Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Протеомная характеристика межмолекулярных комплексов мембранных рецепторов лимфоцитов человека

На правах рукописи

Крутикова Мария Петровна

ПРОТЕОМНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ МЕМБРАННЫХ РЕЦЕПТОРОВ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА

14.00.36. - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ии^458941

Москва, 2008 год

003458941

Работа выполнена в ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор A.B. Филатов Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.Я. Арион доктор медицинских наук, профессор З.Г. Кадагидзе

Ведущая организация:

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Защита диссертации состоится » ^ /12009 г. в '/г часов на заседании совета Д 208.017.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций в ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России» по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, дом 24, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России»

Автореферат разослан «

с7 17

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций

доктор медицинских наук Л.С. Сесларийг!

Общая характеристика работы

Актуальность темы. После завершения проекта по расшифровке генома человека внимание молекулярных биологов стало все более смещаться в сторону изучения функциональных характеристик белков. Для понимания молекулярного механизма функционирования конкретного белка необходимо знать не только его структуру, но и возможные белок-белковые взаимодействия в которые вступает данный протеин. В современных исследованиях при изучении нового белка вслед за первым вопросом о его структуре, как правило, следует второй вопрос о том, с чем данный белок связывается. Белковые комплексы играют важную роль в транскрипции, делении клеток, онкогенной трансформации и многих других жизненно важных клеточных процессах.

Большое значение белковые комплексы имеют и для иммунологии. Многие иммунные процессы регулируются или осуществляются с участием белковых комплексов. Большинство мембранных рецепторов по своему строению являются мультипротеиновыми комплексами, состоящими из набора белков. Другие иммунологически значимые молекулы, такие как ци-топлазматические сигнальные белки, а также ядерные факторы транскрипции при выполнении своих функций образуют временные белковые комплексы со своими партнерами.

По различным оценкам от 15 до 20 % генов кодируют белки, локализованные на мембране. Если учесть, что многие мембранные белки являются рецепторами, то изучение комплексов мембранных белков приобретает особую значимость. К настоящему времени накоплен значительный материал по изучению комплексов цитозольных белков, в то же время комплексы мембранных белков исследованы значительно в меньшей степени. Это связано с методическими трудностями в выделении мембранных белков. Работа с очищенными мембранными белками затрудняется вследствие их высокой гидрофобности, а также необходимости дополнительного связывания с липидами. Для более глубокого изучения мембранных комплексов имеется настоятельная потребность в совершенствовании существующих методов исследования.

В силу сложившихся методических приемов основная часть современных работ, касающихся межмолекулярных комплексов, ограничивается изучением парных ассоциаций между отдельными молекулами, входящими в состав комплекса. Общая картина строения всего комплекса в целом, как правило, строится из разрозненных данных по отдельным парным ассоциациям. В последнее время благодаря развитию протеомного подхода стало возможным изучение не только парных ассоциаций, но и всего комплекса в целом.

Можно надеяться, что идентификация и характеристика мембранных белковых комплексов лимфоцитов человека позволит лучше понять молекулярные основы иммунных процессов, а также даст дополнительную информацию, которая необходима для направленной разработки новых фар-

макологических препаратов, влияющих на иммунный ответ. Таким образом, поиск и разработка новых подходов для идентификации и характеристики белковых комплексов, а также систематическое изучение межмолекулярных комплексов мембранных рецепторов лимфоцитов человека является актуальной задачей.

Цель работы: изучение структуры и состава межмолекулярных комплексов мембранных рецепторов лимфоцитов человека на трех примерах: комплексы рецептора СБ4, комплексы тетраспаниновых микродоменов, и, наконец, липидно-белковые комплексы мембранных рафтов.

Задачи исследования:

1. Развитие методической базы протеомного исследования комплексов мембранных белков. Изучение совместимости флуоресцентного имму-нопреципитационного анализа с последующим иммуноблотом.

2. Определение изоформ белка СЭ45, образующих межмолекулярный комплекс с молекулой С04.

3. Протеомная характеристика белков, ассоциированных с тетраспа-нинами СВ9 и СБ81.

4. Разработка нового метода детекции рафтовых антигенов и изучение с его помощью траслокации в липидные рафты некоторых мембранных белков.

Научная новизна. Впервые показано, что на периферических лимфоцитах крови человека молекула СБ4 образует межмолекулярный белковый комплекс преимущественно с низко молекулярной изоформой тирозин-фосфатазы СБ45, а именно с СВ45Я0.

Впервые в качестве компонента белкового комплекса тетраспанинов СБ9 и С081 идентифицирована металлопротеаза СБ 10.

Впервые продемонстрирована возможность совмещения флуоресцентной иммунопреципитации и последующего иммуноблота с одного и того же геля, что устраняет затруднения при сравнении и интерпретации экспериментальных данных, полученных на параллельных гелях. Разработанная методика позволяет комбинировать между собой качественные данные, полученные с помощью иммуноблота, с количественными данными, получаемыми методом флуоресцентной иммунопреципитации.

Практическая значимость работы. Научная значимость исследования заключается в развитии методологической базы протеомного исследования комплексов мембранных белков и расширении представлений о строении и составе молекулярных комплексов мембранных рецепторов лимфоцитов человека. Разработанные протеомные методы исследования и результаты диссертационной работы М.П. Крутиковой могут быть использованы в фундаментальных разработках проблемы структурно-функционального строения системы иммунитета на молекулярно-генетическом уровне и в лекционном цикле специализированных ВУЗов. Полученные данные о строении и составе комплексов молекул С04, СБ9 и С081 могут в дальнейшем быть использованы при направленной разработ-

ке новых противовирусных фармакологических препаратов, и препаратов обеспечивающих регуляцию иммунных реакций.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, июнь 2005), на 31-ом конгрессе Федерации европейских биохимических сообществ (Стамбул, Турция, июнь 2006), на VIII конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммуно-фармакологии» (Москва, июнь 2007), на III российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, сентябрь 2007). По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 4 статьи, опубликованных, в ведущих рецензируемых научных журналах.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Список литературы включает 140 источников. Работа содержит 3 таблицы и 23 рисунка.

Материалы и методы исследования

1.1. Антитела, клетки и их источники.

Мононуклеары периферической крови человека здоровых доноров выделяли центрифугированием (400xg, 30 мин) на градиенте плотности фи-колл-верографина (р=1,077). Клеточные линии человека поддерживали культивированием в среде DMEM (ICN, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США), 4 мМ L-глутамина и 80 мг/л гентамицина в увлажненной атмосфере с 5%-ным СОг при 37 °С.

Большинство моноклональных антител, использованных в данной работе, были получены ранее в лаборатории иммунохимии ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России».

1.2. Мечение клеток и белков флуоресцентными красителями.

Для мечения клеток и белков использовали аминореактивные флуоресцентные красители («Синтол», Россия). Клетки (4x10 ) суспендировали в 1 мл 10 мМ бикарбонатного буфера, содержавшего 150 мМ NaCl (рН 8,2). Мечение проводили при комнатной температуре, добавляя к клеткам 50 мкл красителя, растворенного в DMSO, до конечной концентрации красителя 0,1-0,3 мг/мл. Через 20 мин реакцию останавливали, отмывая клетки в 10 мМ растворе глицина в PBS.

1.3. Цитофлуориметрический тест.

К осадку 0,5x106 клеток, добавляли 50 мкл первичных антител и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем клетки дважды отмывали в растворе PBS, к осадку клеток добавляли 50 мкл вторичных антител, меченных FITC, и инкубировали 30 мин. Несвязавшиеся антитела дважды отмывали в растворе PBS. Интенсивность флуоресценции клеток измеряли на проточном цитометре FACScan (BD Biosciences,, США).

1.4. Приготовление клеточного лизата и иммунопреципитация.

Клетки (4x107) суспендировали в 1 мл лизирующего буфера, содержавшего ингибиторы протеаз, и инкубировали в течении 40 мин при 4 °С. После удаления клеточных остатков лизат последовательно осветляли путем инкубирования в течение 1-18 ч с БСА и нормальным IgG, предварительно иммобилизованными на BrCN-активированной сефарозе (по 200 мкл 50% суспензии каждого на 1 мл лизата) и протеин А-сефарозой (Bio-Rad, США) (100 мкл 50% суспензии на 1 мл лизата). Полученный лизат клеток использовали для иммунопреципитации на специфических антителах.

