Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Конструирование комбинированных вакцин и иммуноферментных тест-систем для профилактики и диагностики управляемых инфекций

На правах рукописи

НИКОЛАЕВА Алевтина Максимовна

I I

КОНСТРУИРОВАНИЕ КОМБИНИРОВАННЫХ ВАКЦИН И ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ДИАГНОСТИКИ УПРАВЛЯЕМЫХ ИНФЕКЦИЙ (ДИФТЕРИЯ, СТОЛБНЯК, КОКЛЮШ, ГЕПАТИТ В)

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

I

I I

Челябинск-2003

Работа выполнена в ФГУП МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор В.Ф. Петров

Официальные оппоненты:

академик РАН, профессор В.А. Черешнев

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор H.H. Кеворков

доктор биологических наук профессор Э. А. Имельбаева

Ведущая организация:

доктор медицинских наук, профессор О.Л. Колесников

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

г. в

часов

Защита диссертации состоится « г> 2003

на заседании Диссертационного Совета Д-208.117.03 при Челябинской государственной медицинской академии по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан

« f » W^JÜL--

2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Л.Ф. Телешева

^ооН

I

Актуальность проблемы

Вакцинопрофилактика является одним из самых надежных, действенных и, в то же время, экономически эффективных средств современной медицины. Успешная реализация программы ВОЗ по ликвидации оспы в мире резко повысила престиж вакцинации. В 1974 году была принята «Расширенная программа иммунизации» (РПИ), выполняя которую все страны добились впечатляющих успехов в предупреждении основных инфекционных заболеваний.

Вместе с тем, возможности вакцинопрофилактики далеко не исчерпаны не только в отношении заболеваний, пока еще не входящих в круг управляемых, но и в отношении таких инфекций, как коклюш, корь, дифтерия, краснуха, паротит, гепатит В. Во всем мире от инфекций, потенциально управляемых методами иммунопрофилактики, ежегодно погибает 12 миллионов детей, число детей, ставших инвалидами, а также расходы на лечение вообще подсчитать невозможно (Медуницын Н.В., 1999; Таточенко В.К., Озерецковский H.A.,

Таким образом, в ближайшей перспективе мы не вправе ожидать снижение числа инфекций, подлежащих активной иммунопрофилактике. Так, уже сейчас в первые 2 года жизни ребенок получает более 15 инъекций. Более того, предполагается, что календарь прививок 2025 года будет включать вакцинацию против 35-40 инфекций (Покровский В.И., Семенов Б.Ф., 1999). Расширение числа инфекций, контролируемых специфической профилактикой, обусловливает необходимость максимально широкого использования различных комбинаций вакцинных препаратов. В связи с этим, одной из стратегических задач федеральной целевой программы «Вакцинопрофилактика на 1999-2000 гг. и на период до 2005 г.» является проведение исследовательских и опытно-конструкторских работ по созданию новых отечественных комбинированных вакцин, отвечающих национальным стандартам и требованиям ВОЗ (Онищен-ко Г.Г., 1998 г.).

2001).

Особенно актуальными являются исследования по созданию комбинированных вакцин с включением в них компонента со специфической направленностью против гепатита В.

Вирусный гепатит В, характеризующийся тяжелыми, потенциально летальными осложнениями, такими как цирроз и первичный рак печени, продолжает оставаться серьезной проблемой современного здравоохранения. У новорожденных гепатит В в 90 % случаев принимает хроническое течение, при заражении на первом году жизни - в 50 %, у взрослых - в 5-10 %. Это указывает на первостепенную важность защиты детей самого раннего возраста (Онищен-ко Г.Г., Шахгильдян И.В., 2000; Шахт иль дян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г., 2003; Chang М.Н. etal., 1997).

В связи с этим, в соответствии с рекомендациями ВОЗ, отечественным календарем прививок предусмотрена вакцинация против гепатита В всех новорожденных и детей первого года жизни.

Выполнение этой программы может быть в значительной мере упрощено при объединении вакцины гепатита В (ВГВ) с другими вакцинами (АКДС, АД С) в комбинированных препаратах. Положительный опыт по применению вакцин такого класса получен за рубежом (Andre F.E, 1996; Papaevangelou G., 1998).

Успех программ вакцинопрофилактики во многом определяется эффективностью эпидемиологического надзора за управляемыми инфекциями, в котором важная роль принадлежит серологическому мониторингу специфического ангиинфекционного иммунитета (Медуницын Н.В., 2000-2001; Онищенко Г.Г., 2002; Фельдблюм И.В., 2002).

Необходимость определения иммунного статуса населения для систематической оценки прививочной работы и осуществления постоянного контроля за эпидобстановкой требуют разработки новых диагностических препаратов со стандартизованными свойствами, пригодных как для проведения массовых об-

следований в очагах и определения напряженности иммунитета в процессе вакцинации, так и оценки качества новых профилактических препаратов.

Современным требованиям эпидемиологической практики в значительной степени отвечает иммуноферменгный анализ (ИФА), который стал одним го ведущих в области качественных и, что особенно важно, количественных определений в биологических пробах. В настоящее время ИФА включен в число обязательных методов экспресс-диагностики, рекомендованных ВОЗ. Именно ИФА является одним из таких серологических методов, которые могут способствовать организации более совершенной системы диагностики иммунитета, сделать её более эффективной на основе точной инструментальной оценки уровня специфических антител (Березин И.В., Егоров A.M., 1987; Ngo Т.Т., Lenhoff Н.М., 1985; VonHunoIstein С. et al, 2000; Waloiy J., Gizesiowski P., Hryniewicz W., 2000).

Таким образом, анализ опубликованных за последние годы в отечественной и иностранной литературе исследований позволяет сделать заключение, что наиболее актуальными вопросами проблемы специфической профилактики и диагностики управляемых инфекций являются:

создание базовых комбинированных вакцин, направленных на профилактику нескольких инфекций одновременно;

совершенствование лабораторных методов диагностики контролируемых инфекций.

Цель исследования — экспериментально обосновать и разработать конструкции комбинированных вакцин и иммуноферментных тест-систем для профилактики и диагностики управляемых инфекций (дифтерия, столбняк, коклюш и гепатит В).

<

Задачи исследования

!

1. Экспериментально обосновать конструкции комбинированных вакцин, предназначенных для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В.

2. Разработать технологию изготовления комбинированных вакцин для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В с оформлением нормативно-технической документации для их производства.

I

3. Разработать иммуноферменгные тест-системы для количественного определения специфических антител (дифтерийных, столбнячных, анти-НВБ) с оформлением нормативно-технической документации для их производства.

4. Продемонстрировать эффективность применения разработанных тест-систем для оценки поствакцинального иммунитета у людей, оценки им-муногенности вакцин на животных, отбора плазмы доноров с высоким содержанием специфических антител для производства направленных иммуноглобулинов.

Научная новизна

Впервые в эксперименте оценен эффект объединения вакцины гепатита В с вакцинами АДС-М и АКДС. Установлен выраженный потенцирующий эффект как анатоксинов (дифтерийного, столбнячного), так и коклюшного компонента на формирование клеточного и гуморального иммунного ответа против гепатитного компонента комбинированных вакцин. Обнаруженный эффект позволил уменьшить дозу гепатитного компонента в составе разработанных комбинированных вакцин без изменения его иммуногенной активности.

Экспериментально обоснованы и разработаны оригинальные конструкции комбинированных вакцин для профилактики дифтерии, столбняка, гепати-

та В (Бубо-М) и для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша, гепатита В (Бубо-Кок), защищенные патентами РФ № 2130779, № 2130778. На препараты

оформлены Международные заявки № РСТ/1Ш99/00266 (\УО 00/06197. Опубл. 10.02.2000) и № РСТ/1Ш99/00265 (ЧУО 00/07623. Опубл. 17.02.2000).

Разработаны эффективные методические подходы и универсально стандартизированные схемы конструирования высокочувствительных иммунофер-менгных тест-систем (ИФТС), предназначенных для определения антител различной специфичности, отвечающих по своим характеристикам требованиям ВОЗ, предъявляемым к наборам для иммунологических испытаний.

Впервые предложены ИФТС (непрямой вариант ИФА), в которых в качестве ангивидового конъюгата применены Р(аЬ' )г -ф рагменггы аффиноочищен-ных антител сыворотки лошади против человека, меченные пероксвдазой хрена, обеспечивающие высокую чувствительность и специфичность ИФА.

Впервые с применением оригинально сконструированных антигенных маркеров (анатоксины, меченные биотином) на основе авидин-биотинового взаимодействия разработана универсальная конструкция ИФТС для определения дифтерийного и столбнячного антитоксинов в сыворотках как людей, так и животных.

Впервые для определения анти-НВБ предложена оригинальная конструкция, в которой рекомбинангный HBsAg подтип ау\у применен для сорбции на твердой фазе и в составе конъюгата с биотином (Патент № 2206095 РФ).

Впервые при оценке качества ИФТС использован метрологический подход, позволивший разработать эффективную методику количественного иммуноферменгного определения специфических антител в международных единицах (МЕ/мл). На основании предлагаемого алгоритма обработки результатов ИФА разработана унифицированная компьютерная программа количественного определения антител различной специфичности.

Теоретическое и практическое значение работы Теоретическое значение работы определяется обоснованием рациональной методологии конструирования препаратов для диагностики и профилактики управляемых инфекций: сумма предложенных конструктивных подхо-

дов, технологических схем, а также, систем обработки результатов экспериментов способна послужить универсальным инструктивным руководством при создании нового поколения комбинированных вакцин и иммуноферменг-ных тест-систем.

Разработана технология производства первых отечественных комбинированных вакцин, содержащих гепатитный компонент (вакцина Бубо-М, Бубо-Кок) и оформлена нормативно-техническая документация (НТД) для их производства. Вакцина Бубо-М зарегистрирована в установленном порядке (Р № 000071 /01-2000 от 23.10.2000) и разрешена к промышленному выпуску и медицинскому применению.

Вакцина Бубо-Кок успешно прошла государственные испытания и рекомендована к регистрации Комитетом медицинских иммунобиологических препаратов РФ (протокол № 1 от 27.02.03).

Безопасность, высокая иммунологическая активность вакцин Бубо-М и Бубо-Кок, не уступающая, а в большинстве случаев превосходящая используемые в настоящее время вакцины (АКДС, АДС-М, ВГВ), определяет их конкурентоспособность.

Разработана технология производства ИФТС для выявления дифтерийных, столбнячных антител и анги-НВэ. Оформлена нормативно-техническая документация. ИФТС для выявления дифтерийных и столбнячных антител зарегистрирована в установленном порядке и разрешена к использованию в практике здравоохранения (Р № 94/90/10). С 1994 года начат производственный выпуск продукции. ИФТС для выявления анги-НВБ находится в фазе регистрации в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Информативная ценность метода ИФА продемонстрирована эффективным применением 6 сконструированных ИФТС в реальной практике: оценки поствакцинального иммунитета у людей (непрямой вариант для выявления дифтерийных и столбнячных антител, авидин-биотиновый - анги-НВв); отбора плазмы доноров с высоким содержанием антител при производстве проти-

востолбнячного иммуноглобулина и иммуноглобулина против гепатита В (непрямой вариант ИФА); оценки иммуногенности вакцин на животных; определения тигра антител гипериммунных антитоксических лошадиных сывороток (авидин-биотиновый вариант).

Положения, выносимые на защиту

1. Конструкции комбинированных вакцин для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В (Бубо-М, Бубо-Кок), обеспечивающие напряженный иммунитет в отношении каждого составляющего компонента.

2. Технология изготовления комбинированных вакцин (Бубо-М, Бубо-Кок), обеспечивающая получение препаратов, соответствующих требованиям ВОЗ по иммуногенности, безвредности, стабильности при хранении.

3. Принципы конструирования и стандартизации высокочувствительных ИФТС для определения антител различной специфичности. Эффективная методика количественного иммуноферментного определения специфических антител.

4. Применение разработанных тест-систем для контроля эффективности вакцинации против дифтерии, столбняка и гепатита В, а также отбора плазмы доноров для производства специфических иммуноглобулинов.

Апробация диссертации

Результаты проведенных исследований доложены и обсуждены на Всесоюзной конференции «Современные направления создания медицинских ди-агностикумов» (Москва, 1988); Всесоюзном симпозиуме «Иммунобиотехноло-гия-91» (Адлер, 1991); научно-практической конференции «Актуальные проблемы теоретической и практической иммунологии» (Пермь, 1994); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы разработки микробиологических питательных сред и тест-систем» (Махачкала, 1994); Международных конференциях «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (СПб, 1995, 1998, 2003 гг); II, III и IV Российских конференциях «Гепатит В, С и D. Проблемы диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 1999, 2000, 2001);

научно-практической конференции Западно-Уральского региона «Вакцино-профилактика в XXI веке» (Пермь, 2000); Millennium second world congress on vaccines and immunization (Belgium - August 29 - September 3, 2000); научно-практической конференции, посвященной 60-летию кафедры эпидемиологии ПГМА «Актуальные вопросы инфекционной патологии» (Пермь, 2001); VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002); заседаниях Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Пермь 2000, 2001, 2002 гг); первом конгрессе педиатров-инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей» (Москва, 2002).

Диссертация прошла экспертизу и апробирована на расширенном заседании Научно-технического совета ФГУП «Пермское НПО «Биомед», 2003 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 34 научные работы и 2 Международные заявки на патенты, получено 4 патента Российской Федерации.

Структура и объем диссертации

Приведенные в диссертации материалы, выполненные под руководством и при непосредственном участии автора, обобщены в двух разделах: конструирование комбинированных вакцин и конструирование иммуноферменгных тест-систем. Раздел исследования по разработке комбинированных вакцин выполнен совместно с коллективом сотрудников ЗАО НПК «Комбиотех». Автор выражает искреннюю признательность президенту ЗАО НПК «Комбиотех» В.Н. Борисовой и всем участникам совместных исследований.

