Автореферат и диссертация по медицине (14.00.24) на тему:Комплексное исследование мочи в следах на вещественных доказательства[

I la правах рукописи УДК 340 6 612 46(021)

ÜQ344G464

СИЛКИНА Светлана Юрьевна

КОМПЛЕКСНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МОЧИ В СЛЕДАХ НА ВЕЩЕСТВЕННЫХ ДОКАЗАТЕЛЬСТВАХ

14 00 24 - «Судебная медицина»

Авторефера1 дисссрмции на соискание ученой степени кандидата медицинских паук

? 2 СЕН 2008

Москва - 2008

003446464

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Нижс1 ородская 1 осударственная медицинская академия Росздрава»

Научный руководитель Заслуженный врач РФ, доктор

медицинских паук, профессор Эделев Николаи Серафимович

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор

Тучик Евгений Савельевич

Ведущая организация

кандидат медицинских паук, доцет Сундуков Дмифий Вадимович Российская медицинская академия последипломно! о обраювания

Защит СОСЮИ1СЯ «

» Ш1А Л 2008 юла в //

часов на заседании диссер1ационного сове 1а ДМ 208 041 04 при I ОУ ВПО «Московский государс1 венный медико-стомагологическии универсигет Росздрава» по адресу 127006, г Москва, ул Долгоруковская, д 4 стр 7 (кафедра истории медицины)

Почтовый адрес 127473, г Москва, ул Делегатская, д 20/1

С диссершциеи можно ознакомиться в научной библиотеке I ОУ ВПО «Московский государственный медико-стомаюло1 ический университет Росздрава» по адресу 127006,1 Москва, ул Вучешча, д 10а

Авторефсра1 разослан« 2008 юда

Ученый секретарь диссергациоппо! о сове)а

кандидат медицинских паук, доцент I 10 Хохлова

Ак1уальносгь проблемы

Постоянно возрастающий уровень расследования преступлении, направленных прошв жизни, здоровья человека, повышае! роль судебно-медицинской экспершзы но исследованию следов биоло! ического происхождения, в гом числе мочи А успехи в области биологии, i сне гики, иммунологии, цитологии создают базу и возможности развития новых медицинских îcxHOTOimi, направленных к решению основной мдачи судебно-медициискои -жеперипы выделений в плане идешификации личиосш

В судебно-медицинском плане следы мочи изучены исдосшочно В частности, кроме определения ее наличия, видовои и фупповои принадлежности, другие исследования не проводятся (Ъарсегяпц JI О , Левчснков fi Д , 1978, Ьарсегяпц JÍ О , 1999)

Слсдус1 о iмсi и i ь, чю из данных о клиническом исследовании мочи (Прсдтсчеискпй В П , Боровская В M , Марголииа JT Т , 1950) и единичных публикации в судебно-медицинской литературе (Fscclund V, 1956, Rus Р, Pilgaard С h , 1956, Castro N M , Sasso W S , 1 îcnch U S , Kcibany J , 1957, Тишииова JI A , 1988) известно, что осадок мочи содержал клеючные элементы

Исследованию клеюк посвящено миожеиво pa6oi о i счес i венных и зарубежных авюров (Jelacic О, 1964, Willemc-Pissait F, Mouicau Р, 1964, Шалаев IIГ , 1965, 1966,, Капустин А В , 1969, Ашопова СП, Мишсва II А , 1972, Федоровцева JI С , Загрядская ЛП, Одинцов II В , 1977, Фсдоровцев АЛ, Рсвпи1ская JI А, 1980, Еранов НВ, 1981, Королева? И, 1985, Фсдоровцев А Л , 2003), в коюрых отмечены возможности усыновления оргапно-тканевои (рииональпои), видовои, групповой и половой иринадлсжпосш изолированных клеюк

Тем пс менее мы не нашли в судебно-медицинской jmiepaiypc pa6oi, посвященных изучению kjiciочного состава осадка мочи

Трудности в исследовании пятен мочи в -жепершои пракшке связаны еще и с 1см обс1оя1слъспюм, что с мочой здоровою человека выделяется ме-

нее 0,002 г/л белка (Данилова Л А, 2002) Обычно этого количества белка недостаточно для достоверного определения его видовои принадлежности (Гуртовая С В , 2001)

Таким образом, вышеизложенное подчеркивает ак1уалыюс1ь работы и опредсляс!

ЦЕЛЬ исследования - установить возможное i и судебно-медицинского исследования клеточного осадка мочи и определения ее видовои принадлежности

В соо liíc i с 1вии с целыо поставлены следующие ЗАДАЧИ:

1 Исследовать клеточный состав осадка мужской и женской мочи с установлением региональной и половой принадлежности клеюк

2 Разработай» способ диагностики половой принадлежности мочи по соотношению в осадке ядросодержащих и безъядерных клеюк

3 Разрабо1ап, ошимальные варианты определения фупповои принад-лежносш клеюк осадка мочи но системам ЛВ0 и MNSs

4 Изучить устойчивость клеток осадка мочи к воздеиепшю некоторых факторов внешней среды влажности, высокой и низкой icMiiepaiypbi

5 Разработть модификации постановки реакции всфечного иммуно-элекфофореза на мембранах из апетат-целлюлозы для определения видовой принадлежности следов мочи

6 Разрабоып. комплексную методику исследования следов мочи на вещественных доказательствах

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые установлена возможность определения peí ионалыгои, ipyri-повой и половой принадлежности клеток осадка мочи

Изучена сохраняемое ib клеток мочевою осадка в зависимое i и oí воздействия различных факюров внешней среды (влажнойи, высокой и низкой температуры)

Разработпы оптимальные методики определения видовой принадлежности следов мочи

Предложена комплексная меюдика исследования пя1ен мочи в следах на вещественных доказательствах

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Комплексное исследование следов мочи на вещественных доказательствах с изучением ее клс1 очного состава в предложенном варианте существенно расширяет возможности судебно-медицинской экспертизы в плане конкретизации экспертных выводов о происхождении мочи от определенного человека

Найден эффективным и рациональный способ определения видовой принадлежности мочи с использованием протсолитичсских ферментов и предварительным накоплением белков на фильтровальной бумаге перед постановкой реакции всфечною иммуноэлекфофореза на мембранах из ацетат-целлюлозы

НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ.