Перед иммунопреципитацией антитела предварительно иммобилизовали на протеин А-сефарозе или протеин G-сефарозе (Pierce, США). Затем носитель отмывали от несвязавшихся антител в PBS. При иммуноаффинной очистке белковых комплексов для масс-спектрометрического анализа пре-формированные комплексы антител ковалентно зашивали на протеин А-сефарозе или протеин G-сефарозе с помощью диметилпимелимидата. На одну иммунопреципитацию брали 100-200 мкл 50% суспензии носителя. Иммунопреципитацию проводили на ледяной бане в течение 1-18 ч. Несвя-завшие белки отмывали путем трехкратного центрифугирования (2000xg, 5 мин). Выделенные белки элюировали с носителя, добавляя 20 мкл электро-форетического буфера для нанесения образцов (95 °С, 5 мин). В некоторых случаях использовали кислую элюцию, для этого носитель со связавшимися белками переносили в колонку. Элюцию вели кислым буфером (pH 2,5), собирая фракции по 100 мкл. За выходом целевого антигена следили по интенсивности флуоресценции, измеряемой на флуориметре «Джин» (ДНК-технология, Россия).

1.5. Одномерный и двумерный электрофорез.

После иммунопреципитации белки подвергали электрофоретическому разделению по методу Лэммли в SDS-полиакриламидном геле в ячейке Mini-PROTEAN®3 (Bio-Rad, США). Процентность разделяющего геля в зависимости от эксперимента варьировала от 7 до 12%. При двумерном электрофорезе белки вначале разделяли в 10% ПААГ в невостанавливающих условиях, затем вырезали трек, уравновешивали его в буфере, содержащем 2-меркаптоэтанол, и подвергали электрофорезу в перпендикулярном направлении в 10% ПААГ. После электрофореза визуализацию белков в геле проводили на флуоресцентном сканере Molecular Imager FX Pro (Bio-Rad) без предварительной фиксации, окрашивания или сушки геля.

1.6. Маес-спектрометрическая идентификация белков.

Белковые полоски (~5мм3) вырезали из геля, отмывали, высушивали и

добавляли 5-8 мкл раствора трипсина (Promega, США) в концентрации 25 нг/мкп в 50 мМ бикарбонате аммония. Гидролиз белков проводили при 37 "С в течение ночи. Пептиды экстрагировали добавлением 12-17 мкл раствора для экстракции (5% ацетонитрила, 0,5% муравьиной кислоты в деиони-зованной воде) в течение 30 мин. Полученные пептиды подвергали масс-спектрометрическому анализу. Обратнофазную жидкостную хроматогра-

6

фию проводили, используя Agilent 1100 нано-проточную LC систему, соединенную с ионной ловушкой «Agilent 1100 SL Series MSD Trap» (Agilent Technologies Inc.). Триптические пептиды разделяли, используя линейный градиент 5-80% ацетонитрила, содержавшего 0,1% муравьиной кислоты, в течение 60 мин и детектировали с помощью ионной ловушки в диапазоне от 200 до 1800 m/z.

Идентификацию белков по тандемным масс-спектрам (MS/MS) трип-тических пептидов проводили с помощью программы MASCOT (www.matrixscience.com), и все тандемные масс-спектры идентифицировали путем корреляции с последовательностью пептидов человеческих белков присутствующих в базе данных белковых последовательностей NCBI (www. ncbi.nlm.nih.gov).

1.7. Иммуноблот.

Белки, полученные после иммунопреципитации, разделяли электрофорезом в 10% или 7% SDS-ПААГ в нередуцирующих условиях в буферной системе Лэммли. Разделенные белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану на приборе Mini Trans-Blot (Bio-Rad) в течение 1 ч при напряжении 100-120 В в буфере следующего состава: 25 мМ Триса, 192 мМ глицина (pH 8,3), 20%-ный этанол. Мембраны блокировали 5%-ным сухим обезжиренным молоком в PBS с 0,1%-ным Tween 20 и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с биотинилированными первичными антителами. Мембраны отмывали и инкубировали со стрептавидином, конъюгиро-ванным с пероксидазой хрена (Amersham, США). Визуализацию проводили с помощью хемилюминесценции, используя реагенты фирмы Bio-Rad.

1.8. Трансфекция.

Плазмиды, кодирующие различные изоформы CD45 человека, были получены методом стандартного ПЦР на кДНК, полученной из клеток Jurkat. CD45 ORF (около 4 kb) была получена из двух кусочков ДНК длиной примерно 2 kb. Для клонирования ДНК использовались рестрикционные сайты: 5'-XbaI, в середине - SacII и 3'- Xmal. На С-конце CD45 перед стоп кодоном была вставлена последовательность Flag DYKDDDDK для дополнительного распознавания изоформ с помощью соответствующих антител. CD45 собирали в плазмиде рТОРО (Invitrogen), секвенировали примерно по 600-800 нуклеотидных остатков и затем полную ORF клонировали в экс-прессионной плазмиде млекопитающих pCMVpA. Различные изоформы CD45 получали путем ПЦР генерированной делеции соответствующих участков ДНК в 5'-конце полной изоформы CD45RABC. Плазмида рМХ4, экс-прессирующая CD4 человека под контролем CMV промотера, была получена из лаборатории Veneet KewalRamani (NCI-Frederick, США).

Временную трансфекцию клеток почек человека 293Т проводили в 10 см чашках Петри (Costar). 5x106 клеток в среде DMEM с добавлением 10% ЭТС трансфецировали 10 мкг плазмидной ДНК, используя 35 мкл реагента Унифектин (Россия). Соотношение плазмид, экспрессирующих CD4 и CD45, составляло 1:4, что соответствовало их максимальной ко-экспрессии.

Спустя 24 ч культуральную среду заменяли на свежую, а через 48 ч после начала трансфекции клетки собирали с чашек, отмывали однократно раствором PBS и лизировали в 1 мл лизирующего буфера, содержащего 1% Brij97 в течение 40 мин при 4 °С для дальнейшего анализа белков. Небольшие аликвоты клеток оставляли для иммунофлуоресцентного анализа на проточном цитометре FACScan.

1.9. Выделение рафтов методом гель фильтрации с предварительным окрашиванием флуоресцентномечеными антителами.

К осадку, содержавшему 2><107 клеток, добавляли флуоресцентноме-ченные моноклональные антитела в насыщающих концентрациях либо FITC меченую В-субъединицу холерного токсина (CT-F). Инкубировали 30 мин при комнатной температуре. После двух отмывок в PBS (300xg) клетки либо лизировали, либо крослинкировали добавлением вторичных антител (SHAM-F) в насыщающей концентрации. При кросслинкировании к осадку клеток добавляли 1 мл FITC меченых F(ab')2 фрагментов овечьих антител против IgG мыши, инкубировали 30 мин при комнатной температуре, а затем клетки дважды отмывали в PBS (300xg). Для контроля эффективности мечения клеток использовали метод проточной цитометрии. Осадок окрашенных антителами клеток ресуспендировали в 300 мкл холодного лизирующего буфера с ингибиторами протеаз и инкубировали в течение 30 мин при 4°С, клеточные остатки осаждали (3000xg, 5 мин, 4°С), а полученный лизат использовали для гель-фильтрации. Элюцию проводили при 4°С. Ли-зат (200-300 мкл) наносили на колонку и оставляли на 4 мин, чтобы образец вошел в колонку. В это время 0,3 мл элюата собирали в качестве первой фракции. Затем наносили следующие 0,3 мл лизирующего буфера и в течение 4 мин собирали вторую фракцию и так далее. Всего собирали 10 фракций. За выходом целевого антигена следили по интенсивности флуоресценции, измеряемой на флуориметре «Джин» (ДНК-технология, Россия).

1.10. Обработка результатов экспериментов.

Изображения гелей обрабатывали с помощью программы Quantity One (Bio-Rad), цитометрические данные собирали и анализировали с помощью программного обеспечения CELLQUEST. Обработку цитометрических файлов осуществляли с помощью прикладной программы WinMDI 2.8. Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с помощью программы Excel 2000 фирмы Microsoft.

