Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Идентификация молекулярных маркеров прогрессии гепатокарцином

На правах рукописи

003167646

ФЛЕЙШМАН ДАРЬЯ ИГОРЕВНА

ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ ПРОГРЕССИИ ГЕПАТОКАРЦИНОМ

14.00.14 -онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2008

003167646

Работа выполнена в ГУ Российский Онкологический научный центр им Н Н Блохина Российской академии медицинских наук

Научный руководитель

Доктор биологических наук Н Л Лазаревич Официальные оппоненты

Доктор биологических наук, профессор Б П Копнин Доктор биологических наук, профессор В Я Бродский

Ведущая организация:

Институт биологии гена РАН, г. Москва

Защита состоится« 10 » <Я о2008 г в А/ часов на заседании диссертационного ученого совета К 001 17 01 ГУ РОНЦ им Н Н Блохина РАМН по адресу 115478, Москва, Каширское шоссе, 24

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ РОНЦ им НН Блохина РАМН

Автореферат разослан « » ' У"'"_2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Ю.А. Барсуков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Опухолевую прогрессию можно охарактеризовать как процесс последовательных генетических мутаций, в результате которых в популяции трансформированных клеток происходит отбор в пользу все более злокачественных клонов Последовательность и специфичность генетических изменений варьирует от опухоли к опухоли, тем не менее, можно с уверенностью говорить о существовании общей направленности этих изменений опухолевая прогрессия сопровождается снижением уровня дифференцировки, увеличением скорости пролиферации клеток, изменением характера взаимодействии между клетками и приобретением способности к метастазированию Таким образом, направление опухолевой прогрессии складывается из ряда отдетьных процессов, каждый из которых возникает в результате генетических изменении, претерпеваемых клетками опухоли, и способствует дальнейшей малигнизации Общая направленность и единовременность развития позволяет предположить существование взаимосвязи и взаиморегуляции между этими процессами Однако последовательность и иерархия изменений, ведущих к опухолевой прогрессии, до сих пор остаются малоизученными Определение этапов развития опухоли и их генетическая характеристика являются приоритетным направлением онкотогии, а выявление событий, маркирующих опухолевую прогрессию, представляет не только огромный научный интерес, но и позволяет применять новые инструменты для диагностики и терапии опухолей

Настоящая работ посвящена поиску новых молекулярных маркеров прогрессии гепатоцеллолярных карцином Гепатокарциномы (ГК) - опухоли, возникающие из зрелых клеток печени - гепатоцитов, являются наиболее распространенной формой опухолей печени Прогрессия ГК ассоциирована с изменением набора экспрессирусмых генов, кодирующих опухолевые супрессоры, факторы роста, компоненты межклеточных и адгезионных контактов, а также ткане-специфические транскрипционные факторы и, соответственно, их мишени К настоящему времени идентифицирован ряд генов, функция которых нарушена в большинстве ГК, однако ключевые механизмы, определяющие развитие злокачественного фенотипа ГК, остаются неясными Исследования последних лет показали, что в ряде случаев дедифференцировка ГК сопровождается подавлением экспрессии гепатоцитарных ядерных факторов (hcpatocyte nuclear factors, HNF, ГЯФ) - основных печень-специфичсских регуляторов транскрипции [Wang et al, 1998, Flodby et al, 1995, Xu et al, 2001, Lazarevich et al, 2004] Более того, было продемонстрировано, что восстановление функции одного из таких факторов, HNF4al, в культурах клеток ГК приводит к частичной реверсии злокачественного фенотипа [Lazarevich et al, 2004], в клетках дедифференцированной гепаточы крысы Н5 под воздействием экзогенною HNF4ctl

происходило частичное восстановление эпителиальной морфологии и реэкспрессия белка адгезионных контактов Е-кадхерина [Spath и Weiss, 1998]

ГЯФ (семейства HNF1, С/ЕВР, HNF3, HNF4 и HNF6) являются мощными транскрипционными регуляторами, активность которых необходима для развития и поддержания дифференцированного фенотипа гепатоцитов Факторы, входящие в эти семейства, образуют сложную регуляторную сеть, изменения в работе которой приводит к нарушениям экспрессии огромного спектра генов-мишеней Однако последовательность нарушения экспрессии ГЯФ, а также значимость каждого из этих нарушений для развития ГК практически не изучены Нам представлялось чрезвычайно важным выявить молекулярные изменения, наиболее четко отражающие развитие злокачественного фенотипа ГК, а также определить общие генетические изменения, ведущие к прогрессии этого вида опухолей печени

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является выявление и функциональная характеристика молекулярных маркеров прогрессии гепатокарцином мыши и человека

Для выполнения поставленной цели были выдвинуты следующие задачи

1 Создание и гистологическая характеристика коллекции мышиных гепатокарцином независимого происхождения с различным уровнем дифференцировки, а также коллекции гепагокарцином человека

2 Анализ экспрессии гепато-специфических генов, а также генов, экспрессия которых значительно изменилась при одноступенчатой прогрессии, в панели химически индуцированных гепатокарцином мыши с различной скоростью роста и уровнем дифференцировки

3 Изучение закономерностей экспрессии гепато-специфических генов, а также потенциальных маркеров гепатоканцерогенеза, в опухолях печени человека, полученных при резекции гепатокарцином у пациентов РОНЦ РАМН

4 Поиск возможных механизмов возникновения событий, маркирующих опухолевую прогрессию (исследование механизма инактивации гена HNF4al)

Научная новизна и практическая значимость исследования

На протяжении длительного времени изучение генетических изменений, лежащих в основе гепатоканцеро) енеза, ограничивались исследованиями нетканеспецифических факторов, нарушение в активности которых является общим явлением для опухолей разного

типа Работы, посвященные роли ткане-специфических регуляторов транскрипции в прогрессии отдельных типов эпителиальных опухолей, и, в частности, гепатокарцином, чаще всего затрагивали лишь один или несколько из упомянутых транскрипционных факторов, причем о нарушении работы последних судили по результатам анализа модельных систем in vitro

В представленной работе были проанализированы спектры экспрессии большинства печень-специфических транскрипционных факторов на панели из ГК мыши независимого происхождения, различающихся по уровню дифференцировки и скорости роста, что позволило определить спектр генов, уровни экспрессии которых наиболее четко связаны с этими признаками Кроме того, следует отметить, что в большинстве работ, посвященных изучению роли ГЯФ в гепатоканцерогенезе, изучаются общие свойства семейств, в то время как в представленном исследовании мы постарались отдельно рассмотреть роль каждого из представителей и его изоформ Это позволило впервые описать гиперэкспрессию эмбриональной формы HNF4a7 в образцах дифференцированных гепатокарцином мыши и человека

На модели ГК мыши независимого происхождения и разного уровня дифференцировки нам удалось показать четкую зависимость между степенью дедифференцировки ГК и профилем экспрессируемых в них ткане-специфических регуляторов транскрипции HNF4a, HNFla, HNFip, HNF3y, C/EBPa и FTF

В работе впервые проведен анализ полного спектра экспрессии ГЯФ в образцах опухолей печени человека Впервые охарактеризованы закономерности экспрессии ряда генов (остеопонтина, кавеолина, аспарагинсинтазы ASNS, секреторного лейкоцитарного ингибитора протеаз SLPI, киназы Ufo/Axl), транскрипция которых повышается в ходе гепатоканцерогенеза, в гепатокарциномах и холангиокарциномах человека

Кроме того, мы впервые показали, что гепатоциты неопухолевой ткани печени пациентов с гепатокарциномами экспрессируют ряд генов, нехарактерных для взрослой печени (например гены HNF4a7, HNFip, snail и виментин) Эти данные позволяют предположить о влиянии опухоли на генетическую программу клеток окружающей ткани Не исключено, что под этим воздейсгвием опухоли нормальные клетки вырабатывают факторы, способствующие изменению внеклеточного матрикса, что в свою очередь ускоряет инвазию опухоли

Мы установили, что репрессия гена HNF4al в дедифференцированных ГК происходит на транскрипционном уровне Исследования регуляторного района гена HNF4al показали, что участок -14 т п н /-363 п н ответственен за связывание репрессора, подавляющего транскрипцию гена Кроме того, впервые показано, что ни один из других

ГЯФ - Н]\Т1а и (5, Н№6, САТА6, НКТЗа, р и у, С/ЕВРа и Н№4а7 - сайты связывания которых находятся в исследованном регуляторном участке, не способен активировать экспрессию гена, контролируемого промотором НОТ4а1

Изучение взаимосвязи паттерна экспрессируемых генов с прогрессиояным статусом опухоли представляет интерес для фундаментальной науки Выявление маркеров прогрессии ГК является важным этапом в исследованиях механизмов опухолевой прогрессии и представляет новые инструменты для диагностики и мишени для терапии ГК

Апробация работы

Диссертация апробирована 26 сентября 2007 г на совместной научной конференции лабораторий механизмов прогрессии эпителиальных опухолей, иммунохимии опухолей, цитогенетики, регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ канцерогенеза РОНЦ им Н Н Блохина РАМН Материалы работы докладывались на международной конференции «Молекулярные механизмы сигнальной трансдукции и рака» Европейской Федерации Биохимических обществ (РЕВЭ) (Спецес, 2007), на девятой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология- наука XXI века» (Пущино, 2005), на 13 съезде Европейской Конференции по раковым исследованиям (ЕССО) (Париж, 2005) и на Конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения-2006» (Санкт-Петербург, 2006)