Диссертация изложена на 254 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, четыре главы собственных исследований, заключение, выводы, приложение. Указатель литературы содержит 349 источников, из них 114 отечественных и 235 иностранных. Текст иллюстрирован 32 рисунками и 65 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований При конструировании комбинированных вакцин и иммунофермент-ных тест-систем были использованы следующие препараты и реагенты

Анатоксин дифтерийный очищенный концентрированный производства ФГУП «Пермское НПО «Биомед», приготовленный в соответствии с производственным регламентом № 553-96.

Анатоксин столбнячный очищенный концентрированный производства ФГУП «Пермское НПО «Биомед», приготовленный в соответствии с производственным регламентом № 1113-01.

Нативная коклюшная суспензия производства ФГУП «Пермское НПО «Биомед», приготовленная в соответствии с производственным регламентом № 136-69.

Поверхностный антиген (подтип ayw) вируса гепатита В (HBsAg), выделенный из штамма-продуцента Saccharomyces cerevisiae, производства ЗАО НПК «Комбиотех», г.Москва (регламент№ 1121-95).

Гель алюминия гидроксида производства ФГУП «Пермское НПО «Биомед», приготовленный в соответствии с производственным регламентом № 409-92.

Пероксцдаза хрена (ПХ) высокоочшценная с RZ не менее 2,7 производства НПО «Биолар» (г. Олайне, Латвия) и фирмы «Sigma», США.

Аввдин-пероксидаза фирмы «Sigma», США.

Препараты сравнения

Анатоксин дифтерийно-столбнячный очищенный адсорбированный с уменьшенным содержанием антигенов жидкий (АДС-М-анатоксин) производства ФГУП «Пермское НПО «Биомед».

Анатоксин дифтерийно-столбнячный очищенный адсорбированный жидкий (АДС-анатоксин) производства ФГУП «Пермское НПО «Биомед».

Вакцина коклюшно-дифтерийно-столбнячная адсорбированная жидкая (АКДС-вакцина) производства ГУЛ «Иммунопрепарат», г. Уфа.

Вакцина гепатита В (ВГВ) рекомбинангная дрожжевая жидкая производства ЗАО НПК «Комбиотех», г. Москва.

MONOLISA® anti-HBs 3.0 - иммуноферменгная тест-система для определения антител к поверхностному антигену вируса гепатита В в сыворотке или плазме, производства фирмы "Sanofi Diagnostics Pasteur", Франция.

"AUSAB® EIA" - иммуноферменгный набор для количественного определения антител (anti-HBs) к поверхностному антигену вируса гепатита В в сыворотке или плазме, производства фирмы "Abbott Laboratories", США.

Методы

Контроль стерильности препаратов, содержания мертиолята, остаточного формальдегида, ионов алюминия в сорбированных препаратах, рН проводили согласно методическим указаниям «Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям» (МУК 4.1/4.2.588-96).

Определение иммуногенности компонентов комбинированных вакцин (дифтерийного, столбнячного, коклюшного и гепатитного компонентов), контроль безвредности комбинированных вакцин на белых мышах и морских свинках, определение полноты сорбции гепатитного, дифтерийного и столбнячного компонентов в комбинированных вакцинах проводили в соответствии с действующими фармакопейными статьями на АДС-М-анатоксин (ФС 42-3358-97), АКДС-вакцину (ФС 42-3362-97) и вакцину гепатита В (ФС 42-3438-97).

Влияние комбинированных вакцин на клеточное звено иммунитета оценивали в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) (Y. Oh-michi et al., 1976).

Иммуноферментный анализ. Определение анти-HBs проводили с помощью тест-систем MONOLISA® anti-HBs 3.0 и "AUSAB® ИА" в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к наборам.

Реакция нейтрализации (РН). Определение тигра дифтерийных и

столбнячных антител в сыворотках крови людей и животных проводили с помощью биологического теста - реакции нейтрализации дифтерийного токсина на морских свинках и кроликах, столбнячного токсина - на белых мышах (Методическое руководство по лабораторной оценке качества бактерийных и вирусных препаратов, 1972).

Реакция агглютинации (РА). Проводили по общепринятой методике с помощью диагностикума коклюшного жидкого для реакции агглютинации производства АООТ «Биомед» им. И.И. Мечникова (г. Москва).

Определение белка в сыворотках и антительных препаратах. Проводили спектрофотометрическим методом по величине экстинции при длине волны 280 им.

Гельхроматография. Выполняли на сефадексе G-200 ("Pharmacia Fine Chemicals", Швеция), используя колонки размером 120 х 2,5 см, в течение 24 часов при постоянной температуре (+18 °С).

Иммуноэлектрофорез. Проводили по варианту классического метода П.Г. Грабаря (1957) в 1 % агаровом геле на веронал-мединаловом буфере.

Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ). Разделение сывороточных белков проводили в 7 % ПААГ при помощи вертикального гель-электрофореза по методу V.K. Laemmli (1970).

Постановка реакции двойной иммунодиффузии. Проводили по методу Оухтерлони в модификации Гусева А.И. (1968).

Статистический анализ результатов. Проведен с использованием методов описательной статистики. Достоверность различий между группами оценивали с помощью парного и непарного /-критерия Стъюденга, критерия Ньюмена-Кейлса. В работе использовали электронные таблицы Excel для Windows (Microsoft), пакет статистических программ "DIASTA" (МГУ, Россия), являющегося версией пакета "STADIA", программу статистической обработки результатов ИФА методом параллельных линий (ГИСК им. Л.А. Тарасевича), программу «БИОСТАТ» для Windows (Microsoft), версия 4.03 (Stanton A. Glantz, 1998).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Конструирование комбинированных вакцин

Трудности создания комбинированных вакцин связаны, прежде всего, с решением проблемы совместимости компонентов, стабильности и сохранения достаточной иммуногенности препарата (Медуницьш Н.В., 1998, 2001; Decker M.D., Edwards K.M., 1995, 1999). При разработке комбинированных вакцин важно было гарантировать, чтобы иммунный ответ на любой из компонентов вакцины не оказался неприемлемым из-за присутствия других.

В связи с этим на первом этапе работы было проведено экспериментальное изучение совместимости и конкурентности трех компонентов (дифтерийного, столбнячного и гепатитного) в составе двух вариантов комбинированных вакцин: АДС-М / ВГВ (10 мкг) и АДС / ВГВ (10 мкг).

В предварительных опытах на животных было установлено, что иммунизация экспериментальными вариантами комбинированных вакцин приводила к формированию напряженного иммунитета в отношении всех компонентов. При этом совместное применение трех вакцинных препаратов заметно усиливало иммуногенность гепатитного компонента: частота положительных серо-конверсий была значительно выше, чем при использовании моновакцины гепатита В (табл.1). В серии экспериментов, предусматривающих заражение иммунизированных животных дифтерийным и столбнячным токсинами, была также установлена более высокая иммуногенность соответствующих компонентов в том случае, когда они входили в состав вакцин, содержащих рекомбинантный HBsAg.

Таблица 1

Результаты изучения иммуногеииой активности гепатитного компонента комбинированных вакцин на белых мышах

Число животных,

Препарат Доза HBsAg, (нг) давших положительный ответ / об- Положительная сероконверсия (%)

щее число животных

250 8/10 80

АДС-М/ВГВ* 125 5/8 65

62,5 8/9 88

250 10/10 100

АДС/ВГВ 125 62,5 8/10 5/10 85 50

250 2/6 30

ВГВ 125 62,5 3/8 0/6 37 0

Примечание: * далее этот вариант вакцины обозначен как Бубо-М.

При изучении совместимости четырех компонентов (дифтерийного, столбнячного, коклюшного и гепатитного) было установлено, что комбинированные вакцины, содержащие НБ$5А§, по иммуногенности превосходят базовые препараты (АКДС, ВГВ). Снижение дозы НВзА§ (с 10 до 5 мкг) в составе комбинированных вакцин также не повлияло на иммуногенность последних по гепатитному компоненту: она сохранялась или даже несколько превышала аналогичный показатель моновакцины гепатита В (табл. 2).

Таблица 2

Результаты изучения иммуногенных свойств экспериментальных серий комбинированных вакцин в опытах на животных

Наименование препарата № серии Дифтерийный, МИЕ/мл Столбнячный, МИЕ/мл Коклюшный, МЗЕ/мл Гепатитный, относительная потенция

АКДС / ВГВ (10 мкг) 1 вариант 1 2 99,8 104,8 707,75 452,28 12,87 12,61 1,4 1,4

АКДС/ВГВ (5 мкг)** 2 вариант 1 2 100,4 107,1 551,03 413,71 11,43 14,08 1,25 1,25

АКДС-вакцина (препарат сравнения) 1 2 72,5 83,9 417,46 209,35 9,00 9,73 -

ВГВ (препарат сравнения) 76 - - - 1,0

Примечание. * в состав экспериментальных и контрольных препаратов входили одни и те же серии монокомпонентов.

** далее этот вариант вакцины обозначен как Бубо-Кок

Вакцины, предназначенные для массовой профилактики широко распространенных инфекций, представляют собой весьма специфический класс иммунобиологических препаратов. В отличие от лекарственных средств терапевтического назначения прямая оценка действия вакцин в значительной степени затруднена и возможна лишь в результате длительных эпидемиологических исследований. В этой ситуации предварительный разносторонний лабораторный контроль имеет весьма важное значение, особенно при разработке новых комбинаций вакцинных препаратов.

В связи с этим на следующем этапе работы для сравнительной оценки предлагаемых конструкций комбинированных вакцин и базовых препаратов (АДС-М, АКДС, ВПВ), помимо регламентированных методов был использован ряд дополнительных тестов.

Известно, что в становлении любой антигенспецифической резистентности наряду с гуморальным важное значение имеет и клеточный иммунитет (Н.В. Медуницын, 1999). Поэтому оценка специфического клеточного иммуни-

тета представлялась нам весьма важной как в плане характеристики иммунобиологических свойств комбинированных вакцин, так и в отношении возможного использования полученных данных для контроля эффективности вакцинации.

Влияние комбинированных вакцин (АДС-М, АКДС, Бубо-М и Бубо-Кок) на клеточное звено иммунного ответа оценивали в реакции гиперчувствительности замедленного типа (У. ОИпнсЫ, 1976). Опытные группы белых беспородных мышей иммунизировали субплангарно комбинированными вакцинами, контрольные - монопрепаратами (коклюшная суспеюия, дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин и ВГВ). Через 7 суток животным опытных и контрольных групп вводили разрешающую дозу соответствующего монопрепарата. Для оценки клеточного иммунного ответа использовались следующие тесты: масса и клеточность регионарных (подколенных) лимфатических узлов, соотношение толщины опытной и контрольной стоп, а также соотношение их масс. Результаты представляли в виде индексов реакции, рассчитывавшихся по формуле:

Ро~Рк х 100 % Рк

где: Ро - показатели опыта Рк - то же в контроле.

Исследования показали, что все препараты оказывают стимулирующее влияние на массу и клеточность регионарных лимфатических узлов, а также достоверно увеличивают размер и массу опытных стоп по сравнению с контрольными (р<0,05).

При этом установлено, что выраженность ответа клеточного звена иммунной системы на гепатитный компонент комбинированных вакцин в значительной мере зависит от остальных составляющих препарата: отмечено достоверное нарастание всех показателей клеточного ответа как при комбинации

HBsAg с дифтерийным и столбнячным анатоксинами, так и при последующем введении в состав вакцины коклюшной суспензии (р<0,05) (табл. 3).

Таблица 3

Клеточный иммунный ответ на компоненты вакцин

Препарат Число живо тных Реакция ГЗТ (индекс реакции, %) Масса и клеточность регионарных лимфатических узлов (индекс реакции, %)

по толщине стопы по массе стопы по массе по количеству ЯСК*

гепатитный компонент

Монопрепарат 8 36,23 ±5,15 14,84 ± 5,23 208,33 ± 83,84 235,87 ±77,36

Бубо-М 15 73,59 ± 4,64 44,29 ±6,71 436,22 ± 124,20 428,19 ± 83,45

Бубо-Кок 16 116,86 ±9,06 69,68 ± 7,58 592,01 ± 86,24 1160,68 ±280,29

столбнячный компонент

Монопрепарат 8 36,64 ± 5,54 9,42 ± 2,04 69,79 ±16,51 75,90 ± 24,27

АДС-М 14 62,15 ±7,08 51,05 ±8,19 219,34 ±37,67 424,93 ± 112,99

Бубо-М 16 59,89 ± 3,69 39,45 ± 6,83 256,86 ± 33,79 271,54 ±32,38

АКДС 14 92,30 ± 15,32 74,75 ± 8,58 531,13 ± 105,21 924,28 ±212,02

Бубо-Кок 15 87,05 ± 10,53 41,21 ±6,11 399,85 ± 65,28 820,25 ± 181,52

дифтерийный компонент

Монопрепарат 14 96,95 ± 7,08 82,91 ±11,22 209,83 ± 54,81 743,18 ± 161,99

АДС-М 7 123,53 ± 19,57 66,94 ± 5,77 316,53 ±48,70 1009,51 ±328,40

Бубо-М 7 100,79 ± 15,89 86,96 ±21,37 548,81 ±256,83 694,68 ±91,01

АКДС 15 129,85 ± 10,13 113,76 ± 10,43 551,01 ±96,43 737,43 ± 227,59

Бубо-Кок 16 123,16 ±7,84 103,17 ±7,19 541,77 ±84,01 1128,27 ±228,20

коклюшный компонент

Монопрепарат 7 64,21 ±5,23 306,73 ± 49,26 208,33 ±46,61 255,22 ±7,13

АКДС 15 114,59 ±8,29 835,29 ± 134,72 655,07 ± 154,21 766,51 ±3,1

Бубо-Кок 15 136,84 ± 8,57 1111,43 ±241,90 550,29 ±76,24 775,46 ±2,09

Примечание. * ядросодержащие клетки

В то же время, сам гепатитный компонент не оказывал значимого влияния на клеточный ответ против остальных составляющих комбинированных вакцин (рХ),05).

