Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Комплексная оценка функциональной активности аутотрансплантатов селезенки у крыс

На правах рукописи

ЛЕОНОВ Сергей Дмитриевич

Комплексная оценка функциональной активности аутотрансплантатов

селезенки у крыс

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Смоленск - 2008

003459911

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник ФЕДОРОВ Геннадий Николаевич

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор медицинских наук, профессор Ярилин Александр Александрович Доктор медицинских наук, профессор Семенков Виктор Фадеевич

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита состоится » с^Цшкл. 2009 г. в 14^ часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.017.01 при Государственном научном центре «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства» (г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, корп. 2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства»

Автореферат разослан « 14 » ЗуцЕзачу ^ 2009 г.

Ученый секретарь совета по защите

докторских и кандидатских диссертаций доктор медицинских наук

Актуальность проблемы,

Спленэктомию (СЭ) чаще всего (в 97% случаев) производят по поводу повреждения органа, которое составляет до 50% от всех видов травм брюшной полости. Наиболее часто нарушение целостности органа имеет место при тупой травме живота (до 75% у взрослых и до 97% у детей). Ятрогенное повреждение селезенки служит причиной СЭ в 4,6-50% случаев. [Барамия H.H., 1990, Mirvis М.Т., 1989]

Среди осложнений, вызванных СЭ, по мере уменьшения частоты встречаемости стоят: поддиафрагмальный абсцесс, пневмония и плеврит слева, нагноение послеоперационных ран с последующей эвентрацией органов, перитонит, несостоятельность швов анастомозов [Saikh K.U., 2007], краевой панкреатит [Богданов A.B., 2002]. Очень тяжелым осложнением СЭ является сепсис (4,3%) с летальным исходом до 2,5% у взрослых, и до 50-70% у детей [Кузин М.И., 1985].

Больных, перенесших СЭ, с самого начала необходимо рассматривать как группу высокого риска по развитию инфекционных послеоперационных осложнений и так называемого постспленэктомического синдрома (ПСЭС), одним из проявлений которого является снижение иммунорезистентности [Апарцин К.А., 1995].

После СЭ наблюдаются нарушения гуморального и клеточного звеньев иммунитета, что проявляется снижением уровня сывороточных иммуноглобулинов всех классов [Поздеев O.K., 1998], СЗ и С4 фракций комплемента [Павловский М.П., 1986], тафцина [Апарцин К.А., 1995], уменьшением абсолютного числа Т- и B-лимфоцитов и подавлением фагоцитарной функции нейтрофилов [Павловский М.П., 1986].

Для предотвращения ПСЭС целесообразно проводить иммунно- или химиопрофилактику [Иванов В.В., 1996]. Органосохраняющие вмешательства на селезенке также являются способом профилактики ПСЭС [Апарцин К.А., 1993], позволяющим снизить частоту послеоперационных осложнений [Богданов A.B., 2002].

Но в связи с трудоемкостью и развитием частых осложнений после органосохраняющих вмешательств, операцией выбора служит аутотрансплантация ткани селезенки (АТТС), основными преимущес

которой являются относительно высокая физиологичность и простота манипуляции [Муратов И.Д., 1999].

Вопрос о функциональной полноценности пересаженной ткани селезенки является дискутабельным [Муратов И.Д., 1999, Апарцин К.А., 1995] и требует, на наш взгляд, дальнейшего изучения.

Цель исследования.

Оценить иммунологические, морфологические, биофизические, общеклинические показатели, характеризующие динамику приживления и функциональную активность аутотрансплантатов селезенки у крыс.

Задачи исследования:

1. Изучить динамику приживления аутотрансплантатов селезенки, пересаженных в большой сальник морфометрическим методом.

2. Разработать способы оценки жизнеспособности аутотрансплантатов и травматического повреждения селезенки с помощью биоимпедансометрии.

3. Оценить фагоцитарную и перекисную активность нейтрофилов у животных с аутотрансплантацией селезенки.

4. Изучить динамику содержания интерлейкина-1 в сыворотке крови у крыс с аутотрансплантацией селезенки.

5. Выявить основные нарушения в периферическом звене эритроцитарного ростка кроветворения у крыс после спленэктомии и динамику их восстановления после аутотрансплантации селезенки.

6. Уточнить роль аутотранспланта селезенки в предупреждении постспленэктомического синдрома.

Научная новизна исследования.

В нашей работе впервые:

морфометрическим методом доказано, что с 14 суток в аутотрансплантатах селезенки появлялись мелкие мономорфные зачаточные лимфоидные фолликулы, площадь распределения которых к 90 суткам соответствовала интактной селезенке, причем их количество не изменялось на протяжении всего срока наблюдения,

- использован биоимпедансометрический метод определения сроков приживления аутотрансплантатов селезенки в большой сальник,

- показано, что аутотрансплантацня селезенки препятствует нарушению фагоцитарной функции нейтрофилов периферической крови и компенсаторному повышению активности их ферментных систем.

доказано, что в условиях аутотрансплантации селезенки восстанавливается нормальная концентрация интерлейкина-1 в сыворотке крови, сниженная после спленэктомии,

установлено увеличение среднего диаметра эритроцитов в периферической крови после спленэктомии и аутотрансплантации ткани селезенки,

- доказано, что спленэктомия сопровождается ослаблением барьерной функции мембран эритроцитов, обусловленным нарушением созревания ретикулоцитов и снижением антирадикальной активности сыворотки крови.

Практическая значимость работы.

1. Повышена точность биоимпедансометрии путем усовершенствования электродов, позволяющих измерять электрическое сопротивление различных по толщине, площади и глубине залегания биологических структур, исключая влияние электрического сопротивления окружающих тканей.

2. Разработаны объективные критерии оценки жизнеспособности аутотрансплантатов селезенки в динамике послеоперационного периода биоимпедансометрическим методом.

3. Разработан способ диагностики травматического повреждения селезенки, позволяющий объективно оценить степень ее повреждения при тупой травме живота.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Спленэктомия сопровождается нарушениями в периферическом звене иммунной системы и эритрона, что проявляется снижением функциональной активности фагоцитов, синтеза интерлейкина-1 и антирадикальной активности сыворотки крови; анемией, наличием ретикулоцитоза, макроцитоза и нарушением барьерной функции мембран эритроцитов;

2. Аутотрансплантацня селезенки предупреждает угнетение функции фагоцитов, восстанавливает концентрацию интерлейкина-1 и антирадикальную активность сыворотки крови, препятствует развитию анемии.

Апробация работы.

Материалы работы доложены на конференциях молодых ученых и студентов СГМА в 2001, 2002, 2003, 2004, 2006, 2007, 2008 гг.; на Всероссийской Бурденковской студенческой конференции г. Воронеж в 2004, 2005 г.г.; на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007», г. Москва; на первой международной межвузовской конференции студентов и молодых ученых славянских государств «Медицинская наука, молодежь и современность» г. Смоленск в 2007 г.

По теме диссертации опубликовано 16 научных работ (8 в центральной печати, из них 3 в изданиях рекомендованных ВАК и 8 в местной печати). Получено 8 удостоверений на рационализаторские предложения и 4 патента на изобретения.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена 105 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 90 источников отечественных и 137 зарубежных авторов, иллюстрирована 12 таблицами и 19 рисунками.

Материалы и методы исследования.

Исследование выполнено на основании хронического эксперимента на 140 белых крысах обоего пола линии Вистар массой 180-230 г, которые были разделены на 4 группы: 1. Ложно оперированные (ЛО); 2. Со спленэктомией (СЭ); 3. С аутотрансплантацией ткани селезенки (АТТС); 4. С кровопотерей (КП) 1 % от массы тела.

Оценку гистологических изменений в ткани АТ проводили, используя микропрепараты аутотрансплантатов селезенки и интактной селезенки (окраска гематоксилином-эозином, наливка тушью).

Биоимпедансометрию (БИМ) ткани аутотрансплантата осуществляли на экспериментальной установке по оригинальной методике (Патент №2328214, Патент №2325846) с помощью усовершенствованных электродов (Патент № 2318435). Электроды погружали в ткань селезенки на глубину 2-3 мм, расстояние между электродами составляло 3-4 мм. С генератора на электрод подавался высокочастотный ток синусоидальной формы (10 кГц, выходное

напряжение 1,020 V). При этом происходило падение напряжения, фиксируемое вольтметром V2 и вольтметром VI. Величину импеданса рассчитывали по формуле: Z=(Ul/U2)xRl, где U1 - напряжение, регистрируемое вольтметром VI, U2 - напряжение регистрируемое вольтметром V2, R1 - подстроечное сопротивление резистора, причем R1«Z. В нашей установке R1 =10 Ом. Длительность процедуры биоимпедансометрии не превышала трех минут.