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 3 статьи в международных и отечественных журналах, и 11 тезисов международных конференций

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 151 странице машинописного текста (12 шрифт, полу горный интервал), содержит 12 рисунков, б таблиц Состоит из глав «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования и их обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы» Список литературы содержит 151 источник, в том числе 5 в отечественных рецензируемых изданиях

Введение

Гелатоканцерогенез - это многостадийный процесс, ассоциированный с изменениями спектра генов, экспрессируемых опухолевыми клетками, по сравнению с нормальными

гепатоцитами Очевидно, что для опухолевой прогрессии наиболее значимыми являются нарушения в экспрессии транскрипционных факторов, подавление или индукция которых приводит к изменениям целого ряда генов-мишеней Фенотип взрослых гепатоцитов формируется при координированном действии белков ГЯФ - эта группа включает 5 семейств транскрипционных факторов Н№1, С/ЕВР, НОТЗ, Н№4 и Н№6, представители которых участвуют в закладке, дифференцировке и дальнейшем поддержании дифференцированного фенотипа печени Ранее было опубликовано несколько работ, описывающих нарушение экспрессии отдельных ГЯФ в клетках дедифференцированных гепатокарцином, однако механизм нарушения их экспрессии, а также последовательность событий при прогрессии ГК оставались малоизученными

Ранее в нашей лаборатории была разработана экспериментальная модель одноступенчатой прогрессии, в которой из медленнорастущей высокодифференцированной гепатокарциномы (мГК) мыши одномоментно выщепился злокачественный быстрорастущий низкодифференцированный вариант (6ГК) Было показано, что дедифференцировка мГК сопровождалась подавлением активности большинства ГЯФ, а также снижением уровня экспрессии генов, определяющих поддержание эпителиальной морфологии гепатоцитов Восстановление экспрессии фактора Н№4а в культуре клеток 6ГК привело к частичной реверсии злокачественного фенотипа Было выдвинуто предположение, что скоординированная работа ГЯФ играет ключевую роль в поддержании дифференцировки гепатоцитов, причем НОТ4а является центральным регулятором этого процесса Однако механизм подавления НКТ4а в 6ГК оставался неясным

Для дальнейшего поиска 1енов, вовлеченных в прогрессию ГК на этой модели, спектры экспрессии генов в мГК и 6ГК были исследованы с помощью гибридизации с кДНК микрочипами Было выявлено более 20 потенциальных опухолевых маркеров, экспрессия которых была более чем в 5 раз повышена обеих опухолях по сравнению с нормальной печенью, и около 30 генов со значительным уровнем гиперэкспрессии в 6ГК по сравнению с мГК - потенциальных маркеров опухолевой прогрессии

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Сравнительная характеристика 11 ГК мыши независимого происхождения и разного уровня дифференцировки

Для создания адекватной системы для проверки закономерностей экспрессии генов, полученных на модели одноступенчатой прогрессии, нами была проведена сравнительная гистохимическая характеристика ГК мыши независимого происхождения с разной скоростью роста и уровнем дифференцировки Опухоли были отобраны из полученной ранее

в НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН коллекции перевиваемых мышиных ГК Первичные опухоли были индуцированы у гибридов F1 линий С57В1 и DBA (BDF) диэтилнигрозамином с последующей промоцией фенобарбиталом, полученные опухоли перевивали подкожно Для исследования было выбрано 11 опухолей, каждая из которых была охарактеризована гистологически Для всех 11 ГК методом ОТ-ПЦР нами были проанализированы спектры экспрессии 46 генов, изменения уровней транскрипции которых наблюдались при исследовании модели одноступенчатой прогрессии

1 1 Гистологический анализ

На первом этапе работы был проведен гистологический анализ образцов Были получены гистологические препараты каждой опухоли Описание гистологических препаратов проводили в сотрудничестве с В С Турусовым и О В Морозовой (Лаборатория канцерогенных веществ НИИ канцерогенеза РОНЦ РАМН) Степень дифференцировки опухоли определялась следующими факторами сохранилась ли в опухоли хотя бы частично балочная структура печени, каков пролиферативный статус опухоли (оценивали общее количество митозов, а также наличие аномальных митозов), врастают ли в опухоль тяжи соединительной ткани, сохраняют ли опухолевые клетки эпителиальный фенотип, одинаковы ли клетки между собой по размеру и плоидности, или же наблюдается выраженный клеточный полиморфизм, также оценивались и внутриклеточные параметры размеры ядер, их количества, а также консистенция ядер и цитоплазмы

По результатам гистологического анализа для дальнейших исследований нами было выбрано 11 ГК, из них 5 опухолей были охарактеризованы как высокодифференцированные и 6 образцов получили статус низкодифференцированных ГК

Примечательно, что опухоли обладали разной скоростью роста (скорость роста опухоли определяли по требуемой частоте перевивки от одной особи к другой) Оказалось, что ГК, гистологически описанные как высокодифференцированные, росли гораздо медленнее, чем низкодифференцированные опухоли средняя скорость роста дифференцированной опухоли составляла 3-7 месяцев, а скорость роста низкодифференцированных ГК варьировала от двух недель до двух месяцев Типичная морфология высоко- и нюко-дифференцированной опухоли представлена та рисунке 1

1 2 Анализ экспрессии генов в ГК мыши

Следующим этапом работы стало проведение анализа спектра генов, экспрессируемых в панели мышиных ГК Для этого из образцов опухолей была выделена суммарная РНК, панель соответствующих РНК была подвергнута обратной транскрипции (ОТ-реакция) с

г

последующей полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Для постановки ПЦР использовали специфические праймеры к ^ЦНК исследуемых генов. Полученные данные подтверждали повторными ПЦР с независимо ревергированных кДНК.

Рисунок 1. Гистологии гепатокарцнном мыши.

Левая колонка: высокодифференцированная опухоль (образец № 2); Правая колонка: низкодифференцированная ПК (образец № 7). Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 1*400 (А. В) и 1*1000 (Б, Г). Высокодифференцированная опухоль сохраняет характерную для печени балочную структуру, клетки одинаковы по размеру. Клетки низ недифференцированной опухоли различаются по размеру и плоидности, часто встречаются м игозы, заметны врастания тяжей соединительной ткани

В качестве контроля нормального уровня экспрессии генов в панели использовали РНК из нормальной печени взрослой мыши линии ВОР. В реакцию обратной транскрипции брали равное количество РНК из каждого образна, однако для полного подтверждения точности выравнивания проводили ПЦР с праймерами к гену гипоксангин фосфорибозилтрансферазы (НРКТ), который равномерно экспрессируется во всех клетках. Результаты ОТ-ПЦР исследований представлены на Рисунках 24. На электрофорез продукты ПЦР наносили в следующем порядке: образец №1 - нормальная печень взрослой

мыши, образцы № 2-6 - высокодифференцированные ГК (где №2 соответствует мГК), образцы № 7-12 - низкодифференцированные ГК (где №7 соответствует 6ГК)

В первую очередь нами быт проведен анализ спектров экспрессии печень-специфических генов альбумина, онко-эмбрионального маркера альфа-фетопротеипа (АФП) и различных ГЯФ (Рис 1) По итогам проведенного исследования часть последовательностей были описапы нами как гены, экспрессия которых полностью коррелирует с уровнем дифференцировки опухоли Остальные гены были активны как в высоко-, так и в низкодифференцированных ГК мышей

Тот факт, что экспрессия альбумина - основного маркера зрелых гепатоцитов -наблюдалась лишь в нормальной печени и в тех пяти опухолях, которые при гистологическом анализе были признаны высокодифференцированными, подтверждает четкое соответствие между гистологическим и молекулярными методами оценки уровня дифференцировки образцов

Один из компонентов центральных регуляторной сети ГЯФ - транскрипционный фактор HNF4a предположительно связывается с респонсивными элементами более, чем 12% генов fOdom et al, 2004], экспрессирующихся в гепатоцитах человека, продукты этих генов вовлечены в самые разнообразные процессы клеточного метаболизма, дифференцировки и роста гепатоцитов [Duncan et al, 1997, Hatzis и Taliamdis, 2001, Lucas et al, 2005] Группой авторов [Spath и Weiss, 1997] было выдвинуто предположение, что HNF4a является морфогеном и способен индуцировать мезенхимально-эпителиальный переход Ранее на модели одноступенчатой прогрессии гепатокарциномы нами было показано, что вынужденная экспрессия HNF4a приводит к частичной реверсии злокачественного фенотипа [Lazarevich et al, 2004] В настоящей работе мы показали, что HNF4a экспрессирован во всех высокодифференцированных опухолях на том же уровне, что и в нормальной печени мыши (Рис 2) При этом экспрессии HNF4a в дедифференцированных образцах не было обнаружено Это подтверждает ранее выдвинутое предположение [Lazarevich et al, 2004] о взаимосвязи активности гена HNF4a и уровня дифференцировки клеток, и важной роли репрессии этого факюра при прогрессии ГК

дифф. ГК недифф. ГК

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

% дифф. ГК недифф. ГК

с I 11 l

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

HNF6

С/ЕВРР

Рисунок 2. Экспрессия печеиь-спепифических генов в ГК мышей. Фотография электрофореза продуктов ОТ-ПЦР со специфическими праймерами к указанным генам. Продукты ОТ-ПЦР мРНК нормальной печени взрослой мыши (дорожка 1), дифференцированных ГК мыши (дорожки 2-6), низкоди|)ференцированных ПС мыши (7-12). ОТ-ПЦР с праймерами к гену HPRT служит контролем равенства количеств мРНК, взятых в реакции.

