетание поверхностных, язвенных, опухолевых форм (10,7%) у больных с множественными очагами. Локализовались опухоли как правило на открытых участках кожного покрова, преимущественно на лице. В соответствии с Международной клинической

классификацией TNM большая часть очагов базалиом имела размер до 2 см (Т1) (71,9%), реже встречались очаги величиной от 2 до 5 см (Т2) по максимальному диаметру (24,4%) и более 5см (ТЗ) (3,7%). Для уточнения и подтверждения клинического диагноза мы проводили гистологическое исследование. Диагноз ставили на основании выявления типичной морфологической картины БКР. Среди исследуемых нами опухолей чаще всего встречался солидный тип (59,7%), реже - солидно-аденоидный (14,5%), аденоидный (11,3%), тип «морфеа» (9,7%) и поверхностный (4,8%). Таким образом, в спектр нашего исследования вошли больные с разными клиника-морфологическими формами БКР, первичными и рецидивными опухолями, единичными и множественными очагами поражения, что может служить основанием для объективного анализа результатов специальных исследований и оценки эффективности предложенных нами экспериментальных методов.

На основе техники культивирования нормальных ЭКЦ человека [Rheinwald J.G., Green Н.,1975] и б результате длительного подбора условий культивирования клеток БКР нам удалось разработать оригинальную модель выращивания клеток данной опухоли и использовать ее для изучения влияния лекарственных препаратов на физиологические параметры клеток для оценки их противоопухолевого действия. Мы получали хорошо растущие культуры БКР в 90% случаев. При этом при культивировании е среде DMEM/F12 (с физиологическим содержанием кальция) клетки сохраняли характерные морфологические и пролиферативные параметры, свойственные базалиоме в организме. Однако, они отличались по морфологии от нормальных эпидермальных кератиноцитов человека и имели более низкую скорость роста. Клетки росли компактно, часто наползая друг на друга. Клеточные ядра и ядрышки сильно варьировали по форме и размеру. Продолжительность жизни таких культур достигала 30-40 суток. Нам удалось проводить пассирование первичных культур БКР, на что в литературе имеются единичные указания [Brysk М М. et al., 1992].

Для получения монослойных культур БКР нами использован метод культивирования в среде с пониженным содержанием кальция [Воротеляк Е.А. с соает, 1996]. Данный метод был впервые применен нами для культивирования клеток БКР. С целью получения монослойных культур, мы

инкубировали клетки БКР в среде MCDB 153 (содержание ионов кальция 0,1 мМ) с добавлением бычьего сывороточного альбумина и ростовых добавок. В этом случае клетки не только не образовывают многослойных структур, но и обладают более высоким пролиферативным потенциалом, что делает такую культуру удобной для проведения разного рода исследований.

Таким образом, нами были разработаны два оригинальных метода устойчивого получения первичных культур БКР из биопсийного материала. Также нам удалось получить чистую культуру фибробластов из окружающей опухоль БКР стромы. Использование таких культур позволит изучать эпителиально-мезенхимальное взаимодействие в ходе возникновения и развития БКР, а также поможет выяснить характер изменений в строме, происходящих непосредственно в очаге опухоли [Hernandez A.D. et ai, 1985].

Для идентификации клеток мы изучили ультраструктурные особенности первичных культур, полученных из базалиом преимущественно солидного строения , базалиом с аденоидной и смешанной дифференцировкой . Для сравнения нами также были исследованы электронно-микроскопические особенности клеток первичной культуры, полученной из опухоли плоскоклеточного рака с нечетким ороговением. В культуре клеток солидных базалиом в результате электронно-микроскопического исследования было обнаружено две группы клеток: первую группу составили опухолевые клетки с определенными ультраструктурными признаками дифференцировки в направлении эпидермиса или придатков кожи. Сюда вошли клетки с ультраструктурными признаками тканеспецифической дифференцировки по типу плоского эпителия, сальных и потовых желез, волосяных фолликулов, шиловидных и зернистых кератиноцитов, меланоцитов. Вторую группу составили клетки, лишенные признаков специфической дифференцировки (недифференцированные клетки). Те минимальные ультраструктурные признаки кератиноцитов, которые выявлялись в дифференцированных и в части недифференцированных опухолевых клеток (тонофибриллы, десмосомы, меланосомы) придавали сходство с базапьными клетками эпидермиса. В пределах одной культуры могли встречаться клетки с признаками различных типов дифференцировки (клетки «химеры»).

