Автореферат и диссертация по медицине (14.01.14) на тему:Изучение маркеров остеогенеза регенератов костной ткани челюстей после имплантации остеопластических материалов

УДК: 6:

ПАВЛОВ СТЕПАН АНДРЕЕВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ МАРКЁРОВ ОСТЕОГЕНЕЗА РЕГЕНЕРАТОВ КОСТНОЙ ТКАНИ ЧЕЛЮСТЕЙ ПОСЛЕ ИМЛАНТАЦИЙ ОСТЕОПЛАСТИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

14.01.14- «Стоматология» 03.01.04 - «Биохимия»

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 С [.¡АР 2011

Москва - 2011

4839973

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Минздравсоцразвития России

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

УШАКОВ Рафаэль Васильевич

ВАВИЛОВА Татьяна Павловна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Член-корреспондент РАМН доктор медицинских наук, профессор

Панин Андрей Михайлович

Морозов Сергей Георгиевич

Ведущее учреждение:

«Российский государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Росздрава

е о

Защита состоится «/'/» ¿¿¿(Ж^ 2011 года в «/У» часов на заседании диссертационного совета Д 208.041.07 при ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет»

Минздравсоцразвития России по адресу: г. Москва, ул. Делегатская, д. 20/1. Почтовый адрес: 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет»

Минздравсоцразвития России по адресу: 127206, Москва, ул. Вучетича, д. 10а.

Автореферат разослан

»(¡4/ги^ 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук, доцент

О.П. Дашкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Остеопластические материалы широко используются в пародонтологии, челюстно-лицевой хирургии и травматологии с целью оптимизации образования костной ткани (Дробышев А.Ю., 2001; Ленина С.А. с соавт., 2003; Кулаков А.А.с соавт., 2007). Эффективность остеопластических материалов во многом обусловлена наличием в их составе минералов с разными свойствами, а так же коллагеновых белков различных типов (Воложин А.И. с соавт., 1993; Friess W., 1998; Краснов А.П. с соавт., 2004). Однако большинство материалов не обладают прогнозируемыми и достаточно выраженными остеопластическими свойствами, особенно у пациентов со слабым репаративным остеогенезом, в силу наследственных или приобретенных качеств и в результате воздействия различных неблагоприятных факторов (Панин A.M., 2003; Кузнецов Г.В., 2004).

Соблюдение условий остеопластики, наличие многостенного костного дефекта, отсутствие воспалительного процесса, хорошая фиксация материала и сочетание различных материалов между собой позволяет получать наилучшие результаты (Панин A.M., 2003). Вместе с тем, остается много неясных моментов связанных с воздействием биоматериалов на остеогенез (Bruck, S.D., Mueller Е.Р.,1989). В то же время отсутствие на сегодняшний день комплекса оптимальных остеозамещающих материалов, обеспечивающих направленную регенерацию костной ткани, определяет необходимость дальнейших исследований в этом направлении.

Среди биоматериалов, способных перестраиваться является материал «Остеоматрикс», созданный на основе аллокостного коллагена, сульфатированных гликозаминогликанов и гидроксиапатита (Аснина С.А. с соавт., 2004; Панин A.M., 2003; Махова Ф.М., 2008; Лекишвили М.В., Панасюк А.Ф., 2008). Как показали проведённые экспериментальные и клинические испытания, этот материал обладает хорошей биоинтеграцией, высокой биосовместимостью, устойчивостью к биодеградации, способностью

выполнять остеокондуктивную функцию. Вместе с тем, мало изучены остеогенные потенции данных биополимеров (Иванов С.Ю. и соавт. 2003; Панин A.M., 2003; Махова Ф.М., 2008).

Продолжается поиск и создание новых остеопластических материалов и изучение их влияния на остеогенез позволит определить наиболее эффективные остеозамещающие материалы, направленных на образование собственной костной ткани, что является актуальным для практической стоматологии.

Цель настоящего исследования:

Оценить эффективность восстановления структуры костной ткани на ранних и поздних этапах остеогенеза при использовании остеозамещающих материалов, содержащих сульфатированные гликозаминогликаны. Задачи исследования:

1. Изучить в биоптатах костной ткани альвеолярного отростка верхней челюсти крыс содержание инсулиноподобного фактора роста-1, трансформирующего фактора роста-ip, основного фактора роста фибробластов-p и фактора некроза опухоли-а на ранних этапах остеогенеза после имплантации остеопластического материала «Остеоматрикс».

2. В эксперименте оценить процессы минерализации межклеточного матрикса в биоптатах костной ткани верхней челюсти опытных животных по содержанию остеокальцина и щелочной фосфатазы после введения в область дефекта материала «Остеоматрикс» и его модификаций.

3. Исследовать в биоптатах костной ткани верхней челюсти опытных животных содержание факторов роста и белков, участвующих в процессах минерализации после имплантации модифицированного материала «Остеоматрикс» с добавлением бисфосфонатов и повышенного количества кристаллов гидроксиапатита.

4. Сопоставить количество образующихся белков в костных регенератах верхней челюсти опытных животных после имплантации остеопластических материалов, различающихся по составу.

5. Сравнить количество водорастворимых белков и пептидов в костной ткани верхней и нижней челюсти человека в зависимости от пола.