Существует 9 вариантов альтернативного сплайсинга гена НЫР4а. Все они обладают различными свойствами и функциями. Такое разнообразие обусловлено существованием двух независимых промоторов, контролирующих транскрипцию гена. Показано, что для взрослых гепатоцигов характерна экспрессия юоформ а1-а6 с промотора Р1 (далее «Н№4а1»), в то время как в эмбриональной печени транскрипция осуществляется преимущественно с Р2 (изоформы а7-сс9, далее - «РПМР4а7»), Примечательно, что, в отличие от нормальной печени мыши, в которой выявляется только а1 варианты сплайсинга, в опухолях вклад в суммарное количество РГМР4а вносят как а1, так и а7 формы сплайсинга, что указывает на активацию альтернативного промотора гена РПМР4(х на ранних стадиях прогрессии опухоли.

В группу печень-специфических генов, экспрессия которых четко коррелировала с уровнем НЫЕ4а и выявлялась только в дифференцированных медленнорастущих ГК, попали гены ЮШа, НОТф. ИЧРЗу, С/ЕВ Ра и РТР (Рис. 2). Это согласуется с полученными ранее данными об индукции в клетках культуры 6ГК генов НИРЗу, НЫР1а и РТР при экзогенной экспрессии НЫР4а1 [1_ага1еую11 е1 а!, 2004].

Транскрипты генов HNF6, HNF3a, HNF3p и С/ЕВРр обнаруживались как в высоко-, так и в низкодифференцированных образцах По всей вероятности, факторы HNF3P и HNF3a, являясь одними из самых ранних эффекторов эмбриогенеза печени, во взрослом организме не оказывают определяющего влияния на дифференцировку Таким образом, несмотря на сохранение экспрессии HNF3¡3 и HNF3a, ряд опухолей претерпевает дедифференцировку, и лишь гепатокарциномы, экспрессирующие HNF4a, сохраняют основные свойства клеток, из которых они произошли

Важным этапом прогрессии эпителиальных опухолей является эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) - процесс, выражающийся в утрате клетками эпителиальной морфологии, общей дедифференцировке и приобретении клеточной подвижности Нам представилось целесообразным выяснить, экспрессия каких из генов, ассоциированных с ЭМП, нарушается при прогрессии ГК мыши (Рис ЗА) Мы наблюдали тенденцию сохранения высокодифференцированными опухолями эпителиальных маркеров и приобретения низкодифференцированными опухолями свойств мезенхимы активации генов виментина, Snail, при одновременном падении уровня транскрипции эпителиальных маркеров Е-кадхерина и коннексина 32 (Сх 32) Тем не менее, ни для одного из исследован ных генов этой группы не было выявлено полной корреляции экспрессии с уровнем дифференцировки опухолей (Рис ЗА) По всей видимости, изменение активности рассмотренных генов не является абсолютно необходимым условием для прогрессии ГК, а индукция ЭМП может осуществляться разными путями

В исследованных нами ГК повышается экспрессия генов, продукты которых способны оказывать антиапоптотическое действие bcl2, bcl-xl, при этом четкой корреляции между степенью злокачественности опухоли и паттерном экспрессии этих генов выявлено не было (Рис ЗБ) Экспрессия гена рецептора смерти Fas, определяющего чувствительность клеток к проапоптотическим стимулам, регистрируется лишь в части исследованных опухолей (4 высоко- и 1 дедифференцированной ГК), а также в печени нормальной мыши, что указывает на возможность апоптотического контроля в этих образцах Вполне вероятно, что ГК, в которых произошло подавление транскрипции рецептора смерти, приобрели резистентность к внешним проапоптотическим сигналам Вероятно, что процессы дедифференцировки и подавления апоптотических программ протекают параллельно и не имеют общего индуктора Тот факт, что в дифференцированных ГК все еще регистрируется экспрессия гена рецептора смерти Fas, позволяет предположить, что подавление возможности экзогенной индукции апоптоза является важным шагом опухолевой прогрессии

л

HPRT

Е-кадхерин Snail Сх32

Виментин иЗ-нитегрин Фиброме ктин р-катенин

Рисунок 3. Экспрессия генов, ассоциированных с ЭМП (А) и апоптозом (Б), в ГК мышей. Фотография электрофореза продуктов ОТ-ПЦР со специфическими праймерами к указанным генам. Продукты ОТ-ПЦР мРНК нормальной печени взрослой мыши (дорожка 1), дифференцированных ГК мыши (дорожки 2-6), низкодифференцированных ГК мыши (7-12). ОТ-ПЦР с праймерами к гену HPRT служит контролем равенства количеств мРНК, взятых в реакции.

Целью нашего исследования был поиск и характеристика новых потенциальных маркеров профессии гепатокарцином. По результатам, полученным Н. Лазаревич при анализе профилей транскрипции при 6ГК и мГК методом гибридизации с микрочипами, в группу интереса попали несколько генов, уровень экспрессии которых значительно изменялся в опухолях по сравнению с нормальной печенью (аспарагинсинтаза ASNS, секреторный лейкоцитарный ингибитор протеаз SLPI, циклин G. остеопонтин), а также некоторые гены, гиперэкспрессированные в 6ГК по сравнению с мГК (цитохезин, кавеолин. 5TG3' взаимодействующий фактор TGIF, TGFp-стимулируемый клон 22 TSC-22, киназа Ufo/Axl, TGFP -индуцируемый белок 68 kDa Tbi-68). Мы выбрали для дальнейшего анализа только те гены, которые потенциально могли оказаться маркерами или эффекторами гепатоканцерогенеза. Таким образом, в группу интереса попали гены транскрипционных факторов, последовательности, кодирующие поверхностные маркеры, а также гены, продукты которых секретируются опухолевыми клетками. По результатам проведенного анализа мы охарактеризовали гены остеопонтина, кавеолина и цитохезина как наиболее

% дифф. ГК недифф. ГК

0 ____,

с 1 1 i 1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

г дифф. ГК недифф. ГК

перспективные маркеры гепатоканцерогенеза, а гены 1Яо/Ах1, ASNS - как предположительные маркеры опухолевой прогрессии (Рис. 4). Примечательно, что большинство генов этой группы являются ТСРр-реслонсивными. Белки семейства ТСРр (трансформирующий фактор роста Р) являются регуляторами роста, развития и дифференцировки. Они играют двоякую роль в развитии и канцерогенезе печени [МПш1а е/ а/., 2003; УаЫеэ е1 а!, 2002]: показано, что они ингибируют пролиферацию эпителиальных клеток нормальной печени, однако способствуют ускорению роста трансформированных гепатоцитов. Клетки, способные выжить при воздействии ТвРр, сначала претерпевают ЭМП, а затем приобретают способность аутокринно стимулировать пролиферацию посредством секреции ТСРр1. В настоящее время у млекопитающих идентифицировано три представителя семейства ТСРр: 2, 2 и 3, в различных типах клеток печени экспрессируются только ТСРР1 и 2.

HPRT Кавеолин Ufo/Axl Цитохезин SLPI

ASNS

р21 Рисунок 4.

гепатоканцерогенезом Фотография электрофореза продуктов ОТ-ПЦР со специфическими праймерами к указанным генам. Продукты ОТ-ПЦР мРНК нормальной печени взрослой мыши (дорожка 1), дифференцированных ГК мыши (дорожки 2-6), низкодифференцированных ГК мыши (7-12). ОТ-ПЦР с праймерами к гену HPRT служот контролем равенства количеств мРНК, взятых в реакции.

Анализ уровней экспресс™ этих генов показал, что в опухолевых образцах наблюдается гиперэкспрессия факторов TGFpi и TGFp2, а также их генов-мишеней (TSC-22, Tbi-68, TGIF, остеопонтина, циклина G) причем в низкодифференцированных опухолях регистрируется преимущественно транскрипция фактора TGFfS2, в то время как TGFpl экспрессирован практически во всех ГК (Рис. 4).

