Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Кроветворная ткань и стромальное микроокружение в процессе интенсивной терапии и мобилизации гемопоэтических стволовых клеток у больных множественной миеломой

На правах рукописи

Покровская Ольга Станиславовна

КРОВЕТВОРНАЯ ТКАНЬ И СТРОМАЛЬНОЕ МИКРООКРУЖЕНИЕ В ПРОЦЕССЕ ИНТЕНСИВНОЙ ТЕРАПИИ И МОБИЛИЗАЦИИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК У БОЛЬНЫХ МНОЖЕСТВЕННОЙ

МИЕЛОМОЙ

14.01.21 - Гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 9 СЕН 2011

Москва-2011

4854787

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные руководители:

Доктор медицинских наук Менделеева Лариса Павловна Кандидат медицинских наук Капланская Ирина Борисовна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Домрачева Елена Васильевна Кандидат медицинских наук Вотякова Ольга Михайловна

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение «Федеральный Научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится « 28 » сентября 2011 года в часов на заседании диссертационного совета Д 208.135.01 при ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздравсоцразвития России по адресу: 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, дом 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздравсоцразвития России

Автореферат разослан « »августа 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Зыбунова Е.Е.

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы: Внедрение в клиническую практику рекомбинантных человеческих гемопоэтических ростовых факторов, которые способствуют увеличению концентрации клеток-предшественниц в крови, расширило возможности использования периферической крови в качестве источника гемопоэтических клеток как для аутологичной, так и для аллогенной трансплантации. В последние 15 лет гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) зарекомендовал себя в качестве эффективного средства, мобилизующего СБ34+ клетки в периферическую кровь. Несмотря на многочисленные исследования, остается дискутабельным вопрос о необходимом количестве СЭ34+ клеток для успешного и быстрого восстановления гемопоэза после аутотрансплантации. Схемы, содержащие Г-КСФ, используются для мобилизации гемопоэтических стволовых клеток крови (ГСКК) при различных онкогематологических заболеваниях. Преимуществами такой мобилизации на фоне стабильного состояния кроветворения является отсутствие фебрильной нейтропении, тяжелых инфекционных осложнений, продолжительной госпитализации, необходимости применения антибактериальной терапии и заместительных трансфузий компонентов крови. Однако количество СОЭ4+ клеток, которое удается собрать в результате мобилизации одним Г-КСФ, значительно уступает таковому при использовании сочетания химиотерапевтических препаратов и ростового фактора [№гауапазапи и. и соавт., 2001]. До сих пор не решен вопрос, какая схема мобилизации является оптимальной, позволяющей заготовить количество СВ34+ клеток, достаточное для быстрого и полноценного восстановления гемопоэза.

Высокодозная химиотерапия с последующей трансплантацией аугологичных ГСКК является стандартом в современной терапии больных множественной миеломой (ММ) моложе 65 лет [Нагошвеаи Л,. И соавт, 2007 Вагк^е В. И соавт., 2008] Так, по данным Европейского Регистра по трансплантации костного мозга, в 2009 году всего выполнено 16591 трансплантация аутологичных ГСКК, при этом наиболее частым показанием для выполнения аутотрансплантации была ММ. При этой нозологии выполнено 6918 трансплантаций аутологичных гемопоэтических клеток, что составляет 41,7% от общего количества.

Целесообразность сбора значительного количества СВ34+клеток у больных ММ диктуется не только потребностью выполнения двух трансплантаций. Анализ течения раннего посттрансплантационного периода у больных ММ, лейкозами и лимфомами показал,

что доза перелитых СБ34+ клеток оказывает влияние на сроки восстановления гранулоцитов в периферической крови [ВоЬуеИ В1 и соавт., 2007, \Vahlin А и соавт., 2004, Менделеева Л.П. и соавт. 2005].

Несмотря на многочисленные исследования, до настоящего времени нет однозначного ответа на вопрос о механизмах воздействия Г-КСФ на кроветворение, которые обеспечивают «выход» СБ34+ клеток в кровь. В литературе представлены противоречивые сведения о стимуляции пролиферации костномозговых клеток, а также о клетках, служащих мишенями для действия Г-КСФ и посредниками в реализации его эффектов.

Сообщается, что при ММ происходит выраженное новообразование сосудов, однако отсутствуют четкие сведения об изменении сосудистого русла на разных этапах терапии, а также роль ангиогенеза как прогностического фактора [Уасса А. и соавт., 1994,11а]китаг БУ и соавт., 2002]. Имеются лишь единичные работы, посвященные изучению влияния Г-КСФ на кроветворение с использованием гистологических и цитологических методик. В основном встречаются работы, в которых представлены результаты иммунофенотипического и молекулярного анализа. Однако изучение гистологической и иммуногистохимической (ИГХ) картины остается единственным способом, позволяющим оценить структуру костного мозга и взаимодействие клеточных элементов, в частности - стромы и гемопоэтической ткани, полноценно оценить клеточность костного мозга. Нами не найдено работ, подробно анализирующих изменения, происходящие в костном мозге и стромальном микроокружении при различных режимах мобилизации ГСКК.

В связи с этим представляется важным сопоставить результаты мобилизации и сбора ГСКК у больных ММ в зависимости от дозы химиотерапевтического препарата циклофосфана, включенного в схему мобилизации, оценить влияние мобилизующих агентов на костномозговое кроветворение и изучить некоторые клинические эффекты. Комплекс перечисленных проблем и определил выбор темы данной научной работы.

Цель работы - изучить состояние кроветворной ткани и стромального микроокружения на фоне применения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в различных схемах мобилизации гемопоэтических стволовых клеток, а также интенсивной индукционной и консолидирующей терапии у больных множественной миеломой.

Задачи исследования: 1. Изучить эффективность мобилизации и сбора гемопоэтических стволовых клеток крови у больных ММ в зависимости от дозы циклофосфана, сроков начала инъекций Г-КСФ, схем индукционной химиотерапии для оптимизации мобилизационных режимов.

2. Исследовать состояние кроветворения у больных ММ на фоне мобилизации ГСКК гистологическим, морфометрическим и ИГХ методами.

3. Изучить плотность микрососудов в костном мозге у больных ММ в дебюте заболевания, после индукции и высокодозной консолидации с последующей аутологичной трансплантацией.

4. Проанализировать влияние схемы мобилизации ГСКК на ангиогенез в костном мозге у больных ММ.

5. Оценить значимость показателя плотности микрососудов в костном мозге больных ММ как прогностического фактора, влияющего на вероятность посттрансплантационной выживаемости без признаков прогрессии.

Научная новизна.

В работе проанализирована эффективность мобилизации и сбора ГСКК в зависимости от дозы ЦФ, используемого в схеме мобилизации, показано влияние различных схем индукционной терапии, сроков начала инъекций Г-КСФ на результаты мобилизации ГСКК у больных ММ.

Проведен подробный анализ изменений в костном мозге больных ММ, происходящих на фоне мобилизации ГСКК с использованием гистологических, морфометрических и ИГХ методов с маркерами гемопоэтических клеток. Выполнено сравнение результатов цитологического и ИГХ исследований.

Изучены параметры ангиогенеза в костном мозге у больных ММ на каждом этапе программной терапии. Впервые показано, что количество сосудов в костном мозге является признаком, определяющим вероятность сохранения ремиссии после трансплантации аутологичных ГСКК, опережая по значимости противоопухолевый ответ, достигнутый на этапе индукционной терапии.

Изучено влияние различных режимов мобилизации на ангиогенез в костном мозге.

Научно-практическая ценность работы.

Оптимизирован режим мобилизации и сбора ГСКК у больных ММ. Отработаны сроки начала введений Г-КСФ, позволившие сэкономить 4-5 инъекций препарата. Установлены оптимальные дозы ЦФ в схеме мобилизации, обеспечивающие заготовку необходимого количества СЭ34+ клеток при минимальной потребности в сопроводительной терапии.

Изучены гистологические изменения, происходящие в кроветворной ткани и стромальном микроокружении на фоне мобилизации ГСКК. Показана роль ангиогенеза в костном мозге в становлении длительной ремиссии после высокодозной химиотерапии с последующей трансплантацией аутологичных ГСКК.

Положения, выносимые на защиту.

1. При мобилизации ГСКК происходит значительное увеличение числа клеток гранулоцитарного ряда. Длительное применение Г-КСФ приводит к уменьшению площади костной ткани.

2. В дебюте ММ имеет место выраженный неоангиогенез. На фоне индукционной и высокодозной консолидационной химиотерапии по мере нарастания противоопухолевого ответа, происходит снижение плотности микрососудов.

3. Плотность микрососудов является важным прогностическим фактором, определяющим выживаемость без прогрессии после трансплантации аугологичных ГСКК. Наиболее высокие показатели 5-ти летней выживаемости без прогрессии наблюдаются у больных ММ с низкой плотностью микрососудов вне зависимости от наличия полкой или очень хорошей частичной ремиссии.

4. В результате применения Г-КСФ происходит увеличение плотности микрососудов в костном мозге у больных ММ, лимфосаркомами, лимфогранулематозом и острыми лейкозами.

5. Использование ЦФ в дозе 4 и 6 г/м2 в сочетании с Г-КСФ является эффективной схемой мобилизации ГСКК у больных ММ и позволяет заготовить достаточное для выполнения двойной ауготрансплантации количество С034+ клеток. При использовании ЦФ в дозе 4 г/м2 наблюдается меньшая потребность в сопутствующей терапии, однако уменьшение дозы ЦФ с 6 до 4 г/м2 приводит к снижению эффективности мобилизации.

6. Эффективность мобилизации и сбора С034+ клеток не зависит от того, в какие сроки после введения ЦФ начаты инъекции Г-КСФ.

Апробация работы состоялась на заседании Проблемной комиссии ФГБУ Гематологический научный центр Минздравсоцразвития России «Гемопоэз, молекулярная биология, биотехнология, иммуногематология; гемобластозы и депрессии кроветворения» 20 июня 2011 года. Основные положения работы доложены на ежегодных рабочих совещаниях Международной школы гематологов «Лейкозы и лимфомы. Терапия и фундаментальные исследования» (Москва, 2004 год, 2008 год, 2009 год), XII Российском онкологическом конгрессе «Гемобластозы» (Москва, 2008 год), II Симпозиуме «Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток» (Санкт-Петербург, 2008 год), на Европейской конференции по трансплантации костного мозга (Флоренция, Италия 2008 год, Париж, Франция 2011 год), на конференции американского общества гематологов (Сан-Франциско, США, 2008 год). По теме диссертации опубликовано 17 работ.

Объем и структура работы: Диссертация изложена на 185 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», 3 глав, посвященных собственным результатам, заключения, выводов, списка литературы, включающего 266 работ, в том числе 15 отечественных авторов. В работе содержится 17 таблиц и 17 рисунков.

Диссертация выполнена в отделении химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга (научный руководитель - д.м.н. E.H. Паровичникова) и патологоанатомической лаборатории (заведующая лабораторией - д.б.н. А.М. Ковригина)

Содержание работы

Общая характеристика больных

В настоящей работе использованы материалы наблюдений за 93 больными ММ, которым выполнялась мобилизация ГСКК с использованием циклофосфана и Г-КСФ в отделении химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга ГНЦ МЗСР РФ с 2003 по 2010 гг.

Среди 93 больных было 52 мужчины и 41 женщина в возрасте 29-67 лет (медиана - 52 года). У 54 (58,1%) больных была диагностирована миелома G, у 15 (16,2%) - миелома А, у 16 (17,2%) - миелома BJ, у 3 (3,2%) - миелома D, у 1 (1,1%) - миелома М, у. 2 (2,1%) пациентов - несекретирующая форма и у 2 (2,1%) - плазмоклеточный лейкоз. Стадия болезни у 50 (53,8%) больных расценивалась как II и у 43 (46,2%) больных - как III.-.