В отношении столбнячного анатоксина также был установлен стимулирующий эффект как дифтерийного компонента, так и коклюшной суспензии (р<0,05). При этом иммунный ответ на дифтерийный анатоксин слабо зависел от присутствия в препарате столбнячного компонента (р>0,05) и в достаточной мере стимулировался лишь коклюшной суспензией (р<0,05).

Наконец, коклюшный компонент оказывал выраженное, статистически достоверное потенцирующее влияние на клеточное звено иммунного ответа против каждого из компонентов исследуемых комбинированных вакцин (р<0,05).

Влияние состава комбинированных вакцин на гуморальное звено иммунного ответа оценивалось нами на иной экспериментальной модели - аутбред-ных морских свинках.

В ходе данного этапа работы было показано, что введение в состав комбинированных вакцин гепатитного компонента ни в одном из изученных вариантов не приводило к снижению гуморального иммунного ответа на дифтерийный, столбнячный анатоксины и коклюшный компонент (табл. 4).

В случае использования комбинированных вакцин, содержащих HBsAg, по сравнению с АДС-М и АКДС, в целом наблюдался более высокий уровень дифтерийных и столбнячных антител. При этом, для столбнячных антител эти различия были статистически достоверны (р<0,05). Был также установлен выраженный потенцирующий эффект как анатоксинов, так и, в особенности, коклюшной суспензии на формирование иммунного ответа против HBsAg (р<0,05).

Таблица 4

Гуморальный иммунный ответ на компоненты вакцин у морских свинок

Средняя геометрическая титра

Компоненты АДС-М Бубо-М АКДС Бубо-Кок

Дифтерийный, МЕ/мл 4,81 [3,04-7,62] 7,28 [5,73-9,25] 11,74 [6,16-22,38] 12,88 [6,44-25,77]

Столбнячный, МЕ/мл 3,48 [1,69-7,19] 7,14 [5,15-9,90] 7,89 [5,34-11,64] 13,97 [10,64-18,35]

Коклюшный* - - 259,92 [162,46-415,85] 262,51 [117,41-586,92]

ВГВ 10 мкг Бубо-М ВГВ 5 мкг Бубо-Кок

Гепатитный, мМЕ/мл 343,32 [231,04-510,19] 931,26 [369,34-2348,11] 112,41 [50,61-249,61] 427,24 [309,59-589,59]

Примечание: * величина, обратная разведению сыворотки.

Итак, в условиях разносторонних экспериментов была продемонстрирована полная иммунологическая совместимость антигенов отечественного производства (дифтерийного, столбнячного, коклюшного, НВзА§) в составе предлагаемых комбинированных вакцин - Бубо-М, Бубо-Кок. Установленный потенцирующий эффект позволил снизить дозу гепатитного компонента (с 10 до 5 мкг) в составе 4-х компонентной комбинированной вакцины без уменьшения его иммуногенной активности. Это весьма важно как в плане снижения антигенной нагрузки на организм ребенка, так и уменьшения стоимости достаточно дорогостоящего препарата.

Таким образом, в результате проведенных исследований была экспериментально обоснована возможность получения комбинированных препаратов для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В. Оптимальными были признаны следующие два варианта вакцин: Бубо-М, содержащая в 1 прививочной дозе (0,5 мл): 5 дифтерийного анатоксина, 5 ЕС столбнячного

анатоксина, 10 мкг ре комбинат-ног о HBsAg, 0,3-0,5 мг геля гидроксида алюминия и 0,025 мг мерггиолята натрия; Бубо-Кок, включающая 15 Lf дифтерийного анатоксина, 5 ВС столбнячного анатоксина, 10 млрд. коклюшной суспензии, 5 мкг рекомбинантного HBsAg, 0,3-0,5 мг геля гидроксида алюминия и 0,05 мг мергиолята натрия.

Оригинальность разработанных конструкций вакцин подтверждена патентами РФ (№ 2130778, № 2130779).

Проведенные исследования, доказавшие высокую эффективность вакцин Бубо-М и Бубо-Кок в отношении формирования гуморального и клеточного иммунитета, послужили основанием для разработки технологии их изготовления и оформления нормативно-технической документации (регламенты производства, фармакопейные статьи).

В производственных условиях по разработанной технологии приготовлено 5 серий вакцины Бубо-М и 5 серий вакцины Бубо-Кок.

Изучение физико-химических свойств, стерильности, токсичности, специфической безвредности, подлинности и специфической активности показало, что комбинированные вакцины для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В, полученные в производственных условиях, полностью соответствуют требованиям, предъявляемым к препаратам такого класса ВОЗ и ГИСК им. J1.A. Тарасевича, а по показателям иммуногенности в значительной степени превышают эти требования (рис. 1).

Дифтерийный Столбнячный Коклкхшый компонент .Гепатитныи компонент

компонент, МИЕ/мл компонент, МИВмл МЗВмл Огноситеьная

потенция

□ Требования ВОЗ

Ш Вакцина Бубо-Кок

И АКДС-вакцина

Ш АДС/ВГВ

Рис. 1. Иммуногенность монокомпонентов в составе комбинированных вакцин

К числу важных критериев, определяющих качество препаратов, относится стабильность свойств вакцин при длительном хранении. Как показали результаты наблюдения, разработанная технология обеспечивает получение стабильных вакцин: регламентированные показатели качества при хранении в сроки, установленные для базовых вакцин (АДС-М и АКДС), существенно не изменялись.

Положительные результаты, полученные при контроле вакцин Бубо-М и Бубо-Кок в ГИСК им. Л.А. Тарасевича позволили перейти к клиническим испытаниям по программам, утвержденным Комитетом медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП).

Результаты исследований показали, что введение в состав комбинированных вакцин гепатитного компонента не увеличило реактогенность новых препаратов - вакцин Бубо-М и Бубо-Кок. При этом была подтверждена высокая иммунологическая активность разработанных вакцин (табл. 5-10).

Как видно из представленных данных, в наблюдениях на взрослых и детях подтвердился взаимопотенцирующий эффект совместного введения антигенов, обнаруженный ранее в опытах на животных.

Таблица 5

Иммунный ответ на дифтерийный и столбнячный компоненты вакцины Бубо-М

у взрослых

Группы Число наблю дений Средняя геометрическая титра, МЕ/мл

Дифтерийный компонент Столбнячный компонент

фон после прививки фон после прививки

I(набл ) 30 0,40 7,03** 0,62 15,87**

1 прививка Бубо-М* [0,31-0,52] [5,55 - 8,92] [0,45 - 0,86] [12,82 -19,66]

II (сравн) 21 0,37 4,02** 0,59 4,14**

1 прививка [0,21-0,65] [2,6 - 6,2] [0,36 - 0,96] [2,87 - 5,95]

АДС-М + ВГВ* (20 мкг)

Примечание: * 2 и 3 прививки ВГВ

** различия величины СГТ между I и II группами существенны (р<0,05)

Таблица 6

Иммунный ответ на гепатитный компонент вакцины Бубо-М у взрослых

№ группы Число наблю уровень (МЕ/л) и структура (%) тигров анги-НВв средняя геометрическая

дений <10 10-100 100-1000 100010000 >10000 титра, МЕ/л

I(набл) 30 0 13 47 37 3 658,61 [330,7- 1311,0]

II (сравн) 21 0 33 33 33 0 273,26 [109,7-681,0]

Примечание- * различия величины СГТ между I и II группами не существенны (р>0,05), при этом каждый взрослый I группы суммарно получил 50 мкг гепатитного компонента, а II - 60 мкг.

Таблица 7

Иммунный ответ на дифтерийный и столбнячный компоненты вакцины Бубо-М

у детей

Группы Число наблюдений Средняя геометрическая титра, МЕ/мл

Дифтерийный компонент Столбнячный компонент

фон после прививки фон после прививки

I(набл ) 37 0,45 19,60** 0,43 39,07**

1 прививка' [0,34 - 0,60] [15,31-25,09] [0,32 - 0,56] [31,55-48,39]

Бубо-М *

II (сравн) 30 0,58 26,85** 0,43 23,04**

1 прививка: [0,39 - 0,73] [21,96-32,84] [0,32-0,58] [18,14-29,27]

АДС-М +

ВГВ (10 мкг)»

III (сравн ) 29 0,43 13,48** 0,40 14,28**

1 прививка [0,32 - 0,58] [10,38-17,51] [0,32 - 0,49] [11,33- 17,98]

АДС-М

Примечание. * 2 и 3 прививки ВГВ (доза 10 мкг)

** Дифтерийный компонент: различия величины СГТ между I и П, I и 1П, II и III группами существенны (р<0,05),

** Столбнячный компонент различия величины СГТ между I и II, I и III, II и III группами существенны (р<0.0Т)

Таблица 8

Иммунный ответ на гепатитный компонент вакцины Бубо-М у детей

№ группы Число наблюдений уровень (МЕ/л) и структура (%) титров анти-НВз средняя геометрическая титра, МЕ/л

<10 10-100 100-1000 1000-10000 >10000

I (набл.) 37 0 4 10 27 59 12557*

[6298 - 25035]

II (сравн ) 30 4 0 19 46 31 2729*

[1053-7069]

Примечание. * различия величины СГТ между I и II группами существенны (р<0,05)

Таблица 9

Иммунный ответ ira дифтерийный, столбнячный и коклюшный компоненты вакцины Бубо-Кок

Группы Число наблюдений Средняя геометрическая титра

Коклюшный** Дифтерийный, МЕ/мл Столбнячный, МЕ/мл

I(набл ) Бубо-Кок* 36 219,65 [150,53-320,52] 2,52 [1,85-3,43] 3,68 [2,85-4,74]

II (сравн ) АКДС+ВГВ (Юмкг) 32 156,42 [96,00-254,99] 1,53 [1,12-2,08] 2,30 [1,70-3,12]

III (сравн ) АКДС 25 142,54 [92,03-220,79] 1,76 [1,29-2,38] 3,38 [2,52-4,54]

Примечание' * Вакцины вводили трехкратно в возрасте 3,4 и 5 месяцев; ** единицы измерения - величина обратная разведению сыворотки.

Коклюшный компонент различия величины СГТ между группами не существенны (р>0,05) Дифтерийный и столбнячный компоненты различия величины СГТ между I и III, II и III группами не существенны (р>0,05), различия величины СГТ между I и II группами существенны (р<0,05)

Таблица 10

Иммунный ответ на гепатитный компонент вакцины Бубо-Кок

Группы Число наблюдений Уровень (МЕ/л) и структура (%) титров анти-HBs Средняя геометрическая тигра, МЕ/л

<10 10-100 100-1000 1000-10000

I(набл ) 453,64

36 0 19,44 % 50% 30,56 % [268,33-766,92]

II (сравн ) 32 15,62 % 6,25 % 40,63 % 37,5 % 238,11

(отр) [92,89-610,32]

Примечание: * различия величины СГТ между 1 и II группами не существенны (/>>0,05),

при этом каждый ребенок I группы суммарно получил 15 мкг гепатитного компонента, а И - 30 мкг.

Таким образом, результаты проведенных клинических испытаний показа-

V

ли, что комбинированные вакцины для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В отличаются безопасностью и высокой иммунологической активностью.

Вакцина Бубо-М зарегистрирована в установленном порядке (Р№ 000071 /01-2000 от 23.10.2000) и разрешена к промышленному выпуску и медицинскому применению. Вакцина Бубо-Кок успешно прошла государственные испытания и рекомендована комитетом МИБП к регистрации в Российской Федерации.

Конструирование иммуноферментных тест-систем для диагностики управляемых инфекций (дифтерия, столбняк, коклюш, гепатит В) Особую значимость при использовании любых вакцин, в том числе и комбинированных, имеет оценка уровня специфического иммунитета в регионе, в коллективе и у отдельных лиц, позволяющая судить об эффективности профилактических прививок. Эта задача может быть решена с помощью высокочувствительных лабораторных методов, позволяющих проводить широкий эпидемиологический мониторинг.

Иммуноферменгный анализ в настоящее время успешно конкурирует с традиционными серологическими методами, используемыми в диагностике и биологических исследованиях, связанных с различными разделами иммунологии.

Одним ш важнейших моментов в программе конкретных разработок им-муноферменгного метода определения специфических антител является выбор оптимальных реагентов для основных составляющих тест-систем - конъюга-тов. В своих исследованиях мы пошли по пути максимальной очистки анги-тельной составляющей коньюгата, так как именно этот путь ведет к достижению наиболее высокой чувствительности ИФА (Егоров A.M. и др., 1991, Райхер И.И. и др., 1998). В этом плане перспективными представлялись препараты, которые в качестве основного специфического действующего начала содержали бы только F(ab')2 -фрагменты аффинноочищенных антител к IgG человека, преимущество которых определяется большей удельной активностью по сравнению с сыворотками и нативными чистыми антителами.

В результате проведенных экспериментов была обоснована технология приготовления достаточно стандартных препаратов Р(аЬ'^-фрагментов аф-финноочищенных антител лошади против ^О человека, меченных пероксида-зой, обладающих высокой чувствительностью и практически не дающих неспецифической фоновой окраски при использовании в качестве контроля 1 % раствора БСА. Последнее весьма важно для получения максимальной дискриминанты между положительными и отрицательными результатами, необходимой при разнообразном возможном использовании таких конъюгатов.