1 Пятна мочи, как выделения, кроме жидкой части, содержат клетки, исследование которых может использоваться для установления видовой, половой и групповой принадлежности мочи

2 В моче практически здоровых людей содержится белок в достаточном количестве для определения его видоспецифических свойств

3 Комплексное исследование пятен мочи с изучением ктеточното состава осадка существенно расширит возможности судебно-медицинской экспертизы в плане конкретизации выводов о происхождении следов мочи от определенно] о человека

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ

Основные положения работы доложены на 5 заседаниях Нижегородского отделения Всероссийского общества судебных медиков (2001- 2007 г г) На Всероссийской научпо-практическои конференции «Актуальные вопросы судсбпо-медиципскои экспертизы вещественных докашельств и Пленума правления ВОСМ» 0 Воронеж, 2007 I ) 11а заседаниях кафедры судебной медицины I ОУ В1Ю «11ижГМА Росздрава» (2001-2008 т г)

ЛИЧНОЕ УЧАСТИЕ АВТОРА

Суммарное долевое участие автора на всех -лапах pa6ou,i сосгавило 9095 % Автором лично была проведена серия экспсримепюв по исследованию образцов мочи от 150 практически здоровых человек, мужчин и женщин в возрасте от 3 до 76 лет Самостоятельно проведено 4000 эксперимешов разных серий, изучено 800 цитологических препаратов осадка мочи

Авюром выполнено 12 практических судебно-медицинских экспертиз по исследованию следов мочи на вещественных доказагельсшах ВНЕДРЕНИЕ

Разработанные меюдики по изучения kjiciочного cociaBa пятен мочи, определению ее видовой и половой принадлсжиос i и внедрены в практику работы судебно-медицинских экспертов - биолоюи и циюдогов Нижегородского, Новосибирского, Самарского, Ярославскою обласшых бюро судебно-медицинской экспертизы, республиканских бюро судебно-медицинской экспертизы Республик Гатареган, Марий Эл, а 1акжс используются в учебном процессе кафедры судебной медицины ГОУ В1Ю «Нижегородская государственная медицинская академия Росздрава» ПУБЛИКАЦИИ

По 1сме дисссршции опубликовано 7 журнальных cuich, из них 1 в журнале, рекомендованном ВАК России

Получено положиюлыюе решение Федеральной службы по интеллектуальной co6ci венное i и, пагеитам и товарным знакам о выдаче патента па изобретение «Способ определения половой принадлежноии мочи при су-дсбно-мсдицинскои экспсршзе следов мочи» oí 11 Mapia 2008 года ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Дисссршция СОСЮИ1 из введения, 7 глав текста, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, 4 приложений Работа изложена па 139 сфапипах машинописного ickcia, содержи i В ыблиц, 27 рисунков Список лшерагуры включает 304 исючиика, и! них 106 иностранных

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Мшсриал и методы исследования

Для решения nocidiiJicHHbix задач проведено 4000 экспсримсшов разных серии, самоскшельно выполнено 12 пракшчсских судебно-медицинских экспертиз по исследованию следов мочи Объем и характеристика эксперимешов преде 1авлены в таблице 1

Всею в процессе изучения эксперимеп1ально1 о макриала микроскопическому исследованию подвергнуто 800 uhtojioi ичсских препараюв осадка мочи, в 540 наблюдениях проведено определение видовой принадлежности мочи, в 2400 опъпах осуществлено уаановление i рупновои (но сис1емам ABO и MNSs) дифференцировки клеток в осадке мочи, проведено 260 опытов по изучению воздействия па клетки высокой, нижои гемпераiyp¡,i и влажности

В -жеперимешах исследовали моч\ 150 человек, ишую в разное время суток в CLcpujibiiyro С1Скляппую посуду у пракшчески уюровых добровольцев (110 женщин и 40 мужчин) в возрасте oí 3 до 76 Jiei, у коюрых о!сутст-вовал клинический анамнез по нефрологии Обращы брались на про1Яжении 2 лет

Одна час1ь мочи иссчедовалась в жидком виде, друыя - в виде пятен, высушенных на марле, сложенной в 8 слоев Высушивание производили в условиях вытяжного шкафа при комнатной 1емпературе в oí крытых чашках Петри Высушенные обращы хранили в бумажных пакетх при комнатной температуре При заборе материала фиксировали цвет, фазу мспсфуального цикла у женщин, измеряли рН мочи с помощью ипдикаюрпои бумаги

Кроме того, исследованию подвергали 30 образцов мочи самцов и самок кошек и собак в возрасте от 3 месяцев до 17 jici Образцы мочи животных брали на марлю, высушивали и хранили при компашои reMiiepaiype

Таблица 1

Количссiнсинаи характеристика выполненных экспериментов

№№ Характер исследований количество

1 Определение видовой принадлежности жидкои мочи и ее пятен реакцией преципитации в агаровом геле 220

Определение видовой принадлежности жидкои мочи и ее пятен

2 методом встречного иммуноэлекфофореза па ацетат-целлюлозных мембранах 220

Разработка модификации реакции преципитации в атаровом ге-

3 ле для определения видовои принадлежпос i и мочи в пятнах после накопления белка и обработки 0,1% pací вором трипсина или 50

папаипа

Разработка модификации методики всфечпою иммупоэлскфо-

4 фореза на anciai-целлюлозных мембранах для определения видовой принадлежпос!и мочи в пятнах после накопления белка и обрабоаси 0,1% раствором трипсина или папаипа 50

5 Изучение морфологических особенностей клеюк осадка мочи с определением половой принадлежности Mei одами

- люмипсспепгпои микроскопии 400

- свсювой микроскопии 400

6 Определение групповой принадлежности клеюк реакцией смешанной агглютинации

- по сис1смс ЛВ0 1440

- по системе MNSs 960

7 Изучение влияния некоторых факторов внешней среды на сохраняемость клеюк осадка мочи

- высокой темпера iypw 40

-пилкой icMiicpaiypbi 160

- повышенной влажное!и 60

Всего 4000

Мсюдика приготовления цитоло!ических прспараюв

Жидкую мочу пешрифугировали в течение 10 минут при 1500 об/мин Для удаления солей осадок помещали в 10 мл 15% раствора уксусной кислоты на 20 часов

Вырезки из ИЯ1СП мочи экстрагировали 10 мл 15% рас]вора уксусной кисло 1ы в 1счспис 20 часов Кусочки извлекали, опкимали, же фаю пешрифугировали в ючснис 10 минут при 1500 об / мип