Для лечения ММ использовался протокол, основанный на принципе ранней интенсификации и высокодозной консолидации. В период с 2003 по 2005 годы в качестве индукционной терапии 30 больным было выполнено 3-4 курса VAD (винкристин + адриабластин + декеаметазон). 15 больным кроме 3-4 курсов VAD было проведено по 1-2 курса МР (мелфалан + преднизолон) или М2 (винкристин + кармустин + мелфалан + циклофосфан + преднизолон), или 1 курс EDAP (этопозид + декеаметазон + цитарабин + цисплатин). Мобилизация ГСКК проводилась с использованием высоких доз циклофосфана (6 г/м2) и Г-КСФ по 5 мкг/кг/сут. Затем пациентам, которым не был выполнен курс EDAP ранее, проводился дополнительный курс химиотерапии EDAP. Аутологичную трансплантацию (однократную или двойную) выполняли после введения высоких доз мелфалана (200 мг/м2). Далее назначали поддерживающую терапию (интерферон-альфа), которую продолжали до развития рецидива заболевания. Представленная программа была выполнена 45 больным.

В 2006 году был модифицирован протокол лечения ММ. В тех случаях, когда после 13 курсов VAD наблюдался недостаточный противоопухолевый ответ (частичная ремиссия или стабилизация), в схему лечения включали 4-6 курсов VD (велкейд + дексаметазон) или 2-4 курса PAD (велкейд + адриабластин + дексаметазон). Данная схема индукционной терапии была выполнена 19 пациентам. В 24 случаях бортезомиб-содержащие курсы выполнялись в качестве терапии первой линии. После завершения индукционной терапии пациентам выполнялись мобилизация (с использованием ЦФ в дозе 4-6 г/м2 и Г-КСФ) и трансплантация аутологичных ГСКК. По модифицированному протоколу было пролечено 48 больных.

После индукционной терапии у 23 (24,7%) пациентов была достигнута полная ремиссия, у 36 (38,7%) - очень хорошая частичная ремиссия, у 29 (31,2%) - частичная ремиссия, а у 5 (5,4%) больных наблюдалась прогрессия заболевания.

Схема мобилизации ГСКК у больных ММ включала циклофосфан и Г-КСФ. В 59 случаях доза ЦФ составила 6 г/м2 (высокие дозы ЦФ) и в 34 случаях 4 г/м2 (промежуточные дозы ЦФ).

Г-КСФ назначали в дозе 5 мкг/кг в сутки подкожно и продолжали инъекции до завершения сбора ГСКК. С целью разработки оптимального режима мобилизации нами использовались различные сроки начала применения Г-КСФ: 3-ий или 5-ый дни после введения ЦФ, а также день снижения числа лейкоцитов периферической крови менее 1х109 кл/л.

Сбор ГСКК из периферической крови выполняли на сепараторах непрерывного тока крови в донорского и лечебного гемафереза (рук. отд., д.м.н. Калинин H.H.). 93 больным ММ после мобилизаций было проведено 206 лейкаферезов.

Методы исследования

Трепанобиопсии костного мозга у 36 больных ММ выполняли на следующих этапах лечения: в момент диагностики заболевания, после выполнения схемы индукции, после мобилизации ГСКК, перед 1-ой ауготрансплантацией и через 3 месяца после завершения высоко дозной трансплантационной методики. Всего было проанализировано 129 трепанобиоптатов костного мозга на разных этапах лечения. Однако информативными и достаточными по объему было только 103 (79,8%) трепанобиоптата. Таким образом, в анализ в дебюте заболевания включено 16 трепанобиоптатов, после выполнения индукции -26, после мобилизации - 10, перед 1-ой ауготрансплантацией - 25 и после завершения высокодозной химиотерапии - 26 трепанобиоптатов.

В группу сравнения были включены 8 пациентов с лимфосаркомами, 6 с лимфогранулематозом, 9 с острыми лейкозами (5 с OMJ1 и 4 с OJIJ1). Им трепанобиопсию выполняли дважды - до начала мобилизации и на следующий день после последнего лейкафереза. Контрольную группу составили доноры костного мозга, которым во время эксфузии выполнялась трепанобиопсия задней ости подвздошной кости. В эту группу вошло 7 мужчин и 3 женщины в возрасте 19-56 лет (медиана 29 лет). Таким образом, всего было проанализировано 185 трепанобиоптатов.

Для решения поставленной задачи при гистологическом исследовании биоптатов костного мозга визуально оценивали следующие параметры:

1) состояние костных структур (истончение/утолщение костных балок, наличие признаков рассасывания и тип резорбции костной ткани),

2) соотношение между кроветворной и жировой тканью костного мозга,

3) соотношение между клетками гранулоцитарного и эритроидного ростков,

4) локализацию клеток каждого из 3-х ростков кроветворной ткани,

5) степень дифференцировки клеток гранулоцитарного ростка,

6) количество мегакариоцитов,

7) наличие и выраженность диспластических изменений в клетках каждого из 3-х ростков кроветворной ткани,

8) состояние стромы (отек, кровоизлияния, фиброз, синусы).

Для полуколичественной оценки состояния костномозгового кроветворения использовали метод морфометрии (Г.Г. Автандилов, 1973 г.). С помощью окулярной сетки, содержащей 25 тест-точек, в 40 случайно взятых полях зрения при увеличении 140 определяли объемные доли жировой и костной ткани. По числу совпадений тест-точек с изучаемыми структурами получали объемную долю этих элементов в процентах. Площадь миелокариоцитов вычисляли по формуле: SM=100% - (Sjk + SK), где

Sm - площадь миелокариоцитов (%), Sx - площадь жировой ткани (%), SK - площадь костной ткани (%).

Площадью сосудов пренебрегали, так как она была мала и не оказала существенного влияния на значение площади кроветворной ткани.

Для гистологического исследования биоптаты костного мозга фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, декальцинировали в растворе Де Кастро, помещали в батарею спиртов восходящей концентрации и заключали в парафин. Срезы толщиной 3 мкм окрашивали гематоксилином и эозином по рутинной методике.

ИГХ-исследование костного мозга выполнялось для более точной характеристики изменений гемопоэза. Проводилась количественная оценка содержания крупных CD34+ клеток с использованием моноклонального антитела к CD34, Кроме того, осуществлялся подсчет и характеристика мегакариоцитов после окрашивания микропрепарата моноклональным антителом к Factor VIII. С использованием маркера клеток эритроидного ряда (гликофорина А) и миелоидного ряда (миелопероксидазы - МПО), у всех больных до и после применения высоких доз ЦФ и Г-КСФ оценивалось количество клеток эритроцитарного и гранулоцитарного ростков, а также их соотношение (М:Е индекс).

Экспрессию гемопоэтических маркеров оценивали полуколичественным методом как долю клеток в процентах, экспрессирующих данный антиген, к общему количеству клеток.

Подсчет микрососудов осуществляли с использованием моноклональных антител к Factor VII и CD34 в 10 полях зрения при увеличении 400х (объектив 40х, окуляр 10х/18). Площадь одного поля зрения составила 0,159 мм2. Таким образом, в каждом гистологическом препарате подсчитывалось количество сосудов на площади кроветворной ткани в 1,59 мм2 с последующим перерасчетом на единицу площади, равную 1 мм2. Под термином «микрососуды» понимали эндотелиальные клетки, расположенные поодиночке или кластерами в виде гнезд или трубочек, четко отделенных одна от другой, без наличия или с наличием просвета, не превышающего 10 мкм в диаметре (т.е. не более чем в 1,5 раза превышающего диаметр ядра эндотелиальной клетки в поперечном сечении). Сосуды большего диаметра, а также сосуды, близко расположенные к трабекулам, не учитывались.

Всего ИГХ методом с моноклональными антителами к гемопоэтическим маркерам клеток проанализировано 636 микропрепаратов костного мозга. Для ИГХ-исследования использовали срезы толщиной 3 мкм, которые наносили на высокоадгезивные стекла и высушивали при температуре 37°С в течение 18 часов. Восстановление антигенной активности проводили в специализированном приборе «Retriever 2100» при температуре 121 °С в течение 20 мин с последующим остыванием в течение 45 мин при комнатной температуре. Для восстановления антигенной активности использовали цитратный буфер рН 6,0. В качестве детекционной системы применяли систему «EnVision» ("Dako"), в качестве хромогена - диаминобензидин. ИГХ реакции проводили с использованием автоматического иммуногистостейнера DakoAvtostainer ("Dako Cytomation", США) и ручным способом.

Иммунохимический вариант ММ определяли по классу и типу патологических иммуноглобулинов, секретируемых опухолевыми клетками, методами электрофореза в

агарозном геле и иммунофиксации (лаб. гуморального иммунитета, зав. лаб. к.м.н. Варламова Е.Ю.).

Содержание СР34+ клеток в лейкоконцентратах, а также в периферической крови до начала мобилизации и в дни проведения лейкоцитаферезов определяли методом проточной цитофлюориметрии (лаборатория функциональной морфологии гемобластозов, зав. лаб. д.б.н., проф. Воробьев И.А.).

Подсчет гемограмм и миелограмм выполнялись в клинико-диагностической лаборатории (зав. лаб. Тихонова Л.Ю.).

Цитогенетическое исследование клеток КМ было выполнено 31 пациенту (кариологическая лаборатория, зав. лаб. д.м.н., проф. Домрачева Е.В.).

Результаты исследований. Эффективность мобилизации ГСКК в зависимости от величины дозы ИФ в схеме ЦФ + Г-КСФ. Для определения оптимальной дозы ЦФ, используемого в схеме мобилизации ЦФ + Г-КСФ, нами проведен сравнительный анализ эффективности мобилизации и осложнений, наблюдаемых при назначении высоких (б г/м2) и промежуточных (4 г/м2) доз ЦФ. 59 пациентам ММ мобилизация проводилась с использованием высоких (6г/м2) доз ЦФ, 34 больным ЦФ вводился в дозе 4 г/м2. Группы пациентов были сопоставимы по возрасту, полу, распределению по типам ММ.

Таблица 1

Результаты мобилизации ГСКК в зависимости от применявшейся дозы ЦФ.

Параметры Результаты мобилизации и сбора ГСКК при различных дозах ЦФ в схеме мобилизации

ЦФ 6 г/м2 + Г-КСФ п=59 ЦФ 4 г/м2 + Г-КСФ п=34

Количество CD34+ клеток в крови до мобилизации, кл/мл, (М±т, разброс значений) 3143 ±434* (410-13900) 2017 ± 387* (290-6820)

Максимальное содержание CD34+ клеток в крови, кл/мл, (М±ш и разброс значений) 279462 ±41593* (2050-1797120) 161409 ±29128* _J1870-575960)

Кратность увеличения CD34+ клеток в крови (М±т, разброс значений) 159 ±26* (3,6-802) 128 ±31* (2,6-369)

Количество CD34+ клеток, собранных за 1-ый лейкаферез, (х106/кг), (М±т, разброс значений) 19,2 ±2,54* (0,2-106) 9,9 ± 1,67* (0,4-35,8)

Общее количество CD34+ клеток, заготовленных за всю мобилизацию, (х106/кг), (М±т, разброс значений) 29,45 ±3,37* (1,1-106) 21,1 ±3,68* (4,6-101)

Заготовлено >4х10о/кг CD34+ клеток за всю мобилизацию, %, (число больных) 94,9 (56 из 59) 100 (34 из 34)

Эффективность мобилизации гемопоэтических стволовых клеток определялась по выбросу CD34+ клеток в периферическую кровь. Результаты, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что введение ЦФ в дозе 6 г/м2 сопровождалось более высокой эффективностью мобилизации, чем применение ЦФ в дозе 4 г/м2: кратность увеличения CD34+ клеток в крови составляла 159 ±26 против 128 ± 31 128 ±31, (р<0,05).

Несмотря на то, что в результате применения как высоких, так и промежуточных доз ЦФ у 94,9 и у 100% больных удалось заготовить необходимое для проведения двух аутотрансплантаций количество CD34+ клеток, при использовании ЦФ в дозе 6 г/м2 все же было заготовлено большее количество гемопоэтических клеток как за всю мобилизацию, так уже и за 1-ый лейкаферез.

Длительность миелотоксического агранулоцитоза после введения ЦФ практически не отличалась в двух группах и составляла 3-11 (медиана 5,5) дней при использовании ЦФ 6 г/м2 и 1-8 (медиана 4) дней при использовании ЦФ 4 г/м2. Медиана начала введений Г-КСФ в обеих группах больных приходилась практически на одни и те же сроки: 8-ой день при дозе ЦФ 6 г/м2 и 9-ый день при дозе ЦФ 4 г/м2. Продолжительность применения Г-КСФ также оказалась сопоставимой в обеих группах больных: 9 и 8 дней, соответственно.