Далее нами исследовалась возможность использования ангивидового конъюгата при конструировании ИФТС для определения антител различной специфичности. Конъюгаты испытывали в непрямой иммуноферменгной реакции с соответствующими антигенами, сорбированными на твердую фазу (полистироловый планшет).

В силу того, что все антигены индивидуально различны, и вследствие этого могут различаться по способности фиксироваться на твердой фазе, была проведена серия экспериментов по исследованию условий сорбции каждого антигена на полистироловую основу. Для столбнячного и дифтерийного анатоксинов оптимальной оказалась концентрация 10 мкг/мл по белку в 0,01 моль/л карбонат-бикарбонатном буферном растворе рН 9,6; для рекомбинант-ного HBsAg - 1 мкг/мл (по белку) в 0,01 моль/л фосфатном буферном растворе рН 7,2. Наиболее благоприятным температурно-временным режимом сорбции всех изученных антигенов оказалась экспозиция в течение 20-24 часов при температуре 4 °С. Изменение свойств иммобилизованных антигенов не наблюдалось при хранении в течение 12 месяцев при температуре 4-10 °С.

Оптимальная концентрация конъюгата для использования в рассматриваемых ИФТС составила 50-100 нг фермента в 1 мл. Равновесие в реакции устанавливалось в течение 40-60 минут при 37 °С. При этом наблюдалась максимальная чувствительность анализа, а кинетика превращения субстрата имела линейный характер.

Далее для каждой из разрабатываемых тест-систем была установлена величина порогового уровня, позволяющего надежно различать сигналы, соответствующие отрицательным и положительным образцам сывороток. Было установлено, что непрямой вариант ИФА с использованием ангивидового конъю-гата обеспечивает чувствительность анализа при определении дифтерийных и столбнячных антител - 0,5 мМЕУмл, анги-HBs - 50 мМЕ/мл. При этом, следует отметить, что минимальный защитный уровень дифтерийных антител составляет 30 мМЕУмл, столбнячных и анги-HBs - 10 мМЕ/мл. Следовательно, при определении антител к поверхностному антигену вируса гепатита В (HBsAg) этот вариант не обеспечивает необходимой чувствительности анализа.

В связи с этим мы обратились к методам, основанным на нековаленгном введении ферментной метки. Один из наиболее эффективных методов такого рода основан на использовании авидина и биотина, образующих между собой комплекс, характеризующийся константой связывания 1015 М что в десятки тысяч раз превышает характеристики связи антиген-антитело (А. Bayer, М. Wilchek, 1980).

В результате проведенных экспериментов была отработана оптимальная методика биотинилирования антигенов и оптимизированы параметры твердофазного авидин-биотинового варианта ИФА. Разработанная конструкция ИФТС представляет собой твердофазный «сэндвич» с сорбированным на планшете антигеном; при этом визуализация результатов реакции осуществляется с помощью реакции между меченным биотином антигеном и меченным пероксвдазой хрена аввдином.

При сравнительных испытаниях непрямого и авидин-биотинового вариантов ИФА было показано, что чувствительность последнего в отношении определения анги-HBs достоверно выше - в 7-10 раз. В то же время, для дифтерийных и столбнячных антител существенных различий обнаружено не было. При этом важным преимуществом разработанного авидин-биотинового варианта стала возможность определения специфических антител в сыворотках крови не

только людей, но и животных, что важно при лабораторной оценке качества комбинированных вакцин.

Существенным моментом создания коммерческих ИФТС стала также разработка метрологического обеспечения интерпретации результатов.

В 31 докладе комитета экспертов ВОЗ по биологической стандартизации сформулирован перечень рекомендуемых критериев и руководящих указаний по оценке качества наборов для ИФА, но не описаны методы и технические приемы, с помощью которых можно количественно оценить результаты имму-ноаналтаа.

В связи с этим одной из задач исследования являлась разработка методики количественного иммуноферментного определения специфических антител на модели дифтерийных антител (АТ). При решении этой задачи был использован метрологический подход: количественное определение АТ рассматривалось как многоэтапный процесс, где каждый этап вносит свою составляющую погрешности в конечный результат определения. Эксперименты по выявлению составляющих погрешности измерений проводились во всем диапазоне определяемых концентраций. При этом использовались образцы сывороток с высоким, средним и низким содержанием АТ, установленные методом in vivo (РН), и образец сыворотки не содержащий АТ. В итоге определены такие характеристики, как сходимость и воспроизводимость результатов, установлена зависимость значений оптической плотности растворов от концентрации АТ и её графическое выражение (градуировочный график), а также необходимость применения стандартного образца состава исследуемого вещества для определения указанных'характеристик.

На основании проведенных исследований предложен алгоритм обработки результатов ИФА, состоящий из четырех этапов: снятие показаний прибора, нахождение значений по градуировочному графику, определение кратности разведения, вычисление по формуле пересчета абстрактных значений в конкретные (ОП раствора — содержание антител, МЕ/мл).

Данный алгоритм обработки результатов ИФА позволил: аттестовать положительную контрольную сыворотку; определить суммарную погрешность измерений; выделить линейный участок в ограниченном диапазоне значений на градуировочном графике, что привело к получению обоснованных результатов, сравнимых с результатами прецизионного теста определения антитоксинов - реакции нейтрализации (г = 0,9). Учет результатов иммуноферменгной реакции стандартизирован таким образом, что позволяет оценить содержание специфических антител в крови в международных единицах (ME/мл), аналогично биологическому тесту. Разработанная методика была успешно применена для обсчета данных иммуноферменгного определения антител к токсинам основных возбудителей клостридиозов (С. perfringens типа А; С. oedematiens типа А; С. tetani, С. botulinum типов А,В,Е), анги-HBs. На основании предлагаемого алгоритма обработки результатов ИФА была создана компьютерная программа количественного определения специфических антител (рис.2).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Развед S, 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20

А ОП 0,889 1,691 1,567 1,248 2,145 1,467 1,234 1,339 1,177 1,015 0,712 1,139

Конц * 25 (+)1565,8 (+)1364,6 (+)910,1 (+>2419,5 (+>1212,3 (+>892,2 (+>1030,5 (+>821,3 (+>635,7 351,8 (+>873,4

Развед S2 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200

В ОП 0,596 0,315 0,49 0,34 0,682 0,653 0,432 0,759 0,381 0,744 0,122 0,536

Конц * 12,5 1054,3 1964,2 1167,2 3282,0 3061,6 1631,8 3904,1 1364,7 3778,8 374,8 1745,8

Развед s3 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000

С ОП 0,36 0,056 0,08 0,084 0,109 0,102 0,067 0,142 0,089 0,115 0,079 0,067

Конц * 6,25 (->2208,3 (-)2721,6 (->2812,4 3412,8 3238,8 (->2437,0 4293,3 (->2927,8 3565,4 (->2699,2 (->2437,1

Развед. s„ 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20

D ОП 0,197 0,998 1,911 0,475 1,256 1,572 0,872 1,339 1,286 0,698 2,258 0,889

Конц.* 3,125 (+)617,6 (+)1956,6 187,5 (+>920,4 (+>1372,5 491,4 (+>1030,5 (+>959,4 340,7 (+>2660,4 511,6

Развед. S5 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200

Н ОП 0,096 0,208 0,689 0,083 0,347 0,65 0,169 0,749 0,768 0,119 0,674 0,137

Конц * 1,5625 635,4 3336,4 (->279,0 1199,8 3039,2 508,8 3820,3 3980,4 366,9 3220,4 495,3

Развед. S(.) 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000

t ОП 0,015 0,045 0,115 0,051 0,087 0,1 0,064 0,112 0,114 0,083 0,118 0,051

Конц.* (-)1990,8 3565,4 (->2108,1 (->2881,4 3190,0 (->2373,5 3488,7 3539,7 (->2789,5 3643,0 (->2108,1

Развед S(-) 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20

(i ОП 0,024 0,367 1,659 1,77 1,369 1,077 1,091 0,639 0,615 1,258 0,1 0,315

Конц.* 129,6 (+)1512,6 (+>1701,2 (+>1071,8 (+>703,9 (+>719,8 295,8 278,4 (+>922,9 31,9 105,4

н Развед Blank 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200

ОП 0,085 0,855 0,804 0,457 0,701 0,788 0,122 0,107 0,489 0,069 0,065

Конц* (-)283,5 4754,7 4292,5 1771,3 3430,5 4152,3 374,8 336,3 1958,2 (->248,0 (->2573,4

Примечание:

Si - Ss разведения положительного контрольного образца; 20, 200, 2000 - разведения исследуемых образцов. S (-) - отрицательный контроль;

(+) - необходимо увеличить разведение исследуемого образца; (-) - необходимо уменьшить разведение исследуемого образца; * - концентрация, мМЕ/мл.

Рис. 2. Распечатка результатов расчета тнтров столбнячных антител с помощью компьютерной программы

В соответствии с требованиями ВОЗ проведет оценка качества разработанных тест-систем по таким основным критериям, как: оценка линейности и параллелизма результатов измерения анализируемого вещества и калиброва-теля, точность и воспроизводимость рабочих характеристик и методов их оценки, сопоставление результатов определения анализируемого вещества, полученных разными методами.

Дисперсионный анализ показал:

- наличие параллелизма результатов измерения анализируемого вещества и положительного контрольного образца (калибрователя);

- точность и воспроизводимость результатов измерений в пределах одной серии испытаний и разных серий испытаний для исследуемых тест-систем была весьма высокой - коэффициент вариации не превышал 10 %.

Таким образом, из представленных данных видно, что предлагаемые тест-системы обеспечивают достаточно высокую степень достоверности результатов иммуноферменгного определения специфических антител.

Высокая степень корреляции результатов параллельного исследования сывороток в ИФА и биопробе при определении антитоксинов, а также с зарубежными тест-системами, зарегистрированными в России, при определении анги-НВв (рис. 3, 4) обосновала возможность использования разработанных тест-систем для обеспечения иммунологического мониторинга в системе эпи-днадоора за дифтерией, столбняком и гепатитом В.

Проведенные исследования послужили основанием для разработки технологии получения иммуноферменгных тест-систем для определения дифтерийных, столбнячных и анти-НВз и оформления нормативно-технической документации для их производства.

Непрямой вариант ИФА

А. г Б.

Лвидин-биотиновый вариант ИФА

А. Б.

Рис 3. Сопоставление результатов определения титров дифтерийных и столбнячных антител в ИФА и биопробе (По оси абсцисс - ИФА, МЕ/мл, по оси ординат - РН, МЕ/мл) А. Дифтерийные антитела; Б. Столбнячные антитела

4СГО

ЗСШ

2СШ 0

А °

ЮОО

Ж0

01 Ш-- -

о

л=97 г=0,94

аго, ваш

4300 2000 01

0 п=97 [=0,92

4Ш

ваш

5000

НЮ

Рис 4. Сопоставление результатов определения титров анти-НВ5 (мМЕ/мл) По оси абсцисс - отечественная тест-система (г. Пермь), по оси ординат. А - «МопоЬва*» (Франция), Б - «АиБаЬ® Е1А» (США).

О

Б

БИБЛИОТЕКА ! С. Петербург I О» 300 мт |

ИФТС для выявления дифтерийных и столбнячных антител (непрямой |

вариант) зарегистрирована в установленном порядке (Р№ 94/90/10). С 1994 года начат производственный выпуск продукции. Успешно завершены государственные испытания ИФТС для определения анти-НВБ (авидин-биотиновый , вариант). Конструкция ИФТС для определения анти-ИВв защищена патентом РФ (Патент № 2206095).

Практическая ценность метода ИФА продемонстрирована эффективным |

I

применением шести сконструированных ИФТС в реальной практике при: 1) /

оценке поствакцинального иммунитета у людей (непрямой вариант для выяв- (

I

ления дифтерийных и столбнячных антител, авидин-биотиновый - для анги- ,

НВб); 2) отборе плазмы доноров с высоким содержанием антител для произ- I

водства противостолбнячного иммуноглобулина и иммуноглобулина против I

гепатита В - препарат Ангигеп (непрямой вариант ИФА); 3) оценке иммуно-генности вакцин на животных и определении тигра антител гипериммунных антитоксических лошадиных сывороток (авидин-биотиновый вариант). ,

Таким образом, нами впервые были разработаны методические основы количественного определения специфических антител с помощью ИФА, а для практического осуществления метода предложен ряд высокочувствительных и специфичных вариантов ИФТС в полной мере отвечающих по своим характеристикам требованиям ВОЗ, предъявляемым к наборам для иммунологических испытаний.

Обобщая итоги проделанной работы следует отметить, что основные поставленные задачи были решены в процессе ее выполнения (табл. 11).

Таблица 11

Основные задачи исследования и полученные результаты

Основные задачи исследования Полученные результаты

1. Экспериментально обосновать конструкции комбинированных вакцин, предназначенных для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В. Разработаны оригинальные конструкции комбинированных вакцин для иммунопрофилактики вирусного гепатита В, столбняка, дифтерии (патент № 2130779) и для иммунопрофилактики вирусного гепатита В, столбняка, дифтерии и коклюша (патент № 2130778)

2. Разработать технологию изготовления комбинированных вакцин для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В с оформлением нормативно-технической документации для их производства. Разработаны технологии изготовления комбинированных вакцин, для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В, оформлена НТД для их производства Вакцина Бубо-М зарегистрирована в установленном порядке (Р Л» 000071 /01-2000 от 23.10.2000). Вакцина Бубо-Кок рекомендована к регистрации Комитетом МИБП РФ (протокол № 1 от 27.02.03).

3. Разработать иммуноферменгные тест-системы для количественного определения специфических антител (дифтерийных, столбнячных, апти-МВэ) с оформлением нормативно-технической документации для их производства. Разработаны иммуноферменгные тест-системы для количественного определения специфических антител (дифтерийных, столбнячных, анти-НВв), оформлена НТД для их производства. ИФТС для выявления дифтерийных и столбнячных антител (непрямой вариант) зарегистрирована в установленном порядке (Р № 94/90/10) ИФТС для определения анти-НВв (Патент № 2206095) находится в фазе регистрации.