Отмывание Maicpiuuia после экстракции осуществляли nyicM ценгри-фугировапия в 10 мл 15% уксусной кислоты при 1500 об /мин в 3 порциях (по 10 минут в каждой)

Разведенный осадок помещали в виде капель на предварительно обезжиренные в смсси Никифорова предметные eiCKjia, высушивали при комнатной температуре и фиксировали 96° этиловым спирюм

Меюдики окраски прсиараюв

В наших исследованиях использованы 2 основных метда окраски препаратов, широко применяемых при проведении судебно-медицинских цию-логических исследовании Это флюорохромировапие препаратов растворами акрихина и акридинового оранжевого

Для более полного выявления морфологических пргипаков многослойного плоского псороговевающего эпителия бычи применены дифференцирующие окраски pací ворами амидочерного 1ОЬ и Лююля

Ф iюорохрохшрование препаратов раствором акрихина Для окраски препаратов раствором акрихина использована методика, разработанная С С Кирееиой (1976), в модификации L И Королевой (1983) зафиксированные препараты в течение 10-15 мин окрашиваю i 0,0005% водным раствором акрихина (в наших исследованиях использован акрихин производства фирмы «Bayer» под названием «агебрин») и 5-10 сек промывают npoiочной водой

Флюорохромировапие препаратов раствором акридинового оранжевого Для флюорохромироваттия препаратов pací вором акридинового оранжевого (АО) использована модифицированная меюдика L Bertalanffy, JBrckis (1956), сосюятцая в следующем зафиксированные препараты 2 мин окрашивают 0,01% раствором АО, приготовленном на фосфатом буфере с pH 6,0, и 20-30 сск промывают проточной водой В данном случае обя;а-тельным является применение раствора красителя с pH 6,0, i к, по данным

А В Зеленина (1967), именно при таком значении pli, обнаруживаются минимальные количес гва РНК в клетках

Окрашивание препаратов раствором амидочерного 10Б В соответствии с методикой, предложенной А Л Федоровцевым (2003), препараш 10 мип окрашивали 0,05% раствором амидочерного 10Б, приготовленном на смеси Карнуа, и 10-15 сек промывали проючной водой Окрашивание препаратов раствором Люго iя На npenapai помещали 1-2 капли Люголя, накрывали покровным стеклом и микросконировали

Условия и режимы микроскопии Цитологические препараты изучали с помощью микроскопов ЛЮМАМ Р-8 и МИКМЕД-2 и ар 12, которые позволяют проводить исследования объектов, как в проходящем свете, так и в режиме люминесцентной микроскопии

Люминссцентпо-микроскопические исследования проводили в отраженном свете микроскопа, тк такой режим микроскопии позволяет изучать непрозрачные обьскш (Барский И Я с coaBi , 1976) Кроме эюго, объектив при гаком вариаше микроскопии играет роль конденсора, в связи с чем, освещенность препарата возрастает с ростом anepiypw и увеличения объектива (Корн M Я , 1977)

При изучении препаратв, окрашенных растворами акрихина и АО, использовали пропускающие светофильтры типа ФС-1 или СС-15 с толщиной стекла 2-6 мм, выделяющие сине-фиолетовую обласп> спскфа, чю позволяет получить наибольшую яркость свечения обьекюв В качеыве запирающих филы ров (коюрыс ПОЛНОС1ЫО поглощают сипе-фиолеюву ю облаиь спекфа) применен свеюфилыр ЖС-18+ЖЗС-19 для микроскопа ЛЮМАМ Р-8 и ЖС-18-4 для микроскопа МИКМЬД-2 вар 12

Изучение клеток проводили с объективами водной иммерсии 40х, 60х, ЮОх и масляной иммерсии ЮОх, а обзорную микроскопию - с обьсктивами 10-20х

При окраске pací ворами Люголя и амидочерпого 1ОЬ применяли световую микроскопию обьсктивы - 20х, 40х, окуляры -10-15х

Для фотографической регистрации наблюдаемой микроскопической картины применяли цифровой фотоаппарат «OLYMPUS С-5060 Wide 7oom» и компьютерную виде0сис1сму «ВидеоТест 4,0»

Для ма1сматическои обработки полученных результатов использовали лицензированные и свободно-распространяемые статистические продукты «Медицинская с1ашс!ика», «STATISTICA вар 6», «MS-Fxcel» Полученные данные заносили в статистическую оболочку профаммы, где и производился расчет средних значений и среднеквадратических отклонений показателей Основные результаты исследования Проведенные микроскопические исследования показали, что цитологическая картина препаратов мочи, полученной от мужчин и женщин, существенно различается по количеству и морфоло1 ичсским особенностям клеток эпителия, образующих ее осадок Так, в препаратах, притотовлепных из мочи лиц женскою пола, число клеюк было в 5 -10 раз больше, чем у мужчин

В мужской моче превалировали безъядерные клепки поверхностною слоя кожи (лшдермальные чешуйки) Встречаемость ядросодержащих клеток составила только 13,7 ± 9,3% Эти клетки имели политональную или овальную форму и ровные не ввернутые края Ядра клеюк преимущественно овальной формы, чаще располагались эксцентрично, ядерно-цитоплазматическии индекс (отношение величины ядра к наибольшему размеру клетки) составлял 14-110, что, по данным М Г Арссньевой (1977), свидетельствовало о наличии в препаратах клеток поверхностною и промежуточного слоев МН010СЛ0ЙИ01 о плоского неороговеватощс) о эпителия

Кроме этих клеток, в одном наблюдении была найдена клетка переходного эпителия, а в двух наблюдениях - сперматозоиды

При окрашивании препаратов раствором амидочерною 10Б циюплазма ядросодержащих клеюк приобретала неишенсивныи и равномерный светло-синий цвет, была мелкозернистой или бесструктурной, в пей у большинства

клеток различались мелкие (величиной около 2-3 мкм) черно-синие включения неправильной формы В части клеток вокруг ядра имелась светлая зона -«нимб» Отмеченные морфологические особенности, по данным A JI Федоровцева (2003), типичны для клеток многослойного плоского нео-роговсвающсго эпшслия ладьевидной ямки мочеиспускагельпою канала

При окраске клеток раствором Люголя были обнаружены единичные гликогенсодержащие клетки (до 1-2 на препарат), чю частично подтверждает данные И И Ильина (1962) о наличии глико1епа в клетках слизис го и оболочки конечною 01 дела мочеиспускательного капала (ладьевидной ямке)