Глубокая тромбоцитопения (<30 х109/л) чаще наблюдалась при использовании ЦФ 6г/м2, что потребовало проведения у большего количества пациентов заместительных трансфузий тромбоконцентратов (54% против 20,6%, р=0,01). При этом после введения ЦФ в дозе 6 г/м2 необходимыми были 2-5 трансфузии тромбоконцентратов, а после ЦФ в дозе 4 г/м2 - лишь 1 трансфузия. Трансфузии эритроцитной массы также чаще проводили после применения высоких доз ЦФ, чем промежуточных (28,8% против 8,8%, р<0,05).

Фебрильная лихорадка, потребовавшая назначения системной антибактериальной терапии, наблюдалась у 50,8% больных в группе ЦФ 6 г/м2 и у 35,3% больных их группы ЦФ 4 г/м2 (различия статистически незначимые). Частота тяжелых инфекционных осложнений была сопоставима в двух группах больных: септицемия - 11,9% против 5,9%, пневмония -3,4% против 5,8%. Частота присоединения некротической энтеропатии II-III степени тяжести (11,9% и 11,7%), стоматитов II степени тяжести (13,6 и 15,7%) также была одинаковой в двух группах больных.

Эффективность мобилизации ГСКК в зависимости от сроков начала применения Г-КСФ. С целью определения оптимальных сроков начала введений колониестимулирующего фактора в применявшейся нами схеме мобилизации ЦФ + Г-КСФ, были проанализированы результаты мобилизации и сбора ГСКК у больных, доза ЦФ у которых равнялась 6 г/м2 (Таблица 2).

Таблица 2

Результаты мобилизации и сбора ГСКК в зависимости от сроков начала применения Г-КСФ в группе больных с дозой ЦФ 6 г/м2.

Параметры Результаты мобилизации и сбора ГСКК при различных сроках начала введений Г-КСФ

С +3 дня мобилизации С +5 дня мобилизации При числе лейкоцитов <1х10?/л (медиана +8 день)

Число больных 28 7 24

День 1-го лейкафереза (от начала мобилизации), медиана и разброс значений 15 (13-20) 15 (14-16) 15 (14-18)

Длительность применения Г-КСФ, дни, медиана и разброс значений 14 (11-20) 12 (9-15) 9* (6-13)

Общее количество CD34+ клеток, заготовленных за всю мобилизацию,(х 106/кг), М±т, разброс 31,4 ±4,96 (1,1-93,8) 29,2 ±5,91 (2,06-100) 31,4 ±4,97 (5,5-106)

Максимальное содержание CD34+ клеток в крови, кл/мл, М±т, разброс значений 326740 ± 80728 (2050-1797120) 335391 ±64505 (11200-514800) 311043 ±39678 (21900-708700)

Эффективность мобилизации и сбора, также как и сроки начала лейкаферезов оказались одинаковыми, вне зависимости от того, на 3-ий, 5-ый день от начала мобилизации или же на фоне развившегося агранулоцитоза были начаты инъекции Г-КСФ. Проведенный анализ показал, что экономия 3-5 доз Г-КСФ у каждого пациента за счет более позднего назначения препарата в схеме мобилизации не снижает эффективность мобилизации ГСКК, обеспечивая достаточный для нескольких аутологичных трансплантаций сбор Сй34+ клеток. Эффективность мобилизации ГСКК в зависимости от схем индукционной терапии. Нами были сопоставлены результаты мобилизации С034+ клеток в зависимости от того, какие лекарственные препараты применялись больным ММ на этапе индукции.

Сопоставив результаты мобилизации и сбора ГСКК, стоит отметить, что у больных, получавших до мобилизации мелфалан и цисплатин, пиковые значения СИ34+ клеток в периферической крови составили 2050-774000 кл/мл (в среднем 195480±67164 кл/мл), что оказалось практически в 2 раза ниже, чем у больных, леченных только курсами УАО (190201797120 кл/мл, в среднем 322287±73994 кл/мл). Аналогичная зависимость выявлена и при сравнении общего количества заготовленных СР34+ клеток. В результате применения в индукции курсов МР, М2 или ЕОАР у больных было собрано почти вдвое меньше СИ34+ клеток, чем у больных, получивших в индукции только курсы УА1) (в среднем 18,3±5,71

хЮ6 клеток/кг и 34,7±4,81х106 клеток/кг, соответственно). Тем не менее, 86,7% пациентам, получившим до мобилизации мелфалан и цисплатин, удалось заготовить достаточное количество СЭ34+ клеток для проведения двойной аутотрансплантации.

Результаты сравнительного анализа влияния бортезомиба, входившего в состав индукционной терапии, представлены в таблице 3.

Таблица 3

Результаты мобилизации и сбора ГСКК в зависимости от программы индукционной

терапии.

Параметры Характеристика больных

I группа 3-4 курса VAD (п=30) II группа 1-3 курса УАО +6-8 курсов VI) или 3-4 курса РАБ (п=19) III группа 6-8 курсов VD или 3-4 курса PAD ± 4-6 курсов VD (п=24)

Количество курсов индукционной терапии, медиана и разброс значений Мед 3 (3-5) Мед 7 (6-И) Мед 6 (3-8)

Доза ЦФ в схеме мобилизации 6г/м2 4 г/м2 30 100% 0 11 58% 8 42% 4 16,7% 20 83,3%

Количество лейкоцитов в периферической крови (х109/л), М+т, разброс значений До мобилизации 6,09 ± 0,36* (2,4-10,3) 5,3 ± 0,37* (3,2-10,5) 5,03 ± 0,34* (2,9-9,7)

В день первого афереза 16,0 ± 2,3 (5,4-62,0) 17,7 ±2,8 (5,8-48,3) 16,7 ±2,6 (3,7-54,5)

Количество С034+ клеток в периферической крови (кл/мл), М+гп, разброс значении До мобилизации 3575 ±631* (440-11460) 2164 ± 516* (420-6820) 1586 + 405* (290-5760)

В день первого афереза 247785±62110 (9900-1369550) 218029+41603 (1680-563000) 132032+42655* (1870-708700)

Максимальное содержание 322287±73994* (19020-1797120) 231624+39708* (1680-563000) 161007+44266* (1870-708700)

Кратность увеличения Мед 99 (3,8-802) 172,0 ±38,8 Мед 81 (3,3-654) 193,25 + 64,5 Мед 99,3 (1,5-469) 147,7 + 45,6*

Количество собранных СШ4+ клеток (хЮ6 кл/кг) за всю мобилизацию, М+т, разброс значений 34,7 ±4,81* (2,06-100,0) 28,38 ± 5,09* (8,7-106,0) 22,7 ± 5,14* (4,6-102,0)

Число лейкаферезов, медиана, разброс значений Мед 2 (1-3) Мед 2 (1-4) Мед 2 (1-6)

Количество успешных сборов >2х107кг 30 100% 19 100% 24 100%

>4Х106/кг 29 96,7% 19 100% 24 100%

Эффективность мобилизации ГСКК оказалась в прямой зависимости от индукционных курсов и дозы ЦФ в схеме мобилизации. Приняв показатель максимального содержания CD34+ клеток в крови за основной параметр, характеризующий результаты мобилизации, можно отметить, что при увеличении числа индукционных курсов до 7 (медиана) и снижении у 42% больных дозы ЦФ до 4 г/м2 эффективность мобилизации во II группе больных снизилась на 28%.

У больных же III группы при аналогичном числе индукционных курсов (медиана 6) ЦФ в дозе 4 г/м2 был назначен уже подавляющему большинству больных (83,3%), что сопровождалось дальнейшим снижением эффективности мобилизации (уже на 50% по сравнению с I группой больных). Тем не менее, эффективность мобилизации оказалась весьма высокой как у больных, получивших 3-4 курса VAD, так и у больных, получивших от 3 до 11 бортезомиб-содержащих курсов. У всех больных удалось заготовить CD34+ клетки в количестве более 2х106/кг, что было достаточным для выполнения одной аутологичной трансплантации.

Изменение состояния костномозгового кроветворения у больных ММ в результате применения высоких доз ЦФ и Г-КСФ с целью мобилизации ГСКК.

Изменение состояния костномозгового кроветворения в результате мобилизации ГСКК было изучено у 10 больных ММ в возрасте 36-67 лет. В качестве условной нормы были приняты параметры состояния кроветворной ткани доноров костного мозга.

Иммунохимическое исследование крови и мочи перед мобилизацией ГСКК позволило констатировать у 1 пациента полную ремиссию, у 2 - очень хорошую частичную ремиссию и у 7 - частичный ответ.

Гистологическая картина костного мозга больных ММ до и после мобилизации ГСКК.

У больных ММ после выполнения индукционной терапии и перед началом мобилизации ГСКК соотношение между жировым костным мозгом и миелокариоцитами варьировало - от выраженной гипоплазии, когда в примыкающих к корковому слою полостях выявлялся лишь жировой костный мозг, а миелокариоциты обнаруживались в глубоких полостях (6 случаев), до примерно равного соотношения жировой и кроветворной ткани (3 случая) или незначительного преобладания последней (2 случая).

Качественный анализ кроветворной ткани показал, что в биоптатах костного мозга выявлялись клетки трех ростков гемопоэза на всех стадиях созревания. У 2 пациентов наблюдалось расширение эритроцитарного ростка.

Основную часть клеток гранулоцитарного ряда составляли зрелые клетки и вызревающие формы. Сужение гранулоцитарного ростка наблюдалось в 5 случаях, в 2

случаях гранулоцитарный росток соответствовал норме, и в 3 случаях отмечалась расширение гранулоцитарного ростка за счет зрелых и вызревающих форм.

Число мегакариоцитов в 3 случаях соответствовало норме, тогда как в 5 случаях их число было существенно сниженным. Мегакариоциты располагались преимущественно равномерно поодиночке возле синусов, однако имелись случаи с неравномерным их распределением. В 2 случаях отмечалось расширение мегакариоцитарного ростка.

В 4 случаях в костном мозге определялась лимфо- и/или плазмоклеточная инфильтрация: у 2-х больных это было обусловлено сохраняющейся инфильтрацией атипичными плазмоцитами и у 2 других выявлялись реактивные лимфоидные узелки. В 6 случаях количество лимфоцитов и плазматических клеток не превышало норму. (Таблица 4)

Таблица 4

Характеристика костномозгового кроветворения в гистологических препаратах

костного мозга больных ММ до и после мобилизации.

Показатели Частота нарушений состояния гемопоэза у больных ММ

До мобилизации (число больных/%) После мобилизации (число больных/ %)

Клеточность КМ гипоклеточный 6 (60%) 5 (50%)

нормоклеточный 3 (30%) 3 (30%)

гиперклеточный 1 (10%) 2 (20%)

Эритроидный росток сужен 5 (50%) 8 (80%)

норма 3 (30%) 1 (10%)

расширен 2 (20%) 1 (10%)

Гранулоцитарный росток сужен 5 (50%) 2 (20%)

норма 2 (20%) 3 (30%)

расширен 3 (30%) 5 (50%)

Количество мегакариоцитов снижено 5 (50%) 8 (80%)

нормальное 3 (30%) 2 (20%)

увеличено 2 (20%) 0

Лимфоплазмоцитарный росток сужен 1 (10%) 3 (30%)

норма 5 (50%) 4 (40%)

расширен 4 (40%) 3 (30%)

Применение высоких доз ЦФ с последующим назначением Г-КСФ с целью мобилизации ГСКК не привело к дальнейшему снижению общей клеточности КМ. Количество случаев гипоклеточного, нормоклеточного и гиперклеточного костного мозга осталось практически тем же, что и до мобилизации. При этом значительно изменилось соотношение между клетками этироцитарного и гранулоцитарного ростков. После мобилизации у большинства больных эритроидный росток был сужен, в то время как

расширенный гранулоцитарный росток наблюдался уже у половины пациентов. Количество мегакариоцитов после мобилизации у большинства больных оказалось сниженным, тогда как до мобилизации у 50% пациентов мегакариоцитарный росток был нормальным или расширенным. Представленные изменения состояния костномозгового кроветворения демонстрируют различные сроки восстановления каждой клеточной линии после миелосупрессивного воздействия высоких доз ЦФ и стимулирующего влияния Г-КСФ.

