Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Экспериментальное обоснование нового способа фармакологической и хирургической коррекции хронической ишемии конечностей

На правах рукописи

Пашков Денис Валерьевич

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ НОВОГО СПОСОБА ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ И ХИРУРГИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ ХРОНИЧЕСКОЙ ИШЕМИИ КОНЕЧНОСТЕЙ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология 14.00.27 - хирургия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ООЗ162807

Курск - 2007

003162807

Работа выполнена на базе Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители-

доктор медицинских наук, профессор Покровский Михаил Владимирович доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАЕН и МАИ ¡Мясников Альберт Дмитриевич!

Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук,

профессор Резников Константин Михайлович

доктор медицинских наук, профессор Кошелев Петр Иванович

Ведущая организация*

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический универ-сшет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состой 1ся « Оу » _2007 г в часов на

¡аседании диссертационного совета К 208 039 01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (г Курск, 305041, ул К Маркса)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Росздрава

Авторефераг разослан «

» 2007 г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Хронические облитерирующие заболевания артерий нижних конечностей (ХОЗАНК) составляют более 20% от всех видов сердечно-сосудистой патологии, что соответствует 2-3% от всей численности населения и 35-50% от численности лиц старше 60 лет (Дадвани С А , 2000) По данным ГР Галстян (2006), распространенность ХОЗАНК составляет 910% среди лиц старше 50 лет Особенностью этих заболеваний является тенденция к неуклонному прогрессированию процесса, высокие степени инвали-дизации, процент ампутаций и летальности По прогнозам экспертов ВОЗ, в ближайшие годы ожидается существенный рост этой категории больных - на 57% (Соколович Г Е , 2005)

Весь спектр методов лечения хронической ишемии конечностей можно разделить на консервативные и хирургические Основным разделом лечения больных ХОЗАНК является терапия, проводимая в амбулаторных условиях Дополнением к ней могут быть эпизоды интенсивного лечения в стационаре или же хирургическое вмешательство Наиболее часто для фармакологической коррекции ишемии используются антиагреганты (пентоксифиллин, ацетилсалициловая кислота, клопидогрель) и алпростадил (Кошкин В.М , 2002)

В настоящее время определены показания для выбора того или иного метода в зависимости от стадии заболевания Оба направления лечения активно развиваются в настоящее время и в большинстве случаев используются сочета-но консервативные мероприятия проводятся в предоперационном периоде, а также продолжаются после выписки пациентов из стационаров Применяемые в практике виды хирургических вмешательств и программы фармакологической коррекции ишемии различаются также механизмом действия

Несмотря на устоявшиеся программы консервативного лечения ХОЗАНК, целостное представление о фармакологической стимуляции неоангиогенеза в полной мере не сформировано Стимуляция неоангиогенеза в пораженной конечности и активация коллатерального кровообращения — одно из перспективных направлений лечения Это может быть достигнуто как консервативными, так и хирургическими методами

Хроническая ишемия конечности закономерно сопровождается развитием дисфункции сосудистого эндотелия, которая сама по себе является фактором, усугубляющим артериальную недостаточность В широком смысле эндотели-альная дисфункция может быть определена как неадекватное образование в эндотелии различных биологически активных веществ Поскольку оксид азота принимает участие в регуляции практически всех функций эндотелия (регуляция сосудистого тонуса, тромборезистетность сосудов, регуляция адгезии лейкоцитов и проницаемости), понятие эндотеяиальной дисфункции почти полностью укладывается в состояние пониженной продукции эндотелием оксида азота (Петрищев Н Н и соавт, 2003). Пониженное образование оксида азота при ХОЗАНК требует фармакологической коррекции В качестве донора N0 в эксперименте может быть использована незаменимая аминокислота Ь-аргинин, являющаяся природным предшественником N0

Предлагаемые в литературе хирургические методы прямой реваскуляриза-ции не всегда обеспечивают положительный эффект, в ряде случаев имеют противопоказания, иногда сопровождаются развитием гнойных осложнений, а также рецидивов тяжелых степеней ишемии конечностей (Казанчян П О, 2006) Проблема раннего послеоперационного тромбоза шунтов и протезов связана с отсутствием у больных воспринимающего дистального русла, что в условиях увеличивающегося притока крови после операции приводит к осложнениям Увеличение компенсаторных возможностей микроциркуляторного русла может быть достигнуто за счет увеличения плотности и общей площади капиллярной сети, что возможно путем стимуляции неоангиогенеза в ишемизирован-ной конечности (Шевченко Ю JI, 2002)

Установлено, что раздражение костного мозга вызывает расширение сосудов раздражаемой конечности и умеренное сужение сосудов других областей (Озолиныш ПП, 1963) По теории П С Кромпехера (1979), в ответ на травму кости происходит выброс из костного мозга стволовых недифференцированных клеток, образующих между концами отломков сеть мельчайших, не имеющих характерной идентификации сосудов Эти сосуды содержат большое количество крови, необходимой для полноценного осуществления процесса репаратив-ной регенерации Многочисленные исследования позволили теоретически и экспериментально обосновать использование реакции регионарного кровообращения на травму с целью создания локальной стойкой артериальной гиперемии, которая могла бы компенсировать хроническую ишемию конечности Развитие этой концепции определило, что стимулирующим фактором неоангиогенеза является пролонгированная травма костной ткани

Б С Суковатых и соавт (2006), используя в качестве прототипа реваскуля-ризирующую остеотрепанацию ФН Зусмановича (1991), предложили вместо нанесения нескольких отверстий в кости создавать одну большую костную полость с последующей мышечной тампонадой Операция названа авторами рева-скуляризирующей остеомиопластикой (РОМП) Вмешательство имеет целью индуцировать неоваскуляризацию мышц конечности посредством роста кровеносных сосудов из костного мозга, а также миграции стволовых клеток, моно-нуклеаров из костного мозга в мышцу Авторами получены хорошие результаты при экспериментальной и клинической апробации метода Хорошие результаты от использования подобного рода вмешательств у пациентов с хронической ишемией конечности отражены в материалах XII Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов (28-31 октября, Москва, 2006) Проведенные A Abdulaziz (2003) эксперименты показали, что введение аутолошчных стро-мальных клеток костного мозга индуцирует неоваскуляризацию в ишемизиро-ванной конечности крысы Кроме того, исследователем отмечена активация регенерации различных компонентов мышечной ткани (эндотелий, гладкие мышцы, скелетные мышцы, адипоциты) Подобные результаты опубликованы другими авторами (Minamoto V В , 2001, Hawke Т J , 2001, Chen J С , 2003)

В свете данных представлений интересным является изучение эффективности L-аргинина и операции РОМП в условиях экспериментальной ишемии

конечности, а также оценка эффективности комбинированного использования операции и Ь-аргинина

В диссертации продолжены исследования эффектов операции реваскуля-ризирующей остеомиопластики, проходящие на кафедре общей хирургии Курского государственного медицинского университета, а также изучение эффектов Ь-аргинина, проходящие на экспериментальной базе Научно-исследовательского института Экологической медицины Курского государственного медицинского университета. Номер государственной регистрации темы 01 2 007 09149

Целью работы явилось экспериментальное обоснование эффективности Ь-аргинина, операции реваскуляризирующей остеомиопластики (РОМП), а также комбинации операции РОМП с Ь-аргинином при хронической ишемии конечности

Задачи исследования

1 Разработать модель экспериментальной хронической ишемии конечности у крыс и изучить динамику клинических признаков патологии, уровня микроциркуляции и морфологической картины на протяжении 3 месяцев

2 Изучить немедленную реакцию системы микроциркуляции у здорового животного на введение пентоксифиллина и Ь-аргинина в различных дозировках.