Состояние фагоцитарного звена иммунитета исследовали, определяя фагоцитарную активность клеток крови простым латексным тестом, интенсивность стимулированной хемилюминесценции цельной крови (Земсков В.М. (1988) в модификации Аверченкова В.М. (2001)), концентрацию ИЛ-1 в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа тест-системой «Bender MedSystems».

Антирадикальную активность сыворотки крови изучали с помощью хемилюминесцентного анализатора CL-3603 фирмы «Диалог» по методике Чукаева С.А. (1993).

Для оценки эритроцитарного ростка кроветворения определяли содержание в периферической крови эритроцитов, гемоглобина и ретикулоцитов, средний диаметр эритроцитов на гелий-неоновом лазере типа ЛГ-75 (Россия), а также осмотическую резистентность эритроцитов по Линбеку и Рибьеру.

Математическую обработку, полученных результатов проводили с помощью методов вариационной статистики, используя параметрические (критерий Стьюдента), если исследуемая величина имеет нормальный закон распределения, и непараметрические критерии (критерии Манна-Уитни и Колмогорова-Смирнова). Также для выяснения зависимости изучаемых величин проводили корреляционный анализ с расчетом коэффициента корреляции.

Результаты собственных исследований:

Морфологические изменения AT в динамике. На 7 сутки у крыс (п=6) в ткани сальника, окружающей аутотрансплантат (AT), наблюдалось умеренно выраженное экссудативное воспаление. В местах врастания капилляров в ткань AT определялись скопления тучных клеток в количестве 20-30 в поле зрения (увеличение *400). В синусах красной пульпы присутствовали, как гемолизированные эритроциты, больше в центральной части AT, так и негемолизрованные - на периферии. Белая пульпа не визуализировалась. Ткань

АТ была незначительно инфильтрирована нейтрофилами. Гемосидерофаги в виде небольших скоплений присутствовали во всех АТ.

На 14 сутки (п=6) сохранялась умеренная воспалительная реакция тканей окружающих АТ. Появлялась тонкостенная капсула, инфильтрированная лейкоцитами с преобладанием плазматических клеток, гемосидерофагами, тучными клетками.

По сравнению с 7 сутками, синусы красной пульпы были шире, заполнены эритроцитами и плазмой. Обращает внимание обилие полнокровных, относительно крупных сосудов по периферии АТ. В центре АТ нередко определялась интенсивная инфильтрация гемосидерофагами.

Периартериолярные муфты отсутствовали, появлялись мелкие мономорфные -незрелые «зачаточные» лимфоидные фолликулы (ЛФ) и очаговые лимфоидные инфильтраты.

На 30 сутки у крыс (п=16) АТ постепенно приобретали типичные для селезенки черты. Капсула АТ выражена слобо, имела место перифокапьная лейкоцитарная инфильтрация разной степени интенсивности. Определялась достаточно развитая красная пульпа с полнокровными синусами, в которых помимо негемолизированных эритроцитов присутствовало некоторое количество лейкоцитов. Имелась тенденция к формированию белой пульпы, представленной, большей частью, мелкими, незрелыми, редко расположенными лимфоидными фолликулами, количество которых было в сумме 5,2±0,85 на срез. Средняя площадь одного ЛФ (8,, ф ) составляла 0,015±0,003 мм2.

Спустя 90 суток (п=12) после пересадки, АТ был окружен хорошо выраженной, зрелой соединительнотканной капсулой, в которой наблюдалось небольшое продуктивное воспаление в виде скопления макрофагов, лимфоцитов и плазмоцитов. Синусы красной пульпы были полнокровны. Белая пульпа была представлена лимфоидными фолликулами с наличием центров просветления. Центральная артерия фолликула чаще отсутствовала или была представлена 2-3 сосудами малого диаметра. Большинство фолликулов имели органотипичное строение, но встречались незрелые формы. Среднее количество ЛФ составляло 4,9±1,6, а Бл.ф - 0,038±0,005 мм2 (р<0,05 при сравнении с Бл.ф. на 30 сутки), что практически не отличалось от интактной селезенки Бл.ф. 0,05±0,0018 мм2 (Р<0,05).

На 30 и 90 сутки ЛФ имели округлую форму и располагались преимущественно по периферии среза АТ (в наиболее васкуляризированных зонах), так как кровоснабжение в ткани трансплантата восстанавливалось от периферии к центру.

При определении плотности распределения ЛФ (ПРЛФ) в АТ, как отношение общей площади ЛФ к площади среза АТ установлено, что к 30 суткам послеоперационного периода ПРЛФ составила 0,016±0,0025, а на 90 сутки ПРЛФ достоверно увеличилась до 0,039±0,0034 (р<0,05). В селезенках интактных животных ПРЛФ равна 0,044±0,0027, и не отличалась от показателей ПРЛФ животных с АТТС на 90 сутки наблюдения (р>0,05), но была больше чем ПРЛФ на 30 сутки опыта (р<0,05).

Таким образом, пересаженные в большой сальник фрагменты селезенки, приживались в течение трех месяцев и приобретали черты органа с нормальным гистологическим строением.

Разработка способа определения жизнеспособности

аутотрансплантатов с помощью биоимпедансометрии. При исследовании БИМ большого сальника на 3 сутки (Табл. 1) ПО периода показатели импеданса составляли 21=86,5±6,5 Ом и 22=114,4±8,5 Ом (р<0,01) (где Ъ\ - импеданс в зоне АТ, а Ъ2 - импеданс в зоне большой кривизны желудка).

На 7 сутки показатели импеданса были равны 21=107,3±2,8 Ом, 72. =127,8±7,1 Ом (р<0,05), но далее достоверно выравнивались и составляли 21=182,4±8,5 Ом, 22=182,7±8,3 Ом на 14 сутки и 21=203,0±0,1 Ом, 22=203,4±0,2 Ом на 30 сутки соответственно.

Таблица 1.

Динамика изменения импеданса большого сальника при АТТС

к Импеданс на Импеданс на Импеданс на Импеданс на

я Т. ж К 3 сутки ПО 7 сутки ПО 14 сутки ПО 30 сутки ПО

П О" - м СП 5 периода (Ом) периода (Ом) периода (Ом) периода (Ом)

21 86,5±6,5* 107,3±2,8* 182,4±8,5 203,0±0,1

(М±ш) (п=9) (п=9) (п=9) (п=9)

22 114,4±8,5* 127,8±7,1 * 182,7±8,3 203,4±0,2

(М±ш) (п=9) (п=9) (п=9) (п=9)

Примечание:

* - различия достоверны в пределах одного срока наблюдения при р<0,05

Исследование показателей импеданса ткани АТ показало (Табл. 2), что на 3 сутки импеданс АТ был минимальный, что соответствовало процессам некробиолиза, в результате которых мембраны клеток разрушались, и емкостная

составляющая импеданса уменьшалась.

Таблица 2.

Динамика изменения импеданса АТ

Интактная ткань селезенки Ом (М±т) 3 сутки ПО периода Ом (М±гп) 7 сутки ПО периода Ом (М±ш) 14 сутки ПО периода Ом (М±т) 30 сутки ПО периода Ом (М±т)

144,7±4 (п=41) 80,8±4,5* (п=24) 81,7±1,9* (п=2 О 131,7±2,8*' (п=33) 158,2±8,7' (п=9)

Примечание: различия достоверны при р<0,05

* - по сравнению с импедансом интактной селезенки ' - по сравнению с предыдущим сроком наблюдения

К 14 дню наблюдения с появлением красной пульпы импеданс начинал увеличиваться и на 30 сутки приближался к показателям интактной селезенки.

Таким образом, гистологическая картина приживления АТ в динамике наблюдения полностью соотносилась с изменениями импеданса АТ, т.е. его нарастанием до показателей интактной ткани к моменту приживления.

Влияние АТТС на фагоцитарную и перекисную активность фагоцитов. При исследовании содержания лейкоцитов в периферической крови, на протяжении всего ПО периода достоверных различий между показателями

исследуемых групп выявлено не было (Табл. 3).

Таблица 3.