6. По количеству факторов роста, остеопротегерина, фактора некроза опухоли-а, аннексина V, растворимого рецептора активации нуклеации каппа В лиганд, активности щелочной фосфатазы и лактатдегидрогеназы оценить влияние остеопластических материалов «Остеоматрикс» и «Биоматрикс» на созревание костной ткани челюстей в зоне их имплантации.

Научная новизна

Впервые в эксперименте определено количество факторов роста инсулиноподобного-1, фибробластов-р, трансформирующего-^, белков и пептидов, участвующих в остеогенезе в области костного дефекта при имплантации остеозамещающих материалов, состоящих из коллагена и сульфатированных гликозаминогликанов. Показаны более выраженные остеокондуктивные свойства данных полимеров через неделю после имплантации.

Модификация биоматериала «Остеоматрикс» опосредованное дополнительным введением кристаллов гидроксиапатита и органической небелковой составляющей - бисфосфонатами, приводит к индуцированию синтеза факторов роста - ИФР-1 и ТФР-ф и увеличению количество остеокапьцина и щелочной фосфатазы. Ещё большему росту количества исследованных факторов роста и белков, участвующих в минерализации, в регенератах костной ткани животных в эти сроки, способствовал новый остеозамещающий материал «Остеоиндуцин».

Впервые доказано, что количество белков, участвующих в ремоделировании интактной костной ткани верхней и нижней челюсти человека различно. На содержание исследованных показателей влияет

половая принадлежность. Для лиц женского пола характерна активность щелочной фосфатазы и повышенное количество белка остеопротегерина, блокирующего остеокластогенез. Практическая значимость работы

Полученные данные могут использоваться в практической стоматологии для предварительной оценки успешности установки пациенту внутрикостных дентальных имплантатов и других оперативных вмешательств, связанных с предварительной имплантацией остеозамещающих материалов, содержащих коллаген и сульфатированные гликозаминогликаны. Следует учитывать, что вторичный остеогенез в участках замещения остеопластическими материалами, содержащих коллаген и сульфатированные гликозаминогликаны через 3 месяца на нижней и 6 месяцев на верхней челюсти полностью не завершается. В случае имплантации материала «Остеоматрикс» в эти сроки синтез белков, участвующих в ремоделировании костной ткани челюстей человека происходит более интенсивно.

Наилучший остеоиндуктивный эффект на ранних сроках формирования костного регенерата достигается в случае имплантации биоматериалов, содержащих аллокостный коллаген, сульфатированные гликозаминогликаны с увеличенным количеством гидроксиапатита и включением бисфосфонатов, а также имеющих полисахаридную основу. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Имплантация остеозамещающих материалов «Остеоматрикс», «Остеоматрикс»+ГАП, «Остеоматрикс»+БФ, «Биоматрикс» и «Остеоиндуцин» в область дефекта альвеолярного отростка верхней челюсти крыс сопровождается изменениями в количестве факторов роста ИФР-1, ТФР-1р, оФРФ-р, остеогенного цитокина ФНО-а, остеокальцина и щелочной фосфатазы в разные сроки остеорепарации, и их содержание в костных регенератах существенно отличается от данных полученных у животных, которым не проводили имплантацию остеозамещающих материалов.

2. Образование факторов роста и белков, участвующих в минерализации на ранних этапах формирования костного регенерата зависит от вида остеозамещающих материалов, содержащих аплокостный или ксенокостный коллаген и разное количество минеральных компонентов.

3. После имплантации остеопластических материалов «Биоматрикс» и «Остеоматрикс» в альвеолярный отросток верхней и нижней челюсти человека через 6 и 3 месяца соответственно, процесс остеогенеза не завершается, о чём свидетельствует увеличение водорастворимого белка, высокая активность щелочной фосфатазы, повышенное содержание оФРФ-Р и аннексина V. Процесс остеогенеза сочетается с остеорезорбцией, активируемой повышенным количеством

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в практическую деятельность поликлиники взрослого отделения хирургической стоматологии на базе стоматологического комплекса МГМСУ, а также используются в научном и педагогическом процессах на кафедрах хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии ФПДО и биохимии МГМСУ, кафедры стоматологии РМАПО. Личный вклад

Автором лично выбрана тема и инициированно проведение данной работы, организовано выполнение всех экспериментальных изысканий на 72 животных, определены методы исследования и этапы выполнения. Автором обследовано 40 пациентов, которым имплантировали в костную ткань верхней и нижней челюсти остеопластические материалы «Остеоматрикс» и «Биоматрикс». Проведён анализ полученных результатов, сделаны научные выводы.

Апробация работы

Результаты исследования докладывались на 10-ом Международном

конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке», РУДН (Москва, 2009), на

заседаниях кафедр хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии ФПДО, детской хирургической стоматологии, госпитальной хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, биохимии МГМСУ, кафедры стоматологии РМАПО.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 3 публикации - в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Объём и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 135 страницах машинописного

текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы, глав собственных исследований и обсуждения результатов исследования; выводов, практических рекомендаций и списка литературных источников, который включает 150 источников, из них 100 отечественных и 50 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 14 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные исследования проводились на кафедре биохимии МГМСУ (заведующая кафедрой, д.м.н., профессор Т.П. Вавилова) в тесном сотрудничестве со специалистом ООО «Конектбиофарм», доктором биологических наук А.Ф. Панасюком.