3 Оценить уровень микроциркуляции и динамику морфологической картины у крыс с экспериментальной ишемией конечности на фоне лечения Ь-аргинином

4 Оценить уровень микроциркуляции и динамику морфологической картины у крыс с экспериментальной ишемией конечности на фоне лечения препаратом сравнения - пентоксифиллином

5. Оценить уровень микроциркуляции и динамику морфологической картины у крыс с экспериментальной ишемией конечности после операции реваскуляризирующей остеомиопластики

6 Оценить уровень микроциркуляции и динамику морфологической картины у крыс с экспериментальной ишемией конечности на фоне комбинации оперативного и консервативного лечения (реваскуляризирующая остеомиопластика + Ь-аргинин).

Научная новизна и теоретическая значимость

В работе впервые изучен уровень микроциркуляции в мышцах голени здоровых крыс, а также его динамика на протяжении 3 месяцев после моделирования хронической ишемии задней конечности Изучена динамика уровня микроциркуляции на фоне введения пентоксифиллина и Ь-аргинина в различных дозах, изучена и доказана эффективность Ь-аргинина в дозе 200 мг/кг при экспериментальной хронической ишемии конечности Получены патенты на изобретения «Способ хирургического лечения хронической ишемии нижних конечностей», № 2268662 от 27 01 2006 г, «Способ фармакологической коррекции

хронической ишемии конечностей», № 2302239 от 10 07 2007 Получены удостоверения на 2 рационализаторских предложения

Практическая значимость. Доказательство эффективности предлагаемых методов непрямой реваскуляризации поередством фармакологической и хирургической стимуляции неоангиогенеза при экспериментальной ишемии конечности позволяет проводить их клиническую апробацию, что расширит спектр лечебных методов при хронической ишемии конечностей

Внедрение в практику. Метод реваскуляризирующей остеомиопластнки используется в качестве средства непрямой реваскуляризации в клинике сосудистой хирургии МУЗ ГБ СМП г Курска

Апробация полученных результатов Основные положения диссертации отражены в 12 печатных работах, в том числе в рецензируемых ВАК журналах Основные положения работы доложены на XII Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов, проходившем 2831 октября 2006 г в НЦ ССХ им А Н Бакулева (2006) Диссертация представлена на межкафедральной научной конференции кафедр общей хирургии, оперативной хирургии и топографической анатомии, хирургических болезней № 1 и № 2, онкологии, фармакологии, клинической фармакологии, анатомии, патологической анатомии, гистологии КГМУ Материалы исследования опубликованы в Бюллетене XI ежегодной Национальной сессии НЦ ССХ им А Н Бакулева, в сборниках трудов 71-й и 72-й научных конференций КГМУ и сессий Центрально-Черноземного научного центра РАМН (2006, 2007), в материалах XIV национального конгресса «Человек и лекарство», 1 национального конгресса терапевтов, Второй международной Российско-Китайской конференции по фармакологии

Положения, выносимые на защиту

1 Экспериментальная хроническая ишемия конечности, вызываемая удалением участка магистрального сосуда нижней конечности у крыс, характеризуется развитием к 7 суткам после операции клинических симптомов артериальной недостаточности конечности (трофические язвы, гипотрофия, акральные некрозы, боль по косвенным признакам), достоверным снижением уровня микроциркуляции в мышцах голени, развитием дистрофических и некробиотических процессов в тканях С течением времени наблюдается относительная компенсация кровообращения в конечности и восстановление исходного уровня микроциркуляции к 3 месяцу наблюдения

2 Ежедневное применение Ь-аргинина в дозе 200 мг/кг 1 раз в сутки при экспериментальной ишемии конечности полностью восстанавливает перфузию мышечной ткани к 28 суткам эксперимента, увеличивает скорость метаморфоза морфологической картины в тканях, т е производит значимый лечебный эффект

3 Ежедневное применение пентоксифиллина в дозах 60, 120 и 240 мг/кг 1 раз в сутки при экспериментальной ишемии конечности к 28 суткам не приводит к достоверному увеличению уровня микроциркуляции в мы-

шечной ткани животного и не влияет на скорость морфологических превращений в ишемизированных тканях 4 Операция реваскуляризирующей остеомиопластики при экспериментальной хронической ишемии конечности улучшает кровообращение на микроциркуляторном уровне, увеличивает скорость метаморфоза морфологической картины в ишемизированных тканях и может быть использована в клинике как в качестве самостоятельного метода лечения больных с ХОЗАНК, так и в комплексе с L-аргинином Структура и объем диссертации Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, который включает 103 отечественных и 111 иностранных источников Представленный материал иллюстрирован 32 рисунками и 7 таблицами

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Обоснование доз и дизайн эксперимента. Рекомендуемая доза L-аргинина составляет 200-400 мг/кг (Покровский М В и соавт , 2006) Для изучения эффективности препарата мы выбрали наименьшую рекомендуемую дозу -200 мг/кг Доза 30 мг/кг рекомендована СанПиНом в качестве пищевой добавки Нами проведены исследования пентоксифиллина в дозах 60, 120 и 240 мг/кг, которые в эксперименте на крысах дают дозозависимый эффект (Котов В Н, 2006)

Экспериментальное исследование выполнено на 350 крысах-самках линии Wistar, которые были разделены на контрольную (п=100) и опытную (п=250) серии В контрольной серии изучены нормальные уровень микроциркуляции и морфологическая картина в мышцах голени, а также динамика этих показателей на протяжении трех месяцев после операции моделирования хронической ишемии конечности

На 60 здоровых (интактных) крысах опытной серии оценивалась динамика уровня микроциркуляции на протяжении 6 часов после введения L-аргинина и пентоксифиллина Для этого животные были разделены на 3 группы по 20 животных в каждой Животным первой группы вводили пентоксифиллин в дозе 60 мг/кг, животным второй группы - пентоксифиллин в дозе 240 мг/кг, животным третьей группы вводили L-аргинин в дозе 200 мг/кг. Флоуметрию производили на сроках 1 час, 2 часа, 4 часа и 6 часов после введения препарата На каждый срок наблюдения выводилось по 5 животных из группы

На 190 крысах, которым было выполнено моделирование ишемии задней конечности, изучена динамика уровня микроциркуляции и морфологической картины на фоне лечения экспериментальной ишемии конечности традиционным антиагрегантом пентоксифиллином и изучаемыми методами

Моделирование экспериментальной ишемии конечности проводилось путем удаления участка магистрального сосуда задней конечности, включающего бедренную, подколенную артерии и начальные отделы артерий голени Методика моделирования описана в работах S Takeshita et al (1998), М Suganoetal (2004)

После выполнения операции моделирования животные были разделены на 7 групп. В каждой группе на седьмые сутки после операции начинали коррекцию экспериментальной патологии. Срок в семь суток условно принят как время, в течение которого купируются признаки острой ишемии конечности и постепенно формируется хроническая артериальная недостаточность.

В качестве средства коррекции экспериментальной ишемии в опытных группах использовались следующие консервативные и оперативные методы лечения:

• пентоксифиллин в дозах 60, 120 и 240 мг/кг перорально (препарат сравнения) («Trental 400»., Aventis Pharma Std., Индия);

• L-аргинин внутрибрюшинно в виде водного раствора в дозах 30 и 200 мг/кг (L-Arginine, "Ajinomoto Co.Ink.", Japan);

• операция реваскуляризирующей остеомиопластики (РОМГ1) per .ve;

• комбинированное лечение; операция РОМП + L-аргинин 200 мг/кг.