Результаты исследований и их обсуждение

Разработка метода, позволяющего совместить флуоресцентную иммунопреципитацию и иммуноблот.

Межмолекулярные комплексы, которые формируются на поверхности мембраны, отличаются между собой по своим размерам и характеру ассоциации отдельных компонентов. Условно эти комплексы можно разделить на три типа. Во-первых, это небольшие комплексы, характеризующиеся

строгим составом. Сюда относятся комплексы, образуемые такими клеточными рецепторами, как BCR, TCR, FcRIgE, а также некоторые другие. К ним можно отнести комплекс рецептора CD4. Комплексы второго и третьего типа являются более крупными образованиями, и их состав подвержен значительной вариации. Эти комплексы могут занимать значительные области мембраны, за что их часто называют микродоменами. Один из видов микродоменов формируется молекулами тетраспанинов, которые за счет белок-белковых взаимодействий образуют так называемую тетраспанино-вую сеть. Другим видом микродоменов являются липидные рафты, структура которых в основном формируется за счет липид-липидных и липид-белковых взаимодействий. В соответствии с этой классификацией нами были проведены протеомные исследования всех трех типов белковых ассоциа-тов, а именно были изучены комплексы молекулы CD4, комплексы тетраспанинов и липидные рафты.

Исследование межмолекулярных комплексов было проведено как на трансформированных Т - и В-клетках, так и нормальных лимфоцитах периферической крови человека. Каждая из клеточных мишеней была изучена тремя независимыми методами: собственно иммунопреципитацией, непрямым иммуноблотом и масс-спектрометрией.

Прежде чем непосредственно перейти к изучению комплексов мембранных белков нами были модифицированы методы иммунопреципитации и иммуноблота. Эти два метода хорошо дополняют друг друга. Если имму-нопреципитация дает более ясное представление о количественном соотношении компонентов белкового комплекса, то иммуноблот обладает более высокой чувствительностью и позволяет идентифицировать отдельные полосы на геле. Поэтому представляется весьма продуктивным комбинировать эти два метода. Однако в стандартном формате иммунопреципитация и иммуноблот в силу методических ограничений, как правило, осуществляются на параллельных гелях, что затрудняет сравнение и интерпретацию экспериментальных данных.

Недавно в нашей лаборатории был предложен и разработан новый подход [Filatov 2007], который получил название флуоресцентного имму-нопреципитационного анализа (ФИПА). Этот метод позволил упростить процедуру мечения белков, увеличить динамический диапазон детекции и сделать ее количественной. Однако самое главное его достоинство состоит в том, что он позволил совместить собственно иммунопреципитацию с масс-спектрометрическим анализом. С помощью предложенного подхода гель после регистрации результатов собственно иммунопреципитации поступает на масс-спектрометрический анализ, таким образом, оба метода работают с одним и тем же гелем. В настоящей работе была поставлена задача, расширить возможности применения метода флуоресцентной иммунопреципитации путем его комбинации с Вестерн блотом.

Для того чтобы выяснить можно ли предложенный нами метод ФИПА совместить с Вестерн блотом необходимо было проверить, как влияет

введение в состав белков флуоресцентного красителя на иммунохимическое проявление антигенов. С этой целью из лизата клеток №1т6 в детергенте ТХ-100 были иммунопреципитированы антигены СБ9 и СБ 10, которые затем были проявлены в иммуноблоте. В контроле использовали клетки неокрашенные флуоресцентным красителем. Сравнение сигналов хемилюми-несценции опытного и контрольного образца показали, что введение красителя не приводит к заметному падению сигнала хемилюминесценции.

IP: CD 9 IgG CD9 IgG

FIPA WB : CD9

Рис. 1. Метод флуоресцентной иммунопреципитации совместим с иммуноблотом.

Клетки Nalmö метили флуоресцентным красителем R6G, лизировали, иммуноаффинно выделяли антиген CD9, разгоняли в электрофорезе и визуализировали результаты общей иммунопреципитаии на флуоресцентном сканере (левая панель). Далее белки из геля переносили на мембрану, обрабатывали anmu-CD9 антителом и проявляли иммуноблот (правая панель). В качестве отрицательного контроля использовали иммунопреципита-цию на нормальном IgG мыши.

Таким образом, метод флуоресцентной иммунопреципитации является совместимым с иммуноблотом и позволяет регистрировать с одного геля результаты собственно иммунопреципитации и Вестерн блота, что устраняет затруднения связанные со сравнением результатов, полученных на различных гелях. Пример такого совмещения приведен на рис. 1. При собственно иммунопреципитации из лизата клеток Nalmö были получены две мажорные полосы в районе 24 кДа, а также набор слабых полос в более высокомолекулярной области. При иммуноблоте полученного геля были зарегистрированы две полосы, которые при наложении на картину общей иммунопреципитации полностью, совпали с наблюдавшимися на ней мажорными полосами.

Использование флуоресцентных красителей для мечения клеточных белков облегчает также наблюдение за целевым белком при иммуноаффин-ном выделении и не препятствует последующему масс-спектрометриче-скому анализу. Применение флуоресцентных красителей обеспечивает возможность комбинировать между собой различные протеомные методики. Некоторые из них могут выполняться последовательно на одном образце,

10

другие могут выполняться в параллельных экспериментах. Все это позволяет говорить о том, что флуоресцентный иммунопреципитационный анализ создает общую платформу для ряда наиболее используемых протеомных методов исследования

Межмолекулярные комплексы белка СБ4.

На первом этапе исследования межмолекулярных комплексов мембранных белков были рассмотрены комплексы, образованные молекулой СБ4. Эта молекула играет важную роль в развитии и активации Т-клеток; являясь корецептором, она увеличивает аффинность антигенного рецептора Т-лимфоцитов к пептидам, представляемым в составе антигенов гистосов-местимости класса II. С04 также участвует в передаче сигнала посредством ассоциированной с ним тирозинкиназы Ьск. Кроме того, СБ4 в комплексе с хемокиновыми рецепторами СХСЯ4 и ССК.5 является рецептором к ВИЧ-1.

Для того чтобы выяснить, с какими белками ассоциирована молекула СЭ4 были проведены опыты по копреципитации. С этой целью живые клетки метили сукцинимидным эфиром красителя родамин 60. Как известно, 1160 реагирует с ЫН2 группировками лизинов, а также с Ы-концевым амином, и включается в состав большинства поверхностных и цитоплазма-тических белков. Лизис клеток осуществляли в мягком детергенте Вгу97, который солюбилизирует мембранные белки, но оставляет интактными межбелковые комплексы. В качестве мишеней были выбраны клетки линии СЕМ, которые среди доступных Т-клеточных линий в наиболее ярко экс-прессировали белок СБ4. При преципитации из лизата клеток СЕМ в детергенте Вгу97 антитело 0КТ4 (анти-СБ4) кроме мажорной полосы антигена СБ4 давало ряд копреципитационных полос. Наиболее выраженные из них в редуцирующих условиях располагались при 32, 95 и 200 кДа. Полосы 95 и 200 кДа мигрировали с той же скоростью, что и белки С071 и СБ45. Данное отнесение было подтверждено в опытах по иммуноблоту, а также масс-спектрометрическим анализом. Полоса при 32 кДа с помощью масс-спектро метрии была идентифицирована как принадлежащая белку ЬРАР.

Известно, что белок СБ45 существует в виде нескольких изоформ. Возникает естественный вопрос о том, какие изоформы СБ45 участвуют в комплексообразовании с СБ4. Для ответа на этот вопрос из лизата клеток СЕМ в 1% растворе детергента Вгу97 были получены иммунопреципитаты белковых комплексов С045 и СБ4, которые после электрофореза были перенесены на нитроцеллюлозу и проявлены антителами специфическими к определенным изоформам. После преципитации белка СБ45 он хорошо проявлялся на иммуноблоте как с помощью антител специфичных к определенным изоформам, так и антитела ЬТ45 распознающего общую детерминанту молекулы СР45. При преципитации антигена СБ4 регистрировался сигнал копреципитированного СЭ45, который был виден при проявке антителом ЬТ45, которое не различает изоформы, и проявке антителом против изоформы 0045110, но не против изоформы С045КВ (Рис. 2А, Б).

