Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Экспрессия рафт-образующих белков при немелкоклеточном раке легкого и ее влияние на свойства неопластических клеток

005056920

На правах рукописи

ШНЕЙДЕРМАН АНАСТАСИЯ НИКОЛАЕВНА

ЭКСПРЕССИЯ РАФТ-ОБРАЗУЮЩИХ БЕЛКОВ ПРИ НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОМ РАКЕ ЛЕГКОГО И ЕЕ ВЛИЯНИЕ НА СВОЙСТВА НЕОПЛАСТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

Специальность 14.01.12-онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2012

005056920

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» Российской академии медицинских наук

(директор - академик РАН и РАМН, д.м.н., проф. Михаил Иванович Давыдов) Научный руководитель:

кандидат биологических наук Зборовская Ирина Борисовна

Официальные оппоненты:

Делекгорская Вера Владимировна - доктор медицинских наук, заведующий лабораторией гистохимии и электронной микроскопии Научно-исследовательского института Клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН.

Логунов Денис Юрьевич — доктор биологических наук, заведующий лабораторией клеточной микробиологии ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук.

Защита диссертации состоится «2% Ц&^^Ь^ 2012 года в A4 часов на заседании диссертационного совета Д 001.017.01 Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 23.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24)

Автореферат разослан » Стл 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор Шишкин Юрий Владимирович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В последние годы в молекулярной биологии все больший интерес исследователей вызывает изучение липидных рафтов - микродоменов клеточных мембран, богатых холестеролом, сфинголипидами и различными сигнальными белковыми молекулами. Липидные рафты могут представлять собой чрезвычайно маленькие, лабильные и короткоживущие структуры, но наряду с такими существуют также и более крупные и стабильные микродомены, которые поддерживаются особыми рафт-образующими белками. Наиболее значимой функцией рафт-образующих белков является их способность формировать «сигнальные платформы», и тем самым регулировать передачу клеточных сигналов. В настоящее время известно большое количество рафт-образующих белков, но наиболее изученными среди них являются белки семейства кавеолинов, основным представителем которых является кавеолин-1. Роль кавеолина-1 в канцерогенезе обусловлена его способностью влиять на пролиферацию, клеточную миграцию, программируемую гибель клеток, ангиогенез и другие процессы, которые важны при опухолевой трансформации и профессии, а изменения его экспрессии фиксируются во многих типах опухолей человека. Исследования показали, что экспрессия кавеолина-1 имеет характер двухфазной кривой и, в зависимости от гистогенеза опухоли, может как стимулировать опухолевую прогрессию, так и подавлять ее.

До настоящего времени изучению других семейств рафт-образующих белков, среди которых наибольший интерес представляет группа ЭРИН (ЗкнпаШ^, РгоМЬШпв, РЫШтя, НПК/С), уделялось значительно меньше внимания. Одними из представителей этой группы являются белки семейства флотиллинов, широко экспрессирующиеся в тканях человека. Данные белки локализуются в клетках преимущественно на плазматической мембране, способны к олигомеризации и принимают участие в регуляции многих сигнальных путей, часто пересекаясь в своих функциях с кавеолинами. Существуют лишь скудные и разрозненные данные об участии флотиллинов в процессах канцерогенеза, и их роль при развитии злокачественных новообразований различного происхождения на сегодняшний день остается неизученной. Следует отметить, что исследований об изменении экспрессии стоматина в аспекте канцерогенеза ранее вовсе не проводилось. Кроме

того, различные рафт-образующие белки могут являться функциональными аналогами друг друга, что наводит на мысль об их возможном взаимодействии или взаимозаменяемости. Однако до сих пор совместных скрининговых исследований экспрессии различных рафт-образующих белков как в опухолях человека, так и на модельных системах клеточных линий не существует.

В качестве объекта исследования экспрессии некоторых представителей группы ЭРРН белков нами был выбран немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ). Исследование молекулярных механизмов возникновения и прогрессии опухолевого роста на модели рака легкого, как одного из самых распространенных, неблагоприятно текущих и сложно поддающихся лечению онкологических заболеваний, предоставляет возможность в полной мере оценить значимость изменения тех или иных факторов, ассоциированных с канцерогенезом. На сегодняшний день важнейшими факторами прогноза для больных НМРЛ остаются клинические параметры, и в первую очередь, степень дифференцировки опухолевых клеток и статус метастазирования. Некоторые успехи достигнуты и в изучении молекулярных маркеров, однако поиск дополнительных факторов опухолевой прогрессии представляет собой одну из наиболее актуальных проблем современной молекулярной онкологии.

Цель н задачи исследования

Целью данной работы явилось изучение экспрессии флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ) и исследование возможных механизмов влияния данных рафт-образующих белков на свойства опухолевых клеток.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Оценить продукцию флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина в образцах первичных опухолей НМРЛ.

2. Сопоставить изменения продукции флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина с клинико-морфологическими показателями, такими как гистологический тип опухолей, степень дифференцировки опухолевых клеток, статус метастазирования.

3. Исследовать влияние гиперэкспрессии генов ПОТ-1, ПОТ-2 и ЯТОМ, а также подавления экспрессии генов РЬОТ-! и РЬОТ-2 на характеристики клеточных линий А549 (АК легкого) и Н460 (крупноклеточная карцинома легкого) человека.

4. Изучить влияние изменения экспрессии генов РЬОТ-1, ИЮТ-! и БТОМ на уровень продукции и статус фосфорилирования некоторых белков, участвующих в передаче клеточных сигналов.

5. Оценить взаимное влияние изменения экспрессии различных рафт-образующих белков в клеточных линиях А549 и Н460.

Научная новизна и практическая значимость исследования В данной работе проведено скрининговое исследование продукции флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина при НМРЛ, которое впервые показало, что содержание стоматина снижается в большинстве исследованных случаев НМРЛ человека.

Анализ полученных результатов позволил выявить корреляционные связи между уровнем продукции рафт-образующих белков и клинико-морфологическими показателями опухолевого роста при НМРЛ человека. Так, обнаруженная в исследуемой выборке НМРЛ корреляционная связь между уровнем продукции флотиллина-2 и степенью дифференцировки опухолевых клеток позволяет использовать этот белок в качестве маркера дифференцировки при данном онкологическом заболевании.

На модельных системах клеточных линий РЛ обнаружено влияние флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина на такие важнейшие свойства клеток, как пролиферация, миграция, способность к деградации внеклеточного матрикса. При совместном исследовании экспрессии рафт-образующих белков получены приоритетные данные об их взаимовлиянии, т.е. изменение экспрессии одного из рафт-образующих белков может сопровождаться изменением эндогенного уровня других представителей этой группы белков, что, очевидно, изменяет структуру и функционирование мембранных рафтов. Данная работа расширяет фундаментальные представления о функционировании различных мембранных микродоменов и взаимодействии белков, регулирующих важнейшие пути передачи сигналов, ассоциированных с опухолевой трансформацией и прогрессией.