Все выполненные исследования поделены на 2 части. В первой части представлены результаты исследований проведённых in vivo на лабораторных животных, которым в дефект альвеолярного отростка верхней челюсти были имплантированы остеозамещающие материалы с разным составом. Во второй чатси описаны результаты исследования состояния костного регенерата после

имплантации пациентам остеозамещающих препаратов «Остеоматрикс» и «Биоматрикс».

В эксперименте было использовано 72 беспородных крыс-самцов весом 350-400 г., содержащихся на стандартном рационе вивария, с достаточным освещением и вентиляцией в специальных пластмассовых клетках, закрывающихся металлической сеткой. Опытных животных разделили на пять групп, в зависимости от вида имплантируемого остеозамещающего материала - «Остеоматрикс», «Биоматрикс», Остеоматрикс»+бисфофсфонаты (БФ), «Остеоматрикс»+гидроксиапатит (ГАП), «Остеоиндуцин». Животным 6-ой группы (контрольной) остеозамещающий материал в область дефекта не имплантировали, и рана заживала под сгустком. В состав остеозамещающего материала «Остеоматрикс» входили аллокостнй коллаген, сульфатированные гликозаминогликаны (сГАГ) и ГАП; материала «Биоматрикс» - ксенокостнй коллаген и сГАГ; материала «Остеоиндуцин» - частицы ГАП, сорбированные на полисахаридной матрице.

Методы работы с экспериментальными животными. Костный дефект моделировали на верхней челюсти крыс путём удаления первых моляров. Перед оперативным вмешательством осуществлялась премедикация животных всех опытных групп седативным препаратом «Ветранквил» в дозе 0,0175 мл 1%-го раствора на 1г веса животного. Операцию удаления моляров с правой и левой сторон проводили под эфирным наркозом. После имплантации биоматериалов свободные лоскуты слизистой оболочки раны репозировали и далее дефект сверху закрывали стерильной тонкой коллагеновой плёнкой. Все оперативные мероприятия проводились в условиях стерильности и соблюдения правил антисептики. Животных выводили из опыта через 7 и 14 дней после имплантации остеопластического материала с соблюдением правил эвтаназии, согласно Хельсинскому соглашению, принятом в 1973 году.

Методы получения образцов костной ткани человека. Образцы костной ткани верхней и нижней челюстей человека были получены у 40 пациентов

(20 женщин и 20 мужчин), средний возраст которых составил 42,8±Ю,2 лет, не имеющих выраженной патологии, при проведении операций синус-лифтинг, заполнении дефектов челюстей и восстановления высоты альвеолярного отростка при отсроченной дентальной имплантации. Забор образцов костной ткани у пациентов проводился с помощью костной ловушки «Anthogyr» во время подготовки костного ложа для имплантации остеопластических материалов, и через 3 месяца на нижней челюсти и 6 месяцев на верхней челюсти во время операции формирования костного ложа под имплантат.

Лабораторные методы исследования. Фрагменты костной ткани альвеолярных отростков опытных животных и человека, очищали от мягких тканей, отмывали в физиологическом растворе от крови, растирали в фарфоровой ступке с кварцевым песком на холоду в соотношении 1:1. Растворимые белки экстрагировали 0,5 М раствором №С1 в соотношении 1:10. Полученные гомогенаты центрифугировали при 3000 об./мин в течение 15 мин. и определяли в супернатантах спектрофотометрическим методом содержание общего белка, активность ЛДГ и ЩФ, иммуноферментным количество ИФР-1, ТФР-10, оФРФ-0, ФНО-а, аннексина V, Нсу, ОРв, бЛАЖЬ, ЩФ, остеокальцина.

Результаты исследования обрабатывали с помощью пакета стандартных компьютерных программ для статистического анализа (^аИэйса 6,0». Определяли среднюю арифметическую (М), среднее квадратичное отклонение (БИ), ошибку средней арифметической (т). Достоверность различий исследуемых выборочных данных определяли при помощи критерия Стьюдента (I), между несвязанными группами по критерию Манна-Уитни, в связанных группах по критерию Вилкоксона. Различия считались значимыми при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 1.1. Содержание белков и пептидов в костных регенератах животных после имплантации в дефект верхней челюсти остеопластических

материалов

Наши исследования показали, что образование факторов ротса, пептидов и белков в ранние сроки после имплантации материалов «Остеоматрикс», модифицированного материала «Остематрикс», «Биоматрикс» и «Остеоиндуцин» зависит от входящих в состав компонентов (табл. 1 и 2).