Соотношение дифференцированных и недифференцированных клеток в пределах одной культуры могло значительно варьировать.

Суммируя изученные нами ультраструктурный признаки, мы пришли к выводу, что в условиях культуры клетки базалиомы сохраняют присущие данной опухоли in vivo ткане- и цитоспецифические признаки в зависимости от типа дифференцировки клеток, что в свою очередь может быть использовано для дифференциальной диагностики опухолей, служить одним из критериев характера воздействия противоопухолевых препаратов на клетки в условиях in vitro, а также может использоваться в качестве ультраструктурного прогностического признака эффективности проводимого лечения.

Разработка новых методов лечения базалиомы и предварительная оценка их эффективности является актуальной проблемой современной дерматоонкологии. В оригинальных клеточных моделях мы изучили действие проспидина - цитостатического препарата, применяемого для лечения базалиомы, и препарата из группы интерферонов - гаммаферона. В исследования был включен также циклофосфан - лекарственный препарат, обладающий широким цитостатическим действием. Он использовался нами как препарат сравнения, так как известно его антипролиферативное и противоопухолевое действие не только в условиях in vivo, но и in vitro [Twentymen Р.К et al., 1992]. Антипролиферативное действие лекарственных препаратов было изучено в первичных культурах клеток БКР и ЭКЦ человека от здоровых доноров, в базальных ЭКЦ человека, а также в перевиваемой клеточной линии эпидермоидной карциномы человека А-431.

Для исследования антипролиферативного действия препаратов непосредственно на клетки БКР применялась разработанная нами клеточная методика культивирования клеток опухоли, в основе которой находился метод стимуляции пролиферации эпидермальных кератиноцитов [Воротеляк Е.А. с соавт., 1996]. Данный метод получения первичных культур БКР в сочетании с методом авторадиографии [Епифанова О.И.,1977] позволяет предварительно изучать антипролиферативное действие различных веществ по степени угнетения ими синтеза ДНК в культуре клеток БКР. Используя эту модель, мы показали, что внесение проспидина в концентрации 1 мг/мл в культуры нормальных эпидермальных кератиноцитов приводило к снижению процента

меченых клеток до 62,42+0,08% по сравнению с 77,2+0,8% меченых клеток в контрольных культурах , то есть на фоне действия проспидина происходило снижение количества меченных клеток на 10% ( р <0,05) по сравнению с контролем. В то время как в культуре БКР проспидин вызывает уменьшение доли меченых клеток с 56,7+1,02% до 32,3+1,09% на фоне действия препарата, то есть снижение интенсивности включения метки клетками БКР в присутствии проспидина происходило в среднем на 20% (р<0,05). Циклофосфан оказывал подобное проспидину действие в культурах нормальных эпидермальных кератиноцитов и культурах БКР. Совместное применение цитостатиков и гаммаферона в культурах эпидермальных кератиноцитов вызывало снижение интенсивности метки на 10-13% (р<0,05). Клетки БКР оказались более чувствительными к антипролиферативному действию гаммаферона. Включение метки в его присутствии падало на 15% (рО,05), а при совместном применении с цитостатиками - до 30%(р<0,05). Таким образом, мы показали, что проспидин обладает специфическим действием в отношении клеток БКР. Кроме того, мы обнаружили усиление цитостатического эффекта проспидина в присутствии гаммаферона в первичных культурах БКР, по сравнению с нормальными кератиноцитами, что дает основание предложить дальнейшее совместное использование этих препаратов в клинической практике.