4. Продемонстрировать эффективность применения разработанных тест-систем для оценки поствакцинального иммунитета у людей, оценки иммуногенности вакцин на животных, отбора плазмы доноров с высоким содержанием специфических антител для производства направленных иммуноглобулинов Разработанные тест-системы используются для оценки эффективности вакцинации и ревакцинации против дифтерии, столбняка и гепатита В, характеристики иммунной структуры населения и выявления групп повышенного риска, а также оценки иммуногенности комбинированных вакцин на животных. Применяются для отбора плазмы доноров с высоким содержанием антител при производстве противостолбнячного иммуноглобулина и препарата Антигеп (Патент № 2144379)

В заключение следует отметить, что использование новых отечественных комбинированных вакцин Бубо-М и Бубо-Кок позволит не только уменьшить стрессовую нагрузку на прививаемых, но и более успешно реализовать проведение прививок в сроки, определенные календарем прививок, снизить загру-

женность медицинских работников и соответственно уменьшить стоимость программ иммунизации. В связи с этим перспективы осуществления программы вакцинации взрослых и детей против гепатита В, дифтерии, столбняка и коклюша с использованием комбинированных вакцин выглядят достаточно реальными.

Разработанные ИФТС открывают широкие возможности для проведения массовых эпидемиологических обследований с целью объективной оценки эффективности вакцинации и ревакцинации против дифтерии, столбняка и гепатита В, характеристики иммунной структуры населения и выявления групп повышенного риска.

Выводы

1. Экспериментально обоснованы и разработаны оригинальные конструкции комбинированных вакцин для одновременной продуктивной иммунизации против дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В - вакцины Бубо-М и Бубо-Кок, защищенные патентами РФ № 2130779, № 2130778.

2. Разработана технология изготовления комбинированных вакцин (Бубо-М, Бубо-Кок), обеспечивающая получение препаратов, соответствующих требованиям ВОЗ по иммуногенности, безвредности, стабильности при хранении, и оформлена нормативно-техническая документация (производственные регламенты, ФСП).

3. Безопасность и высокая иммунологическая активность первых отечественных комбинированных вакцин (Бубо-М и Бубо-Кок), содержащих гепатитный компонент, определяет их конкурентоспособность. Вакцина Бубо-М зарегистрирована в установленном порядке (Р№ 000071 /01-2000) и разрешена к промышленному выпуску и медицинскому применению. Вакцина Бубо-Кок успешно прошла государственные испытания и рекомендована к регистрации.

4. Разработаны методические подходы и универсально стандартизированные схемы конструирования высокочувствительных ИФТС для определе-

I

а

ния специфических антител с использованием непрямого и авидин-биотинового варианта ИФА.

5. Впервые предложены иммунофермеигные тест-системы (непрямой вариант ИФА), в которых в качестве ангивидового конъюгата использованы Р(аЬ,)2-фрагмеш'ы аффиноочищенных антител сыворотки лошади против 1§0 человека, меченные пероксидазой хрена. Показано, что этот вариант ИФТС обеспечивает чувствительность анализа при определении антитоксинов (столбнячного и дифтерийного) на уровне - 0,5 - 1 мМЕ/мл, анги-НВв - 50 -100 мМЕ/мл.

6. Впервые с применением оригинально сконструированных антигенных маркеров (антигены, меченные биотином) на основе авидин-биотинового взаимодействия разработана универсальная конструкция ИФТС для определения специфических антител в сыворотках как людей, так и животных. Показано, что этот вариант ИФТС обеспечивает чувствительность анализа для анги-НВв на уровне 5—10 мМЕ/мл, при сохранении чувствительности непрямого варианта ИФА при определении антитоксинов. Конструкция ИФТС для определения анги-НВя защищена патентом РФ № 2206095.

7. Впервые при обработке результатов ИФА использован метрологический подход, позволивший разработать эффективную методику количественного иммуноферменгного определения специфических антител в международных единицах (МЕУмл). На основании предлагаемого алгоритма обработки результатов ИФА разработана унифицированная компьютерная программа количественного определения антител различной специфичности. Установлена высокая степень воспроизводимости результатов иммуноферменгного определения специфических антител с использованием разработанных тест-систем.

8. Разработаны технологии изготовления ИФТС, отвечающих требованиям ВОЗ, для выявления дифтерийных и столбнячных антител (непрямой вариант) и анти-НВэ (авидин-биотиновый вариант) и оформлена нормативно-техническая документация (производственные регламенты, ФСП, инструкции

[

по применению). Тест-система для -выявления дифтерийных и столбнячных антител зарегистрирована в установленном порядке и разрешена к использованию в практике здравоохранения (Р № 94/90/10). ИФТС для выявления анги-HBs находится в фазе регистрации.

9. Практическая ценность метода ИФА продемонстрирована эффективным применением 6 сконструированных ИФТС при оценке поствакцинального иммунитета у людей, отбора плазмы доноров с высоким содержанием антител при производстве специфических иммуноглобулинов, оценке иммуно-генности вакцин на животных и определении тигра антител гипериммунных антитоксических лошадиных сывороток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Сравнение твердофазного иммуноферменгного анализа с реакцией нейтрализации токсина на белых мышах как метода определения столбнячного антитоксина в человеческих сыворотках // Тезисы докл. науч. конф. - Пермь, 1986. - С. 25-26 (соавт. Ефимова Н.П., Павленко A.M., Скудаева Л.К.).

2. Опыт использования иммуноферменгного анализа для определения уровня столбнячных антител в сыворотках крови доноров // Научно-производственные проблемы улучшения качества вакцинно-сывороточных препаратов: Сб. науч. тр. - Ташкент, 1987. - С. 48-50 (соавт. Ефимова Н.П., Гряз нова Д.В., Арсентьев A.M.).

3. Разработка новых иммунодиагностических препаратов на основе аффино-очищенных антител и их (Fab')2 -фрагментов // Всесоюзн. конф. Современные направления создания медицинских диагностикумов: Тез. докл. - М., 1988. - С. 86 (соавт. Райхер Л.И., Райхер И.И., Петров В.Ф. и др.).

4. Усовершенствованные методы иммуноспецифической детекции бактериальных токсинов и антитоксических антител // Состояние проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций: Матер, раб. Со-

вещания. - Оболенск, 1991. - С. 25 (соавт. Райхер Л.И., Райхер И.И., Хазина Е.Х. и др.).

5. Серологическая оценка противодифтерийного иммунитета у доноров // Актуальные проблемы теоретич. и прикладн. иммунологии: Матер, докл. -Пермь, 1994. - С. 45-46 (соавт. Петров В.Ф., Ефимова Н.П., Сафонова Г.М. и др.).

!

6. Применение аффиноочищенных антител и их фрагментов в препаратах и тест-системах для серологического анализа при дифтерии // Актуальн. вопр.

* разработки микробиологич. питательных сред и тест-систем: Матер, докл.

Всерос. науч.-практич. конф.-Махачкала, 1994. - С. 149 (соавт. Райхер Л.И., Райхер И.И., Ефимова Н.П. и др.).

7. Современное иммуноферменгное обеспечение эпиднадзора за дифтерией //

f

Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: Тез. докл. - СПб., 1995.- С. 23 (соавт. ' Петров В.Ф., Райхер Л.И., Ефимова Н.П. и др.).

8. Новые методические подходы к проблеме оценки качества медицинских

í

иммунобиологических препаратов // Матер. VII съезда Всерос. общества

(

эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - М.,1997. - Т. 1. - С. 444445 (соавт. Иванова В.А., Шобухова Т.С., Туманова Г.М., Озерецковский ! Н.А).

■ 9. Новые критерии оценки качества диагностических препаратов для опреде-

f

ления антител к дифтерийному токсину //' Современная вакцинология: Тез. докл. II Межд. конф, поев. 100-летию Пермского НПО "Биомед". - Пермь, ' 1998. - С. 47-48 (соавт. Шобухова Т.С., Туманова Г.М., Миете П. и др.).

' Ю.Разработка метода получения ангиввдовых иммунных сывороток как осно-

вы многоцелевого назначения // Современная вакцинология: Тез. докл. II Межд. конф, поев. 100-летию Пермского НПО "Биомед". - Пермь, 1998. - С. 166-167 (соавт. Басалгина С.А., Тимашева O.A., Балуева Ж.И. и др.).

11.Разработка иммуноферменгных тест-систем для экспресс-диагностики анаэробной газовой инфекции и оценки напряженности иммунитета к токсинам

основных возбудителей клостридиозов // Современная вакцинология: Тез. докл. II Межд. конф, поев. 100-летию Пермского НПО "Биомед". - Пермь, 1998. - С. 166-167 (соавт. Грязнова Д.В., Ефимова Н.П.).

12.0 сертификации набора для иммунологических испытаний // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 1998. -№2. - С. 39-43 (соавт. Бектимиров Т.А., Петров В.Ф., Миете П. и др.).

13.0 многоэтапном метрологическом подходе к проблеме оценки результатов количественного иммуноферменгного определения антитоксических антител //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. — 1998. -№2. - С. 43-46 (соавт. Петров В.Ф., Иванова В.А., Шобухова Т.С., Туманова Г.М.).

14.06 оценке параллелизма результатов измерения анализируемого вещества и калибрователя при иммунологических испытаниях // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 1999. -№ 2. - С. 68-71 (соавт. Шобухова Т.С., Туманова Г.М., Костюков C.B., Миете П.).

15.Новая отечественная комбинированная вакцина Бубо-М для детей и взрослых // Здоровье населения и среда обитания: Информ. бюлл. - М., 2000. - № 11 /92. - С. 3-6 (соавт. Борисова В.Н., Мельников В.А., Буданов М.В. и др.).

16.Разработка комбинированной вакцины Бубо-Кок для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В // Вакцинопрофилактика в XXI веке: Материалы науч.-практич. конф. Западно-Уральского региона - Пермь: Перм. гос. мед. академия, 2000. - С. 56-58 (соавт. Семенова В.Д., Пушкарева Е.В., Грязнова Д.В. и др.).

17.Результаты изучения реакгогенности и иммуногенности первой отечественной комбинированной вакцины Бубо-М применительно к взрослым // Вакцинопрофилактика в XXI веке: Материалы науч.-практич. конф. Западно-Уральского региона.- Пермь: Перм. гос. мед. академия, 2000. - С. 52-54 (соавт. Фельдблюм И.В., Борисова В.Н., Мельников В.А. и др.).

18.Результаты изучения реактогенности и иммуногенности первой отечественной комбинированной вакцины Бубо-М применительно к детям // Вакцино-профилактика в XXI веке: Материалы науч.-пракгич. конф. Западно-Уральского региона.- Пермь: Перм. гос. мед. академия, 2000. - С. 54-56 (со-авт. Фельдблюм И.В., Борисова В.Н., Мельников В.А. и др.).

19. BUBO-M combined vaccine influence on antimicrobe human blood cell activity // Millenium Second World Congress in vaccines and immunization. Amphitheaters of Europe, Liege, Belgium. August 29-September 3, 2000. - P. 11 (Feldblum I., Kazyanin A., Timasheva O. et al).

20.Иммунологическая эффективность симультанной экстренной профилактики в очагах хронического гепатита В при различных схемах иммунизации // Достижения отечественной эпидемиологии в XX веке: Тр. науч. конф. с ме-ждунар. участием, посвященной 80-летию со Дня рождения академика Белякова В.Д. - СПб., 2001. - С. 243-244 (соавт. Фельдблюм И.В., Казьянин A.B., Борисова В.Н. и др.).

21.Бубо-М - новая комбинированная вакцина против дифтерии, столбняка и гепатита В // Вакцинация. - 2001. - № 3. - С. 10-11 (соавт. Борисова В.Н., Фельдблюм И.В., Воробьева H.H.)

22.Оценка реактогенности и иммуногенности отечественной комбинированной вакцины Бубо-М при иммунизации взрослых против дифтерии столбняка и вирусного гепатита В // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2001. - № 5. - С. 27-30 (соавт. Фельдблюм И.В., Воробьева H.H., Борисова В.Н.).

23.Реакгогенность и иммуногенность комбинированной вакцины Бубо-М при иммунизации детей против дифтерии, столбняка и вирусного гепатита В // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2001. -№ 6. -С. 50-52 (соавт. Фельдблюм И.В., Воробьева H.H., Борисова В.Н. и др.).

24.Reactogenicity and immunological-activity of BUBO-M combined vaccine in children group experience // Journal of hepatology. - 2001. - V. 34, № 10. - P. 178 (Borisova V., Feldblum I., Melnikov V., et al.).

25.Первый опыт использования комбинированной отечественной вакцины «Бубо-М» (гепатит В, дифтерия, столбняк) для иммунизации детей и взрослых // Вирусные гепатиты В, С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики: Тез. докл. IV Российской науч.- практич. конф. - М., 2001. - С. 252-253 (соавт. Борисова В.Н., Фельдблюм И.В.).

26.Новые отечественные комбинированные вакцины в системе контроля за вирусным гепатитом В // Теоретические и прикладные проблемы эпидемиологии инфекционных и паразитарных болезней: Матер, межрегиональной науч.-практич. конф., посвященной 60-летию кафедры эпидемиологии ПГМА - Пермь, 2001. - С. 53-55 (соавт. Борисова В.Н., Казьянин A.B., Гряз нов В.Н. и др.).

27.Изучение влияния новой отечественной комбинированной вакцины Бубо®-Кок на клеточный иммунный ответ // Теоретические и прикладные проблемы эпидемиологии инфекционных и паразитарных болезней: Матер, межрегиональной науч.- практич. конф., посвященной 60-летию кафедры эпидемиологии ПГМА - Пермь, 2001. - С. 56-58 (соавт. Увицкий А.Ю., Ведерникова Н.В., Пагнуева Л.Ю. и др.)