лимфоциты периферической крови человека

Рис. 2 Белок СБ4 копреципнтирует изоформу СБ45К0

Из лизата клеток СЕМ (А, Б) и лимфоцитов крови (В) в детергенте Вгу97 были преципитированы антигены С045 (А) или Сй4 (Б, В). Копреципитированные изоформы антигена СЭ45 были проявлены в иммуноблоте с антителами специфически реагирующими с изоформами С045ЯА, СО45Я0 и СВ45ЯВ. В положительном контроле иммуно-преципитаты были проявлены анти-СИ4 и анти-С045 антителами.

Таким образом, было показано, что в комплекс с молекулой СБ4 на клетках СЕМ вступает только низкомолекулярная изоформа СВ45Я0. Клетки линии СЕМ обладают тем недостатком, что несут на своей поверхности только две изоформы СБ45. Кроме того СЕМ является трансформирован-' ной Т-клеточной линией, на клетках которой могут нарушаться взаимодействия между молекулами характерные для нормальных лимфоцитов. Поэтому в следующей серии экспериментов в качестве объекта исследования были использованы первичные клетки, а именно лимфоциты периферической крови, на которых обнаруживаются пять различных изоформ СБ45. С помощью масс-спектрометрического анализа, иммуноблота и коиммуно-преципитации было показано, что на лимфоцитах, также как и на клеточной линии СЕМ, белок СБ4 образует межмолекулярный комплекс с тирозин фосфатазой С045. Данные иммуноблота свидетельствуют о том, что антиген С045 выделяемый совместно с СБ4 проявляется только антителом иСНЫ, которое специфично к изоформе СВ45Я0, но не антителами против изоформ С045ИА и СБ4511В (Рис. 2В).

Потенциальными возможностями для идентификации конкретной изоформы СБ45, которая взаимодействует с молекулой СБ4, обладает метод масс-спектрометрии, однако на этом пути мы столкнулись с определенными трудностями. Структурный анализ последовательностей изоформ СБ45 показал, что при гидролизе трипсином, наиболее часто используемым ферментом для протеолиза белков, из вариабельной области изоформ СВ45ВС, СБ45В и СВ45Ы0 образуются пептиды с массами больше 4000 Да. Эти пептиды имеют слишком большие размеры для того, чтобы их можно было ионизировать с помощью элетроспрей ионизации и проанали-

зировать методом тандемной масс-спектрометрии с помощью ионной ловушки, поскольку пределом детекции для ионной ловушки является отношение массы пептида к его заряду (m/z) равное 2000. В соответствии с этим ни в одном эксперименте не удалось зарегистрировать пептиды из вариабельной части CD45, полученные при гидролизе трипсином. Для получения пептидов меньшей массы мы использовали фермент GluC, который расщепляет полипептидную цепь возле остатка глютаминовой кислоты. В масс-спектре пептидных фрагментов белка CD45, копреципитированного с рецептором CD4, нам удалось зарегистрировать первичный двухзарядный ион имеющий соотношение m/z равное 838,41, которое соответствовало фрагменту QSPTPSPTDAYLNASE из вариабельной части изоформы CD45R0. К сожалению, присутствие в первичной последовательности пептида трех остатков пролина (Р) и невысокая интенсивность пика не позволили расшифровать его первичную последовательность с помощью тандемной масс-спектрометрии. Тем не менее, из представленных данных можно сделать вывод о том, что данные масс-спектрометрии подтверждают ассоциацию антигена CD4 с изоформой CD45RO.

Поскольку изоформа CD45R0 является маркером клеток памяти [Boursalian 1999], то можно предположить, что комплекс молекулы CD4 может формироваться преимущественно на поверхности Т-лимфоцитов уже вступавших в контакт с чужеродным антигеном.

Нами были получены данные о том, что в состав комплекса молекулы CD4 входит также трансферриновый рецептор CD71. Белок CD71 может существовать в форме гомодимера скрепленного -S-S- связью, а также в форме мономерной молекулы. Для того чтобы выяснить в каком виде белок CD71 представлен в комплексе с CD4 нами были проведены эксперименты по двумерному электрофорезу. Сначала образец разделяли в SDS-форезе в невосстанавливающих условиях, затем подвергали электрофорезу в перпендикулярном направлении в восстанавливающих условиях. В отличие от основной части белков, которые укладывалась на некую диагональ, белок CD71 располагался отдельно отстоящим пятном. Это указывает на то, что в невосстаналивающих условиях он мигрировал значительно медленнее, чем в восстанавливающих. Отсюда можно сделать вывод, что белок CD71 в составе комплекса молекулы CD4 находится исключительно в димерной форме скрепленной -S-S- связью.

Ранее нами было определено, что белки CD45 и CD71 входят в комплекс в эквимолярных соотношениях [Кротов 2007]. Из этого можно сделать вывод о том, что молекула CD45 также димеризована. Это хорошо согласуется с литературными данными о склонности изоформы CD45R0 образовывать димеры [Takeda 1992]. При этом было отмечено, что при гомоди-меризации ингибируется фосфатазная активность CD45. Таким образом, в составе комплекса наблюдается изоформа CD45R0, которая обладает самой малой фосфатазной активностью. Возможно, в этом заключается биологи-

ческий смысл образования комплекса, в котором осуществляется мягкое регулирование активности находящейся в комплексе киназы Lck.

Несмотря на то, что качественный состав комплекса, образованного молекулой CD4, вполне определен, тем не менее, порядок вхождения в него отдельных компонентов остается невыясненным. Молекулы CD4 и CD45 являются белками, которые наиболее хорошо детектируются в составе комплекса. Однако наличие на клетке молекул CD4 и CD45 не является достаточным условием для образования комплекса. Так в частности на клетках U937, экспрессирующих и CD4, и CD45, такие комплексы не наблюдаются. Этот результат имеет два возможных объяснения. Первое объяснение предполагает, что для образования комплекса необходима низкомолекулярная изоформа белка CD45, а именно CD45R0, которая представлена на клетках U937 в недостаточном количестве. Второе объяснение сводится к тому, что для образования комплекса требуются некоторые вспомогательные молекулы, которые могут отсутствовать на клетках U937.

Для того чтобы выяснить могут ли белки CD4 и CD45 взаимодействовать непосредственно между собой в отсутствие других вспомогательных молекул были проведены эксперименты по котрансфекции белков CD4 и CD45 в нелимфоидные клетки. Были использованы плазмиды, кодирующие антиген CD4 и основные изоформы белка CD45, а именно CD45RABC, CD45RB, CD45R0. Прежде всего, была проверена корректность экспрессии клонированного гена CD45.

А

и о н о

ч ы

о

И

н о о

С04-ФИТЦ С045-ФИТЦ

Рис. 3. Котрансфекции СБ4 и различных изоформ СБ45 в нелимфоидные 293Т клетки.

Котрансфецированные клетки 293Т окрашены антителами против антигена Сй4 (А) и антигена Сй45 (Б). Закрашенными гистограммами показана флуоресценция в отрицательном контроле

Несколькими независимыми методами было показано, что полученные плазмиды при временной трансфекции в человеческие нелимфоидные клетки 293Т и НеЬа обеспечивали синтез искомого белка С045. Молекулярная масса синтезируемого полипептида равнялась примерно 200 кДа, что следовало из результатов прямого иммуноблота с антителами против

пептида FLAG, который в процессе клонирования был включен в состав С-конца белка CD45.

Рекомбинантный белок распознавался антителами, реагирующими с различными участками антигена CD45. Окраска цитоплазматичаской части CD45 наблюдалась под флуоресцентным микроскопом при обработке трансфецированных и пермебилизованных клеток HeLa антителом анти-CD45 clone 69. С помощью антител реагирующих с вариабельным и константным внеклеточными доменами на проточном цитометре наблюдалось поверхностное окрашивание трансфецированных клеток 293Т. При обработке антителом LT45, которое реагирует с константной частью внеклеточного домена, окрашивались все три полученных трансфектомы. Антитела T6D11 и UCHL1 реагировали исключительно только с одной изоформой: антитело T6D11 (CD45RA) с трансфектомой CD45RABC, a UCHL1 (CD45R0) с трансфектомой CD45R0. Антитело МЕМ-143 (CD45RB) реагировало с изоформами CD45RABC и CD45RB. Таким образом, было проверено, что при трансфекции рекомбинантный CD45 сохранял все свои основные эпитопы, что говорит о корректной укладке его полипептидной цепи.