На 7-ой день опыта наибольшее количество оФРФ-р в костных регенератах выявлено после имплантации материала «Остеоиндуцин», которое колебалось в пределах от 16,5 до 23,3 нг/мг ткани, а после имплантации материала «Остеоматрикс»+ГАП в среднем равнялось 15,7±1,55 нг/мг ткани, что было достоверно (р<0,05) выше значений контрольной группы. В то же время в участках имплантации материала «Остеоматрикс» оФРФ-Р в этот срок не определялся, а в участках имплантации «Остеоматрикс»+БФ и «Биоматрикс» количество данного фактора роста достоверно было снижено относительно данных контрольной группы (р<0,05). В этот срок эксперимента в костных регенератах, полученных после имплантации материалов «Остеоматрикс» и «Остеоиндуцин» также не был обнаружен ИФР-1. Вместе с тем, количество ИФР-1 было повышено по сравнению с контролем в костных регенератах верхней челюсти в 3,5 раза после имплантации материала «Остеоматрикс»+ГАП, в 4,7 раза после имплантации материала «Биоматрикс». Определение количества ТФР-1Р в этот срок опыта не выявило достоверных отличий от контроля в случае имплантации материалов «Остеоматрикс», «Остеоматрикс»+ГАП и «Биоматрикс». В то же время после имплантации материала «Остеоматрикс»+БФ количество ТФР-1Р в костных регенератах было достоверно снижено (р<0,05), а после имплантации материала «Остеоиндуцин» достоверно повышено (р<0,05). После имплантации материалов «Остеоматрикс», «Биоматрикс», «Остеоиндуцин» в

Таблица 1

Содержание белков и пептидов в регенератах костной ткани крыс после имплантации остеозамещающими материалами «Остеоматрикс» в различной модификации (М±т)

Группы Контрольная Опытные

«Остеоматрикс» «Остеоматрикс» + ГАП «Остеоматрикс» +БФ

Дни Показатели 7 14 7 14 7 14 7 14

оФРФ-р (нг/мг ткани) 11,2±0,86 0 0 11,5±0,93* А 15,7±1,55* 0 8,27±0,82* 10,2±0,95*

ТФР-1Р (пг/мг ткани) 3183±617 2864±239 2676±228 3272±267 2468±207 5131±403*А 1838±51,2* 2901±378А

ИФР-1 (нг/мг ткани) 1,93±0,70 0, 47±0,17 0 0 6,84±1,01* 3,19±0,46*А 9,05±1,20* 2,75±0,70*ж

Остеокальцин (нг/мг ткани) 6,65±2,47 14,0±2,42* 1,11±0,08** 1,11±0,03* 8,56±1,85 55,5±10,6**а 6,15±0,97 34,0±5,73**а

ЩФ (нг/мг ткани) 3,37±0,17 3,11±0,52 1,23±0,43** 0,99±0,04* 2,11±0,12** 1,35±0,03*а 1,35±0,11** 1,52±0,04*

ФНО-а (пг/мг ткани) 10,2±0,75 0 0 11,2±0,73 А 10,3±1,68 0 9,64±1,43 8,37±1,20*

Достоверность различий **р<0,00; *р<0,05 по сравнению с контролем; Ар<0,05 между сроками заживления раны.

Таблица 2

Содержание белков и пептидов в регенератах костной ткани крыс после имплантации остеозамещающими

материалами «Биоматрикс» и «Остеоиндуцин» (М±ш)

Группы Контрольная Опытные

«Биоматрикс» «Остеоиндуцин»

Показатели /Дни 7 14 7 14 7 14

оФРФ-Р (нг/мг ткани) 11,2±0,86 0 6,74±0,68* 7,34±0,77* 18,8±1,06* 22,5±0,99*ж

ТФР-1Р (пг/мг ткани) 3183±617 2864±239 2549±277 2686±282 6128±482* 3376±313а

ИФР-1 (нг/мг ткани) 1,93±0,70 0,47±0,17А 9,42±1,42* 1,87±0,14*А 0 1,26±0,43а

Остеокальцин (нг/мг ткани) 6,65±2,47 14,0±2,42а 0,30±0,01** 20,7±2,65+а 0,88±0,03** 17,7±3,48а

ЩФ (нг/мг ткани) 3,37±0,17 3,11±0,52 1,29±0,25** 0,76±0,05*а 1,36±0,32** 1,93±0,03*

ФНО-а (пг/мг ткани) 10,2±0,75 0 6,84±1,24* 8,09±1,58* 17,8±1,47* 16,9±1,88*

Достоверность различий **р<0,00; *р<0,05 по сравнению с контролем; Ар<0,05 между сроками заживления раны.

костных регенератах было достоверно (р<0,001) снижено количество белка остеокальцина и ЩФ. Сходные изменения в содержании ЩФ выявлены и в случае имплантации модифицированных образцов остеопластических материалов. Выявленные изменения в содержании остеокальцина и ЩФ отражают сниженный по активности процесс минерализации в зонах имплантации остеопластических материалов.

Определение количества ФНО-а, запускающего процессы резорбции и апоптоза показало, что в костных регенератах опытных животных по сравнению с контролем, наблюдалось достоверное повышение (р<0,05) уровня данного пептида после имплантации материала «Остеоиндуцин», после внедрения материала «Биоматрикс» - снижение количества остеогенного пептида и его отсутствие в случае имплантации материала «Остеоматрикс».

На 14-ый день эксперимента оФРФ-р не определялся в биоптатах костной ткани крыс контрольной группы и в случае имплантации материала «Остеоматрикс»+ГАП, но появлялся при имплантации материала «Остеоматрикс». При этом полученные значения соответствовали показателям животных контрольной группы на 7-ой день опыта. В случае имплантации материала «Биоматрикс» и «Остеоматрикс»+БФ показатели оФРФ-р не имели достоверных отличий по сравнению с 7-ым днём. Только после имплантации материалов «Остеоматрикс»+ГАП и «Остеоматрикс»+БФ отмечалось достоверное (р<0,05) по сравнению с 7-ым днём увеличение количества ТФР-1р, а в случае имплантации материала «Остеоиндуцин» происходило достоверное его снижение (р<0,05) до значений крыс контрольной группы.