При исследовании клеточных ядер в 39,7 + 10,7% из них выявлен Y-хроматин, наличие коюрого позволяет не только диа! носшроваи, мужской генетическии пол, но и одновременно определить видовое происхождение мочи (Pearson Р el al, 1971, Blazek J , Braza J , 1972, Загрядская Л II с соавт , 1977, Одинцов И В , 1979)

В upeiiapaiax, пршоювленных из осадка женской мочи в каждом ноле зреиия микроскопа выявлялось не менее 20-50 клеток При лом в 87,4 ± 6,8% из них содержались ядра, остальные клетки были преде швлены безъядерными эпидермальными чешуйками

Ядросодсржащис клетки имели полигональную и овальную форму, мелкозубчато края, у части - завернутые, ядра - округлые или овальные, расположены прсимущеовенно центрально (ядсрно-циюплашатический индекс сос!авлял 14-1 11) - клетки промежуточною и поверхностного слоев мноюслойпою плоскою неороговевающего шителия

При окраске препараюв 0,05% раствором амидочериою IОБ цитоплазма клеток окрашивалась интенсивно и неравномерно в синие юна, имела грубозернистое строение, включения в ней или о1сутс1вовали, или иногда встречались мелкие (до 2 мкм) неправильной формы черно-синею цвет Вокруг ядер в нскотрых кле1ках отмечалась свси1ая зона - «нимб»

В препаратах, приготовленных из осадка мочи 11 женщин имелись немногочисленные клетки, цитоплазма которых была как бы «вспенена» за-

полнена мноючислсппыми пузырьками окруиюй или miioi oyi олыюи формы, центральная часть которых не окрашена Данный признак, наряду с вышеописанными морфологическими особенностями, типичен, по данным Л J1 Федоровпева (2003), для клеток втагалищного эпителия

При лгамипссцсншои микроскопии препараюв, окрашенных распюра-ми атебрииа или акридинового оранжевого, в 36,2 ± 6,4 % ядер клеток промежуточною слоя выявлен Х-хроматин

Х-хрома1ин был найден во всех случаях исследования клеток осадка мочи Ol лиц жспскою пола, как в пяшах, iак и в жидкои моче При ном каких-либо различии в содержании Х-хроматина в ядрах клеюк осадка мочи в зависимости от возраста (3 - 76 лет), фазы менструального цик ia у женщин, а также давпосш шпеп в пределах 3 дня - 1 год не выявлено

При окраске препараюв раствором Лююля в циюплазмс 36,4 ± 10,8% клеток отмечено ирису 1ствис гликогена

Более низкое содержание гликогена в Baiипальпых клспсах по сравнению с исследованиями П Г Шалаева (1966) и А Л Федоровцсва (2003) можно объясни и, разрушающим действием мочи (II Wessel, П Schwais, 1975)

Клетки переходного и призматическою каемчаюго шшелия мочевы-водящих nyicH не были найдены ни в одном ш наблюдении

Поскольку число ядросодержащих клеюк, извлекаемых из следов мочи у женщин оказалось значительно больше, чем у мужчин (ра»шчия с1атисти-чески достоверны, t > 4), был разработан способ диашоешки половой при-надлежносш мочи но cooi ношению в осадке ядросодержащих и безъядерных клеток Для оюю использован метод последоваюпыюго анализа Вальда, впервые примененный в судебно-медицинскои пракшке СИ Любинской (1969) для диагностики половой принадлежносш крови

В основе эюю меюда лежит рассчи1аииая с шдаппои величиной ошибки верояшость происхождения мочи oi женщины или мужчины в зависимости о I числа изученных клеток и наличия ядер в них

В связи с ошосшелыго небольшой выборкой (препараты мочевого осадка от 40 мужчин и 60 женщин), для повышения точности диагностики мы воспользовались данными Р Б Котельникова (1986) о том, чго теоретически наибольшее и наименьшее отклонения о г среднего арифметического значения (М) в выборке (с всрояптостыо ошибки 0,1%) сосшвляю1 ± 3,2ст (среднего квадрашческого отклонения)

Исходя из ЭЮ10 положения, мы определили наибольшую вероятную встречасмосн, ядросодсржащих клеток в осадке мужской мочи (43,5%) и наименьшее вероятное значение выявляемое™ ядросодсржащих клеток в женской моче (65,6%) Именно эти цифры, а не средние арифметические значения встречаемости ядросодержащих клеток в мужской и женской моче были использованы нами в анализе Вальда

Проведенные расчеш (с вероятностью ошибки 1%) показали, что происхождение мочи 01 женщины може! быть установлено при обнаружении всего 5 ядросодсржащих клеюк из 5 исследованных, а 01 мужчины - при вы-

явлении 8 безъядерных клеток (из 8 изученных) и i д (таблица 2)

1аблица 2

Соотношение ядросодержащих и безъядерных клеюк для диаиюешки

половой принадлежности следов мочи

Число ядросодержащих клеюк (не менее) Число клеток, подлежащих исследованию Число ядросодержащих клеток (не более) Число клеток, подлежащих исследованию

женский н о л мужской НОЛ

5 5 0 1 8

6 8 1 И

7 11 2 14

8 14 3 17

9 17 4 20

10 20 5 23

И 1.Д. и тли___________

Для разрабожи опшмальных вариантов определения групповой принадлежности клеюк из осадка мочи по системам ABO и MNSs изучено 60 об-

разцов мочи oí пракшчески здоровых женщин и мужчин в возрасте ог 3 до 76 лет всех четырех групп по системе ABO и грех групп - по системе MNSs (А-22, В -18, 0- 16 и ЛВ - 4 человека, М - 15, N- 15, MN - 30 человек)

Групповую принадлежность клеток устанавливали в соответствии с рекомендациями М С Свирского (1967), НВ Еранова с соавт (1971), МШ Колыш (1977) и Л А Тишиновой (1988) с помощью реакции смешанной агглютинации (РСА)

В экспериментах использовали гетероиммуппые (аши-М, шпи-N, анти-Н), изоиммунпые (анти-А, апти-В) сыворотки и диагпосшческие реагенты с моноклональными антителами (МКА) анти-М, аши-N, анти-А, аши-В и ан-ти-Н Фаза абсорбции при 4° продолжалась от 3 до 48 часов в зависимости от применяемо! о peai ен i а