Динамика изменения количества лейкоцитов в периферической крови

Группа 3 сутки ПО периода Ю'/мл (Ме) п 14 сутки ПО периода 103/мл (Ме) п 30 сутки ПО периода 10 7мл (Ме) п

21,3 5 15,4 5 16,45 5

АТТС (9,2-25,2) (13,0-39,0) (13,5-25,0)

15,4 5 21,7 5 17,6 5

СЭ (11,3-18,9) (20,3-26,5) (14,1-18,3)

18,8 5 19,0 5 16,4 5

ЛО (11,4-20,5) (13,3-35,1) (13,5-16,9)

Примечание: во всех случаях р>0,05

Однако, функциональная активность лейкоцитов (Табл. 4) периферической крови крыс на 3 сутки была подавлена в группе с АТТС, что подтверждалось снижением ФИ до 65,2% (56,0%-75,0%) (р<0,05 по сравнению с показателями ЛО группы - 89,0% (86,0%-93,0%) и СЭ - 88,6% (79,0%-91,0%)) и ФЧ до 8,9 (7,3-11,8) по сравнению с ЛО - 11,2 (8,1-14,2) и СЭ крысами - 12,5 (9,3-16,4) (р<0,05).

Анализ изменения фагоцитарной активности мононуклеаров периферической крови показал, что СЭ с 14 по 30 день ПО периода сопровождалась стойким, прогрессирующим снижением количества фагоцитирующих клеток и их поглотительной способности по сравнению с животными с АТТС и ЛО (р<0,05). АТТС к 30 суткам наблюдения не полностью, но в значителеной степени востанавливала нарушенные количественные и функциональные показатели фагоцитоза мононуклеаров периферической крови у СЭ крыс (р<0,05) (Табл. 4).

Таблица 4.

Динамика показателей фагоцитарной активности мононуклеаров периферической крови

Группа ^ 3 сутки ПО периода (Ме) п 14 сутки ПО периода (Me) п 30 сутки ПО периода (Ме) п

АТТС ФИ 65,2*° (56,0-75,0) 5 72,0*°' (64,0-76,0) 5 70,2*° (57,0-80,0) 5

ФЧ 8,9*° (7,3-11,8) 5 6,7*' (6,0-7,2) 5 5,9* (3,5-6,5) 5

СЭ ФИ 88,6° (79,0-91,0) 6 52,9*°' (42,3-68,0) 5 40,35*°' (31,25-55,2) 5

ФЧ 12,5° (9,3-16,4) 6 5,15*' (4,5-6,6) 5 4,3* (3,3-7,6) 5

ЛО ФИ 89,0 (86,0-93,0) 5 83,0' (76,0-87,3) 5 85,0 (79,0-87,0) 5

ФЧ 11,2 (8,1-14,2) 5 Ю,1 (7,9-13,4) 5 9,8 (7,8-12,3) 5

Примечание: различия достоверны при р<0,05

* - по сравнению с ЛО животными в пределах одного срока наблюдения 0 - между группами с АТТС и СЭ в пределах одного срока наблюдении ' - по сравнению с предыдущим сроком наблюдения в пределах одной группы

Активность выработки на 3 день ПО периода перекисных соединений фагоцитами (кислородный взрыв) в исследуемых группах не отличалась (р>0,05) (Табл. 5). На 14 сутки наблюдалось значительное повышение индуцированной зимозаном хемилюминесценции фагоцитов периферической крови у СЭ животных (1,52 имп/мин/клетка) (р<0,05), и отсутствие различий в фуппе с АТТС - 0,55 имп/мин/клетка, и контролем - 0,66 имп/мин/клетка.

На 30 сутки опыта интенсивность ХЛ в группе крыс со СЭ оставалась высокой - 1,64 имп/мин/клетка (р<0,05), а при АТТС соответствовала ЛО контролю (Табл. 5).

Время появления максимума ХЛ при СЭ и АТТС на протяжении всего срока наблюдения достоверно не отличалось от контроля (р>0,05).

Таблица 5.

Динамика изменения активности хемилюминесценции нейтрофилов периферической крови

ее 3 сутки 14 сутки 30 сутки

С С ПО периода ПО периода ПО периода

О. имп/мин/клетка п имп/мин/клетка п имп/мин/клетка п

(Ме) (Me) (Ме)

0,56 5 0,55° 5 0,74° 5

АТТС (0,36-1,7) (0,38-0,7) (0,35-1,03)

0,7 6 1,52*°' 5 1,64*° 5

СЭ (0,5-1,2) (1,3-1,7) (1,11-2,27)

0,84 5 0,66 5 0,68 5

ЛО (0,66-0,89) (0,48-0,72) (0,52-0,9)

Примечание: различия достоверны при р<0,05

* - по сравнению с ЛО животными в пределах одного срока наблюдения ° - между группами с АТТС и СЭ в пределах одного срока наблюдении ' - по сравнению с предыдущим сроком наблюдения в пределах одной группы

Таким образом, СЭ сопровождалась нарушением фагоцитарной функции мононуклеаров периферической крови, что подтверждалось снижением ФИ и ФЧ. АТТС защищала СЭ крыс от данных нарушений с 14 дня ПО периода.

Кроме того, СЭ сопровождалась резким возрастанием интенсивности ХЛ, возможно, в результате компенсаторной реакции, направленной в сторону увеличения агрессивности ферментных систем фагоцитов. Причем

интенсивность XJ1 зависела обратно пропорционально от количества фагоцитирующих клеток (ФИ) периферической крови (г= -0,73).

АТТС у крыс предупреждала также развитие данных изменений и выраженной депрессии фагоцитов.

Антирадикальная активность сыворотки крови после СЭ и АТТС.

В связи с повышением агрессивности ферментных систем нейтрофилов при СЭ, мы изучили антирадикальную активность сыворотки крови и интенсивность спонтанной продукции эндоперекисей нейтрофилами периферической крови.

На 3 сутки ПО периода у животных с СЭ и АТТС ПОЛ было выше, чем в ЛО контроле (67560 у.е. (54970-91090 у.е.) и 67935 у.е. (57580-94980 у.е.), против 53235 у.е. (48570-60800 у.е.), р<0,05).

К 14 суткам светосумма в обеих группах увеличилась еще на 50% и составляла 115730 у.е. (105540-125140 у.е.) в группе СЭ и 101400 у.е. (92182130927 у.е.) при АТТС (р>0,05). Дальнейший рост интенсивности ПОЛ у животных с АТТС на 30 сутки прекращался, тогда как при СЭ, он достоверно нарастал до 150% по отношению к контролю и составлял - 159390 у.е. (116370210370 у.е.) Таким образом при СЭ снижалась антирадикальная активность сыворотки крови.

На 3 сутки (Табл. 6) у контрольных животных максимум люминесценции 462 у.е. (415-492 у.е.) определялся на 149 минуте (138-162 мин) исследования, тогда как у опытных животных фиксировались достоверно большие значения ХЛ, и, следовательно, большая перекисная активность фагоцитов в системе: кровь + р-р Хенкса + люминол (АТТС - 775 у.е. (494-854 у.е.), t=169MHH (165251 мин) и СЭ - 562,5 у.е. (427-744 у.е.), t=164 мин (152-166 мин). Важно отметить, что время достижения максимума ХЛ было у исследуемых крыс больше, чем в контроле (р<0,05).

За все время наблюдения продукция активных форм кислорода (АФК) в группе с АТТС уменьшалась, тогда как у СЭ животных нарастала и на 14 сутки составляла 1320,5 у.е. (961-1823 у.е.), причем максимум ХЛ приходился на 114,5 минуту (112-126 мин).

Динамика показателей люминол зависимой XJ1 цельной крови

Группа Интенсивность спонтанной ХЛ (у.е.) (Me)

3 сутки п 14 сутки п 30 сутки п

АТТС 775* (494-854) 5 542,5° (221-784) 5 464° (359-718) 5

СЭ 562,5* (427-744) 5 1320,5*°' (961-1823) 5 785*°' (572-1019) 5

ЛО 462 (415-492) 5 530,4 (476-680) 5 470 (388-507) 5

Примечание: различия достоверны при р<0,05

* - по сравнению с ЛО животными в пределах одного срока наблюдения 0 - между группами с АТТС и СЭ в пределах одного срока наблюдения ' - по сравнению с предыдущим сроком наблюдения в пределах одной группы

На 30 сутки спонтанная ХЛ при АТТС была достоверно меньше, чем у животных со СЭ (464 у.е. (359-718 у.е.), против 785 у.е. (572-1019 у.е.)) и не отличалась от значений в группе ЛО.