Далее нами были оптимизированы условия котрансфекции плазмид CD4 и CD45. Если указанные плазмиды использовались в равных концентрациях, то в этом случае антиген CD4 экспрессировался в значительно большем количестве, чем антиген CD45. При варьировании соотношения плазмид было определено, что наилучшие результаты достигаются при соотношении плазмид CD4 и CD45 равном 1:4. В этих условиях более половины клеток несли антигены CD45 и CD4, которые экспрессировались примерно равных количествах (рис. 3).

С целью выявления возможных комплексов между молекулами CD4 и CD45 котрансфецированные клетки лизировали в мягком детергенте Brij97. Лизаты разделяли на две части, с каждой из которых проводили иммуно-преципитацию на сорбенте с антителом либо против CD4, либо против CD45. После иммуноаффинного выделения и электрофореза материал переносили на нитроцеллюлозу и проявляли антителами против CD45 или CD4. Как известно мягкий детергент Brij97 при лизисе не разрушает ассоциацию между CD4 и CD45, тем не менее, ни в одном случае копреципита-ционных полос обнаружено не было (рис. 4 А, Б). Ни одна из тестированных изоформ CD45RABC, CD45RB или CD45R0 не образовывала комплекс с молекулой CD4 на клетках 293Т. Этот результат наблюдался как при им-мунопреципитации CD4 и проявке с помощью антитела против CD45, так и при иммунопреципитации CD45 и проявке с помощью антитела против CD4. В правой части рис. 4 приведены положительные контроли на эффективность иммунопреципитации и иммуноблота. Таким образом, при экспрессии в нелимфоидные клетки белки CD4 и CD45 не могут напрямую взаимодействовать между собой и образовывать комплекс.

Рис. 4. Антиген CD4 не копреципитируются с антигеном CD45 из лизатов клеток 293Т, котрансфецированных CD4 и различными изоформами CD45.

Лизат клеток иммунопреципитировали с помощью aumu-CD4 (А, Г) или анти-CD45 (Б, В) антител и проявляли в иммуноблоте с помощью биотинилированных аити-CD45 (А, В) или aumu-CD4 (Б, Г) антител.

Вполне вероятно, что молекулами, которые могут облегчать образование комплекса, являются белки LP АР и Lck, которые, как известно, входят в состав комплекса CD4/CD45 на клетках СЕМ. В подтверждение этого на клетках HUT-78, лишенных антигена CD4, масс-спектрометрически был идентифицирован комплекс, состоявший из молекул CD45, CD71, Lck и LP АР. По всей видимости, располагая основными компонентами комплекса, возможна его биохимическая реконструкция in vitro.

Межмолекулярные комплексы тетраспанинов.

На следующем этапе исследования нами были изучены белковые комплексы образованные тетраспанинами. Для изучения тетраспаниновых комплексов была выбрана B-клеточная линия Nalmô, которая экспрессирует на своей поверхности рекордно большое количество тетраспанина CD9, к которому в нашем распоряжении имелось антитело, дающее хорошие результаты как в иммунопреципитации, так и в иммуноблоте. Кроме того, на клетках Nalmô экспрессируются также тетраспанины CD81 и CD63. При преципитации из лизата клеток Nalmô, полученного в детергенте Brij97, на антителе TRI2 (анти-С09) были получены две мажорные полосы при 24 и 26 кДа и ряд копреципитационных полос. По литературным данным мажорные полосы соответствовали двум формам антигена CD9, которые отличаются по степени гликозилирования.

Из всех копреципитационных полос наиболее отчетливой была полоса при 100 кДа. Из антигенов экспрессированных на клетках Nalm6 наиболее близкой молекулярной массой обладает белок CD 10. При иммунопреципитации антигена CD 10 он комигрировал с обнаруженной копреципита-ционной полосой. Это позволило предположить, что антиген CD 10 копре-

ципитирует с CD9. Для доказательства того, что белки CD9 и CD 10 образуют межмолекулярный комплекс, была проведена иммунопреципитация в обратном направлении. При этом было обнаружено, что при выделении антигена CD 10 из лизата клеток в детергенте Brij97 обнаруживается копреци-питационная полоса, которая эмигрировала с антигеном CD9. Интересно, что в этом случае наилучшим образом проявлялась та полоса, которая соответствовала низкомолекулярной форме CD9. Для подтверждения вывода о коиммунопреципитации молекул CD9 и CD 10, белки после иммунопреци-питации и флуоресцентного сканирования геля были перенесены на нитроцеллюлозу и проявлены в иммуноблоте специфическими антителами. Как и ожидалось, главные полосы в иммунопреципитации были идентифицированы как антигены CD9 и CD 10. Наиболее интересно было то, что копреципи-тационные полосы были также идентифицированы как CD9 и CD 10. Таким образом, было продемонстрировано, что эти молекулы взаимодействуют друг с другом с образованием комплекса, который проявляется при иммунопреципитации в обоих направлениях.

Следует заметить, что обнаруженное взаимодействие между CD9 и CD 10 проявлялось только в присутствии ионов Са2+ и Mg2+. При использовании буферов, не содержащих данные ионы, копреципитация не наблюдалась. Для того чтобы определить насколько взаимодействие между белками CD9 и CD 10 является специфическим были преципитированы некоторые другие антигены, экспрессированные на клетках Nalm6. Было обнаружено, что тетраспанин CD81 также хорошо проявлял себя в коиммунопреципитации с CD10, как и антиген CD9. Другие белки, такие как CD71, HLA класса I и II, а также CD38 оказались менее эффективными в совыделении как CD9, такиСОЮ

Для того чтобы определить, какие еще молекулы входят в тетраспа-ниновый комплекс на клетках Nalm6, нами с помощью масс-спектрометрии были проанализированы целиком все треки после электрофореза иммуно-преципитатов CD9 и CD 10. Каждый из треков был разделен на 19 равных фрагментов, которые были трипсинизированы и подвергнуты масс-спектрометрическому анализу. В иммунопреципитатах антигена CD9 было идентифицировано более 20 различных поверхностных белков (Табл. 1). Прежде всего, в составе комплекса были обнаружены другие тетраспанины, такие как CD81, CD63, а также два мало изученных тетраспанина 9 и 14, которые еще не вошли в классификацию поверхностных антигенов. Вместе с белком CD9 выделялись также протеины, чье участие в формировании тетраспаниновой сети является хорошо известным фактом. К таким белкам можно отнести аб и (31 цепи интегрина (CD49f и CD29), CD 19, HLA класса I и II [Naour 2006]. В составе ассоциатов мы также обнаружили протеины, которые только недавно были определены как партнеры тетраспанинов. Это белки CD315 (CD9P-1) [Charrin 2001], CD316 (EWI-2) [Charrin 2003, Kolesnikova 2004], мембранная протеиназа CD156c (ADAM 10) и рецептор холина CD92 [Naour 2006].

J7

Таблица 1. Профилирование белков, выделяемых совместно с антигенами СБ9 и СБ10 из клеток №1т6.