Применено два варианта постановки РСА с ошываписм (Свирский МС, 1969, За1рядская АП, Ревншская Л А, 1 фанов II В, 1972, CiemoBa Т В , 1976) и без ошывания от несвязавшихся ашител по модифицированной нами методике, предложенной ТВ Стегновой (1976) для определения групповой принадлежности выделений

За положительный результат принимали 4ciko выраженную ащпоги-нацию из 2-3 и более гест-эритроцитов, свободно прикрепленных к клеюч-ной мембране

Учет резулыатов реакций проводили через 30 мину! и 2 часа экспозиции при комнатной температуре

Критерием специфичности служило отеу1С1вие ап люшпации эритроцитов, иногруппных относительно искомого аншгена

Исследования показали, что выявление ашигенов А, В и II системы ABO с помощью РСА не вызывает каких-либо за1рудпении, как в варианте постановки реакции с ошыванием, гак и без ошывания oí непрореагиро-вавших антител

Наилучшие результаты по выявлению антигенов системы ABO были получены при применении peai ентов и сывороюк с тигром oí 1 64 до 1 256

При использовании реагентов с моноклопальпыми антителами (МКА анти-А, апти-В, анти-Н с титром более 1 256 во всех опытах наблюдали пе рекрестные реакции, а применение в реакциях МКА анти-А, апш-В, анти-Н титром ниже 1 32 привело к полному невыявлению ан1 и) снов

Антигены системы MNSs были выявлены всею лишь в 90 опьпах и 960 при абсорбции am шел в течение 48 часов и пятикратном отмывании ле дяным физиологическим раствором в вариантах абсорбции как иммунным! сыворотками аши-М и апти-N, гак и МКА аши-М и апги-N

При абсорбции иммунными сыворотками и МКА реагсшами анги-М i анти-N в 1счсиис трех часов (укороченный вариаш) ашшепы пе были выяв лены во всех 480 эксперимешах

При применении МКА с титром 1 256 и выше и при абсорбции в тече ние 20 часов, наблюдались перекрестные реакции и интенсивное прилипанш эршроцшов к предмешому С1еклу, а с титром ниже 1 32 ашшепы пе выяв лялись

Сложности определения антигенов М и N системы MNSs, связаны, пс данным Baranowski, Lisowska, Romanovska (1956, 1959), ПН Косяков. (1974), МП Резникова (1947), A Simon (1962), G Uhlenbiuck (1960), с более слабой иммуногеииостыо и специфической абсорбционной способность«: антигенов этой системы, что пе всегда позволяет определить по ним группо вую принадлежность клеток

В 260 экспериментах и ¡учена устойчивость клеток осадка мочи к воз действию некоторых факюров внешней срсды влажности, высокой и низко! температуры

Исследования показали, что нагревание клеток до 180° быстро приво дит к изменениям их структуры и уже через 2 часа клетки полностью разру шаются

При замораживании клеток на протяжении всего срока наблюдения ( месяцев) выявлялись клетки с четкими контурами, неповрежденной оболоч

кой, в ядрах коюрых хорошо различалась хромашповая сгрук1ура и половые метки (Х- и У-хромашп)

Действие влажности в условиях комнатой 1смпера1уры оказалось губительным для клеток Во всех наблюдениях уже в первый час клетки в препаратах хогя и имели неповрежденную струмуру, но были сплошь обсеменены микроор!анизмами

Через 2 часа различии» сфуктуру клеток было еще возможно, а через 1 сутки клетки сплошным слоем покрывались различными видами микробов (кокками, палочками, дрожжевыми грибками и т д), из-за чет о выявить их морфоло1 ичсские особенноеги и хроматиновую субс1анцию в ядрах не представлялось возможным

Полученные нами данные подтвердили резулыап,! ранее проведенных исследований по изучению действия высоких 1емперагур на клетки буккаль-ного эпителия (1ишипова Л А, 1988) и некоторых ор!анов (1 ранов НВ, 1971), а также на целые органы и мазки-отпечатки с пих (Одинцов НВ, 1979)

Для решения задачи по определению видовои принадлежности следов мочи использовались реакция преципитации в аыровом юле и меюд встречного иммупоэлскфофореза на мембранах из ацегат-целлюлозы При этом оказалось, чго видовая принадлежность белка в моче установлена только в 122 наблюдениях из 280 после экстракции физиологическим распюром

В связи с пизкои вьгявляемостыо видоспсцифичсских белков, была проведена обрабо1ка пяюн мочи 0,1% растворами трипсина и папаина в соответствии с рекомендациями Р С Сахарова с соав1 (1987) Однако даже при использовании ггроюаз в 10 опытах из 160 видоспецифичсские свойства мочи не были определены

Поэтому мы разрабо!али методику повышения концентрации белка в моче, которая состоит в следующем

- няню мочи весом более 100 мг помещаю! в пробирки, заливаю! физиологическим распюром и накапливают белки способом, подобным након-

лению аплюгининов по Т Маюткошвкл (1959) на всршкальиых полосках фильтровальной бума1 и,

- верхнюю часп. полоски фильтровальной бума1и срезаки, заливают 0,1% раствором трипсина или папаина и экстрагируют в течение 20 часов при 4°,

- в вытяжках реакцией преципитации в а1аре или меюдом встречного иммуноэлекфофореза на ацетат-целлюлозных мембранах выявляют видо-специфические белки

При э! ом во всех 100 опытах наблюдалось выпадение осадков между всеми подготовленными таким образом образцами мочи и сывороткой, пре-ципитирующсй белок человека, как в реакции преципитации в агаровом геле, так и при всфсчпом иммупоэлекгрофорезе па ацс!а!-целлюлозных мембранах

Проведенные нами исследования позволили провес ш дифференцирование клеточною осадка мочи, образованного различными видами эпителия, установить групповую принадлежность клеток реакцией смешанной агглютинации Обработка следов мочи протеазами позволили определить видовую принадлежность в трудно растворимых пятнах

В связи с полученными данными, мы разработали наиболее рациональную последовательное 1Ь действий при исследовании пяша мочи при которой в 1е же сроки и на одном и юм же экспертном ма!сриале М01у1 бьпь получены данные, существенно расширяющие возможное 1 и судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств, в плане конкрс1изации выводов о происхождении мочи от определенного человека (рисунок 1)