Таким образом, при СЭ происходила интенсификация процессов ПОЛ, что связано с гиперактивацией ферментных систем фагоцитов через увеличение продукции эндоперекисей, что в сумме приводила к дисбалансу антиоксидантной системы периферической крови. АТТС препятствовала развитию этого процесса, но не нормализовала антирадикальную активность сыворотки крови.

Влияние АТТС и СЭ на уровень ИЛ-1 в сыворотке крови. В связи с нарушением фагоцитарной и перекисной активности в популяции фагоцитирующих мононуклеаров крови при СЭ, было важно установить содержание в сыворотке крови ИЛ-1.

Мы показали, что у интактных крыс содержание ИЛ-1 составляло 4,6 пг/мл. На 3 сутки (Табл. 7) ПО периода концентрация ИЛ-1 в группе животных с АТТС повысилась до 5,1 пг/мл (4,8-5,3 пг/мл), а у крыс со СЭ снизилась до 3,9 пг/мл (р<0,05 по сравнению с ЛО группой и АТТС).

Динамика концентрации ИЛ-1 в сыворотке крови

Группа 3 сутки ПО периода пг/мл п 14 сутки ПО периода пг/мл п 30 сутки ПО периода пг/мл п

АТТС 5,1° с 4,1*' < 4,5°' 5

(Ме) (4,8-5,3) (3,8-4,6) (4,0-6,11)

СЭ 3,9*° 4,6* 4,3*

(Ме) (3,5-4,8) (4,0-5,3) (3,8-4,7)

ЛО 4,8 < 5,7 5,0

(Ме) (4,24-5,6) (4,59-6,42) (4,8-6,1)

Примечание: различия достоверны при р<0,05

* - по сравнению с ЛО животными в пределах одного срока наблюдения ° - между группами с АТТС и СЭ в пределах одного срока наблюдения ' - по сравнению с предыдущим сроком наблюдения в пределах одной группы

В группе ЛО концентрация ИЛ-1 достоверно не отличалась от показателей интактных животных. На 14 сутки наблюдения ИЛ-1 достоверно снижался в фуппе с АТТС и СЭ до 4,1 пг/мл и 4,6 пг/мл соответственно) относительно ЛО животных - 5,7 пг/мл.

На 30 сутки ПО периода концентрация ИЛ-1 в группе с АТТС увеличивалась до 4,5 пг/мл и не отличалась от значений ЛО животных - 5,0 пг/мл (р<0,05). В группе СЭ крыс содержание ИЛ-1 оставалось сниженным.

Таким образом, АТТС способствовала восстановлению синтетической функции системы мононуклеарных фагоцитов - секреции ИЛ-1.

Влияние АТТС на периферическое звено эритрона. Установлено, что у интактных животных средний уровень диаметра эритроцита составлял 6,7 (6,36,8) мкм. Уже на 1 сутки диаметр эритроцитов начинал снижаться до 5,8 (5,46,1) мкм у крыс с АТТС, до 6,3 (5,8-6,8) мкм у крыс со СЭ, до 6,15 (6,0-6,25) мкм с кроволотерей и 6,2 (6,1-6,3) у ЛО (по сравнению с интактными животными, р<0,01). У животных с АТТС микросфероцитоз был более выражен чем в других группах (р<0,01) (Табл. 8)

На 3-е сутки исследуемый показатель в группе с АТТС не отличался от показателей у крыс во всех группах (р>0,05).

Динамика изменения средних диаметров эритроцитов

Группа 1 сутки ПО периода мкм п 3 сутки ПО периода мкм п 7 сутки ПО периода мкм п 14 сутки ПО периода мкм п 30 сутки ПО периода мкм п

АТТС (Ме) 5,8* (5,4-6,1) 5 6,6' (6,45-7,0) 9 7,24*' (6,8-7,7) 11 7,5* (7,0-8,4) 6 7,05*' (6,9-7,2) 6

СЭ (Ме) 6,3 (5,8-6,8) 5 6,5 (5,8-7,0) 7 7,45*' (6,9-7,82) 8 7,5*' (6,9-8,4) 6 7,09* (6,6-7,6) 6

КП (Ме) 6,15 (6,0-6,25) 6 6,7' (6,65-6,9) 5 6,95*' (6,6-7,55) 10 6,65' (6,5-6,9) 5 6,6 (6,5-6,8) 5

ЛО (Ме) 6,2 (6,1-6,3) 5 6,5' (6,5-6,6) 5 6,5 (6,4-6,6) 5 6,6 (6,4-6,85) 5 6,6 (6,4-6,8) 5

Примечание: различия достоверны при р<0,05

* - по сравнению с Л О животными в пределах одного срока наблюдения ' - по сравнению с предыдущим сроком наблюдения в пределах одной группы

Уменьшение среднего диаметра эритроцитов на 1 сутки после СЭ, АТТС, КП, ЛО происходило, возможно, за счет образования или накопления в крови эхиноцитов и стоматоцитов, что сопровождалось микросфероцитозом и неизбежным массовым гемолизом эритроцитов. На 7-е сутки наблюдался увеличение диаметра эритроцитов у крыс с АТТС (до 7,24 (6,8-7,7) мкм), со СЭ (до 7,45 (6,9-7,82) мкм) (р<0,05), и при кровопотере (до 6,95 (6,6-7,55) мкм) (р<0,05 по сравнению с группой ЛО).

Пик макроцитоза у животных с АТТС приходился на 14 сутки - 7,5 (7,08,4) мкм, но затем к 30 дню достоверно снижался до 7,05 (6,9-7,2) мкм (р<0,05). В группе СЭ животных максимальное повышение среднего диаметра эритроцита наблюдалось на 7-14 сутки. На 14 и 30 сутки у крыс с АТТС и СЭ был более характерен макроцитоз по сравнению с ЛО животными и перенесшими КП, у которых диаметр эритроцитов возвращался к норме на 14 сутки эксперимента (Табл. 8).

Таким образом, СЭ сопровождалась стойким повышением среднего диаметра эритроцитов, причем АТТС на этот процесс не влияла.

Для выяснения причин макроэритроцитоза и анализа интенсивности эритропоэза после СЭ, АТТС и КП мы определяли уровень ретикулоцитов в периферической крови.

Динамика изменения содержания ретикулоцитов в периферической крови

Группа 3 сутки ПО периода % (Ме) п 7 сутки ПО периода % (Ме) п 14 сутки ПО периода % (Ме) п 30 сутки ПО периода % (Ме) п

АТТС 0,9 (0,8-1,0) 6 5,95*°' (3,3-13,5) 6 6,55* (4,6-8,9) 6 5,2*' (1,7-5,6) 6

СЭ 1,0 (0,8-1,3) 6 1,9*°' (1,3-3,5) 6 . 6,1*' (4,3-10,0) 6 5,6* (2,5-11,3) 6

КП 1,0 (0,9-1,3) 6 3,2*' (2,4-4,0) 6 1,2' (0,8-1,4) 6 1,1 (0,9-1,2) 6

ЛО и (0,9-1,3) 5 1,7' (1,4-1,9) 5 1,2' (0,9-1,3) 5 1,2 (0,8-1,3) 5

Примечание: различия достоверны при р<0,05

* - по сравнению с ЛО животными в пределах одного срока наблюдения 0 - между группами с АТТС и СЭ в пределах одного срока наблюдения ' - по сравнению с предыдущим сроком наблюдения в пределах одной группы

Содержание ретикулоцитов (Табл. 9) на 3 сутки наблюдения во всех исследуемых группах не различалось (р>0,05).

На 7 сутки регистрировалось повышение количества ретикулоцитов при АТТС до 5,95% (3,3%-13,5%), при СЭ до 1,9% (1,3%-3,5%) и КП до 3,2% (2,4%-4,0%) (р<0,05 по сравнению с ЛО контролем), что положительно (г=0,81) коррелировало с повышением диаметра эритроцитов в крови у экспериментальных животных.

Уровень ретикулоцитов в группах с АТТС и СЭ на 14 и 30 сутки был достоверно (в 5-6 раз) выше, чем в ЛО контроле и у животных с КП (р<0,05). Однако, у крыс с АТТС наблюдалась тенденция к уменьшению ретикулоцитоза к 30 дню наблюдения.