Животных выводили из эксперимента на 10, 21 и 28 сутки (по 10 крыс из

группы на каждый срок наблюдения). На этих сроках производили флоуметрию в мышцах конечности, которые впоследствии забирали для морфологического и морфометрического исследований.

Пентоксифиллин вводили внутрижелудочно в виде суспензии, которую готовили из таблетированной формы препарата. L-аргинин вводили внутрибрюшинно в виде водного раствора, приготовленного extempore.

Операцию РОМП проводили по оригинальной методике (патент № 2268662 от 27.01.2006). Под наркозом в переднебоковом участке области голени после подготовки операционного ноля рассекается кожа, собственная фасция. Мышцы отодвигаются крючком, обнажается латеральная поверхность большеберцовой кости, с которой удаляется кортикальная пластинка длиной около 40% от длины кости на всю ширину латеральной поверхности больше-берцовой кости. Дефект распространяется в глубину вплоть до вскрытия костномозгового канала. Формируется точечное отверстие на середине длины медиальной поверхности большеберцовой кости. Участок мышцы освобождается от фасции и подшивается к образовавшемуся дефекту кости. Рана послойно ушивается. Этап операции изображен на рис. 1.

Рисунок 1. Этап операции РОМП: мышцы голени отодвинуты, схематично показан фрагмент кортикального слоя большеберцовой кости, подлежащий удалению.

Оценка уровня микроциркуляции проводилась методом лазерной доппле-ровской флоуметрии при помощи аппарата «Вюрас-зу^етк МР-100» и датчика

«Т80-144». Запись и обработка данных осуществлялись при помощи программы АсцК.по\у1е<%е 38. Процедура флоуметрии проводилась под накрозом эта-миналом натрия в дозе 35 мг/кг. Иссекали участок кожи в передненаружном участке области голени, обнажали переднюю группу мышц. Уровень микроциркуляции регистрировали в пяти точках: 1) середина длины мышцы; точка на 3-4 мм - 2) выше, 3) ниже, 4) латеральнее и 5) медиальнее от первой. Запись кривой уровня микроциркуляции проводили в течение 30 сек в каждой точке. Из полученных пяти значений выводили среднее, которое вносили в протокол и принимали за уровень микроциркуляции в мышцах голени у данного животного. Из 10 полученных значений выводили среднее, которое принимали за уровень микроциркуляции в данной группе животных на данном сроке исследования. Фрагмент кривой микроциркуляции представлена на рис. 2,

переходе от одной точки к другой.

Изготовление морфологических препаратов мышц конечности проводили по общепринятой методике. Срезы окрашивали по методу «гематоксилин + эозин». Микроскопию проводили при помощи светового микроскопа. Для мор-фомегрии использовали сетку Автандилова. При оценке результатов учитывали соотношение в препаратах площади грануляционной ткани и площади некроза на 10 и 21 сутки; соотношение площадей мышечной и грануляционной тканей на 28 сутки.

Статистическая обработка результатов. Достоверность наблюдавшихся при действии исследованных препаратов изменений параметров, как абсолютных, так и в приростах от исходного уровня, определяли разностным методом описательной статистики с нахождением средних значений сдвигов (М), средней ошибки средней арифметической (±т) и вероятности возможной ошибки (р), рассчитанной с использованием t-test для групп с различной дисперсией. Различия оценивали как достоверные при р<0,05. Статистические расчеты проводились с использованием программы Microsoft Excel 2003.

1 Колебания уровня микроциркуляции связаны с дыхательными движениями животного.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Динамика клинических, флоуметрических и морфологических показателей при моделировании ишемии.

Среднее значение уровня микроциркуляции в наружной группе мышц правой голени в интактной группе крыс составляет 535,2+37,1 п е. (перфузионных единиц) Ошибка этого среднего значения (37,1) не превышает 10% от абсолютного значения (53,52), что свидетельствует о достаточном количестве единиц наблюдения в группе После операции моделирования наблюдались признаки острой ишемии оперированной конечности Отмечались ишемический отек, боль в конечности, что проявилось неучастием конечности в передвижении и появлением агрессивной реакции животного в ответ на касание инструментом к больной конечности В остром периоде после моделирования в 100% случаев отмечено развитие ишемического отека конечности, неучастие конечности в передвижении, наличие признаков интенсивного болевого синдрома В 3,3% случаев развилась влажная гангрена голени

По прошествии 3-4 суток наблюдалась относительная компенсация острой артериальной недостаточности конечность включалась в акт передвижения, исчезал или уменьшался ишемический отек Параллельно появлялись признаки формирующейся хронической ишемии конечности, что характеризовалось наличием таких патогномоничных симптомов, как перемежающаяся хромота, трофические расстройства в дистальных участках конечности - артериальные трофические язвы В некоторых случаях наблюдалась сухая гангрена пальцев стопы, характерная для синдрома хронической артериальной недостаточности В отдельных случаях мы наблюдали самоампутацию конечности (очевидно, что развилась сухая гангрена с последующим развитием линии демаркации и отторжением некротизированных участков)

Проведение флоуметрии показывает, что после операции уровень микроциркуляции резко и быстро снижается, а затем медленно восстанавливается, однако до 28 суток включительно остается достоверно ниже нормального значения, зарегистрированного в группе интактных животных Прежних значений уровень микроциркуляции достигает только через 3 месяца после операции

На протяжении первых десяти суток уровень микроциркуляции остается приблизительно таким же, который наблюдался и в остром периоде после операции - в пределах 210-230 п е , тенденция к восстановлению появляется только с 14 суток эксперимента Настоящий факт мы объясняем становлением к этому сроку анатомического механизма компенсации артериальной недостаточности - по данным Б 1иёаЬ (1998), с 7 суток начинается ангиогенез

Динамика уровня микроциркуляции у животных контрольной группы представлена на рис 3

куляции в перфузионных единицах. В точках, отмеченных белым цветом, имеются достоверные различия по сравнению со значением в точке «Норма» при р<0,05.

При морфологическом исследовании на 10 сутки после операции моделирования в мышцах наблюдается субтотальный коагуляционный некроз миоци-тов, окруженный демаркационной зоной. В некоторых участках отмечается резорбция некротических клеток и замещение их незрелой соединительной тканью, При морфометрическом исследовании отмечено, что зона некроза занимает 79,5+6,7% от общей площади препарата. На остальную часть (20,5+7,06%) приходится грануляционная ткань, которая уже успела развиться на месте некроза, подвергающегося резорбции. На 21 сутки препарат так же, как и на 10 сутки, представлен участками некроза, которые прогрессивно резорбируются и замещаются грануляционной тканью. Отмечается начало регенерации мышечных волокон на месте развития грануляций, однако четко разграничить данные тканевые элементы достаточно сложно из-за выраженной интерстициальной инфильтрации. Площадь живых тканей (грануляционная ткань + регенерирующая мышечная ткань) составляет 74,06+6,65% по отношению к общей площади препарата; площадь оставшегося некроза в препарате - 25,94+7,25% от общей площади. На 28 сутки эксперимента наблюдается активная регенерация мышечных волокон, которые замещают грануляционную ткань. На этом сроке участков некроза почти нет. Там, где регенерация паренхимы по тем или иным причинам оказывается невозможной, наблюдается созревание грануляционной ткани с превращением последней в рубцовую. При морфометрии получены следующие результаты. Регенерирующая мышечная ткань занимает 68,1+8,64% от общей площади среза. Грануляционная ткань занимает 31,9+8,64% от общей площади. Результаты морфометрии в контроле изображены на рис. 4-5.