Белок Номер в базе данных Swiss-Prot Mr, кДа Иммунопреципитация

CD9 (TR12) CD10 (NA4)

MASCOTS core Кол-во пептидов MAS-COTScore Кол-во пептидов

1 CD49f (VLA-6) Р23229 126 258 8 - -

2 Активатор морфогенеза 1 Q9Y4D1 123 352 9 67 2

3 CD315 (CD9P-1) Q9P2B2 98 49 4 - -

4 CD29 P05S56 88 76 4 - -

5 CD 10 (CALLA) Р08473 85 471 18 887 32

6 CD71 Р02786 85 172 5 - -

7 CD 156с (ADAM 10) 014672 84 184 9 - -

8 Аннексии А6 Р08133 76 393 11 239 10

9 CD92 Q8WWI5 73 61 1 - -

10 CD 146 (MUC18) Р43121 71 86 3 - -

11 Неохарактеризованный белок C14orí21 A8MY76 69 - - 43 2

12 CD316 (EWI-2, CD81 партнер 3) Q969P0 65 113 5 - -

13 CD19 Р15391 61 93 3 - -

14 CD98 Р08195 58 56 2 - -

15 Белковая дисульфид -изомераза А6 Q15084 48 161 5 - -

16 Галактокиназа Р51570 42 79 4 - -

17 HLA класс I Р01892 40 120 4 77 2

18 Неохарактеризованный белок C3orf26 Q9BQ75 32 - - 46 2

19 Тетраспанин -14 Q8NG11 30 63 5 - -

20 Неохарактеризованный белок С14огП66 Q0VAA2 28 62 4 - -

21 HLA класс II Р04229 28 280 3 50 3

22 Неохарактеризованный белок C22orfl3 Q96NT3 27 - - 38 2

23 CD81 (ТАРА-1) Р60033 26 84 1 58 1

24 CD9 Р21926 26 103 5 82 4

25 CD63 Р08962 26 36 1 - -

26 Тетраспанин-9 075954 26 76 1 - -

27 Неохарактеризованный белок C21orf70 Q9NSI2 25 - - 130 4

28 CD 179b Р15814 23 57 1 100 2

Наконец здесь же были обнаружены пять белков, ассоциация которых с тетраспаниновой сетью ранее не отмечалась. Это белки СЕ) 10, СЕ)71, С098, СО 146 (МиС18), и СБ179Ь. В набор белков, совыделяемых с антигеном СБ 10 входило всего 5 протеинов: белки НЬА класса I и II, С09, СБ81,

18

а также CD 179b. В таблицу I были включены также 5 неохарактеризован-ных пока протеинов, один из которых выделялся совместно с CD9 (C14orfl66), а четыре других только вместе с антигеном CD 10 (C14orf21, C3orf26, C22orfl3 C21orf70). Функция и клеточная локализация этих белков до сих пор неустановленна.

Поскольку с антигеном CD9 был выделен целый ряд различных мембранных белков, то возникает вопрос о специфичности их взаимодействия с CD9. На первый взгляд может показаться, что CD9 реагирует со всеми белками, экспрессированными на поверхности клеток Nalm6. Однако в имму-нопреципитатах нами не были обнаружены такие белки как CD43, CD47, CD99 и CD147, которые обильно представлены на клетках Nalm6. Интересно, что CD43 и CD 147 образуют между собой комплекс, отличный от комплекса тетраспанинов [Khunkaewla 2008]. Из этих экспериментов можно сделать вывод, что, несмотря на то, что антиген CD9 может связываться с очень широким спектром поверхностных белков, тем не менее существует определенная избирательность в его связывании с другими белками.

Протеомное изучение липидных рафтов.

На следующем этапе исследования были изучены комплексы мембранных белков, называемые мембранными рафтами. Лизис клеток в холодных неионных детергентах приводит к солюбилизации основной части мембранных белков, однако области исходно присутствующие в виде липидных рафтов не солюбилизируются, а остаются прикрепленными к цито-скелету экстрагированных клеток, либо сливаются между собой и отрываются от клеток в виде детергент резистентных мембран (ДРМ). Выделение липидных рафтов методом гель-фильтрации основывается на том, что ДРМ обладают размером, намного превышающим размер мономерных солюби-лизированных белков. ДРМ не способны входить в поры хроматографиче-ской матрицы, поэтому они не задерживаются колонкой и выходят в свободном объеме. Напротив, солюбилизированные в мономерной форме белки проникают в поры матрицы и выходят с задержкой.

На первом этапе изучения липидных рафтов нами была воспроизведена описанная ранее методика выделения детергент резистентных мембран с помощью гель-фильтрации в ее стандартном исполнении [Cinek 1992, Radeva 2004]. Далее для упрощения процедуры детекции рафтовых и не-рафтовых маркеров, а также уменьшения времени детекции нами было предложено использовать иммунофлуоресцентное окрашивание мембранных маркеров еще до стадии лизиса. Окрашивание выполнялось путем обработки клеток флуоресцентно мечеными антителами. В связи с этим возникает вопрос о том, может ли комплексообразование между антителом и рецептором повлиять на солюбилизационные характеристики белков, и сохраняют ли белки после лигирования свою исходную принадлежность к рафтовым или нерафтовым компартментам.

Нами было проанализировано поведение рафтового маркера CD59 и 9-ти нерафтовых белков (CD1 la, CD71, CD23, CD20, CD45, CD54, HLA-DR,

CD95 и CD98). Наряду с антителами мы также использовали В-субъединицу холерного токсина (СТ), которая специфически связывается с ганглиозидом GM1, преимущественно локализованным в липидных рафтах. Следует заметить, что свободные флуоресцентномеченые антитела и холерный токсин ведут себя как обычные белки и сходят с колонки со значительной задержкой. Пик флуоресценции на профиле элюции для данных реагентов приходился на седьмую и восьмую фракции соответственно. После того флуоресцентно-меченный холерный токсин (CT-FITC) реагировал с мембранами, а клетки были лизированы, флуоресценция CT-FITC была зарегистрирована в третьей и четвертой фракциях элюата, которые соответствовали свободному объему колонки. Аналогичное поведение демонстрировало флуоресцентно-меченое антитело против GPI-заякоренного рафто-вого белка CD59. Напротив, при окрашивании антителом, реагирующим с нерафтовым белком - рецептором трансферрина (CD71), пик флуоресценции регистрировали в 5-6 фракциях, соответствующих полному объему колонки. Подобные картины были получены для других нерафтовых белков, таких как CD1 la, CD23, CD45, CD54, CD95, CD98 и HLA-DR. Полученные результаты показывают, что регистрация в элюате флуоресцентного сигнала свидетельствует не только о присутствии в той или иной фракции флуоресцирующего антитела, но, что более важно, о наличии антигена, с которым оно реагирует.

HCD71-A488 ■ CT-B+SA-Cy3

3 4 s 6 7 номера фракций

Рис. 5. Профиль элюции рафтового маркера GM1 и нерафтового белка CD71 при двухцветном окрашивании.

Клетки линии HUT-78 одновременно обрабатывали антителом CD71, меченным А1еха488, и биотинилированной В-субъединш^ей холерного токсина. Далее клетки окрашивали с помощью стрептавидина конъюгированного с красителем СуЗ, лизировали в Тритоне Х-100, и лизат подвергали гель-фильтрации на Сефарозе 4В Интенсивность зеленой (А1еха488) и красной (СуЗ) флуоресценции обозначена заштрихованными и черными столбцами соответственно.

Наиболее наглядно различие в поведении рафтовых и нерафтовых маркеров было продемонстрировано в двухцветном эксперименте (рис. 5).

При этом клетки одновременно метили по рафтовому маркеру сфинголипи-ду GM1 и рецептору трансферрина CD71. После окрашивания клетки лизи-ровали, а лизат подвергали хроматографированию. В процессе совместной элюции рафтовые и нерафтовые маркеры выходили двумя раздельными пиками, для регистрации которых использовали два канала флуоресценции. На рис. 5 видно, что максимум пика флуоресценции СуЗ приходился на 3-4 фракцию, а маркера CD71 - на 6-7 фракции, что соответствовало свободному и полному объему использованной колонки соответственно. Разница в интенсивностях пиков объясняется тем, что в процессе лизиса только некоторая часть рафтовых маркеров переходит в лизат, а значительная их доля остается прикрепленной к цитоскелету, который нерастворим в Тритоне X-100. Таким образом, рафтовые маркеры элю провались в свободном объеме колонки, там, где ожидается выход ДРМ, а нерафтовые белки задерживались колонкой как мономерные молекулы. Иммунофлуоресцентное окрашивание одних маркеров никак не влияло на поведение других маркеров, и они солюбилизировались независимо друг от друга. При одновременном лигировании рафтового маркера (GM1) и нерафтового (CD71), эти маркеры вели себя так же, как если бы они обрабатывались и солюбилизировались в раздельных экспериментах.