Таким образом, увеличение диаметра эритроцитов при АТТС и СЭ связано с повышением уровня ретикулоцитов в кровяном русле. Причем у животных с АТТС интенсивность эритропоэза на 7 сутки была выше, чем в группе с СЭ и КП, возможно, в результате стимулирующего влияния интенсивного эритродиереза на 1 сутки эксперимента.

Для оценки периферического звена эритрона в условиях АТТС и СЭ мы

проанализировали общее количество эритроцитов, содержание гемоглобина и осмотическую резистентность эритроцитов.

На 3 сутки послеоперационного периода количество эритроцитов (Табл. 10) в группе крыс с АТТС и СЭ соответствовало 5,1 х 106/мл (4,9-5,4x10л/мл) и 5,25><106/мл (4,2-6,8x10б/мл), т.е. было выше чем у ЛО крыс - 4,7хЮ6/мл (4,35-5,36хЮ6/мл) (р<0,05).

На 14 сутки количество эритроцитов у крыс с АТТС и СЭ не изменялось (Табл. 10), а в группе ЛО животных повышалось до 5,7x106/мл (5,08-6,1 хЮ'Умл) (1X0,05).

Таблица 10.

Динамика изменения содержания эритроцитов в периферической крови_

га с с

à L.

Содержание эритроцитов (107мл) (Me)

3 сутки ПО периода

14 сутки ПО периода

30 сутки ПО периода

АТТС

5Д* (4,9-5,4)

4,92* (4,0-5,0)

5,0° (4,0-6,1)

СЭ

5,25* (4,2-6,8)

5,4 (4,6-6,8)

4,14*°' (3,2-4,7)

ЛО

4,7 (4,35-5,36)

5,7' (5,08-6,1)

5,47 (4,96-6,0)

Примечание: различия достоверны при р<0,05

* - по сравнению с ЛО животными в пределах одного срока наблюдения 0 - между группами с АТТС и СЭ в пределах одного срока наблюдении ' - по сравнению с предыдущим сроком наблюдения в пределах одной группы

В последующем количество эритроцитов в группе с АТТС не изменялось до 30 суток наблюдения и не отличалось от ЛО животных - 5,0x106/мл (4,0-6,1хЮ%л) (р>0,05), тогда как при СЭ наблюдалась тенденция к усугублению анемии и к концу срока наблюдения количество эритроцитов составляло 4,14х]06/мл (3,2-4,7 х]06/мл) (р<0,05 по сравнению с показателями Л О 5,47хЮ6/мл (4,96-6,0x106/мл) и АТТС крыс 5,0х106/мл (4,0-6,1 *106/мл)).

Интересно, что на 3 сутки наблюдения гемоглобин у крыс в опытных группах (АТТС и СЭ) был достоверно выше, чем в ЛО контроле (145 г/л (131146 г/л) и 137 г/л (132-155 г/л) против 126 г/л (101-134 г/л), р<0,05). Однако, на 14 день наблюдения отмечалось снижение концентрации гемоглобина в

опытных группах до 123,8 г/л (116-135 г/л) при АТТС и 115 г/л (100-130 г/л) при СЭ. В ЛО контроле уровень гемоглобина повышался до 157,8 г/л (143-168 г/л).

К 30 суткам концентрация гемоглобина у животных с АТТС и СЭ оставалась на прежнем уровне и не отличалась от показателей ЛО контроля (р>0,05).

Исследуя осмотическую резистентность эритроцитов (ОРЭ), мы определили, что процент гемолизированных эритроцитов при концентрации ЫаС1 0,5% достоверно повышался (р<0,05) в обеих подопытных группах крыс начиная с 14 суток и составлял у животных с АТТС - 26,3% (11,3%-55,7%), с СЭ - 37,6% (32,3%-79,6%), тогда как в ЛО контроле - 8,6% (6,5%-12,0%) . Причем снижение ОРЭ в группе СЭ наблюдалась с 3 суток эксперимента. На 30 сутки в группе АТТС и СЭ процент гемолизированных эритроцитов составлял более 50%, что свидетельствовало о повышении доли эритроцитов с функционально незрелой мембраной.

Увеличение ОРЭ в крови крыс с АТТС и СЭ по сравнению с ЛО контролем в 0,4% №С1 на протяжении всего срока наблюдения, согласуется с данными о повышении количества ретикулоцитов, обладающих более высокой осмотической устойчивостью.

Таким образом, вследствие СЭ нарушались физиологические параметры периферического отдела эритрона, что проявлялось анемией, наличием выраженного ретикулоцитоза, значительным увеличением среднего диаметра эритроцитов и ослаблением барьерной функции их мембран. Эти изменения приводят к нарушению микроциркуляции, иммунологической и транспортной функции эритроцитов. АТТС предупреждала развитие анемии в ближайшем ПО периоде.

Выводы.

1. Приживление аутотрансплантатов селезенки у крыс наблюдалось с 7 дня послеоперационного периода и сопровождалось поэтапным регенераторным процессом с восстановлением клеточных и структурных единиц органа, что подтверждалось не только гистологическими методами, но и разработанными способами биоимпедансометрии аутотрансплантатов селезенки.

2. После спленэктомии наблюдалось угнетение функции фагоцитов, что проявлялось снижением фагоцитарного числа, фагоцитарного индекса и усилением выработки активных форм кислорода и, как следствие, снижение антирадикальной активности сыворотки крови. Аутотрансплантация селезенки частично восстанавливала функциональную активность фагоцитов, снижала интенсивность секреции активных форм кислорода в сыворотке крови.

3. Спленэктомия сопровождалась подавлением секреторной активности фагоцитов, проявляющимся снижением уровня интерлейкина-1 в сыворотке крови, тогда как аутотрансплантация селезенки оказывала протективный эффект.

4. Спленэктомия у крыс сопровождалась развитием нарушений в периферическом звене эритрона: увеличением среднего диаметра эритроцитов, ретикулоцитозом, анемией, нарушением функции мембран эритроцитов. Аутотрансплантация селезенки препятствовала развитию анемии, но не обеспечивала элиминацию патологических эритроцитов и процесс созревания ретикулоцитов.

5. Аутотрансплантация селезенки благоприятно влияла на течение послеоперационного периода после спленэктомии и предупреждала развитие большей части исследованных проявлений постспленэктомического синдрома.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Федоров Г.Н., Леонов С.Д. Селезенка, как один из компонентов поддержания гомеостаза в организме. // Вестник Смоленской медицинской академии, 2004, №3, с.64-68.

2. Леонов С.Д. Изменение среднего диаметра эритроцитов в условиях СЭ и аутотрансплантации ткани селезенки в эксперименте. //Сборник материалов межрегиональной студенческой конференции с международным участием «Студенческая медицинская наука - 2004», Воронеж, 2004, 400 с.

3. Леонов С.Д. Оценка динамики формирования лимфоидных фолликулов в аутотрансплантатах селезенки. // Материалы 1(65) Всероссийской Бурденковской студенческой конференции под редакцией проф. И.Э. Есауленко, Воронеж, 2005, 506 с.

4. Леонов С.Д. Влияние аутотрансплантации ткани селезенки на активность фагоцитов периферической крови крыс после спленэктомии. //Сборник-материалов 34-й конференции молодых ученых и лучших научных работ 58-й научной студенческой конференции, Смоленск, 2006, с.49.

5. Смородинов A.B., Леонов С.Д. Использование метода импедансометрии при АТТС в эксперименте. //Сборник материалов 34-й конференции молодых ученых и лучших научных работ 58-й научной студенческой конференции, Смоленск, 2006, с.84.

6. Леонов С.Д. Морфофункциональные особенности аутотрансплантации ткани селезенки в большой сальник. //Конкурс молодых ученых: материалы конференции, Смоленск, «Универсум», 2006, 244 с.

7. Баженов С.М., Федоров Г.Н., Леонов С.Д. Экстрамедуллярное кроветворение в аутотрансплантате селезенки у крыс после спленэктомии. //Вестник Смоленской медицинской академии. Медико-биологический выпуск, 2006, №3, с.52-53.

8. Федоров Г.Н., Леонов С.Д. Селезенка и её роль в поддержании гомеостаза. //Математическая морфология, 2006, том 5, вып.4 http://www.smoIensk.ru/user/ sgma/MMORPH/№12-html/fedorov/leonov.htrn

9. Федоров Г.Н., Леонов С.Д. Оценка динамики формирования лимфоидных фолликулов в аутотрансплантатах селезенки. //Системный анализ и управление в биомедицинских системах, 2006, том 5, №3, с.78-79

10. Леонов С.Д., Прудников И.М., Смородинов A.B. Импедансометрия селезенки. //Математическая морфология, 2006, том 5, вып.4 http://www.smolensk.ru/user /sgma/MMORPH/№l 2-html

11. Леонов С.Д. Способ диагностики приживления аутотрансплантата селезенки, пересаженного в большой сальник. // Материалы докладов XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007», том II, М: изд-во МГУ, 2007, 550 с.