2 Расстояния между точками показаны одинаковыми с целью упрощения графика.

Рисунок 4. Результаты морфометрии в контрольной группе. По оси X - срок наблюдения, по оси У - проценты площади препарата. * - звездочкой отмечены достоверные различия по сравнению со значением на 10 сутки.

1Й1я||1§

ШШЯЙЩ

ЩРЩж ЙЙШЙ

ЩЙЙвШ

ЙШЙЙЙЙЙ

□ Мышцы

О Грануляции

Рисунок 5. Результаты морфометрии в контрольной группе. По оси X - срок наблюдения, по оси У - проценты площади препарата.

Следует отметить, что результаты морфологического исследования на 21 и 28 сутки между собой статистически несравнимы, так как морфологическая картина на этих сроках состоит из различных тканей, почему отличия являются не количественными, а качественными. В связи с этим результаты морфометрии на 28 сутки показан на отдельном рисунке.

2. Немедленная реакция уровня микроциркуляции в мышцах голени на фоне введения Ь-аргинина и пентоксифиллина у здоровых крыс.

Флоуметрическое исследование на фоне введения пентоксифиллина показало, что продолжительное и достоверное повышение уровня микроциркуляции наблюдается лишь при применении препарата в дозе 240 мг/кг, что намного превышает терапевтическую дозу (до 20 мг/кг). Введение Ь-аргинина значимых изменений уровня микроциркуляции в течение 6 часов наблюдения не вызвало. Динамика уровня микроциркуляции в остром опыте показана на рис. 6.

Рисунок 6. Динамика уровня микроциркуляции у здоровых крыс на фоне введения изучаемых препаратов. По оси X - срок наблюдения в часах, по оси У - уровень микроциркуляции в перфузионных единицах. Белым цветом обозначены точки, в которых регистрируются статистически значимые различия по сравнению с точкой «0:00» при р<0,05.

Повышение уровня микроциркуляции после введения пентоксифиллина объясняется тем, что препарат улучшает реологические свойства крови, оказывает умеренное спазмолитическое действие. Как результат этого, активируется кровообращение в сосудах микроциркуляторного русла, что регистрируется при помощи флоуметрии. Следует отметить, что на протяжении шести часов после введения Ь-аргинина величина уровня микроциркуляции изменяется незначительно: статистически значимых различий не наблюдается.

Из графика видно, Ь-аргинин непосредственного влияния на систему микроциркуляции не оказывает, что совпадает с литературными данными о механизме действия Ь-аргинина. У вещества отсутствует влияние на реологические свойства крови, нет прямого вазодилатирующего эффекта. Для оказания эффекта в данном случае требуется время для включения соединения в клеточный метаболизм и синтез оксида азота, который и произведет лечебный эффект.

3. Результаты флоуметрии и морфологического исследования в группах с моделированием ишемии конечности, получавших Ь-аргинин.

В группе, получавшей Ь-аргинин в дозе 30 мг/кг, уровень микроциркуляции на 10 сутки составляет 226,2+9,17 п. е., на 21 сутки - 282,84+13,55 п. е., на 28 сутки - 426,28+15,58 п. е. Прослеживается явная тенденция к отличиям на сроках 10 и 21 суток по сравнению с контролем, на сроке 28 суток имеются достоверные различия (р<0,05).

В группе, получавшей Ь-аргинин в дозе 200 мг/кг, уровень микроциркуляции на 10 сутки составляет 239,54+11,59, на 21 сутки - 415,40+19,71, на 28 сутки - 489,36+18,48. В этой группе имеются статистически значимые различия по сравнению с контролем на всех сроках эксперимента (р<0,05) (рис. 7).

0> с о оэ ст> АО -Г

5 Я" £ 400 1 § 300 0 1 1 200 л | 100- о а * 0- 1209.20 Я ™ 1 1312,08 тГ СО N СО с* ш 5 — 1369,56

10 сутки 21 сутки 28 сутки

|о Контроль □ Ь-аргинин 30 мг/кг И Ьаргиним 200 мг/кг |

Рисунок 7. Результаты флоуметрии в группах, получавших Ь-аргинин. По оси X -срок наблюдения, по оси У - уровень микроциркуляции в перфузионных единицах. * - отмечены достоверные различия по сравнению с контролем.

При морфологическом исследовании в группе животных, получавших Ь-аргинин, динамика морфологической картины не имеет принципиальных отличий по сравнению с контролем. Так же, как и в контроле, на 10 сутки в препарате наблюдается морфологическая картина сухого некроза миоцитов. Впоследствии зона некроза резорбируется и замещается грануляционной тканью, на месте которой затем регенерируют мышечные элементы. Однако при проведении морфометрического исследования и сравнении результатов отмечается либо тенденция к отличиям между опытом и контролем, либо статистически значимая разница.

На 10 сутки результаты морфометрии в группах, получавших Ь-аргинин, не отличаются от показателей контроля. К 21 суткам эксперимента отмечается усиленная резорбция некроза, прогрессивное развитие грануляционной ткани, появляются признаки регенерации мышечных клеток. При морфометрии нами измерена общая площадь грануляций и регенерирующих мышечных волокон, так как четкого различия на этом сроке невозможно провести из-за выраженной интерстициальной инфильтрации молодыми клеточными элементами соединительной ткани. На 28 сутки эксперимента в контрольной и в опытных группах наблюдается почти полная резорбция некроза. Отмечается активная пролиферация мышечных волокон, уменьшается интерстициальная инфильтрация новообразованных участков мышечной ткани. В некоторых местах остается грануляционная ткань без признаков регенерации паренхиматозных элементов мышечной ткани и формированием из грануляционной ткани грубоволокнистой. В группе, получавшей Ь-аргинин в дозе 200 мг/кг, на 28 сутки имеются достоверные различия по сравнению с контролем (р<0,05). Результаты морфометрии на 28 сутки отображены на рис. 8.

Контроль I.-аргинин 30 мг/кг 1.-арг*нин 200 мг/кг

□ Грануляционная ткань Мышечная ткань

Рисунок 8. Результаты морфометрии на 28 сутки в группах, получавших Ь-аргинин. * - отмечены достоверные различия по сравнению с контролем.

4. Результаты флоуметрии и морфологического исследования в группах с моделированием ишемии конечности, получавших пентоксифнллин.

В опытных группах, получавших в качестве средства коррекции ишемии пентоксифнллин, получены следующие результаты. Уровень микроциркуляции в группе, получавшей пентоксифнллин в дозе 60 мг/кг, на 10 сутки составляет 232,20+13,57, на 21 сутки - 347,96+17,36, на 28 сутки - 388,98±13,34. Имеют место отличия по сравнению с контрольной группой на всех сроках на уровне тенденции, достоверных различий между этой и контрольной группами животных нет. В группах, получавших пентоксифнллин в дозах 120 мг/кг и 240 мг/кг, отмечаются достоверные различия по сравнению с контролем на 10 сутки эксперимента. Однако на сроке 28 суток достоверных отличий не наблюдается и регистрируется уровень микроциркуляции, сопоставимый с контролем (рис. 9). Динамика морфологической картины в группах, получавших пентоксифнллин, аналогична тем изменениям, которые наблюдаются в контроле. При статистической обработке результатов статистически значимых различий по сравнению с контрольной группой ни на одном из сроков наблюдения не получено (рис. 10).