Количество ИФР-1 на 14-ый день опыта в биоптатах костной ткани контрольных животных по сравнению с 7-ым днём достоверно (р<0,05) снижалось. Уменьшение содержания этого фактора роста выявлено также в случае имплантации материалов «Биоматрикс», «Остеоматрикс»+ГАП, «Остеоматрикс»+БФ, но полученные данные достоверно отличались (р<0,05) от значений контроля. В случае имплантации материала «Остеоматрикс» присутствие ИФР-1 не было выявлено не только на 7-ой, но и 14-ый дни опыта.

Следует отметить, что через 2 недели после имплантации в дефект верхней челюсти крыс материалов «Остеоматрикс»+ГАП и «Остеоматрикс»+БФ, «Биоматрикс» и «Остеоиндуцин» в костных регенератах возрастает количество белка остеокальцина, в то время содержание этого глнкопротеина в этот срок не менялось после имплантации материала «Остеоматрикс». При этом, количество ЩФ после имплантации либо достоверно снижалось (материалы «Биоматрикс», «Остеоматрикс»+ГАП), либо не менялось (материалы «Остеоиндуцин», «Остеоматрикс», «Остеоматрикс»+БФ).

Сходные изменения в количестве ФНО-а в костных регенератах выявлены между данными контрольной группы и группой крыс, которым имплантировали «Остеоматрикс»+ГАП. В остальных группах животных, содержание ФНО-а на 14-ый день опыта существенно не менялось относительно 7-ого дня эксперимента. Исключение составляют показатели ФНО-а в группе животных, которым имплантировали материал «Остеоматрикс», поскольку он появляется на 14-ый день в биоптатах из области дефекта.

Таким образом, полученные данные показали, что выраженными кондуктивными свойствами на ранних сроках после имплантации обладает остеопластический материал «Остеоматрикс», а биопрепараты содержащие кристаллы гидроксиапатита проявляют более выраженные остеоиндуктивные свойства.

1.2. Исследование количества белков, пептидов и гомоцистеина в биоптатах костной ткани челюстей человека

В практике для восполнения костного дефекта челюстей нередко применяются остеопластические материалы «Остеоматрикс» и «Биоматрикс». В наших исследованиях имплантация остеопластических материалов проводилась как на верхней, так и на нижней челюстях. Перед имплантацией материала были получены образцы костной ткани для исследования количества белков, участвующих в физиологическом процессе ремоделирования. Согласно полученным данным в костной ткани нижней челюсти у пациентов обоего пола

количество общего белка достоверно выше (р<0,05) по сравнению с его содержанием в верхней челюсти, а количество ФНО-а ниже в 2-3,6 раза (табл.3 и 4).

Корреляционный анализ (R Gamma) данных между показателями обеих челюстей человека выявил отрицательную высокодостоверную корреляционную взаимосвязь между изменением количества водорастворимых белков и содержанием ФНО-а (R= -0,45; р=0,02), оФРФ-ß (R= -0,56; р=0,003) и аннексина V (R= -0,44; р=0,02), между активностью ЛДГ и содержанием аннексина V (R= -0,39; р=0,05). Установлена прямая положительная высокодостоверная корреляционная взаимосвязь между содержанием ФНО-а и оФРФ-ß (R=0,65; р=0,0003), аннексина V (R=0,44; р=0,03), остеопротегерина (R=0,38; р=0,05), а также между количеством Hey и аннексина V (R=0,48; р=0,01). Данный анализ позволяет предположить, что в костной ткани изменение содержания ФНО-а влечёт за собой сдвиги в количестве оФРФ-ß, аннексина V и остеопротегерина, а содержание гомоцистеина напрямую зависит от уровня аннексина V.

Следует также отметить существенные различия в содержании исследованных показателей в зависимости от половой принадлежности пациентов. Так, у лиц женского пола, в отличие от мужчин, в биоптатах, полученных как из верхней, так и из нижней челюсти определялось более высокая активность ЩФ и количество остеопротегерина, а у мужчин более высокое количество ФНО-а в биоптатах костной ткани нижней челюсти.

После остеопластики дефекта нижней челюсти у мужчин материалом «Остеоматрикс» через 3 месяца в костных регенератах выявлялось достоверное повышение (р<0,05) активности щелочной фосфатазы, содержания общего белка, оФРФ-ß, аннексина V, OPG и sRANKL. Активность ЛДГ существенно не менялась, и количество Hey и ФНО-а достоверно снижалось (р<0,05) (табл.3).