Белки, элюировавшиеся в свободном объеме, были дополнительно проанализированы с помощью масс-спектрометрии. В этой фракции были обнаружены типичные рафтовые маркеры [Foster 2003], такие как щелочная фосфатаза, клатрин, CD59 и GPI-заякоренный белок р137, белок, содержащий мотив, обогащенный лейцин PPR, полиаденилат-связывающий белок, сериновая гидроксиметилтрансфераза. Здесь также были зарегистрированы белки, имеющие рибосомальное и цитоскелетное происхождение. Рибосомы имеют размеры, сравнимые с ДРМ. При инкубации лизата клеток с РНКазой количество рибосомальных белков, идентифицированных в раф-товой фракции, значительно уменьшилось. Такое уменьшение, видимо, происходит вследствие распада рибосом на мономерные белки. Следует заметить, что ранее неоднократно отмечалась ассоциация липидных рафтов с цитоскелетом [Brdickova 2001], поэтому обнаружение актина, тубулина, миозина, плектина и спектрина вместе с ДРМ может также свидетельствовать об ассоциации этих цитоскелетных белков с липидными рафтами.

Известно, что многие рецепторы в результате их связывания вторичными антителами транслоцируются в липидные рафты и становятся резистентными к Тритону Х-100. Было обнаружено, что в результате последовательной обработки клеток первичными и вторичными антителами значительная часть молекул HLA-DR, CD95 и CD54 переходила из фракции, растворимой в Тритоне Х-100, в ДРМ фракцию. Менее выраженная транслокация наблюдалась для белка CD45. Отсутствие резистентности к Тритону X-100, индуцированной обработкой антителом, у молекул CD71 и CD98 находится в хорошем соответствии с фактом, что данные белки не способны к антитело зависимым транслокациям в липидные рафты [Filatov 2003]. Осо-

бый интерес представляют данные о Тритон Х-100 солюбилизируемости белка СБ20. Ранее было обнаружено, что данная молекула является рекордсменом по способности транслоцироваться в липидные рафты. Лигирование с помощью первичного антитела вполне достаточно для того, чтобы около половины молекул СБ20 переходила в состав липидных микродоменов. Вероятно, с этой удивительной способностью белка СЭ20 связан необычайно высокий потенциал анти-СЭ20 антител при их иммунотерапевтическом использовании. Активная транслокация в рафты белка СБ20 под действием анти-С020 антител обеспечивает эффективное связывание комплемента, последующий лизис и элиминацию опухолевых С020+ клеток при лечении В-клеточных лимфом [Cragg 2003]. Этими аномальными свойствами белка СЭ20 объясняется то, что данная молекула после иммунофлуоресцентного окрашивания в процессе гель-фильтрации наблюдалась во фракции ДРМ.

Таким образом, поведение всех изученных маркеров при гель-фильтрации с предварительным окрашиванием антигенов флуоресцентно-меченными антителами находится в хорошем соответствии с известными данными о конститутивной или антитело индуцированной Тритон Х-100 устойчивостью этих молекул, и предложенный метод дает адекватные результаты.

Разработанный нами метод обладает еще одним преимуществом. В альтернативном подходе, в котором идентификация белков осуществляется с помощью иммунопреципитации или иммуноблоттинга, предъявляются гораздо более жесткие требования к используемым антителам. Антитела, используемые в иммунопреципитации, должны обладать очень высокой аффинностью, а антитела, предназначенные для иммуноблота, должны сохранять способность узнавать антиген даже после его денатурации в процессе БОБ-фореза. Далеко не все антитела соответствуют этим жестким требованиям. Предложенный нами метод позволяет использовать для исследования гораздо более широкую панель антител, поскольку единственным требованием к антителам является их положительная реакция в тесте иммунофлуоресценции.

Таким образом, нами был предложен и апробирован новый подход к детекции мембранных белков, который позволяет значительно упростить процедуру выделения и идентификации рафтовых и нерафтовых молекул. Помимо простоты исполнения он обладает еще тем преимуществом, что с его помощью селективно детектируются только мембранные молекулы и не регистрируется внутриклеточный пул исследуемых антигенов.

Выводы

1. Предложена и разработана модификация метода флуоресцентной иммунопреципитации, позволяющая совместить её с последующим иммуноб-лотом. Продемонстрирована возможность регистрировать с одного геля результаты иммунопреципитации и иммуноблота, что позволяет комбиниро-

вать данные по качественной идентификации белков методом иммуноблота с количественными результатами флуоресцентной иммунопреципитации.

2. Флуоресцентный иммунопреципитационный анализ позволяет вести пробоподготовку общую Для нескольких методов и совместить в одном эксперименте иммунопреципитацию, иммуноаффинное выделение, имму-ноблот и масс-спектрометрию. Флуоресцентный иммунопреципитационный анализ можно рассматривать как общую платформу для нескольких проте-омных методов исследования.

3. Обнаружено, что рецептор CD4 на периферических лимфоцитах крови человека и клетках линии СЕМ, образует комплексы не со всеми молекулами CD45, а только с его низкомолекулярной изоформой CD45R0.

4. Определено, что трансферриновый рецептор CD71, ассоциированный с CD4, на клетках линии СЕМ находится в комплексе исключительно в ди-мерной форме скрепленной -S-S- связью.

5. Показано, что для взаимодействия молекул CD4 и CD45 необходимы некоторые дополнительные молекулы. При экспрессии в нелимфоидные клетки 293Т, которые лишены белков Lck и LPAP, молекулы CD4 и CD45 не могут напрямую взаимодействовать между собой и образовывать комплекс.

6. Обнаружено, что на клетках линии Nalmô белок CD 10 образует комплекс с молекулами CD9 и CD81. Масс-спектрометрически определен круг белков, ассоциированных с тетраспаниновыми комплексами, в составе которых идентифицировано более 25 различных мембранных белков.

7. Предложен и апробирован новый подход к детекции мембранных белков, который позволяет значительно упростить процедуру выделения и идентификации рафтовых и нерафтовых молекул. Помимо простоты исполнения он также обладает тем преимуществом, что с его помощью селективно детектируются только мембранные молекулы и не регистрируется внутриклеточный пул исследуемых антигенов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Крутикова М.П., Кротов Г.И., Филатов А.В. Изучение транслокаций в липидные микродомены поверхностных рецепторов лейкоцитов человека при их лигировании антителами. // Труды международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», 2005, С. 14-17.

2. A. Filatov, G. Krotov, M. Krutikova V. Zgoda Fluorescent immuno-precipitation assay (FIPA) — a proteomic analysis of cell surface proteins. // FEBS Journal, 2006, Vol. 273, P. 62-63.

3. Кротов Г.И., Крутикова М.П. Протеомика липидных микродоменов (рафтов). // Труды 10-ой школы-конференции «Биология-наука XXI века», 2006, С. 81.

4. Крутикова М.П., Кротов Г.И., Згода В.Г., Филатов A.B. Изучение липидных рафтов методом гельфильтрации с предварительным окрашиванием флуоресцентно-меченными антителами. // Биологические мембраны, 2007, Том 24, №4, С. 323-332.

5. Кротов Г.И., Крутикова М.П., Згода В.Г., Филатов А.В Профилирование белков рецепторного комплекса молекулы CD4. // Биохимия, 2007, Том 72, Выпуск 11, С. 1495-1505.

6. Кротов Г.И., Згода В.Г., Родионов C.B., Крутикова М.П., Филатов A.B. Протеомный подход к определению специфичности антител направленных к поверхностным антигенам лимфоцитов. // Иммунология, 2007, Том 28, №5, С. 263-268.

7. Кротов Г.И., Крутикова М.П., Филатов A.B. Протеомная характеристика мультимолекулярных комплексов молекулы CD4. // Российский аллергологический журнал.- 2007,- №3.- приложение 1- С. 25-26.

8. Филатов A.B., Кротов Г.И., Крутикова М.П., Згода В.Г. Протеомная характеристика межмолекулярных комплексов поверхностных рецепторов лимфоцитов человека. // Труды III Российского симпозиума «Белки и пептиды», 2007, С. 15.