28.Оценка реакгогенности новой комбинированной вакцины Бубо-Кок против коклюша, дифтерии, столбняка и гепатита В // Матер. VIII съезда Всерос. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. -М., 2002. - Т. 2. - С. 239-240 (соавт. Фельдблюм И.В., Мельников A.B., Борисова В.Н. и др.).

29.Исследование влияния комбинированных вакцин на клеточный иммунный ответ //Матер. VIII съезда Всерос. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - М., 2002. - Т. 2. - С. 214-215 (соавт. Увицкий А.Ю., Семенова В.Д., Борисова В.Н.).

ЗО.Бубо-Кок - новая отечественная комбинированная вакцина против дифте-

рии, столбняка, коклюша и гепатита В // Идеи Пастера в борьбе с инфек-

I

циями: Матер. III Междунар. конф., посвященной 80-летию института им.

f

Пастера. - СПб, 4-5 сентября 2003. - С. 47 (Фельдблюм И.В., Казьянин A.B., Борисова В.Н. и др.). 31.Оценка реактогенности отечественного специфического иммуноглобулина человека против гепатита В «Ангигеп» и комбинированной вакцины «Бубо-

I

М» при иммунизации контактных лиц в очагах // Актуальные вопросы вак-цинно-сывороточного дела в XXI веке: Матер. Всерос. науч. конф. - Пермь, 2003. - С. 122-125 (соавт. Казьянин A.B., Пленкина C.B., Борисова В.Н. и др.).

32.Сравнительная оценка отечественной ИФТС и зарубежных тест-систем для ' выявления антител к HBsAg // Актуальные вопросы вакцинно-

5

сывороточного дела в XXI веке: Матер. Всерос. науч. конф. - Пермь, 2003. -' С. 157-159 (соавт. Борисова В.Н., Вязникова Т.В.).

33.Оценка валидности рабочих характеристик иммуноферменгной тест' системы для выявления анги-HBs // Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке: Матер. Всерос. науч. конф. - Пермь, 2003. -

i

С. 159-161 (соавт. Вязникова Т.В.). '' 34.Бубо-Кок - новая отечественная комбинированная вакцина против дифте-

рии, столбняка, коклюша и гепатита В // Медицинская картотека. - 2003. -

}

№ 78. - С. 18-19 (соавт. Борисова В.Н., Фельдблюм И.В.).

I

' Патенты и международные заявки:

I. Комбинированная вакцина для иммунопрофилактики вирусного гепатита В,

' столбняка, дифтерии и коклюша: Патент № 2130778 РФ // Бюл. изобрете-

|

ний. -1999. - № .15 - 14 с. (соавт. Борисова В.Н., Мельников В.А., Буданов М.В. и др.).

2. Комбинированная вакцина для иммунопрофилактики вирусного гепатита В, столбняка и дифтерии: Патент № 2130779 РФ // Бюл. изобретений. - 1999. -№ 15. -12 с. (соавт. Борисова В.Н., Мельников В.А., Буданов М.В. и др.).

3. Combined vaccine for immunoprophylaxis against viral hepatitis В and D, tetanus, diphtheria and pertussis: Междунар. заявка № PCT/RU99/00265 // WO 00/07623. - 17. 02. 2000 г. - 10 p. (Borisova V., Melnikov V., Budanov M., et al.).

4. Combined vaccine for immunoprophylaxis against viral hepatitis B, tetanus and diphtheria: Междунар. заявка № PCT/RU99/00266 // WO 00/06197. - 10. 02. 2000 г. - 8 p. (Borisova V., Melnikov V., Budanov M., et al.).

5. Противовирусный препарат и способ получения иммуноглобулина для профилактики и лечения вирусных заболеваний: Патент на изобретение

№ 2144379 РФ // Бюл. изобретений. - 2000. - № 2. - 14 с. (соавт. Петров В.Ф., Казьянин А.В., Пархоменко Т.Г. и др.).

6. Тест-система для определения антител к HBs-антигену и блокатор в тест-системе: Патент на изобретение № 2206095 РФ // Бюл. Изобретений. - 2003. -№ 16. - 28 с. (соавт. Казьянин А.В., Вязникова Т.В., Борисова В.Н. и др.).

!

f I

I

»

I

I

»

i

I

!

Препринт. Подписано в печать 31.10.2003 г. Формат 60x84/16. Отпечатано на ризографе. Объем усл. п.л. 2,63. Тираж 100 экз. Заказ 305

Типография ГосНИИУМС, 614990, г. Пермь, ул. Ленина, 66 Тел. (3422) 39-57-85

i

i

I )

l

! f

!

i

I

»18470

антигенов АКДС-вакцина вакцина коклюшно-дифтерийно-столбнячная адсорбированная Анти-HBs Бубо-Кок Бубо-М антитела к поверхностному антигену вируса гепатита В вакцина против дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В вакцина против дифтерии, столбняка и гепатита В адсорбированный с уменьшенным Hib-вакцина вакцина против гемофильной инфекции типа b Вакцина 1/Вакцина2-комбинированная вакцина Вакцина 1+ Вакцина 2 одномоментное введение вакцин ВОЗ ЕС ИПВ ИФА ИФТС ME МЗЕ МИЕ Всемирная организация здравоохранения единицы связывания вакцина полиомиелитная инактивированная 1,2,3 типов иммуноферментный анализ иммунофсрментная тест-система международные единицы международные защитные единицы международные иммунизирующие единицы НА-вакцина вакцина против гепатита А НВ вакцина вакцина против гепатита В НТД ОФД РН РПГА РПИ СГТ МИБП норматив1ю-техническая документация орто-фенилендиамин реакция нейтрализации реакция пассивной гемагглютинации расширенная программа иммунизации средняя геометрическая титра медицинские иммунобиологические препараты ВВЕДЕНИЕ Вакцинопрофилактика является высокоэффективной мерой борьбы с инфекциоьшыми болезнями, воздействующей на важнейший регулятор эпидемического процесса иммунитет населения. Успешная реализация программы ВОЗ по ликвидации оспы в мире резко повысила престиж вакцинации. В 1974 году была принята «Расширенная программа иммунизации» (РПИ), выполняя которую все страны добились впечатляющих успехов в предупреждении основных инфекционных заболеваний [66, 67, 94]. Вместе с тем возможности вакцинопрофилактики далеко не исчерпаны не только в отношении заболеваний, пока еще не входящих в круг управляемых, но и в отношении таких «добрых старых» инфекций, как коклюш, корь, дифтерия, краснуха, паротит. Во всем мире от инфекций, потенциально управляемых методами иммунопрофилактики, ежегодно погибает 12 миллионов детей, число детей, ставших инвалидами, а также расходы на лечение вообще подсчитать невозможно [87,89,90]. Таким образом, в ближайшей перспективе мы не в праве ожидать снижение числа инфекций, подлежащих активной иммунопрофилактике. Более того, предполагается, что календарь прививок 2025 года будет включать вакцинацию против 35-40 заболеваний. Так, уже сейчас в первые 2 года жизни ребенок получает более 15 инъекций [95, 268]. Для решения этой проблемы приказом Минздрава России от 18 декабря 1997 года 375 «О календаре профилактических прививок» предусмотрено одновременное (в один день) проведение вакцинации препаратами, указанными в календаре профилактических прививок. Данное положение приказа привело отечественные международными, правила проведения прививок 10 в лет. соответствие с существующими последние Одномоментная вакцинация, не сопровождающаяся угнетением иммунного ответа к какомулибо из антигенов и потенцированием реактогенности, позволяет не только более успешно реализовать проведение прививок в декретированные сроки, но и снизить загруженность медицинских работников. Вместе с тем при одномоментной вакцинации остается нерешенным ряд вопросов, таких как нереальность парентеральной иммунизации более чем двумя препаратами, избыточная инокуляция сорбента и консерванта в случае их содержания в обоих вакцинных препаратах и, наконец, проблема транспортирования препаратов, применения вакцин. Поэтому приоритетным Особенно актуальными направлением являются современной вакцинологии по созданию является программа разработки поливалентных комбинированных препаратов. исследования комби1шрованных вакцин с включением в них компонента со специфической направленностью против гепатита В. HBV-инфекция, характеризующаяся тяжелыми, потенциально летальными осложнениями, такими как цирроз и первичный рак печени, продолжает оставаться серьезной проблемой современного здравоохранения. У новорожденных гепатит В в 90 случаев принимает хроническое течение, при заражении на первом году жизни в 50 у взрослых в 5-10 [109, 110, 111, 131, 193]. Это указывает на первостепенную важность защиты детей самого раннего возраста [90, 149, 150]. В связи с этим, в соответствии с рекомендациями ВОЗ, отечественным календарем прививок предусмотрена вакцинация против ГВ всех новорожденных и детей первого года жизни. Выполнение этой программы может быть в значительной мере упрощено при объединении НВ-вакцины с другими вакцинами (АКДС, АДС), включенными в РПИ, в комбинированных препаратах. Положительный опыт по применению вакцин такого класса получен за рубежом [268, 269, 192, 225, 226, 271]. и хранения наличия большого всех количества для термолабильных единовременного а также показанных

ВЫВОДЫ

1. Экспериментально обоснованы и разработаны оригинальные конструкции комбинированных вакцин для одновременной продуктивной иммунизации против дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В - вакцины Бубо®-М и Бубо®-Кок, защищенные патентами РФ № 2130779, № 2130778.

2. Разработана технология изготовления комбинированных вакцин (Бубо®-М, Бубо®-Кок), обеспечивающая получение препаратов, соответствующих требованиям ВОЗ по иммуногенности, безвредности, стабильности при хранении, и оформлена нормативно-техническая документация (производственные регламенты, ФСП).

3. Безопасность и высокая иммунологическая активность первых отечественных комбинированных вакцин (Бубо®-М и Бубо®-Кок), содержащих гепатитный компонент, определяет их конкурентоспособность. Вакцина Бубо®-М зарегистрирована в установленном порядке (Р № 000071 /01-20000) и разрешена к промышленному выпуску и медицинскому применению. Вакцина Бубо-Кок успешно прошла государственные испытания и рекомендована к регистрации.

4. Разработаны методические подходы и универсально стандартизированные схемы конструирования высокочувствительных ИФТС для определения специфических антител с использованием непрямого и авидин-биотинового варианта ИФА.

5. Впервые предложены иммуноферментные тест-системы (непрямой вариант ИФА), в которых в качестве антивидового конъюгата использованы Р(аЬ)2-фрагменты аффиноочищенных антител сыворотки лошади против Ig G человека, меченные пероксидазой хрена. Показано, что этот вариант ИФТС обеспечивает чувствительность анализа при определении антитоксинов (столбнячного и дифтерийного) на уровне - 0,5 - 1 мМЕ/мл, анти-HBs - 50 -100 мМЕ/мл.

6. Впервые с применением оригинально сконструированных антигенных маркеров (антигены, меченные биотином) на основе авидин-биотинового взаимодействия разработана универсальная конструкция ИФТС для определения специфических антител в сыворотках как людей, так и животных. Показано, что этот вариант ИФТС обеспечивает чувствительность анализа для анти-HBs на уровне 5-10 мМЕ/мл, при сохранении чувствительности непрямого варианта ИФА при определении антитоксинов. Конструкция ИФТС для определения анти-HBs защищена патентом РФ № 2206095.

7. Впервые при обработке результатов ИФА использован метрологический подход, позволивший разработать эффективную методику количественного иммуноферментного определения специфических антител в международных единицах (МЕ/мл). На основании предлагаемого алгоритма обработки результатов ИФА разработана унифицированная компьютерная программа количественного определения антител различной специфичности. Установлена высокая степень воспроизводимости результатов иммуноферментного определения специфических антител с использованием разработанных тест-систем.

8. Разработаны технологии изготовления ИФТС, отвечающих требованиям ВОЗ, для выявления дифтерийных и столбнячных антител (непрямой вариант) и анти-HBs антител (авидин-биотиновый вариант) и оформлена нормативно-техническая документация (производственные регламенты, ФСП, инструкции по применению). Тест-система для выявления дифтерийных и столбнячных антител зарегистрирована в установленном порядке и разрешена к использованию в практике здравоохранения (Р № 94/90/10). ИФТС для выявления анти-HBs антител находится в фазе регистрации.

9. Практическая ценность метода ИФА продемонстрирована эффективным применением 6 сконструированных ИФТС при оценке поствакцинального иммунитета у людей, отбора плазмы доноров с высоким содержанием антител при производстве специфических иммуноглобулинов, оценке иммуногенности вакцин на животных и определении титра антител гипериммунных антитоксических лошадиных сывороток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработка новых комбинированных вакцин имеет важное значение для решения медицинских, социальных и экономических аспектов проблемы вак-цинопрофилактики [50, 57, 58, 97]. Особую значимость при использовании любых вакцин, в том числе и комбинированных, имеет оценка уровня специфического иммунитета в регионе, в коллективе и у отдельных лиц, позволяющая судить об эффективности профилактических прививок. Эта задача может быть решена с помощью высокочувствительных лабораторных методов, позволяющих проводить широкий эпидемиологический мониторинг.

Все вышеизложенное предопределило цель настоящей работы - разработку конструкций комбинированных вакцин и ИФТС для профилактики и диагностики управляемых инфекций (дифтерия, столбняк, коклюш, гепатит В).

Первый раздел настоящей работы был связан с разработкой конструкций комбинированных вакцин для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В.

Трудности создания комбинированных вакцин связаны прежде всего с решением проблемы совместимости компонентов, стабильности и сохранения достаточной иммуногенности препарата. При разработке комбинированных вакцин важно было гарантировать, чтобы иммунный ответ на любой из компонентов вакцины не оказался неприемлемым из-за присутствия других.