Навеску пяша мочи в 200 мг экстратирую1 физиоло!ическим раствором в течение 20 часов при 4° С, затем вьияжку из нягпа разделяют на две части (осадок и надосадочнуто жидкость) пугем центрифугирования при 1500 об /мин

Рисунок 1 - последовательность исследования следов мочи па вещественных доказательствах

Надосадочпую жидкость используют для определения наличия мочи по мочевине и креашпииу методом восходящей тонкослойной хроматографии на пластиках силуфоля

После установления наличия мочи определяют ее видовую принадлежность реакцией преципитации в агаре или меюдом ни речною иммуноэлек-трофореза на мембране из ацетата целлюлозы При отсутствии положительного результата следуй провести накопление белка па фильтровальной бумаге с последующей обработкой материала протеолитическими ферментами

Высушенную чаиь падосадочной жидкости испольювать для определения трупповой характеристики мочи в реакции абсорбции-иноции

Осадок, полученный после центрифугирования шпен мочи, исследовать цитологическими методами

Дальнейшее изучение клеточного осадка позволяет провести групповую дифферепцировку клеток по системам ABO и MNSs

В соответствующих случаях при обнаружении ядросодержащих клеток мочевого осадка возможно проведение молекулярно-теистического исследо-

вания, при котором устанавливается происхождение мочи oí конкретного лица

ВЫВОДЫ:

1 В мужской и женской моче, наряду с эиидермальными чешуйками, всегда содержаюя kjicikh мпоюслойного плоскою iicopoi овевающего эпителия, в ядрах которых выявляются половые маркеры (Х- и Y-хроматин)

2 Для женской мочи характерно наличие клеток влагалищного эпителия, а для мужской - уретрального эпителия, происходящего из ладьевидной ямки мочеиспускат слыгого капала

3 Разработан новый способ диагностики половой принадлежности мочи по соотношению в осадке ядро содержащих и безъядерных клеюк

4 Изолированные клетки мочевого осадка, находящиеся в устовиях, не способствующих развитию гнилостных или кариолигичсских процессов, сохраняются в течение дли i слыгого времени

5 Клетки осадка мочи несут выраженную антигенную характеристику по системе ЛВО, что усгатгавливается различными вариантами реакции смешанной агтлютинации Более слабая выраженность аггтитеггов системы MNSs не всегда позволяем определить групповую принадлежность клеюк в осадке мочи

6 В моче содержится белок в достаточном количестве дня установления видовой принадлежности рационально модифицированным методом им-муноэлектрофореза гга arreiar-целлюлозных мембранах

7 Разработана комплексная методика исследования следов мочи на вещественных доказательствах с использованием цитолотических методов исследования, позволяющая разрешить вопрос об их ипдивидуалишрующей характеристике

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Для диагностики половой и органпо-ткаттсвои принадлежности следов мочи необходимо притотовить цитологические препараты

С цслыо усыновления половой принадлежности клегок мазки окрашивают раствором 0,0005% раствором акрихина

Для определения органно-тканевого происхождения клеток по цитохимическим особенное 1ям используют 0,01% рас тор акридиновот оранжевого, селскшвно окрашивающий ДНК и РНК

При дифференцировании клеток различных видов многослойного плоского неороговеваюгцего эпителия применяют 0,05% раствор амидочер-ного 10Б, избирательно окрашивающий белки

С цслыо подтверждения происхождения клеюк и* слизисюй оболочки влагалища для выявления гликогена используют окраску раствором Лютоля

При недостаточном количестве клеток с половыми маркерами (Х- и Y-хроматипом) целесообразно использовать сггособ определения гголовой принадлежности мочи по соотношению ядросодержатцих и безьядерных клеток (таблица 2)

2 Во всех случаях при проведении реакции смешанной аплюгинации целесообразно и^учап. параллельно образны мочи заведомо известных групп по системам ЛВ0 и MNSs, а также использован» не менее двух серии диагностических peaicnioB и сывороток Рекомендуем одновременно исследовать объекты двумя модификациями РСА (с отмыванием и бе i отмывания) при выявлении антигенов системы ABO, изменять время абсорбции в сторону удлинения при определении антигенов системы MNSs

3 С целью установления видовой принадлежности мочи используют реакции преципитации в твердой среде, а при отрицательном результате метод иммупо)лектрофореза гга ПАЦ

Наиболее оптимальными для выявления белка при большой давности следов являются навеска пятна мочи гге менее 200 mi, накопленная на фильтровальной бумаге, экстрагированная в 0,1 % раствор папаииа или трипсина и использование метода встречного иммуиозлектрофореза па ацетат-целлюлозггои пленке

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Ревнитская Л А К вопросу об установлении видовой и половой принадлежности мочи / JIА Ревпигская, СЮ Силкина//Актуальные проблемы морфологии сб научн трудов - Красноярск, 2003 -С 178-181

2 Ревнитская ЛАК вопросу о видовой принадлежности мочи / Л А Ревнитская, С Ю Силкина//Актуальные проблемы судебной медицины сб научн трудов РЦ СМЭ МЗ РФ - М , 2003 - С 148-149

3 Силкина С 10 К вопросу о комплексном исследовании мочи /СЮ Силкина, Л А Ревнитская // Материалы шестого Всероссийского сьезда судебных медиков «Перепек i ивы развития и совершена вования судебно-медиципскои пауки и практики» (посвященные 30-лс1ию Всероссийского общества судебных медиков) - Москва - Тюмень изда1ельскии центр «Академия», 2005 -С 263

4 Силкина С 10 К вопросу о действии высоких и нижих температур на эпителиальные кле i ки, содержащиеся в моче / С 10 Силкина // Ак1уальные вопросы судебной медицины и экспертной практики - Новосибирск «Межрегиональная ассоциация «Судебные медики Сибири», 2006 - Выи 11 - С 265267

5 Силкина СЮ Один И! способов определения видовой принадлежности мочи в следах па вещественных доказательствах /СЮ Силкина // Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики на современном этапе материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием посвященной 75-летию РЦ СМЭ - М , 2006 - С 500

6 Силкина С 10 Особенности клеточного состава мочи лиц мужского и женского генетического пола /СЮ Силкина, Л А Ревнитская // Сборник работ врачей судебно-медицинских экспертов-биолотов РЦСМЭ - Вып 4 -М, 2007 - С 28-30

7 Силкина С 10 Новые технологии исследования мочи в следах на вещественных доказательствах / СЮ Силкина // Нижсюродскии медицинский

журнал. - № 6 - 2007 - С 81 - 84 - Дополнение к перечню - редакция июль 2007 г

8 Силкина СЮ «Способ определения половой прииадлежносж мочи при судебно-медицинской экспертизе следов мочи» / С К) Силкина, IIС Эделев -положительное решение Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам о выдаче патента па изобретение от 11 марта 2008 года заявки № 2007108948/15 от 13 03 2007 г

Силкина Светлана Юрьевна

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано к печати 23 06 08 г Формат 60х84'/,б Бумага писчая Печап» офсегиая Уел печ л 1 Тираж 100 экз Заказ 98

Полиграфический участок ГОУ В110 Ниж! МЛ 603005, Н Новгород, ул Алексеевская, 1

Актуальность работы

Постоянно возрастающий уровень расследования преступлений, направленных против жизни, здоровья человека, повышает роль судебно-медицинской экспертизы по исследованию следов биологического происхождения, в том числе мочи. А успехи в области биологии, генетики, иммунологии, цитологии создают базу и возможности развития новых медицинских технологий, направленных к решению основной задачи судебно-медицинской экспертизы выделений в плане идентификации личности.

В судебно-медицинском плане следы мочи изучены недостаточно. В частности, кроме определения её наличия, видовой и 1рупповой принадлежности, другие исследования не проводятся (Барсегянц JI.O., Левченков Б.Д., 1978; Барсегянц Л.О., 1999).

Здесь следует отметить, что из данных о клиническом исследовании мочи (Предтеченский В.Е., Боровская В.М., Марголина Л.Т., 1950) и единичных публикаций в судебно-медицинской литературе (Escelimd V., 1956; Riis P., Pilgaard C.E., 1956; Castro N.M., Sasso W.S., Trench U. S., Kerbany J., 1957; Тишинова Л.A., 1988) известно, что осадок мочи содержит и клеточные элементы. Его более глубокое изучение могло бы существенно расширить возможности экспертизы в плане конкретизации выводов о происхождении следов мочи от определённого человека.

Исследованию клеток посвящено множество работ отечественных и зарубежных авторов (Jelacic О., 1964; Willeme-Pissart F., Moureau P., 1964; Шалаев Н.Г., 1965, а-м, 1966, а-ж; Капустин А.В., 1969; Антонова С.Н., Митяева Н.А., 1972; Глизер С.Э., 1972; Любинская С.И., Антонова С.Н., 1976; Федо-ровцева Л.С., Загрядская Л.П., Одинцов Н.В., 1977; Антонова С.Н, 1980; Фе-доровцев А.Л., Ревнитская Л.А., 1980; Еранов Н.В., 1981; Барсегянц Л.О., Тамжидмаа Д., 1985; Загрядская А.П., Королева Е.И., Федоровцев А.Л., 1985; Королева Е.И., 1985; Федоровцев, 2003), в которых отмечены возможности установления органно-тканевой (региональной), видовой, трупповой и половой принадлежности изолированных клеток.

Тем не менее мы не нашли в судебно-медицинской литературе работ, посвященных изучению клеточного состава осадка мочи.

Трудности в исследовании пятен мочи в экспертной практике связаны ещё и с тем обстоятельством, что с мочой здорового человека выделяется менее 0,002 г/л белка (Данилова Л.А., 2002). Обычно этого количества белка недостаточно для достоверного определения его видовой принадлежности (Гуртовая С.В., 2001).

Таким образом, вышеизложенное подчеркивает актуальность работы и определяет

Цель исследования - установить возможности судебно-медицинского исследования клеточного осадка мочи и определения её видовой принадлежности.

Задачи исследования;

1. Исследовать клеточный состав осадка мужской и женской мочи с установлением региональной и половой принадлежности клеток.

2. Разработать способ диагностики половой принадлежности мочи по соотношению в осадке ядросодержащих и безъядерных клеток.

3. Разработать оптимальные варианты определения групповой принадлежности клеток осадка мочи по системам AB0 и MNSs.

4. Изучить устойчивость клеток осадка мочи к воздействию некоторых факторов внешней среды: влажности, высокой и низкой температуры.

5. Разработать модификации постановки реакции встречного иммуно-электрофореза на мембранах из ацетат-целлюлозы для определения видовой принадлежности следов мочи.

6. Разработать комплексную методику исследования следов мочи на вещественных доказательствах.

Научная новизна

Впервые установлена возможность определения региональной, групповой и половой принадлежности клеток осадка мочи.

Изучена сохраняемость клеток мочевого осадка в зависимости от воздействия различных факторов внешней среды (влажности, высокой и низкой температуры).

Разработаны оптимальные методики определения видовой принадлежности следов мочи.

Предложена комплексная методика исследования пятен мочи в следах на вещественных доказательствах.

Практическая значимость

Комплексное исследование следов мочи на вещественных доказательствах с изучением её клеточного состава в предложенном варианте существенно расширяет возможности судебно-медицинской экспертизы в плане конкретизации экспертных выводов о происхождении мочи от определенного человека.

Найден эффективный и рациональный способ определения видовой принадлежности мочи с использованием протеолитических ферментов и предварительным накоплением белков на фильтровальной бумаге перед постановкой реакции встречного иммуноэлектрофореза на мембранах из ацетат-целлюлозы.

Внедрение

Разработанные методики по изучения клеточного состава пятен мочи, определению её видовой и половой принадлежности внедрены в практику работы судебно-медицинских экспертов - биологов и цитологов Нижегородского, Ивановского, Самарского, Ярославского областных бюро судебно-медицинской экспертизы, республиканских бюро судебно-медицинской экспертизы Республик Мордовия, Татарстан, Марий Эл, а также используются в процессе преподавания на кафедре судебной медицины ГОУ ВПО «НижГМА Росздрава».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Пятна мочи, как выделения, кроме жидкой части, содержат клетки, исследование которых может использоваться для установления видовой, половой и групповой принадлежности мочи.

2. В моче практически здоровых людей содержится белок в достаточном количестве для определения его видоспецифических свойств.

3. Комплексное исследование пятен мочи с изучением клеточного состава осадка существенно расширит возможности судебно-медицинской экспертизы в плане конкретизации выводов о происхождении следов мочи от определённого человека.