О Контроль О Пентоксифллин 60 мг/кг

в Пентокси(4мллнн 120 мг/кг а Пентоксифнллин 240 мг/кг

Рисунок 9. Результаты флоуметрии в опытных группах, получавших пентоксифнллин. По оси X - срок наблюдения, по оси У - уровень микроциркуляции в перфузионных единицах. * - звездочкой отмечены достоверные различия по сравнению с контролем.

100

90

ЯП

70

!"

п 60

ЯП

& С 40

Л я 30

3 о 20

с с 10

0

Ж

¡5

"С»*'

¡.-¡^ 1

I :

Контроль

Пентокс 60 Пентокс 120 Пентокс 240 мг/кг мг/кг мг/кг

□ Грануляционная ткань Ш Мышечная ткань

Рисунок 10. Результаты морфомегрии на 28 сутки в группах, получавших пентокси-филлин. Статистически значимых различий по сравнению с контролем не получено. Пентокс - пентоксифиллин.

5. Результаты флоумегрии и морфологического исследовании в группе с моделированием ишемии конечности, получавшей оперативное лечение.

Уровень микроциркуляции на фоне оперативного лечения на 10 сутки составляет 249.16+9,84, на 21 сутки - 439,21+24,18, на 28 сутки - 567,16+28,12 н. е. На всех сроках эксперимента в группе животных, которым была выполнена операция РОМП, флоуметрические показатели достоверно отличаются от показателей контрольной группы (р<0,05). Результаты флоуметрии в группе, получавшей оперативное лечение, показаны на рис. 11.

При проведении морфологического исследования на 28 сутки имеет место статистически значимая разница между площадью регенерирующей мышечной ткани в опытной группе по сравнению с контролем при р<0,05 (рис. 12).

600 500 ■• 400 ■ 300

200 -I 100 :

0 —

Ж

10 сутки 21 сутки

':□ Контроль □ РОМП

28 сутки

Рисунок 11. Результаты флоуметрии в группе, получавшей оперативное лечение. Имеются достоверные различия по сравнению с контролем на всех сроках наблюдения - обо-шачены - *.

Рисунок 12. Результаты морфометрии н группе, получавшей оперативное лечение, на 28 сутки. * - отмечены статистически значимые различия по сравнению с контролем.

6. Результаты флоуметрии и морфологического исследовании в группе с моделированием хронической ишемии, получавшей комбинированное лечение.

В данной группе животных коррекция ишемии производилась сочетанием операции РОМП с внутрибрюшинным введением Ь-аргинина в дозе 200 мг/кг. В этой группе получены наилучшие результаты; уровень микроциркуляции достоверно выше показателей контрольной группы на всех сроках эксперимента (р<0,001). Величина уровня микроциркуляции на фоне комбинированного лечения представлена на рис. 13. Следует отметить, что в группах, получавших Ь-аргинин в дозе 200 мг/кг на фоне оперативного лечения - РОМП, результаты флоуметрии на 28 сутки не отличаются от исходного уровня, что позволяет говорить о полном восстановлении уровня микроциркуляции на фоне лечения.

Как и в контроле, динамика морфологической картины в группе, получавшей комбинированное лечение, заключается в развитии некроза на 10 сутки, резорбции некроза и развитии грануляций на 21 сутки и появлении начинающейся на 28 сутки регенерации. При статистической обработке результатов на 28 сутки имеются достоверные различия по скорости регенерации миоцитов но сравнению с контролем (рис. 14).

® 700 с

| 600

с 500

| 400

I 300

I 200

I 100

О Контроль И РОМП + [.-аргинин 200 мг/кг

Рисунок 13. Результаты флоуметрии в группе, получавшей комбинированное лечение. Имеются достоверные различия по сравнению с контролем на всех сроках наблюдения - обозначены - *.

10 сутки

21 сутки

28 сутки

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

шшшж

" «да* -

plfflf

jHeij; '.7V

Контроль

РОМП + L-аргинин 200 мг/кг

И Грануляционная ткань S Мышечная ткань

Рисунок 14. Результаты морфометрии в группе, получавшей комбинированное лечение, на 28 сутки. * - отмечены статистически значимые различия по сравнению с контролем.

Представленные в работе морфологические данные неоднозначно трактуются в части правомочности заключения о регенерации мышечной ткани на месте некроза и вообще о возможности регенерации скелетной мускулатуры в целом. Тем не менее в сообщениях периодической печати ряда последних лет публикуются данные о восстановлении мышечной ткани именно после некротических ее изменений (Ferrari G. et al., 1998; Minamoto V.B. et al, 2001; Hawke T.J. et al, 2001; Chen J.C., 2003). Наблюдаемый авторами процесс восстановления мышц обозначается как «remarkable» - замечательный, в высшей степени необыкновенный. Описывается потенцирование регенерации с помощью стволовых клеток костного мозга, мононуклеаров и др. В связи с высокой диффе-ренцировкой скелетного мышечного волокна сами миоциты не могут служить источником регенерации, эту функции несут в себе вспомогательные клетки мышечной ткани - клетки-сателлиты (satellite cells). В работах отмечено, что фенотип и физиология этих клеток недостаточно изучена, т. к. с момента их открытия не прошло и 40 лет (Hawke T.J. et al., 2001). В свете этих данных в диссертации употребляется термин «регенерация» по отношению к скелетным мышцам крыс без претензии на абсолютные правомочность и правильность такого утверждения. Таким термином мы в первую очередь обозначаем наблюдаемый в мышцах конечности метаморфоз морфологической картины с течением времени. Проведение морфометрии и статистическая обработка данных показывают, что скорость таких превращений в контрольной и опытных группах неодинакова. Эти особенности и нашли отражение в представленных нами диаграммах.

Таким образом, в результате проведенных исследований изучен уровень микроциркуляции в мышцах голени крыс в норме, а также динамика клинических, флоуметрических и морфологических показателей в течение 3 месяцев после операции моделирования ишемии конечности. Результаты обследования животных контрольной группы показали действительное развитие хронической ишемии конечности, которая регистрируется на основании наличия клинических признаков артериальной недостаточности, достоверного снижения уровня

микроциркулядии и развития ишемического повреждения и некроза миоцитов В то же время отмечено неполное соответствие экспериментальной патологии тем закономерностям прогрессирования заболевания, которые наблюдаются у пациентов с ХОЗАНК Изучена немедленная реакция уровня микроциркуляции на введение пентоксифиллина и Ь-аргинина у здорового животного в разных дозах, в результате чего выявлено, что мгновенной реакции флоуметрического показателя на введение Ь-аргинина не наблюдается Это совпадает с теоретическими данными о метаболизме этого вещества и физиологических эффектах такого важного метаболита, как оксид азота Достоверные изменения в группе, получавшей пентоксифиллин, объясняются реолитическим и спазмолитическим действием препарата В диссертации доказана эффективность Ь-аргинина в дозе 200 мг/кг ежедневно 1 раз в сутки, операции РОМП, выполненной на 7 сутки после моделирования, и комбинированного лечения (операции РОМП + Ь-аршнин 200 мг/кг) при хронической ишемии конечности Это подтверждается полным восстановлением уровня микроциркуляции к 28 суткам эксперимента и статистически значимой разницей между скоростью резорбции некроза и восстановления миоцитов после повреждения в опыте по сравнению с контролем Отмечено, что Ь-аргинин оказывает дозозависимое действие прирост флоумет-рических показателей тем выше, чем больше доза вещества В группах с моделированием ишемии конечности, получавших только пентоксифиллин, не выявлено достоверных различий по сравнению с контролем Наилучшие результаты наблюдаются в группе животных, получавших комбинированное лечение

