Автореферат и диссертация по медицине (14.01.14) на тему:Изучение остеоиндуктивной активности остеопластических материалов, содержащих рекомбинантный морфогенетический белок кости rhBMP-2, в экспериментальных моделях

Долинер Михаил Эллевич

Изучение остеоиндуктивной активности остеопластических материалов, содержащих рекомбинантный морфогенетический белок кости гЬВМР-2, в экспериментальных моделях

14.01.14 - Стоматология (мед. науки)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 з 12015

Москва-2015

005568447

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор БЫЧКОВ Алексей Игоревич

Научный консультант:

Кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории тканевой инженерии ФГБУ Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН ЧЕКАНОВ Алексей Владимирович

Официальные оппоненты:

Лепилин Александр Викторович - доктор медицинских наук, профессор (ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медгщинский университет имени В. И. Разумовского» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий кафедрой стоматологии хирургической и челюстно-лицевой хирургии)

Сипкин Александр Михайлович — доктор медицинских наук (ГБУ Московской области Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М. Ф. Владимирского, ведущий научный сотрудник отделения челюстно-лицевой хирургии)

Ведущая организация:

ФГБУ "Центральный научно-исследовательский институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «2» июня 2015 г. в_ часов на

заседании диссертационного совета Д 208.041.03, созданного на базе ГБОУ ВПО МГМСУ имени А.И.Евдокимова Минздрава России, по адресу: 127006 Москва ул. Долгоруковская д. 4.

Почтовый адрес: 127473, Москва, ул. Делегатская д. 20 стр.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного медико-стоматологического университета имени А.И.Евдокимова» (127206, г. Москва, ул. Вучетича, д. 10а) и на сайте http://dissov.msmsu.ru .

Автореферат разослан « » С^-'_2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Юлия Александровна Гиоева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы и степень ее разработанности

Существует большое количество работ, посвященных решению вопросов восстановления дефектов костной ткани путем усовершенствования остеопластических материалов и синтезирования новых, что свидетельствует об актуальности данной задачи в хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии.

Определенные дефекты костной ткани, ее возрастная утрата или патологические состояния не могут быть устранены путем ее репаративной регенерации. В таких случаях для восстановления костной ткани, как правило, применяются биоматериалы или их синтетические аналоги, способные выполнять механические функции кости. (Haid R.W., 2004; МсКее M.D., 2004).

Несмотря на огромное многообразие предложенных методик, наиболее перспективным направлением повышения остеоиндуктивности костных имплантатов и усиления регенерации соединительной ткани является создание биокомпозитных материалов, содержащих основные компоненты ткани и активные белковые субстанции - факторы роста. (Воложин А.И., 2006; Иванов С.Ю., 2000; Ожелевская С.А., 2006)

В настоящее время уже используются ростовой фактор тромбоцитарного происхождения (Graham S., 2009), трансплантация аутоклеток костного дифферона после их культивирования на соответствующих носителях (Tohrna Y., 2011), применяются полипотентные стволовые клетки, имплантация остеоиндуктивных матриц (Деев Р.В., 2007), интенсификация ангиогенеза и микроциркуляции в зоне регенерации (Cui Q., 2006; Lee, E.H., 2006). Одним из наиболее перспективных направлений в последнее время стало локальное использование костных морфогенетических белков (BMP), способных непосредственно воздействовать на

предшественников остеобластов (Chen X., 2002; Cook S.D., 2000). Усиление остеогенеза при локальном применении неоднократно было показано как в экспериментальных, так и в клинических исследованиях (Cook S.D., 1994; Govender S., 2002; Jones A.L., 2004). Однако, отмечена возможность образования гетеротопических оссификатов при применении BMP (Brower R.S., 2008; Koide М., 1999), что сдерживает их широкое клиническое применение как стимуляторов остеогенеза. Не решенным остается также вопрос об оптимальном носителе морфогенетического белка.

Анализ представленных работ подтверждает значимость имеющегося направления усиления остеоиндукции и необходимость продолжения дальнейших исследований, касающихся изучения возможности воздействия на метаболизм костной ткани препаратов, усиливающих остеогенез (морфогенетические белки кости), в зоне хирургического вмешательства.

Цель работы

Провести комплексную экспериментальную оценку остеогенной активности материала на основе недеминерализованного костного матрикса, содержащего рекомбинантный человеческий морфогенетический белок кости rhBMP-2, в экспериментальных моделях на лабораторных животных.

Задачи работы

1. Изучить влияние остеопластического материала на основе недеминерализованного костного матрикса, насыщенного морфогенетическим белком кости, на процессы репарации костной ткани на модели остеотомии у экспериментальных животных с помощью гистоморфологиче,ского и гистоморфометрического методов.

2. Оценить влияние остеопластического материала на основе недеминерализованного костного матрикса, насыщенного морфогенетическим белком кости, на образование костной ткани.

3. Определить и спрогнозировать возможность применения

остеопластического материала на основе недеминерализованного

4

костного матрикса, насыщенного рекомбинантным человеческим морфогенетическим белком кости гЬВМР-2, при стоматологических хирургических вмешательствах 4. Разработать показания и рекомендации к применению нового остеопластического материала на основе недеминерализованного костного матрикса, насыщенного морфогенетическим белком кости, в хирургической стоматологии.

Научная новизна

Впервые синтезирован и применен в эксперименте на лабораторных животных рекомбинантный человеческий морфогенетический белок кости гЬВМР-2 в составе остеопластического материала «Остеодент» на основе недеминерализованного костного матрикса.

Впервые в эксперименте доказано, что остеопластический материал «Остеодент» на основе недеминерализованного костного матрикса, насыщенный рекомбинантным морфогенетическим белком кости гИВМР-2 не влияет на течение раневого процесса.

Установлено, что лучшее качество новообразованной костной ткани в дефекте свода черепа крысы наблюдается в экспериментальной группе при заполнении дефекта недеминерализованным костным матриксом, насыщенным рекомбинантным человеческим морфогенетическим белком кости гЬВМР-2 по отношению к группе сравнения при применении чистого недеминерализованного костного матрикса.

Впервые с помощью компьютерной томографии показано, что при применении рекомбинантного человеческого морфогенетического белка кости гЬВМР-2 в составе недеминерализованного костного матрикса «Остеодент» разницы в площади заполнения дефекта новообразованной костной тканью к 3 месяцу исследований в группе сравнения и экспериментальной группе не выявлено.

Теоретическая и практическая значимость работы

На основании изучения экспериментальных данных разработаны рекомендации к применению остеопластического материала для заполнения костных дефектов, созданного на основе недеминерализованного костного матрикса, насыщенного рекомбинантным человеческим морфогенетическим белком кости гЬВМР-2.

В результате проведенных исследований выявлена и обоснована способность к качественной репарации костной ткани при использовании нового остеопластического материала, насыщенного морфогенетическим белком кости.

Методология и методы исследования

Работа состояла из лабораторной и экспериментальной части.

Лабораторная часть включала в себя: эксперимент со стромальными клетками-предшественниками костного мозга, сканирующую электронную микроскопию (СЭМ). В эксперименте использовано 54 половозрелых самцов белых крыс породы Вистар. Животные были разделены на 3 группы: 1-я -контрольная, Н-я - группа сравнения и Ш-я - экспериментальная (по 18 крыс в каждой). У животных 1-ой группы дефект заживал под сгустком, П-ой группы (группы сравнения) дефект заполняли чистым

недеминерализованным костным матриксом «Остеодент», а у Ш-ей (экспериментальной) группы дефект заполняли недеминерализованным костным матриксом «Остеодент», содержащим гЬВМР-2. В дальнейшем проведено подробное морфологическое исследование полученных образцов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту 1. Клетки-предшественники фибробластов прикрепляются на поверхности недеминерализованного костного матрикса, содержащего рекомбинантный человеческий морфогенетический белок кости гЬВМР-2.

2. Микрорельеф поверхности остеопластического материала в виде гранул с размерами 700-800 мкм на основе недеминерализованного костного матрикса является оптимальным для адгезии клеток-предшественников костного мозга.