Апробация диссертации

Основные положения работы доложены на:

1. 412 заседании Нижегородского отделения Всероссийского общества судебных медиков: «Судебно-медицинское исследование мочи, современное состояние вопроса, перспективы» (2001 г.).

2. 422 заседании Нижегородского отделения Всероссийского общества судебных медиков «Клеточный состав мочи и его значение при судебно-медицинских исследованиях вещественных доказательств» (2003 г.).

3. 432 заседании Нижегородского отделения Всероссийского общества судебных медиков «Влияние некоторых факторов на сохранность клеток, содержащихся в моче» (2004 г.).

4. 455 заседании Нижегородского отделения Всероссийского общества судебных медиков «Определение групповой принадлежности клеток следов мочи по системам AB0 и MNSs» (2007 г.).

5. 460 заседании Нижегородского отделения Всероссийского общества судебных медиков «Комплексное исследование мочи в экспертизе вещественных доказательств» (2007 г.).

6. Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств и Пленума правления ВОСМ» - доклад «Особенности клеточного состава мочи лиц мужского и женского генетического пола» - г. Воронеж (2007 г.).

7. На заседаниях кафедры судебной медицины ГОУ ВПО «НижГМА Росздра-ва» (2001-2008 г.г.).

Личное участие автора

Суммарное долевое участие автора на всех этапах работы составило 9095%. Автором лично была проведена серия экспериментов по исследованию образцов мочи от 150 практически здоровых человек, мужчин и женщин в возрасте от 3 до 76 лет. Самостоятельно проведено 4000 экспериментов разных серий.

Автором выполнено 12 практических судебно-медицинских экспертиз по исследованию следов мочи на вещественных доказательствах.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 журнальных статей, из них 1 в журнале, рекомендованном ВАК России.

Получено положительное решение Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам о выдаче патента на изобретение «Способ определения половой принадлежности мочи при судебно-медицинской экспертизе следов мочи» от 11 марта 2008 года (приложение

3)

Оформлены два рационализаторских предложения: «Способ накопления белков для последующего определения видовой принадлежности мочи» (Свидетельство № 2 от 21.02.2006 г.) и «Определение групповой принадлежности клеток по системе AB0 в осадке мочи реакцией смешанной агглютинации» (Свидетельство № 8 от 16.10.2006 г.) (приложения 1, 2).

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, 7 глав текста, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, 4 приложений. Работа изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц, 27 рисунков. Список литературы включает 304 источника, из них 106 иностранных.

ВЫВОДЫ

1. В мужской и женской моче, наряду с эпидермальными чешуйками, всегда содержатся клетки многослойного плоского неороговевающего эпителия, в ядрах которых выявляются' половые маркеры(Х- и Y-хроматин).

2. Для женской мочи характерно наличие клеток влагалищного эпителия, а для мужской — уретрального эпителия, происходящего из ладьевидной ямки мочеиспускательного канала.

3. Разработан новый способ диагностики половой принадлежности мочи по соотношению в осадке ядросодержащих и безъядерных клеток.

4. Изолированные клетки мочевого осадка, находящиеся в условиях, не способствующих развитию гнилостных или кариолитических процессов, сохраняются в течение длительного времени.

5. Клетки осадка мочи несут выраженную антигенную характеристику по системе АВО, что устанавливается различными вариантами реакции смешанной агглютинации.

Более слабая выраженность антигенов системы MNSs не всегда позволяет определить групповую принадлежность клеток в осадке мочи.

6. В моче содержится белок в достаточном количестве для установления видовой принадлежности рационально модифицированным методом им-муноэлектрофореза на ацетат-целлюлозных мембранах.

7. Разработана комплексная методика исследования следов мочи на вещественных доказательствах с использованием цитологических методов исследования, позволяющая разрешить вопрос об их индивидуализирующей характеристике.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Пятно мочи весом не менее 200 мг экстрагируют физиологическим раствором 20 часов при 4° в условиях бытового холодильника и разделяют на две части путем центрифугирования в течение 10 минут при 1500 об./мин.

2. Надосадочную жидкость используют для определения наличия мочи методом восходящей тонкослойной хроматографии на пластинках силуфоля и видовой принадлежность белка реакцией преципитации в 1% бессолевом агаровом геле.

3. При отрицательном результате реакции преципитации в твердой среде проводят иммуноэлектрофорез на мембранах из ацетат-целлюлозы.

При большой давности следов мочи перед проведением иммуноэлектрофореза целесообразно использовать методику повышения концентрации белка в пятне исследуемого материала, которая состоит в следующем:

- перед постановкой реакции вырезки из пятна мочи (весом 100 — 400 мг) помещают в пробирки, заливают физиологическим раствором и накапливают на вертикальных полосках фильтровальной бумаги, верхушка которых срезана под углом. Экстрагирование происходит при комнатной температуре;

- после накопления экстракта в верхней части полосок фильтровальной бумаги, наиболее насыщенная вытяжкой мочи часть срезается и измельчается;

- пятна экстрагируют 0,1% раствором трипсина или папаина в течение 20 часов при 4°.

4. Для диагностики половой и органно-тканевой (региональной) принадлежности клеток готовят цитологические препараты:

- вырезки из пятна мочи экстрагируют 15% раствором уксусной кислоты в течение 20 часов. Кусочки извлекают, отжимают, экстракт отмывают путем центрифугирования в 3 порциях 15% уксусной кислоты при 1500 об./мин. по 10 минут в каждой;

- осадок в виде капель помещают на предварительно обезжиренные в смеси Никифорова предметные стекла, высушивают при комнатной температуре и фиксируют 96° этиловым спиртом в течение 10 минут;

- для установления наличия клеток и выявления Y-хроматина препараты окрашивают 0,0005% раствором акрихина в течение 10 минут. Одновременно при этом в клетках может быть выявлен и Х-хроматин;

- для диагностики органно-тканевого и регионального происхождения клеток препараты 2 мин. окрашивают 0,01% раствором акридинового оранжевого;

- при необходимости дифференцирования клеток многослойного плоского неороговевающего эпителия проводят 10-минутное окрашивание препаратов 0,05% раствором амидочёрного 10Б;

- для выявления гликогена в клетках непосредственно на мазок наносят раствор Люголя.

При недостаточном количестве клеток с половыми метками может быть использован разработанный нами «Способ определения половой принадлежности мочи при судебно-медицинской экспертизе следов мочи» с использованием метода последовательного анализа Вальда в виде таблицы 8.