т дифф. ГК недифф. ГК

X дифф. ГК недифф. ГК

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Остепонтин

Экспрессия генов, нарушение активности которых ассоциировано с

Ранее в нашей лаборатории было показано, что клетки 6ГК в культуре активно секрешруют ТОР[)2, добавление которого в культуральную среду способствует защите различных типов клеток от апоптоза, вызываемого повреждением ДНК В то же время, ТСрр1 не оказывает такого воздействия [Овчинников, 2004] Вместе эти данные свидетельствуют в пользу предположения о том, что именно ТСРр2, а не ТОРр 1, играет важную роль в профессии гепатокарцнном

Итак, на коллекции химически индуцированных гепатокарцнном мыши независимого происхождеш1я с различным уровнем дифференцнровки и степенью опухолевой прогрессии нам удалось подтвердить основные закономерности ткане-специфической регуляции генов, выявленные ранее на экспериментальной модели одноступенчатой прогрессии гепатокарцнном, и определить наиболее значимые из них Полученные данные указывают на существование зависимости между дифференцировочным статусом опухоли, ее эпителиальными характеристиками, скоростью роста и паттерном экспрессии ткане-специфических регуляторов транскрипции В совокупности с полученными ранее результатами эти данные указывают на важную роль ядерного рецептора НЫР4се в поддержании дифференцировочного статуса опухолей печени Кроме того, полученные данные позволяют охарактеризовать некоторые события как потенциальные маркеры опухолевой прогрессии (появление и последующее исчезновение экспрессии Н№4а7 и Н№1 р, индукция ТСРР-респонсивных генов, экспрессия генов иГо/Ах1 и ЛЗЫБ)

1.3. Анализ экспрессии генов в опухолях печенн человека

Исследование химически индуцированных ГК мышей, несомненно, представляет научный интерес, однако оставалось неясным, насколько справедливы закономерности, полученные на экспериментальных моделях, в которых опухоли развиваются не в естественном микроокружении печени, а растут подкожно, а также, распространяются ли полученные результаты на ГК человека Для решения этой задачи мы провели анализ экспрессии тех генов, экспрессия которых менялась в ГК мышей по сравнению с нормальной печенью, в панели из различных опухолей печени человека Для этого в сотрудничестве с отделением опухолей печени и поджелудочной железы НИИ Клинической онкологии РОНЦ РАМН (руководитель - проф Ю И Патютко) была собрана панель из 21 ГК (4 из них были ассоциированы с инфекцией вирусами гепатита В, «НВУ+»), 1 гепатобластомы, и 3 холангиокарцином (ХЦР) (2 из них были ассоциированы с инфекцией вирусом гепатита В), полученных в результате резекции опухолей у пациентов РОНЦ РАМН В качестве контроля к каждой опухоли использовали образцы неопухолевой ткани печени, изъятой в ходе операции у того же пациента Кроме того, общим контролем специфичности праймеров

служили нормальная печень взрослой мыши и клетки высокодифференцированной человеческой гепатокарциномы Нер02

Методом ОТ-ПЦР был проанализирован спектр экспрессии 32 генов Оказалось, что наиболее значимым нарушением транскрипционной программы гепатоцитов было подавление экспрессии Н№4а (Рис 5) Мы показали, что экспрессия гена Н№4а1 полностью утрачена в 7 и понижена в 5 из 17 ГК (71%), не ассоциированных с инфекцией вирусами гепатита (Рис 5) Примечательно, что ни в одной из ГК, возникших у пациентов, инфицированных НВ\', снижения уровня транскрипции ЬШР4а не наблюдалось Возможно, прогрессия таких опухолей протекает по НМ^а-независимому пути, либо связана с инактивацией продукта этого гена на белковом уровне

САРОН НОТ4о Н\Р4а1

НРчГ4а7

ТОГР1

ТСР|52

ОС! СОПОН11Ш

вичснтин

Рисунок 5 Экспрессия некоторых генов в ГК человека невирусного происхождения

Фотография электрофореза продуктов ОТ-ПЦР со специфическими праймерами к указанным генам Продукты ОТ-ПЦР мРНК ГК человека (дорожки 1,3,7,9,11), неопухолевой ткани печени тех же пациентов (дорожки 2,4,6,8,10), клеток культуры Нер02 (дорожка 13), нормальной печени взрослой мыши (дорожка 14) ОТ-ПЦР с праймерами к гену глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы (ОЛРОН) служит контролем равенства количества мРНК, взятого в реакции

Кроме того, в опухолях печени человека также, как в мышиных ГК, была показана корреляция между уровнем транскрипции ГПЧГ4а1 и степенью дифференцировки большая часть из высокодифференцированных опухолей (10 из 13) экспрессирует Н№4а1 При этом,

вклад в суммарное количество 1ШР4а вносила как взрослая форма Н1\Т4а 1, так и эмбриональная сплайс-форма НЫР4а7. Кроме того, изоформа Н№4а7 была гиперэкспрессирована во всех образцах ткани, прилежащей к ГК (как в случае «НМЧсН-», так и для «Н№4а-» опухолей) Тот факт, что в неопухолевой ткани транскрибируется ген, активность которого характерна для эмбрионального этапа развития, может свидетельствовать о том, что опухоль способна оказывать влияние на транскрипционную программу окружающих ее клеток Возможно, это происходит за счет секреции клетками опухоли в окружающее пространство факторов роста, способных индуцировать эмбрио-специфические сигнальные пути, либо металлопротеиназ Кроме того, в ответ на некроз и фиброз, ассоциированные с развитием опухоли, нормальные гепатоциты, окружающие карциному, вынуждены постоянно пролиферировать (способность к регенерации - свойство, хорошо описанное для клеток печени), не исключено, что такая пролиферативная активность приводит к частичной реверсии дифференцировки, в результате которой во взрослых клетках инициируется экспрессия генов, характерных для незрелых гепатоцитов Мы полагаем, что экспрессия эмбрионального варианта НОТ4а7, так же, как и снижение транскрипционной активности взрослых изоформ НЫР4а1, являются важными маркерами гепатоканцерогенеза, а последующее исчезновение активности гена Н№4а7 - маркером поздних стадий опухолевой прогрессии

Мы также проанализировали спектры экспрессии других печень-специфических генов, изменения в уровней которых были выявлены при анализе панели ГК мыши Результаты этой части исследования обобщены в Таблице 1 В частности, было показано, что экспрессия фактора НОТ 1а была подавлена полностью (4 ГК) или частично (4 ГК) в 8 ГК невирусного происхождения Как и следовало ожидать, экспрессия гена НОТ1а в ГК, ассоциированных с инфекциями вирусами гепатита, практически не отличалась от таковой в норме, что согласуется с экспрессией в этих образцах гена Н№4а Одновременно с падением НОТ 1а, в 12 невирусных ГК регистрировалась гиперэкспрессия эмбрионального гена НЫР1р, который в норме не экспрессируется во взрослой печени [СоШшег е/ а/, 1999] Примечательно, что, как и в случае с экспрессией Н№4а7, во всех образцах ткани, окружающей гепатокарцяномы (за исключением одного случая с ГК вирусной этиологии), наблюдалась гиперэкспрессия этого гена

Во время резекции опухолей человека, а также при дальнейшем мониторинге пациентов проводился тщательный поиск возможных очагов метастазирования Таким образом, мы получали доказательства инвазивной способности клеток, входящих в состав изучаемых нами опухолей Именно поэтому чрезвычайный интерес для нас имели данные об экспрессии группы генов, ассоциированных с ЭМП (Таблица 1) Экспрессия гена Е-

кадхерина была снижена лишь в 2 ПС (1 НВV- и 1 НВV+), примечательно, что ни у одного из пациентов, чьи опухоли вошли в эту группу, не было выявлено очагов метастазирования Это позволяет предположить, что утрата Е-кадхерина является важным, но не достаточным фактором для похождения ЭМП и приобретения клетками инвазивных свойств При этом репрессор Е-кадхерина - ген Snail экспрессировался практически во всех (за исключением одной) образцах и опухолей, и неопухолевой ткани (95%) Не исключено, что активация гена Snail значительно предшествует этапу подавления активности гена Е-кадхерина и утраты клетками адгезионных контактов Активация еще одного гена, попавшего в эту группу -вименгина - является важным условием перехода от цигокератиновых филаменгов, характерных для статичного состояния клеток, к вименгиновым, ассоциированным с клеточным движением Гиперэкспрессия вименгина наблюдалась в 13 ГК невирусного происхождения и в 3 ГК, ассоциированных с инфекцией вирусами гепатита (76%) Так же, как в случае Snail, HNF4a7, HNFip и других генов, экспрессия вименгина была зарегистрирована не только в опухолях, но и в неопухолевой ткани печени (14 образцов от нацистов с ГК невирусного происхождения и 2 - от пациентов с ПС, больных гепатитом) Как и в случае Snail, логично предположить, что активация вименгина происходиг в ответ на внешний сигнал, который, возможно, генерируется клетками опухоли

Кроме того, мы подтвердили, что прогрессия гепатокарцином сопровождается индукцией TGFp-респонсивных генов было показано, что фоновая активность гена TGFpi наблюдается практически во всех образцах ГК и окружающей их неопухолевой ткани (экспрессии не было зарегистрировано в одной паре опухоль-печень из HBV+ ГК, а также в 3 образцах опухолей и одной печени ю группы HBV- ГК) В то же время, хотя фоновый уровень экспрессии TGFP2 регистрировался в 16 из 21 (76%) образцов неопухолевой ткани, в опухолевых образцах наблюдалось значительное повышение этого уровня (10 ш 21 пар опухоль-окружаюпая ткань) (Таблица 1, Рис 5)

Мы проанализировали спектры экспрессии генов, потенциально вовлеченных в гепатоканцерогенез (кавеолина, SLPI, аннексина, цитохезина, ASNS, Ras и Ufb/Axl), в опухолях печени человека (Табл 1) Примечательно, что в неопухолевой ткани вновь наблюдалась активация генов, подавленных в нормальной печени Так, экспрессия SLPI была зарегистрирована в 17 ш 21 образцов печени, гиперэкспрессия ASNS - в 8 (однако в 7 парах ГК-печень активация гена наблюдалась лишь в опухолях), кавеолина - в 20 пробах ткани, окружающей опухоль, аннексина - в 18 образцах Таким образом, ни один из генов, попавших в последнюю группу, не характеризовался полным падением или, напротив, абсолютной гиперэкспрессией в опухолях по сравнению с образцами окружающей печени Нам представляется чрезвычайно важным то наблюдение, что гены, в норме подавленные в