ВЫВОДЫ

1 Моделирование ишемии конечности обнаружило, что к 7 суткам после операции удаления участка магистрального сосуда нижней конечности у крыс развивается комплекс функциональных (клинических), флоуметри-ческих и морфологических изменений, указывающих на формирование хронической артериальной недостаточности конечности Отмечено достоверное различие по уровню микроциркуляции между контрольной и интактной группами При морфологическом исследовании наблюдаются некробиоз и дистрофия тканей оперированной конечности

2 Введение пентоксифиллина здоровым крысам приводит к статистически достоверному повышению уровня микроцикуляции в мышцах конечности, которое сохраняется в течение 2 часов при дозе препарата 60 мг/кг и более 6 часов при дозе 240 мг/кг Введение Ь-аргинина здоровым крысам в дозе 200 мг/кг не приводит к значимым изменениям уровня микроциркуляции в течение 6 часов, что объясняется особенностями метаболизма вещества — необходимостью некоторого времени для генерации N0.

3 Ежедневное системное введение Ь-аргинина с 7 по 28 дни в дозе 30 мг/кг 1 раз в сутки на фоне моделирования ишемии приводит к достоверному увеличению уровня микроциркуляции к 28 суткам эксперимента Ежедневное системное введение Ь-аргинина в дозе 200 мг/кг 1 раз в сутки приводит к полному восстановлению уровня микроциркуляции и ускоря-

ет процессы восстановления мышечной ткани конечности к 28 суткам эксперимента Данные флоуметрического исследования кровообращения в сосудах микроциркуляторного русла полностью подтверждаются морфологическими данными, где обнаружено статистически достоверное увеличение удельной площади мышечной ткани

4 Ежедневное системное введение пентоксифиллина с 7 по 28 дни в дозах 60, 120 и 240 мг/кг 1 раз в сутки на фоне моделирования ишемии к 28 суткам не приводит к достоверному увеличению уровня микроциркуляции по сравнению с контролем Данные флоуметрического исследования сопоставимы с динамикой морфологических изменений, где также не отмечено статистически значимых отличий от контрольной группы крыс

5 Операция реваскуляризирующей остеомиопластики, выполненная на 7 сутки после моделирования ишемии конечности, приводит к полному ее регрессу, который отмечается также к 28 суткам эксперимента с восстановлением исходного уровня микроциркуляции в мышцах конечности

6 Комбинированное лечение в виде операции РОМП и Ь-аргинина в дозе 200 мг/кг также приводит к полному восстановлению кровообращения в конечности к 28 суткам наблюдения и увеличивает скорость регенерации миоцитов Данное сочетание обладает наилучшим лечебным эффектом на экспериментальную ишемию

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Эффективность Ь-аргинина в дозе 200 мг/кг при экспериментальной ишемии конечности позволяет рекомендовать препарат для дальнейшего изучения в клинике у больных с ХОЗАНК

2 Эффективность операции РОМП при хронической ишемии конечности позволяет рекомендовать данный метод в качестве средства непрямой ре-васкуляризации у пациентов с ХОЗАНК, которым не может быть выполнена реконструктивная операция

3 Комбинация операции РОМП и введения Ь-аргинина в дозе 200 мг/кг рекомендована для дальнейшего клинического изучения как наиболее перспективная

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние Ь-аргинина и пентоксифиллина на состояние микроциркуляции при моделировании ишемии конечности у крыс / Д В Пашков, Е.Б Ар-тюшкова, М В Покровский и др // Материалы I Нац конгр терапевтов (1-3 ноября 2006 г, г. Москва) - М , 2006 - С 170

2. Возможности фармакологической коррекции хронической ишемии конечности в эксперименте / Е Б Артюшкова, Д В Пашков, Б С Суковатых идр //Кубанский науч мед вестн -2007.-№1-2 -С 19-22.

3 Возможности фармакологической коррекции экспериментальной ишемии конечности / Е Б Артюшкова, М В Покровский, Д В Пашков и др // Ма-терилы XIV Национального конгресса «Человек и лекарство» (16-20 апреля 2007, г Москва) - М, 2007 - С 794-795

4 Патент № 2268662 от 27 01 2006 Способ хирургического лечения хронической ишемии нижних конечностей / Б С Суковатых, Л Н Беликов, О А Родионов и др. // патентообладатель — Курский государственный медицинский университет

5 Патент № 2302239 от 10 07 2007 г Способ фармакологической коррекции ишемии конечности / М В Покровский, Т Г Покровская, Е Б Артюшкова и др. // патентообладатель — М В Покровский, Т Г Покровская, Е Б Артюшкова, В И Кочкаров

6 Пашков, Д В Возможности непрямой реваскуляризации при критической ишемии конечности / Д В Пашков, А Д Мясников, Б С Суковатых и др // Тез докл XI Ежегод сес Науч центра сердечно-сосудистой хирургии им А.Н Бакулева с Всерос конф молодых ученых (13-15 мая 2007, г Москва)/НЦССХ им АН Бакулева РАМН -М., 2007 -С 64

7 Пашков, Д В Ь-аргинин в коррекции экспериментальной ишемии конечности / Д В Пашков, М В Покровский, Е Б Артюшкова // Тез докл XII Всерос съезда сердечно-сосудистых хирургов (28-31 октября 2006 г, г Москва)/НЦССХ им АН Бакулева РАМН -М,2006 -С 273

8 Пашков, Д.В. Экспериментальное обоснование нового способа непрямой реваскуляризации мышц при хронической ишемии конечности / Д В Пашков, А Д Мясников, В А Липатов Ч Университетская наука взгляд в будущее Сб тр 71-й науч конф КГМУ и сес Центр-Чернозем научного центра РАМН - Курск, 2007 — Т 1 — С 233

9 Экспериментальное и клиническое обоснование применения реваскуля-ризирующей остеомиопластики для лечения критической ишемии нижних конечностей / Б С Суковатых, Л Н Беликов, А Н Щербаков и др // Вестн хир им Грекова -2006 - №6 -С 21-24

10 Эндотелиотропное действие Ь-аргинина при экспериментальном моделировании дефицита оксида азота / Е Б. Артюшкова, М П Гладченко,

Д В Пашков и др // Университетская наука взгляд в будущее Сб тр 71-й науч конф КГМУ и сес Центр-Чернозем научного центра РАМН -Курск, 2007 -Т 3 -С 168

11 L-аргинин в фармакологической коррекции ишемии конечности / Д В Пашков, Е Б Артюшкова, М В Покровский и др // Биомедицина -№4 -2006 -С 103-105

12 Pharmacological correction of extremity ischemia by means of L-argmme / E В Artyushkova, D. V Pashkov, M V Pokrovskiy et al // Materials of Russia-China international scientific conference of farmacology and pharmacy-clmical practice (25-27 September 2006, Perm, Russia) - Perm, 2006 -P 1213

Лицензия ЛР № 020862 от 30 04 99 г Сдано в набор 03 10 2007 г Подписано в печать 04 10 2007 г Формат 30х42'/8 Бумага офсетная Гарнитура Times New Rom Печать офсетная Уел печ л 1,0 Тираж 100 экз Заказ № 13 А Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г Курск, ул К Маркса, 3

Распространенность ХОЗАНК составляет более 20% от всех видов сердечно-сосудистой патологии, что соответствует 2-3% от всей численности населения и 35-50% от численности лиц старше 60 лет [24, 27, 97]. По данным Г.Р. Галстян (2006), распространенность ХОЗАНК составляет 9-10% среди лиц старше 50 лет [24]. Особенностью этих заболеваний является тенденция к неуклонному прогрессированию процесса, высокие степени инвалидизации, процент ампутаций и летальности. По прогнозам экспертов ВОЗ, в ближайшие годы ожидается существенный рост этой категории больных - на 5-7% [24, 41, 79].