В связи с этим на первом этапе работы было проведено экспериментальное изучение совместимости и конкурентности трех компонентов (дифтерийного, столбнячного и гепатитного) в составе двух вариантов комбинированных вакцин (АДС-М/НВ-вакцина и АДС/НВ-вакцина).

В предварительных опытах на животных было установлено, что иммунизация экспериментальными вариантами комбинированных вакцин приводила к формированию напряженного иммунитета в отношении всех компонентов. При этом совместное применение трех вакцинных препаратов заметно усиливало иммуногенность гепатитного компонента: частота положительных сероконверсий была значительно выше, чем при использовании моновакцины гепатита В. В серии экспериментов, предусматривающих заражение иммунизированных животных дифтерийным и столбнячным токсинами, была установлена более высокая иммуногенность соответствующих компонентов в том случае, когда они входили в состав вакцин, содержащих рекомбинантпый HBsAg.

При изучении совместимости четырех компонентов (дифтерийного, столбнячного, коклюшного и гепатитного) было установлено, что комбинированные вакцины, содержащие HBsAg, по иммуногенности превосходят базовые препараты (АКДС, НВ-вакцина). В ходе эксперимента были изучены варианты комбинированных вакцин с уменьшенным содержанием антигенов. При этом при уменьшении содержания в одной прививочной дозе комбинированной вакцины дифтерийного (с 15 до 10 Lf) и столбнячного (с 5 до 2,5 ЕС) анатоксинов иммуногенность этих компонентов оставалась на уровне АКДС-вакцины. Снижение дозы HBsAg (с 10 до 5 мкг) в составе комбинированных вакцин также не повлияло на иммуногенность последних по гепатитному компоненту: она сохранялась или даже несколько превышала аналогичный показатель моновакцины гепатита В.

Помимо тестов, регламентированных для доклинической оценки комбинированных вакцин, нами был проведен ряд дополнительных исследований с целью получения максимально объективной оценки влияния новых препаратов на различные звенья иммунной системы.

Известно, что в становлении любой антигенспецифической резистентности наряду с гуморальным важное значение имеет и клеточный иммунитет [47]. Поэтому оценка специфического клеточного иммунитета представлялась нам весьма важной как в плане характеристики иммунобиологических свойств комбинированных вакцин, так и в отношении возможного использования полученных данных для контроля эффективности вакцинации.

Для оценки влияния вакцин на клеточное звено иммунной системы сравнивали такие их характеристики, как влияние на массу и клеточность регионарных лимфатических узлов и способность вызывать реакции гиперчувствительности замедленного типа. Опыты выполнялись на аутбредных белых мышах.

Анализ результатов данного этапа исследования позволил нам прийти к заключению о том, что выраженность ответа клеточного звена иммунной системы на гепатитный компонент комбинированных вакцин в значительной мере зависит от остальных составляющих препарата: отмечено достоверное нарастание показателей как при комбинации HBsAg с дифтерийным и столбнячным анатоксинами, так и при последующем введении в состав вакцины коклюшной суспензии.

В то же время, сам гепатитный компонент не оказывал значимого влияния на клеточный ответ против остальных составляющих комбинированных вакцин.

В отношении столбнячного анатоксина показан стимулирующий эффект как дифтерийного компонента, так и коклюшной суспензии. При этом иммунный ответ на дифтерийный анатоксин слабо зависел от присутствия в препарате столбнячного компонента и в достаточной мере стимулировался лишь коклюшной суспензией.

Наконец, коклюшный компонент оказывал выраженное, статистически достоверное потенцирующее влияние на клеточное звено иммунного ответа против каждого из компонентов исследуемых комбинированных вакцин, что в целом согласуется с литературными данными [47].

Влияние состава комбинированных вакцин на гуморальное звено иммунного ответа оценивалось нами на иной экспериментальной модели - на аутбредных морских свинках. Выбор объекта определялся тем, что в данном случае требовался неоднократный забор крови для оценки уровня специфических антител в динамике. Кроме того, представлялось весьма заманчивым на одном виде животных оценить иммуногенность всех компонентов комбинированных вакцин. В настоящее время регламентированные методы оценки им-муногенности достаточно сложны и предусматривают использование, например, для контроля одной серии комбинированной вакцины несколько видов различных животных: 82 морских свинок (дифтерийный компонент), 165 аут-бредных белых мышей (столбнячный компонент), 165 мышей линии Balb (гепатитный компонент), 160 мышей-гибридов F1 (CBAxC57BL/6J) (коклюшный компонент).

В ходе данного этапа работы было показано, что введение в состав комбинированных вакцин гепатитного компонента ни в одном из изученных вариантов не приводило к снижению гуморального иммунного ответа на дифтерийный, столбнячный анатоксины и коклюшный компонент. В случае использования комбинированных вакцин, содержащих HBsAg, по сравнению с АДС-М и АКДС, в целом наблюдался более высокий уровень дифтерийных и столбнячных антител. При этом, для столбнячных антител эти различия были статистически достоверны. Был также установлен выраженный потенцирующий эффект как анатоксинов, так и в особенности коклюшной суспензии на формирование иммунного ответа против HBsAg.

Итак, в условиях разносторонних экспериментов была продемонстрирована полная иммунологическая совместимость антигенов отечественного производства (дифтерийного, столбнячного, коклюшного, HBsAg) в составе предлагаемых комбинаций вакцин - АДС-М анатоксин/НВ-вакцина, АКДС/НВ-вакцина. Установленный выраженный потенцирующий эффект при комбинации антигенов вакцины АКДС с HBsAg позволил снизить дозу гепатитного компонента (с 10 до 5 мкг) в составе 4-х компонентной комбинированной вакцины без уменьшения его иммуногенной активности. Это весьма важно как в плане снижения антигенной нагрузки на организм ребенка, так и уменьшения стоимости достаточно дорогостоящего препарата.

Кроме того, было показано,-что по содержанию специфических антител на одном виде предварительно иммунизированных животных (морских свинках) можно определять активность нескольких компонентов комбинированной вакцины. При этом, результаты оценки иммуногенности идентичны полученным с помощью регламентированных тестов. Использованный метод перспективен для оценки иммуногенности комбинированных вакцин, так как упрощает процедуру контроля и в значительной степени сокращает количество используемых животных. При разработке соответствующих стандартов иммуногенности отдельных компонентов вакцин предлагаемый метод может быть использован в практике.

Таким образом, в результате проведенных исследований была экспериментально обоснована возможность получения комбинированных препаратов для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В. Оптимальными были признаны следующие два варианта вакцин: Бубо-М, содержащая в 1 прививочной дозе (0,5 мл): 5 Lf дифтерийного анатоксина, 5 ЕС столбнячного анатоксина, 10 мкг рекомбинантного HBsAg, 0,3-0,5 мг геля гидро-ксида алюминия и 0,025 мг мертиолята натрия; и Бубо-Кок, включающая 15 Lf дифтерийного анатоксина, 5 ЕС столбнячного анатоксина, 10 млрд. коклюшной суспензии, 5 мкг рекомбинантного HBsAg, 0,3-0,5 мг геля гидрокси-да алюминия и 0,05 мг мертиолята натрия.

При этом следует отметить, что концентрация мертиолята в составе вакцины Бубо-М в 2 раза ниже, чем в базовом препарате (АДС-М анатоксине). Это весьма важно, т.к. в мире вновь возобновилась дискуссия о возможном негативном воздействии мертиолята на организм ребенка и подчеркивается потенциальная опасность увеличения его дозы при одновременном введении нескольких вакцин, содержащих этот консервант [88]. Последнее обстоятельство еще раз подтверждает необходимость создания комбинированных вакцин.

На основании проведенных исследований, разработана технология получения комбинированных вакцин для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В и оформлена НТД (регламенты производства и фармакопейные статьи).

В производственных условиях по разработанной технологии приготовлено 5 серий вакцины «Бубо-М» и 5 серий вакцины «Бубо-Кок».

Изучение физико-химических свойств, стерильности, токсичности, специфической безвредности, иммуногенности показало, что комбинированные вакцины для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В, полученные в производственных условиях, полностью соответствуют требованиям, предъявляемым к препаратам такого класса ВОЗ и ГИСК им. JI.A. Тарасевича. При этом следует отметить, что по показателю иммуногенности вакцины Бубо-М и Бубо-Кок значительно превосходили эти требования [336].

К числу важных критериев, определяющих качество препаратов, относится стабильность свойств вакцин при длительном хранении. Как показали результаты наблюдения, разработанная технология обеспечивает получение стабильных вакцин: регламентированные показатели качества при хранении существенно не изменялись.

Государственные клинические испытания подтвердили безопасность и высокую иммунологическую эффективность разработанных вакцин «Бубо-М» и «Бубо-Кок». Введение в состав комбинированных вакцин АДС-М и АКДС гепатитного компонента не увеличило реактогенность новых препаратов - вакцин Бубо®-М и Бубо®-Кок.

Изучение иммуногенности вакцины Бубо-М выявило ее высокую иммунологическую активность при вакцинации взрослых. Так, при практически одинаковом фоновом уровне дифтерийных и столбнячных антител (р>0,05) после завершения первичной вакцинации иммунный ответ как на столбнячный, так и на дифтерийный компонент вакцины Бубо-М превышал таковой при использовании АДС-М (р<0,05). Следует также отметить, что нарастание титров антител к дифтерийному и столбнячному компоненту при иммунизации вакциной Бубо-М наблюдалось у 100 % вакцинированных, а при сочетанием введении АДС-М анатоксина и НВ-вакцины - у 95 % вакцинированных. В отношении HBsAg защитный уровень (10 МЕ/л) как при использовании вакцины Бубо-М, так и при сочетанном введении АДС-М анатоксина и НВ-вакцины был достигнут в 100 % случаев, однако средняя геометрическая титров во втором случае была ниже - 273, 26 МЕ/л против 658,6 МЕ/л.

Оценка иммуногенности вакцины Бубо-М при иммунизации детей показала, что по прошествии 1 месяца после завершения первичного курса вакцинации у всех детей наблюдалось значительное нарастание уровня дифтерийных и столбнячных антител (р<0,05). При этом уровень титров столбнячных антител в опытной группе статистически значимо (р<0,05) превышал соответствующий показатель в контрольной группе (АДС-М + НВ-вакцина). В то же время содержание дифтерийных антител после вакцинации в контрольной группе было значимо выше, чем в опытной (р<0,05), хотя по кратности нарастания титров антител (в 33,7 и 39,9 раза соответственно) различия не были существенными.

Ответ на гепатитный компонент вакцины Бубо-М наблюдался через месяц после завершения цикла вакцинации у 100 % детей. При этом в опытной группе вакцинированных уровень антител был значительно выше защитного (средний геометрический титр 12356 мМЕ/мл). В контрольной группе (соче-танное введение) процент сероконверсии составил 95 (средний геометрический титр 2729 мМЕ/мл).

При анализе иммунного ответа на Бубо-Кок и препараты сравнения было установлено, что защитный титр антител против столбняка и дифтерии формировался в 100 % случаев, при этом различия между группами носили в целом недостоверный характер. Средние геометрические титров антител против коклюшного компонента отличались также недостоверно, но при этом среди получавших Бубо-Кок титры ниже 1:80 имели лишь 11 % детей, а в группах сравнения - не менее 20 %. Наконец, в отношении гепатитного компонента было показано, что у всех детей, привитых Бубо-Кок, уровень специфических антител превышал защитный. В то же время, при одновременном введении АКДС и НВ-вакцины в разные участки тела процент сероконверсии составил 84,38 %. При этом суммарная доза HBsAg, введенная в составе вакцины Бубо-Кок составила 15 мкг, а в группе сравнения — 30 мкг. Следует отметить, что в наблюдениях на взрослых и детях подтвердился взаимопотенцирующий эффект совместного введения антигенов, обнаруженный ранее в опытах на животных.

Таким образом, в результате проведенных исследований разработаны первые отечественные комбинированные вакцины, содержащие гепатитный компонент, отличающиеся безопасностью и высокой иммунологической активностью. Одномоментная вакцинация, не сопровождающаяся потенцированием реактогенности и угнетением иммунного ответа к какому-либо из антигенов, позволит не только уменьшить стрессовую нагрузку на прививаемых, но и более успешно реализовать проведение прививок в сроки, определенные календарем прививок, снизить загруженность медицинских работников и соответственно уменьшить стоимость программ иммунизации.

Вакцина Бубо-М зарегистрирована в установленном порядке (Р № 000071 /01-20000 от 23.10.2000) и разрешена к промышленному выпуску и медицинскому применению. Вакцина Бубо-Кок рекомендована комитетом МИБП к регистрации в Российской Федерации (протокол № 1 от 27.02.03).

Второй раздел работы был связан с поиском высокоэффективных решений проблемы рациональных конструктивных разработок ИФТС со стандартизованными свойствами для определения антител различной специфичности.

Одним из важнейших моментов в программе конкретных разработок им-муноферментного метода определения специфических антител является выбор оптимальных реагентов для основных составляющих тест-систем - коньюгатов. В своих исследованиях мы пошли по пути максимальной очистки антительной составляющей конъюгата, так как именно этот путь по нашему мнению и данным литературы [1, 76, 85], ведет к достижению наиболее высокой чувствительности анализа. В этом плане перспективными представлялись препараты, которые в качестве основного специфического действующего начала содержали бы только F(ab')2 -фрагменты аффинноочищенных антител к IgG человека, преимущество которых определяется большей удельной активностью по сравнению с сыворотками и нативными чистыми антителами. Кроме того, F(ab')2-фрагменты аффинноочищенных антител избавлены от такого серьезного недостатка моноклональных антител, как слишком узкая специфичность последних [91].