Предполагается, что БКР развивается из медленно пролиферирующей стволовой клетки эпидермиса [Miller S.J., 1991]. Морфологически эпителиальные клетки из очага БКР очень сходны с базальными кератиноцитами. Мы изучили действие исследуемых лекарственных препаратов на синтез ДНК в базальных кератиноцитах, используя метод получения базального слоя эпидермиса в культуре [Васильев А.В., 1993; Васильев А.В, Терских В.В., 1994]. Внесение в культуру базальных кератиноцитов проспидина в концентрации 1мг/мл вызывало ингибирование синтеза ДНК до 70% (р<0,05) от контрольного уровня. Циклофосфан слабее подавлял включение меченного тимидина (84% (р<0,05) от контроля). Гаммаферон значительно подавлял синтез ДНК в концентрациях - 100, 500 и 1000 ME. При совместном применении проспидина или циклофосфана с гаммафероном в концентрации 50МЕ происходило незначительное усиление

ингибирующего действия препаратов. В гораздо более значительной степени происходит ингибирование синтеза ДНК в клетках эпидермоидной карциномы А-431, которую мы использовали как модельную культуру трансформированных эпителиальных клеток. Проспидин в концентрации 1,0мг/мл ингибировал пролиферацию клеток А-431 до 60% (р<0,05)от контроля, а циклофосфан в аналогичной концентрации - до 75% (р<0,05) от контрольного уровня. При совместном применении цитостатиков и гаммаферона происходило выраженное усиление ингибирующего влияния в культуре.

Таким образом, изученные цитостатики, самостоятельно и в комбинации с гаммафероном, обладают высокой специфичностью по отношению к опухолевым клеткам, какими являются клетки БКР и эпидермоидной карциномы, в то время как их ингибирующий эффект в культуре нормальных эпидермальных кератиноцитов выражен слабее.

Проблема химиотерапии и индивидуального подбора противоопухолевых препаратов для лечения наиболее тяжелых форм БКР остается актуальной [Motley R.J. et al.,1995; Karagas M.R.,1994], Устойчивое получение культур БКР из биопсийного материала больных позволило разработать методику индивидуального подбора лекарственных препаратов и назначаемых курсовых доз для каждого конкретного больного. Мы сопоставляли полученный антипролиферативный эффект проспидина на рост опухолевых клеток в культуре с его клинической эффективностью. Под нашим наблюдением находилось 20 больных с различными клинико-морфологическими формами БКР кожи. По результатам действия препарата на культуру клеток, выделенную из биопсийного материала конкретного больного, проводили лечение этим цитостатиком с последующей поверхностной криодеструкцией очага. В качестве контроля использовалась группа больных из 130 человек, получавших лечение проспидином без предварительной оценки его эффективности in vitro.

Среди 20 больных БКР кожи было 12 мужчин и 8 женщин в возрасте от 33 до 78 лет (средний возраст 60 лет). 10 пациентов имели единичные и 10 множественные очаги. У 3 больных с солитарными образованиями имелись рецидивы БКР. Во всех случаях диагноз БКР ставился на основании клинико-анамнестических данных и подтверждался результатами гистологического исследования. Наблюдалось преобладание пациентов с опухолевой формой

БКР - 10 (50%) человек, в меньшей степени были представлены больные с поверхностной формой БКР - 6(30%), склеродермоподобной - 3(15%), язвенной -1 (5%) человек. Исследуемые опухоли чаще имели солидное строение (50%), реже - солидно-аденоидное (15%), тип «морфеа» (20%), мультицентрический (10%) и аденоидный (5%). После проведения исследования для определения чувствительности клеток 20 опухолей от изучаемых пациентов были получены следующие результаты: в 14 случаях наблюдался высокий процент ингибирования пролиферации клеток в культуре на вторые сутки после внесения препарата (в среднем на 20-40%), в 4 случаях - на 10-20%, у 2 больных ингибирование синтеза ДНК в клетках исследуемых опухолей было выражено слабо (менее 10%). В нашем исследовании по результатам тестирования проведение проспидинотерапии было признано нецелесообразным в 2 случаях, когда клетки БКР из биопсий практически не замедляли рост после внесения препарата в культуру. В остальных случаях было проведено комплексное лечение проспидином с индивидуальным подбором курсовых доз с учетом чувствительности клеток опухоли к ингибирующему действию препарата. Отдаленные результаты прослежены у всех больных в сроки от 6 месяцев до 3 лет. Всем пациентам проводился цитологический или гистологический контроль за результатами лечения. У 18 больных, получавших лечение проспидином с предварительной оценкой его антипролиферативного действия in vitro, рецидивы БКР в эти сроки не наступали. У 22(16,9%) из контрольной группы больных, получавших лечение проспидином без предварительной оценки его активности в культуре имели место рецидивы опухоли. Эти данные свидетельствуют о том , что результаты, получаемые в культурах БКР , хорошо коррелируют с клиническим эффектом применения препарата. Адекватность клеточной модели in vitro делает возможным предварительный скрининг предполагаемого препарата на первичной культуре клеток БКР от конкретного больного, что, несомненно, повышает эффективность лечения, позволяет сокращать сроки лечения за счет подбора курсовой дозы препарата, избежать токсического эффекта и привыкания к химиотерапии.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод выделения и культивирования клеток БКР из биопсийного материла больных. При культивировании в среде с низким содержанием ионов кальция (0,1мМ) клетки БКР образуют монослойную культуру с высоким пролиферативным потенциалом.

2.В условиях in vitro клетки БКР сохраняют основные морфологические и пролиферативные параметры, свойственные клеткам опухоли in vivo. В то же время клетки первичной культуры БКР отличаются по морфологии и скорости роста от культуры клеток эпидермальных кератиноцитов, выделенных из кожи здоровых доноров и культивируемых в аналогичных условиях.

3.В условиях культуры клетки БКР сохраняют тканеспецифические и цитослецифические признаки, присущие клеткам опухоли в состоянии in vivo. Показана возможность использования электронно-микроскопического исследования культуры клеток для дифференциальной диагностики различных форм БКР.

4.Созданная модель БКР in vitro позволяет в условиях культуры проводить оценку действия противоопухолевых препаратов по степени угнетения ими пролиферации клеток данной опухоли.

5. Использование эпидермальных клеток разной степени трансформированное™ дает возможность оценить антилролиферативкый эффект препаратов и осуществить предварительный отбор перспективных лекарственных средств для лечения БКР. Полученные результаты по совместному действию проспидина и гаммаферона на пролиферацию опухолевых клеток позволяют рекомендовать их комплексное применение для лечения БКР.

6. Культивирование клеток от конкретных больных дает возможность индивидуального подбора и прогнозирования клинической эффективности противоопухолевых препаратов , сокращению сроков лечения за счет подбора курсовых доз, уменьшению числа рецидивов; позволит избежать развития осложнений от применения больших курсовых доз цитостатиков и возникновения устойчивости к ним.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Давыдова И.Л., Васильев A.B., Терских В.В. Культура клеток как модель для исследования эпителиальных новообразований кожи // VII Российский съезд дерматологов и венерологов. Тез. докл. - Казань, 1996 ( часть 2) с. 5-6

2. Ежова М.Н., Давыдова И.Л., Молочков В.А., Белова Н.И. Клинико-морфологические особенности базальноклеточного рака кожи у жителей Московской области II Vtl Российский съезд дерматологов и венерологов. Тез. докл. - Казань, 1996 ( часть 2) с. 6-7

3. Давыдова И.Л., Данилова Т.И., Васильев A.B., Молочков В.А., Терских В.В. Оценка эффективности противоопухолевых препаратов в клеточных моделях II Научно-практическая конференция посвященная 75-летию ЦНИКВИ. Тез. докл. - Москва, 1996 с.45

4. Давыдова И.Л., Петушкова H.A., Васильев A.B., Терских В.В. Изучение особенностей экспрессии цитохром р450-зависимых монооксигеназ в фибробластах от больных опухолями кожи // Республиканский научный симпозиум «Пролиферативные заболевания кожи». Тез. докл. - Москва,1996 с. 2-3

5. Давыдова И.Л., Молочков В.А., Воротеляк Е.А., Васильев A.B., Терских В.В. Использование культуры ткани для оценки эффективности противоопухолевых агентов II Республиканский научный симпозиум «Пролиферативные заболевания кожи». Тез. докл. - Москва,1996 с. 3

6. Давыдова И.Л., Молочков В.А., Васильев A.B., Терских В,В. Использование клеточных культур для изучения базальноклеточного рака кожи II XVII научно-практическая конференция дерматологов и венерологов Хабаровского края. Тез докл. - Хабаровск, 1996 с.11