Весь спектр методов лечения ХИНК можно разделить на консервативные и хирургические. Основным разделом лечения больных ХОЗАНК является терапия, проводимая в амбулаторных условиях [4, 61, 78, 79, 84, 85]. Дополнением к ней могут быть эпизоды интенсивного лечения в стационаре или же хирургическое вмешательство. Наиболее часто для фармакологической коррекции ишемии используются антиагреганты (ацетилсалициловая кислота, клопидогрель), пентоксифиллин и алпростадил [61,94].

В настоящее время определены показания для выбора того или иного метода в зависимости от стадии заболевания. Оба направления лечения активно развиваются в настоящее время и в большинстве случаев используются сочетано: консервативные мероприятия проводятся в предоперационном периоде, а также продолжаются после выписки пациентов из стационаров [49, 50, 55]. Применяемые в практике виды хирургических вмешательств и программы фармакологической коррекции ишемии различаются также механизмом действия.

Несмотря на устоявшиеся программы консервативного лечения ХОЗАНК, целостное представление о фармакологической стимуляции неоангиогенеза в полной мере не сформировано. Стимуляция неоангиогенеза в пораженной конечности и активация коллатерального кровообращения -одно из перспективных направлений лечения [19, 20, 23, 26, 108, 189]. Это может быть достигнуто как консервативными, так и хирургическими методами.

Хроническая ишемия конечности закономерно сопровождается развитием дисфункции сосудистого эндотелия, которая сама по себе является фактором, усугубляющим артериальную недостаточность [24, 29, 32, 41, 104, 106, 181]. В широком смысле эндотелиальная дисфункция может быть определена как неадекватное образование в эндотелии различных биологически активных веществ [9, 30, 130, 170]. Поскольку оксид азота принимает участие в регуляции практически всех функций эндотелия (регуляция сосудистого тонуса, тромборезистетность сосудов, регуляция адгезии лейкоцитов и проницаемости), понятие эндотелиальной дисфункции почти полностью укладывается в состояние пониженной продукции эндотелием оксида азота [30, 33, 42, 113, 134]. Пониженное образование оксида азота при ХОЗАНК требует фармакологической коррекции. В качестве донора NO в эксперименте может быть использована незаменимая аминокислота L-аргинин, являющаяся природным предшественником NO [104, 113, 134, 142, 146, 193,200].

Предлагаемые в литературе хирургические методы прямой реваску-ляризации не всегда обеспечивают положительный эффект, в ряде случаев имеют противопоказания, иногда сопровождаются развитием гнойных осложнений, а также рецидивов тяжелых степеней ишемии конечностей [46, 47, 49]. Проблема раннего послеоперационного тромбоза шунтов и протезов связана с отсутствием у больных воспринимающего дистального русла, что в условиях увеличивающегося притока крови после операции приводит к осложнениям [99]. Увеличение компенсаторных возможностей микроциркуляторного русла может быть достигнуто за счет увеличения плотности и общей площади капиллярной сети, что возможно путем стимуляции неоангиогенеза в ишемизированной конечности [99, 108, 111, 189].

Установлено, что раздражение костного мозга вызывает расширение сосудов раздражаемой конечности и умеренное сужение сосудов других областей [39, 40]. По теории П.С. Кромпехера (1979), в ответ на травму кости происходит выброс из костного мозга стволовых недифференцированных клеток, образующих между концами отломков сеть мельчайших, не имеющих характерной идентификации сосудов. Эти сосуды содержат большое количество крови, необходимой для полноценного осуществления процесса репаративной регенерации. Многочисленные исследования позволили теоретически и экспериментально обосновать использование реакции регионарного кровообращения на травму с целью создания локальной стойкой артериальной гиперемии, которая могла бы компенсировать хроническую ишемию конечности. Развитие этой концепции определило, что стимулирующим фактором неоангиогенеза является пролонгированная травма костной ткани [39].

Б.С. Суковатых и соавт. (2006) [101], используя в качестве прототипа реваскуляризирующую остеотрепанацию Ф.Н. Зусмановича (1991) [39, 40], предложили вместо нанесения нескольких отверстий в кости созда-. вать одну большую костную полость с последующей мышечной тампонадой. Операция названа авторами реваскуляризирующей остеомиопласти-кой (РОМП). Вмешательство имеет целью индуцировать неоваскуляриза-цию мышц конечности посредством роста кровеносных сосудов из костного мозга, а также миграции стволовых клеток, мононуклеаров из костного мозга в мышцу. Авторами получены хорошие результаты при экспериментальной и клинической апробации метода. Хорошие результаты от использования подобного рода вмешательств у пациентов с хронической ишемией конечности отражены в материалах XII Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов [71]. Проведенные А. АЪАпХг.тлх (2003) эксперименты показали, что введение аутологичных стромальных клеток костного мозга индуцирует неоваскуляризацию в ишемизированной конечности крысы [105]. Кроме того, исследователем отмечена активация регенерации различных компонентов мышечной ткани (эндотелий, гладкие мышцы, скелетные мышцы, адипоциты). Такой эффект представляя-ется крайне важным в условиях ишемического повреждения миоцитов при КИНК [5]. Подобные результаты опубликованы другими авторами [119, 125, 132, 133, 136, 175].

В свете данных представлений интересным является изучение эффективности Ь-аргинина и операции РОМП в условиях экспериментальной ишемии конечности, а также оценка эффективности комбинированного использования операции и Ь-аргинина.

Целью работы явилось экспериментальное обоснование эффективности Ь-аргинина, операции реваскуляризирующей остеомиопластики (РОМП), а также комбинации операции РОМП с Ь-аргинином при хронической ишемии конечности.

Задачи исследования

1. Разработать модель экспериментальной хронической ишемии конечности у крыс и изучить динамику клинических признаков патологии, уровня микроциркуляции и морфологической картины на протяжении 3 месяцев.

2. Изучить немедленную реакцию системы микроциркуляции у здорового животного на введение пентоксифиллина и Ь-аргинина в различных дозировках.

3. Оценить уровень микроциркуляции и динамику морфологической картины у крыс с экспериментальной ишемией конечности на фоне лечения Ь-аргинином.

-94. Оценить уровень микроциркуляции и динамику морфологической картины у крыс с экспериментальной ишемией конечности на фоне лечения препаратом сравнения - пентоксифиллином.

5. Оценить уровень микроциркуляции и динамику морфологической картины у крыс с экспериментальной ишемией конечности после операции реваскуляризирующей остеомиопластики.

6. Оценить уровень микроциркуляции и динамику морфологической картины у крыс с экспериментальной ишемией конечности на фоне комбинации оперативного и консервативного лечения (реваску-ляризирующая остеомиопластика + Ь-аргинин).