В Пермском НИИ вакцин и сывороток накоплен большой опыт получения аффинноочищенных антител (столбнячных, дифтерийных, ботулиниче-ских и др.) из сыворотки крови гипериммунизированных лошадей. На этой основе и с учетом доступности исходного материала были предприняты исследования по созданию промышленного метода получения конъюгата на основе F(ab')2 -фрагментов аффинноочищенных антител лошади к IgG человека и пероксидазы хрена и испытание его в качестве индикатора антител. В результате проведенных экспериментов была обоснована технология приготовления достаточно стандартных препаратов - аффинноочищенных антител против IgG человека, меченных пероксидазой, обладающих высокой чувствительностью и практически не дающие песпецифической фоновой окраски при использовании в качестве контроля 1 % раствора БСА. Последнее весьма важно для получения максимальной дискриминанты между положительными и отрицательными результатами, необходимой при разнообразном возможном использовании таких конъюгатов.

На разработанную технологию составлен экспериментально-производственный регламент, утвержденный за № 293 [113]. В производственных условиях приготовлено более 40 серий антивидового конъюгата.

Далее нами исследовалась возможность использования разработанного антивидового конъюгата при конструировании ИФТС для определения антител различной специфичности. Конъюгаты испытывали в непрямой иммуно-ферментной реакции с соответствующими антигенами, сорбированными на твердую фазу (полистироловый планшет).

В силу того, что все антигены индивидуально различны, и вследствие этого могут различаться по способности фиксироваться на твердой фазе, была проведена серия экспериментов по исследованию условий сорбции каждого антигена на полистироловую основу. Для столбнячного и дифтерийного анатоксинов оптимальной оказалась концентрация 10 мкг/мл по белку в 0,01 моль/л карбонат-бикарбонатном буферном растворе рН 9,6; для рекомбинантного HBsAg - 1 мкг/мл (по белку) в 0,01 моль/л фосфатном буферном растворе рН 7,2. Наиболее благоприятным температурно-временным режимом сорбции всех изученных антигенов оказалась экспозиция в течение 20-24 часов при температуре 4 °С. Изменение свойств иммобилизованных антигенов не наблюдалось при хранении в течение 12 месяцев при температуре 4-10 °С.

При конструировании ИФТС мы столкнулись с проблемой неспецифического связывания, которое приводило как к появлению ложноположительных реакций, так и к существенному искажению кривых титрования. Согласно результатам проведенных исследований наиболее эффективное блокирование неспецифического связывания реагентов, используемых в ИФТС, с полистироловой основой достигалось при помощи введения в отмывающий 0,01 моль/л фосфатный буферный раствор твина-20 и казеината натрия. При этом для дифтерийной и столбнячной тест-систем неспецифическое связывание удалось устранить в значительной мере даже в образцах отрицательной сыворотки без разведения, в то время как для тест-системы для определения анти-HBs только в разведении 1:10. Оптимальная концентрация конъюгата для использования в рассматриваемых ИФТС составила 50-100 нг фермента в 1 мл. Равновесие в реакции устанавливалось в течение 40-60 минут при 37 °С. При этом наблюдалась максимальная чувствительность анализа, а кинетика превращения субстрата имела линейный характер.

Далее для каждой из разрабатываемых тест-систем была установлена величина порогового уровня, позволяющего надежно различать сигналы, соответствующие отрицательным и положительным образцам сывороток. Было установлено, что непрямой вариант ИФА с использованием антивидового конъюгата обеспечивает чувствительность анализа при определении дифтерийных и столбнячных антител - 0,5 мМЕ, анти-HBs - 50 мМЕ. При этом, следует отметить, что минимальный защитный уровень дифтерийных антител составляет 30 мМЕ/мл, столбнячных и анти-HBs - 10 мМЕ/мл. Следовательно, при определении антител к поверхностному антигену вируса гепатита В (HBsAg) этот вариант не обеспечивает необходимой чувствительности анализа.

В связи с этим мы обратились к методам, основанным на нековалентном введении ферментной метки. Один из наиболее эффективных методов такого рода основан на использовании авидина и биотина, образующих между собой комплекс, характеризующийся константой связывания 1015 М что в десятки тысяч раз превышает характеристики связи антиген-антитело [346].

В результате проведенных экспериментов была отработана оптимальная методика биотинилирования антигенов и оптимизированы параметры твердофазного авидин-биотинового варианта ИФА. Разработанная конструкция ИФТС представляет собой твердофазный «сэндвич» с сорбированным на планшете антигеном; при этом визуализация результатов реакции осуществляется с помощью реакции между меченым биотином антигеном и меченым пероксидазой хрена авидином.

При сравнительных испытаниях непрямого и авидин-биотинового вариантов ИФА было показано, что чувствительность последнего в отношении определения анти-HBs антител достоверно выше - в 7-10 раз. В то же время, для противодифтерийных и противостолбнячных антител существенных различий обнаружено не было. При этом важным преимуществом разработанного авидин-биотинового варианта стала возможность определения специфических антител в сыворотках крови не только людей, но и животных, что важно при лабораторной оценке качества комбинированных вакцин.

Существенным моментом создания коммерческих ИФТС стала также разработка метрологического обеспечения интерпретации результатов.

В докладе комитета экспертов ВОЗ по биологической стандартизации сформулирован перечень рекомендуемых критериев и руководящих указаний по оценке качества наборов для ИФА, но не описаны методы и технические приемы, с помощью которых можно количественно оценить результаты им-муноанализа [336].

В связи с этим одной из задач исследования являлась разработка методики количественного иммуноферментного определения специфических антител на модели дифтерийных антител (AT). При решении этой задачи был использован метрологический подход: количественное определение AT рассматривалось как многоэтапный процесс, где каждый этап вносит свою составляющую погрешности в конечный результат определения. Эксперименты по выявлению составляющих погрешности измерений проводились во всем диапазоне определяемых концентраций. При этом использовались образцы сывороток с высоким, средним и низким содержанием AT, установленные методом in vivo (РН), и образец сыворотки не содержащий AT. В итоге определены такие характеристики, как сходимость и воспроизводимость результатов, установлена зависимость значений оптической плотности растворов от концентрации AT и её графическое выражение (градуировочный график), а также необходимость применения стандартного образца состава исследуемого вещества для определения указанных характеристик.

На основании проведенных исследований предложен алгоритм обработки результатов ИФА, состоящий из четырех этапов: снятие показаний приборов, нахождение значений по градуировочному графику, определение кратности разведения - вычисление по формуле пересчета абстрактных значений в конкретные (ОП раствора - содержание антител, МЕ/мл).

Данный алгоритм обработки результатов ИФА позволил: аттестовать положительную контрольную сыворотку; определить суммарную погрешность измерений; выделить линейный участок в ограниченном диапазоне значений на градуировочном графике, что привело к получению обоснованных результатов, сравнимых с результатами прецизионного теста определения антитоксинов - реакции нейтрализации (г = 0,9). Учет результатов иммунофермент-ной реакции стандартизирован таким образом, что позволяет оценить содержание специфических антител в крови в международных единицах (МЕ/мл), аналогично биологическому тесту. Разработанная методика была успешно применена для обсчета данных иммуноферментного определения антител к токсинам основных возбудителей клостридиозов (С. perfringens типа А; С. oedematiens типа А; С. tetani, С. botulinum типов А,В,Е) [23], анти-HBs. На основании предлагаемого алгоритма обработки результатов ИФА была создана компьютерная программа количественного определения специфических антител.

Согласно положениям 31 доклада Комитета экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов [336], изготовитель набора для иммунологических испытаний должен привести подробные данные, касающиеся воспроизводимости рабочих характеристик набора, и информировать контрольный орган о методах, используемых для их оценки.

В соответствии со схемой логических шагов, рекомендуемых Европейской Фармакопеей [175], для подтверждения валидности экспериментальных данных, исследования были начаты с проверки предположения о том, является ли распределение результатов иммуноферментного определения антител нормальным (гауссовским).

На большом экспериментальном материале было продемонстрировано наличие нормального распределения результатов иммуноферментного определения специфических антител (дифтерийных, столбнячных, анти-HBs). Это обстоятельство явилось основанием для использования дисперсионного анализа при оценке качества разработанных тест-систем по таким основным критериям, как: оценка линейности и параллелизма результатов измерения анализируемого вещества и калибрователя, точность и воспроизводимость рабочих характеристик и методов их оценки.

Дисперсионный анализ показал:

- наличие параллелизма результатов измерения анализируемого вещества и положительного контрольного образца (калибрователя);

- точность измерений в пределах одной серии оказалась достаточно высокой, коэффициент вариации для исследуемых тест-систем находился в диапазоне 3,3 % - 8,7 %;

- воспроизводимость результатов тоже была весьма высокой - коэффициент вариации не превышал 10 %.

Таким образом, из представленных данных видно, что предлагаемые тест-системы обеспечивают достаточно высокую степень достоверности результатов иммуноферментного определения специфических антител.

Проведенные исследования послужили основанием для разработки технологии получения иммуноферментных тест-систем для определения дифтерийных, столбнячных и анти-HBs антител и оформления НТД. ИФТС для выявления дифтерийных и столбнячных антител (непрямой вариант) зарегистрирована в установленном порядке (Р № 94/90/10). С 1994 года начат производственный выпуск продукции. Следует отметить, что в настоящее время это единственная ИФТС такого класса прошедшая все фазы регистрации и разрешенная к применению в практике здравоохранения. Завершены государственные испытания ИФТС для определения анти-HBs (авидин-биотиновый вариант). Конструкция ИФТС для определения анти-HBs с использованием рекомбинантного HBsAg признана патентоспособной (Патент № 2206095 от 10.06.03 г.).

Следует отметить ещё один важный аспект применения ИФТС - отбор плазмы доноров по титрам специфических антител с целью формирования пулов для приготовления направленных иммуноглобулинов. В Пермском НПО «Биомед» ИФТС для выявления дифтерийных и столбнячных антител уже более 10 лет успешно применяется при изготовлении противостолбнячного иммуноглобулина. К настоящему времени с использованием тест-системы оттитровано более 300 тысяч донорских сывороток и приготовлено 47 серий противостолбнячного иммуноглобулина (50 тыс. доз).

ИФТС для определения анти-HBs (непрямой вариант ИФА) используется и для приготовления препарата Антигеп - иммуноглобулина человека против гепатита В (Патент № 2144379 от 20.01.2000 г.).

Перспективно использование универсальной конструкции ИФТС (ави-дин-биотиновый вариант) для контроля иммуногенности вакцин на животных, при приготовлении гипериммунных лошадиных сывороток (противостолбнячных и противодифтерийных).

Подводя итог исследованиям, результаты которых обобщены во втором разделе работы, следует указать, что нами впервые были разработаны методические основы количественного определения специфических антител с помощью ИФА, а для практического осуществления метода предложен ряд высокочувствительных и специфичных вариантов ИФТС со стандартизованными свойствами, в полной мере отвечающих по своим характеристикам требованиям ВОЗ, предъявляемым к наборам для иммунологических испытаний.

Обобщая итоги проделанной работы следует отметить, что основные поставленные задачи были решены в процессе ее выполнения (табл. 65).

Основные задачи исследования и полученные результаты

Основные задачи исследования Полученные результаты

1. Экспериментально обосновать конструкции комбинированных вакцин, предназначенных для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В. Разработаны оригинальные конструкции комбинированных вакцин для иммунопрофилактики вирусного гепатита В, столбняка, дифтерии (патент № 2130779) и для иммунопрофилактики вирусного гепатита В, столбняка, дифтерии коклюша (патентно 2130778)

2. Разработать технологии изготовления комбинированных вакцин для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В с оформлением нормативно-технической документации для их производства. Разработаны технологии изготовления комбинированных вакцин, предназначенных для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В, оформлена НТД для их производства. Вакцина Бубо-М зарегистрирована в установленном порядке(Р № 000071 /01-20000 от 23.10.2000). Вакцина Бубо-Кок рекомендована к регистрации Комитетом медицинских иммунобиологических препаратов РФ (протокол № 1 от 27.02.03).

3. Разработать иммуноферментные тест-системы для количественного определения специфических антител (дифтерийных, столбнячных, апти-HBs) с оформлением нормативно-технической документации для их производства. Разработаны иммуноферментные тест-системы для количественного определения специфических антител (дифтерийных, столбнячных, анти-HBs), оформлена НТД для их производства. ИФТС для выявления дифтерийных и столбнячных антител (непрямой вариант) зарегистрирована в установленном порядке (Р № 94/90/10). ИФТС для определения анти-HBs (Патент № 2206095) находится в фазе регистрации.

4. Продемонстрировать эффективность применения разработанных тест-систем для оценки поствакцинального иммунитета у людей, оценки иммуногенности вакцин на животных, отбора плазмы доноров с высоким содержанием специфических антител для производства направленных иммуноглобулинов. Разработанные тест-системы используются для оценки иммуногенности комбинированных вакцин на животных, а также оценки эффективности вакцинации и ревакцинации против дифтерии, столбняка и гепатита В, характеристики иммунной структуры населения и выявления групп повышенного риска. Применяются для отбора плазмы доноров с высоким содержанием антител при производстве противостолбнячного иммуноглобулина и препарата Антигеп (Патент № 2144379).

В заключение следует сказать, что первые отечественные комбинированные вакцины Бубо-М и Бубо-Кок, содержащие рекомбинантный HBsAg, характеризуются весьма высоким эпидемиологическим и экономическим потенциалом. В связи с этим перспективы осуществления программы вакцинации взрослых и детей против гепатита В, дифтерии, столбняка и коклюша с использованием комбинированных вакцин выглядят достаточно реальными.

Разработанные ИФТС открывают широкие возможности для проведения массовых эпидемиологических обследований с целью объективной оценки эффективности вакцинации и ревакцинации против дифтерии, столбняка и гепатита В, характеристики иммунной структуры населения и выявления групп повышенного риска.