12. Леонов С.Д. Влияние аутотрансплантации селезенки на гомеостаз эритрона у спленэктомированных крыс. // Сборник материалов 35-й конференции молодых ученых и лучших научных работ 59-й научной студенческой конференции, том И, Смоленск, 2007, с.3-4.

13. Федоров Г.Н., Леонов С.Д. Активность фагоцитов периферической крови крыс в условиях аутотрансплантации ткани селезенки. //Российский аллергологический журнал, 2007, №3, приложение 1, с. 37.

14. Леонов С.Д., Федоров Г.Н. Влияние аутотрансплантации ткани селезенки на гомеостаз эритрона у спленэктомированных крыс. // Вестник новых медицинских технологий, 2007, том XIV, №3, с. 26-28

15. Леонов С.Д. Диагностика приживления аутотрансплантата селезенки. //Сборник материалов первой международной межвузовской конференции студентов и молодых ученых славянских государств «Медицинская наука, молодежь и современность», Смоленск, изд-во СГМА, 2007, с. 52-53

16. Леонов С.Д. Критерии оценки функциональной активности аутотрансплантатов селезенки, пересаженных в большой сальник. // Сборник материалов 60-й научной студенческой конференции и 36-й конференции молодых ученых СГМА, Смоленск: СГМА, 2008, с. 129-130

Рационализаторские предложения:

1. Леонов С.Д., Смородинов A.B. Способ оценки соотношения красной и белой пульпы селезенки в гистологических препаратах. Удостоверение на рационализаторское предложение №1495 от 25.09.06.

2. Смородинов A.B., Леонов С.Д. Электроды для измерения полного электрического сопротивления (импеданса) биологических тканей. Удостоверение на рационализаторское предложение №1402 от 02.02.06.

3. Федоров Г.Н., Баженов С.М., Леонов С.Д. Метод оценки длительности хемилюминесценции в системе цельной крови. Удостоверение на рационализаторское предложение №1489 от 25.09.06.

4. Федоров Г.Н., Баженов С.М., Леонов С.Д. Способ регистрации хемилюминесценции в системе цельной крови. Удостоверение на рационализаторское предложение №1488 от 25.09.06.

5. Федоров Г.Н., Леонов С.Д., Смородинов A.B. Экспериментальная установка для электрохимического лизиса. Удостоверение на рационализаторское предложение №1496 от 25.09.06.

6. Федоров Г.Н. Гумиров Р.З. Леонов С.Д., Смородинов A.B. Способ определения полного электрического сопротивления (импеданса) биологических тканей. Удостоверение на рационализаторское предложение №1480 от 12.12.05.

7. Леонов С.Д. Способ ранней диагностики приживления аутотрансплантата селезенки. Удостоверение на рационализаторское предложение №1508 от 17.01.07.

8. Леонов С.Д. Способ ранней диагностики приживления аутотрансплантата селезенки в большой сальник. Удостоверение на рационализаторское предложение №1513 от 15.02.07.

Патенты:

1. Федоров Г.Н, Леонов С.Д., Смородинов A.B. Способ диагностики травматического повреждения селезенки. Патент № 2312607

2. Смородинов A.B., Леонов С.Д. Электрод для проведения биоимпедансометрии. Патент № 2318435

3. Леонов С.Д., Федоров Г.Н. Способ ранней диагностики приживления аутотрансплантатов селезенки. Патент №2325846.

4. Федоров Г.Н., Леонов С.Д. Способ ранней диагностики приживления аутотрансплантата селезенки в большой сальник. Патент №2328214

Подписановпечать12.01.09 Формат 60x84/16. Бумага офсетная.

_Тираж 100 экз. Заказ № з_

Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Спленэктомию (СЭ) чаще всего (в 97% случаев) производят по поводу повреждения органа, которое составляет до 50% от всех видов травм брюшной полости. Наиболее часто нарушение целостности органа имеет место при тупой травме живота (до 75% у взрослых и до 97% у детей). Ятрогенное повреждение селезенки служит причиной СЭ в 4,6-50% случаев.[7, 161]

Среди осложнений, вызванных СЭ, по мере уменьшения частоты встречаемости стоят: поддиафрагмальный абсцесс, пневмония и плеврит слева, нагноение послеоперационных ран с последующей эвентрацией органов, перитонит, несостоятельность швов анастомозов [2, 86], краевой панкреатит [11] и свищи полых органов [1]. Очень тяжелым осложнением СЭ является сепсис (4,3%) с летальным исходом до 2,5% у взрослых, и до 50-70% у детей [40].

Больных, перенесших СЭ, с самого начала необходимо рассматривать как группу высокого риска по развитию инфекционных послеоперационных осложнений и так называемого постспленэктомического синдрома (ПСЭС), одним из проявлений которого является снижение иммунорезистентности [3,4, 5].

После СЭ наблюдаются нарушения гуморального и клеточного звеньев иммунитета, что проявляется снижением уровня сывороточных иммуноглобулинов всех классов [59], СЗ и С4 фракций комплемента [55], тафцина [4], уменьшением абсолютного числа Т- и В-лимфоцитов и подавлением фагоцитарной функции нейтрофилов [55].

Для предотвращения ПСЭС целесообразно проводить иммунно- или химиопрофилактику [31].

Органосохраняющие вмешательства на селезенке также являются способом профилактики ПСЭС [4], позволяющим снизить частоту послеоперационных осложнений [11, 28].

Существует достаточно много видов органосохраняющих операций: зашивание глубоких разрывов селезенки по Э.А.Степанову с соавт. (1984); свободная оментоспленопексия (Иванчев И. и др., 1979); ампутация селезенки по методу Р.М.Гланца и М.М.Рожинского (1973); или её резекция; перевязка селезеночной артерии; субтотальная и предельно субтотальная резекция селезенки при гематологических заболеваниях с оставлением верхнего полюса (Казимиров Л.И. с соавт., 1992); эмболизация селезеночной артерии, аутотрансплантация ткани селезенки (АТТС).

Высокая частота осложнений ограничивает применение большинства органосохраняющих методик, а именно: прорезывание швов, вторичное кровотечение, образование ложных кист, инфицирование поврежденных тканей селезенки, некроз ткани в области швов, перевязка крупного сосуда при зашивании раны в области полюса с последующим некрозом паренхимы, формирование центральной гематомы с опасностью позднего вторичного разрыва или инфицирования, развитие спаечной болезни после операции [52].

В связи с трудоемкостью и развитием частых осложнений после органосохраняющих вмешательств, операцией выбора является АТТС, основное преимущество которой состоит в относительно высокой физиологичности [50]. Частота осложнений после АТТС составляет всего 1—3% [68].

Вопрос о функциональной полноценности пересаженной ткани селезенки является дискутабельным и требует, на наш взгляд, дальнейшего изучения.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: Оценить иммунологические, морфологические, биофизические, общеклинические показатели, характеризующие динамику приживления и функциональную активность аутотрансплантатов селезенки у крыс.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучить динамику приживления аутотрансплантатов селезенки, пересаженных в большой сальник морфометрическим методом.

2. Разработать способы оценки жизнеспособности аутотрансплантатов и травматического повреждения селезенки с помощью биоимпедансометрии.

3. Оценить фагоцитарную и перекисную активность нейтрофилов у животных с аутотрансплантацией селезенки.

4. Изучить динамику содержания интерлейкина-1 в сыворотке крови у крыс с аутотрансплантацией селезенки.

5. Выявить основные нарушения в периферическом звене эритроцитарного ростка кроветворения у крыс после спленэктомии и динамику их восстановления после аутотрансплантации селезенки.