здоровой печени, транскрибируются в гепатоцитах в ответ на появление соседствующих опухолевых клеток

Таблица 1 Изменение экспрессии генов в опухолях печени человека

1 общее количество опухолей IV V VI VII VIII К

1 | II III

Н№4 25 17+4 1 +2 1 16 J 12 0 J1 J 2 T

HNF4-a1 " 25 17 +4 1 +2 1 16 J 11 !1 J1 J 2 f

HNF4 а7 25 17+4 1 +2 1 14 16 f 5 f 1 T1 T! f

HNF1a 25 17 +4 1 +2 1 13 J Э f 1 0 Г1.11 f

HNFIp 25 17+4 1 +2 1 16 П T1 J1 J

HNF6 25 17+4 1 +2 1 14 J9,f1 f1.J1 J1 J1 *-*

ОС 2 25 17+4 1 +2 1 13 J10 11 0 J1

HNF30 25 17 +4 1 +2 1 18 112 f 2. J 1 0 Г1.11 0

HNF3a 25 17+4 1 +2 1 15 J6, f1 13 0 TU1 T

FTF 25 17+4 1 +2 1 12 J7.f1 fl J1 J 2 4-*

С/ЕВРа 25 17+4 1 +2 1 15 J9, f 2 f 2 J1 J 2 f-t

Альбумин 25 17+4 1+2 1 12 19 0 J1 T1.J1 <-*

АФП 25 17+4 1 +2 1 7 J3, f3 0 0 0 f

TFN 25 17 + 4 1 +2 1 12 ¡8 J 1 J1 T M 1

E-cadh 25 17 + 4 1 +2 1 4 J 1 Л 0 f 1 J

Виментин 25 17 +4 1+2 1 10 J4.f5 f 1 0 0 n

Snail 25 17+4 1 +2 1 12 16,15 0 0 0 J

Фибронекгин 25 17+4 1 +2 1 8 Jl.f6 0 0 fi

Сх32 25 17+4 1 +2 1 11 J9 ?1 0 11 *■*

TGFpl 25 17 +4 1+2 1 9 15. f4 0 0 0

TGFp2 25 17 + 4 1 +2 1 15 13, f7 13 0 f 1.11

Tbi-68 25 17 +4 1 +2 1 4 11 f 1 J1 J1

TGIr 25 17+4 1 +2 1 14 19. f3 Л 0 J1

Остеолонтин 25 17+4 1 +2 1 18 12. f12 11 T1 12

Циклин G 25 17+4 1 +2 1 9 |5,|3 0 11 0

Кавеолин 25 17+4 1 +2 1 12 15, f4 J1 J1 I

SLPI 25 17+4 1 +2 1 16 16, J6 0 f 1 12 i

Ufo/Ax! 25 17 + 4 1 +2 1 16 110. fl П 11 fl.JI i

Цитохезин 25 17+4 1 +2 1 12 14. f5 f1 J 1 J

ASNS 25 17+4 1+2 1 16 13. t8 f i.ji T.I f 2

Annexin 25 17+4 1 +2 1 19 14. f9 t 2, J 2 J1 J 1

Ras 25 17+4 1 +2 1 10 J4, T4 T1 0 T1 f-*

Общее количество I ГК (НВУ-/'НВУ+), IIХЦР (НВУ-/НВУ+), III гепатобластом, IV Общее количество опухолей с измененной экспрессией гена относительно образца печени того же пациента, V Количество ГК (НВУ-) с измененной экспрессией ¡ена относительно образца печени того же пациента, VI Количество ГК (НВУ4-) с измененной экспрессией гена относительно образца печени того же пациента, VII* Количество ХЦР (НВУ-) с измененной экспрессией гена относительно образца печени того же пациента, VIII: Количество ХЦР (НВУ+) с измененной экспрессией гена относительно образца печени того же пациента, IX: Экспрессия гена в гепатобластоме относительно образца печени того же пациента Стрелками обозначено повышение или подавление активности гена в опухоти по сравнению с образцом неопухо ¡евой ткани печени того же пациента

Изучение регуляторного района гена HNF4al

Методом ОТ-ПЦР мы проанализировали спектр экспрессии генов в 11 ПС мыши и 27 человеческих опухолях печеночного происхождения Из 46 генов, включенных в исследование, наиболее значимая корреляция экспрессии с уровнем дифференцировки и обратная зависимость со скоростью роста in vivo была выявлена для гена HNF4al и его транскрипционных мишеней Совместно с данными других исследований [Lazaievich et al, 2004, Chiba et al 2005, Hwang-Veislues et al 2007, Spath и Weiss, 1998], полученные нами результаты позволяют предположить, что фактор HNF4al играет ключевую роль в поддержании дифференцированного фенотипа печени, а подавление активности этого гена является важным этапом опухолевой прогрессии Таким образом, изучение регуляции гена HNF4ccl и выяснение причины его репрессии в клетках дедифференцированных гепатом представляется важным этапом изучения прогрессии опухолей печени

В представленной работе мы выяснили, какой участок регуляторного района гена HNF4al определяет снижение уровня его экспрессии в ходе опухолевой прогрессии Для этого мы провели серию трансфекций с набором генетических конструкций, в которых репортерный ген находился под контролем различных фрагментов регуляторного района HNF4ctl Репортерные гшазмиды были сконструированы на основе вектора pZLuc и содержали ген люциферазы светлячка, лишенный собственного промотора и контролируемый фрагментами 5' регуляторного района HNF4al Фрагменты получали при удалении участков разной длины с 5' конца регуляторного района HNF4al, дистального от точки начала транскрипции, до +182 п н В работе использовали следующие конструкции

- «-7 5» (-7 5 т п н /-5 3 т п н и -1 4 т п н /+182 п н ),

- «-6 8» (-6 8т п н /+182 п н ), -«-1 4» (-1 4 т п н /+182 п н ),

- «-363» (-363 п н /+182 п н I

- «-228» (-228 п н /+182 п н ),

- «-34» (-34 п н /+182 п н ),

- «0» (плазмида без энхансер-промоторныхэлементов)

Для контроля эффективности трансфекции и для выравнивания полученных результатов клетки культуры НЗЗ котрансфицировали отдельно каждой из репортерных конструкций совместно с вектором, кодирующим ген люциферазы Renilla remformis С помощью системы двойной люциферазной детекции мы последовательно определяли активность обоих люциферазных генов гена, находящегося под контролем участка регуляторного района HNF4al, а также гена люциферазы Renilla remformis, по

люциферазной активности которого прошводилн выравнивание остальных результатов измерений Результаты оценки люциферазной активности представлены на Рисунке 6А

Рисуиокб Изучение регуляторного района гена Н,\Т4и1

\ \на ипикшвпосш фрлмеиюи рем -шгоршно рл'ншл (сил ||М*4и1 в ыстклх к>.1ьт>>!1.1 НЗЗ

30

2" •><; -----

-а- '

з

Фрагменты реп литерного района, опрекгшюшпе активность рснортертии 1СНЯ иокнфсрлы

Б. \UJ-1H1 .1КП111НОПТ1 ф)Ш ЧСНЮВ рСПЛНПфМОГО [>.ШОШ1 I с'11.1П\1-1и1 в ккчках илтры |1срС2

80-

Фрлмспп.! |»1\ляторио1 о района, (шрсде.1ЯН)щпе активнос1ь репортерши о юна 1№1Шфера!ы

Мы наблюдали полную репрессию гена-репортера при трансфекции векторами, в которых экспрессию гена люциферазы контролировал участок регуляторного района -6 8 т п н /+182 п н (фрагмент «6 8»), и -1 4

Оказалось, что под контролем участка «-363» п н репортерный ген активен, причем его активность повышается в 20 раз по сравнению с фоновым уровнем При удалении фрагмента -363 п н /-228 п н активность репортерного гена немного снижалась Тот факт, что в тех же клетках, что были использованы при трансфекции конструктов «-6 8» и «-1 4», возможна активация репортерного гена, свидетельствует о существовании в клетках дедифференцированной гепатомы НЗЗ репрессора транскрипции, сайт связывания которого локализован на участке -1 4 т п н /-363 п н

Для того чтобы подтвердить, что подавление активности гена-репортера является результатом репрессии регуляторного района Н№4а1, специфической для клеток культуры НЗЗ, мы провели серию трансфекции тех же конструктов в клетки дифференцированной гепатомы человека НерС2 В этой культуре описана экспрессия Н№4а1, таким образом, регуляторный район гена в этих клетках не подавлен каким-либо внутренним транскрипционным репрессором и его активность может служить контролем специфичности работы разных репортерных конструкций

Полученные нами данные согласуются с результатами исследования независимой лаборатории, что подтверждает их достоверность [Zhong е1 а1, 1994] Результаты количественной оценки активности репортерного гена люциферазы представлены на Рисунке 6Б

Как и ожидалось, репортерные конструкции демонстрируют значительную активность в клетках Нер02 В соответствии с литературными данными, репортерный ген люциферазы активируется регуляторным районом Н№4а1 всеми использованными участками регуляторного района Н№4а1