Морфометрическое исследование костного мозга больных ММ до и после мобилизации ГСКК. Для более точной характеристики соотношения гемопоэтической ткани, жировой ткани и костных структур в гистологических препаратах до и после мобилизации ГСКК у больных ММ было проведено морфометрическое исследование. За норму приняты результаты морфометрии у доноров костного мозга.

Таблица 5

Морфо.чстричсские показатели соотношения гемопоэтической, жировой и костной ткани у больных ММ и доноров костного мозга.

Показатели Результаты морфометрического исследования трепанобиоптатов

Доноры КМ Больные ММ

До мобилизации После мобилизации

Кроветворная ткань, %. М + т, разброс 46,7 ± 0,97* (39,8-48,4) 41,6 ± 1,93* (35,4-50,1) 44,1 ±3,19 (29,7-56,0)

Жировая ткань, %. М + т, разброс 38,5 ±2,52* (37,3-46,3) 44,0 ± 1,95* (38,2-56,0) 43,3 ±3,12 (31,4-53,5)

Костная ткань, %. М + т, разброс 14,8 ±0,51 (14,1-16,2) 14,4 ± 0,62* (11,9-15,9) 13,1 ±0,60* (11,3-14,8)

Как представлено в таблице 5, у больных ММ до мобилизации площадь кроветворной ткани в среднем составляла 41,6±1,93%, а у доноров костного мозга 46,7±0,97%, т.е. процентное содержание кроветворной ткани у больных ММ перед мобилизацией было достоверно ниже, чем у доноров (р<0,05). Выявленные различия обусловлены предшествовавшей индукционной химиотерапией, поскольку всем 10 пациентам было проведено по 3 курса УАХ>, а 3 из них дополнительно еще и курс по схеме ЕОАР. Соответственно, процентное содержание жировой ткани у больных ММ (в среднем 44,0±1,95%) было достоверно выше по сравнению с донорами КМ (в среднем 38,5±2,52%). Процентное содержание костной ткани у больных ММ и доноров не отличалось.

Анализируя результаты морфометрии гистологических препаратов больных ММ до и после мобилизации, удалось отметить, что соотношение площади кроветворной ткани и

площади жировой ткани практически не изменилось. Небольшое повышение площади кроветворной ткани после мобилизации (44,1±3,19% против 41,6±1,93%, соответственно) статистически не достоверно. В то же время выявлено достоверное снижение площади костной ткани после мобилизации (13,1±0,60% против 14,4±0,62%, соответственно).

Иммуногистохимическое исследование костного мозга больных ММ до и после мобилизации ГСКК. Для детальной характеристики изменений, происходящих в костном мозге больных ММ до и после мобилизации ГСКК, нами было проведено ИГХ-исследование с использованием моноклональных антител к гемопоэтическим маркерам С034, МПО, Гликофорин А и РайогУШ. В качестве контроля приведены ИГХ показатели состояния кроветворения здоровых доноров костного мозга.

Таблица 6

Показатели М:Е индекса у больных ММ до и после мобилизации ГСКК и у доноров КМ по данным иммуногистохимического исследования костного мозга.

Показатели Соотношение клеток эритроидного и миелоидного ряда в КМ

Доноры КМ Больные ММ

До мобилизации После мобилизации

ИГХ- исследование М:Е индекс М+ш, разброс значений 2,2 ± 0,54 (1,5-5,2) 1,6 ±0,34 (1,1-3,8) 4,9 ± 0,72 (2,4-8,5)

% клеток эритроидной линии, М+ш, разброс значений 28,1 ±3,4 (20-50) 37,6 ±2,2 (20-60) 16,8 ± 1,9 (5-20)

% клеток миелоидной линии, М+т, разброс значений 64,3 ± 4,8 (40-70) 58,4 ±3,9 (30-75) 76,2 ±4,1 (30-90)

По результатам ИГХ анализа у доноров костного мозга содержание клеток эритроидной линии составляло от 20% до 60% (в среднем 37,6±2,2%), а клеток миелоидной линии - от 40% до 70% (в среднем 64,3±4,8%). Соотношение между миелоидным и эритроидным ростками у доноров равнялось от 1,5 до 5,2 (в среднем 2,2±0.54). Соотношение между миелоидным и эритроидным ростками кроветворной ткани у больных ММ до и после мобилизации ГСКК и у доноров представлено в таблице 6.

После применения высоких доз ЦФ и Г-КСФ с целью мобилизации ГСКК наблюдалось повышение М:Е индекса по данным ИГХ-исследования. Мобилизация ГСКК с использованием высоких доз ЦФ и длительного применения Г-КСФ приводит к изменению соотношения клеток эритроидного и гранулоцитарного ряда в сторону увеличения последних.

Лигиогенез в костном мозге больных множественной миеломой на различных этапах высокодозной химиотерапии.

Ангиогенез в костном мозге на различных этапах терапии был исследован у 36 больных ММ. При этом в гистологических препаратах костного мозга были охарактеризованы качественные и количественные показатели состояния микрососудов.

Иммуногистохимическое исследование КМ здоровых доноров позволило установить, что количество микрососудов в гистологическом препарате составляло от 36,5 до 55,3 на 1 мм2. Среднее значение, равное 46,8+2,0 микрососудам/мм2, в данном исследовании было принято за условную норму.

Таблица 7

Изменение количества микрососудов в гистологических препаратах КМ больных ММ на каждом этапе интенсивной терапии.

Время исследования Характеристика противоопухолевого ответа Количество микрососудов в КМ п/мм2 (М + т, разброс значений) Р

До начала терапии 96,0 + 5,3 (66,7-139,6)

После индукции ПР + охЧР = 44,5% ЧР = 47,2% Стабилизац. = 8,3% 78,6 + 3,9 (52,2-135,5) Р,,2<0,01

Перед 1-ой аугоТГСКК ПР + охЧР = 55,5% ЧР = 41,7% Стабилизац. = 2,8% 68,6 + 3,4 (49,1-111,3) Р2д<0,01

Через 3 мес. после завершения трансплантационной методики ПР + охЧР = 77,8% ЧР= 19,4% Стабилизац. = 2,8% 60,8+1,8 (43,4-78,0) Рз,4<0,01

Здоровые доноры КМ 46,8 ± 2,0 (36,5-55,3) Р4,5<0,01

У пациентов с ММ в дебюте заболевания количество микрососудов более чем в 2 раза превышало таковое у доноров и составляло 66,6-139,6 микрососудов/мм2 (в среднем, 96,0+5,3). Ни в одном случае плотность микрососудов в КМ при развернутой фазе ММ не соответствовала нормальным значениям. После индукционного этапа терапии количество микрососудов несколько уменьшилось, но оставалось еще значительным и равнялось 52,2135,5 микрососудов/мм2, (в среднем 78,6+3,9). Перед выполнением 1-ой трансплантации показатели плотности микрососудов достоверно снизились по сравнению с предыдущими исследованиями и составили 49,1-111,3 микрососудов/мм2 (в среднем 68,6+3,4). Таким

образом, перед 1 аутотрансплантацией у 5 из 25 больных количество микрососудов было в норме, т.е. не превышало 48,6 сосудов/мм2. Через 3 месяца после завершения высокодозной трансплантационной терапии количество микрососудов было уже 43,4-78,0 микрососудов/мм2. При этом средние значения плотности микрососудов в эти сроки (60,8±1,8) снизились более чем на треть по сравнению с исходными; и у 8 пациентов число микрососудов в КМ нормализовалось, составив 43,4-55,3 сосудов/мм2. В таблице 7 представлена динамика показателей плотности микрососудов КМ и противоопухолевого ответа больных ММ на каждом этапе проводившегося лечения. Была выявлена статистически значимая обратная корреляция между количеством микрососудов в КМ и характеристикой противоопухолевого ответа (г„=-0,9, р=0,05). По мере увеличения процента полных и очень хороших частичных ремиссий после выполнения каждого из этапов интенсивного лечения количество микрососудов в КМ достоверно снижалось. Тем не менее, даже после окончания лечения среднее количество микрососудов у больных ММ оставалось достоверно выше, чем в контрольной группе (р<0,01).

Изменение состояния ангиогенеза в костном мозге на фоне мобилизации ГСКК. Изменение показателей плотности микрососудов в гистологических препаратах костного мозга больных ММ в результате применения ЦФ 6 г/м2 и Г-КСФ было изучено у 10 пациентов. Исследование выполнялось до начала мобилизации и сразу после завершения инъекций Г-КСФ. Рисунок 1 демонстрирует увеличение числа микрососудов у всех 10 обследованных больных.

СО О

ч

о о о : р,

к з

0

1 о

Рисунок 1.

Изменение плотности микрососудов КМ у 10 больных ММ на фоне применения Г-КСФ, назначенного после ЦФ в качестве мобилизации гемопоэтических стволовых клеток.

А - до начала мобилизации Б - после завершения инъекций Г-КСФ

Так, если перед мобилизацией плотность микрососудов составляла 52,2-84,3 микрососудов/мм2 (в среднем 72,5±3,1), то после 8-15 дневного применения Г-КСФ плотность микрососудов возросла до 78,6-103,1, (в среднем 90,0±2,6). Выявленные различия оказались статистически значимыми (р=0,005).

Далее был предпринят поиск аналогичных корреляций у больных острыми лейкозами и лимфопролиферативными заболеваниями на фоне мобилизации гемопоэтических стволовых клеток.

Рисунок 2

Увеличение плотности микрососудов в костном мозге после мобилизации гемопоэтических стволовых клеток крови у пациентов с различными гемобластозами.

У 14 пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями мобилизация выполнялась по схеме: курс полихимиотерапии ОехаВЕАМ (дексаметазон+ВОЩ+этопозид+цитарабин +мелфалан) с последующим назначением Г-КСФ в дозе 5 мкг/кг/сут подкожно с момента снижения числа леикоцитов в гемограмме менее 1x107л до окончания сбора ГСКК. После мобилизации плотность микрососудов у пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями возросла в среднем на 50% (с 30-83 (в среднем, 48,2±4,3) микрососудов/м2 до 52-112 (в среднем 73,2±4,4) микрососудов/м2). У больных острыми лейкозами схема мобилизации гемопоэтических стволовых клеток включала только гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. У пациентов из этой группы плотность сосудов до мобилизации составляла 14-55 (в среднем 43,9±4,2) микрососудов/мм2, тогда как после мобилизации она увеличилась на 55% (до 36-94 (в среднем 74,1±5,8) микрососудов/мм2). Причем у больных ОЛ, у которых можно оценить непосредственное действие Г-КСФ, наблюдалось максимальное увеличение плотности микрососудов.

Влияние плотности микрососудов в костном мозге больных ММ на отдаленные результатов высокодозной химиотерапии с последующей ауго-ТГСКК.

Поскольку на предыдущих этапах данного исследования была выявлена четкая взаимосвязь между величиной плотности микрососудов в КМ и степенью выраженности противоопухолевого ответа, нами была предпринята попытка определить наличие зависимости между количеством микрососудов в КМ перед первой аутотрансплантацией и показателями посттрансплантационной выживаемости без прогрессии.

82%

Ь.-• А

14% р=0,0008 -* Б

з ........, . . . .........

в О 20 40 60 80 100

Месяцы после ауто-ТГСКК

Рисунок 3

Выживаемость больных без признаков прогрессии ММ в зависимости от количества микрососудов в КМ перед 1-ой аутотрансплантацией (п=25).

А - количество микрососудов менее 68,6/мм2

Б - количество микрососудов более 68,6/мм2

Все больные были разделены на 2 группы в зависимости от показателя состояния ангиогенеза на момент выполнения 1-ой ауто' Б гантации. Вероятность 5-ти летней выживаемости без прогрессии составила 82% у больных с количеством микрососудов менее 68,6 на мм2, в отличие от 19% у больных с высоким содержанием микрососудов. (Рисунок 3).

Также было проведено сопоставление выживаемости больных без признаков прогрессии ММ от фазы заболевания на момент выполнения трансплантации. Как представлено на рисунке 4, вероятность выживаемости без признаков прогрессии ММ в течение 5 лет после трансплантации составляла 80% для больных I группы, у которых определялся высокий противоопухолевый ответ на индукционную терапию, в отличие от 13% для больных II группы, достигших перед трансплантацией лишь частичную ремиссию и стабилизацию заболевания.

03

Месяцы после ауто-ТГСКК

Рисунок 4

Выживаемость больных без признаков прогрессии ММ в зависимости от фазы заболевания перед 1-ой аутотрапсплантацией (п=36).

А - полная + очень хорошая частичная ремиссия

Б - частичная ремиссия + стабилизация

Таким образом, посттрансплантационная выживаемость больных ММ без признаков прогрессии заболевания статистически значимо зависела как от количества микрососудов в КМ, так и от степени противоопухолевого ответа перед 1 -ой аутотрансплантацией.

Кроме того, было выполнено сравнительное исследование отдаленных результатов аугологичной трансплантации у больных ММ в зависимости от различного сочетания перед трансплантацией двух изучавшихся признаков — количества микрососудов в КМ и степени противоопухолевого ответа. Наилучшие 5-летние результаты выживаемости без прогрессии наблюдались у больных с низкой плотностью микрососудов вне зависимости от достигнутого на этот момент противоопухолевого ответа.

В нашем исследовании основной акцент был сделан на изучении плотности микрососудов в КМ перед аутоТГСКК. И на основании полученных результатов отмечено, что выживаемость без признаков прогрессии значимо выше у тех пациентов, у которых количество сосудов в КМ перед трансплантацией было менее 68,6/мм2, вне зависимости от достигнутого на этот момент противоопухолевого ответа. Именно количество сосудов в КМ явилось признаком, определявшим вероятность сохранения ремиссии после аутоТГСКК, опережая по значимости противоопухолевый ответ, достигнутый на этапе индукционной терапии.

О 20 40 60 80 100

Месяцы после ауто-ТГСКК

Рисунок 5.

Выживаемость больных без признаков прогрессии ММ в зависимости от сочетания 2-х признаков: количества сосудов в КМ и ответа на терапию перед аутоТГСКК (п=25)

А - низкая плотность микрососудов + полная и очень хорошая частичная ремиссия;

Б - низкая плотность микрососудов + частичная ремиссия и стабилизация; В - высокая плотность микрососудов + полная и очень хорошая частичная ремиссия;

Г - высокая плотность микрососудов + частичная ремиссия и стабилизация

Выводы

1. Применение гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в сочетании с циклофосфаном у больных множественной миеломой приводит к увеличению в костном мозге числа клеток гранулоцитарного ряда с 58,4 ± 3,9% до 76,2 ± 4,1% и к резорбции костной ткани, проявляющейся снижением ее площади с 14,4 + 0,62% до 13,1 ± 0,60%. При этом не возрастает общая клеточность костного мозга.

2. В дебюте множественной миеломы опухолевая инфильтрация костного мозга сопровождается значительно выраженным неоангиогенезом (плотность микрососудов достигает 96,0 + 5,3 микрососудов/мм2). В результате индукционной и консолидирующей терапии происходит достоверное снижение этого показателя (до 78,6 ± 3,9 и 60,8 + 1,8 микрососудов/мм2, соответственно). При этом у 30,8% больных после ауготрансплантации плотность микрососудов снижается до нормальных значений.

3. Состояние ангиогенеза является важным прогностическим признаком, определяющим продолжительную выживаемость больных множественной миеломой после аутологичной трансплантации. Вероятность 5-летней посттрансплантационной выживаемости без признаков прогрессии составляет 90% для больных с низкой плотностью (менее 68,6/мм2) микрососудов и полной и очень хорошей частичной ремиссией перед выполнением аутотрансплантации, 68% - для больных с низкой плотностью микрососудов и частичной ремиссией, и 20% для больных с высокой плотностью (более 68,6/мм2) микрососудов даже при наличии полной и очень хорошей частичной ремиссии.

4. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор в схеме мобилизации приводит к достоверному увеличению плотности микрососудов в костном мозге у больных множественной миеломой (с 72,5 ±3,1 до 90,0 ± 2,6 микрососудов/мм2, р<0,05), а также при лимфосаркомах и лимфогранулематозе (с 48,2 ± 4,3 до 73,2 ± 4,4 на мм2, р<0,05) и у больных острыми лейкозами (с 43,9 ± 4,2 до 74,1 + 5,8 микрососудов/мм2, р<0,05).

5. Мобилизация гемопоэтических стволовых клеток крови с использованием различных доз циклофосфана (6 г/м2 или 4 г/м2) и гранулоцигарного колониестимулирующего фактора обеспечивает сбор С034+ клеток в количестве, достаточном для выполнения двойной аутотрансплантации (29,45 ± 3,37 и 21,1 ± 3,68 х106/кг С034+клеток, соответственно) у 94,9 - 100% больных. Применение циклофосфана в дозе 6 г/м2 сопровождалось более высоким выбросом С034+ клеток в периферическую кровь (р<0,01), в то время как при дозе циклофосфана 4 г/м2 отмечена достоверно меньшая (р<0,05) потребность в заместительной гемотрансфузионной терапии.

6. Начало применения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в схеме мобилизации стволовых клеток крови при уровне лейкоцитов менее 1 х109/л не снижает эффективность мобилизации и сбора СО 34+ клеток, позволяя сэкономить 4-5 инъекций препарата.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Покровская О.С., Менделеева Л.П., Гальцева И.В., Варламова Е.Ю., Капланская И.Б., Воробьев И.А., Грецов Е.М., Калинин Н.Н., Варламова C.B., Клясова Г.А., Тихонова Л.Ю., Савченко В.Г.//Мобилизация гемопоэтических клеток крови у больных миеломной болезнью//Проблемы гематологии и переливания крови.-2003.-№2.-С.55.

2. Покровская О.С., Менделеева Л.П., Капланская И.Б., Семенова Е.А., Любимова Л.С., Грибанова Е.О., Савченко В.Г.//Изменение клеточности костного мозга в зависимотси от режимов мобилизации гемопоэтических стволовых клеток крови//Проблемы гематологии и переливания крови.-2004.-№2.-С.54.

3. Pokrovskaya О., Mendeleeva L., Kaplanskaya I., Semenova E., Lubimova L., Savchenko V.//The effects of G-CSF on bone marrow cellularity, CD34, Ki67, CD106 und CD95 expressions during haematopoietic stem cell mobilization//Bone Marrow Transplantation.-2005,-Vol.35,Suppl. 2: 31th Annual meeting European Group for Blood and Marrow Transplantation.-P.334, abstr. 1105.

4. Менделеева Л.П., Савченко В.Г., Тюрина Н.Г., Варламова Е.Ю., Момотюк К.С., Любимова Л.С., Грибанова Е.О., Устинова Е.Н., Покровская О.С., Митиш Н.Е., Жеребцова В.А., Капланская И.Б., Воробьев И.А., Грецов Е.М., Калинин Н.Н.//Высокодозная химиотерапия и аутотрансплантация при множественной миеломе//Современная онкология.-2006.-Т.8,№1.-С.55- 57.

5. Менделеева Л.П., Покровская О.С., Грибанова Е.О., Гапонова Т.В., Желнова Е.И., Анухина М.В., Урнова Е.С., Варламова Е.Ю., Калинин Н.Н., Грецов Е.М., Савченко В.Г. //Высокодозная химиотерапия с последующей аутотрансплантацией у пожилых больных множественной миеломой/ЛСпиническая геронтология.-2007.-Т. 13,№4.-С.20-24

6. Покровская О.С.//Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор: механизмы мобилизации гемопоэтических стволовых клеток периферической крови и системные эффекты применения//Терапевтический архив.-2007.-Т.79,№7.-С.83-87.

7. Pokrovskaya О., Mendeleeva L., Lubimova L., Kaplanskaya I., Savchenko V//Increase of bone marrow angiogenesis during stem cell mobilization with granulocyte colony-stimulating factor//Bone Marrow Transplantation.-2008.-Vol.41,Suppl.1: 34-th Annual meeting European Group for Blood and Marrow Transplantation.-P. 149, abstr.587.

8. Менделеева Л.П., Покровская О.С.//Протокол высокодозной химиотерапии и трансплантации аутологичных гемопоэтических клеток при множественной миеломе//В кн.:

Программное лечение лейкозов. Под ред. член-корр. РАМН В.Г.Савченко.-М.,2008.-С.358-399.

9. Менделеева Л.П., Покровская О.С.//Протокол мобилизации гемопоэтических стволовых клеток крови//В кн.: Программное лечение лейкозов. Под ред. член-корр. РАМН В.Г.Савченко.-М.,2008.-С. 343-357.

10. Pokrovskaya О., Mendeleeva L., Kaplanskaya I., Parovichnikova E., Kulikov S., Savchenko V.//Prognostic value of bone marrow angiogenesis in patients with multiple myeloma undergoing high-dose therapy and autologous stem cell transplantation//Blood.-2008.-Voll 12,№11:15-th annual meeting of American Society of Hematology, San Francisco, December 6-8, 2008).-P.l 141, abstr.3321.

11. Менделеева Л.П., Покровская О.С., Урнова Е.С., Грецов Е.М., Пантелеев А.В., Калинин Н.Н., Штырева Е.М.//Мобилизация препаратом филграстима - граногеном аутологичных гемопоэтических стволовых клеток крови у больных с онкогематологически-ми заболеваниями//Гематология и трансфузиология.-2009.-Т.54,№3.-С.31-36.

12. Покровская О.С., Менделеева Л.П., Урнова Е.С., Алексеева И.В., Калинин Н.Н., Штырева Е.М., Грецов Е.М., Пантелеев А.В., Савченко В.Г.//Мобилизация аутологичных гемопоэтических клеток с использованием высоких доз циклофосфана и Г-КСФ у больных множественной миеломой//Вестник гематологии.-2009.-Т.5,№2.-С.33-34.

13. Pokrovskaya О., Mendeleeva L., Kaplanskaya I., Varlamova E., Parovichnikova E., Kulikov S., Savchenko V.//Bone marrow angiogenesis is a prognostic value in patients with multiple myeloma undergoing high-dose therapy and autologous stem cell transplantation//Cellular Therapy and Transplantation.-2009.-Vol.2, №5.-P.95-96.

14. Pokrovskaya O., Mendeleeva L., Urnova E., Alekseeva I., Gribanova E., Gretsov E., Panteleev A., Savchenko V.//High-dose or intermediate-dose cyclophosphamide plus granulocyte colony-stimulating factor for progenitor cell mobilization in patients with multiple myeloma.// Haematologica.-2010.-Vol.95,Suppl.2: Abstract book of 15-th Congress of the European Hematology Association, Barcelona, Spain, June 10-13, 2010.-P.578, abstr.1448.

15. Покровская О.С., Менделеева Л.П., Капланская И.Б., Грибанова Е.О., Варламова Е.Ю., Обухова Т.Н., Гемджян Э.Г., Савченко В.Г.//Ангиогенез в костном мозге больных множественной миеломой на различных этапах высокодозной химиотерапии//Клиническая онкогематология.-2010.-Т.З.-№4.-С. 347-353

16. Pokrovskaya О., Mendeleeva L., Alekseeva I., Gaponova T., Urnova E., Gribanova E., Varlamova E., Kalinin N., Gretsov E., Savchenko V.//Treatment of multiple myeloma with autologous stem cell transplantation: a long-term observation//Bone Marrow Transplantation. -

2011.-Vol.45,Suppl.l: 37th Annual meeting European Group for Blood and Marrow Transplantation.-P.265, abstr.P906

17. Покровская О .С.,. Менделеева Л.П., Урнова E.C., Гапонова T.B., Грибанова Е.О., Алексеева И.В., Дроков М.Ю., Калинин Н.Н., Грецов Е.М., Клясова Г.А., Савченко В.Г. Оптимизация режимов мобилизации гемопоэтических стволовых клеток крови у больных множественной миеломой/ГГерапевтический архив.-2011.-Т.83.-№7.-С. 50-57

Список сокращений.