6. Уточнить роль аутотранспланта селезенки в предупреждении постспленэктомического синдрома.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА В нашей работе впервые:

- морфометрическим методом доказано, что с 14 суток в аутотрансплантатах селезенки появлялись мелкие мономорфные зачаточные лимфоидные фолликулы, площадь распределения которых к 90 суткам соответствовала интактной селезенке, причем их количество не изменялось на протяжении всего срока наблюдения,

- использован биоимпедансометрический метод определения сроков приживления аутотрансплантатов селезенки в большой сальник,

- показано, что аутотрансплантация селезенки препятствует нарушению фагоцитарной функции нейтрофилов периферической крови и компенсаторному повышению активности их ферментных систем. доказано, что в условиях аутотрансплантации селезенки восстанавливается нормальная концентрация интерлейкина-1 в сыворотке крови, сниженная после спленэктомии, установлено увеличение среднего диаметра эритроцитов в периферической крови после спленэктомии и аутотрансплантации ткани селезенки,

- доказано, что спленэктомия сопровождается ослаблением барьерной функции мембран эритроцитов, обусловленным нарушением созревания ретикулоцитов снижением антирадикальной активности сыворотки крови.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

1. Повышена точность биоимпедансометрии путем усовершенствования электродов (Патент №2318435), позволяющих измерять электрическое сопротивление различных по толщине, площади и глубине залегания биологических структур, исключая влияние электрического сопротивления окружающих тканей.

2. Разработаны объективные критерии оценки жизнеспособности аутотрансплантатов селезенки в динамике послеоперационного периода биоимпедансометрическим методом (Патент №2325846, Патент №2328214).

3. Разработан способ диагностики травматического повреждения селезенки (Патент №2312607), позволяющий объективно оценить степень повреждения селезенки при тупой травме живота.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Спленэктомия сопровождается нарушениями в периферическом звене иммунной системы и эритрона, что проявляется снижением функциональной активности фагоцитов и синтеза интерлейкина-1; анемией, наличием ретикулоцитоза, макроцитоза и нарушением барьерной функции мембран эритроцитов; снижением антирадикальной активности сыворотки крови;

2. Аутотрансплантация селезенки предупреждает угнетение функции фагоцитов, восстанавливает концентрацию интерлейкина-1 в сыворотке крови и препятствует развитию анемии.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Материалы работы доложены на конференциях молодых ученых и студентов СГМА в 2001, 2002, 2003, 2004, 2006, 2007, 2008 гг.; на Всероссийской Бурденковской студенческой конференции г. Воронеж в 2004, 2005 г.г.; на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007», г. Москва; на первой международной межвузовской конференции студентов и молодых ученых славянских государств «Медицинская наука, молодежь и современность» в 2007 г.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 16 научных работ (8 в центральной печати, из них 3 в изданиях рекомендованных ВАК и 8 в местной печати). Получено 8 удостоверений на рационализаторские предложения и 4 патента на изобретения.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 90 источников отечественных и 137 зарубежных авторов, иллюстрирована 12 таблицами и 19 рисунками.

ВЫВОДЫ

1. Приживление аутотранеплантатов селезенки у крыс наблюдалось с 7 дня послеоперационного периода и сопровождалось поэтапным регенераторным процессом с восстановлением клеточных и структурных единиц органа, что подтверждалось не только гистологическими методами, но и разработанными способами биоимпедансометрии аутотранеплантатов селезенки.

2. После спленэктомии наблюдалось угнетение функции фагоцитов, что проявлялось снижением фагоцитарного числа, фагоцитарного индекса и усилением выработки активных форм кислорода и, как следствие, снижение антирадикальной активности сыворотки крови. Аутотрансплантация селезенки частично восстанавливала функциональную активность фагоцитов, снижала интенсивность секреции активных форм кислорода в сыворотке крови.

3. Спленэктомия сопровождалась подавлением секреторной активности фагоцитов, проявляющимся снижением уровня интерлейкина-1 в сыворотке крови, тогда как аутотрансплантация селезенки оказывала протективный эффект.

4. Спленэктомия у крыс сопровождалась развитием нарушений в периферическом звене эритрона: увеличением среднего диаметра эритроцитов, ретикулоцитозом, анемией, нарушением функции мембран эритроцитов. Аутотрансплантация селезенки препятствовала развитию анемии, но не обеспечивала элиминацию патологических эритроцитов и процесс созревания ретикулоцитов.

5. Аутотрансплантация селезенки благоприятно влияла на течение послеоперационного периода после спленэктомии и предупреждала развитие большей части исследованных проявлений постспленэктомического синдрома.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Уже в начале XX века ученые понимали важную роль селезенки в организме [37], однако СЭ остается одной из самых распространенных оперативных вмешательств на этом органе [1].

Впервые взаимосвязь между удалением селезенки и последующей молниеносной инфекцией показали в 1952 году Н. King и Н. Jr. Schumacker [143]. В настоящее время накоплен колоссальный фактический материал о последствии СЭ - постспленэктомическом синдроме (ГТСЭС) [3].

По данным литературы, аутотрансплантация ткани селезенки (АТТС) является операцией выбора, так как послеоперационные осложнения минимальны, а техника вмешательства достаточно проста [50, 66]. Однако до настоящего времени вопрос о функциональной компетентности пересаженной ткани селезенки и влиянии ее на развитие ПСЭС остаётся открытым.

Хронический эксперимент выполнялся на 140 крысах «Вистар» обоего пола. Для проведения комплексного исследования функциональной активности AT селезенки мы выбрали модель пересадки 2-3 фрагментов поперечных срезов селезенки толщиной 1-2 мм в большой сальник. Исследуемые показатели крыс с АТТС сравнивали с животными со СЭ, кровопотерей (КП) 1% от массы тела и ложно оперированными животными.

При гистологическом изучении AT установлена динамика морфологических процессов, соответствующая данным, полученным другими авторами [48, 85, 110, 162].

В ходе работы была впервые в динамике проведена морфометрическая оценка формирования лимфоидных фолликулов в AT селезенки и разработан способ оценки соотношения красной и белой пульпы в гистологических препаратах селезенки.

Доказано, что с 14 суток в АТТС появлялись мелкие мономорфные -зачаточные лимфоидные фолликулы, а к 90 суткам площадь распределения лимфоидных фолликулов соответствовала интактной селезенке, причем их количество не изменялось на протяжении всего последующего срока наблюдения.

В связи с отсутствием доступных нам методов прижизненной оценки жизнеспособности АТ было разработано два способа диагностики приживления АТ селезенки с использованием импедансометрии биологических тканей.

Для этого мы сконструировали оригинальные электроды (Патент № 2318435), позволяющие измерять электрическое сопротивление различных по толщине, площади и глубине залегания биологических структур, исключая влияние электрического сопротивления окружающих тканей, тем самым, повышая точность биоимпедансометрии.

Нами показано, что АТ селезенки можно считать прижившимися, если его импеданс повышался в течение ПО периода по сравнению с 3 сутками наблюдения. Аналогично о приживлении АТ можно судить, по выравниванию импеданса большого сальника между зонами АТ и большой кривизны желудка.

После подтверждения приживления АТ морфологическим и биофизическим методами мы оценили их функциональную компетенцию.

В литературе детально описано влияние АТТС на такие гематологические показатели как функциональное состояние тромбоцитов, коагуляционный гомеостаз, клеточность костного мозга [34, 41, 85, 179, 215], но недостаточно данных об изменениях в периферическом звене эритрона. Если учесть, что эритроциты играют первостепенную роль в абсорбции и транспорте иммунных комплексов и от их функционального состояния зависит реология крови и микроциркуляция, то вопрос изучения состояния периферического звена эритрона при АТТС является важнейшим для теоретической и практической иммунологии.

С этой целью мы изучили общий анализ крови, количество ретикулоцитов, измерили средний диаметр и осмотическую резистентность эритроцитов.

При оценке среднего диаметра эритроцитов в группах с АТТС, СЭ и КП была зафиксирована стереотипная реакция, проявляющаяся микросфероцитозом на 1 сутки ПО периода, вследствие усиленного эритродиереза, затем нарастающим макроцитозом с пиком на 7 сутки у животных с КП и на 14 сутки в группах с АТТС и СЭ.

В отличие от животных с КП и ЛО средний диаметр при АТТС и СЭ не нормализовался в течение 30 суток наблюдения.

Нами доказано, что увеличение диаметра эритроцитов при АТТС и СЭ связано с повышением количества ретикулоцитов в периферической крови (г=0,81), которое, в свою очередь, по-видимому, вызвано нарушением их созревания из-за отсутствия селезенки.

По нашему мнению, селезенка является «калибратором» размеров эритроцитов, что валено для поддержания нормальной микроциркуляции и гемореологии. По-видимому, АТ в результате некробиотических изменений в ранние сроки после пересадки не способен удалять из кровотока макроциты и еще не может быть местом созревания ретикулоцитов, так как их количество к 30 наблюдения не уменьшалось по сравнению с группой СЭ.