Тот факт, что, в отличие от результатов, полученных для клеток культуры НЗЗ, и «1 4» и «-6 8» фрагменты способны инициировать экспрессию гена-репортера в клетках Нсрв2, подтверждает предположение о существовании репрессора, способного связываться с участком -1 4 т п н /-363 п н

Ранее было показано, что с регуляторным районом Н№4а (0/-440 п н) способны связываться факторы НОТ!, НОТЗ, Н№4, Н№6 и вАТАб Энхансерный элемент регуляторного района (-6 3 т п н /-6 0 т п н) включает сайты связывания для факторов семейств С/ЕВР, Н№1, НОТЗ и Н№4 В клетках культуры НЗЗ не экспрессируется часть вышеперечисленных факторов, а именно НШЧа, НКТЗу, Н№6 и С/ЕВРа Мы провели серию ко-трансфекций, в которых вместе с вектором, содержащим репортерный ген

люциферазы под контролем регуляторного участка НМР4а1 «-6 8», в клетки вводили вектор, экспрессирующий тот или иной транскрипционный фактор Нашей целью было выяснить, произойдет ли активация репортерного гена в присутствии какого-либо из используемых транскрипционных факторов Ко-трансфекции проводили с факторами НМПа и р, НКРЗа, р и у, вАТАб, НОТб, С/ЕВРа и НЫР4а7 Оказалось, что ни один из перечисленных факторов не способен индуцировать экспрессию репортерного гена в клетках НЗЗ, то есть, отсутствие этих транскрипционных активаторов НК'Р4а1 не является причиной подавления его экспрессии, что дополнительно свидетельствует в пользу предположения о репрессорном механизме инактивации гена в клетках культуры НЗЗ

Заключение

В представленной работе был впервые проведен комплексный анализ экспрессии генов, предположительно вовлеченных в возникновение и прогрессию гепатокарцином Был проанализирован спектр экспрессии 46 генов в 11 ГК мыши и 32 генов в 27 различных опухолях печени человека, а также в неопухотевой ткани печени тех же пациентов По итогам проведенной работы наиболее общим явлением гепатоканцерогенеза и для мыши, и для человека оказалось снижение активности гена транскрипционного фактора Н№4а1, а также гиперэкспрессия его эмбриональной сплайс-формы НОТ4а7 в дифференцированных ГК Мы полагаем, что появление трапскриптов Н1чТ4а7 является ранним маркером гепатоканцерогенеза, в то время как подавление экспрессии обеих форм НЫР4а1 и Н>№4а7 маркируют поздние Э1апы опухолевой прогрессии Нами был изучен регуляторный район гена Н№4а1, мы полагаем, что репрессия этого гена в дедифференцированных ГК обусловлена действием транскрипционного репрессора, сайт связывания для которого находится на участке -14 тпн/-363 пн регуляторного района НОТ4а1 Поиск этого репрессора, а также дальнейшее изучение механизма подавления гена 1ЮТ4а1 станет темой нашей дальнейшей работы

Активация генов ТСГР-сигнального пути была также охарактеризована нами, как событие, маркирующее прогрессию ГК было показано, что дедифференцированные ГК самостоятельно транскрибируют Тйрр, кроме того, мы регистрировали в этих опухолях гиперэкспрессию некоторых ТСРр-зависимых генов (Т5С-22, ТЫ-68, остеопонтин, р2Г'Шар1)

По результатам проведенной работы гены остеопопгина, ий)/Ах1 и АЭКЭ охарактеризованы нами как наиболее перспективные маркеры гепатоканцерогенеза Кроме того, мы впервые показали, что в гепатокарциномах повышена экспрессия генов БЬР!, АЭ^,

кавеолина и цитохезина 3 Нам представляется интересным дальнейшее изучение роли этих факторов в гепатоканцерогенезе

Одним из важнейших направлений фундаментальной онкологии сейчас стало изучение взаимосвязи опухоли и окружающей ее неопухолевой ткани Немаловажным результатом нашей работы стало наблюдение об активации генов (HNF4a7, HNFip, АФП, остеопонтин, виментин, Snail), нехарактерных для нормальных гепатоцитов, в клетках ткани печени, окружающей опухоль Мы предполагаем, что под воздействием опухолевых клеток изменяется генетическая программа окружающих нормальных гепатоцитов, что способствует дальнейшему развитию опухоли

Несмотря на то, что каждая опухоль уникальна по способу возникновения и развития, а спектр генетических поломок, последовательно направляющих клетку по пути канцерогенеза, сугубо индивидуален, нам представляется целесообразньм продолжать поиски общих закономерностей опухолевой прогрессии Изучение отдельных этапов этой прогрессии и способов перехода на следующую ступень озлокачествления представляет как неоспоримый интерес для фундаментальной науки, так и перспективное направление в лечении и диагностике опухолей

ВЫВОДЫ

1 В гепатокариномах мыши и человека выявлена обратная зависимость между степенью опухолевой прогрессии и профилем экспрессируемых в них ткане-специфических регуляторов транскрипции HNF4a, HNFla, HNFip, HNF3y, C/EBPa и FTF Подавление активности гена HNF4al представляется наиболее значимым событием прогрессии гепатокарцином

2 Впервые описана гиперэкспрессия эмбриональной формы HNF4a7 в образцах дифференцированных гепатокарцином мыши и человека На поздних этапах опухолевой прогрессии происходит подавление транскрипции HNF4a7

3 При прогрессии в значительной части гепатокарцином впервые описана активация экспрессии гена TGFp2 и TGFP-зависимых генов

4 Из 46 проанализированных генов остеопонтин, тирозин-киназа Ufo/Axl и аспарагинсинтаза охарактеризованы как наиболее перспективные маркеры гепатоканцерогенеза

5 Клетки ткани, окружающей гепатокарциному, экспрессируют не характерные для зрелых гепатоцитов гены HNF4a7 и HNFip, виментин, остеопонтин и snail

6 Гепатокарциномы человека, ассоциированные с инфекцией вирусным гепатитом, развиваются по альтернативному механизму в них не происходит репрессии гена HNF4a

7 В регуляторном районе гена HNF4al выявлен участок -14 тпн/-363 пн, определяющий транскрипционную репрессию этого гена в клетках дедифферснцированной гепатокарциномы

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 N L Lazarevich, О A Cheremnova, Е V Varga, D A Ovchinnikov, Е I Kudqavtseva, О V Morozova, D I Fleishman, N V Engelhardt, S A Duncan Progression of HCC m mice is associated with a downregulation m the expression of hepatocyte nuclear factors (2004) Hepatology, 39(4) 1038-1047

2 Д И Флейшман, О В Морозова, H Л Лазаревич Сравнительная характеристика гепатокарцином мыши с различной степенью дифференцировки (2008) Вестник Российского онкологического научного центра им НН Блохина РАМН, 2 19-23

3 H Л Лазаревич, Д И Флейшман Ткане-специфические транскрипционные факторы в прогрессии эпителиальных опухолей (2008) Биохимия, том 78 (5)

4 H Л Лазаревич, Д А Овчинников, Д И Флейшман, О А Чсремнова, О В Морозова, В С Турусов H В Энгельгардт Ткане-специфические транскрипционные факторы в прогрессии гепатоцеллюлярных карцином (2006) Петровские чтения-2006 Конференция по фундаментальной онкологии, Санкт-Петербург, Россия Вопр Онкол, том 52 (1) 20-21

5 Д И Флейшман, О А Черемнова, Д А Овчинников, M В, Макарова, О А Чернобельская, H Л Лазаревич (2005) Изменения паттерна экспрессии генов в гепатокарциномах мыши и человека 9-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, тезисы докладастр 59

6 H Л Лазаревич, Д И Флейшман, О А Чернобельская, M В Макарова, Д В Альперн, О В Морозова, Ю И Патютко, H В Энгельгардт Ткане-специфические транскрипционные факторы в прогрессии гепатоцеллюлярных карцином Материалы VI Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» 12-16 декабря 2005 г, Звенигород, Москва, стр 44

7 DI Fleishman, M V Makarova, D V Alpem, D A Shavochkina, A A Kuznetzova, О V Morozova, Y I Patyutko, N L Lazarevich Gene expression alterations m hepatocarcmogenesis Molecular Mechanisms m Signal Transduction and Cancer

FEBS/EMBO Special meeting, Augast 15-24, 2007, Spetses, Greece Abstractbook, p 28

8 EV Varga, OA Cheremnova, D A Ovchinnikov, EI Kudijavtseva, O V Morozova, DI Fleichman, N V Engelhardt and N L Lazarevich Steroid family nuclear receptor HNF4 expression increases differentiation level m a hepatocellular carcinoma (2001) 27 FEBS Annual Meeting, FEES J, v 268, Suppl l,p 68

9 N Lazarevich, O Cheremnova, E Varga, D Ovchinnikov, E Kudijavtseva, 0 Morozova, D Fleichman, N Engelhardt Comparative analyses of mam properties and gene expression during mouse hepatocellular carcinoma one-step progression (2002) European Association for Cancer Research (EACR) 17 Meeting, Rev Oncol, 4 (Suppl 1) 91-92

10 N Lazarevich, O Cheremnova, E Varga, D Ovchinnikov, D Fleishman, E Kudrjavtseva, O Morozova, N Engelhardt Tumor progression of mouse transplantable hepatocarcmomas analyses of biological properties and gene expression (2002) FASEB Summer Research Conference "Mechanisms of Liver Growth, Differentiation and Molecular Pathogenesis of Hepatic Diseases", Snowmass, Colorado, Abstract book, X-15

11 N L Lazarevich, D I Fleishman, O A Chernobel'skaya, M V Makarova, D V Alpern, O V Morozova, Yu I Patyutko, N V Engelhardt (2005) Tissue-specific transcription factor network m hepatocellular carcinoma progression The European Cancer Conference ECCO 13, Pans, Abstract book

12 MV Makarova, OA Chernobelskaya, D I Fleishman, OV Morozova, NL Lazarevich Role of TGF-b signaling m hepatocellular carcinoma progression FEBS Special Meeting on Cellular Signaling, May 26 - June 1, 2006, Dubrovnik, Croatia Abstract book, CTp 146-147

13 N Lazarevich, D Fleishman, O Chernobelskaya, M Makarova, D Alpern, A Kuznetsova, D Shavochkma, O Morozova, Y Patyutko Dysfunction of tissue-specific transcriptional network is an important determinant of hepatocellular carcinoma progression Budapest, Hungary 1-4 July 2006 EACR-19 Meeting Proceedings, p 174

14 D Alpern, M Makarova, D Fleishman, O Chernobelskaya, N Lazarevich Expression of HNF4alpha is switched under influence of TGFbeta and p53 United Kingdom, Bath, 26-28 June, 2007 JDRF Center for Beta Cell Therapy m Diabetes Training Course "Transdifferentiation to Beta Cells", p 12-13

Подписано в печать 04 12 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 1016 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Гепатокарциномы (ГК) - опухоли, возникающие из зрелых гепатоцитов. Их возникновение ассоциировано с хроническими инфекциями вирусами гепатита В (HBV) или С (HCV), алкоголизмом, циррозом печени, а также связано с действием на организм химических канцерогенов и гепатоканцерогенов, таких как микотоксин или афлатоксин В1 [Rocken и McGrath, 2001].

Прогрессия гепатокарцином представляет собой многостадийный процесс, который приводит к приобретению опухолью злокачественного фенотипа. При этом развитие опухоли сопровождается снижением уровня дифференцировки, увеличением скорости пролиферации клеток, утратой эпителиальной морфологии и приобретением способности к метастазированию. Опухолевая прогрессия ассоциирована с изменением паттерна экспрессируемых генов, в том числе последовательностей, кодирующих опухолевые супрессоры, факторы роста, компоненты межклеточных и адгезионных контактов, а также -ткане-специфические белки. Определяющую роль в регуляции экспрессии функциональных генов печени играет несколько семейств регуляторных белков, получивших общее название гепатоцитарных ядерных факторов (ГЯФ; Hepatocyte nuclear factors - HNF): HNF1, С/ЕВР (СААТ/энхаксер связывающий белок a), HNF3, HNF4 и HNF6. Роль этих факторов в развитии и дифференцировке гепатоцитов активно изучается, однако их роль в гепатоканцерогенезе до сих пор исследована недостаточно полно.

Для решения этой проблемы ранее в лаборатории была использована экспериментальная система одноступенчатой прогрессии, в которой из медленнорастущей высокодифференцированной ГК мыши одномоментно выщепился злокачественный быстрорастущий ннзкодифференцированный вариант. Было показано, что дедифференцировка медленнорастущей гепатокарциномы сопровождалась подавлением активности большинства гепатоцитарных ядерных факторов, а также снижением уровня экспрессии генов, определяющих эпителиальный фенотип гепатоцитов. Восстановление экспрессии гепатоцитарного ядерного фактора HNF4a в культуре клеток быстрорастущей гепатокарциномы привело к частичной реверсии злокачественного фенотипа. Было выдвинуто предположение, что скоординированная работа гепатоцитарных ядерных факторов шрает ключевую роль в поддержании дифференцировки гепатоцитов, причем HNF4a является ключевым регулятором этого' процесса;

Для дальнейшего' поиска генов; вовлеченных в прогрессию гепатокарцином, спектры экспрессии генов в гепатокарциномах мыши были исследованы с помощью гибридизации с кДНК микрочипами. Было выявлено более 20 потенциальных опухолевых маркеров, экспрессия которых была более чем в 5 раз повышена во всех исследованных гепатокарциномах по сравнению с нормальной печенью, и около 30 генов со значительным уровнем гиперэкспрессии в дедифференцированной гепатокарциноме.

В настоящей работе мы выяснили, :какиё из закономерностей, выявленных на модели одноступенчатой прогрессии гепатокарциномы,' имеют наиболее общий характер, а также определили частоту встречаемости изменения уровней транскрипции факторов;, выявленных при кДНК гибридизации, при прогрессии гепатокарцином.

В работе была использована серия химически индуцированных мышиных гепатокарцином из коллекции, полученной ранее в НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН, а также образцы опухолей печени человека, полученные при резекции опухолей у пациентов РОНЦ РАМН. Мы провели сравнительный анализ исследуемых опухолей и выявили гены, изменение экспрессии которых наиболее четко отражает - развитие злокачественного фенотипа. Мы предполагаем, что ключевую роль в поддержании дифференцировочного статуса гепатоцитов играет фактор HNF4a, а подавление' .транскрипции его изоформы HNF4al, совместно с активацией экспрессии его эмбриональной сплайс-формы HNF4a7 служит маркером гепатоканцерогенеза. Налай был проведен -анализ регуляторного района гена HNF4al и выявлен участок, который, по нашему мнению, . содержит сайт связывания для репрессора, . ответственного за инактивацию гена HNF4a в ходе опухолевой прогрессии.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ . Целью настоящей работы стало выявление и .функциональная характеристика, молекулярных маркеров прогрессни гепатокарцином мышии: человека./ В связи с заданной целью мы выдвинули следующие задачи:. / !. Создание и гистологическая характеристика коллекции мышиных гепатокарцином независимого происхождения с различным уровнем дифференцировки, а. также • ■ коллекцгш гепатокарцином. человека. • . ■ . • • б

2. Анализ экспрессии гепато-специфических генов, а также генов, экспрессия ■ которых значительно изменилась при одноступенчатой прогрессии,- в панели химически индуцированных гепатокарциноммыши с различной скоростью роста и уровнем дифферещщровки.

3. Изучение закономерностей экспрессии гепато-специфических генов, а также потенциальных маркеров:;. гепато канцерогенеза, .выявленных на предыдущих стадиях исследования,, в опухолях печени, человека, полученных при резекции, гепатокарцином у пациентов РОНЦ.

4. Поиск возможных механизмов возникновения событий, маркирующих опухолевую прогрессию (исследование механизма инактивации гена HNF4al).

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ОТАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

На протяжении длительного времени изучение генетических изменений, лежащих ' в основе гепатоканцерогенеза,, ограничивались исследованиями нетканеспецифических. факторов, нарушение в активности которых является общим явлением для опухолей разного типа. Работы, посвященные роли ткане-специфических регуляторов транскрипции в прогрессии отдельных типов эпителиальных опухолей, и, в частности, гепатокарцином; . чаще всего затрагивали лишь один или несколько из упомянутых транскрипционных факторов, причем о нарушении работы последних судили по результатам анализа модельных систем in vitro.

В представленной работе были проанализированы спектры экспрессии большинства печень-специфических транскрипционных факторов на панели из ГК мыши •i независимого происхождения, различшощихся по уровню дифференцировки и скорости • ^:.роста, что .позволило. определить спектр генов, уровни экспрессии которых наиболее ■'- четко, связаны с этими признаками. Кроме того, следует отметить, что в большинстве работ, посвященных изучению роли ГЯФ в гепатоканцерогенезе, изучаются общие свойства семейств, в то время как в представленном исследовании мы постарались отдельно рассмотреть роль каждого из представителей и его изоформ. Это позволило впервые описать гиперэкспрессию эмбриональной формы HNF4a7 в ,. образцах •дифференцированных гепатокарцином мыши и человека.

На модели ГК мыши независимого происхождения и разного уровня дифференцировки нам удалось показать четкую зависимость между степенью дедифференцировки ГК и профилем зкспрессируемых в них ткане-специфических регуляторов транскрипции HNF4a, HNFlaj HNFlp, HNF3y, C/EBPa н FTF (транскрипционный фактор альфа-фетопротеина).

В работе впервые проведен анализ полного спектра экспрессии ГЯФ в образцах опухолей печени человека. Впервые охарактеризованы закономерности экспрессии ряда генов (остеопонтина, кавеолина, аспарагинсинтазы ASNS, секреторного лейкоцитарного ингибитора протеаз SLPI, киназы Ufo/Axl), транскрипция которых повышается в ходе гепатоканцерогенеза, в гепатокарциномах и холангиокарциномах человека.

Кроме того, мы впервые показали, что гепатоциты неопухолевой ткани печени пациентов с гепатокарциномами экспрессируют ряд генов, нехарактерных для взрослой печени (например, гены HNF4a7, HNFip, snail и виментин). Эти данные позволяют предположить о влиянии опухоли на генетическую программу клеток окружающей ткани. Не исключено, что под этим воздействием опухоли нормальные клетки вырабатывают факторы, способствующие изменению внеклеточного матрикса, что в свою очередь ускоряет инвазию опухоли.

Мы установили, что репрессия гена HNF4al в низкодифференцированных ПС происходит на транскрипционном! уровне. Исследования регуляторного района гена HNF4al показали, что участок—1.4 т.п.н./-363 п.н. ответственен за связывание репрессора, подавляющего транскрипцию гена. Кроме того, впервые показано, что ни один из других ГЯФ - HNFla и р, HNF6, GATA6 (энтодермальный транскрипционный фактор, содержащий ДНК-связывающий домен типа "цинковые пальцы", который взаимодействует с последовательностью WGATAR), HNF3a, Р и у, С/EBPa и HNF4a7 -сайты связывания которых находятся в исследованном регуляторном участке, не способен активировать экспрессию гена, контролируемого промотором HNF4al.

Изучение взаимосвязи паттерна экспрессируемых генов с прогрессионным статусом опухоли представляет интерес для фундаментальной науки. Выявление маркеров прогрессии ГК является важным этапом в исследованиях механизмов опухолевой прогрессии и представляет новые инструменты для диагностики и мишени для терапии ГК.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. В гепатокариномах мыши и человека выявлена обратная зависимость между степенью опухолевой прогрессии и профилем экспрессируемых в них ткане-специфических регуляторов транскрипции HNF4a, HNFla, HNFip, HNF3y, C/EBPa и FTF. Подавление активности гена HNF4al представляется наиболее значимым событием прогрессии гепатокарцином.

2. Впервые описана гиперэкспрессия эмбриональной формы HNF4a7 в образцах дифференцированных гепатокарцином мыши и человека. На поздних этапах опухолевой прогрессии происходит подавление транскрипции HNF4a7.

3. При прогрессии в значительной части гепатокарцином впервые описана активация экспрессии гена TGF02 и TGFp-зависимых генов.

4. Из 46 проанализированных генов остеопонтин, тирозин-киназа Ufo/Axl и аспарагинсинтаза охарактеризованы как наиболее перспективные маркеры гепатоканцерогенеза.

5. Клетки ткани, окружающей гепатокарциному, экспрессируют не характерные для зрелых гепатоцитов гены HNF4a7 и HNFip, виментин, остеопонтин и snail.

6. Гепатокарциномы человека, ассоциированные с инфекцией вирусным гепатитом, развиваются по альтернативному механизму: в них не происходит репрессии гена HNF4gl

7. В регуляторном районе гена HNF4al выявлен участок -1.4 т.п.н./-363 п.н., определяющий транскрипционную репрессию этого гена в клетках дедифференцированной гепатокарциномы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленной работе был впервые проведен комплексный анализ экспрессии ключевых регуляторов дифференцировки печени - ГЯФ в опухолях печени мыши и человека. Также для этих опухолей было проведено исследование закономерности экспрессии генов, предположительно вовлеченных в возникновение и прогрессию гепатокарцином.

Кроме того, был изучен регуляторный район гена HNF4al — фактора, который, по результатам проведенного исследования, является ключевым регулятором поддержания дифференцировочного статуса гепатоцитов, а подавление его активности может расцениваться, как маркер опухолевой прогрессии.

Ранее, на модели одноступенчатой прогрессии в нашей лаборатории был выведен ряд закономерностей изменения экспрессии генов в ходе гепатоканцерогенеза. На панели из 11 химически индуцированных гепатокарцином независимого происхождения и разного уровня дифференцировки мы подтвердили существование этих закономерностей. Мы установили, что уровень дифференцировки опухоли четко коррелирует с паттерном экспрессируемых в ней ткане-специфических транскрипционных факторов, причем наибольшая корреляция наблюдается с экспрессией гена HNF4a и его мишеней. Мьг показали, что высоко-дифференцированные опухоли, экспрессирующие основные ГЯФ, обладают меньшей скоростью роста, в них подавлена экспрессия генов, продукты которых вовлечены в эпителиально-мезенхимаьный переход, кроме того, судя по паттерну транскрибируемых в них генов, эти опухоли более чувствительны к проапоптотическим сигналам.

Целью данного исследования бы поиск и характеристика возможных маркеров прогрессии гепатокарцином. По итогам проведенной работы наиболее общим явлением гепатоканцерогенеза и для мыши, и для человека является снижение активности гена транскрипционного фактора HNF4al, а также гиперэкспрессия его эмбриональной сплайс-формы HNF4a7. HNF4a связывается с респонсивными элементами более, чем 12% всех генов, экспрессируемых в гепатоцитах человека, продукты которых вовлечены в самые разнообразные процессы клеточного метаболизма, дифференцировки и роста: это гены основных ферментов глюконеогенеза и обмена липидов, гены плотных и щелевых контактов, гены, кодирующие ингибиторы роста, а также большая часть генов других печень-специфических транскрипционных факторов. Эти данные указывают на то, что описываемый фактор лежит на пересечении множества сигнальных путей, нарушение которых способствует приобретению гепатоцитами злокачественного фенотипа.

Вероятно, именно поэтому нарушение его функции является одним из ключевых событий гепатоканцерогенеза. Мы полагаем, что появление транскриптов HNF4a7 является ранним маркером гепатоканцерогенеза. В то же время, мы показали,, что в дедифференцированных опухолях агрессивного фенотипа, происходит падение активности этого гена. Таким образом, можно предположить, что подавление гиперэкспрессии HNF4a7 служит маркером опухолевой прогрессии.

Активация генов TGFP-сигнального пути была также охарактеризована нами, как событие, маркирующее прогрессию гепатокарциномы: представители' семейства TGFp являются мощными регуляторами клеточного роста. В норме воздействие TGFP на эпителиальные клетки приводит к активации в них проапоптотической программы. В то же время, эпителиоциты, претерпевшие ЭМП, оказываются резистентными к действию TGFP: напротив, под влиянием этого фактора в таких клетках активируются пролиферационные антиапоптотические каскады. Мы показали, что дедифференцированные ГК самостоятельно транскрибируют TGFP, кроме того, мы регистрировали в этих опухолях гиперэкспрессию некоторых TGFP-зависимых генов (TSC-22, Tbi-68, Остеопонтин, р21). Логично предположить, что приобретение устойчивости к про-апоптотическому воздействию TGFP и последующая активация TGFp-респонсивных генов также являются маркерами опухолевой прогрессии.

Мы провели анализ спектра экспрессии 46 генов в опухолях печени мыши и человека. По результатам проведенной работы гены остеопонтина, Ufo/Axl и ASNS охарактеризованы нами как наиболее перспективные маркеры гепатоканцерогенез. Кроме того, мы впервые показали, что в гепатокарциномах повышена экспрессия генов SLPI, ASNS, кавеолина и цитохезина 3.

Немаловажным результатом работы стало наблюдение об активации некоторых генов, нехарактерных для нормальных гепатоцитов, в клетках ткани печени, окружающей опухоль. К ним относятся гены, кодирующие ГЯФ; в норме присутствующие лишь в эмбриональной печени: HNF4a7 и HNFip, ген эмбрионального белка АФП, а также гены, продукты которых вовлечены в изменение внеклеточного матрикса, различных клеточных контактов и перестройку клеточного цитоскелета в сторону подвижного фенотипа (остеопонтин, виментин, Snail). Мы предполагаем, что опухолевые клетки, способны секретировать в окружающую среду факторы, которые, в' свою очередь, активируют сигнальные каскады как в клетках опухоли, так и в клетках прилежащей к ней ткани. Таким образом, окружающие нормальные гепатоциты участвуют в моделировании внеклеточного матрикса, а значит, способствуют инвазии опухолевых клеток. Изучение этого явления представляется нам чрезвычайно важным направлением онкологии, и, несомненно, станет темой наших дальнейших исследований.

В работе также охарактеризован регуляторный район гена HNF4al. Выдвинуто предположение, что участок -1.4 т.п.н./-363 п.н. содержит сайт связывания для неизвестного пока регулятора транскрипции HNF4a. Удаление этого фрагмента из регуляторного района HNF4al позволяет активировать экспрессию гена-репортера в клетках дедифференцированной гепатомы НЗЗ, в норме не экспрессирующей HNF4a. Мы показали, что ни один из известных ГЯФ (HNFla и Р, HNF6, GATA6, HNF3a, Р и у, C/EBPa и HNF4a7), сайты связывания которых находятся в исследованном регуляторном участке, не способен активировать транскрипцию гена-репортера, находящегося под контролем полного регуляторного района HNF4al. Это позволило нам предположить, что репрессия гена HNF4a в клетках культуры НЗЗ вызвана именно наличием репрессора, сайт связывания для которого находится на участке -1.4 т.п.н./-363 п.н. регуляторного района. В дальнейшем мы планируем выявить и охарактеризовать этот репрессор. Не исключено, что именно за счет действия этого фактора осуществляется подавление активности гена HNF4al, что приводит к углублению опухолевой прогрессии.

Несмотря на то, что каждая опухоль уникальна по способу возникновения и развития, а спектр генетических поломок, последовательно направляющих клетку по пути канцерогенеза, сугубо индивидуален, нам представляется целесообразным продолжать поиски общих закономерностей опухолевой прогрессии. Изучение отдельных этапов этой прогрессии и способов перехода на следующую ступень озлокачествления представляет как неоспоримый интерес для фундаментальной науки, так и перспективное направление в лечении и диагностике опухолей.