СО - кластер дифференцировки

Ауто-ТГСКК - трансплантация аутологичных гемопоэтических стволовых клеток крови

Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

ГСКК - гемопоэтические стволовые клетки крови

ИГХ-исследование - иммупогистохимическиое исследование

КМ - костный мозг

ММ - множественная миелома

МПО - миелопероксидаза

ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз

ОМЛ - острый миелобластный лейкоз

охЧР - очень хорошая частичная ремиссия

ПР - полная ремиссия

ЧР - частичная ремиссия

Курсы химиотерапии:

РАО - велкейд, адриамицин, дексаметазон УАО - винкристин, адриамицин, дексаметазон УСБ - велкейд, циклофосфан, дексаметазон УО - велкейд, дексаметазон МР - мелфалан, преднизолон

М2 - винкристин, кармустин, мелфалан, циклофосфан, преднизолон ЕБАР - этопозид, дексаметазон, цитарабин, цисплатин ЦФ - циклофосфан

Беха-БЕАМ - дексаметазон, ВСЖ1, этопозид, цитарабин, мелфалан

Заказ№66-Р/08/2011 Подписано в печать 25.08.2011 Тираж 50экз. Усл. п.л. 1,4

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Актуальность проблемы.

Внедрение в клиническую практику рекомбинантных человеческих гемопоэтических ростовых факторов, которые способствуют увеличению концентрации клеток-предшественниц в крови, расширило возможности использования периферической крови в качестве источника гемопоэтических клеток как для аутологичной, так и для аллогенной трансплантации. В последние 15 лет гранулоцитарный колониестимулирующий фактор зарекомендовал себя в качестве эффективного средства, мобилизующего СБ34+ клетки в периферическую кровь. Несмотря на многочисленные исследования, остается дискутабельным вопрос о необходимом количестве СБ34+ клеток для успешного и быстрого восстановления. гемопоэза после аутотрансплантации. Схемы, содержащие только гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, используются для мобилизации гемопоэтических стволовых клеток крови при различных онкогематологических заболеваниях. Преимуществами такой мобилизации на фоне стабильного состояния кроветворения является отсутствие фебрильной нейтропении, тяжелых инфекционных осложнений, продолжительной госпитализации, необходимости применения антибактериальной терапии и заместительных трансфузий компонентов крови. Однако количество СЭ34+ клеток, которое удается собрать в результате мобилизации с использованием только одного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, значительно уступает таковому при использовании сочетания химиотерапевтических препаратов и ростового фактора. До сих пор не решен вопрос, какая схема мобилизации является оптимальной, позволяющей заготовить количество СБ34+ клеток, достаточное для быстрого и полноценного восстановления гемопоэза.

Высокодозная химиотерапия с последующей трансплантацией аутологичных гемопоэтических стволовых клеток является стандартом в современной терапии больных множественной миеломой моложе 65 лет. Так, по данным Европейского Регистра по трансплантации костного мозга, в 2009 году всего выполнено 16591 трансплантация аутологичных гемопоэтических клеток, при этом наиболее частым показанием для выполнения аутотрансплантации была множественная миелома. При этой нозологии выполнено 6918 трансплантаций аутологичных гемопоэтических клеток, что составляет 41,7% от общего количества.

Целесообразность сбора значительного количества С034+клеток у больных множественной миеломой диктуется не только потребностью выполнения двух трансплантаций. Анализ течения раннего посттрансплантационного периода у больных множественной миеломой, лейкозами и лимфомами показал, что доза' перелитых С034+ клеток оказывает влияние на сроки восстановления гранулоцитов в периферической крови.

Несмотря на многочисленные исследования, до настоящего времени нет однозначного ответа на вопрос о механизмах воздействия гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на кроветворение, которые обеспечивают «выход» СБ34+ клеток в кровь. В литературе представлены противоречивые сведения о стимуляции пролиферации костномозговых клеток, а также о клетках, служащих мишенями для действия гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и посредниками в реализации его эффектов.

Сообщается, что при множественной миеломе происходит выраженное новообразование сосудов, однако отсутствуют четкие сведения об изменении сосудистого русла на разных этапах терапии, а также роль ангиогенеза как прогностического фактора. Имеются лишь единичные работы, посвященные изучению влияния гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на кроветворение с использованием гистологических и цитологических методик. В основном встречаются работы, в которых представлены результаты иммунофенотипического и молекулярного анализа. Однако изучение гистологической и иммуногистохимической картины остается единственным способом, позволяющим оценить структуру костного мозга и взаимодействие клеточных элементов, в частности — стромы и гемопоэтической ткани, полноценно оценить клеточность костного мозга. Нами не найдено работ, подробно анализирующих изменения, происходящие в костном мозге и стромальном микроокружении при различных режимах мобилизации гемопоэтических стволовых клеток крови.

В связи с этим представляется важным сопоставить результаты мобилизации, и сбора гемопоэтических стволовых клеток крови у больных множественной миеломой в зависимости от дозы химиотерапевтического препарата циклофосфана, включенного в схему мобилизации; оценить влияние мобилизующих агентов на костномозговое кроветворение и изучить некоторые клинические эффекты. Комплекс перечисленных проблем и определил выбор темы данной научной работы.

Цель работы:

Изучение состояния кроветворной ткани и стромального микроокружения на фоне применения Г-КСФ в различных схемах мобилизации гемопоэтических стволовых клеток крови, а также интенсивной индукционной и консолидирующей терапии у больных множественной миеломой.

Задачи работы:

1. Изучить эффективность мобилизации и сбора гемопоэтических стволовых клеток крови у больных ММ в зависимости от дозы циклофосфана, сроков начала инъекций Г-КСФ, схем индукционной химиотерапии для оптимизации мобилизационных режимов.

2. Исследовать состояние кроветворения у больных ММ на фоне мобилизации гемопоэтических стволовых клеток крови гистологическим, морфометрическим и иммуногистохимическим методами.

3. Изучить плотность микрососудов в костном мозге у больных ММ в дебюте заболевания, после индукции и высокодозной консолидации с последующей аутологичной трансплантацией.

4. Проанализировать влияние схемы мобилизации гемопоэтических стволовых клеток крови на анпюгенез в костном мозге у больных ММ.

5. Оценить значимость показателя плотности микрососудов в костном мозге больных ММ как прогностического фактора, влияющего на вероятность посттрансплантационной выживаемости без признаков прогрессии.

Научная новизна.

В работе проанализирована эффективность мобилизации и сбора гемопоэтических стволовых клеток крови в зависимости от дозы циклофосфана, используемого в схеме мобилизации, показано влияние различных схем индукционной терапии, сроков начала инъекций гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на результаты мобилизации гемопоэтических стволовых клеток крови у больных множественной миеломой.

Проведен подробный анализ изменений в костном мозге больных множественной миеломой и острыми лейкозами, происходящих на фоне мобилизации гемопоэтических стволовых клеток крови с использованием гистологических, морфометрических и иммуногистохимических методов с маркерами гемопоэтических клеток. Выполнено сравнение результатов цитологического и иммуногистохимического исследований.

Изучены параметры ангиогенеза в костном мозге у больных множественной миеломой на каждом этапе программной терапии. Впервые показано, что количество сосудов в костном мозге является признаком, определяющим вероятность сохранения ремиссии после трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток крови, опережая по значимости противоопухолевый ответ, достигнутый на этапе индукционной терапии.

Впервые изучено влияние различных режимов мобилизации на ангиогенез в костном мозге.

Научно-практическая ценность работы.

Оптимизирован режим мобилизации и сбора гемопоэтических стволовых клеток крови-у больных множественной миеломой. Отработаны сроки начала введений ростового фактора, позволившие сэкономить 4-5 инъекций препарата. Установлены оптимальные дозы циклофосфана в схеме мобилизации, обеспечивающие заготовку необходимого количества СОЗЛ+ клеток при минимальной потребности в сопроводительной терапии.

Изучены гистологические изменения, происходящие в кроветворной ткани и стромальном микроокружении на фоне мобилизации гемопоэтических стволовых клеток крови. Показана роль ангиогенеза в костном мозге в становлении длительной ремиссии после высокодозной химиотерапии с последующей трансплантацией аутологичных гемопоэтических стволовых клеток крови.

Пути практической реализации.

Результаты исследования внедрены в практику работы отделения высокодозной химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга ГНЦ МЗСР РФ. На основании этих результатов создан протокол мобилизации гемопоэтических стволовых клеток крови.

Выводы

1. Применение гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в сочетании с циклофосфаном у больных множественной миеломой приводит к увеличению в костном мозге числа клеток гранулоцитарного ряда с 58,4 ± 3,9% до 76,2 14,1% и к резорбции костной ткани, проявляющейся снижением ее площади с 14,4 ± 0,62% до 13,1 ± 0,60%. При этом не возрастает общая клеточность костного мозга.

2. В дебюте множественной миеломы опухолевая инфильтрация костного мозга сопровождается значительно выраженным неоангиогенезом (плотность микрососудов достигает 96,0' ± 5,3 микрососудов/мм). В результате индукционной и консолидирующей терапии происходит достоверное снижение этого показателя (до 78,6 ± 3,9- и 60,8 ± 1,8 л микрососудов/мм , соответственно). При этом у 30,8% больных после аутотрансплантации плотность микрососудов снижается до нормальных значений.

3. Состояние ангиогенеза является важным прогностическим признаком, определяющим продолжительную выживаемость больных множественной миеломой после аутологичной трансплантации. Вероятность 5-летней посттрансплантационной выживаемости без признаков прогрессии составляет 90% для больных с низкой плотностью (менее 68,6/мм ) микрососудов и полной и очень хорошей частичной ремиссией перед выполнением аутотрансплантации, 68% - для больных с низкой плотностью микрососудов и частичной ремиссией, и 20% для

14 больных с высокой плотностью (более 68,6/мм ) микрососудов даже при наличии полной и очень хорошей частичной ремиссии.

4. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор в схеме мобилизации приводит к достоверному увеличению плотности микрососудов в костном мозге у больных множественной миеломой (с 72,5 л

3,1 до 90,0 ± 2,6 микрососудов/мм , р<0,05), а также при лимфосаркомах и лимфогранулематозе (с 48,2 ± 4,3 до 73,2 ± 4,4 на мм2 , р<0,05) и у больных острыми лейкозами (с 43,9 ± 4,2 до 74,1 + 5,8 микрососудов/мм2, р<0,05).

5. Мобилизация гемопоэтических стволовых клеток крови с

О О использованием различных доз циклофосфана (6 г/м или 4 г/м ) и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора обеспечивает сбор СБ34+ клеток в количестве, достаточном для выполнения двойной аутотрансплантации (29,45 ± 3,37 и 21,1 ± 3,68 х106/кг С034+клеток, соответственно) у 94,9 — 100% больных. Применение циклофосфана в дозе 6 г/м сопровождалось более высоким выбросом СИЗ 4+ клеток в периферическую кровь (р<0,01), в то время как при дозе циклофосфана 4 л г/м отмечена достоверно меньшая (р<0,05) потребность в заместительной гемотрансфузионной терапии.

6. Начало применения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в схеме мобилизации стволовых клеток крови при уровне леикоцитов менее

1 х109/л не снижает эффективность мобилизации и сбора СБ 34+ клеток, позволяя сэкономить 4-5 инъекций препарата.

Заключение

Высокодозная химиотерапия с последующей трансплантацией аутологичных гемопоэтических стволовых клеток является стандартом в современной терапии больных ММ моложе 65 лет. Благодаря внедрению в практику интенсивных высокодозных лечебных стратегий, а также новых биологически направленных лекарственных препаратов (ингибиторы протеосом, иммуномодуляторы), взгляды клиницистов на результаты терапии ММ значительно изменились. Появилась возможность обсуждать не только частоту полных и частичных ремиссий у больных ММ, но и оценивать длительность ремиссий, а также зависимость продолжительности ответа на лечение от глубины этого ответа. В клинических исследованиях последнего десятилетия было убедительно показано, что достижение полной ремиссии ассоциируется* с длительной" выживаемостью больных без прогрессии заболевания (ВБП). В то же время у пациентов, противоопухолевый ответ на лечение у которых был минимальным (МО) или не превышал параметров частичного (ЧО), прогрессия ММ наблюдалась в ближайшие сроки. [37, 132, 154, 229] В. Ваг^1е и соавт., проанализировав отдаленные результаты лечения ММ по программе Тотальной Терапии 2, показал, что достижение полной ремиссии сопровождается также и более высокими показателями, общей выживаемости. [38] Аналогичную закономерность отмечали Клш 18 и соавт., изучавшие влияние фазы заболевания перед аутологичной трансплантацией на общую выживаемость больных после трансплантации. При медиане посттрансплантационного наблюдения 22,4 месяца (разброс 0,4-96 мес.), общая выживаемость пациентов с документированной ПР перед трансплантацией значительно превышала таковую у пациентов, трансплантация которым выполнялась на фоне лишь ЧР (р=0,0015). [132].