Важно отметить, что у животных с АТТС интенсивность эритропоэза на 7 сутки была выше, чем в группе со СЭ и КП. Скорее всего, это следствие стимулирующего влияния усиленного эритродиереза на 1 сутки эксперимента, в результате которого при трансформации эритроцитов образуются микровизикулы, усиливающие эритропоэз в костном мозге [72].

При СЭ, в отличие от группы с АТТС, развивалась анемия. Количество эритроцитов на 30 сутки снижалось до 4,14хЮ6/мл (3,2-4,7><10б/мл), против 5,47х Ю6/мл (4,96-6 ,0хЮ6/мл) в контроле (р<0,05), хотя уровень гемоглобина в группах с АТТС и СЭ не отличался от показателей контроля.

Исследуя ОРЭ, мы определили, что процент гемолизированных эритроцитов при 0,5% концентрации ЫаС1 достоверно повышался на протяжении всего ПО периода в группах с АТТС и СЭ, достигая 50% гемолиза к 30 суткам, что говорит о накоплении эритроцитов с функционально незрелой мембраной, в результате нарушения созревания ретикулоцитов после СЭ.

Достоверное увеличение ОРЭ в обеих группах по сравнению с ЛО контролем в 0,4% ЫаС1 на протяжении всего срока наблюдения было обусловлено на наш взгляд повышенным содержанием ретикулоцитов, которые, как известно, более устойчивы к осмотическому шоку [78].

Таким образом, вследствие СЭ с 1 по 30 сутки ПО периода нарушались физиологические параметры периферического звена эритрона, проявляющиеся анемией, ретикулоцитозом, макроэритроцитозом и нарушением барьерной функции мембран эритроцитов, что не могло не сказаться на микроциркуляции, иммунологической и транспортной функции эритроцитов.

АТТС предупреждала развитие анемии, но не влияла па содержание ретикулоцитов, размер и осмотическую резистентность эритроцитов.

Известно, что спленоциты синтезируют интерлейкины, спленин, тафцин, которые регулируют, функциональную активность фиксированных макрофагов, и мононуклеарных фагоцитов периферической крови [23, 47, 49, 73, 117, 212, 103, 144]. В данном исследовании мы проверили противоречивые данные в отношении активности мононуклеарных фагоцитов после АТТС [68, 74,157, 158, 197].

Мы установили, что СЭ сопровождается нарушением фагоцитарной активности мононуклеаров периферической крови, проявляющейся снижением ФИ и ФЧ. АТТС, начиная с 14 дня ПО периода, если не предупреждает, то значительно защищает СЭ крыс от данных нарушений.

При оценке ЛХЛ фагоцитов в цельной крови с 14 суток и до конца наблюдения у СЭ крыс определялось троекратное усиление люминесценции индуцированной зимозаном и в полтора раза спонтанной ЛХЛ по сравнению с АТТС и интактными животными. По нашему мнению, это связано с компенсаторной реакцией мононуклеарных фагоцитов, направленной в сторону увеличения агрессивности ферментных систем фагоцитов, в связи с нарушением их поглотительной функции.

По литературным данным, первичным звеном в инициации процессов ПОЛ являются нейтрофилы и макрофаги за счет выделения при «оксидативном взрыве» активных форм кислорода, каспаз и эластазы [23]. Поэтому, у животных со СЭ снижалась антирадикальная активность сыворотки крови, что в 1,5 раза превышало показатели крыс с АТТС и в 2,5 раза Л О животных.

Зафиксированные нами, нарушения в системе мононуклеарных фагоцитов дают основание предполагать, что анемия у СЭ крыс является следствием нескольких разнонаправленных процессов. Во-первых, активация ПОЛ в сыворотке крови приводит к повреждению липидного бислоя мембран эритроцитов [71, 72], что нарушает их барьерную функцию и ведет к гемолизу. Во-вторых, снижение функциональной активности фагоцитов, по-видимому, носило системный характер и затрагивало макрофаги эритробластических островков костного мозга, которые участвуют в созревании эритроцитов, что подтверждается положительной корреляцией (1-0,53) между снижением ФИ и уменьшением эритроцитов в крови животных.

Итак, недостаточность фагоцитарной функции нейтрофилов после СЭ компенсируется усиленной выработкой ими АФК, что в свою очередь ведет к активации перекисного окисления липидов в сыворотке крови и повреждению мембран эритроцитов.

АТТС препятствует развитию выраженного нарушения функциональной активности фагоцитов и, как следствие, активации процессов ПОЛ, по-видимому, за счет выделения аутотрансплантатом тафтцина, спленина и других биологически активных веществ, регулирующих этот процесс.

В связи с нарушением фагоцитарной и перекисной активности мононуклеарных фагоцитов при СЭ, мы провели анализ содержания в сыворотке крови ИЛ-1, который преимущественно синтезируется клетками системы мононуклеарных фагоцитов.

ИЛ-1 важнейший регулятор гомеостаза организма, так как опосредует некоторые виды системного ответа острой фазы (вызывает лихорадку, нейтрофилию, стимулирует эндотелиальные клетки, индуцирует синтез простагландинов и белка острой фазы) и местные воспалительные изменения [23].

В результате оказалось, что уровень продукции ИЛ-1 на всем протяжении ПО периода у животных со СЭ был ниже, чем в контроле, тогда как в группе с АТТС снижение концентрации ИЛ-1 наблюдалось лишь на 14 сутки.

Снижение концентрации ИЛ-1 в группе со СЭ связано с нарушением секреторной активности системы мононуклеарных фагоцитов, что особенно проявилось на 3 сутки эксперимента.

Повышенное содержание ИЛ-1 при АТТС относительно СЭ животных могли опосредовать несколько факторов:

1. На 3 сутки ПО периода в центральной зоне АТ происходили процессы некробиолиза, и параллельная активная элиминация макрофагами некротизированной, богатой протеазами ткани, что являлось благоприятной средой для синтеза ими ИЛ-1 [23].

2. В АТ до этого момента оставался депонированный тафцин. Хотя он и является функциональным антагонистом ИЛ-1, но при этом стимулирует его высвобождение из фагоцитирующих клеток периферической крови и фиксированных фагоцитов [3].

Снижение концентрации ИЛ-1 с 14 суток в группе с АТТС можно объяснить завершением процесса некробиолиза АТ, в котором к этому сроку формировалась красная пульпа и зачаточные лимфоидные фолликулы, но, по-видимому, синтез ИЛ-1 не происходил.

По нашему мнению, положительное влияние АТТС обеспечивается скорее за счет гуморальной функции АТ, т.е. выработки гормонов селезенки (спленин, тафтцин) и регуляторных цитокинов (ИЛ-1), нежели за счет стромального компонента, который обеспечивает «калибровку» эритроцитов и созревание ретикулоцитов.

Таким образом, мы установили ранее не известные патогенетические звенья развития ПСЭС (Рис. 14). К ним относятся:

1. Нарушение гемореологии и микроциркуляции;

2. Снижение синтеза ИЛ-1;

3. Анемия, за счет угнетения системы мононуклеарных фагоцитов, затрагивающих макрофаги-няньки костного мозга и гемолитического компанента, связанного с повреждением мембран эритроцитов продуктами перекисного окисления липидов.

Мы доказали положительную роль АТТС в нормализации или предупреждении развития данных системных процессов (Рис. 15), что служит экспериментальным обоснованием для использования АТТС в целях профилактики ПСЭС.

Рис.18. Патогенетические пути развития ПСЭС депрессия фагоцитоза компенсаторная ^ активация ферментных систем фагоцитов антирадикальная активность сыворотки крови нарушение созревания ретикулоцитов 1 повреждение мембран эритроцитов ретикулоцитоз = макроцитоз (г=0,83)

ИЛ-1 I I внутрисосудистыи гемолиз

Рис. 19. Роль АТТС в предупреждении ГТСЭС депрессия фагоцитоза компенсаторная ^ активация ферментных систем фагоцитов антирадикальная активность сыворотки крови нарушение созревания ретикулоцитов 1 ретикулоцитоз = макроцитоз (г=0,83)

1 ИЛ-1 1 I снижение системного воспалительного ответа острой фазы I повреждение мембран эритроцитов 1 внутрисосудистый гемолиз нарушение функции транспорта антигенов и иммунных комплексов I анемия псэс