3. Применение остеопластического материала на основе недеминерализованного костного матрикса, содержащего рекомбинантный человеческий морфогенетический белок кости гЬВМР-2 обеспечивает лучшее качество новообразованной костной ткани в эксперименте. Подтверждено морфологическим исследованием.

Апробация работы

Материалы и результаты исследования были доложены на Всероссийском симпозиуме «Биотехнология и тканевая инженерия в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии» (Москва, 2014)

Основные положения диссертации доложены, обсуждены и одобрены на совместном заседании сотрудников кафедры хирургии полости рта, кафедры пропедевтической стоматологии и материаловедения Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации и лаборатории тканевой инженерии Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования 1. Получение эксплантационного материала в эксперименте на культуре клеток-предшественников стромапьных фибробластов костного мозга.

В эксперименте, проводимом на базе лаборатории стромальной регуляции иммунитета института эпидемиологии и микробиологии им. Гамалеи под руководством Чайлахяна Рубена Карповича использовали крыс породы «Вистар». Крыс усыпляли эфиром. С соблюдением правил асептики через разрез на задней части бедра выделяли бедренные и большеберцовые кости. Эпифизы костей обрезали и шприцом выдували костный мозг во флакон с питательной средой. Фрагменты костного мозга пропускали через шприц с последовательно уменьшающимся диаметром игл при минимальном давлении в нем до получения гомогенной взвеси клеток. Взвесь дважды отмывали центрифугированием при 4°С (40(^), осадок ресуспендировали в свежей питательной среде, фильтровали через 4-х слойный капроновый фильтр.

Для получения штаммов стромапьных клеток-предшественников клетки костного мозга эксплантировали во флаконы. На 10-14 день культивирования, когда колонии стромапьных фибробластов были полностью сформированы, проводили I пассаж.

Первичные культуры, выращенные во флаконах, дважды отмывали от сыворотки физиологическим раствором. Затем во флаконы добавляли 2-3 мл. 0,25% раствора трипсина, которым обрабатывали культуры в течение 3-5 мин., затем флаконы переворачивали и в таком виде помещали в термостат при 37°С. Через 15-20 минут трипсин сливали, в культуральные флаконы добавляли свежую питательную среду и несколько раз встряхивали их. Не открепившиеся клетки снимали пипетированием. Необходимое количество клеток переносили во флаконы с большей площадью дна. Повторные пассажи проводили по этой же методике по достижении полного монослоя клеток в культурах.

2. Технология получения остеопластического материала

При производстве остеопластического материала используется ксеногенная кость. Получение биоматериала производится путем механической очистки кости, при этом кость очищают от надкостницы, мышц и сухожилий. Размельчают до костных гранул размером до 400 мкм, обрабатывают раствором 2% щелочи при комнатной температуре, отмывают деионизированной водой, затем обрабатывают 6М раствором мочевины, затем 3% раствором перекиси водорода, обезжиривают в смеси раствора хлороформ-этанол, меняя раствор не менее 2-х раз, отмывают деионизированной водой, насыщают ГАГ 800-1500 мкг/см3, высушивают в лиофильной сушке, добавляют склеральный коллаген, аминокислоты, БАД, антисептики, упаковывают и стерилизуют радиационным способом.

Для изучения взаимодействия штаммов остеогенных клеток-предшественников с остеопластическим материалом, его засеивали пассивированными клетками. Культивирование проводили в течение 5-7 дней. Затем производили фиксацию.

Перед фиксацией культуральную среду сливали, материал несколько раз промывали физиологическим раствором и на 30 мин. заливали 80% этанолом. Фиксированные культуры окрашивали по Гимзе. После этого оценивали полученный результат под микроскопом.(Воложин Г.А. 2005, Фриденштейн А.Я. 1971, Фриденштейн А.Я. 1973)

3. Подготовка остеопластического материала с выращенными на его поверхности костномозговыми стромальными клетками к электронному сканирующему микроскопированию.

С помощью метода сканирующей электронной микроскопии анализировались образцы стоматологического материала после инкубации в ростовой среде с клеточной культурой фибробластов. Несколько кусочков материала размерами 2-3 мм из среды монтировались (крепились) на алюминиевые столики с помощью двустороннего карбонового скотча, после

чего напылялись слоем золота толщиной 4 нм и переносились для анализа в сканирующий электронно-ионный микроскоп "Quanta 200 3D" (FEI Company, USA). Анализ образцов в СЭМ проводился в режиме высокого вакуума и напряжении тока lOkV.(Волков О.В., 1987)

4. Описание эксперимента на лабораторных животных

Весь эксперимент на животных проводили в условиях вивария МГМСУ им. Евдокимова, (зав. вивария Комова JI.B.)

В исследовании использовали биокомпозиционный материал на основе недеминерализованного костного матрикса «Остеодент» в виде гранул в чистом виде и соединенный с рекомбинантным человеческим морфогенетическим белком кости (rhBMP-2). Синтез и соединение рекомбинантного морфогенетического белка с недеминерализованным костным матриксом Проводились на базе Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук (ИТЭБ РАН) по методике, описанной зарубежными авторами (Malik, D.K., 2007). Концентрация белка в имплантате составляла 0,6-0,8 мг/см'. В эксперименте использовано 54 половозрелых самцов белых крыс массой тела 400-500 г. Во всех случаях выполнялась операция по одной и той же методике.

5. Описание экспериментальных групп

В эксперименте использовано 54 половозрелых самцов белых крыс породы Вистар с массой тела 400-500 г. в возрасте 4-5 месяцев. Животные были разделены на 3 группы: 1-я - контрольная, Н-я - группа сравнения и Ш-я - экспериментальная (по 18 крыс в каждой). У животных П-ой группы (группы сравнения) дефект заполняли чистым недеминерализованным костным матриксом «Остеодент», а у Ш-ей (экспериментальной) группы дефект заполняли недеминерализованным костным матриксом «Остеодент», содержащим rhBMP-2. В контрольной группе дефект заживал под сгустком.

Из эксперимента животные выводились в следующие сроки: 1, 2, 3 месяца, по 6 крыс из каждой группы.

После выведения всех животных из эксперимента проводили КТ исследование черепа крысы. Следующим "этапом выполняли сегментарную остеотомию свода черепа, после чего выделенный сегмент свода черепа фиксировали в формалине и помещали в пробирку для морфологического исследования. Исследования проводили в течение первых 10 дней после получения материала.

6. Техника операции

Все операции выполнялись под наркозом Золетил 100 0,2 мл. Во время операции животные фиксировались в положении на животе. После трехкратной обработки операционного поля 70% раствором спирта в области свода черепа крысы выполнялся кожный разрез длиной 3 см до кости. Мягкие ткани гладилкой отсепаровывались от свода черепа и фиксировались пинцетом. В центре свода черепа при помощи физиодиспенсера с охлаждением стерильным физиологическим раствором при температуре 5°С и трепана выполнялся бикортикальный костный дефект диаметром 8 мм.

Образованный дефект высушивался при помощи стерильных марлевых салфеток и заполнялся чистым недеминерализованным костным матриксом либо насыщенным рекомбинантным морфогенетическим белком кости, заготовленным заранее (ортотопическая имплантация). Рана ушивалась узловыми швами наглухо. Кожный шов обрабатывался раствором бриллиантовой зелени.

В день операции и на следующий день все животные получали антибиотикотерапию: линкомицина гидрохлорид по 80 мг. в/мышечно. Животные содержались в клетках по 5 особей. Из эксперимента их выводили путем передозировки наркоза (соблюдались требования «Европейской

Конвенции о защите позвоночных животных, используемых в экспериментах или в иных научных целях» от 18.03.1986 г.).

7. Оценка состояния животных после операции

Для оценки клинического состояния и внешнего вида раны были отобраны хорошо известные признаки послеоперационных явлений: повышение температуры тела, отек мягких тканей, увеличение регионарных лимфоузлов, наличие гиперемии кожи в области линии швов, несостоятельность швов.

Клиническую картину оценивали по набору этих клинических признаков по системе «Да» и «Нет», что соответствует числовым значениям «1» и «0», и заносили результаты в таблицы в процентах. Оценку течения раневого процесса у всех животных всех групп производили на 1-ые, 3-й, 5-ые и 7-е сутки после операции. На 7-ые сутки после операции снимали швы.

8. Компьютерная томография

Для оценки объема и качества восстановленного дефекта выполнялась компьютерная томография черепа крыс с последующей оценкой плотности костной ткани по шкале Хаунсфилда.

Компьютерная томография — это особый вид рентгенологического исследования, которое проводится посредством непрямого измерения ослабления или затухания, рентгеновских лучей из различных положений, определяемых вокруг обследуемого объекта.

КТ-сечения ориентированы вертикально по отношению к оси тела. Они называются аксиальными или поперечными срезами. Для каждого среза рентгеновская трубка поворачивается вокруг пациента, толщина среза выбирается заранее. КТ-сканер работает по принципу постоянного вращения с веерообразным расхождением лучей. При этом рентгеновская трубка и детектор жестко спарены, а их ротационные движения вокруг сканируемой

области происходят одновременно с испусканием и улавливанием рентгеновского излучения. Таким образом, рентгеновские лучи, проходя через объект, доходят до детекторов, расположенных на противоположной стороне. Веерообразное расхождение происходит в диапазоне от 40° до 60°, в зависимости от устройства аппарата, и определяется углом, начинающимся от фокусного пятна рентгеновской трубки и расширяющимся в виде сектора до наружных границ ряда детекторов.

Исследование было выполнено в Красногвардейской ветеринарной клинике на аппарате Toshiba Asteion S4 по стандартной методике: толщина томографического среза 1 мм, обработка информации по программе мультипланарной и объемной поверхностной реконструкции в режиме сканирования томографических срезов Inner ear, при напряжении на трубке 110 кв и 120 мАс.

9. Морфологическое исследование

Гистологическое исследование образцов свода черепа, включавших область хирургического вмешательства, проводили непосредственно после биопсии. Материал помещали в 10% раствор формалина на фосфатном буфере на 72 часа, после чего в течение 24 часов образцы ткани промывали в проточной воде. Декальцинацию проводили электролитическим способом в перенасыщенном растворе ЭДТА. По завершении процесса образцы ткани промывали в проточной воде в течение 24 часов. Промытые и обсушенные на фильтровальной бумаге кусочки помещали на 24 часа в 50% раствор этанола. После стандартной гистологической проводки образцы тканей заливали в парафин («Гистомикс», Биовитрум), используя гистологические заливочные кольца (Биовитрум).

Серийные срезы получали на микротоме Microm (7 мкм). Для изучения срезов тканей использовались следующие методы:

Обзорные окраски - гематоксилином и эозином по Майеру;

13

Для выявления специфических процессов образования костной ткани и ее резорбции препараты окрашивали по Массон-Голднер (BioOptica, Italy).

После окраски препараты заключали в монтирующую среду и высушивали в течение 2 дней при комнатной температуре.

Интенсивность костеобразования и характер изменений в области костного имплантата оценивали в баллах по 3-х балльной системе:

1 балл — слабое костеобразование (область костного дефекта заполнена рыхлой волокнистой тканью и фрагментами костного имплантата, представленными безостеоцитными костными балками);

2 балла — умеренное костеобразование (в проекции дефекта имеются очаги новообразованной зрелой костной ткани вокруг костного имплантата или краевое костеобразование на основе хрящевой ткани с остатками костного имплантата);

3 балла — выраженное костеобразование (область дефекта заполнена новообразованной зрелой костной тканью без остатков костного имплантата).

Исследование проводилось совместно с кандидатом медицинских наук Волковым А. В. (лаборатория «Гистолаб»).

10. Документирование

Фотодокументирование проводилось на микроскопе Leica DM2500 с фотокамерой Leica DTC295. В качестве метода рандомизации использовалась следующая схема, если не было необходимости в прицельном изучении объекта, то с помощью генератора случайных чисел Random определялись 5-7 номеров стекол (например, 12, 18, 22, 25, 38 из 50 стекол в серии), изучению и документированию подвергался каждый 3 срез, если качество было не удовлетворительное, то исследовался последующий и так далее.

11 .Статистический анализ полученных данных

Результаты лабораторных исследований обрабатывали методами вариационной статистики с определением средней величины, ее ошибки, критерия Стьюдента для множественных сравнений, используя программы EXCEL (MS Office). Сравнение средних показателей трех независимых выборок проводили, используя критерий х2 с поправкой Yates на непрерывность выборки. С учетом количества выборки определяли вероятность различий Р. Статистически достоверным считали значения при Р <0,05 (ГланцС, 1999).

Результаты собственных исследования и их обсуждение

Результаты, полученные в эксперименте со стромальными клетками-предшественниками костного мозга, подтвердили, что, несмотря на наличие рекомбинантного человеческого морфогенетического белка кости rhBMP-2 в составе остео пластического материала, клетки-предшественники фибробластов адгезируются на его поверхности {рисунок 1).

а б

Рисунок 1. Внешний вид остепластического материала с клетками-предшественниками фибробластов на поверхности (под микроскопом, увеличение 120 раз., а - образец №1, б - образец №2)

На данных рисунках в поле зрения отчетливо видны клетки на поверхности остеопластического материала. Клетки различной формы расположены в хаотичном порядке на разных участках материала.

С помощью метода сканирующей электронной микроскопии анализировались образцы материала перед началом эксперимента со стромальными клетками и после инкубации в ростовой среде с клеточной культурой фибробластов, была получена визуальная картина микрорельефа поверхности материала и подтверждение факта адгезии фибробластов, предшественников костного мозга. Результаты исследования показали, что характеристика поверхностной структуры изучаемого остеопластического материала оптимальна и отвечает требованиям к микрорельефу.

Рисунок 2, 3. Поверхность гранул остеопластического материала «Остеодент» (увеличение 6000 раз и 3000 раз)

Рисунок 4, 5. Поверхность гранул препарата «Остеодент» с фибробластами (увеличение 2000 раз и 8000 раз)

На данных рисунках представлена поверхность остеопластического материала, при увеличении 6000 раз и 3000 раз {рисунок 2, 3), 2000 раз и 8000 раз {рисунок 4, 5) с фибробластоподобными клетками округлой, вытянутой формы, в зависимости от рельефа поверхности, с выростами эктоплазмы (Волков О.В., 1987).

Визуальная оценка клеток-предшественников на остеопластическом материале с помощью сканирующего электронного микроскопа показала, что наличие гЬВМР-2 не препятствует прикреплению и фиксации клеточного материала на недеминерализованном костном матриксе. Данное исследование проводилось в лаборатории анатомии микроорганизмов ФГБУ НИИ им. Н.Ф. Гамалеи, руководитель лаборатории - д.м.н. Л.В. Диденко.

После завершения лабораторной части исследования приступили к эксперименту на животных.

Для проведения экспериментальной части нами была разработана экспериментальная модель критического дефекта в своде черепа крысы. Используемая нами экпериментальная модель дефекта, по мнению зарубежных исследователей, является максимально информативной и приближенной к естественным условиям функционирования остеоиндуктивного биоматериала в организме реципиента. Моделирование процесса закрытия дефекта дает возможность исследовать плотность, объем и качество образующегося регенерата и оценить остеоиндуктивные характеристики в цифровых значениях. Так же исследовалось влияние рекомбинантного человеческого морфогенетического белка кости гЬВМР-2 в составе недеминерапизованного костного матрикса на процесс костеобразования как в зоне хирургического вмешательства, так и в сегменте в целом.

В послеоперационный период животным производили антисептическую обработку раны раствором хлоргексидина 0,05% на первые, третьи, пятые и седьмые сутки. У животных всех групп швы снимали на

17

седьмые сутки после операции. При осмотре отмечали признаки послеоперационных воспалительных явлений и проводили оценку течения раневого процесса на первые, третьи, пятые и седьмые сутки после операции и заносили результат в таблицы. Клиническая картина была оценена по набору клинических признаков, которые оценивали по системе «Да» и «Нет», что соответствовало баллам 1 и 0, и выражали в процентном соотношении.

Таблица 1

Частота встречаемости клинических признаков в послеоперационном периоде.

Контрольная группа Группа сравнения Экспериментальная группа

Клинический признак (симптом) Сутки Сутки Сутки

1 3 5 7 1 3 5 7 1 3 5 7

% признаков % признаков % признаков

Повышение температуры тела 66,7 33,3 11,1 5,6 94,4 77,8 38,9 16,7 94,4 83.3 33,3 11,1

Отек мягких тканей 72,2 55,6 33,3 1Ы 83,3 77,8 44,4 0 72,2 83,3 38,9 0

Увеличение регионарных лимфоузлов 0 0 0 0 5,6 5,6 5,6 5,6 5,6 5,6 5,6 5,6

Наличие гиперемии 11,1 5,6 5,6 0 27,8 66,7 27,8 11,1 27,8 61,1 27,8 5,6

Несостоятельность швов 0 0 0 0 0 0 0 11,1 0 0 0 5,6

Наличие гематомы 0 0 11,1 11,1 0 0 0 0 5,6 5,6 5,6 0

Нагноение раны 0 0 0 0 0 0 0 11,1 0 0 0 5,6

На первые сутки разница частоты встречаемости клинических признаков в экспериментальной группе и группе сравнения составила 4,5% в пользу экспериментальной группы.

На третьи сутки разница частоты встречаемости клинических признаков составила 8%.

На пятые сутки разница частоты встречаемости клинических признаков составила 5,8%.

На седьмые сутки разница частоты встречаемости клинических признаков составила 4,2%.

После проведенного анализа полученных данных выраженности клинических проявлений у лабораторных животных после вмешательства статистически значимых различий между группой сравнения и экспериментальной группой выявлено не было. Следовательно, наличие гЬВМР-2 в составе костного материала не влияет на степень и течение воспалительного процесса.

Оценку результатов компьютерной томографии проводили по площади восстановления костного дефекта в следующие сроки: 1, 2, 3 месяца. Площадь созданного дефекта в своде черепа крысы составляла 50,24 мм2. Данную величину приняли за «0». После проведенной компьютерной томографии измеряли диаметр невосстановленного дефекта и вычисляли его площадь, после чего переводили в проценты и анализировали процент восполнения костного дефекта.

Через 1 месяц в экспериментальной группе дефект был восстановлен на 45%, в группе сравнения на 41%, в то время как в контрольной группе восстановления костного дефекта выявлено не было.

Через 2 месяца в экспериментальной группе дефект восполнился на 65%, в группе сравнения на 59%, в контрольной группе на 15%

20

Через 3 месяца в экспериментальной группе дефект восстановился на 91%, в группе сравнения на 87%, в контрольной группе на 17%

Качество восстановленного костного дефекта оценивалось по шкале плотности Хаунсфилда.

Через 1 месяц в экспериментальной группе плотность восстановленного костного дефекта составила 245, в группе сравнения 223, в контрольной группе 53.

Через 2 месяца в экспериментальной группе плотность восполненного костного дефекта составила 355, в группе сравнения 282, в контрольной группе 136.

Через 3 месяца в экспериментальной группе плотность восстановленного костного дефекта составила 364, в группе сравнения 303, в контрольной группе 198.

Исходя из полученных данных компьютерной томографии, выявлены различия между контрольной и опытными группами в пользу последних. Между экспериментальной группой и группой сравнения статистически значимых различий обнаружено не было.

Следовательно, наличие рекомбинантного человеческого морфогенетического белка кости гЬВМР-2 в составе остеопластического материала не влияет на площадь восполненной костной ткани. Что же относительно различий между контрольной и опытными группами, то это можно объяснить тем, что сформированный костный дефект <3=8мм. в своде черепа крысы является критическим и не имеет возможности восполниться самостоятельно.

Гистологическое исследование образцов свода черепа, включавших область хирургического вмешательства, проводили непосредственно после биопсии. Материал помещали в 10% раствор формалина на фосфатном буфере на 72 часа, после чего в течение 24 часов образцы ткани промывали в проточной воде. Декальцинацию проводили

электролитическим способом в перенасыщенном растворе ЭДТА. По завершении процесса образцы ткани промывали в проточной воде в течение 24 часов. Промытые и обсушенные на фильтровальной бумаге кусочки помещали на 24 часа в 50% раствор этанола.

В результате проведенного морфологического исследования установлено, что имплантация материала с гЬВМР-2 показывает разницу с группой сравнения в первые 2 срока наблюдения (1 и 2 мес.) в сторону более высокой эффективности образования костной ткани по сравнению с имплантацией материала, не содержащего гЬВМР-2, а также использованная модель критического дефекта костной ткани является адекватной и отвечает требованию к поставленным целям и задачам.

Выводы

1. Содержание рекомбинантного человеческого рекомбинантного морфогенетического белка кости гЬВМР-2 в составе остеопластического материала на основе недеминерализованного костного матрикса во время исследования на биологической модели не препятствует адгезии клеток-предшественников фибробластов на его поверхности.

2. По данным сканирующей электронной микроскопии микрорельеф поверхности остеопластического материала в виде гранул с размерами 700-800 мкм на основе недеминерализованного костного матрикса является оптимальным для адгезии клеток-предшественников костного мозга.

3. Наличие рекомбинантного человеческого морфогенетического белка кости гйВМР-2 в составе остеопластического материала на основе недеминерализованного костного матрикса не влияет на течение раневого процесса в послеоперационном периоде по отношению к группе сравнения.

4. С помощью гистроморфологического метода исследования установлено лучшее качество новообразованной костной ткани в дефекте свода черепа крысы в экспериментальной группе при заполнении дефекта недеминерализованным костным матриксом, насыщенным рекомбинантным человеческим морфогенетическим белком кости гИВМР-2 (2,3 балла) по отношению к группе сравнения при применении чистого недеминерализованного костного матрикса (2 балла). Структурно оформленная костная ткань получена при применении рекомбинантного человеческого морфогенетического белка кости гЬВМР-2 в комплексе с носителем.

5. На основании результатов компьютерной томографии достоверной разницы в площади заполнения дефекта новообразованной костной тканью к сроку 3 месяца между группой сравнения и экспериментальной группой не выявлено.

Практические рекомендации

1. На основании данных сканирующей электронной микроскопии в качестве носителя рекомбинантного человеческого морфогенетического белка кости гЬВМР-2 рекомендовано использовать недеминерализованный костный матрикс «Остеодент» в виде гранул размерами 700-800мкм.

2. Рекомендуемая концентрация рекомбинантного человеческого морфогенетического белка кости гЬВМР-2 в остеопластическом материале составляет 0,6-0,8 мг/см3.

3. Целесообразно применение остеопластического материала, содержащего рекомбинантный человеческий морфогенетический белок кости гЬВМР-2 при восстановлении костных дефектов на верхней и нижней челюстях в случае дальнейшего протезирования с опорой на имплантаты.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Долинер, М.Э. Перспективы использования морфогенетического белка кости в составе остеопластического материала для ускорения остеоиндукции / М.Э. Долинер, А.И. Бычков, А.И. Ситдикова // Dental Forum - 2013. - №4. - С.20-23.

2. Бычков, А.И. Замещение костных дефектов при помощи остеопластического материала, насыщенного морфогенетическим белком кости (rhBMP-2) / А.И. Бычков, М.Э. Долинер // Дентальная имплантология и хирургия. - 2013. - №1. - С.50-53.

3. Бычков, А.И. Изучение остеоиндуктивной активности рекомбинантного морфогенетического белка кости (rhBMP-2) в составе остеопластического материала на основе деминерализованного матрикса в эксперименте / А.И. Бычков, М.Э. Долинер, А.И. Ситдикова, A.B. Волков, O.A. Рачинская // Стоматология для всех. -2013. - №3. - С.16-20.

Список сокращений

БАД - биологически активная добавка

ГАГ - гликозаминогликаны

KT - компьютерная томография

РАН - Российская Академия Наук

СЭМ - сканирующий электронный микроскоп

BMP - bone morphogenetic protein

rhBMP-2 - recombinant human bone morphogenetic protein 2

Подписано в печать: 19.02.2015 Тираж: 100 экз. Заказ №1416 Отпечатано в типографии "Реглет" г. Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77 www.reglet.ru