Несмотря на многочисленные исследования, остается дискутабельным вопрос о необходимом количестве СЭ34+ клеток для успешного и быстрого восстановления гемопоэза после аутотрансплантации. [55, 78, 94, 102, 124, 173, 184. 227, 228, 256, 265] Целесообразность сбора значительного количества СЭ34+клеток у больных ММ диктуется не только потребностью выполнения двух трансплантаций. Анализ течения раннего посттрансплантационного периода у больных ММ, лейкозами и лимфомами показал, что доза перелитых СБ34+клеток оказывает влияние на сроки восстановления гранулоцитов в периферической крови. Так, продолжительность агранулоцитоза была достоверно меньше в группе больных, которым было трансплантировано более 5x106 СЭ34+ клеток/кг. Антибиотикотерапия у этих пациентов была отменена достоверно раньше, чем у больных с меньшей дозой трансплантированных С034+ клеток. Однако частота и характер инфекционных осложнений в ранние сроки после аутотрансплантации не зависели от дозы перелитых клеток и были одинаковыми у больных, которым перелили как более, так и менее 5x106 СБ34+ клеток/кг. [6].

Схемы, содержащие только Г-КСФ, используются для мобилизации ГСКК при различных онкогематологических заболеваниях. Преимуществами такой мобилизации на фоне стабильного состояния кроветворения является отсутствие фебрильной нейтропении, тяжелых инфекционных осложнений, продолжительной госпитализации, необходимости применения антибактериальной терапии и заместительных трансфузий компонентов крови. Однако количество С034+ клеток, которое удается собрать в результате мобилизации одним Г-КСФ, значительно уступает таковому при использовании сочетания химиотерапевтических препаратов и ростового фактора. [4, 42, 212] Клинические исследования, выполнявшиеся в нашей клинике в предыдущие годы, также статистически незначимыми. Что же касается параметров, характеризующих тромбоцитарный и эритроцитарный ростки кроветворения после применения схемы ЦФ+Г-КСФ, то глубокая тромбоцитопения и анемия наблюдались значительно чаще после применения ЦФ в дозе 6 г/м , что требовало достоверно большего объема заместительных трансфузий.

Аналогичные сведения представлены в некоторых зарубежных публикациях. Авторы отметили, что при практически равнозначных количествах собранных СБ34+клеток, в группе ЦФ 4 г/м2 отмечена л меньшая длительность нейтропении по сравнению с группой ЦФ 7г/м , меньшее число фебрильных эпизодов (73,8 и 97,3% соответственно, р<0,001), что потребовало меньшего применения системных антибиотиков (69,1 и 97,3% соответственно, р<0,001). Заместительные трансфузии л тромбоконцентратов также реже проводились в группе ЦФ 4 г/м по л сравнению с ЦФ 7 г/м (26,2 и 75,7% соответственно, р<0,001). Однако более 2,5x106/кг СБ34+ клеток удалось заготовить у 92,7% больных в группе ЦФ 4 г/м и лишь у 67,6% больных в группе ЦФ 7г/м , что связано с большей частотой инфекционных осложнений. [87, 123, 135]

С целью определения оптимальных сроков начала введений колониестимулирующего фактора в схеме мобилизации ЦФ + Г-КСФ, были проанализированы результаты мобилизации и сбора ГСКК у л больных, доза ЦФ у которых равнялась 6 г/м . Было показано, что дата первого сбора ГСКК выпадала на одни и те же сроки (медиана - 15-ый день после введения ЦФ) вне зависимости от того, на 3-ий, 5-ый день от начала мобилизации или уже на фоне развившегося агранулоцитоза приходилось начало инъекций Г-КСФ. Эффективность мобилизации и сбора ГСКК также оказалась одинаковой независимо от сроков начала введения Г-КСФ или от продолжительности его применения. Полученные нами результаты подтвердили, что экономия 3-5 доз Г-КСФ у каждого пациента за счет более позднего назначения препарата в схеме мобилизации не снижает эффективность мобилизации ГСКК, обеспечивая достаточный для нескольких аутологичных трансплантаций сбор СЭ34+ клеток.

На основании проведенного анализа стало возможным заключить, что схема ЦФ+Г-КСФ является адекватной для мобилизации ГСКК у больных ММ. В нашей работе у 90 из 93 (96,7%) больных мобилизация по этой схеме завершилась успешным сбором СВ34+ клеток в количестве, достаточном для двух аутотрансплантаций. Эффективность мобилизации и сбора ГСКК не зависела от сроков начала введения Г-КСФ или от продолжительности его применения, что позволило оптимизировать схему мобилизации. Нами было показано, что начало лейкаферезов приходится в среднем на 15-ый день после введения ЦФ. Это позволяет планировать приблизительные сроки начала мобилизации, чтобы сбор С034+ клеток, по возможности, не выпадал на выходные дни. Кроме того, при подробном анализе роли импульсного воздействия высоких доз циклофосфана в формировании противоопухолевого ответа при ММ было выявлено, что дополнительный противоопухолевый эффект наблюдался лишь у пациентов с химиочувствительной опухолью. При сохраняющейся значимой секреции парапротеина (5,2-16,8 г/л) не происходило выраженной редукции опухолевого клона. Доза ЦФ, равная 4 г/м , может рассматриваться как оптимальная, позволяющая собрать достаточное для двух аутотрансплантаций количество СБ34+ клеток, сопровождающаяся менее глубокой тромбоцитопенией и меньшей потребностью в заместительных трансфузиях, и не вызывающая серьезных токсических осложнений.

Гистологическое исследование костного мозга, особенно проведенное в динамике на разных этапах подготовки и проведения аутоТГСКК, является единственным методом, позволяющим оценить структуру, клеточность и взаимоотношение клеточных элементов гемопоэтической ткани и стромы и, таким образом, получить наиболее полную и достоверную характеристику костномозгового кроветворения. Нам встретились лишь единичные работы, в которых описаны изменения в костном мозге, строме и костной ткани больных ММ, происходящие на фоне лечения. [5, 11]

С целью более глубокого изучения изменений, происходящих в кроветворной ткани и стромальном микроокружении при мобилизации ГСКК у больных ММ, нами были использованы гистологические, иммуногистохимические и морфометрические методы исследования. Показано, что применение высоких доз ЦФ с последующим длительным назначением Г-КСФ с целью мобилизации ГСКК не влияет на общую клеточность костного мозга, но приводит к нарушению соотношения! среди клеток нормального гемопоэза. Это проявляется заметным снижением количества эритрокариоцитов, в то время- как происходит увеличение клеток гранулоцитарного ростка. Количество мегакариоцитов после мобилизации у большинства больных оставалось сниженным, тогда как до мобилизации у 50% пациентов мегакариоцитарный росток был нормальным или расширенным.

Результаты гистологического исследования КМ были подтверждены морфометрическим и иммуногистохимическим исследованием. Отмечено, что соотношение площади кроветворной ткани и площади жировой ткани практически не изменилось. Небольшое повышение площади кроветворной ткани после мобилизации (44,1 ± 3,19% против 41,6 ± 1,93%, соответственно) статистически не достоверно. В то же время выявлено достоверное снижение площади костной ткани после мобилизации (13,1 ± 0,60% против 14,4 ± 0,62%. соответственно). Объяснения этого факта можно найти в работах Bishop N.J. и соавт., а также ряда других авторов, где было показано, что длительное применение Г-КСФ у молодых пациентов с тяжелой врожденной нейтропенией приводит к развитию остеопороза. [49] Уже на 3-й день применения Г-КСФ уменьшается концентрация специфического маркера костеобразования — сывороточного остеокальцина. Деградация костной ткани продолжается и после отмены Г-КСФ: в течение всего времени введения Г-КСФ и вплоть до 7-го дня после его отмены в моче оставалась повышенной концентрация дезоксипиридинолина — специфического маркера резорбции костной ткани. В эксперименте на мышах было обнаружено, что после назначения Г-КСФ количество остеокластов в костном мозге увеличивалось одновременно с повышением содержания дезоксипиридинолина в моче. [240].

После применения высоких доз ЦФ и Г-КСФ с целью мобилизации ГСКК наблюдалось повышение М:Е индекса как по данным ИГХ-исследования (до 4,9 ± 0,72), так и по данным подсчета миелограммы (до 6,93 ± 1,46), что еще раз достоверно подтверждало увеличение количества клеток миелоидного ряда. При этом повышение содержания клеток гранулоцитарного ряда и снижение количества эритрокариоцитов было выражено более ярко при изучении цитологических препаратов.

После мобилизации не было выявлено увеличения содержания СБ34+ клеток в костном мозге. Более того, ни в одном случае СБ34+ незрелые предшественники гранулоцитарного ряда не были обнаружены в центрах костномозговых полостей. Данный факт доказывает, что режим мобилизации ЦФ + Г-КСФ ведет к расширению гранулоцитарного ростка за счет увеличения содержания молодых форм, но не примитивных клеток, экспрессирующих С034+.

Мы учитывали, что изменения, произошедшие в костном мозге больных ММ после мобилизации ГСКК, связаны не только с длительным использованием Г-КСФ, но и с импульсным воздействием высоких доз ЦФ. Для того, чтобы изучить непосредственное влияние Г-КСФ на костномозговое кроветворение, нами было оценено состояние КМ у больных гемобластозами, которым мобилизация ГСКК проводилась в виде монотерапии Г-КСФ на фоне стабильного состояния кроветворения. Проведенное гистологическое исследование продемонстрировало, что после мобилизации у больных ОЛ резко возросла клеточность костного мозга, у 77,8% пациентов был выявлен гиперклеточный костный мозг, тогда как до мобилизации у 66,7% пациентов отмечалась гипоплазия кроветворения. Увеличение клеточности также было обусловлено увеличением числа клеток гранулоцитарного ряда. При этом не было выявлено влияния Г-КСФ на мегакариоцитарный росток. После применения Г-КСФ в гистологических препаратах КМ больных ОЛ, также как и у пациентов с ММ не было выявлено увеличения содержания примитивных СБЗ 4-позитивных клеток.

Результаты нашего исследования сопоставимы с данными, полученными- С.Маг1:те2 и соавт., исследовавших влияние Г-КСФ на содержание С034+ клеток и наиболее ранних клеток-предшественниц в костном мозге у 10 здоровых доноров, которым мобилизация ГСКК проводилась на фоне стабильного состояния кроветворения. Было выявлено значительное увеличение количества ядросодержащих клеток в костном мозге на фоне применения ростового фактора. Процентное содержание СБ34+ клеток в костном мозге уменьшалось с 0,88 (0,47-1,44) в первый день до 0,57 (0,32-1,87) в третий день и 0,42 (0,16-0,87) в пятый день. Авторы отметили небольшое увеличение общего количества С034+ клеток костного мозга на третий день мобилизации (0,66 х 109/л (0,130,77)), и снижение на пятый день (0,23 х 109/л (0,06-1,23)) по сравнению с исходными значениями (0,40 х 109/л (0,06-1,68)). Было выявлено уменьшение в костном мозге процентного содержания наиболее примитивных клеток-предшественниц (СБ34+СБ38-, СВ34+НЬА-1Ж-, СВ34+СВ117-). [168] Однако это исследование было выполнено с использованием цитологических и иммунофенотипических методик, что не позволяет оценить локализацию CD34+ клеток.