Таблица 3

Содержание белков и пептидов в регенератах костной ткани челюстей мужчин после остеопластики материалом «Остеоматрикс» (М±ш)

Челюсть Верхняя Нижняя

Сроки забора материала до имплант. через 6 месяцев До имплант. через 3 месяца

Общий белок (мг/г ткани) 3,01±0,37 7,02±0,62* 5,44±0,56 7,33±0,68*

ЩФ (МЕ/ мин -г ткани) 6,44±0,76 43,0±3,48** 8,12±0,60 46,6±4,93*

ЛДГ (МЕ/ мин т ткани) 322±4,10 336±1,41 313±10,2 329±6,28

ФНО-а (пг/мг ткани) 4,24±0,50 4,40±0,43 2,07±0,83 0,81±0,21*

оФРФ-ß (нг/мг ткани) 62,3±6,89 43,1±2,43 40,0±4,08 75,5±4,72*

Hey (мкмоль/г ткани) 77,1±4,34 227±41,8** 78,7±0,75 65,9±2,76*

Аннексии V (пг/мг ткани) 1,35±0,10 1,93±0,18* 0,82±0,10 1,73±0,08*

OPG (пкмоль/г ткани) 0,10±0,03 0,50±0,09** 0,07±0,01 0,18±0,04*

sRANKL (пкмоль/г ткани) 0,39±0,10 0,01±0,009** 0,60±0,22 2,23±0,15*

Vilcoxon Matched Pairs Test при **p<0,001; *p<0,05 до и после проведённой остеопластики

В регенератах костной ткани нижней челюсти женщин после остеопластики материалом «Остеоматрикс» также наблюдалось достоверное увеличение количества водорастворимых белков, оФРФ-ß, аннексина V и активности ЩФ. Имелась также тенденция (р>0,05) к росту количества OPG и sRANKL. Все эти изменения происходили на фоне неизменяющейся активности ЛДГ. Через 6 месяцев после остеопластики верхней челюсти материалом «Остеоматрикс» у пациентов обоего пола достоверно возрастало количество общего белка (в среднем в 2 раза), а содержание Hey, аннексина V, OPG (р<0,001; р<0,05). Активность ЩФ возрастает в 4-6 раз и уменьшается количество sRANKL (р<0,001; р<0,05) (табл.4).

Таблица 4

Содержание белков и пептидов в регенератах костной ткани челюстей женщин после остеопластики материалом «Остеоматрикс» (М±гп)

Челюсть Верхняя Нижняя

Сроки забора материала до имплант. через 6 месяцев до имплант. через 3 месяца

Общий белок (мг/г ткани) 3,36±0,37 6,54±0,55* 5,50±0,77 7,80±0,43*

ЩФ (МЕ/ мин -г ткани) 9,94±1,07 42,3±2,90** 11,6±2,38 31,2±1,69*

ЛДГ (МЕ/ мин -г ткани) 319±2,19 342±6,56* 323±7,02 337±б,45

ФНО-а (пг/мг ткани) 4,90±0,26 4,82±0,56 1,35±0,60 0,42±0,21**

оФРФ-ß (нг/мг ткани) 63,0±3,99 53,0±4,50 49,5±2,20 116±21,0*

Hey (мкмоль/г ткани) 81,1 ±4,47 358±69,1* 71,7±6,31 75,5±8,72

Аннексин V (пг/мг ткани) 1,22±0,15 2,37±0,46* 0,72±0,08 1,94±0,30*

OPG (пкмоль/г ткани) 0,16±0,03 0,57±0,08* 0,20±0,06 0,29±0,12

sRANKL (пкмоль/г ткани) 0,38±0,07 0,13±0,05* 0,58±0,13 1,00±0,бб

Vilcoxon Matched Pairs Test при **p<0,001; *p<0,05 до и после проведённой остеопластики

Полученные данные свидетельствуют о том, что через 3 месяца в области имплантации материала «Остеоматрикс» ещё продолжается активация остеокластов, образование фибробластов и синтез водорастворимых, вероятно, регуляторных белков. Одновременно активируется процесс минерализации, о чём свидетельствует очень высокая активность ЩФ и возрастающее количество кальций-содержащего белка - аннексина V. В зоне регенерации кости через б месяцев после имплантации данного материала процесс резорбции замедляется, и продолжаются реакции активной минерализации.

Через 3 месяца после остеопластики материалом «Биоматрикс», содержащего ксенокостный коллаген и сГАГ, в регенератах костной ткани нижней челюсти у мужчин в 1,5 раза повышалось количество водорастворимых белков (табл.5). Также выявлено достоверное увеличение активности ЩФ (в 2,4

раза), количества оФРФ-ß, аннексииа V, OPG и sRANKL. Увеличение количества этих показателей сочеталось с достоверным снижением содержания ФНО-а и Hey (р>0,05).

Таблица 5

Содержание белков и пептидов в регенератах костной ткани челюстей

мужчин после остеопластики материалом «Биоматрикс» (М±т)