9. Кротов Г.И., Крутикова М.П., Филатов A.B. Межмолекулярные комплексы рецептора CD4. // Физиология и патология иммунной системы, 2008, Том 11,№ 11, С. 3-10.

Подписано в печать27 .11. 08 Формат 60x84/16. Бумага офсетная.

_Тираж 100 экз. Заказ № яз7 _

Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское щ., 24

Актуальность темы диссертации

После завершения проекта по расшифровке генома человека внимание молекулярных биологов стало все более смещаться в сторону изучения функциональных характеристик белков. Для понимания молекулярного механизма функционирования конкретного белка необходимо знать не только его структуру, но и возможные белок-белковые взаимодействия в которые вступает данный протеин. В современных исследованиях при изучении нового белка вслед за первым вопросом о его структуре, как правило, следует второй вопрос о том, с чем данный белок связывается. Белковые комплексы играют важную роль в транскрипции, делении клеток, онкогенной трансформации и многих других жизненно необходимых клеточных процессах.

Важное значение белковые комплексы имеют и для иммунологии. Многие иммунные процессы регулируются или осуществляются с участием белковых комплексов. Большинство мембранных рецепторов по своему строению являются мультипротеиновыми комплексами, состоящими из нескольких белков. Другие иммунологически значимые молекулы, такие как цитоплазматические сигнальные белки, а также ядерные факторы транскрипции при выполнении своих функций образуют временные белковые комплексы со своими партнерами.

По различным оценкам от 15 до 20 % генов кодируют белки, локализованные на мембране. Если учесть, что многие мембранные белки являются рецепторами, то изучение комплексов мембранных белков приобретает особую значимость. К настоящему времени накоплен значительный материал по изучению комплексов цитозольных белков, в то же время комплексы мембранных белков исследованы значительно в меньшей степени. Это связано с методическими трудностями в выделении мембранных белков. Работа с очищенными мембранными белками затрудняется вследствие их высокой гидрофобности, а также необходимости дополнительного связывания с липидами. Для более глубокого изучения мембранных комплексов имеется настоятельная потребность в совершенствовании существующих методов исследования.

В силу сложившихся методических приемов основная часть современных работ, касающихся межмолекулярных комплексов, ограничивается изучением парных ассоциаций между отдельными молекулами, входящими в состав комплекса. Общая картина строения всего комплекса в целом, как правило, строится из разрозненных данных по отдельным парным ассоциациям. В последнее время благодаря развитию протеомного подхода стало возможным изучение не только парных ассоциаций, но и всего комплекса в целом.

Можно надеяться, что идентификация и характеристика мембранных белковых комплексов лимфоцитов человека позволит лучше понять молекулярные основы иммунных процессов, а также даст дополнительную информацию, которая необходима для направленной разработки новых фармакологических препаратов, влияющих на иммунный ответ. Таким образом, поиск и разработка новых подходов для идентификации и характеристики белковых комплексов, а также систематическое изучение межмолекулярных комплексов мембранных рецепторов лимфоцитов человека является актуальной задачей.

Цель работы

Целью данной работы являлось изучение структуры и состава межмолекулярных комплексов мембранных рецепторов лимфоцитов человека на трех уровнях: сравнительно простые комплексы образованные молекулой СБ4, более сложно устроенные комплексы тетраспаниновых микродоменов, и, наконец, большие липидно-белковые комплексы, занимающие обширные мембранные области и которые называются липидными рафтами.

Задачи исследования

1. Развитие методической базы протеомного исследования комплексов мембранных белков. Изучение совместимости флуоресцентного иммунопреципитационного анализа с последующим иммуноблотом.

2. Определение изоформ белка СБ45 образующих межмолекулярный комплекс с молекулой СБ4.

3. Протеомная характеристика белков, ассоциированных с тетраспанинами СБ9 и СБ81.

4. Разработать новый метод детекции рафтовых антигенов и изучить с его помощью траслокации в липидные рафты некоторых мембранных белков.

Научная новизна

В настоящей работе впервые продемонстрирована возможность совмещения флуоресцентной иммунопреципитации с последующим иммуноблотом, таким образом результаты иммунопреципитации и иммуноблота считываются с одного и того же геля. Таким образом, разработанная методика позволяет комбинировать между собой качественные данные, полученные с помощью иммуноблота, с количественными данными, получаемыми методом флуоресцентной иммунопреципитации.

Впервые показано, что на периферических лимфоцитах крови человека молекула СБ4 образует межмолекулярный белковый комплекс преимущественно с низмолекулярной изоформой белка СБ45, а именно с СБ45Я0.

Впервые в качестве компонента белкового комплекса тетраспанинов СБ9 и СБ81 идентифицирована металлопротеаза СБ 10.

Теоретическая и практическая значимость работы

Настоящая работа выполнена в рамках фундаментальных исследований. Научная значимость настоящего исследования заключается в расширении представлений о 9 строении комплексов мембранных рецепторов лимфоцитов человека. Полученные данные позволяют глубже понять механизмы взаимодействия мембранных белков, и могут быть использованы при направленной разработке новых иммунотерапевтических препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Метод флуоресцентной иммунопреципитации совместим с последующим анализом с помощью иммуноблота.

2. Флуоресцентный иммунопреципитационный анализ позволяет вести пробоподготовку общую для нескольких методов и совместить в одном эксперименте иммунопреципитацию, иммуноаффинное выделение, иммуноблот и масс-спектрометрию.

3. Молекула CD4 образует межмолекулярный комплекс только с низкомолекулярной изоформой белка CD45, а именно CD45R0.

4. Белки CD4 и CD45 не могут напрямую взаимодействовать между собой, и для образования между ними белкового комплекса необходимы вспомогательные молекулы.

5. Цинкзависимая протеаза CD10 образуют межмолекулярный комплекс с тетраспанинами CD9 и CD81.

Публикации

Результаты исследований были представлены на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, июнь 2005), на 31-ом конгрессе «FEBS» (Стамбул, Турция, июнь 2006), на VIII конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, июнь 2007), на III российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, сентябрь 2007). Материалы диссертации изложены в 10 публикациях.

Выводы.

1. Предложена и разработана модификация метода флуоресцентной иммунопреципитации, позволяющая совместить её с последующим иммуноблотом. Продемонстрирована возможность регистрировать с одного геля результаты иммунопреципитации и иммуноблота, что позволяет комбинировать данные по качественной идентификации белков методом иммуноблота с количественными результатами флуоресцентной иммунопреципитации.

2. Флуоресцентный иммунопреципитационный анализ позволяет вести пробоподготовку общую для нескольких методов и совместить в одном эксперименте иммунопреципитации), иммуноаффинное выделение, иммуноблот и масс-спектрометрию. Флуоресцентный иммунопреципитационный анализ можно рассматривать как общую платформу для нескольких протеомных методов исследования.

3. Обнаружено, что рецептор СВ4 на периферических лимфоцитах крови человека и клетках линии СЕМ, образует комплексы не со всеми молекулами С045, а только с его низкомолекулярной изоформой СБ45110.

4. Определено, что трансферриновый рецептор С071, ассоциированный с С04, на клетках линии СЕМ находится в комплексе исключительно в димерной форме скрепленной —Б-Б— связью.

5. Показано, что для взаимодействия молекул СВ4 и СБ45 необходимы некоторые дополнительные молекулы. При экспрессии в нелимфоидные клетки 293Т, которые лишены белков Ьск и ЬРАР, молекулы СБ4 и СБ45 не могут напрямую взаимодействовать между собой и образовывать комплекс.

6. Обнаружено, что на клетках линии Иакпб белок СБ 10 образует комплекс с молекулами СБ9 и СБ81. Масс-спектрометрически определен крут белков, ассоциированных с тетраспаниновыми комплексами, в составе которых идентифицировано более 25 различных мембранных белков.

7. Предложен и апробирован новый подход к детекции мембранных белков, который позволяет значительно упростить процедуру выделения и идентификации рафтовых и нерафтовых молекул. Помимо простоты исполнения он также обладает тем преимуществом, что с его помощью селективно детектируются только мембранные молекулы и не регистрируется внутриклеточный пул исследуемых антигенов.