Полученные нами данные подтверждают имеющиеся сведения об отсутствии влияния Г-КСФ на количественное содержание CD34+ клеток. Более того, при проведении повторных процедур лейкафереза на фоне продолжающихся инъекций Г-КСФ не происходит дальнейшего увеличения количества CD34+ клеток в периферической крови. [131] Предполагается, что основную роль в процессе мобилизации CD34+ клеток в периферическую кровь играют нейтрофилы, в гранулах которых содержится эластаза и катепсин G. В ответ на связывание Г-КСФ с рецептором, зрелые гранулоциты индуцируют секрецию ферментов; Эластаза играет главную роль в миграции CD34+ клеток из стромы КМ путем разрушения VLA-4 и VCAM. Эти протеазы также разлагают CXCR4 и SDF-1. [155-158, 251], Применение Г-КСФ или циклофосфамида (ЦФ) ведет к резкому уменьшению экспрессии VCAM-1, что совпадает с накоплением гранулоцитов и высвобождением активных протеаз нейтрофилов (нейтрофильной эластазы и катепсина G), in vitro разрушающих VCAM-1/CD106. [158].

При изучении гистологических препаратов костного мозга больных множественной миеломой нами было обращено внимание на увеличенное количество микрососудов в кроветворной ткани. Причем плотность микрососудов то снижалась, то возрастала на фоне выполнения различных этапов терапии. Роль неоангиогенеза при некоторых опухолевых заболеваниях изучалась различными исследователями в течение последних лет. Прогностическое значение неоваскуляризации было впервые описано при меланоме кожи. Было найдено, что увеличенная сосудистая плотность при меланоме коррелирует с высоким метастатическим потенциалом. [103, 230]. Позже этот биологический феномен был описан и для других солидных и гематологических опухолей. [19-21, 28, 84, 105;, 162, 261] Так, у пациентов с острыми лейкозами плотность микрососудов в костном мозге в дебюте заболевания достоверно превышала таковую у пациентов контрольной группы, а при достижении клинико-гематологической ремиссии количество микрососудов было сравнимо с контрольной группой. [2]

Также имеются сообщения о наличии обратной зависимости между бессобытийной выживаемостью и уровнем факторов роста УЕвР и ЬБвР в сыворотке крови у пациентов с лимфомами. [46, 47, 214]

Некоторыми авторами было выявлено увеличение плотности микрососудов в костном мозге у больных множественной миеломой, причем как на фоне развернутой картины заболевания, так и после высокодозной химиотерапии и даже трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток. Кроме того, было показано; что ангиогенез в костном мозге прогрессивно возрастает по мере озлокачествления парапротеинемического гемобластоза, начиная от моноклональной гаммапатии неясного генеза, «тлеющей» миеломы, множественной миеломы с клиническими проявлениями и заканчивая рецидивирующим и прогрессирующим течением ММ. [182, 204, 205, 219, 220, 250] Кроме того, О. Бегег и соавт. показали достоверные различия выживаемости больных ММ в зависимости от наличия низкой или высокой плотности микрососудов в костном мозге в дебюте заболевания. Также сообщалось о корреляции большого количества микрососудов в костном мозге и факторов неблагоприятного прогноза. Однако, несмотря на столь высокий интерес исследователей к значению ангиогенеза в клиническом течении ММ, в литературе не было найдено сведений, характеризующих динамику состояния ангиогенеза на всех этапах программной химиотерапии ММ от индукции до высокодозной консолидации.

В целях оценки прогностического значения ангиогенеза, нами было изучено изменение количества микрососудов в костномозговой ткани больных ММ на фоне проведения индукционной и высокодозной химиотерапии с последующей трансплантацией аутологичных гемопоэтических клеток, а также определена взаимозависимость состояния ангиогенеза и сохранения достигнутого противоопухолевого ответа после высокодозного лечения. По результатам проведенного исследования было отмечено, что у пациентов с ММ в дебюте заболевания количество микрососудов более чем в 2 раза превышало таковое у доноров и составляло в среднем, 96,0±5,3 микрососудов/мм2.

После каждого этапа программной терапии ММ (индукции, высокодозной консолидации) наблюдалось уменьшение количества микрососудов. Так, после завершения индукционного этапа оно составило л в среднем 78,6±3,9 микрососудов/мм . В это время уже у 44,5% пациентов была достигнута полная и очень хорошая частичная ремиссия. После завершения высокодозной трансплантационной терапии количество о микрососудов было в среднем 60,8+1,8 на мм , причем у 8 из 26 пациентов число микрососудов в КМ нормализовалось, составив 43,4-55,3 л сосудов/мм . При этом уже у 77,8% больных была констатирована полная и очень хорошая частичная ремиссия. По мере увеличения процента полных и очень хороших частичных ремиссий после выполнения каждого из этапов интенсивного лечения количество микрососудов в КМ достоверно снижалось. И после завершения высокодозной терапии средние значения плотности микрососудов снизились более чем на треть по сравнению с исходными значениями. При сопоставлении плотности микрососудов на каждом этапе терапии с показателями противоопухолевого ответа на терапию, была выявлена корреляция количества микрососудов со степенью выраженности противоопухолевого ответа.

Учитывая полученные данные, нами была выявлена зависимость между количеством микрососудов в КМ перед аутоТГСКК и показателями посттрансплантационной выживаемости без прогрессии.

Оказалось, что вероятность 5-летней выживаемости без признаков прогрессии заболевания составляла 82% у больных с «малым» (менее 68,6 микрососудов/мм) количеством микрососудов в КМ перед трансплантацией, в отличие от 19% для больных с «высоким» (более 68,6 микрососудов/мм2) содержанием микрососудов в КМ (р=0,0008).

Подобная зависимость выявлена также в исследовании Ргапеп и соавт., показавших в многофакторном анализе влияние плотности микрососудов в костном мозге в дебюте ММ на общую выживаемость и выживаемость без признаков прогрессии ММ. Медиана общей выживаемости составила 33 и 23 месяца (р=0,01) в группах пациентов с низкой и высокой' плотностью микрососудов, соответственно. Однако в данной работе не приведены результаты исследования ангиогенеза после индукционной и консолидационной терапии ММ. [200]

При сопоставлении отдаленных результатов высокодозной химиотерапии с последующей аутоТГСКК в зависимости от фазы заболевания на момент выполнения трансплантации было выявлено, что длительная выживаемость без признаков прогрессии ММ достоверно выше (р<0,0001) в группе пациентов, у которых достигнута полная или очень хорошая частичная ремиссия. Так, 5-ти летняя выживаемость после аутоТГСКК без признаков прогрессии в этой группе составляла 80%, тогда как для больных, у которых противоопухолевый ответ перед аутотрансплантацией оценивался как частичная ремиссия или стабилизация процесса, вероятность прожить 5 лет без прогрессии заболевания не превышала 13%. Наши результаты подтверждают данные, полученные в многоцентровых исследованиях, где было показано, что глубина противоопухолевого ответа коррелирует с длительной выживаемостью без признаков прогрессии ММ. [37, 38, 132, 151, 154, 229, 252]

Высоко значимые сведения были получены нами при сравнительном анализе отдаленных результатов аутологичной трансплантации у больных ММ в зависимости от различного сочетания перед трансплантацией двух признаков — количества микрососудов в КМ и степени противоопухолевого ответа. Наилучшие результаты 5-летней выживаемости без признаков прогрессии ММ (90%) отмечены у больных с низкой плотностью микрососудов и полной или очень хорошей частичной ремиссией перед выполнением аутотрансплантации. Также высокие показатели выживаемости (68%) получены и в группе больных с низкой4 плотностью сосудов и частичной ремиссией или даже стабилизацией ММ. Значительно хуже результаты 5-летней ВБП (20%) наблюдались у пациентов с высокой плотностью микрососудов даже при наличии полной или очень хорошей частичной ремиссии. И у всех пациентов из группы с высокой плотностью микрососудов и слабым противоопухолевым ответом прогрессия заболевания была выявлена в течение 2-х лет после аутотрансплантации.

Нам удалось убедительно доказать, что выживаемость без признаков прогрессии ММ достоверно выше у тех пациентов, у которых количество сосудов в КМ перед трансплантацией было менее 68,6/мм2, вне зависимости от достигнутого на этот момент противоопухолевого ответа. Именно количество сосудов в КМ явилось признаком, определявшим вероятность сохранения ремиссии после аутоТГСКК, опережая по значимости противоопухолевый ответ, достигнутый на этапе индукционной терапии.

Большой интерес представляло изучение изменения плотности микрососудов в костном мозге в результате длительного применения Г

КСФ, назначавшегося после введения высоких доз ЦФ с целью мобилизации ГСКК. У всех обследованных больных было выявлено увеличение количества микрососудов после завершения инъекций Г-КСФ. Так, если до мобилизации плотность микрососудов составляла 72,5±3,1, то после мобилизации она возросла до 90,0+2,6 микрососудов/мм2 (р=0,005). Однако в данной ситуации утверждать, что увеличение плотности микрососудов связано только с непосредственным влиянием Г-КСФ, не представляется возможным, поскольку мобилизация проводилась с использованием сочетания двух агентов — Г-КСФ и ЦФ.

Увеличение плотности микрососудов в костном мозге после мобилизации ГСКК с последовательным использованием химиотерапевтических препаратов и Г-КСФ было выявлено также у больных лимфопролиферативными заболеваниями. Плотность» микрососудов у пациентов' с лимфосаркомами и лимфогранулематозом после мобилизации увеличилась с 48,2±4,3 до 73,2±4,4 на мм2(р<0,001).

Непосредственное влияние Г-КСФ на ангиогенез в костном мозге было изучено в группе пациентов' с острыми лейкозами, которым мобилизацию, проводили одним Г-КСФ в дозе 10 мкг/кг в течение 5-7 дней. Плотность микрососудов до мобилизации составляла 43,9±4,2 на мм , это количество статистически не отличалось от условной нормы, что еще раз подтверждало наличие ремиссии ОЛ. После применения Г-КСФ плотность микрососудов возросла до 74,1±5,8 микрососудов/мм .

Сопоставляя кратность увеличения плотности микрососудов КМ на фоне мобилизации у больных ММ, лимфопролиферативными заболеваниями и ОЛ, удалось отметить, что наиболее выраженное увеличение плотности наблюдалось именно у больных ОЛ, у которых использовался только один мобилизующий агент — Г-КСФ.

В опубликованной литературе приводится несколько объяснений такого феномена как увеличение количества микрососудов в результате применения Г-КСФ. Так, Уи. ОЫа сообщал, что стимуляция ангиогенеза при применении Г-КСФ связана с высвобождением УЕОБ, содержащегося в везикулах и цитоплазматических гранулах нейтрофилов. В свою очередь увеличение концентрации УЕОБ приводит к мобилизации эндотелиальных клеток-предшественников. [185] Именно на этом основана методика лечения инфаркта миокарда, когда Г-КСФ вводится местно в ишемизированную ткань. Это приводит к увеличению плотности капилляров в поврежденном миокарде. В более ранних исследованиях на животных моделях было показано, что при инфаркте миокарда регенерация ткани связана с мобилизацией костномозговых клеток или эндотелиальных клеток-предшественников, участвующих в неоангиогенезе и васкулогенезе. [136, 187,210, 225, 266]

Итак, в результате проведенных исследований удалось оптимизировать протокол мобилизации ГСКК у больных множественной миеломой. Отработаны сроки начала введений ростового фактора, позволившие сэкономить 3-5 флаконов препарата. Установлены оптимальные дозы ЦФ в схеме мобилизации, обеспечивающие заготовку необходимого количества CD34+ клеток при минимальной потребности в сопроводительной терапии.

Убедительно показано, что при применении Г-КСФ происходит выраженная гиперплазия костного мозга за счет увеличения количества клеток гранулоцитарного ряда. При этом имеет место нарастание количества не только зрелых генераций, но и промежуточных форм. В то же время не отмечается нарастания СБ34+ бластных клеток с появлением их атипичной локализации.

Изучение плотности микрососудов в КМ больных ММ на фоне различных этапов, интенсивного лечения позволило убедительно-показать, что количество микрососудов является важным прогностическим признаком, определяющим вероятность продолжительной выживаемости без прогрессии после аутотрансплантации. Полученные нами данные позволяют предложить состояние ангиогенеза у больных ММ как один из ведущих прогностических факторов.