Челюсть Верхняя Нижняя

Сроки забора материала ДО имплант. через 6 месяцев До имплант. через 3 месяца

Общий белок (мг/г ткани) 3,01±0,37 6,74±0,40* 5,44±0,56 7,25±0,40*

ЩФ (МЕ/ мин -г ткани) 6,44±0,76 45,4±6,03* 8,12±0,60 29,0±2,94*

ЛДГ (МЕ/ мин -г ткани) 322±4,10 322±5,85 313±10,2 345±4,60*

ФНО-а (пг/мг ткани) 4,24±0,50 3,66±0,38 2,07±0,83 0,06±0,01*

оФРФ-р (нг/мг ткани) 62,3±6,89 45,7±5,93* 40,0±4,08 95,4±7,22*

Hey (мкмоль/г ткани) 77,1±4,34 181±16,7* 78,7±0,75 59,0±5,64

Аннексии V (пг/мг ткани) 1,35±0,10 1,46±0,12 0,82±0,10 1,30±0,09*

OPG (пкмоль/г ткани) 0,10±0,03 0,10±0,04 0,07±0,01 0,29±0,08

sRANKL (пкмоль/г ткани) 0,39±0,10 0,41 ±0,15 0,60±0,22 1,65±0,15*

Vilcoxon Matched Pairs Test при *p<0,05 до и после проведённой остеопластики

Подобные изменения наблюдаются и у женщин за исключением отсутствия сдвигов в количественном содержании Hey и OPG (р>0,5) (табл.6). Несколько иная картина наблюдалась при исследовании белков и пептидов в костных регенератах, полученных из верхней челюсти после имплантации материала «Биоматрикс». Так, у мужчин через 6 месяцев в костных регенератах достоверно повышалось (в 2 раза) количество водорастворимых белков, в 7 раз активность ЩФ и в 2,3 раза количество Hey (р<0,05). При этом практически на исходном уровне оставалось количество ФНО-а, OPG, sRANKL и аннексина V. В костных регенератах, полученных из верхней челюсти женщин выявлялись схожие изменения в содержании исследованных белков, пептидов и активности

ЩФ, но определялось достоверное повышение активности ЛДГ, количества аннексина V (р<0,05) и Hey (р<0,001) и уменьшение содержания оФРФ-ß (р <0,05).

Таблица 6

Содержание белков и пептидов в регенератах костной ткани челюстей

женщин после остеопластики материалом «Биоматрикс» (М±ш)

Челюсть Верхняя Нижняя

Сроки забора материала ДО имплант. через 6 месяцев ДО имплант. через 3 месяца

Общий белок (мг/г ткани) 3,36±0,37 6,06±0,28* 5,50±0,77 6,63±0,16

ЩФ (МЕ/ мин т ткани) 9,94±1,07 48,3±3,93* 11,6±2,38 25,7± 1,43*

ЛДГ (МЕ/ мин -г ткани) 319±2,19 342±6,89* 323±7,02 333±3,Об

ФНО-а (пг/мг ткани) 4,90±0,26 3,24±0,98 1,35±0,60 0,02±0,01**

ОФРФ-Р (нг/мг ткани) 63,0±3,99 42,0±4,42* 49,5±2,20 87,2±2,66*

Hey (мкмоль/г ткани) 81,1 ±4,47 308±11,3** 71,7±6,31 77,4±6,24

Аннексии V (пг/мг ткани) 1,22±0,15 1,70±0,07* 0,72±0,08 2,10±0,29*

OPG (пкмоль/г ткани) 0,16±0,03 0,28±0,18 0,20±0,06 0,28±0,07

sRANKL (пкмоль/г ткани) 0,38±0,07 0,22±0,04 0,58±0,13 1,71±0,16*

Vilcoxon Matched Pairs Test при **p<0,001; *p<0,05 до и после проведённой остеопластики

Таким образом наши результаты показали, что образование костной ткани после имплантации остеопластических материалов «Остеоматрикс» и «Биоматрикс» в область дефекта челюстей в исследованные сроки не завершается полностью. Наиболее активно протекают процессы как резорбции, так и минерализации межклеточного матрикса происходят после имплантации материала «Остеоматрикс», а синтез исследованных белков и активность минерализации зависят от локализации челюсти и пола человека.

выводы

1. В области костного дефекта верхней челюсти экспериментальных животных после имплантации остеопластических материалов, содержащих сульфатированные гликозаминогликаны, наблюдается отсроченная, отличающаяся от физиологической, реакция клеток. Это проявляется на 7-ой день опыта в отсутствии в костных регенератах факторов роста фибробластов-Р, инсулиноподобного-1, трансформирующего-^, фактора некроза опухоли-а после имплантации материала «Остеоматрикс» и уменьшение количества этих показателей в случае имплантации материала «Биоматрикс»

2. В случае имплантации остеопластических материалов «Остеоматрикс», «Биоматрикс» и «Остеоиндуцин» процесс минерализации в костных регенератах во все сроки исследования существенно изменён, что выражается уменьшением в них количества щелочной фосфатазы, и увеличении содержания остеокальцина как на 7-ой, так и на 14-ый дни опыта, за исключением костного регенерата, сформированного с участием материала «Остеоматрикс» на 14-ый день эксперимента.

3. Повышение количества гидроксиапатита в составе остеопластического материала «Остеоматрикс» на 7-ой день эксперимента вызывает в костных регенератах достоверный рост количества основного фактора роста фибробластов-Р и инсулиноподобного фактора роста-1, а на 14-ый день опыта количества трансформирующего фактора роста-1р и инсулиноподобного фактора роста-1, что свидетельствует об активации деления и дифференцировки остеогенных клеток.

4. Включение в состав остеопластического материала «Остеоматрикс» с добавлением бисфосфонатов способствовало увеличению количества всех исследованных факторов роста, фактора некроза опухоли-а, остеокальцина и щелочной фосфатазы. Данные изменения отражают наличие в костном регенерате верхней челюсти животных как активных процессов образования остеогенных клеток, по-видимому, на фоне деструкции костной ткани.