В диссертации продолжены исследования эффектов операции реваскуляризирующей остеомиопластики, проходящие на кафедре общей хирургии Курского государственного медицинского университета, а также изучение эффектов Ь-аргинина, проходящие на экспериментальной базе Научно-исследовательского института Экологической медицины Курского государственного медицинского университета.

Номер государственной регистрации темы 01.2.007 09149.

Научная новизна и теоретическая значимость

В работе впервые изучен уровень микроциркуляции в мышцах голени здоровых крыс, а также его динамика на протяжении 3 месяцев после моделирования хронической ишемии задней конечности. Изучена динамика уровня микроциркуляции на фоне введения пентоксифиллина и Ь-аргинина в различных дозах; изучена и доказана эффективность Ь-аргинина в дозе 200 мг/кг при экспериментальной хронической ишемии конечности. Получены патенты на изобретения: «Способ хирургического лечения хронической ишемии нижних конечностей», № 2268662 от 27.01.2006 г., «Способ фармакологической коррекции хронической ишемии конечностей», № 2302239 от 10.07.2007. Получены удостоверения на два рационализаторских предложения.

Практическая значимость

Доказательство эффективности предлагаемых методов непрямой реваскуляризации посредством фармакологической и хирургической стимуляции неоангиогенеза при экспериментальной ишемии конечности позволяет проводить их клиническую апробацию, что расширит спектр лечебных методов при хронической ишемии конечностей.

Внедрение в практику

Метод реваскуляризирующей остеомиопластики используется в качестве средства непрямой реваскуляризации в клинике сосудистой хирургии МУЗ ГБ СМП г. Курска.

Апробация полученных результатов

Основные положения диссертации отражены в 12 печатных работах; имеются 2 публикации в рецензируемых ВАК журналах. Основные положения работы доложены на XII Всероссийском съезде сердечнососудистых хирургов, проходившем 28-31 октября 2006 г. в НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева (2006). Диссертация представлена на межкафедральной научной конференции кафедр общей хирургии, оперативной хирургии и топографической анатомии, хирургических болезней № 1 и № 2, онкологии, фармакологии, клинической фармакологии, анатомии, патологической анатомии, гистологии КГМУ. Материалы исследования опубликованы в Бюллетене XI ежегодной Национальной сессии НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева, в сборниках трудов 71-й и 72-й научных конференций КГМУ и сессий Центрально-Черноземного научного центра РАМН (2006, 2007), в материалах XIV национального конгресса «Человек и лекарство», 1 национального конгресса терапевтов, Второй международной Российско-китайской конференции по фармакологии.

Положения, выносимые на защиту

1. Экспериментальная хроническая ишемия конечности, вызываемая удалением участка магистрального сосуда нижней конечности у крыс, характеризуется развитием к 7 суткам после операции клинических симптомов артериальной недостаточности конечности (трофические язвы, гипотрофия, акральные некрозы, боль по косвенным признакам), достоверным снижением уровня микроциркуляции в мышцах голени, развитием дистрофических и некробиотических процессов в тканях. С течением времени наблюдается относительная компенсация кровообращения в конечности и восстановление исходного уровня микроциркуляции к 3 месяцу наблюдения.

2. Ежедневное применение Ь-аргинина в дозе 200 мг/кг 1 раз в сутки при экспериментальной ишемии конечности полностью восстанавливает перфузию мышечной ткани к 28 суткам эксперимента, увеличивает скорость метаморфоза морфологической картины в тканях, т. е. производит значимый лечебный эффект.

3. Ежедневное применение пентоксифиллина в дозах 60, 120 и 240 мг/кг 1 раз в сутки при экспериментальной ишемии конечности к 28 суткам не приводит к достоверному увеличению уровня микроциркуляции в мышечной ткани животного и не влияет на скорость морфологических превращений в ишемизированных тканях.

4. Операция реваскуляризирующей остеомиопластики при экспериментальной хронической ишемии конечности улучшает кровообращение на микроциркуляторном уровне, увеличивает скорость метаморфоза морфологической картины в ишемизированных тканях и может быть использована в клинике как в качестве самостоятельного метода лечения больных с ХОЗАНК, так и в комплексе с Ь-аргинином.

- 12

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, который включает 103 отечественных и 111 иностранных источников. Представленный материал иллюстрирован 32 рисунками и 7 таблицами.

- 108 -ВЫВОДЫ

1. Моделирование ишемии конечности обнаружило, что к 7 суткам после операции удаления участка магистрального сосуда нижней конечности у крыс развивается комплекс функциональных (клинических), флоуметрических и морфологических изменений, указывающих на формирование хронической артериальной недостаточности конечности. Отмечено достоверное различие по уровню микроциркуляции между контрольной и интактной группами. При.морфологическом исследовании наблюдаются некробиоз и дистрофия тканей оперированной конечности.

2. Введение пентоксифиллина здоровым крысам приводит к статистически достоверному повышению уровня микроцикуляции в мышцах конечности, которое сохраняется в течение 2 часов при дозе препарата 60 мг/кг и более 6 часов при дозе 240 мг/кг. Введение Ь-аргинина здоровым крысам в дозе 200 мг/кг не приводит к значимым изменениям уровня микроциркуляции в течение 6 часов, что объясняется особенностями метаболизма вещества - необходимостью некоторого времени для генерации N0.

3. Ежедневное системное введение Ь-аргинина с 7 по 28 дни в дозе 30 мг/кг 1 раз в сутки на фоне моделирования ишемии приводит к достоверному увеличению уровня микроциркуляции к 28 суткам эксперимента. Ежедневное системное введение Ь-аргинина в дозе 200 мг/кг 1 раз в сутки приводит к полному восстановлению уровня микроциркуляции и ускоряет процессы восстановления мышечной ткани конечности к 28 суткам эксперимента. Данные флоуметриче-ского исследования кровообращения в сосудах микроциркуляторно-го русла полностью подтверждаются морфологическими данными, где обнаружено статистически достоверное увеличение удельной площади мышечной ткани.

4. Ежедневное системное введение пентоксифиллина с 7 по 28 дни в дозах 60, 120 и 240 мг/кг 1 раз в сутки на фоне моделирования ишемии к 28 суткам не приводит к достоверному увеличению уровня микроциркуляции по сравнению с контролем. Данные флоуметри-ческого исследования сопоставимы с динамикой морфологических изменений, где также не отмечено статистически значимых отличий от контрольной группы крыс.

5. Операция реваскуляризирующей остеомиопластики, выполненная на 7 сутки после моделирования ишемии конечности, приводит к полному ее регрессу, который отмечается также к 28 суткам эксперимента с восстановлением исходного уровня микроциркуляции в мышцах конечности.

6. Комбинированное лечение в виде операции РОМП и L-аргинина в дозе 200 мг/кг также приводит к полному восстановлению кровообращения в конечности к 28 суткам наблюдения и увеличивает скорость регенерации миоцитов. Данное сочетание обладает наилучшим лечебным эффектом на экспериментальную ишемию.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Эффективность Ь-аргинина в дозе 200 мг/кг при экспериментальной ишемии конечности позволяет рекомендовать препарат для дальнейшего изучения в клинике у больных с ХОЗАНК.

2. Эффективность операции РОМП при хронической ишемии конечности позволяет рекомендовать данный метод в качестве средства непрямой реваскуляризации у пациентов с ХОЗАНК, которым не может быть выполнена реконструктивная операция.

3. Комбинация операции РОМП и введения Ь-аргинина в дозе 200 мг/кг рекомендована для дальнейшего клинического изучения как наиболее перспективная.