Исследование экспрессии рафт-образующих белков флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина, а также выяснение молекулярных механизмов их участия в

процессах, определяющих опухолевую трансформацию и прогрессию, на модельных системах клеточных линий открывает новые перспективы для поиска дополнительных маркеров одного из самых прогностически неблагоприятных онкологических заболеваний - рака легкого.

Публикации и апробация работы Диссертация апробирована и рекомендована к защите 20 июня 2012 года на совместной научной конференции лабораторий регуляции клеточных и вирусных онкогенов, молекулярной биологии вирусов, вирусного канцерогенеза, механизмов прогрессии эпителиальных опухолей, цитогенетики, онкогеномики, механизмов канцерогенеза и генетики опухолевых клеток НИИ Канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН. Материалы работы неоднократно докладывались на конференциях, в том числе автором лично на International Life Sciences Students Conference (2010, Nijmegen, The Netherlands) и Евразийском форуме по диагностике злокачественных новообразований (2011, Киев, Украина). По результатам диссертационной работы опубликованы 4 научные статьи и 7 тезисов докладов.

Структура и объём диссертации Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, содержит 29 рисунков, 12 таблиц. Состоит из глав: «Ведение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы», «Приложение». Список литературы содержит 163 источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы В работе использованы следующие методы исследования: выделение тотальной РНК и приготовление клеточных лизатов из образцов опухолевой и условно нормальной ткани и клеточных культур, анализ количества мРНК методом ПЦР в реальном времени, анализ белковых фракций с помощью Вестерн-блот гибридизации, трансформация бактериальных клеток, выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток, электрофорез нуклеиновых кислот, молекулярное клонирование кодирующей последовательности генов с кДНК, а также предшественников малых шпилечных РНК, ретровирусная и лентивирусная трансфекция эукариотических клеток, инфицирование клеток псевдовирусными частицами, анализ ферментативной активности протеиназ внеклеточного матрикса

(субстрат-специфическая зимография в ПААГ), анализ динамики роста клеток, анализ «зарастания раны» in vitro (wound healing assay), тест на миграцию клеток по градиенту концентраций факторов роста, проведение исследования клеточного цикла на проточном цитофлуориметре, а также статистическая обработка данных.

Результаты исследования н обсуждение 1. Анализ продукции рафт-образующих белков в образцах HMPJI

Ранее в Лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов на выборке образцов HMPJ1 показано, что уровень мРНК генов FLOT-1, FLOT-2 и STOM снижается в подавляющем большинстве исследованных случаев. Одной из задач данной работы было исследование изменения уровня продукции белков флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина в той же выборке НМРЛ, сопоставление полученных данных с результатами предыдущих исследований и клинико-морфологическими показателями опухолей.

Для осуществления этой задачи мы провели скрининг уровня продукции трех белков в панели из 49 образцов первичных опухолей НМРЛ с помощью метода Вестерн-блот анализа. Образцы тканей двух основных типов НМРЛ: ПКРЛ (плоскоклеточный рак легкого) (27 образцов) и АК (аденокарцинома) (22 образца), а также прилегающих к опухолям морфологически нормальных тканей, т.н. «условных норм», получены от пациентов, оперированных в 2005-2007 гг. по поводу рака легкого в НИИ КО ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН.

Весь материал проходил двойную гистологическую верификацию согласно последней классификации ВОЗ (Histological Typing of Lung and Pleural Tumors третьего пересмотра, IARC Press, Lion, 2004) в отделе патологической анатомии опухолей человека НИИ КО ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН и охарактеризован в соответствии с TNM классификацией седьмого пересмотра (версия 2007 г.).

Примеры различных вариантов изменения уровня белков в образцах опухолей и условно нормальных тканей приведены на рис. 1.

А20 П20 1117 П19

TINOMO(IA) T2N1M0(IIB) T4N0M0(IIIB)T4N2M0(IIIB)

HO H о H о н о

флотиллпп-1 --<meat* **"""» ■••mer

актин

A2 П1 A10 П5

T2N0M0(1B) T3N1M0(II1A) TINOMO(IA) T4N1M0(IIIB) HOHO HOHO

флОТИЛЛИН-2 ——• -:„,.. «яштш

актин - «— —«—- „ ,, «т.- »«■

A19 П20 П17 A18

T2N0M0(IB) T2N1M0(1IB) T4N0M0(IIIB) T2N0M0(IB)

HO HO HOHO

стоматин » ***

аКТИН . :тШт? -.....

Рисунок 1. Анализ уровней продукции флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина в образцах НМРЛ методом Вестерн-блот гибридизации. Дана характеристика образцов согласно ТИМ классификации. В скобках указана стадия заболевания. О - опухолевая ткань, Н - условно нормальная ткань. А — образцы АК, П - ПКРЛ, гибридизация блотов с антителами на бета-актин проводилась в качестве контроля нанесения равного количества белков.

Оценив уровни продукции белков, мы отметили, что, в целом, в образцах НМРЛ они сильно варьируют. Так, снижение уровня флотиллина-1 встречается с той же частотой, что и его увеличение (в 41,7% случаев), а его равное содержание в опухоли и условно нормальной ткани составляет всего 16,6% случаев. Содержание флотиллина-2 в опухоли по сравнению с нормальной тканью увеличивается в 48% случаев, снижается в 29,1%, и не изменяется в 22,9% образцов. В отличие от флотиллинов, продукция стоматина снижается в подавляющем числе образцов (74,4% случаев), повышается лишь в 12,8% и не изменяется также в 12,8% случаев.

Ранее в лаборатории на той же выборке образцов НМРЛ проводилось исследование уровня мРНК генов РЬОТ-1, РЬОТ-2 и БТОМ, которое показало, что экспрессия данных генов снижается в 79,2% случаев для флотиллина-1, 78,3% для флотиллина-2 и 83,3% для стоматина. Таким образом, только для стоматина наблюдается соответствие изменения содержания белка и уровня мРНК, в то время

как содержание флотиллинов варьирует гораздо сильнее, чем уровни соответствующих мРНК. Мы предполагаем, что данные различия могут быть обусловлены наличием сложных путей регуляции процессов транскрипции и трансляции, а также стабильности данных белков, благодаря которым изменение уровня мРНК не всегда согласуется с содержанием белка.

Мы сопоставили полученные данные с клинико-морфологическими показателями, такими как гистологический тип опухолей (АК или ПКРЛ), степень дифференцировки опухолевых клеток (высоко и умеренно дифференцированные опухоли против низко или умеренно-низко1 дифференцированных) и статус метастазирования (N0 — отсутствие, 14+ - наличие метастатического поражения регионарных лимфоузлов). При сравнении групп АК и ПКРЛ в отношении изменений уровня продукции флотиллина-2 мы обнаружили статистически значимые различия. Так, в группе ПКРЛ увеличение содержания флотиллина-2 выявлялось гораздо чаще - в 65,4% (17 из 26 случаев), чем в группе АК, где оно составило лишь 27,3 % (6 из 22 случаев) (р=0,0089). Кроме того, мы обнаружили статистически значимую связь между уровнем продукции флотиллина-2 и степенью дифференцировки опухолевых клеток: опухоли с высокой или умеренной степенью дифференцировки характеризуются повышением или сохранением нормального содержания белка, в то время как в низко и умеренно-низко дифференцированных опухолях уровень флотиллина-2 чаще снижается (р=0,0375). Данная корреляционная связь представляется весьма интересной, поскольку известно, что уровень экспрессии флотиллина-2 связан со степенью дифференцировки нормальных клеток организма [Ьаг^Ьогз!, 2005]. Его экспрессия относительно низка на ранних стадиях эмбрионального развития, однако возрастает при дифференцировке различных типов тканей и достигает своего максимума в тканях взрослого организма. Возможно, подобные изменения уровня флотиллина-2 наблюдаются и при опухолевой прогрессии, когда происходит дедифференцировка популяций опухолевых клеток. При этом экспрессия флотиллина-2 может изменяться от достаточно высокой в высоко и умеренно дифференцированных до низкой в низко дифференцированных опухолях.

' Умеренно-низко дифференцированными опухолями в тексте называются умеренно дифференцированные опухоли с очагами низко дифференцированных клеток.

Размеры анализируемой выборки не позволили нам выявить статистически значимых изменений как в уровне продукции флотиллина-1, так и стоматина, в зависимости от клинико-морфологических параметров. Тем не менее, впервые зафиксированное резкое падение или ярко выраженное возрастание содержания стоматина в опухолях человека (рис. 1), безусловно, заслуживает отдельного внимания.

2. Получение производных клеточных линии НМРЛ с гнперэкспрессиен генов ГЬОТ-1, РЬОТ-2 и БТОМ, а также с подавленной экспрессией генов /=ХОГ-/ и ГЬОТ-2

В целях более детального исследования влияния изменения экспрессии флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина на опухолевые клетки и возможных механизмов такого воздействия на следующем этапе работы проводилось изучение влияния изменения экспрессии генов ГЬОТ-1, РЬОТ-2 и 5ТОМ на свойства клеток, ассоциированные с опухолевой прогрессией. Для этого все три гена были гиперэкспрессированы в клеточных линиях НМРЛ человека посредством ретровирусной инфекции, а также проводилось подавление эндогенной экспрессии генов Я.ОГ-/ и РЬОТ-2 с помощью мшРНК.

Для выбора подходящей экспериментальной модели для данных исследований мы оценили уровень флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина в панели из б клеточных линий НМРЛ. На основании полученных результатов линия А549, характеризующаяся средним содержанием всех трех белков, была выбрана в качестве основной для проведения экспериментов как с гиперэкспрессией, так и с подавлением эндогенной экспрессии целевых генов. Кроме того, линия клеток Н460, демонстрирующая наиболее высокий уровень содержания флотиллинов, использовалась для экспериментов с мшРНК. Кодирующие последовательности генов F^.OГ-/, РЬОТ-2 и 5ТОЛ/ человека были заклонированы в ретровирусный вектор рВаЬе-риго, и с помощью ретровирусной инфекции получены производные клеточной линии А549, стабильно гиперэкспрессирующие данные гены. В качестве контроля использовали линию клеток А549-риго, содержащую «пустой» вектор. Вестерн-блот анализ тотальных клеточных лизатов, а также ПЦР в реальном времени подтвердили, что экспрессия флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина

увеличена в производных клеточных линиях с гиперэкспрессией соответствующих

генов по сравнению с контрольной линией клеток (рис. 2).

/ /

стоматин актн и флотнллнн-!

актин флотиллнн-2 актин кавсолин-1 актин

X 29% 281 27-

Щ 26

£ 4'

О А549-Р1о|-1 Ш A549.FI 01-2 ЕШ А549-8Юш ---А549-РНГО

"Ж"*"

П.ОТ-1 П.ОТ-2 ХТОМ СЛУ-1

Рисунок 2. Анализ экспрессии генов рафт-образуюгцих белков в производных клеточных линиях А549 с гиперэкспрессией генов РЬОТ-1, РЮТ-2 и БТОМ. А) Исследование уровней продукции белков стомашина, флотиллина-1, флотиллина-2 и кавеолина-1 методом Вестерн-блот гибридизации. Б) Анализ экспрессии генов РЬОТ-1, БШТ-2, ЗТОМ и СА У-1 с помощью ПЦР в реальном времени. * - р<0,05.

флотиллин-1 флотил.'1ни-2 стоматин кавеолнн тетин

/ / /'

г т г

В

□ А549-хЫПоИ ЕЭ Л549-е Ь 2 По 1-1 ---А549-51\-СР1'

йг-

I-

ПОТ-1 ПОТ-2 ЬТОЧ СЛУ-1

^ **

флотнллин-1 флотиллин-2 стоматин кавеолин актин

I'

□ FI.Hl ЕЭ Н460-к|12РМ-1 ---|1460-5|1-СРР

к

д,

1X01-1 1Ч.0Т-2 .ЧТОМ СА У-1

Рисунок 3. Анализ экспрессии рафт-образующих белков в производных клеточных линиях А549 и Н460 с подавленной экспрессией гена БЮТ-Р А), Б) Исследование уровней продукции белков флотиллина-1, флотиллина-2, стоматина и кавеолина-1 методом Вестерн-блот гибридизации. В), Г) Анализ экспрессии генов БЮТ-1, РЮТ-2, ЗТОМ и СА V-1 с помощью ПЦР в реальном времени. * - р<0,05.

Для подавления эндогенной экспрессии генов FLOT-1 и FLOT-2 были созданы конструкции, кодирующие предшественники малых шпилечных РНК (мшРНК), комплементарные кодирующим областям мРНК FLOT-1 или FLOT-2 человека. Для каждого гена использовалось две независимые последовательности мшРНК. С помощью лентивирусной инфекции получены производные клеточных линий А549 и Н460 со сниженной продукцией флотиллина-1 или флотиллина-2. В качестве контрольных использовали линии клеток A549-sh-GFP и H460-sh-GFP с мшРНК, комплементарной последовательности GFP (pLKO.l-shGFP). Анализ продукции белков в полученных клеточных линиях показал, что в них достигается значимое снижение экспрессии генов FLOT-1 и FLOT-2 по сравнению с контрольными линиями клеток (рис. 3 и рис. 4).

А

флотиллин-2 флотиллин-1 стоматин кавеолин актин

Б

флотиллин-2 флотиллин-1 стоматин кавеолин актин

Рисунок 4. Анализ экспрессии рафт-образующих белков в производных клеточных линиях А549 и Н460 с подавленной экспрессией гена РЮТ-2. А), Б) Исследование уровней продукции белков флотиллина-2, флотиллина-1, стоматина и кавеолина-1 методом Вестерн-блот гибридизации. В), Г) Анализ экспрессии генов РЮТ-2, РЬОТ-1, ЗТОМ и СА VI с помощью ПЦР в реальном времени. * - р<0,05.

ч- ❖ СУ "v "V

Г Г # #

^ г г

□ A549-shlFlot-2 A549-sh2Flot-2 ■ AS49-shCFP

FLOT-2 FLOT-1 STOM CAV-1

/// ^ ^

X o.

□ II460-shlFlot-2 И II460-sh2Flot-2 ---H460-sliGFP

FLOT-2 FLOT-1 STOM CAV-1

3. Исследование характеристик полученных клеточных линии in vitro

В литературе имеется ряд свидетельств того, что рафт-образующие белки разных семейств могут оказывать совместное или схожее влияние на отдельные клеточные сигнальные пути, и некоторые исследователи высказывают предположение о том, что различные рафт-образующие белки способны заменять друг друга, дублируя одни и те же функции. На основе этих теоретических предпосылок мы сделали вывод о необходимости совместного исследования рафт-образующих белков разных семейств. Для этого мы оценили экспрессию флотиллинов, стоматина и кавеолина-1 как на уровне мРНК, так и белка во всех полученных производных линиях.

Мы отметили, что в исследуемых клеточных линиях HMPJT существует и четко обнаруживается влияние уровней продукции флотиллинов друг на друга. Так, гиперэкспрессия флотиллина-1 сопровождается увеличением содержания флотиллина-2 по сравнению с контрольной линией клеток (рис. 2А), в то время, как подавление экспрессии флотиллина-1 не влияет на уровень флотиллина-2 (рис. ЗА-Б). Напротив, гиперэкспрессия гена FLOT-2 не оказывает влияния на уровень флотиллина-1 (рис. 2А), но подавление экспрессии флотиллина-2 в клеточных линиях А549 и Н460 приводит к пропорциональному снижению уровня флотиллина-1 (рис. 4А-Б). Все наблюдаемые изменения происходят на уровне белковой продукции, поскольку ПЦР анализ не выявил каких-либо изменений в уровнях мРНК генов, помимо целевых (рис. 2Б, ЗВ-Г, 4В-Г). Это указывает на посттранскрипционный характер изменений и может быть обусловлено изменением стабильности белковых молекул. Действительно, как известно из литературных данных, стабильность флотиллинов определяется возможностью образования гетероолигомерных комплексов между ними. При отсутствии флотиллина-2 его партнер, флотиллин-1, нестабилен и подвергается деградации по протеаеомному пути. Вероятно, этот же механизм регуляции работает и в нашей модельной системе, где при подавлении экспрессии флотиллина-2 стабильность флотиллина-1 снижается, а содержание данного белка уменьшается вслед за его партнером. При этом, как и в работах других исследователей, в нашей модельной системе подавление экспрессии флотиллина-1 не влияет на уровень флотиллина-2.

Гиперэкспрессия стоматииа в линии А549 приводит к увеличению содержания флотиллина-1 (рис. 2А). Причем данное влияние носит односторонний характер, поскольку в линиях с гиперэкспрессией или с подавленной экспрессией флотиллина-1 уровень стоматина не изменяется (рис. 2А и рис. ЗА-Б). Данный факт интересен тем, что ранее в лаборатории на выборке образцов НМРЛ показано существование сильной корреляционной связи между экспрессией мРНК генов БТОМ и РЬОТ-1. Таким образом, полученные новые данные не только подтверждают наличие связи между экспрессией этих двух генов на модельных системах клеточных линий НМРЛ, но и позволяют утверждать, что данная связь не двусторонняя, а односторонняя, и направлена от стоматина к флотиллину-1. Иными словами, экспрессия стоматина может влиять на уровень флотиллина-1, но не наоборот.

Структурные сходства, участие в регуляции одних и тех же сигнальных путей, одинаковая клеточная локализация позволяет рассматривать флотиллины как функциональные аналоги белков семейства кавеолинов, которые на сегодняшний день гораздо лучше изучены. Однако вопрос о существовании взаимного влияния различных семейств рафт-образующих белков друг на друга остается практически не исследованным. Результаты данной работы свидетельствуют, что гиперэкспрессия флотиллина-2 в клеточной линии А549 приводит к уменьшению экспрессии кавеолина-1 как на уровне мРНК, так и на уровне белка (рис. 2). В свою очередь, подавление экспрессии флотиллина-2 в линиях А549 и Н460 приводит к увеличению продукции кавеолина-1, но уровень мРНК САУ-1 при этом не изменяется (рис. 4). Снижение экспрессии флотиллина-2 сопровождается увеличением содержания еще одного рафт-образующего белка, стоматина, что, однако, не связано с изменением уровня мРНК данного гена. Таким образом, вероятно, изменения количества кавеолина-1 и стоматина при подавлении экспрессии флотиллина-2 носят посттранскрипционный характер и могут быть связаны с изменением трансляции и/или стабильности белковых молекул. В свою очередь, гиперэкспрессия или подавление экспрессии флотиллина-1 не влияют на клеточное содержание ни кавеолина-1, ни стоматина (рис. 2 и рис. 3). Таким образом, в клеточных линиях НМРЛ обнаруживается флотиллин-1-независимое и флотиллин-2-зависимое изменение продукции кавеолина-1 и стоматина.

-•■ A549-puro

A549-Stom j

•» A549-Flot-l /

A549-Flot-2

Рисунок 5. Анализ динамики роста клеточных линий с гиперэкспрессией рафт-образующих белков.

A549-SKGFP ■ш- A549-shlFlot-l

s F

♦ H460-shGFP ■* U460-shIFIot-2 ■A- II460-sh2Flot-2

Рисунок 6. Анализ динамики роста производных клеточных линий А549 А) и Н460 Б) с подавленной экспрессией гена FLOT-I и клеточных линий А549 В) и Н460 Г) с подавленной экспрессией гена FLOT-2.

Все полученные линии исследовались в отношении некоторых параметров, определяющих возникновение и рост опухолевых клеток. Одной из основных характеристик трансформированных клеток является повышенный уровень их пролиферативной активности. Мы исследовали динамику роста клеточных культур при помощи прямого подсчета количества клеток в камере Горяева и обнаружили, что флотиллин-1 замедляет рост клеток, стоматин наоборот стимулирует его, увеличивая скорость роста клеток в полтора раза, а гиперэкспрессия флотиллина-2 не влияет на данную характеристику клеток линии А549 (рис. 5). Подавление экспрессии флотиллина-1 не влияет на пролиферацию (рис. 6А-Б), однако при подавлении экспрессии флотиллина-2 наблюдается уменьшение скорости пролиферации клеток, причем данный эффект выражен сильнее в линиях клеток с ярко выраженным подавлением экспрессии флотиллина-2 (рис. 6В-Г).

С целью изучения возможных механизмов разнонаправленного влияния рафт-образующих белков на скорость роста популяций клеток, нами предпринята попытка оценить изменения продукции некоторых белков, определяющих уровень пролиферации. Известно, что ключевыми участниками митогенных сигнальных путей являются МАР-киназы, активность которых часто возрастает при опухолевой трансформации и прогрессии. Мы оценили уровень фосфорилирования основных МАР-киназ ERK1 (pThr202/Tyr204) и ERK2 (pThrl85/Tyrl87), JNK (PThrl83) и р38 (pThr 180/pTyr 182) с помощью Вестерн-блот анализа с антителами к фосфорилированным по соответствующим сайтам активным формам белков. Мы не обнаружили значимых изменений активности МАР-киназ в клетках с гиперэкспрессией стоматина и флотиллина-1 (рис. 7А). Однако при гиперэкспрессии флотиллина-2 наблюдалось снижение активности р38, а также уменьшение количества тотальных и фосфорилированных форм ERK1/2. Снижение экспрессии флотиллина-1 сопровождалось увеличением уровня фосфорилирования ERK-1/2 (рис. 7Б). В свою очередь, подавление экспрессии флотиллина-2 снижало фосфорилирование ERK-1/2 в линии A549-shl (рис. 7В), но в производных линии Н460 фосфорилирование ERK-1/2 наоборот возрастало (рис. 7Г). Статус фосфорилирования р38 и Jnk при этом не изменялся. Таким образом, мы наблюдали изменение фосфорилирования МАР-киназ только при модуляции экспрессии флотиллина-2, которое не совпадало с изменениями характера роста клеток. Можно

предположить, что в дайной модельной системе изменение роста клеток не коррелирует с изменением статуса фосфорилирования МАР-киназ.

К I / ^ ^ ^

^ ^ ^ V V V т

р-ЕШС1/2 актин

Е11К1/2 актин

# # # V Т V V

р-р38 актин

р38 актин

. - —.......-

р-ЖК JNK актин

//// ////

/УУ

>

❖ V ❖

# ^ ^

^ Г Р

£ ^ V Г V

Е1*К1/2 актин

р38 актин

p-JNK JNK актин

# / чГ Ч> V

V V V ? ^ £

V Т1

у

# /, ^

# ^ ^ ^ ^

р-ЕШа/2 актин

ЕКК1/2 актин

— •

ГУ

» а>"

л?' л?' Л? ^ ^ ^

У У <3 >

Сг V V ^ # /

л? л? ^ ^ ^

ГУ

55

р-р38

актин -----"--

р38 -—' —-

актин

р-ЛМК актин

ЛГ^К актин

■чщци»

Рисунок 7. Вестерн-блот анализ продукции и статуса фосфорилирования МАР-киназ в линиях производных А549 с гиперэкспрессией рафт-образующих белков А), в линиях А549 и Н460 с подавленной экспрессией флотшлина-1 Б), в линиях А549 В) и Н460 Г) с подавленной экспрессией флотиллина-2.

актин

Рисунок S. Сравнительный анализ продукции белков р53 и р21 А) в линиях А549 с гиперэкспрессией рафт-образующих белков, Б) А549 и Н460 с подавленной экспрессией флотиллина-1 и В) в линиях А549 и Н460 с подавленной экспрессией флотшлина-2.

Еще одним ключевым регулятором клеточного цикла является белок р53, который негативно влияет на пролиферацию клеток, в том числе посредством активации экспрессии ингибитора циклинзависимых киназ белка p21Clpl/Wafl. Известно, что активация р53/р21 - зависимого пути останавливает движение клеток по клеточному циклу, а в определенных условиях может приводить к их программируемой гибели. Мы оценили уровень белков р53 и р21 в исследуемых клеточных линиях и обнаружили, что уровень обоих белков повышен в линии А549 с гиперэкспрессией флотиллина-1 (рис. 8А) и во всех производных линиях А549 и Н460 с подавленной экспрессией гена FLOT-2 (рис. 8В). При этом уровень р53 и р21 в клеточных линиях с мшРНК к гену FLOT-1 не изменяется (рис. 8Б). Можно предположить, что снижение скорости пролиферации клеток при гиперэкспрессии флотиллина-1, а также при подавлении экспрессии флотиллина-2, скорее всего, обусловлено повышением уровня белков р53 и р21 и активацией соответствующего сигнального пути. Однако подтверждение существования связи между экспрессией рафт-образующих белков флотиллина-1 и флотиллина-2 и экспрессией р53 и р21 требует выяснения промежуточных звеньев данного сигнального пути, что находится за рамками настоящего исследования.

Рисунок 9. Анализ миграционной способности клеток с гиперэкспрессией рафт-образующих белков А) в тесте на зарастание «раны» in vitro, Б) в тесте на миграцию в камерах Бойдена. * - р<0,05.

Рисунок 10. Анализ миграционной способности клеток производных линий А549 А) и Н460 Б) с подавленной экспрессией гена РЬОТ-1 и клеток линий А549 В) и Н460 Г) с подавленной экспрессией гена ГЬ0Т-2 в камерах Бойдена. * -р<0,05.

Одной из важнейших характеристик злокачественных клеток является их способность к инвазии в окружающие ткани, которая отчасти определяется их миграционными способностями. На сегодняшний день известно, что флотиллины оказывают влияние на миграцию клеток, однако данные об их роли в регуляции клеточной миграции в аспекте канцерогенеза представлены отдельными публикациями. В данной работе с помощью теста на зарастание «раны» in vitro и теста на миграцию в камерах Бойдена мы показали, что экзогенная экспрессия флотиллина-2 усиливает миграцию клеток линии А549 (рис. 9), а подавление эндогенной экспрессии гена FLOT-2 снижает способность клеток к миграции по градиенту концентрации ростовых факторов (рис. 10В-Г). Мы также отметили, что клетки линии A549-Flot-l мигрировали сильнее контрольных (рис. 9), однако это может быть связано как с непосредственным влиянием флотиллина-1 на клеточную миграцию, так и опосредовано повышением уровня флотиллина-2 в данной клеточной линии. Такое предположение подтверждается еще и тем фактом, что

08772120

подавление экспрессии гена ПОТ-1 в клеточных линиях А549 и Н460 не влияло на миграционную способность клеток (рис. 10А-Б).

Одним из важнейших путей регуляции клеточной миграции и инвазии является интегрин-опосредованный сигнальный путь. Известно, что одним из ключевых участников данного пути является нерецепторная тирозинкиназа РАК, активность которой определяется фосфорилированием молекулы по нескольким сайтам. Мы оценили статус фосфорилирования РАК киназы по четырем основным сайтам и обнаружили, что фосфорилирование всех исследованных остатков тирозина увеличилось в клеточных линиях с подавленной экспрессией флотиллина-2 (рис. 11). Кроме того, в производных линии Н460 с мшРНК к гену /*ХОГ-/ наблюдалось повышение уровня фосфорилирования остатков У397, У576/577 и У925 киназы РАК. Таким образом, подавление экспрессии флотиллина-2 приводит к уменьшению миграционной способности клеток и сопровождается усилением фосфорилирования РАК киназы. Безусловно, выяснение возможных путей участия киназы РАК во флотиллин-2-опосредованной регуляции клеточной миграции весьма интересно и требует глубокого изучения.

рРАК У397 рРАК У576/577 рРАК У861 рКАК У925 ИАК

# // / // # / / / // / / # ^ л, У / # / # л? ^ ^

............■ '!■№!<т -<Ш <¥• 1 у"''':; : •»«е*»*

Г — ШШШШ рщ«: шшшш-, ■шшм —« Ш» «И - ттш*-

«ж <м» нтньн 1—. — — чтт шт

Рисунок 11. Вестерн-блот анализ продукции и статуса фосфорилирования киназы ГАК в линиях с подавленной экспрессией флотиллина-1 и флотиллина-2.

Инвазия опухолевых клеток в прилежащие ткани организма, происходящая на поздних этапах опухолевой прогрессии является комплексным процессом и требует не только миграционной активности клеток, но также их способности расщеплять окружающий внеклеточный матрикс (ВКМ) за счет продукции и секреции различных внеклеточных протеаз. Такие ферменты входят в состав систем деградации ВКМ и часто локализуются в плазматической мембране в составе липидных рафтов. В данной работе мы исследовали влияние экспрессии рафт-образующих белков на активность двух основных систем деградации ВКМ - ММР и

20

иРА (рис. 12). Полученные нами данные свидетельствуют о том, что в нашей модельной системе возрастание активности ММР-2 происходит как при гиперэкспрессии, так и при подавлении эндогенной экспрессии флотиллина-1, а также при гиперэкспрессии стоматина. В то же время, активность ММР-2 снижается в клеточных линиях с подавленной экспрессией флотиллина-2. Активность иРА возрастает при подавлении экспрессии флотиллина-2 и снижается при гиперэкспрессии этого же гена. Видимо, рафт-образующие белки влияют на активность систем деградации ВКМ разнонаправлено, а изменение уровня их экспрессии может являться инструментом балансирования данного процесса.

Рисунок 12. Сравнительный анализ активности секретируемых протеаз, расщепляющих ВКМ, методом зимографии кондиционированных сред, полученных при культивировании производных клеточных линий А549 и Н460 с измененной экспрессией рафт-образуюгцих белков.

4. Заключение

На основании полученных в данной работе результатов можно заключить, что флотиллины и стоматин несомненно влияют на такие ключевые характеристики опухолевых клеток, как пролиферация, миграция и инвазия, при этом влияние каждого из трех исследуемых белков на клеточные характеристики различно.

Хотя в данной работе проводилось исследование трех рафт-образующих белков - флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина, - основным объектом нашего внимания явился флотиллин-2, поскольку изменение его экспрессии оказывает наиболее ярко выраженное влияние на характеристики клеточных линий НМРЛ. На основании литературных данных и результатов наших собственных исследований мы предлагаем следующую модель изменения экспрессии гена РЬОТ-2 при опухолевой трансформации и прогрессии (рис. 13).

Время

- Уровень экспрессии флотиллина-2

- —- Степень дифференцировки клеток ......... Миграционная способность клеток

Рисунок 13. Гипотетическая модель изменения экспрессии гена РЬОТ-2 при дифференцировке клеток, опухолевой трансформации и прогрессии.

Уровень флотиллина-2 связан со степенью дифференцировки клеток: действительно, его экспрессия возрастает в ходе эмбрионального развития и достигает максимума в полностью дифференцированных клетках взрослого организма. Затем в процессе опухолевой трансформации и прогрессии происходит дедифференцировка популяции опухолевых клеток. Как показали наши исследования, уровень флотиллина-2 ниже в низко и умеренно-низко дифференцированных опухолях по сравнению с высоко и умеренно дифференцированными. Мы предполагаем, что это связано с тем, что экспрессия флотиллина-2 может изменяться в ходе опухолевой прогрессии от достаточно высокой в высоко и умеренно дифференцированных до низкой в низко

дифференцированных опухолях. Однако на поздних стадиях опухолевой прогрессии огромную роль играет приобретение клетками способности к миграции, необходимое для инвазии в прилежащие ткани организма и для распространения в отдаленные органы. В работе на клеточных линиях А549 и Н460 HMPJI мы показали, что флотиллин-2 стимулирует миграцию опухолевых клеток и необходим для их передвижения по градиенту концентрации ростовых факторов. Увеличение экспрессии флотиллина-2 на поздних этапах опухолевой прогрессии может давать опухолевым клеткам дополнительные преимущества, увеличивая их локомоторную способность. Таким образом, согласно предложенной нами схеме, изменения экспрессии флотиллина-2 носят характер кривой прямо пропорциональной степени клеточной дифференцировки и миграционной активности опухолевых клеток или же доле опухолевых клеток с высокой миграционной способностью в общей популяции на поздних этапах опухолевой прогрессии. Данная модель позволяет объяснить сложную картину изменения экспрессии флотиллина-2 в панели образцов HPMJ1, которую мы наблюдали при скрининговых исследованиях. Действительно, несмотря на ряд общих признаков, все опухоли индивидуальны, представляют собой гетерогенные популяции и находятся на разных этапах опухолевой прогрессии. Именно поэтому мы не увидели однозначной картины изменения уровня продукции флотиллина-2 во всей выборке образцов HMPJI, а отметили чрезвычайную вариабельность опухолей по данному признаку. Предложенная нами модель требует подтверждения в последующих исследованиях и вызывает ряд вопросов. В частности, каковы механизмы изменения экспрессии флотиллина-2 при опухолевой прогрессии и каким образом данные изменения регулируются в опухолевых клетках? Является ли снижение экспрессии флотиллина-2 при дедифференцировке опухолевых клеток следствием данного процесса и дает ли оно клеткам дополнительные преимущества? Происходят ли данные изменения во всей популяции или же в отдельных клонах опухолевых клеток? Какие изменения, помимо усиления локомоторного фенотипа клеток, происходят на поздних этапах опухолевой прогрессии при увеличении уровня флотиллина-2, каким образом это влияет на свойства клеток in vivo? Наконец, как изменяется экспрессия других рафт-образующих белков при изменении уровня флотиллина-2, и каковы механизмы взаимного влияния данных белков друг на друга? Последний вопрос представляется

особенно интересным. Проведенные в данной работе исследования на образцах НМРЛ человека и клеточных линиях опухолевого происхождения дали новые результаты, указывающие на возможность такой взаимной регуляции. На основании литературных данных и результатов наших собственных исследований мы предложили схему, описывающую влияние изменения уровня продукции одних рафт-образующих белков на содержание других белков этой группы (рис.14).

Положительное влияние на продукцию белка Отрицательное влияние на продукцию белка Активация транскрипции гена

Флотиллин-1

Стоматин

Рис. 14. Гипотетическая схема взаимного влияния рафт-образующих белков.

Центральным участником данной схемы, по нашему мнению, является флотиллин-2, который положительно регулирует продукцию своего партнера флотиллина-1. В свою очередь, флотиллин-1 также увеличивает содержание флотиллина-2, устанавливая с ним положительную обратную связь. Флотиллин-2 отрицательно влияет как на продукцию кавеолина-1, так и стоматина. Возможным механизмом подавления продукции кавеолина-1 является опосредованное флотиллином-2 снижение уровня белка р53, который, как известно из литературы, непосредственно активирует транскрипцию гена САУ-1. Таким образом, с помощью пока неизвестного механизма флотиллин-2 может снижать уровень продукции белка р53, что, в свою очередь, вероятно, приводит к уменьшению трансактивации кавеолина-1 и снижению его содержания в клетках. Также существует положительная связь между стоматином и флотиллином-1, которая, по всей видимости, однонаправлена.

Полученные нами данные указывают на существование механизмов регуляции уровней флотиллинов, стоматина и кавеолина-1, которые, на наш взгляд, могут играть компенсаторную роль, поддерживая баланс содержания и функционирования

различных рафт-образующих белков. Решение вопросов о роли разных типов рафт-образующих белков, их возможной взаимозаменяемости, а также о значении нарушения баланса содержания различных типов рафт-образующих белков, соответствующих мембранных микродоменов и сигнальных платформ при опухолевой трансформации и прогрессии позволит не только пролить свет на фундаментальные процессы, протекающие в опухолевых клетках, но и определить новые молекулярно-диагностические маркеры опухолевого роста и прогрессии.

Выводы

1) Впервые выявлено изменение содержания рафт-образующих белков флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина в образцах НМРЛ по сравнению с условно нормальной тканью.

2) Обнаружена статистически значимая связь между содержанием флотиллина-2 и степенью дифференцировки опухолевых клеток: опухоли с высокой или умеренной степенью дифференцировки характеризуются равным или повышенным уровнем белка, в низко дифференцированных опухолях уровень флотиллина-2 чаще снижается.

3) Рост клеток линий А549 и Н460 НМРЛ усиливается при гиперэкспрессии стоматина, снижается при гиперэкспрессии флотиллина-1, а также при подавлении экспрессии флотиллина-2.

4) Миграционная способность клеток линий А549 и Н460 прямо пропорциональна уровню экспрессии флотиллина-2, но не зависит от флотиллина-1 и стоматина.

5) Гиперэкспрессия флотиллина-2 приводит к снижению фосфорилирования киназ Е11К-1/2 и р38, а подавление экспрессии флотиллина-1 усиливает фосфорилирование ЕЮС-1/2. Гиперэкспрессия флотиллина-1, а также подавление экспрессии флотиллина-2 сопровождается увеличением продукции белков р53 и р21. Подавление экспрессии флотиллина-2 увеличивает фосфорилирование РАК киназы.

6) Подавление экспрессии флотиллина-2 в клеточных линиях А549 и Н460 НМРЛ сопровождается снижением содержания флотиллина-1 и возрастанием уровня стоматина и кавеолина-1. Подавление экспрессии флотиллина-1 не влияет на уровень других рафт-образующих белков. Обнаруженная взаимосвязь между рафт-образующими белками действует на пост-транскрипционном уровне.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шнейдерман, А. Н. Изменение экспрессии рафт-образующего белка флотнллппа-2 в адепокарципомах легкого человека и его влияние на свойства клеток линии А549 / А. Н. Шнейдерман, К. К. Лактионов, Б. Е. Полоцкий, И. Б. Зборовская // Биологические мембраны. — 2012. — Т. 29, № 4. — С. 293-304.

2. Шнейдерман, А. Н. Влияние нокдауна флотпллпна-2 на свойства клеток линии Н460 рака легкого / А. Н. Шнейдерман, А. И. Тарасова, М. С. Вагнда, Е. Ю. Брагнн, И. Б. Зборовская // Российский бнотерапевтнческий журнал. - 2012. -Т. 11,№3,-С. 9-14.

3. Ковалева, О. В. Сурвнвнп и его роль в патогенезе злокачественных опухолей / О. В. Ковалева, А. Н. Шнейдерман, Е. М. Чевкнна // Саркомы костей, мягких тканей и опухоли кожи. - 2011. - № 4. - С. 62-72.

4. Архипова, К. А. Роль кавеолина-1 в канцерогенезе / К. А. Архипова, А. Н. Тележкина, И. Б. Зборовская // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. — 2008, —Т. 7, —С. 157-168.

5. Zborovskaya, I. Underlying molecular altérations in progression of NSCLC / I. Zborovskaya, K. Lactionov, B. Polotsky, D. Yudin, I. Favorskaya, E. Musatkina, M. Kochetkova, O. Kovaljova, V. Mochalnikova, K. Arhipova, E. Stepanova, B. Ahmedov, A. Telezhkina // Anticancer Research: Abstracts of the eighth international conférence of anticancer research, Kos, Greece, 17-22 October 2008,— V. 28, № 5C. — P. 3550-3551.

6. Зборовская, И. Б. Экспрессия рафт-образующих белков при немелкоклеточном раке легкого / И. Б. Зборовская, К. А. Архипова, А. Н. Тележкина, Е. А. Мусаткина, А. В. Комельков, В. А. Рыбко, А. К. Аллахвердиев, Б. Е. Полоцкий // Опыт и перспективы развития сотрудничества между российскими и тайваньскими учеными в области изучения молекулярно-генетических механизмов развития злокачественных новообразований и использования результатов фундаментальных исследований в онкологии: Сборник материалов Международного симпозиума в рамках Сибирско-Тайваньского Форума, Томск, 16-17 сент. 2009. —- Т. 2. - С. 94-96.

7. Архипова, К. А. Экспрессия кавеолина-1 и других рафт-образующих белков в мезенхимальных опухолях и немелкоклеточном раке легкого / К. А. Архипова, А. Н. Тележкина, В. В. Мочальникова, И. Б. Зборовская // Вопросы онкологии: Тезисы 5-й

Российской конференции по фундаментальной онкологии, Санкт-Петербург, 17 апр. 2009, —Т. 55, №2,— С. 5.

8. Telezhkina, A. The expression of lipid raft proteins caveolin-1, stomatin, flotillins-1 and -2 in non-small cell lung cancer / A. Telezhkina, K. Arkhipova, I. Zborovskaya // Abstracts of the International Life Sciences Students Conference, Nijmegen, The Netherlands, 10-14 November 2010 — P. 83-84.

9. Telezhkina, A. N. Correlation analysis of lipid raft organizing proteins expression in non-small cell lung cancer / A. N. Telezhkina, K. A. Arkhipova, I. B. Zborovskaya // Abstracts of the Eurasian Forum on Cancer Diagnostics, Kyiv, Ukraine, 9-10 June 2011. -P. 27-28.

10. Shneyderman, A. The expression of lipid rafts organizing proteins in human lung adenocarcinoma / A. Shneyderman, A. Tarasova, I. Zborovskaya // Proseedings of EAFO Global Oncology Forum, Moscow, 4-6 May 2012. - P. 29.

11. Zborovskaya, I. Blood-circulated proteins and microRNAs as potential biomarkers for monitoring of lung cancer /1. Zborovskaya, V. Aushev, V. Shevchenko, A. Komelkov, N. Arnotskaya, O. Kovaleva, S. Kovalev, M. Akselrod, K. Lactionov, K. Archipova, A. Shneiderman, V. Krutovskikh // Tumor Biology: Abstracts of the 40th congress of the International society of oncology and biomarkers, Jerusalem, Israel, 13-17 Oktober 2012. -V. 33, SI.-P. 93.

Подписано в печать:

19.10.2012

Заказ № 7741 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Актуальность. В последние годы в молекулярной биологии все больший интерес вызывает изучение липидных рафтов - микродоменов в составе клеточных мембран, богатых холестеролом и сфинголипидами, а также различными сигнальными белковыми молекулами. Липидные рафты могут представлять собой чрезвычайно маленькие, лабильные и короткоживущие структуры, но наряду с такими существуют и гораздо более крупные и стабильные микродомены, которые поддерживаются особыми рафт-образующими белками. Особой и наиболее значимой функцией рафт-образующих белков является их способность формировать «сигнальные платформы», и тем самым регулировать передачу клеточных сигналов. В настоящее время известно большое количество рафт-образующих белков, но наиболее изученными среди них являются белки семейства кавеолинов, основным представителем которых является кавеолин-1. Роль кавеолина-1 в канцерогенезе обусловлена его способностью влиять на пролиферацию, клеточную миграцию, программируемую гибель клеток, ангиогенез и другие процессы, имеющие важнейшее значение при опухолевой трансформации и прогрессии, а изменения его экспрессии фиксируются во многих типах опухолей человека [1;2].

До настоящего времени изучению других семейств рафт-образующих белков, среди которых наибольший интерес представляет группа БРРН ^отайпб, РгоЫЬШпб, ЕЫШшб, НАК/С), уделялось значительно меньше внимания. Одними из представителей этой группы являются белки семейства флотиллинов. Они широко экспрессируются в тканях человека, локализуются в клетках преимущественно на плазматической мембране, способны к олигомеризации и принимают участие в регуляции многих сигнальных путей, часто пересекаясь в своих функциях с кавеолинами [3]. На сегодняшний день роль флотиллинов в канцерогенезе практически не изучена, что делает их особенно привлекательными объектами для исследования. Кроме того, 8 различные рафт-образующие белки могут являться функциональными аналогами друг друга, что наводит на мысль о их возможной взаимозаменяемости. Однако до сих пор не проводилось совместных скрининговых исследований экспрессии различных рафт-образующих белков в опухолях человека.

В качестве объекта исследования экспрессии некоторых представителей группы 8РРН белков нами был выбран немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ). Исследование молекулярных механизмов возникновения и прогрессии опухолевого роста на модели рака легкого, как одного из самых распространенных, неблагоприятно текущих и сложно поддающихся лечению онкологических заболеваний [4], предоставляет возможность в полной мере оценить значимость изменения тех или иных факторов, ассоциированных с канцерогенезом. На сегодняшний день важнейшими факторами прогноза для больных НМРЛ остаются клинические параметры, и в первую очередь степень дифференцировки опухолевых клеток и статус метастазирования. Некоторые успехи достигнуты и в изучении молекулярных маркеров, однако поиск дополнительных факторов представляет собой одну из наиболее актуальных проблем современной молекулярной онкологии.

Целью данной работы являлось изучение экспрессии флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ) и исследование возможных механизмов влияния данных рафт-образующих белков на свойства опухолевых клеток.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Оценить продукцию флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина в образцах первичных опухолей НМРЛ.

2. Сопоставить изменения продукции флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина с клинико-морфологическими показателями, такими как гистологический тип опухолей, степень дифференцировки опухолевых клеток, статус метастазирования.

3. Исследовать влияние гиперэкспрессии генов FLOT-1, FLOT-2 и STOM, а также подавления экспрессии генов FLOT-1 и FLOT-2 на характеристики клеточных линий А549 (АК легкого) и Н460 (крупноклеточная карцинома легкого) человека.

4. Изучить влияние изменения экспрессии генов FLOT-1, FLOT-2 и STOM на уровень продукции и статус фосфорилирования некоторых белков, участвующих в передаче клеточных сигналов.

5. Оценить взаимное влияние изменения экспрессии различных рафт-образующих белков в клеточных линиях А549 и Н460.

Научная новизна. В данной работе проведено скрининговое исследование продукции флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина при HMPJI, которое впервые показало, что содержание стоматина снижается в большинстве исследованных случаев HMPJI человека.

На модельных системах клеточных линий PJI показано влияние флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина на такие важнейшие свойства клеток, как пролиферация, миграция, способность к деградации внеклеточного матрикса. Получены приоритетные данные о существовании взаимного влияния изменения экспрессии рафт-образующих белков. Изменение экспрессии одного из рафт-образующих белков может сопровождаться изменением эндогенного уровня и других представителей этой группы белков, что, очевидно, изменяет структуру и функционирование мембранных рафтов. Возможные механизмы взаимного влияния рафт-образующих белков являются одной из неисследованных на сегодняшний день, но крайне актуальных проблем, поскольку данные изменения могут приводить к модификации важнейших путей передачи сигналов, ассоциированных с опухолевой трансформацией и прогрессией.

Научно-практическая значимость. Исследование экспрессии рафтобразующих белков флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина, а также определение молекулярных механизмов их влияния на свойства опухолевых клеток открывает новые перспективы для поиска дополнительных маркеров

10 одного из самых прогностически неблагоприятных онкологических заболеваний - рака легкого.

Анализ полученных результатов позволил выявить корреляционные связи между уровнем продукции рафт-образующих белков и клинико-морфологическими показателями опухолевого роста при НМРЛ человека. Так, обнаруженная в исследуемой выборке НМРЛ корреляционная связь между уровнем продукции флотиллина-2 и степенью дифференцировки опухолевых клеток позволяет использовать этот белок в качестве маркера дифференцировки при данном онкологическом заболевании.

Изучение рафт-образующих белков разных семейств и возможных путей их взаимной регуляции позволит расширить фундаментальные знания о механизмах опухолевой трансформации и прогрессии, что крайне актуально и представляет не только большой теоретический научный интерес, но и может широко применяться при решении проблем современной молекулярной онкологии.

Выводы

1) Впервые выявлено изменение содержания рафт-образующих белков флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина в образцах НМРЛ по сравнению с условно нормальной тканыо.

2) Обнаружена статистически значимая связь между содержанием флотиллина-2 и степенью дифференцировки опухолевых клеток: опухоли с высокой или умеренной степенью дифференцировки характеризуются равным или повышенным уровнем белка, в низко дифференцированных опухолях уровень флотиллина-2 чаще снижается.

3) Рост клеток линий А549 и Н460 НМРЛ усиливается при гиперэкспрессии стоматина, снижается при гиперэкспрессии флотиллина-1, а также при подавлении экспрессии флотиллина-2.

4) Миграционная способность клеток линий А549 и Н460 прямо пропорциональна уровню экспрессии флотиллина-2, но не зависит от флотиллина-1 и стоматина.

5) Гиперэкспрессия флотиллина-2 приводит к снижению фосфорилирования киназ ЕЮС-1/2 и р38, а подавление экспрессии флотиллина-1 усиливает фосфорилирование ЕКК-1/2. Гиперэкспрессия флотиллина-1, а также подавление экспрессии флотиллина-2 сопровождается увеличением продукции белков р53 и р21. Подавление экспрессии флотиллина-2 увеличивает фосфорилирование РАК киназы.

6) Подавление экспрессии флотиллина-2 в клеточных линиях А549 и Н460 НМРЛ сопровождается снижением содержания флотиллина-1 и возрастанием уровня стоматина и кавеолина-1. Подавление экспрессии флотиллина-1 не влияет на уровень других рафт-образующих белков. Обнаруженная взаимосвязь между рафт-образующими белками действует на посттранскрипционном уровне.