5. Остеоиндуктивный и минерализующий эффекты в костных регенератах наиболее выражен после имплантации в зону дефекта верхней челюсти крыс остеопластического материала «Остеоматрикс», содержащего повышенное количество гидроксиапатита, а также на фоне отсутствия коллагеновых белков в материале «Остеоиндуцин».

6. Активность щелочной фосфатазы и количество белка остеопротегерина в биоптатах костной ткани верхней и нижней челюсти зависит от пола пациента. Наибольшие значения этих показателей определяются у женщин.

7. Образование факторов роста и белков в костной ткани челюстей человека протекают с разной скоростью, что отражается в более высоком содержании растворимого рецептора активации фактора нуклеации каппа В лиганд, сниженном количестве фактора некроза опухоли-а, основного фактора роста фибробластов-р и аннексина V в нижней челюсти по сравнению с верхней.

8. Через 3 месяца после имплантации материала «Остеоматрикс» в костном регенерате нижней челюсти у пациентов обоего пола наблюдается равновесие между процессами костного ремоделирования - остеосинтезом и резорбцией, что определяется повышением активности щелочной фосфатазы, количества аннексина V, растворимого рецептора активации фактора нуклеации каппа В лиганд и остеопротегерина, а на верхней челюсти через 6 месяцев процессы минерализации преобладают над остеолизисом.

9. В регенератах костной ткани верхней челюсти человека после имплантации материала «Биоматрикс» в область костного дефекта через 6 месяцев выявляется остеорепарация костной ткани, сходная с физиологическим ремоделированием что отражает увеличенное содержание белков аннексина V, гомоцистеина, и высокая активность щелочной фосфатазы. На нижней челюсти через 3 месяца наблюдается снижение количества маркёров костной резорбции и превалирование процессов формирования кости.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ При выполнении экспериментальных работ, связанных с изучением процессов восстановление костной ткани, следует учитывать что, в костной ткани верхней и нижней челюсти человека и крыс имеются частные различия в количестве общего белка, а также отдельных белков и пептидов, участвующих в ремоделировании костной ткани. Модифицированный остеопластический материал «Остеоматрикс» с превалирующим содержанием гидроксиапатита проявил выраженный остеокондуктивный эффект, что позволяет рекомендовать его к применению в клинической практике для восполнения костных дефектов челюстных костей.

В клинической практике, в частности при дентальной имплантации, необходимо учитывать, что после имплантации материалов «Биоматрикс» и «Остеоматрикс» в область костного дефекта на челюстях, процессы остеогенеза через 3 месяца на нижней и 6 месяцев на верхней челюсти полностью не завершаются.

Список работ опубликованных по теме диссертации:

1. Ушаков Р.В., Кочемасов K.M.,Павлов С.А. Определение возможностей проведения ортопедического лечения с использованием имплантатов у пациентов с полной адентией нижней челюсти. /Сб. материалов XI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 20-летию стоматологического факультета Саратовского государственного медицинского университета. «Новые технологии в стоматологии и имплантологии». Саратов,- 2008. С.244-244

2. Панасюк А.Ф., Саващук Д.А., Павлов С.А., Ушаков Р.В. Закрытый синуслифтинг с использованием отечественных остеопластических материалов./ Сб. материалов XI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 20-летию стоматологического факультета Саратовского государственного медицинского университета. «Новые технологии в стоматологии и имплантологии». Саратов.- 2008. С.184-184

3. Ушаков А.Р., Павлов С.А., Ушаков Р.В. Повышение эффективности синуслифтинга при подготовке к дентальной имплантации./Сб. научных трудов XIV международной конференции челюстно-лицевых хирургов и стоматологов «новые технологии в стоматологии» С-П.- 2009. С.201-201

4.Павлов С.А., Вавилова Т.П., Шишкин С.В. Особенности метаболических процессов в костной ткани челюстей крыс./ Материалы научно-практической конференции Центрального федерального округа РФ с международным участием. Инновации и информационные технологии в диагностической и лечебно-профилактической и учебной работе клиник. Тверь - 2009. С.229-229

5.Павлов С.А. Определение факторов роста в костной ткани человека после проведенной остеопластики челюстей остеоиндуктивным материалом./ Материалы X Международного конгресса «Здоровье и образование и XXI веке» «Инновационные технологии в биологии и медицине» 2009. С.826-826

6. С. Шишкин, С. Павлов, Т. Вавилова, О.Ненадова «Сравнительный анализ содержания водорастворимых белков в костной ткани челюстей человека и крысы»// Ж. Cathedra - стоматологическое образование. -2010. -JVH.-C. 33-35

7. Вавилова Т.П., Митронин A.B., Павлов С.А. «Исследование содержания факторов роста и фактора некроза опухоли-а в биоптатах костной ткани альвеолярных отростков челюстей крыс после имплантации гидроксиапатит-содержащими материалами, фиксируемых на различных носителях»// Ж. Эндодонтия Today. - 2010. - №3. - С. 7-10

8. Т.П. Вавилова, Р.В. Ушаков, С.А. Павлов Исследование реакции клеток костной ткани челюстей на имплантацию остеозамещающего материала «Остеоматрикс»// Ж. Пародонтология. — 2011. - №1. - С. 31-34

Объем: 1,0 усл.п.л. Тираж: 120-экз. Заказ № 332 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru